JP2021045100A

JP2021045100A - Cell separation device and cell separation method

Info

Publication number: JP2021045100A
Application number: JP2019171404A
Authority: JP
Inventors: エリックオフォス−チュム; Ofos-Chum Eric; 近藤　健之; Takeyuki Kondo; 健之近藤; 啓介渋谷; Keisuke Shibuya
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 2019-09-20
Filing date: 2019-09-20
Publication date: 2021-03-25

Abstract

To provide a cell separation device and a cell separation method in which a damage to a cell is reduced at the start of liquid feeding when liquid including the cell is sent to a cell separator.SOLUTION: A cell separation device 1 comprises: a main tank 2 in which liquid including a cell is prepared; a cell separator 3 which separates the cell from the liquid discharged from the main tank 2; a transfer pipe 5 which sends the liquid from the main tank 2 to the cell separator 3; a return pipe 6 which returns the separated cell from the cell separator 3 to the main tank 2; and a bypass pipe 8 which connects the cell separator 3 from the transfer pipe 5 to the return pipe 6 in a bypassing manner. In a cell separation method, at the start of liquid feeding before the liquid begins to circulate between the main tank 2 and the cell separator 3 in the cell separation device 1, the liquid discharged from the main tank 2 is not sent to the cell separator 3 but is returned to the main tank 2 through the bypass pipe 8, and during circulation operation after the liquid begins to circulate between the main tank 2 and the cell separator 3, the liquid discharged from the main tank 2 is sent to the cell separator 3, and the separated cell is returned to the main tank 2.SELECTED DRAWING: Figure 1

Description

本発明は、灌流培養や細胞濃縮に用いることができる細胞分離装置及び細胞分離方法に関する。 The present invention relates to a cell separation device and a cell separation method that can be used for perfusion culture and cell concentration.

近年、生物由来の物質を有効成分とするバイオ医薬品の流通が拡大している。抗体医薬等のバイオ医薬品は、一般に、培養液中で浮遊細胞を培養し、目的の物質を培養液中に産生させることにより生産されている。また、各種の工業分野において、動物細胞、植物細胞、微生物細胞等を培養することにより、多様な有用物質が生産されている。 In recent years, the distribution of biopharmacy containing biological substances as active ingredients has been expanding. Biopharmacy such as antibody medicine is generally produced by culturing floating cells in a culture medium and producing a target substance in the culture medium. Further, in various industrial fields, various useful substances are produced by culturing animal cells, plant cells, microbial cells and the like.

培養方式としては、回分培養（Batch Culture）、流加培養（Fed-Batch Culture）、灌流培養（Perfusion Culture）がある。回分培養は、一回の培養毎に培地を用意し、培養中に培地を供給しない培養法である。流加培養は、培養中に系外から培地を供給するが培養が終わるまで培養液を排出しない培養法である。灌流培養は、培養中に連続的に培地を供給し、同量の培養液を連続的に排出させる培養法である。 The culture method includes batch culture (Batch Culture), fed-batch culture (Fed-Batch Culture), and perfusion culture (Perfusion Culture). The batch culture is a culture method in which a medium is prepared for each culture and no medium is supplied during the culture. Fed-batch culture is a culture method in which a medium is supplied from outside the system during culture, but the culture solution is not discharged until the culture is completed. Perfusion culture is a culture method in which a medium is continuously supplied during culture and the same amount of culture solution is continuously discharged.

回分培養は、播種した細胞を栄養が枯渇するまで培養する方式であるため、操作が簡単な利点がある。流加培養は、培養中の細胞に栄養を供給する方式であるため、回分培養よりも長期間の培養が可能であり、物質の生産量を比較的容易に向上させることができる。灌流培養は、栄養の濃度を高く維持しつつ老廃物の濃度を低減することができるため、培養条件を一定に保ち、物質を安定的に生産することができる。 Batch culture has the advantage of being easy to operate because it is a method of culturing the seeded cells until nutrients are depleted. Since fed-batch culture is a method of supplying nutrients to cells being cultured, it can be cultured for a longer period of time than batch culture, and the amount of substance produced can be improved relatively easily. In perfusion culture, the concentration of waste products can be reduced while maintaining a high concentration of nutrients, so that the culture conditions can be kept constant and substances can be stably produced.

灌流培養の運転方法としては、培養槽内の培養液を細胞と共に連続的に排出し、細胞を含む培養液を細胞分離器に送り、分離濃縮された細胞を培養槽に返送するのが一般的である。細胞分離器としては、培養されていた細胞と、細胞が産生した物質や老廃物等との分離に、遠心分離、重力分離、膜分離等の各種の原理を利用するものが知られている。 As a method of operating perfusion culture, it is common to continuously discharge the culture solution in the culture tank together with the cells, send the culture solution containing the cells to the cell separator, and return the separated and concentrated cells to the culture tank. Is. As a cell separator, a cell separator that uses various principles such as centrifugation, gravity separation, and membrane separation for separating cultured cells from substances and waste products produced by the cells is known.

特許文献１には、このような灌流培養に使用可能な生物反応装置が記載されている（図１等参照）。特許文献１の生物反応装置は、培養槽２と、ポンプ８と、ろ過器４と、を備えている。培養槽２内の生物培養液は、ポンプ８によって抜き出され、ろ過器４によってろ過液と微生物等濃縮液とに分離されている。分離された微生物等濃縮液は、培養槽２内に戻されている。 Patent Document 1 describes a biological reaction apparatus that can be used for such perfusion culture (see FIG. 1 and the like). The biological reaction apparatus of Patent Document 1 includes a culture tank 2, a pump 8, and a filter 4. The biological culture solution in the culture tank 2 is extracted by the pump 8 and separated into a filter solution and a concentrated solution such as microorganisms by the filter 4. The separated concentrated solution of microorganisms and the like is returned to the culture tank 2.

国際公開第２０１７／０２９８２３号International Publication No. 2017/029823

灌流培養に際して、培養槽内の培養液を細胞分離器に送るポンプとしては、無菌的な送液が可能であり、取り扱いが容易なペリスタルティックポンプが広く用いられている。しかし、ペリスタルティックポンプは、チューブを扱いて送液するため、移送される細胞を損傷し易い欠点を有している。 As a pump for sending the culture solution in the culture tank to the cell separator during perfusion culture, a peristaltic pump that can send aseptic solution and is easy to handle is widely used. However, since the peristaltic pump handles the tube and sends the liquid, it has a drawback that the transferred cells are easily damaged.

培養槽内の培養液を細胞分離器に送るポンプとしては、高流量や連続流の確保が容易な遠心ポンプ等を用いることも検討されている。しかし、遠心ポンプ等を用いる場合、細胞分離器への送液開始時に、培養槽から排出させた細胞を細胞分離器で分離して培養槽に戻す循環系の特性や、ポンプ自体の特性が原因で、細胞の損傷が顕著になる問題がある。 As a pump for sending the culture solution in the culture tank to the cell separator, it is also considered to use a centrifugal pump or the like which can easily secure a high flow rate and a continuous flow. However, when using a centrifugal pump or the like, the characteristics of the circulatory system in which the cells discharged from the culture tank are separated by the cell separator and returned to the culture tank at the start of liquid feeding to the cell separator, and the characteristics of the pump itself are the causes. Therefore, there is a problem that cell damage becomes remarkable.

培養槽から排出させた細胞を細胞分離器で分離して培養槽に戻す循環系では、ポンプによる送液開始時に、流体の慣性力やサイフォンの未形成等が理由で、大きな始動出力が必要になる。遠心ポンプ等は、培養液を加速させる際に定常運転時と比較して過剰な回転数を要し、回転数に比例して吐出量が過大となる。過大な流量で培養液を細胞分離器に送ると、流路が狭い箇所で大きなせん断応力が発生して細胞がダメージを受け易くなる。 In the circulatory system where cells discharged from the culture tank are separated by a cell separator and returned to the culture tank, a large starting output is required due to the inertial force of the fluid and the non-formation of the siphon at the start of liquid feeding by the pump. Become. Centrifugal pumps and the like require an excessive number of revolutions when accelerating the culture solution as compared with the case of steady operation, and the discharge amount becomes excessive in proportion to the number of revolutions. When the culture medium is sent to the cell separator at an excessive flow rate, a large shear stress is generated in a place where the flow path is narrow, and the cells are easily damaged.

そこで、本発明は、細胞を含む液体を細胞分離器に送る送液開始時に細胞へのダメージが低減する細胞分離装置及び細胞分離方法を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a cell separation device and a cell separation method that reduce damage to cells at the start of feeding a liquid containing cells to a cell separator.

本発明者らは、鋭意検討した結果、培養槽から排出させた細胞を細胞分離器で分離して培養槽に戻す循環系において、培養液の循環を開始させる際に吐出量が過大になるポンプを用いる場合であっても、送液開始時のみ、流路が狭い箇所を有する細胞分離器を迂回する流路に変更し、その後に吐出量を下げてから流路を戻すと、生細胞の減少が抑制されることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of diligent studies, the present inventors separated the cells discharged from the culture tank with a cell separator and returned them to the culture tank. Even when using, if the flow path is changed to a flow path that bypasses the cell separator having a narrow flow path only at the start of liquid feeding, and then the discharge rate is reduced and then the flow path is returned, the living cells We have found that the decrease is suppressed, and have completed the present invention.

すなわち、前記課題を解決するために本発明に係る細胞分離装置は、細胞を含む液体が用意される主槽と、前記主槽から排出された前記液体から前記細胞を分離する細胞分離器と、前記液体を前記主槽から前記細胞分離器に送る移送配管と、分離された前記細胞を前記細胞分離器から前記主槽に戻す返送配管と、前記移送配管から前記返送配管に前記細胞分離器を迂回して接続する迂回配管と、を備える。 That is, in order to solve the above problems, the cell separator according to the present invention includes a main tank in which a liquid containing cells is prepared, a cell separator that separates the cells from the liquid discharged from the main tank, and a cell separator. A transfer pipe for sending the liquid from the main tank to the cell separator, a return pipe for returning the separated cells from the cell separator to the main tank, and a cell separator from the transfer pipe to the return pipe. It is equipped with a detour pipe that detours and connects.

