JP2021040548A - Transformants and methods for producing 1,3-butanediol using the same - Google Patents
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Classifications
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Abstract
Description
本開示は、１，３−ブタンジオール生産技術に関する。
本開示は、一態様において、特定の遺伝子操作が施された形質転換体、及びこの形質転換体を用いた１，３−ブタンジオールの製造技術に関する。
The present disclosure relates to 1,3-butanediol production technology.
The present disclosure relates to, in one aspect, a transformant subjected to a specific genetic manipulation, and a technique for producing 1,3-butanediol using the transformant.
近年、化石資源の枯渇ならびに地球温暖化などの背景から、再生可能資源を原料とした化学品製造技術の重要性が広く認識され、注目を集めている。
１，３−ブタンジオールは化粧品基材、食品香料の溶媒、医薬・農薬等の合成原料として使用される。また、ポリウレタンやポリスチレン樹脂の原料としても使用される。工業的には、１，３−ブタンジオールはアセトアルデヒドのアルドール縮合により製造されるが、持続可能な社会の実現に向け、生物学的プロセスによる製造技術の開発が期待されている。
In recent years, the importance of chemical manufacturing technology using renewable resources as a raw material has been widely recognized and attracted attention due to the depletion of fossil resources and global warming.
1,3-Butanediol is used as a base material for cosmetics, a solvent for food flavors, and a synthetic raw material for pharmaceuticals and pesticides. It is also used as a raw material for polyurethane and polystyrene resins. Industrially, 1,3-butanediol is produced by aldol condensation of acetaldehyde, but it is expected to develop a production technology by a biological process toward the realization of a sustainable society.
特許文献１は、大腸菌、酵母、コリネバクテリウム、及びクロストリジウムを宿主として、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素、及び３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ還元酵素を導入した形質転換菌を用いてグルコースから１，３−ブタンジオールを製造する技術を開示する。実施例では、宿主として大腸菌を用いている。 Patent Document 1 is a transforming bacterium into which acetyl CoA carboxylase, acetoacetyl CoA synthase, acetoacetyl CoA reductase, and 3-hydroxybutyryl CoA reductase are introduced using Escherichia coli, yeast, corinebacterium, and crostridium as hosts. Discloses a technique for producing 1,3-butanediol from glucose using. In the examples, Escherichia coli is used as the host.
特許文献２は、微生物を宿主とし、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ還元酵素、及び３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素を導入することで１，３−ブタンジオール生成能を有する形質転換菌を構築する技術を開示する。
アセトアセチルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子としては、ｔｈｒＡ，ａｋｔｈｒ２，ｈｏｍ６，ｈｏｍ１，ｈｏｍ２，ｆａｄＢ，ｆａｄＪ，Ｈｂｄ２，Ｈｂｄ１，ｈｂｄ，ＨＳＤ１７Ｂ１０，ｐｈｂＢ，ｐｈａＢ，Ｍｓｅｄ＿１４２３，Ｍｓｅｄ＿０３９９，Ｍｓｅｄ＿０３８９，Ｍｓｅｄ＿１９９２，ａｄｈ，ａｄｈＡ，ａｄｈ−Ａ，ｍｄｈ，ｌｄｈＡ，ｌｄｈ，ｂｄｈなどが開示される。
３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子としては、ａｃｒ１，ｓｕｃＤ，ｂｐｈＧ，ｂｌｄ，ａｄｈＥ，Ｍｓｅｄ＿０７０９，ｍｃｒ，ａｓｄ−２，Ｓａｃｉ＿２３７０，Ａｌｄ，ｅｕｔＥなどが開示される。
３−ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素をコードする遺伝子としては、ａｌｒＡ，ＡＤＨ２，ｙｑｈＤ，ｂｄｈＩ，ｂｄｈＩＩ，ａｄｈＡ，４ｈｂｄ，ａｄｈＩ，Ｐ８４０６７，ｍｍｓｂ，ｄｈａｔ，３ｈｉｄｈなどが開示される。
Patent Document 2 is a transformation capable of producing 1,3-butanediol by introducing acetoacetyl CoA reductase, 3-hydroxybutyryl CoA reductase, and 3-hydroxybutylaldehyde reductase using a microorganism as a host. Disclose the technology for constructing bacteria.
Genes encoding acetoacetyl-CoA reductase include thrA, akthr2, hom6, hom1, hom2, dadB, dadJ, Hbd2, Hbd1, hbd, HSD17B10, phbB, phaB, Msed_1423, Msed_0399, Msed_0389, Msed_392, ad. Adh-A, mdh, ldhA, ldh, bdh and the like are disclosed.
As genes encoding 3-hydroxybutyryl CoA reductase, acr1, sucD, bphG, blend, adhE, Msed_0709, mcr, asd-2, Saci_2370, Ald, eutE and the like are disclosed.