また、本発明に係る細胞分離方法は、液体から細胞を分離する細胞分離方法であって、細胞を含む液体が用意される主槽と、前記主槽から排出された前記液体から前記細胞を分離する細胞分離器と、前記液体を前記主槽から前記細胞分離器に送る移送配管と、分離された前記細胞を前記細胞分離器から前記主槽に戻す返送配管と、前記移送配管から前記返送配管に前記細胞分離器を迂回して接続する迂回配管と、を備える細胞分離装置において、前記主槽と前記細胞分離器との間に前記液体が循環し始める前の送液開始時には、前記主槽から排出された前記液体を、前記細胞分離器に送らず、前記迂回配管を通じて前記主槽に戻し、前記主槽と前記細胞分離器との間に前記液体が循環し始めた後の循環運転中には、前記主槽から排出された前記液体を、前記細胞分離器に送り、分離された前記細胞を前記主槽に戻す。 Further, the cell separation method according to the present invention is a cell separation method for separating cells from a liquid, in which the cells are separated from a main tank in which a liquid containing the cells is prepared and the liquid discharged from the main tank. A cell separator, a transfer pipe for sending the liquid from the main tank to the cell separator, a return pipe for returning the separated cells from the cell separator to the main tank, and a return pipe for returning the separated cells from the transfer pipe to the main tank. In a cell separation device including a detour pipe that bypasses and connects the cell separator, at the start of liquid feeding before the liquid starts to circulate between the main tank and the cell separator, the main tank The liquid discharged from the cell separator is not sent to the cell separator, but is returned to the main tank through the detour pipe, and during the circulation operation after the liquid starts to circulate between the main tank and the cell separator. The liquid discharged from the main tank is sent to the cell separator, and the separated cells are returned to the main tank.

本発明によると、細胞を含む液体を細胞分離器に送る送液開始時に細胞へのダメージが低減する細胞分離装置及び細胞分離方法を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a cell separation device and a cell separation method in which damage to cells is reduced at the start of feeding a liquid containing cells to a cell separator.

本発明の実施形態に係る細胞分離装置を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the cell separation apparatus which concerns on embodiment of this invention. 細胞分離装置の主槽の構成例を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the structural example of the main tank of a cell separation apparatus. 中空糸膜フィルタを備える細胞分離器を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the cell separator provided with the hollow fiber membrane filter. 中空糸膜フィルタの作用について説明する図である。It is a figure explaining the operation of the hollow fiber membrane filter. 接線流濾過方式の細胞分離器を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the cell separator of the tangential flow filtration type. 交互接線流濾過方式の細胞分離器を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the cell separator of the alternating tangential flow filtration type. 細胞分離器への流量と細胞の生存率との関係の解析結果を示す図である。It is a figure which shows the analysis result of the relationship between the flow rate to a cell separator and the cell viability. 細胞を含む液体の送液に使用可能な遠心ポンプの横断面図である。It is a cross-sectional view of a centrifugal pump that can be used for sending a liquid containing cells. 細胞を含む液体の送液に使用可能な遠心ポンプの縦断面図である。It is a longitudinal sectional view of a centrifugal pump that can be used for sending a liquid containing cells. ポンプの回転数と細胞分離器への流量との関係を示す図である。It is a figure which shows the relationship between the rotation speed of a pump, and the flow rate to a cell separator. 実施例１で用いた細胞分離装置を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the cell separation apparatus used in Example 1. FIG. 実施例１の細胞培養方法を示すフローチャートである。It is a flowchart which shows the cell culture method of Example 1. 実施例２で用いた細胞培養装置を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the cell culture apparatus used in Example 2. 実施例２の細胞培養方法を示すフローチャートである。It is a flowchart which shows the cell culture method of Example 2. 実施例３で用いた細胞分離装置を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the cell separation apparatus used in Example 3. 実施例３の細胞培養方法を示すフローチャートである。It is a flowchart which shows the cell culture method of Example 3.

以下、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置及び細胞培養方法について、図を参照しながら説明する。なお、以下の説明は、本発明の内容の具体例を示すものであり、本発明は、以下の説明に限定されるものではなく、本明細書に開示される技術的思想の範囲内において当業者による様々な変更が可能である。以下の各図において共通する構成については同一の符号を付し、重複した説明を省略する。 Hereinafter, the cell culture apparatus and the cell culture method according to the embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings. The following description shows specific examples of the contents of the present invention, and the present invention is not limited to the following description, and is within the scope of the technical idea disclosed in the present specification. Various changes can be made by the vendor. The same reference numerals are given to common configurations in the following figures, and duplicate description will be omitted.

図１は、本発明の実施形態に係る細胞分離装置を示す模式図である。
図１に示すように、本実施形態に係る細胞分離装置１は、主槽２と、細胞分離器３と、回収槽４と、移送配管５と、返送配管６と、抜出配管７と、迂回配管８と、循環ポンプ（送液装置）９と、抜出ポンプ１０と、第１バルブ（流路切替装置）１１と、第２バルブ（流路切替装置）１２と、調整バルブ１３と、流量センサ１４と、を備えている。 FIG. 1 is a schematic view showing a cell separation device according to an embodiment of the present invention.
As shown in FIG. 1, the cell separation device 1 according to the present embodiment includes a main tank 2, a cell separator 3, a recovery tank 4, a transfer pipe 5, a return pipe 6, a extraction pipe 7, and the extraction pipe 7. The detour pipe 8, the circulation pump (liquid feeding device) 9, the extraction pump 10, the first valve (flow path switching device) 11, the second valve (flow path switching device) 12, the adjusting valve 13, and the like. It includes a flow sensor 14.

細胞分離装置１は、細胞や、細胞が産生した物質、老廃物をはじめとする低分子等を含む液体を処理して、細胞と低分子等とを互いに分離する機能を備えている。細胞分離装置１では、主槽２に用意された細胞を含む液体が、細胞分離器３に送られ、細胞を高密度に含む液体と、低分子等を高密度に含む液体とに分離され、細胞を高密度に含む液体が、主槽２に戻される。 The cell separation device 1 has a function of processing a liquid containing cells, substances produced by the cells, small molecules such as waste products, and the like to separate the cells and the small molecules from each other. In the cell separation device 1, the liquid containing cells prepared in the main tank 2 is sent to the cell separator 3 and separated into a liquid containing cells at a high density and a liquid containing low molecules and the like at a high density. The liquid containing the cells at high density is returned to the main tank 2.

細胞分離装置１は、主槽２を細胞を培養するための培養槽として用いることによって、灌流培養に適用することができる。或いは、主槽２を細胞懸濁液を溜める貯留槽として用いることによって、液体中の細胞の数密度を向上させるための細胞濃縮処理に適用することができる。 The cell separation device 1 can be applied to perfusion culture by using the main tank 2 as a culture tank for culturing cells. Alternatively, by using the main tank 2 as a storage tank for storing the cell suspension, it can be applied to a cell concentration treatment for improving the number density of cells in a liquid.

細胞分離装置１で取り扱う細胞は、特に制限されるものではなく、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微細藻類、ラン藻類、細菌、酵母、真菌、藻類、酵母等のいずれであってもよい。取り扱う細胞としては、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体等の各種のモノクローナル抗体や、各種の生理活性物質や、その他、医薬品原料、化学原料、食品原料等として有用な各種の有用物質を産生する細胞が好ましい。 The cells handled by the cell separation device 1 are not particularly limited, and may be any of animal cells, insect cells, plant cells, microalgae, orchid algae, bacteria, yeast, fungi, algae, yeast and the like. The cells to be handled include, for example, various monoclonal antibodies such as human antibody, humanized antibody, chimeric antibody, mouse antibody, various physiologically active substances, and various other useful raw materials for pharmaceuticals, chemical raw materials, food raw materials, and the like. Cells that produce useful substances are preferred.

主槽２は、細胞を増殖又は生存維持させるための槽であり、ステンレス鋼、アルミニウム合金、プラスチック（樹脂）、ガラス等の適宜の材料で形成することができる。ステンレス鋼製の槽や容器は、洗浄性や滅菌性に優れており、繰り返しの使用に用いることができる。樹脂製の槽や容器は、ディスポーザブル品としての使用が可能であり、洗浄装置、滅菌装置等の設置を省略することができる。 The main tank 2 is a tank for proliferating or maintaining the survival of cells, and can be formed of an appropriate material such as stainless steel, aluminum alloy, plastic (resin), and glass. Stainless steel tanks and containers are excellent in detergency and sterility, and can be used repeatedly. Resin tanks and containers can be used as disposable products, and installation of cleaning equipment, sterilization equipment, etc. can be omitted.

主槽２は、可撓性の培養バックとして設けることもできる。可撓性の培養バックは、ディスポーザブル品としての使用が可能である。可撓性の培養バックは、例えば、エチレンビニルアセテート、エチレンビニルアルコール、低密度ポリエチレン、ポリアミド等の樹脂製の多層フィルムを用いて形成することができる。 The main tank 2 can also be provided as a flexible culture bag. The flexible culture bag can be used as a disposable product. The flexible culture bag can be formed using, for example, a multilayer film made of a resin such as ethylene vinyl acetate, ethylene vinyl alcohol, low density polyethylene, or polyamide.

図１に示すように、主槽２には、配管等を介して細胞分離器３が接続される。主槽２と細胞分離器３の入口とは、移送配管５によって接続される。移送配管５は、主槽２の槽内の細胞を含む液体を主槽２から細胞分離器３に送るための配管である。移送配管５には、細胞を含む液体を主槽２と細胞分離器３との間で循環させる循環ポンプ９と、循環する液体の流量ないし差圧を計測する流量センサ１４とが設置されている。 As shown in FIG. 1, a cell separator 3 is connected to the main tank 2 via a pipe or the like. The main tank 2 and the inlet of the cell separator 3 are connected by a transfer pipe 5. The transfer pipe 5 is a pipe for sending the liquid containing the cells in the main tank 2 from the main tank 2 to the cell separator 3. The transfer pipe 5 is provided with a circulation pump 9 that circulates a liquid containing cells between the main tank 2 and the cell separator 3, and a flow rate sensor 14 that measures the flow rate or differential pressure of the circulated liquid. ..

細胞分離器３は、主槽２から排出された細胞を含む液体から、膜分離の原理で細胞を分離する。細胞を含む液体は、細胞分離器３の入口から流入し、細胞の大きさに応じた孔径を持つ分離膜によって膜分離処理される。分離膜を透過せず一次側に濃縮された細胞は、細胞分離器３の一次側の出口から流出する。一方、分離膜を透過した低分子等を含む液体は、細胞分離器３の二次側の出口から流出する。 The cell separator 3 separates cells from the liquid containing the cells discharged from the main tank 2 by the principle of membrane separation. The liquid containing cells flows in from the entrance of the cell separator 3 and is subjected to membrane separation treatment by a separation membrane having a pore size corresponding to the size of the cells. The cells concentrated on the primary side without penetrating the separation membrane flow out from the outlet on the primary side of the cell separator 3. On the other hand, the liquid containing small molecules and the like that has permeated the separation membrane flows out from the outlet on the secondary side of the cell separator 3.