As genes encoding 3-hydroxybutyraldehyde reductase, allrA, ADH2, yqhD, bdhI, bdhII, adhA, 4hbd, adhI, P84067, mmsb, dhat, 3hidh and the like are disclosed.
非特許文献１は、大腸菌にRalstonia eutrophaのアセチル基転移酵素ならびにアセトアセチルＣｏＡ還元酵素、Clostoridium saccharoperbutylacetonicumの３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ還元酵素を導入した形質転換菌を用いて、グルコースから１，３−ブタンジオールを生産する技術を開示する。 Non-Patent Document 1 describes 1,3-butane from glucose using a transforming bacterium in which Ralstonia eutropha's acetyltransferase, acetoacetyl CoA reductase, and Clostoridium saccharoperbutylacetonicum's 3-hydroxybutyryl CoA reductase are introduced into Escherichia coli. Disclose the technology for producing diols.
微生物が産生するアルコールの脱水素的酸化を触媒する酵素のうち、ＮＡＤ（Ｐ）+を補酵素とする酵素は数多く知られる。このうち、１，３−ブタンジオールを基質として３−ヒドロキシブタナールを生成する酵素としては、非特許文献２に記載のシュードモナス エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）及びサルモネラ ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）のアルド−ケト還元酵素が知られている。 Among the enzymes that catalyze the dehydrogenation oxidation of alcohols produced by microorganisms, many enzymes that use NAD (P) + as a coenzyme are known. Among these, examples of the enzyme that produces 3-hydroxybutanal using 1,3-butanediol as a substrate include aldoketo of Pseudomonas aeruginosa and Salmonella typhimurium described in Non-Patent Document 2. Reductase is known.
非特許文献３は、大腸菌に非特許文献２のアルド−ケト還元酵素を導入した形質転換菌を用いて、グルコースから３−ヒドロキシブタナールを介して１，３−ブタンジオールを生産する技術を開示する。 Non-Patent Document 3 discloses a technique for producing 1,3-butanediol from glucose via 3-hydroxybutanal using a transformant obtained by introducing the ald-keto reductase of Non-Patent Document 2 into Escherichia coli. To do.
中鎖アルコール脱水素酵素は、アルド‐ケト還元酵素と同様にアルコールの脱水素的酸化を触媒するが、アルド−ケト還元酵素とは異なるスーパーファミリーに属する。非特許文献４は、植物由来のシナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーに属する中鎖アルコール脱水素酵素と、大腸菌由来のＹｊｇＢ及びマイコバクテリウム ボビス（Mycobacterium bovis）のＡｄｈＣとの近縁性に関する情報を開示する。 Medium-chain alcohol dehydrogenase catalyzes the dehydrogenation of alcohols, similar to ald-keto reductase, but belongs to a different superfamily than ald-keto reductase. Non-Patent Document 4 discloses information on the close relationship between a medium-chain alcohol dehydrogenase belonging to the cinnamyl alcohol dehydrogenase family derived from plants and YjgB derived from Escherichia coli and AdhC of Mycobacterium bovis.
本開示は、糖類を原料として１，３−ブタンジオールを生物学的に生産できる形質転換体、及び、この形質転換体を用いる１，３−ブタンジオールの製造方法を提供する。 The present disclosure provides a transformant capable of biologically producing 1,3-butanediol using a saccharide as a raw material, and a method for producing 1,3-butanediol using this transformant.
本開示は、一態様において、シナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）ファミリーに属するアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子が宿主細菌に導入され、かつ、前記宿主細菌は、下記（Ａ）〜（Ｄ）の酵素の少なくとも１つが発現可能なように又は発現誘導可能なように変異又は遺伝子が導入されている、形質転換体に関する。
（Ａ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ
（Ｂ）アセトアセチルＣｏＡ合成酵素
（Ｃ）アセトアセチルＣｏＡ還元酵素
（Ｄ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ還元酵素
In one aspect of the present disclosure, a gene encoding an alcohol dehydrogenase belonging to the cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) family is introduced into a host bacterium, and the host bacterium is the following enzymes (A) to (D). With respect to a transformant in which a mutation or gene has been introduced so that at least one of the above can be expressed or induced.
(A) Acetyl CoA carboxylase (B) Acetoacetyl CoA synthase (C) Acetoacetyl CoA reductase (D) 3-Hydroxybutyryl CoA reductase
本開示は、その他の一態様において、形質転換体を、糖類、又は前記形質転換体が代謝によりアセチルＣｏＡを生成し得る化合物を含む反応液中で培養する反応工程と、
反応培地中の１，３−ブタンジオールを回収する回収工程とを含み、
前記形質転換体は、シナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）ファミリーに属するアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子が宿主細菌に導入されている形質転換体である、１，３−ブタンジオールの製造方法に関する。
The present disclosure comprises, in another aspect, a reaction step of culturing a transformant in a reaction solution containing a saccharide or a compound in which the transformant can metabolize acetyl-CoA.