図１に示すように、細胞分離器３には、配管等を介して回収槽４が接続される。細胞分離器３の二次側の出口と回収槽４とは、抜出配管７によって接続される。抜出配管７は、細胞分離器３で細胞が分離された低分子等を、細胞分離器３から回収槽４に抜き出すための配管である。抜出配管７には、細胞分離器３の一次側の液体を吸引して透過液を回収槽４に送る抜出ポンプ１０と、透過液の流量を調整する調整バルブ１３が設置されている。 As shown in FIG. 1, a recovery tank 4 is connected to the cell separator 3 via a pipe or the like. The outlet on the secondary side of the cell separator 3 and the recovery tank 4 are connected by an extraction pipe 7. The extraction pipe 7 is a pipe for extracting small molecules or the like from which cells have been separated by the cell separator 3 from the cell separator 3 to the recovery tank 4. The extraction pipe 7 is provided with an extraction pump 10 that sucks the liquid on the primary side of the cell separator 3 and sends the permeate to the recovery tank 4, and an adjustment valve 13 that adjusts the flow rate of the permeate.

また、細胞分離器３の一次側の出口と主槽２とは、返送配管６によって接続される。返送配管６は、細胞分離器３で分離された細胞を、細胞分離器３から主槽２に戻すための配管である。主槽２、細胞分離器３、移送配管５及び返送配管６は、主槽２の槽内の細胞を含む液体を主槽２から排出して細胞分離器３に送り細胞分離器３から主槽２に戻す循環路を形成している。 Further, the outlet on the primary side of the cell separator 3 and the main tank 2 are connected by a return pipe 6. The return pipe 6 is a pipe for returning the cells separated by the cell separator 3 from the cell separator 3 to the main tank 2. The main tank 2, the cell separator 3, the transfer pipe 5, and the return pipe 6 discharge the liquid containing the cells in the tank of the main tank 2 from the main tank 2 and send it to the cell separator 3 from the cell separator 3 to the main tank. It forms a circulation path that returns to 2.

回収槽４は、細胞分離器３から抜き出された低分子等を含む液体を回収するための槽であり、ステンレス鋼、アルミニウム合金、プラスチック（樹脂）、ガラス等の適宜の材料で形成することができる。ステンレス鋼製の槽や容器は、洗浄性や滅菌性に優れており、繰り返しの使用に用いることができる。樹脂製の槽や容器は、ディスポーザブル品としての使用が可能であり、洗浄装置、滅菌装置等の設置を省略することができる。 The recovery tank 4 is a tank for recovering a liquid containing low molecules or the like extracted from the cell separator 3, and is formed of an appropriate material such as stainless steel, aluminum alloy, plastic (resin), or glass. Can be done. Stainless steel tanks and containers are excellent in detergency and sterility, and can be used repeatedly. Resin tanks and containers can be used as disposable products, and installation of cleaning equipment, sterilization equipment, etc. can be omitted.

回収槽４は、可撓性の培養バックとして設けることもできる。可撓性の培養バックは、ディスポーザブル品としての使用が可能である。また、回収槽４は、回収の目的に応じて、細胞が産生した生産物を適温で保存するための温度調節装置、細胞が産生した生産物を分離精製工程に送るための送液系統等を備えることができる。回収槽４は、細胞分離装置１で細胞濃縮処理のみを行う場合、設置が省略されてもよい。 The recovery tank 4 can also be provided as a flexible culture bag. The flexible culture bag can be used as a disposable product. Further, the recovery tank 4 includes a temperature control device for storing the product produced by the cells at an appropriate temperature, a liquid feeding system for sending the product produced by the cells to the separation and purification step, and the like, depending on the purpose of recovery. Can be prepared. Installation of the collection tank 4 may be omitted when only the cell concentration treatment is performed by the cell separation device 1.

図２は、細胞分離装置の主槽の構成例を示す模式図である。
図２に示すように、細胞分離装置１の主槽２は、灌流培養に必要な機器、配管等を備えることによって、細胞を培養するための培養槽として用いることができる。 FIG. 2 is a schematic view showing a configuration example of the main tank of the cell separation device.
As shown in FIG. 2, the main tank 2 of the cell separation device 1 can be used as a culture tank for culturing cells by providing equipment, piping, and the like necessary for perfusion culture.

培養槽としての主槽２は、培養液の温度を調節する温度調節装置２０や、培養液に空気、酸素、窒素、二酸化炭素等を通気する通気装置２１や、攪拌装置を構成する攪拌翼２２や、攪拌翼２２の回転運動を駆動するモータ２３や、槽内の培養環境や細胞の培養状態をモニタリングするセンサ２４を備えることができる。 The main tank 2 as a culture tank includes a temperature control device 20 for adjusting the temperature of the culture solution, a ventilation device 21 for aerating air, oxygen, nitrogen, carbon dioxide, etc. through the culture solution, and a stirring blade 22 constituting the stirring device. Alternatively, a motor 23 for driving the rotational movement of the stirring blade 22 and a sensor 24 for monitoring the culture environment in the tank and the culture state of cells can be provided.

また、主槽２は、細胞を培養するための液体培地が用意される培地容器２５と配管等を介して接続することができる。主槽２に培地容器２５を接続する配管には、培地容器２５の容器口を開閉して新鮮培地の必要時に培地容器２５を開状態にする開閉バルブ２６や、培地容器２５に用意された液体培地を主槽２に送液する供給ポンプ２７を備えることができる。 Further, the main tank 2 can be connected to a medium container 25 in which a liquid medium for culturing cells is prepared via a pipe or the like. The piping for connecting the medium container 25 to the main tank 2 includes an open / close valve 26 that opens and closes the container mouth of the medium container 25 to open the medium container 25 when necessary for fresh medium, and a liquid prepared in the medium container 25. A supply pump 27 for feeding the medium to the main tank 2 can be provided.

また、主槽２は、槽内の培養環境や灌流培養の運転を制御する制御装置２８を備えることができる。制御装置２８は、センサ２４による計測、既定の運転スケジュール等に基づいて、温度調節装置２０の作動・停止や温度出力、通気装置２１の作動・停止や通気量、モータ２３の作動・停止や回転数、開閉バルブ２６の開閉、供給ポンプ２７の作動・停止や吐出量等を制御する。 In addition, the main tank 2 can be provided with a control device 28 that controls the culture environment in the tank and the operation of perfusion culture. The control device 28 operates / stops the temperature control device 20 and outputs the temperature, operates / stops the ventilation device 21 and the amount of ventilation, and operates / stops and rotates the motor 23 based on the measurement by the sensor 24, the predetermined operation schedule, and the like. It controls the number, opening / closing of the opening / closing valve 26, operation / stop of the supply pump 27, discharge amount, and the like.

温度調節装置２０としては、例えば、ウォータージャケット、電熱ヒータ等を槽周囲に備えることができる。通気装置２１としては、液中通気のための散気管、スパージャの他に、気中通気のための通気管等を備えることができる。攪拌装置としては、攪拌翼２２を備える機械攪拌式装置に代えて、振盪攪拌式装置、エアーフロー攪拌式装置等を用いることもできる。 As the temperature control device 20, for example, a water jacket, an electric heater, or the like can be provided around the tank. The ventilation device 21 may include a ventilation pipe for air ventilation, a spurger, and a ventilation pipe for air ventilation. As the stirring device, a shaking stirring device, an air flow stirring device, or the like can be used instead of the mechanical stirring device provided with the stirring blade 22.

センサ２４としては、例えば、熱電対等の温度センサ、溶存酸素センサ、二酸化炭素センサ、ｐＨセンサ、静電容量計や吸光光度計等を用いたセルカウンタ等の一種以上を用いることができる。これらのセンサ２４は、主槽２の壁面や槽内等に備えることができる。 As the sensor 24, for example, one or more of a temperature sensor such as a thermocouple, a dissolved oxygen sensor, a carbon dioxide sensor, a pH sensor, a cell counter using a capacitance meter, an absorptiometer, or the like can be used. These sensors 24 can be provided on the wall surface of the main tank 2, the inside of the tank, or the like.

このように主槽２を培養槽として用いると、細胞分離装置１で灌流培養を行うことができる。灌流培養では、培地容器２５から主槽２に連続的に液体培地を供給し、主槽２の槽内の培養液を細胞分離器３に循環させて、細胞分離器３から液体培地の供給量と略同量の培養液を連続的又は逐次的に抜き出す。 When the main tank 2 is used as the culture tank in this way, perfusion culture can be performed by the cell separation device 1. In perfusion culture, the liquid medium is continuously supplied from the medium container 25 to the main tank 2, the culture solution in the tank of the main tank 2 is circulated to the cell separator 3, and the amount of the liquid medium supplied from the cell separator 3 Approximately the same amount of culture medium as above is withdrawn continuously or sequentially.

灌流培養中は、各種のセンサ２４で培養環境を計測することにより、所定の温度、ｐＨ、溶存酸素濃度等となるように、温度調節装置２０や、炭酸ガス通気、溶存酸素通気、窒素通気等を行う通気装置２１や、攪拌装置（２２，２３）等を制御する。灌流培養によると、主槽２で連続的に培養を行いつつ、生産物の回収や老廃物の除去を進めることが可能できる。主槽２内の培養環境を一定に保つことができるため、細胞による物質の生産を行う場合に、生産物の品質や生産量を安定させることができる。 During perfusion culture, the temperature control device 20, carbon dioxide gas aeration, dissolved oxygen aeration, nitrogen aeration, etc. are obtained so that the culture environment is measured by various sensors 24 to obtain a predetermined temperature, pH, dissolved oxygen concentration, etc. The ventilation device 21 and the stirring device (22, 23) are controlled. According to the perfusion culture, it is possible to proceed with the recovery of products and the removal of waste products while continuously culturing in the main tank 2. Since the culture environment in the main tank 2 can be kept constant, the quality and production amount of the product can be stabilized when the substance is produced by cells.

なお、細胞分離装置１の主槽２は、細胞懸濁液を溜める貯留槽として用いて、細胞濃縮処理に利用することもできる。貯留槽としての主槽２は、細胞懸濁液の温度を調節する温度調節装置や、細胞懸濁液に空気、酸素、窒素、二酸化炭素等を通気する通気装置や、攪拌装置等を備えることができる。 The main tank 2 of the cell separation device 1 can also be used as a storage tank for storing cell suspensions and used for cell concentration treatment. The main tank 2 as a storage tank is provided with a temperature control device for controlling the temperature of the cell suspension, a ventilation device for aerating air, oxygen, nitrogen, carbon dioxide, etc. in the cell suspension, a stirring device, and the like. Can be done.

図３Ａは、中空糸膜フィルタを備える細胞分離器を示す模式図である。図３Ｂは、中空糸膜フィルタの作用について説明する図である。図３Ｂは、図３ＡのＡ領域の中空糸膜フィルタ３０を拡大した模式図である。
図３Ａ及び図３Ｂに示すように、細胞分離装置１の細胞分離器３としては、中空糸膜フィルタを備える内圧濾過方式の装置を用いることができる。 FIG. 3A is a schematic view showing a cell separator equipped with a hollow fiber membrane filter. FIG. 3B is a diagram illustrating the operation of the hollow fiber membrane filter. FIG. 3B is an enlarged schematic view of the hollow fiber membrane filter 30 in the region A of FIG. 3A.
As shown in FIGS. 3A and 3B, as the cell separator 3 of the cell separator 1, an internal pressure filtration type device including a hollow fiber membrane filter can be used.

図３Ａに示す細胞分離器３は、複数の中空糸膜フィルタ３０と、中空糸膜フィルタ３０を収容するケーシング３１と、を備えている。ケーシング３１は、筒状に設けられており、一端側に入口側ヘッダ３１ａ、他端側に出口側ヘッダ３１ｂが取り付けられている。ケーシング３１の他端側には、流出口３１ｃが設けられている。 The cell separator 3 shown in FIG. 3A includes a plurality of hollow fiber membrane filters 30 and a casing 31 that houses the hollow fiber membrane filters 30. The casing 31 is provided in a tubular shape, and an inlet side header 31a is attached to one end side and an outlet side header 31b is attached to the other end side. An outlet 31c is provided on the other end side of the casing 31.

入口側ヘッダ３１ａには、中空糸膜フィルタ３０の一次側の入口が設けられており、各中空糸膜フィルタ３０の一端側が接続されている。また、出口側ヘッダ３１ｂには、中空糸膜フィルタ３０の一次側の出口が設けられており、各中空糸膜フィルタ３０の他端側が接続されている。 The inlet side header 31a is provided with an inlet on the primary side of the hollow fiber membrane filter 30, and one end side of each hollow fiber membrane filter 30 is connected to the header 31a. Further, the outlet side header 31b is provided with an outlet on the primary side of the hollow fiber membrane filter 30, and the other end side of each hollow fiber membrane filter 30 is connected to the header 31b.

中空糸膜フィルタ３０の内空は、入口側ヘッダ３１ａに設けられた一次側の入口と、出口側ヘッダ３１ｂに設けられた一次側の出口とに、それぞれ連通している。入口側ヘッダ３１ａには、移送配管５が接続され、出口側ヘッダ３１ｂには、返送配管６が接続される。ケーシング３１の内部の空間には、中空糸膜フィルタ３０の二次側の出口となる流出口３１ｃが開口している。流出口３１ｃには、抜出配管７が接続される。 The inner space of the hollow fiber membrane filter 30 communicates with the primary side inlet provided in the inlet side header 31a and the primary side outlet provided in the outlet side header 31b, respectively. A transfer pipe 5 is connected to the inlet side header 31a, and a return pipe 6 is connected to the outlet side header 31b. An outlet 31c, which is an outlet on the secondary side of the hollow fiber membrane filter 30, is opened in the space inside the casing 31. An outlet pipe 7 is connected to the outlet 31c.

図３Ａに示す細胞分離器３では、主槽２から供給される液体が、入口側ヘッダ３１ａから中空糸膜フィルタ３０の内空に流入して長さ方向に沿って流れる。中空糸膜フィルタ３０の二次側が陰圧にされると、図３Ｂに示すように、中空糸膜フィルタ３０の細孔３２よりも小さい物質３３は、細孔３２を通じて一次側から二次側に透過して流出口３１ｃから流出する。一方、細孔３２よりも大きい物質３４は、一次側から二次側に透過せず、中空糸膜フィルタ３０の内空を長さ方向に沿って流れて出口側ヘッダ３１ｂから流出する。 In the cell separator 3 shown in FIG. 3A, the liquid supplied from the main tank 2 flows into the inner space of the hollow fiber membrane filter 30 from the inlet side header 31a and flows along the length direction. When the secondary side of the hollow fiber membrane filter 30 is subjected to negative pressure, as shown in FIG. 3B, the substance 33 smaller than the pores 32 of the hollow fiber membrane filter 30 moves from the primary side to the secondary side through the pores 32. It permeates and flows out from the outlet 31c. On the other hand, the substance 34 larger than the pores 32 does not permeate from the primary side to the secondary side, flows through the inner space of the hollow fiber membrane filter 30 along the length direction, and flows out from the outlet side header 31b.

中空糸膜フィルタ３０の孔径は、細胞の大きさ（直径）の５分の１以下であることが好ましい。このような孔径であると、サイズ分画用フィルタとしての一般的特性から、分離の対象となる細胞について十分に高い阻止率を確保しつつ、細胞よりも小さい生産物、老廃物等の低分子を高い透過率で分離することができる。中空糸膜フィルタ３０の孔径は、細胞の大きさにもよるが、好ましくは５μｍ以下、より好ましくは２μｍ以下である。 The pore size of the hollow fiber membrane filter 30 is preferably one-fifth or less of the cell size (diameter). With such a pore size, due to the general characteristics of a filter for size fractionation, small molecules such as products and waste products smaller than the cells can be secured while ensuring a sufficiently high inhibition rate for the cells to be separated. Can be separated with high transmittance. The pore size of the hollow fiber membrane filter 30 is preferably 5 μm or less, more preferably 2 μm or less, although it depends on the cell size.

図４Ａは、接線流濾過方式の細胞分離器を示す模式図である。図４Ｂは、交互接線流濾過方式の細胞分離器を示す模式図である。
細胞分離に用いられる一般的な濾過方式としては、図４Ａに示すような接線流濾過（Tangential Flow Filtration：ＴＦＦ）方式や、図４Ｂに示すような交互接線流濾過（Alternating Tangential Flow Filtration：ＡＴＦ）方式がある。 FIG. 4A is a schematic view showing a tangential flow filtration type cell separator. FIG. 4B is a schematic view showing a cell separator of an alternating tangential flow filtration method.
Common filtration methods used for cell separation include the Tangent Flow Filtration (TFF) method as shown in FIG. 4A and the Alternating Tangential Flow Filtration (ATF) as shown in FIG. 4B. There is a method.

図４Ａに示すＴＦＦ方式では、被処理液体が、中空糸膜フィルタ３０の接線方向に沿って一方向に流され、二次側が陰圧にされることによってクロスフロー濾過される。一方、図４Ｂに示すＡＴＦ方式では、被処理液体が、ダイアフラムポンプ３５によって吸引・放出を交互に繰り返され、中空糸膜フィルタ３０の接線方向に沿って移動する間に、二次側が陰圧にされることによってクロスフロー濾過される。 In the TFF method shown in FIG. 4A, the liquid to be treated is flowed in one direction along the tangential direction of the hollow fiber membrane filter 30, and the secondary side is negatively pressured to perform cross-flow filtration. On the other hand, in the ATF method shown in FIG. 4B, the liquid to be treated is alternately sucked and discharged by the diaphragm pump 35, and while moving along the tangential direction of the hollow fiber membrane filter 30, the secondary side becomes negative pressure. By being cross-flow filtered.

ＡＴＦ方式によると、ダイアフラムポンプ３５が送液に用いられるため、ペリスタルティックポンプ等と比較して、送液動作による細胞へのダメージが少なくなる。しかし、ＡＴＦ方式は、被処理液体の脈動が発生し易く、連続流による一定的な処理を行えない方式であり、高流量を実現するにあたり、装置が高コストになる難点がある。 According to the ATF method, since the diaphragm pump 35 is used for liquid feeding, damage to cells due to the liquid feeding operation is reduced as compared with a peristaltic pump or the like. However, the ATF method is a method in which pulsation of the liquid to be processed is likely to occur and constant processing by continuous flow cannot be performed, and there is a problem that the device becomes expensive in realizing a high flow rate.

一方、ＴＦＦ方式によると、連続流を用いて処理を一定的に進めることができるし、高流量を比較的容易に実現できる利点がある。図３に示したように、内圧濾過方式で膜分離処理を行うと、細胞分離の速度的効率が高められる。ＴＦＦ方式では、細胞を含む液体を細胞分離器に送るポンプとして、高流量や連続流の確保が容易な遠心ポンプ等を用いることができる。 On the other hand, according to the TFF method, there is an advantage that the processing can be carried out constantly by using a continuous flow and a high flow rate can be realized relatively easily. As shown in FIG. 3, when the membrane separation treatment is performed by the internal pressure filtration method, the speed efficiency of cell separation is improved. In the TFF method, as a pump that sends a liquid containing cells to a cell separator, a centrifugal pump or the like that can easily secure a high flow rate or a continuous flow can be used.

しかし、細胞分離される細胞が循環する循環系は、流路が狭い箇所を有する細胞分離器を備えている。図３に示したような、中空糸膜フィルタ３０の内空や、入口側ヘッダ３１ａや出口側ヘッダ３１ｂの内部は、送液に用いられる一般的な配管と比較して、流路断面積が小さい箇所となる。これらの箇所に高流量の液体が流入すると、流速が大幅に上昇し、大きなせん断応力が発生するため、細胞へのダメージが問題となる。 However, the circulatory system in which the cells to be separated are circulated includes a cell separator having a narrow flow path. As shown in FIG. 3, the inner space of the hollow fiber membrane filter 30 and the inside of the inlet side header 31a and the outlet side header 31b have a flow path cross-sectional area as compared with a general pipe used for liquid feeding. It will be a small part. When a high flow rate liquid flows into these locations, the flow velocity increases significantly and a large shear stress is generated, which causes damage to cells.