Including a recovery step of recovering 1,3-butanediol in the reaction medium.
The transformant relates to a method for producing 1,3-butanediol, which is a transformant in which a gene encoding an alcohol dehydrogenase belonging to the cinamyl alcohol dehydrogenase (CAD) family has been introduced into a host bacterium.
本開示によれば、一態様において、糖類を原料として１，３−ブタンジオールを生産できる形質転換体を提供できる。本開示によれば、その他の一態様において、この形質転換体を用いて１，３−ブタンジオールを生物学的に製造（生産）できる。 According to the present disclosure, in one embodiment, it is possible to provide a transformant capable of producing 1,3-butanediol from a saccharide as a raw material. According to the present disclosure, in another aspect, 1,3-butanediol can be biologically produced (produced) using this transformant.
本開示は、シナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）ファミリーに属する中鎖アルコール脱水素酵素が、１，３−ブタンジオール酸化活性を有し、１，３−ブタンジオールの生産に利用できる、という知見に基づく。 The present disclosure is based on the finding that medium-chain alcohol dehydrogenases belonging to the cinamyl alcohol dehydrogenase (CAD) family have 1,3-butanediol oxidizing activity and can be used in the production of 1,3-butanediol. ..
［シナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）ファミリー］
本開示において、ＣＡＤファミリーは、中鎖デヒドロゲナーゼ／リダクターゼ（ＭＤＲ）スーパーファミリーに属する一群の中鎖アルコール脱水素酵素をいう（非特許文献４のｐｐ．３８８４−３８８５参照）。
ＣＡＤファミリーの代表的なメンバーであるシナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（シナミルＡＤＨ）は、植物の細胞壁におけるリグニンの生合成に重要な役割を果たす酵素である。
ＣＡＤファミリーに属する酵素は、植物だけではなく、酵母や原核生物（バクテリア）にも存在することが知られている。
[Cinamil alcohol dehydrogenase (CAD) family]
In the present disclosure, the CAD family refers to a group of medium-chain alcohol dehydrogenases belonging to the medium-chain dehydrogenase / reductase (MDR) superfamily (see pp. 3884-3858 of Non-Patent Document 4).
Cinamil alcohol dehydrogenase (Cinamil ADH), a representative member of the CAD family, is an enzyme that plays an important role in the biosynthesis of lignin in the cell wall of plants.
Enzymes belonging to the CAD family are known to exist not only in plants but also in yeast and prokaryotes (bacteria).
本開示において、「ＣＡＤファミリーに属する中鎖アルコール脱水素酵素」とは、一又は複数の実施形態において、ＣＡＤドメインを有する酵素をいう。
ＣＡＤドメインの有無は、一又は複数の実施形態において、検索エンジンNCBI Conserved domain (CD) search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）で調べたい配列をｑｕｅｒｙとして検査したときに「ＣＡＤ１」の構造がヒットするか否かで判断できる（図５参照）。図５は、Mycobacterium smegmatisのａｄｈＣ遺伝子がコードするタンパク質をｑｕｅｒｙとしたときの結果である。
In the present disclosure, "medium-chain alcohol dehydrogenase belonging to the CAD family" refers to an enzyme having a CAD domain in one or more embodiments.
The presence or absence of a CAD domain is determined by the search engine NCBI Conserved domain (CD) search (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) in one or more embodiments. Can be determined by whether or not the structure of "CAD1" is hit when is inspected as a query (see FIG. 5). FIG. 5 shows the results when the protein encoded by the adhC gene of Mycobacterium smegmatis is query.
本開示における「ＣＡＤファミリーに属する中鎖アルコール脱水素酵素」は、一又は複数の実施形態において、ＮＡＤＰ+を補酵素として１，３−ブタンジオールを酸化する活性を有する。
本開示において、「ＮＡＤＰ+を補酵素とする１，３−ブタンジオール酸化活性」は、実施例の記載の方法で測定できる。
The "medium chain alcohol dehydrogenase belonging to the CAD family" in the present disclosure has an activity of oxidizing 1,3-butanediol using NADP + as a coenzyme in one or more embodiments.
In the present disclosure, " 1,3-butanediol oxidizing activity with NADP + as a coenzyme" can be measured by the method described in Examples.