図５は、細胞分離器への流量と細胞の生存率との関係の解析結果を示す図である。
図５には、主槽２から排出させた細胞を細胞分離器３で分離して主槽２に戻す循環路に、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）の培養液を循環させたときの、細胞分離器３への循環流量の変化に対する生細胞数（生存率）の変化を解析した結果を示す。 FIG. 5 is a diagram showing analysis results of the relationship between the flow rate to the cell separator and the cell viability.
FIG. 5 shows cells when a culture solution of Chinese hamster ovary cells (CHO cells) was circulated in a circulation path in which cells discharged from the main tank 2 were separated by a cell separator 3 and returned to the main tank 2. The result of analyzing the change in the number of living cells (survival rate) with respect to the change in the circulation flow rate to the separator 3 is shown.

図５に示すように、流量が３０ｍＬ／ｍｉｎ以下であると、循環を開始して１日後の生存率が、循環開始前の数値に近い高生存率に保たれている。一方、流量が３０ｍＬ／ｍｉｎより高いと、循環を開始して１日後の生存率が、大きく低下している。流路が狭い箇所を有する細胞分離器３に、細胞を含む液体が高流量で送られると、生細胞数が減少することが確認できる。 As shown in FIG. 5, when the flow rate is 30 mL / min or less, the survival rate one day after the start of circulation is maintained at a high survival rate close to the value before the start of circulation. On the other hand, when the flow rate is higher than 30 mL / min, the survival rate one day after the start of circulation is greatly reduced. It can be confirmed that the number of viable cells decreases when the liquid containing the cells is sent at a high flow rate to the cell separator 3 having a narrow flow path.

図６は、細胞を含む液体の送液に使用可能な遠心ポンプの横断面図である。図７は、細胞を含む液体の送液に使用可能な遠心ポンプの縦断面図である。
図６及び図７に示すように、主槽２から排出させた細胞を細胞分離器３で分離して主槽２に戻す循環路には、細胞を含む液体を循環させる循環ポンプ（送液装置）９として、高流量や連続流の確保が容易な遠心ポンプ４０を用いることができる。 FIG. 6 is a cross-sectional view of a centrifugal pump that can be used to feed a liquid containing cells. FIG. 7 is a vertical cross-sectional view of a centrifugal pump that can be used to feed a liquid containing cells.
As shown in FIGS. 6 and 7, a circulation pump (liquid feeding device) that circulates a liquid containing cells in a circulation path in which cells discharged from the main tank 2 are separated by a cell separator 3 and returned to the main tank 2. ) 9, a centrifugal pump 40 can be used, which makes it easy to secure a high flow rate and a continuous flow.

遠心ポンプ４０は、インペラ４１と、インペラ４１を収容するチャンバが内部に設けられたケーシング４２と、チャンバ内に液体を吸い込むインレット４３と、チャンバ内から液体を吐き出すアウトレット４４と、インペラ４１に回転動力を伝達するシャフト４５と、シャフト４５の回転を駆動するモータ４６と、を備えている。 The centrifugal pump 40 has an impeller 41, a casing 42 having a chamber for accommodating the impeller 41 inside, an inlet 43 for sucking liquid into the chamber, an outlet 44 for discharging liquid from the chamber, and rotational power to the impeller 41. A shaft 45 for transmitting the above speed and a motor 46 for driving the rotation of the shaft 45 are provided.

ケーシング４２は、概略形状が中空円盤状であり、内部に渦巻き形のチャンバが設けられている。インペラ４１は、側板を持たない開放型であり、ケーシング４２内のチャンバに収容されている。インレット４３は、ケーシング４２の上部の中央付近に開口している。アウトレット４４は、ケーシング４２の側部から接線状に延びたポートの先端に開口している。 The casing 42 has a substantially hollow disk shape, and is provided with a spiral chamber inside. The impeller 41 is an open type having no side plate, and is housed in a chamber inside the casing 42. The inlet 43 is open near the center of the upper part of the casing 42. The outlet 44 opens at the tip of a port tangentially extending from the side of the casing 42.

インペラ４１の中心は、シャフト４５の先端に固定されている。シャフト４５の基端は、回転可能にモータ４６に連結されている。モータ４６が作動すると、インペラ４１が回転運動して、インレット４３から液体が吸い込まれる。吸い込まれた液体は、インペラ４１によってチャンバ内で昇圧されて、アウトレット４４から吐き出される。 The center of the impeller 41 is fixed to the tip of the shaft 45. The base end of the shaft 45 is rotatably connected to the motor 46. When the motor 46 operates, the impeller 41 rotates and the liquid is sucked from the inlet 43. The sucked liquid is boosted in the chamber by the impeller 41 and discharged from the outlet 44.

遠心ポンプ４０によると、細胞を含む液体を高流量で連続的に循環させることができるため、細胞分離器３への通液量を多くして、効率的な灌流培養や細胞分離を行うことができる。 According to the centrifugal pump 40, the liquid containing cells can be continuously circulated at a high flow rate, so that the amount of liquid passing through the cell separator 3 can be increased to perform efficient perfusion culture and cell separation. it can.

但し、遠心ポンプは、液体の送液開始時に、定常運転時と比較して過剰な回転数を要し、回転数に比例して吐出量が過大となる一般的特性を有している。流路が狭い箇所を有する細胞分離器３に高流量の液体が流入すると、流速が大幅に上昇し、大きなせん断応力が発生するため、送液開始時において、細胞へのダメージが顕著になる。 However, the centrifugal pump has a general characteristic that an excessive rotation speed is required at the start of liquid feeding as compared with the steady operation, and the discharge amount becomes excessive in proportion to the rotation speed. When a high flow rate liquid flows into the cell separator 3 having a narrow flow path, the flow velocity increases significantly and a large shear stress is generated, so that the damage to the cells becomes remarkable at the start of the liquid feeding.

図８は、ポンプの回転数と細胞分離器への流量との関係を示す図である。
図８には、主槽２から排出させた細胞を細胞分離器３で分離して主槽２に戻す循環路に、細胞を含む液体を循環させる循環ポンプ（送液装置）９として、遠心ポンプを設置したときの、ポンプの回転数の変化に対する細胞分離器３への循環流量の変化を計測した結果を示す。 FIG. 8 is a diagram showing the relationship between the rotation speed of the pump and the flow rate to the cell separator.
FIG. 8 shows a centrifugal pump as a circulation pump (liquid feeding device) 9 for circulating a liquid containing cells in a circulation path in which cells discharged from the main tank 2 are separated by a cell separator 3 and returned to the main tank 2. The result of measuring the change of the circulation flow rate to the cell separator 3 with respect to the change of the pump rotation speed at the time of setting is shown.

図８に示すように、この試験系において、遠心ポンプは、液体の循環を開始するのに、６０００ｒｐｍ弱の回転数を要している。遠心ポンプによる送液開始の直後には、液体が循環路を一周してなく、液体の循環が開始していない。しかし、回転数が６０００ｒｐｍ弱になると、細胞分離器３への循環流量が急激に立ち上がっている。６０００ｒｐｍの回転数において、細胞分離器３への循環流量は、２２２ｍＬ／ｍｉｎに上昇している。 As shown in FIG. 8, in this test system, the centrifugal pump requires a rotation speed of less than 6000 rpm to start the circulation of the liquid. Immediately after the start of liquid feeding by the centrifugal pump, the liquid did not go around the circulation path and the liquid circulation did not start. However, when the rotation speed becomes less than 6000 rpm, the circulating flow rate to the cell separator 3 suddenly rises. At a rotation speed of 6000 rpm, the circulating flow rate to the cell separator 3 has increased to 222 mL / min.

遠心ポンプの吐出量や揚程は、回転数に比例して上昇するが、循環路で液体の循環を開始させるためには、大きな始動出力が必要である。液体が循環し始める前の送液開始時には、循環路に液体が満たされていないため、サイフォンが未形成である。液体の循環を開始させるためには、液体を慣性力に逆らって加速させることや、細胞分離器３等の高さまで揚水することが必要である。 The discharge amount and head of the centrifugal pump increase in proportion to the number of revolutions, but a large starting output is required to start the circulation of the liquid in the circulation path. At the start of liquid feeding before the liquid begins to circulate, the siphon is not formed because the circulation path is not filled with the liquid. In order to start the circulation of the liquid, it is necessary to accelerate the liquid against the inertial force and to pump the water to the height of the cell separator 3 or the like.

一方、液体が一周して循環し始めた後の循環運転中には、液体の慣性やサイフォンが働くため、回転数をある程度下げても、液体が循環し続ける。そのため、液体の循環を開始させる際には、定常運転時と比較して過剰な回転数を要することになる。回転数に比例して吐出量が大きくなるが、液体の循環が開始した後には、高圧が加わるため、遠心ポンプの回転数を下げる必要がある。 On the other hand, during the circulation operation after the liquid has made a round and started to circulate, the inertia of the liquid and the siphon work, so that the liquid continues to circulate even if the rotation speed is lowered to some extent. Therefore, when starting the circulation of the liquid, an excessive number of rotations is required as compared with the steady operation. The discharge amount increases in proportion to the rotation speed, but after the liquid circulation starts, a high pressure is applied, so it is necessary to reduce the rotation speed of the centrifugal pump.

このようなポンプ自体の特性は、細胞分離される細胞が循環する循環系において、細胞へのダメージを大きくする要因となる。そこで、細胞分離装置１では、主槽２と細胞分離器３との間に液体が循環し始める前の送液開始時と、主槽２と細胞分離器３との間に液体が循環し始めた後の循環運転中とで、液体の流路を切り替えて細胞分離処理を行う。 Such characteristics of the pump itself become a factor that increases damage to cells in the circulatory system in which cells to be separated are circulated. Therefore, in the cell separator 1, the liquid starts to circulate between the main tank 2 and the cell separator 3 at the start of the liquid feeding before the liquid starts to circulate between the main tank 2 and the cell separator 3. After that, the flow path of the liquid is switched between during the circulation operation and the cell separation process is performed.

図１に示すように、迂回配管８は、移送配管５から返送配管６に細胞分離器３を迂回して接続される。迂回配管８は、主槽２から排出された細胞を含む液体を、細胞分離器３に流入させず、細胞分離器３を迂回させて主槽２に戻すための配管である。迂回配管８は、循環的な送液の観点からは、移送配管５上の循環ポンプ９よりも下流から分岐するように設けることが好ましい。 As shown in FIG. 1, the detour pipe 8 is connected from the transfer pipe 5 to the return pipe 6 by bypassing the cell separator 3. The detour pipe 8 is a pipe for bypassing the cell separator 3 and returning it to the main tank 2 without allowing the liquid containing the cells discharged from the main tank 2 to flow into the cell separator 3. From the viewpoint of circulating liquid feeding, the detour pipe 8 is preferably provided so as to branch from the downstream side of the circulation pump 9 on the transfer pipe 5.