本開示における「ＣＡＤファミリーに属する中鎖アルコール脱水素酵素」のアミノ酸長は、一又は複数の実施形態において、２５０超４５０未満、２６０以上４４０以下、２７０以上４３０以下、２８０以上４２０以下、２９０以上４１０以下、又は３００以上４００以下である。 The amino acid length of the "medium chain alcohol dehydrogenase belonging to the CAD family" in the present disclosure is, in one or more embodiments, more than 250 and less than 450, 260 or more and 440 or less, 270 or more and 430 or less, 280 or more and 420 or less, 290 or more. It is 410 or less, or 300 or more and 400 or less.
本開示における「ＣＡＤファミリーに属する中鎖アルコール脱水素酵素」は、一又は複数の実施形態において、植物や微生物の酵素又はそれらに由来する酵素が挙げられ、１，３−ブタンジオールの生産性向上の観点から、原核生物又は原核生物由来の酵素が好ましく、バクテリア（細菌）又はバクテリア由来の酵素がより好ましい。 The "medium-chain alcohol dehydrogenase belonging to the CAD family" in the present disclosure includes enzymes of plants and microorganisms or enzymes derived from them in one or more embodiments, and improves the productivity of 1,3-butanediol. From this point of view, prokaryotes or enzymes derived from prokaryotes are preferable, and bacteria (bacteria) or enzymes derived from bacteria are more preferable.
「ＣＡＤファミリーに属する中鎖アルコール脱水素酵素」としては、同様の観点から、クロノバクター（Cronobacter）属、エシェリキア（Escherichia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、バチルス（Bacillus）属、又はロドコッカス（Rhodococcus）属の当該酵素、若しくはこれらのオーソログ、又はこれらに由来する酵素が好ましい。 From the same viewpoint, "medium-chain alcohol dehydrogenases belonging to the CAD family" include Cronobacter, Escherichia, Corynebacterium, Mycobacterium, and Bacillus. The relevant enzymes of the genus (Bacillus) or Rhodococcus, or their orthologs, or enzymes derived from them are preferred.
「ＣＡＤファミリーに属する中鎖アルコール脱水素酵素」としては、同様の観点から、クロノバクター サカザキ（Cronobacter sakazakii）、エシェリキア コリ（Escherichia coli）、コリネバクテリウム エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム テルペノタビドゥム（Corynebacterium terpenotabidum）、マイコバクテリウム スメグマティス（Mycobacterium smegmatis）、バチルス サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス メガテリウム（Bacillus megaterium）、ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、又はロドコッカス ジョスティ（Rhodococcus jostii）の当該酵素、若しくはこれらのオーソログ、又はこれらに由来する酵素が好ましい。 From the same point of view, "medium-chain alcohol dehydrogenases belonging to the CAD family" include Chronobacter sakazakii, Escherichia coli, Corynebacterium efficiens, and Corynebacterium terpenotabi. Dum (Corynebacterium terpenotabidum), Mycobacterium smegmatis, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Rhodococcus erythropolis, or Rhodococcus erythropolis, or Rhodococcus erythropolis These orthologs, or enzymes derived from them, are preferred.
「ＣＡＤファミリーに属する中鎖アルコール脱水素酵素」としては、同様の観点から、実施例の表１に記載の酵素、若しくはこれらのオーソログ、又はこれらに由来する酵素が好ましい。
これらの中でも、同様の観点から、クロノバクター サカザキ（Cronobacter sakazakii）のＹｊｇＢ、エシェリキア コリ（Escherichia coli）のＹｊｇＢ、コリネバクテリウム テルペノタビドゥム（Corynebacterium terpenotabidum）のＡｄｈＣ、マイコバクテリウム スメグマティス（Mycobacterium smegmatis）のＡｄｈＣ、バチルス メガテリウム（Bacillus megaterium）のＡｄｈＣ、ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）のＡｄｈＣ、若しくはこれらのオーソログ、又はこれらに由来する酵素が好ましい。
From the same viewpoint, as the "medium-chain alcohol dehydrogenase belonging to the CAD family", the enzymes shown in Table 1 of Examples, their orthologs, or enzymes derived from them are preferable.
Among these, from the same viewpoint, YjgB of Cronobacter sakazakii, YjgB of Escherichia coli, AdhC of Corynebacterium terpenotabidum, and Mycobacterium smegmatis. ), AdhC of Bacillus megaterium, AdhC of Rhodococcus erythropolis, orthologs thereof, or enzymes derived from them are preferable.