迂回配管８の内径は、細胞分離器３内の流路の内径よりも大きく設けられる。迂回配管８の内径は、細胞分離器３内の流路の断面積で換算して得られる流路の内径の２倍以上であることが好ましく、５倍以下であることが好ましい。迂回配管８がこのような内径であると、液体の循環に長い時間をかけず、迂回配管８の側における流速を十分に抑制することができる。流路の断面積で換算した内径値は、その流路の断面積と等しい面積を持つ円の直径を計算して求めることができる。 The inner diameter of the bypass pipe 8 is provided to be larger than the inner diameter of the flow path in the cell separator 3. The inner diameter of the detour pipe 8 is preferably twice or more, and preferably five times or less, the inner diameter of the flow path obtained by converting the cross-sectional area of the flow path in the cell separator 3. When the bypass pipe 8 has such an inner diameter, the liquid circulation does not take a long time, and the flow velocity on the side of the bypass pipe 8 can be sufficiently suppressed. The inner diameter value converted by the cross-sectional area of the flow path can be obtained by calculating the diameter of a circle having an area equal to the cross-sectional area of the flow path.

図１に示すように、細胞分離装置１は、主槽２から排出された液体の流路を細胞分離器３と迂回配管８との間で切り替える流路切替装置として、第１バルブ１１と、第２バルブ１２と、を備えている。第１バルブ１１は、移送配管５上の迂回配管８の接続点よりも下流、且つ、細胞分離器３よりも上流に設けられている。第２バルブ１２は、迂回配管８に設けられている。 As shown in FIG. 1, the cell separation device 1 includes a first valve 11 as a flow path switching device for switching the flow path of the liquid discharged from the main tank 2 between the cell separator 3 and the detour pipe 8. It includes a second valve 12. The first valve 11 is provided downstream from the connection point of the detour pipe 8 on the transfer pipe 5 and upstream from the cell separator 3. The second valve 12 is provided in the detour pipe 8.

細胞分離装置１において、主槽２と細胞分離器３との間に液体が循環し始める前の送液開始時には、第１バルブ１１を閉じ、第２バルブ１２を開いて、迂回配管８の側に流路を切り替える。このような切り替えにより、主槽２から排出された液体を、細胞分離器３に送らず、迂回配管８を通じて主槽２に戻す。 In the cell separation device 1, at the start of liquid feeding before the liquid starts to circulate between the main tank 2 and the cell separator 3, the first valve 11 is closed, the second valve 12 is opened, and the side of the detour pipe 8 is opened. Switch the flow path to. By such switching, the liquid discharged from the main tank 2 is returned to the main tank 2 through the detour pipe 8 without being sent to the cell separator 3.

迂回配管８の側に流路を切り替えた運転は、循環ポンプ９の起動後、少なくとも液体が一周して循環路に満たされるまで行う。このような運転は、液体が一周して循環路に満たされた後、細胞分離器３への循環流量が安定するまで行うことが好ましい。 The operation of switching the flow path to the detour pipe 8 side is performed after the circulation pump 9 is started until at least the liquid goes around and fills the circulation path. It is preferable to perform such an operation until the circulation flow rate to the cell separator 3 becomes stable after the liquid goes around and fills the circulation path.

一方、細胞分離装置１において、主槽２と細胞分離器３との間に液体が循環し始めた後の循環運転中には、第１バルブ１１を開き、第２バルブ１２を閉じて、細胞分離器３の側に流路を切り替える。このような切り替えにより、主槽２から排出された液体を、細胞分離器３に送り、分離された細胞を主槽２に戻す。 On the other hand, in the cell separator 1, during the circulation operation after the liquid starts to circulate between the main tank 2 and the cell separator 3, the first valve 11 is opened, the second valve 12 is closed, and the cells are closed. The flow path is switched to the side of the separator 3. By such switching, the liquid discharged from the main tank 2 is sent to the cell separator 3, and the separated cells are returned to the main tank 2.

細胞分離器３の側に流路を切り替えた運転は、循環ポンプ９の回転数や吐出量を、定常運転時の回転数や吐出量に下げてから行うことが好ましい。定常運転時の回転数や吐出量としては、送液開始時よりも低い適宜の条件に設定することができるが、細胞が実質的にダメージを受けない条件であることが好ましい。細胞分離器３の側への切り替えは、流量センサ１４によって計測される循環流量が、所定流量を超えたとき、所定流量を超えた状態が所定時間持続したとき等に行うことができる。 It is preferable that the operation of switching the flow path to the cell separator 3 side is performed after reducing the rotation speed and the discharge amount of the circulation pump 9 to the rotation speed and the discharge amount in the steady operation. The rotation speed and the discharge amount during steady operation can be set to appropriate conditions lower than those at the start of liquid feeding, but it is preferable that the cells are not substantially damaged. The switching to the cell separator 3 side can be performed when the circulating flow rate measured by the flow rate sensor 14 exceeds a predetermined flow rate, or when the state exceeding the predetermined flow rate continues for a predetermined time.

循環路を流される液体の流量は、主槽２と細胞分離器３との間に液体が循環し始める前の送液開始時には、３０ｍＬ／ｍｉｎを超える流量であることが好ましい。このような流量であると、細胞分離器３への通液量が多くなり、細胞分離処理の効率が向上する。流路が狭い箇所を有する細胞分離器３に液体を流入させた場合に、大きなせん断応力が発生して細胞へのダメージが顕著になるが、迂回配管８の側に流路を切り替える運転がより有効になる。 The flow rate of the liquid flowing through the circulation path is preferably more than 30 mL / min at the start of liquid feeding before the liquid starts to circulate between the main tank 2 and the cell separator 3. With such a flow rate, the amount of liquid passing through the cell separator 3 increases, and the efficiency of the cell separation process is improved. When a liquid is flowed into a cell separator 3 having a narrow flow path, a large shear stress is generated and damage to cells becomes remarkable, but the operation of switching the flow path to the detour pipe 8 side is more effective. validate.

また、循環路を流される液体の流量は、主槽２と細胞分離器３との間に液体が循環し始めた後の循環運転中には、３０ｍＬ／ｍｉｎ以下の流量であることが好ましい。このような流量であると、流路が狭い箇所を有する細胞分離器３に液体を流入させたとしても、大きなせん断応力が発生せず、細胞へのダメージがより低減するため、生細胞数をより高く保つことができる。 Further, the flow rate of the liquid flowing through the circulation path is preferably 30 mL / min or less during the circulation operation after the liquid starts to circulate between the main tank 2 and the cell separator 3. With such a flow rate, even if the liquid is flowed into the cell separator 3 having a narrow flow path, a large shear stress is not generated and the damage to the cells is further reduced, so that the number of living cells can be increased. Can be kept higher.

なお、図１において、流路切替装置としては、第１バルブ１１と、第２バルブ１２と、が備えられている。第１バルブ１１と第２バルブ１２によると、流路を簡単な機器構成で独立的に制御することができる。但し、流路切替装置としては、移送配管５上の迂回配管８の接続点に、三方弁等を備えてもよい。 In FIG. 1, the flow path switching device includes a first valve 11 and a second valve 12. According to the first valve 11 and the second valve 12, the flow path can be controlled independently with a simple device configuration. However, as the flow path switching device, a three-way valve or the like may be provided at the connection point of the bypass pipe 8 on the transfer pipe 5.

移送配管５、返送配管６、迂回配管８及び抜出配管７は、ステンレス鋼等の金属や、シリコンゴム等の樹脂等の適宜の材料で形成することができる。金属製の配管は、蒸気滅菌等で滅菌が可能であり、繰り返し使用することができる。樹脂製の配管は、ガンマ線滅菌、紫外線滅菌等で滅菌が可能であり、ディスポーザブル品としての使用も可能である。 The transfer pipe 5, the return pipe 6, the detour pipe 8, and the extraction pipe 7 can be formed of an appropriate material such as a metal such as stainless steel or a resin such as silicon rubber. The metal pipe can be sterilized by steam sterilization or the like and can be used repeatedly. Resin pipes can be sterilized by gamma ray sterilization, ultraviolet sterilization, etc., and can also be used as disposable products.

主槽２及び回収槽４のうちの一以上は、樹脂製の槽や容器であることが好ましい。また、移送配管５、返送配管６、迂回配管８及び抜出配管７のうちの一以上は、樹脂製の配管であることが好ましい。樹脂製の槽・容器や配管は、ディスポーザブル品としての使用が可能であるため、コンタミネーションのリスクを低減することができるし、洗浄装置、滅菌装置等の設置を省略することができる。 It is preferable that one or more of the main tank 2 and the recovery tank 4 is a resin tank or container. Further, it is preferable that one or more of the transfer pipe 5, the return pipe 6, the detour pipe 8, and the extraction pipe 7 are made of resin. Since the resin tank / container and piping can be used as disposable products, the risk of contamination can be reduced, and the installation of cleaning equipment, sterilization equipment, etc. can be omitted.

移送配管５、返送配管６、迂回配管８及び抜出配管７のうちの一以上は、主槽２、回収槽４、循環ポンプ９等に対してや配管同士が、無菌コネクタで接続されていることが好ましい。配管が無菌コネクタで接続される形態であると、接続後の滅菌が不要になるため、ディスポーザブル品を容易に利用することができる。 One or more of the transfer pipe 5, the return pipe 6, the bypass pipe 8, and the extraction pipe 7 shall be connected to the main tank 2, the recovery tank 4, the circulation pump 9, etc., and the pipes shall be connected to each other by a sterile connector. Is preferable. If the pipes are connected by an aseptic connector, sterilization after the connection is not required, so that a disposable product can be easily used.

無菌コネクタとしては、配管内の無菌状態を維持したまま接続可能な各種のコネクタを用いることができる。無菌コネクタとしては、例えば、接続後に除去可能な隔膜を備えたコネクタや、嵌合、螺合等の接続動作又は操作で開く隔壁を備えたコネクタや、接続動作で破壊されるシールを備えたコネクタ等が挙げられる。 As the aseptic connector, various connectors that can be connected while maintaining the aseptic state in the pipe can be used. Aseptic connectors include, for example, a connector having a diaphragm that can be removed after connection, a connector having a partition wall that opens by a connection operation such as fitting or screwing, or a connector having a seal that is destroyed by the connection operation. And so on.