「ＣＡＤファミリーに属する中鎖アルコール脱水素酵素」としては、一又は複数の実施形態において、
（１）クロノバクター サカザキ（Cronobacter sakazakii）のシナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーに属する中鎖アルコール脱水素酵素ＹｊｇＢ、
（２）クロノバクター（Cronobacter）属、及びエシェリキア（Escherichia）属における前記（１）のオーソログ、
（３）マイコバクテリウム スメグマティス（Mycobacterium smegmatis）のシナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーに属する中鎖アルコール脱水素酵素遺伝子ＡｄｈＣ、及び
（４）マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、バチルス（Bacillus）属、及びロドコッカス（Rhodococcus）属における前記（３）のオーソログ、
が挙げられる。
As the "medium chain alcohol dehydrogenase belonging to the CAD family", in one or more embodiments,
(1) Medium-chain alcohol dehydrogenase YjgB, which belongs to the cinnamyl alcohol dehydrogenase family of Cronobacter sakazakii,
(2) The ortholog of (1) above in the genus Cronobacter and the genus Escherichia.
(3) Medium-chain alcohol dehydrogenase gene AdhC belonging to the cinnamyl alcohol dehydrogenase family of Mycobacterium smegmatis, and (4) Mycobacterium, Bacillus, and Rhodococcus (4) The ortholog of (3) above in the genus Rhodococcus,
Can be mentioned.
本開示において「オーソログ」とは、異なる生物に存在する相同な機能を有する類縁タンパクを意味する。 In the present disclosure, "ortholog" means a related protein having a homologous function existing in a different organism.
本開示において「由来する酵素」とは、一又は複数の実施形態において、元の酵素のアミノ酸配列、例えば、実施例の表１に記載の配列番号１から１２のいずれかのアミノ酸配列、に対して同一性が７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は９７％以上のアミノ酸配列である酵素をいう。
本開示において「由来する酵素」とは、一又は複数の実施形態において、元の酵素、例えば、実施例の表１に記載の酵素と同程度の「ＮＡＤＰ+を補酵素とする１，３−ブタンジオール酸化活性」を有する酵素をいう。同程度とは、一又は複数の実施形態において、活性の差が±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、又は±５％以内のことをいう。
In the present disclosure, the term "derived enzyme" refers to, in one or more embodiments, the amino acid sequence of the original enzyme, eg, any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 12 shown in Table 1 of the Examples. Refers to an enzyme having an amino acid sequence having 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, or 97% or more identity.
In the present disclosure, the term "derived enzyme" means, in one or more embodiments, the same degree as the original enzyme, for example, the enzyme shown in Table 1 of Examples, "NADP + as a coenzyme 1,3-". Butanediol means an enzyme having "oxidizing activity". The same degree means that the difference in activity is within ± 25%, ± 20%, ± 15%, ± 10%, or ± 5% in one or more embodiments.
本開示に係る形質転換体は、本開示における「ＣＡＤファミリーに属する中鎖アルコール脱水素酵素」をコードする遺伝子が宿主細菌に導入された形質転換体である。
本開示に係る形質転換体は、一又は複数の実施形態において、「ＣＡＤファミリーに属する中鎖アルコール脱水素酵素」が発現可能に、又は、発現誘導可能に、該遺伝子が導入された形質転換体である。
該遺伝子の導入は、プラスミドにより導入してもよく、染色体上に導入してもよい。
該遺伝子の導入は、一又は複数の実施形態において、１，３−ブタンジオールの生産が向上する範囲で、遺伝子発現調節の配列（適切なプロモーターなど）とともに導入することが好ましい。
The transformant according to the present disclosure is a transformant in which a gene encoding "medium-chain alcohol dehydrogenase belonging to the CAD family" in the present disclosure has been introduced into a host bacterium.
The transformant according to the present disclosure is a transformant into which the gene has been introduced so that "medium-chain alcohol dehydrogenase belonging to the CAD family" can be expressed or induced in one or more embodiments. Is.
The gene may be introduced by a plasmid or on a chromosome.
The gene is preferably introduced in one or more embodiments with a sequence of gene expression regulation (such as an appropriate promoter) to the extent that production of 1,3-butanediol is improved.
［宿主細菌］
宿主細菌としては、コリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア属細菌（特に、エシェリヒア コリ）、バチルス属細菌（特にバチルス サブチリス）、シュードモナス属細菌（特に、シュードモナス プチダ）、ブレビバクテリウム属細菌、ストレプトコッカス属細菌、ラクトバチルス属細菌、ロドコッカス属細菌（特にロドコッカス エリスロポリス、ロドコッカス オパカス）、ストレプトマイセス属細菌、サッカロマイセス属酵母（特に、サッカロマイセス セレビシアエ）、クライベロマイセス属酵母、シゾサッカロマイセス属酵母、ヤロウィア属酵母、トリコスポロン属酵母、ロドスポリジウム酵母、ピキア属酵母、キャンディダ属酵母、ノイロスポラ属カビ、アスペルギルス属カビ、トリコデルマ属カビなどが挙げられる。
宿主細菌としては、１，３−ブタンジオールの生産性向上の観点から、コリネ型細菌を用いることが好ましい。
コリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bergey's Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。一又は複数の実施形態において、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、マイクロコッカス属菌等が挙げられる。コリネ型細菌の中ではコリネバクテリウム属菌が挙げられる。
[Host bacteria]
Host bacteria include Corinebacterium, Escherichia (especially Escherichia coli), Bacillus (especially Bacillus subtilis), Pseudomonas (especially Pseudomonas petitda), Brevibacterium, Streptococcus, Lactobacillus bacterium, Rhodococcus bacterium (especially Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus opacus), Streptomyces bacterium, Saccharomyces yeast (especially Saccharomyces cerevisiae), Cryberomyces yeast, Sizosaccalomyces yeast , Tricosporon genus yeast, Rhodococcus yeast, Pikia genus yeast, Candida genus yeast, Neurospora genus mold, Aspergillus genus mold, Trichoderma genus mold and the like.