以上の細胞分離装置１によると、迂回配管８が備えられているため、細胞分離器３への循環流量が過大となる送液開始時に、細胞を含む液体を、細胞分離器３に流入させず、細胞分離器３を迂回させることができる。流路が狭い箇所を有する細胞分離器３に、高流量の液体が流入しなくなるため、送液開始時に細胞へのダメージが低減される細胞分離処理が可能になる。細胞の損傷が少なくなり、細胞由来の不純物が低減するため、より高い生細胞数を維持しながら灌流培養や細胞濃縮処理を継続して、高品質の生産物や細胞濃縮液を効率的に得ることができる。 According to the above cell separator 1, since the detour pipe 8 is provided, the liquid containing cells does not flow into the cell separator 3 at the start of liquid feeding when the circulation flow rate to the cell separator 3 becomes excessive. , The cell separator 3 can be bypassed. Since the high flow rate liquid does not flow into the cell separator 3 having a narrow flow path, it is possible to perform a cell separation process in which damage to cells is reduced at the start of liquid feeding. Since cell damage is reduced and cell-derived impurities are reduced, perfusion culture and cell concentration treatment are continued while maintaining a higher viable cell number to efficiently obtain high-quality products and cell concentrates. be able to.

以上、本発明について説明したが、本発明は、前記の実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。例えば、本発明は、必ずしも前記の実施形態が備える全ての構成を備えるものに限定されない。或る実施形態の構成の一部を他の構成に置き換えたり、或る実施形態の構成の一部を他の形態に追加したり、或る実施形態の構成の一部を省略したりすることができる。 Although the present invention has been described above, the present invention is not limited to the above-described embodiment, and various modifications can be made without departing from the spirit of the present invention. For example, the present invention is not necessarily limited to those having all the configurations included in the above-described embodiment. Replacing part of the configuration of one embodiment with another, adding part of the configuration of one embodiment to another, or omitting part of the configuration of one embodiment. Can be done.

例えば、前記の細胞分離装置１は、主槽、回収槽、細胞分離器等の形状・型式や、送液装置、バルブ等の機器の型式・配置や、配管の接続等が、発明の趣旨を逸脱しない限り、特に制限されるものではない。循環ポンプ９としては、ガス圧で送液を駆動する加圧ポンプ等を備えてもよい。加圧ポンプは、密閉された主槽２に高圧ガスを無菌的に供給し、細胞を含む液体が、所定の高圧に調整された主槽１内と下流側との圧力差によって移送されるように構成される。加圧ポンプによると、移送される液体が送液装置に接触しないため、コンタミネーションのリスクを低減することができる。 For example, the purpose of the invention of the cell separation device 1 is that the shape / model of the main tank, collection tank, cell separator, etc., the model / arrangement of equipment such as a liquid feeding device, a valve, the connection of pipes, etc. As long as it does not deviate, there are no particular restrictions. The circulation pump 9 may include a pressurizing pump or the like that drives the liquid feed by gas pressure. The pressurizing pump aseptically supplies high-pressure gas to the closed main tank 2 so that the liquid containing cells is transferred by the pressure difference between the inside of the main tank 1 adjusted to a predetermined high pressure and the downstream side. It is composed of. According to the pressurizing pump, the liquid to be transferred does not come into contact with the liquid feeding device, so that the risk of contamination can be reduced.

以下、実施例を示して本発明について具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited thereto.

＜実施例１：灌流培養＞
循環系における送液開始時に、細胞分離器を迂回させる細胞分離方法を用いて、ＣＨＯ細胞の灌流培養を行った。 <Example 1: Perfusion culture>
Perfusion culture of CHO cells was performed using a cell separation method that bypasses the cell separator at the start of fluid delivery in the circulatory system.

図９は、実施例１で用いた細胞分離装置を示す模式図である。
灌流培養には、新鮮培地を用意した培地容器２５を主槽２に接続した図９に示す細胞分離装置を用いた。主槽２としては、容量が１Ｌの培養容器を用いた。培養条件は、灌流培養中に、３７℃、ｐＨ７．２、溶存酸素濃度：２．７ｐｐｍの一定値に制御した。 FIG. 9 is a schematic view showing the cell separation device used in Example 1.
For the perfusion culture, the cell separator shown in FIG. 9 in which the medium container 25 prepared with the fresh medium was connected to the main tank 2 was used. As the main tank 2, a culture vessel having a capacity of 1 L was used. The culture conditions were controlled to a constant value of 37 ° C., pH 7.2, and dissolved oxygen concentration: 2.7 ppm during perfusion culture.

図１０は、実施例１の細胞分離方法を示すフローチャートである。
図１０に示すように、はじめに、主槽２において、ＣＨＯ細胞が所定の細胞密度になるまで回分培養を行った（ステップＳ１０）。細胞密度が所定値に達した時点で、第１バルブ１１を閉じ、第２バルブ１２を開いて、迂回配管８の側に流路を切り替えた（ステップＳ１１）。 FIG. 10 is a flowchart showing the cell separation method of Example 1.
As shown in FIG. 10, first, batch culture was performed in the main tank 2 until the CHO cells reached a predetermined cell density (step S10). When the cell density reached a predetermined value, the first valve 11 was closed, the second valve 12 was opened, and the flow path was switched to the detour pipe 8 side (step S11).

続いて、循環ポンプ９を起動して、主槽２の槽内の培養液の排出を開始した（ステップＳ１２）。次いで、循環ポンプ９の回転数を上げて、迂回配管８を経由する流路で培養液の循環を開始させた（ステップＳ１３）。 Subsequently, the circulation pump 9 was started to start discharging the culture solution in the main tank 2 (step S12). Next, the rotation speed of the circulation pump 9 was increased to start the circulation of the culture solution in the flow path passing through the bypass pipe 8 (step S13).

続いて、培養液が一周して循環路に満たされ、培養液の循環が開始した時点で、循環ポンプ９の回転数を下げて、吐出量を低下させた（ステップＳ１４）。そして、循環ポンプ９の運転中に、第１バルブ１１を開き、第２バルブ１２を閉じて、細胞分離器３の側に流路を切り替えた（ステップＳ１５）。 Subsequently, when the culture solution circled and filled the circulation path and the circulation of the culture solution started, the rotation speed of the circulation pump 9 was lowered to reduce the discharge amount (step S14). Then, during the operation of the circulation pump 9, the first valve 11 was opened, the second valve 12 was closed, and the flow path was switched to the cell separator 3 side (step S15).

続いて、抜出ポンプ１０と供給ポンプ２７を起動した（ステップＳ１６）。そして、細胞分離器３で細胞分離処理しながら、主槽２で灌流培養を行った（ステップＳ１７）。灌流条件は、培養液の循環流量：２０ｍＬ／ｍｉｎ、灌流率：１ｖｖｄ（新鮮培地容量／培養液容量／日）に制御した。 Subsequently, the extraction pump 10 and the supply pump 27 were started (step S16). Then, perfusion culture was performed in the main tank 2 while performing cell separation treatment in the cell separator 3 (step S17). The perfusion conditions were controlled so that the circulation flow rate of the culture solution was 20 mL / min and the perfusion rate was 1 vvd (fresh medium volume / culture solution volume / day).

＜実施例２：細胞濃縮＞
循環系における送液開始時に、細胞分離器を迂回させる細胞分離方法を用いて、ＣＨＯ細胞の細胞濃縮処理を行った。細胞濃縮処理は、細胞密度を高め、不純物である低分子等を除去する処理であり、細胞治療用の細胞の調製に有効である。 <Example 2: Cell concentration>
At the start of fluid delivery in the circulatory system, CHO cells were enriched using a cell separation method that bypasses the cell separator. The cell concentration treatment is a treatment for increasing the cell density and removing small molecules and the like which are impurities, and is effective for preparing cells for cell therapy.

図１１は、実施例２で用いた細胞分離装置を示す模式図である。
細胞濃縮には、主槽２に攪拌装置を構成する攪拌翼２２とモータ２３を備え、回収槽４を省略した図１１に示す細胞分離装置を用いた。 FIG. 11 is a schematic view showing the cell separation device used in Example 2.
For cell concentration, the cell separation device shown in FIG. 11 was used, in which the main tank 2 was provided with a stirring blade 22 and a motor 23 constituting the stirring device, and the recovery tank 4 was omitted.

図１２は、実施例２の細胞分離方法を示すフローチャートである。
図１２に示すように、はじめに、第１バルブ１１を閉じ、第２バルブ１２を開いて、迂回配管８の側に流路を切り替えた（ステップＳ２０）。 FIG. 12 is a flowchart showing the cell separation method of Example 2.
As shown in FIG. 12, first, the first valve 11 was closed, the second valve 12 was opened, and the flow path was switched to the detour pipe 8 side (step S20).

続いて、循環ポンプ９を起動して、主槽２の槽内の細胞懸濁液の排出を開始した（ステップＳ２１）。次いで、循環ポンプ９の回転数を上げて、迂回配管８を経由する流路で細胞懸濁液の循環を開始させた（ステップＳ２２）。 Subsequently, the circulation pump 9 was started to start discharging the cell suspension in the tank of the main tank 2 (step S21). Next, the rotation speed of the circulation pump 9 was increased to start the circulation of the cell suspension in the flow path passing through the detour pipe 8 (step S22).

続いて、細胞懸濁液が一周して循環路に満たされ、細胞懸濁液の循環が開始した時点で、循環ポンプ９の回転数を下げて、吐出量を低下させた（ステップＳ２３）。そして、循環ポンプ９の運転中に、第１バルブ１１を開き、第２バルブ１２を閉じて、細胞分離器３の側に流路を切り替えた（ステップＳ２４）。 Subsequently, when the cell suspension circled and filled the circulation path and the circulation of the cell suspension started, the rotation speed of the circulation pump 9 was lowered to reduce the discharge amount (step S23). Then, during the operation of the circulation pump 9, the first valve 11 was opened, the second valve 12 was closed, and the flow path was switched to the cell separator 3 side (step S24).

続いて、抜出ポンプ１０を起動した（ステップＳ２５）。そして、細胞分離器３で細胞分離処理して、主槽２に細胞濃縮させた（ステップＳ２６）。濃縮条件は、細胞懸濁液の循環流量：２０ｍＬ／ｍｉｎ、細胞懸濁液の抜出量：１０ｍＬ／ｈに制御した。 Subsequently, the extraction pump 10 was started (step S25). Then, the cells were separated by the cell separator 3 and the cells were concentrated in the main tank 2 (step S26). The concentration conditions were controlled so that the circulating flow rate of the cell suspension was 20 mL / min and the withdrawal amount of the cell suspension was 10 mL / h.

＜実施例３：濃縮流加培養＞
循環系における送液開始時に、細胞分離器を迂回させる細胞分離方法を用いて、ＣＨＯ細胞の濃縮流加培養を行った。濃縮流加培養は、新鮮培地の供給の下で、細胞密度を高め、不純物である低分子等を除去する処理であり、抗体産生細胞による抗体医薬の製造において、種培養の工程に有効である。灌流培養とは異なり、引抜量を抑制することで、細胞密度の更なる高密度化が可能であり、種培養槽を小型化することができる処理である。 <Example 3: Concentrated fed-batch culture>
At the start of fluid feeding in the circulatory system, concentrated fed-batch culture of CHO cells was performed using a cell separation method that bypasses the cell separator. Concentrated fed-batch culture is a treatment for increasing cell density and removing impurities such as small molecules under the supply of fresh medium, and is effective in the step of seed culture in the production of antibody drugs by antibody-producing cells. .. Unlike perfusion culture, by suppressing the withdrawal amount, the cell density can be further increased, and the seed culture tank can be miniaturized.

図１３は、実施例３で用いた細胞分離装置を示す模式図である。
濃縮流加培養には、新鮮培地を用意した培地容器２５を主槽２に接続し、回収槽４を省略した図１３に示す細胞分離装置を用いた。主槽２としては、容量が１Ｌの培養容器を用いた。培養条件は、濃縮流加培養中に、３７℃、ｐＨ７．２、溶存酸素濃度：２．７ｐｐｍの一定値に制御した。 FIG. 13 is a schematic view showing the cell separation device used in Example 3.
For the concentrated fed-batch culture, a medium container 25 prepared with fresh medium was connected to the main tank 2, and the cell separation device shown in FIG. 13 in which the recovery tank 4 was omitted was used. As the main tank 2, a culture vessel having a capacity of 1 L was used. The culture conditions were controlled to a constant value of 37 ° C., pH 7.2, and dissolved oxygen concentration: 2.7 ppm during concentrated fed-batch culture.

図１４は、実施例３の細胞分離方法を示すフローチャートである。
図１４に示すように、はじめに、主槽２において、ＣＨＯ細胞が所定の細胞密度になるまで回分培養を行った（ステップＳ３０）。細胞密度が所定値に達した時点で、第１バルブ１１を閉じ、第２バルブ１２を開いて、迂回配管８の側に流路を切り替えた（ステップＳ３１）。 FIG. 14 is a flowchart showing the cell separation method of Example 3.
As shown in FIG. 14, first, batch culture was performed in the main tank 2 until the CHO cells reached a predetermined cell density (step S30). When the cell density reached a predetermined value, the first valve 11 was closed, the second valve 12 was opened, and the flow path was switched to the detour pipe 8 side (step S31).

続いて、循環ポンプ９を起動して、主槽２の槽内の培養液の排出を開始した（ステップＳ３２）。次いで、循環ポンプ９の回転数を上げて、迂回配管８を経由する流路で培養液の循環を開始させた（ステップＳ３３）。 Subsequently, the circulation pump 9 was started to start discharging the culture solution in the main tank 2 (step S32). Next, the rotation speed of the circulation pump 9 was increased to start the circulation of the culture solution in the flow path passing through the bypass pipe 8 (step S33).

続いて、培養液が一周して循環路に満たされ、培養液の循環が開始した時点で、循環ポンプ９の回転数を下げて、吐出量を低下させた（ステップＳ３４）。そして、循環ポンプ９の運転中に、第１バルブ１１を開き、第２バルブ１２を閉じて、細胞分離器３の側に流路を切り替えた（ステップＳ３５）。 Subsequently, when the culture solution circled and filled the circulation path and the circulation of the culture solution started, the rotation speed of the circulation pump 9 was lowered to reduce the discharge amount (step S34). Then, during the operation of the circulation pump 9, the first valve 11 was opened, the second valve 12 was closed, and the flow path was switched to the cell separator 3 side (step S35).

続いて、抜出ポンプ１０と供給ポンプ２７を起動した（ステップＳ３６）。そして、細胞分離器３で細胞分離処理しながら、主槽２で濃縮流加培養を行った（ステップＳ３７）。濃縮条件は、培養液の循環流量：２０ｍＬ／ｍｉｎ、灌流率：１ｖｖｄ（新鮮培地容量／培養液容量／日）に制御した。 Subsequently, the extraction pump 10 and the supply pump 27 were started (step S36). Then, concentrated fed-batch culture was performed in the main tank 2 while performing cell separation treatment in the cell separator 3 (step S37). The concentration conditions were controlled so that the circulation flow rate of the culture solution was 20 mL / min and the perfusion rate was 1 vvd (fresh medium volume / culture solution volume / day).

１細胞分離装置
２主槽
３細胞分離器
４回収槽
５移送配管
６返送配管
７抜出配管
８迂回配管
９循環ポンプ（送液装置）
１０抜出ポンプ
１１第１バルブ（流路切替装置）
１２第２バルブ（流路切替装置）
１３調整バルブ
１４流量センサ
２０温度調節装置
２１通気装置
２２攪拌翼
２３モータ
２４センサ
２５培地容器
２６開閉バルブ
２７供給ポンプ
２８制御装置
３０中空糸膜フィルタ
３１ケーシング
３１ａ入口側ヘッダ
３１ｂ出口側ヘッダ
３１ｃ流出口
３２細孔
３３小さい物質
３４大きい物質
３５ダイアフラムポンプ
４０遠心ポンプ
４１インペラ
４２ケーシング
４３インレット
４４アウトレット
４５シャフト
４６モータ 1 Cell separator 2 Main tank 3 Cell separator 4 Recovery tank 5 Transfer pipe 6 Return pipe 7 Extraction pipe 8 Detour pipe 9 Circulation pump (liquid transfer device)
10 Extraction pump 11 1st valve (flow path switching device)
12 Second valve (flow path switching device)
13 Adjustment valve 14 Flow sensor 20 Temperature control device 21 Ventilation device 22 Stirring blade 23 Motor 24 Sensor 25 Medium container 26 Open / close valve 27 Supply pump 28 Control device 30 Hollow thread film filter 31 Casing 31a Inlet side header 31b Outlet side header 31c Outflow 32 Pore 33 Small substance 34 Large substance 35 Diaphragm pump 40 Centrifugal pump 41 Impeller 42 Casing 43 Inlet 44 Outlet 45 Shaft 46 Motor

Claims

The main tank where the liquid containing cells is prepared, and
A cell separator that separates the cells from the liquid discharged from the main tank, and
A transfer pipe that sends the liquid from the main tank to the cell separator,
A return pipe that returns the separated cells from the cell separator to the main tank,
A cell separation device including a bypass pipe for connecting the transfer pipe to the return pipe by bypassing the cell separator.

The cell separation device according to claim 1.
A cell separation device including a flow path switching device that switches the flow path of the liquid discharged from the main tank between the cell separator and the detour pipe.

The cell separation device according to claim 2.
The flow path switching device includes a first valve provided on the transfer pipe downstream of the connection point of the bypass pipe and upstream of the cell separator, and a second valve provided on the bypass pipe. And, a cell separator.

The cell separation device according to claim 1.
A cell separation device in which the inner diameter of the detour pipe is at least twice the inner diameter of the flow path obtained by converting the cross-sectional area of the flow path in the cell separator.

The cell separation device according to claim 1.
A liquid feeding device for circulating the liquid between the main tank and the cell separator is provided.
The liquid feeding device is a cell separation device that is a centrifugal pump.

The cell separation device according to claim 1.
An extraction pipe for extracting the liquid from which the cells have been separated from the cell separator,
A collection tank for collecting the liquid extracted from the cell separator is provided.
A cell separation device in which one or more of the main tank and the recovery tank is made of resin.

The cell separation device according to claim 1.
An extraction pipe for extracting the liquid from which the cells have been separated from the cell separator,
A collection tank for collecting the liquid extracted from the cell separator is provided.
A cell separation device in which one or more of the transfer pipe, the return pipe, the detour pipe, and the extraction pipe is made of resin.

The cell separation device according to claim 1.
An extraction pipe for extracting the liquid from which the cells have been separated from the cell separator,
A collection tank for collecting the liquid extracted from the cell separator is provided.
A cell separation device in which one or more of the transfer pipe, the return pipe, the detour pipe, and the extraction pipe are connected by a sterile connector.

The cell separation device according to claim 1.
A cell separator in which the cell separator comprises a hollow fiber membrane filter.

The cell separation device according to claim 9.
A cell separation device in which the pore diameter of the hollow fiber membrane filter is one-fifth or less of the diameter of the cells.

The cell separation device according to claim 1.
The main tank is a cell separation device which is a culture tank including a temperature control device, a ventilation device, a stirrer, and a culture medium container connected by a pipe.

A cell separation method that separates cells from a liquid.
The main tank where the liquid containing cells is prepared, and
A cell separator that separates the cells from the liquid discharged from the main tank, and
A transfer pipe that sends the liquid from the main tank to the cell separator,
A return pipe that returns the separated cells from the cell separator to the main tank,
In a cell separation device including a bypass pipe for connecting the transfer pipe to the return pipe by bypassing the cell separator.
At the start of liquid feeding before the liquid starts to circulate between the main tank and the cell separator, the liquid discharged from the main tank is not sent to the cell separator, but the main is passed through the detour pipe. Return to the tank,
During the circulation operation after the liquid starts to circulate between the main tank and the cell separator, the liquid discharged from the main tank is sent to the cell separator to separate the cells. A cell separation method for returning the cells to the main tank.

The cell separation method according to claim 12.
A cell separation method in which the liquid discharged from the main tank is lowered to a flow rate lower than that at the start of the liquid feeding and then sent to the cell separator.

The cell separation method according to claim 13.
A method for separating cells in which the flow rate of the liquid exceeds 30 mL / min at the start of liquid feeding before the liquid starts to circulate.

The cell separation method according to claim 14.
A cell separation method in which the flow rate of the liquid is 30 mL / min or less during the circulation operation after the liquid starts to circulate.