As the host bacterium, it is preferable to use a coryneform bacterium from the viewpoint of improving the productivity of 1,3-butanediol.
Coryneform bacteria are a group of microorganisms defined in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Vol. 8, 599 (1974), under normal aerobic conditions. It is not particularly limited as long as it proliferates. In one or more embodiments, Corynebacterium spp., Brevibacterium spp., Earthlobactor spp., Mycobacterium spp., Micrococcus spp. And the like can be mentioned. Among the coryneform bacteria, Corynebacterium spp.
コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム ハロトレランス（Corynebacterium halotolerance）、コリネバクテリウム アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）等が挙げられる。
１，３−ブタンジオールの生産性向上の観点から、コリネバクテリウム グルタミカムが好ましい。より具体的には、一又は複数の実施形態において、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ｒ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１８９７６）、ＡＴＣＣ１３０３２株、ＡＴＣＣ１３８６９株、ＡＴＣＣ１３０５８株、ＡＴＣＣ１３０５９株、ＡＴＣＣ１３０６０株、ＡＴＣＣ１３２３２株、ＡＴＣＣ１３２８６株、ＡＴＣＣ１３２８７株、ＡＴＣＣ１３６５５株、ＡＴＣＣ１３７４５株、ＡＴＣＣ１３７４６株、ＡＴＣＣ１３７６１株、ＡＴＣＣ１４０２０株、ＡＴＣＣ３１８３１株、ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）、ＭＪ−２３３ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）等が挙げられる。これらのコリネバクテリウム グルタミカム株は、ブダペスト条約の下で国際寄託されており、公に利用可能である。
同様の観点から、宿主細菌としては、Ｒ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１８９７６）、ＡＴＣＣ１３０３２株、ＡＴＣＣ１３８６９株が好ましい。
Corynebacterium spp. Are Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium halotolerance, Corynebacterium alkano. Examples include Corynebacterium alkanolyticum.
From the viewpoint of improving the productivity of 1,3-butanediol, Corynebacterium glutamicum is preferable. More specifically, in one or more embodiments, Corynebacterium glutamicum R strain (FERM BP-18976), ATCC13032 strain, ATCC13869 strain, ATCC13058 strain, ATCC13059 strain, ATCC13060 strain, ATCC13232 strain, ATCC13286 Examples thereof include strains, ATCC13287 strains, ATCC13655 strains, ATCC13745 strains, ATCC13746 strains, ATCC13761 strains, ATCC14020 strains, ATCC31831 strains, MJ-233 (FERM BP-1497), MJ-233AB-41 (FERM BP-1498) and the like. These Corynebacterium glutamicum strains have been internationally deposited under the Budapest Treaty and are publicly available.
From the same viewpoint, as the host bacterium, R strain (FERM BP-18976), ATCC13032 strain, and ATCC13869 strain are preferable.
なお、分子生物学的分類により、ブレビバクテリウム フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）、コリネバクテリウム リリウム（Corynebacterium lilium）等のコリネ型細菌もコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に菌名が統一されている〔Liebl, W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int J Syst Bacteriol. 41:255-260. (1991)、駒形和男ら, コリネフォルム細菌の分類, 発酵と工業, 45:944-963 (1987)〕。 According to the molecular biological classification, the coryneform type such as Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium divaricatum, Corynebacterium lilium, etc. Bacteria are also unified to Corynebacterium glutamicum [Liebl, W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412 , and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int J Syst Bacteriol. 41: 255-260. (1991), Kazuo Komagata et al., Classification of Coryneform Bacteria, Fermentation and Industry, 45: 944-963 (1987) ].
ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）（例えばＡＴＣＣ６８７２株）等が挙げられる。
アースロバクター属菌としては、アースロバクター グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）（例えばＡＴＣＣ８０１０株、ＡＴＣＣ４３３６株、ＡＴＣＣ２１０５６株、ＡＴＣＣ３１２５０株、ＡＴＣＣ３１７３８株、ＡＴＣＣ３５６９８株）等が挙げられる。
マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム ボビス（Mycobacterium bovis）（例えばＡＴＣＣ１９２１０株、ＡＴＣＣ２７２８９株）等が挙げられる。
マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス フロイデンライヒ（Micrococcus freudenreichii）（例えばＮｏ．２３９株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３２２１））、マイクロコッカス ルテウス（Micrococcus leuteus）（例えばＮｏ．２４０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３２２２））、マイクロコッカス ウレアエ（Micrococcus ureae）（例えばＩＡＭ１０１０株）、マイクロコッカス ロゼウス（Micrococcus roseus）（例えばＩＦＯ３７６４株）等が挙げられる。
これらのブレビバクテリウム属、アースロバクター属、マイコバクテリウム属、及びマイクロコッカス属の菌株は、ブダペスト条約の下で国際寄託されており、公に利用可能である。
Examples of the genus Brevibacterium include Brevibacterium ammoniagenes (for example, ATCC6782 strain) and the like.
Examples of the genus Arthrobacter include Arthrobacter globiformis (for example, ATCC8010 strain, ATCC4336 strain, ATCC21056 strain, ATCC31250 strain, ATCC31738 strain, ATCC35698 strain) and the like.
Examples of Mycobacterium genus include Mycobacterium bovis (for example, ATCC 19210 strain, ATCC 27289 strain) and the like.
Examples of Micrococcus spp. Are Micrococcus freudenreichii (for example, No. 239 strain (FERM P-13221)), Micrococcus leuteus (for example, No. 240 strain (FERM P-13222)), Examples thereof include Micrococcus ureae (for example, IAM1010 strain), Micrococcus roseus (for example, IFO3764 strain) and the like.
These Brevibacterium, Earthlobactor, Mycobacterium, and Micrococcus strains have been internationally deposited under the Budapest Treaty and are publicly available.
［宿主への変異又は遺伝子の導入］
本開示に係る形質転換体における１，３−ブタンジオールの生成経路としては、一又は複数の実施形態において、図６のように概略できる。
グルコールからホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、アセチルＣｏＡと代謝され、さらに、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ、３−ヒドロキシブタナール（３−ヒドロキシブチルアルデヒド）となる。そして、３−ヒドロキシブタナールが、ＣＡＤファミリーに属するアルコール脱水素酵素により触媒され、１．３−ブタンジオールが生成される。
したがって、本開示に係る形質転換体は、一又は複数の実施形態において、１，３−ブタンジオールの生産性向上の観点から、さらに、下記（Ａ）〜（Ｄ）の酵素の少なくとも１つが発現可能なように又は発現誘導可能なように変異又は遺伝子が導入されていることが好ましく、発現亢進可能なように又は発現亢進の誘導が可能なように変異又は遺伝子が導入されていることがより好ましい。
（Ａ）アセチルＣｏＡを基質としてマロニルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ
（Ｂ）アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡから不可逆的にアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセトアセチルＣｏＡ合成酵素
（Ｃ）アセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセトアセチルＣｏＡ還元酵素
（Ｄ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシブタナールを生成する反応を触媒する３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ還元酵素
上記（Ａ）〜（Ｄ）の酵素は、一又は複数の実施形態において、１，３−ブタンジオールの生産性向上の観点から、これらの２つ、３つ、又は全部が発現可能なように又は発現誘導可能なように変異又は遺伝子が導入されていることが好ましい。
ある酵素が発現（若しくは発現亢進）可能なように又は発現（若しくは発現亢進）誘導可能なように変異又は遺伝子を導入することの、一又は複数の実施形態としては、該酵素をコードする遺伝子をプラスミドにより又は染色体上に導入することが挙げられ、あるいは、宿主細菌の染色体上に存在する該酵素遺伝子の制御配列、遺伝子コード領域、又はその両者への変異導入、又は塩基配列置換によってもたらすことが挙げられる。
[Mutation or gene transfer into host]
The production pathway of 1,3-butanediol in the transformant according to the present disclosure can be outlined as shown in FIG. 6 in one or more embodiments.
Glucol is metabolized to phosphoenolpyruvate, pyruvate, and acetyl-CoA to 3-hydroxybutyryl CoA and 3-hydroxybutyraldehyde (3-hydroxybutyraldehyde). 3-Hydroxybutanal is then catalyzed by an alcohol dehydrogenase belonging to the CAD family to produce 1.3-butanediol.
Therefore, in one or more embodiments, the transformant according to the present disclosure further expresses at least one of the following enzymes (A) to (D) from the viewpoint of improving the productivity of 1,3-butanediol. It is preferable that the mutation or gene is introduced so as to be possible or induce expression, and it is more preferable that the mutation or gene is introduced so that expression can be enhanced or expression can be induced. preferable.
(A) Acetyl-CoA carboxylase that catalyzes the reaction that produces maronyl CoA using acetyl-CoA as a substrate (B) Acetoacetyl-CoA synthase that catalyzes the reaction that irreversibly produces acetoacetyl-CoA from acetyl-CoA and malonyl CoA (C) Acetoacetyl CoA Reductase Catalyzing the Reaction of Acetyl-CoA to Produce 3-Hydroxybutyryl CoA (D) 3-Hyhydroxybutyryl CoA Caterases the Reaction of 3-Hydroxybutyryl CoA to Produce 3-Hydroxybutanal Reducing Enzymes The enzymes (A) to (D) above can express two, three, or all of them in one or more embodiments from the viewpoint of improving the productivity of 1,3-butanediol. It is preferable that the mutation or gene is introduced so as to or so that the expression can be induced.
One or more embodiments of introducing a mutation or gene such that an enzyme can be expressed (or upregulated) or induced (or upregulated) is a gene encoding the enzyme. It can be introduced by plasmid or on the chromosome, or it can be brought about by mutagenesis or base sequence substitution in the control sequence, gene coding region, or both of the enzyme gene present on the chromosome of the host bacterium. Can be mentioned.
また、本開示に係る形質転換体は、一又は複数の実施形態において、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、又はアセチルＣｏＡが他の経路に消費されることを抑制して１，３−ブタンジオールの生産性を向上させる観点から、下記（Ａ’）〜（Ｄ’）の酵素の少なくとも１つが機能低下又は機能欠損していることが好ましい。酵素の機能低下又は機能欠損は、一又は複数の実施形態において、該酵素をコードする遺伝子の破壊、欠損、又は変異により行うことができる。
（Ａ’）ホスホエノールピルビン酸を基質としてオキサロ酢酸を生成する反応を触媒するホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＰＣ）
（Ｂ’）ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）
（Ｃ’）アセテートキナーゼ（ＡＣＫ）
（Ｄ’）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）
なお、ＰＴＡ及びＡＣＫは、アセチルＣｏＡを消費して酢酸を生合成する経路の酵素である。
In addition, the transformant according to the present disclosure, in one or more embodiments, suppresses the consumption of phosphoenolpyruvate, pyruvate, or acetyl-CoA by other pathways to suppress the consumption of 1,3-butanediol. From the viewpoint of improving productivity, it is preferable that at least one of the following enzymes (A') to (D') is functionally deteriorated or deficient. Deterioration or dysfunction of an enzyme can be achieved in one or more embodiments by disruption, deficiency, or mutation of the gene encoding the enzyme.
(A') Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PPC) that catalyzes the reaction that produces oxaloacetate using phosphoenolpyruvate as a substrate.
(B') Phosphotransacetylase (PTA)
(C') Acetate Kinase (ACK)
(D') Lactate dehydrogenase (LDH)
PTA and ACK are enzymes in the pathway that consume acetyl-CoA to biosynthesize acetic acid.
［１，３−ブタンジオールの製造］
本開示に係る形質転換体を、炭素源を含む反応液中で反応させることにより１，３−ブタンジオールを製造することができる。
[Manufacturing of 1,3-butanediol]
1,3-Butanediol can be produced by reacting the transformant according to the present disclosure in a reaction solution containing a carbon source.
菌体の増殖
反応に先立ち、形質転換体を好気条件下、温度約２５〜３８℃で、約１２〜４８時間培養して増殖させることが好ましい。
Prior to the growth reaction of the cells, it is preferable to culture the transformants under aerobic conditions at a temperature of about 25 to 38 ° C. for about 12 to 48 hours to grow them.
培養用培地
反応に先立つ形質転換体の好気的培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類及びその他の栄養物質等を含有する天然培地又は合成培地を用いることができる。
炭素源として、糖類（グルコース、フルク卜ース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラク卜ース等の単糖；スクロース、マル卜ース、ラク卜ース、セロビオース、キシロビオース、卜レハロース等の二糖；澱粉等の多糖；糖蜜等）、マンニ卜ール、ソルビ卜ール、キシリ卜ールグリセリン等の糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸等の有機酸；エタノール、プロパノール等のアルコール；ノルマルパラフィン等の炭化水素等も用いることができる。
Culture medium As the medium used for aerobic culture of the transformant prior to the reaction, a natural medium or a synthetic medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, other nutrients and the like can be used.
As a carbon source, sugars (monosaccharides such as glucose, flux, mannose, xylose, arabinose, and galax); disaccharides such as sucrose, malus, lax, cellobiose, xylose, and lehalose. ; Polysaccharides such as starch; sugar alcohols such as mannose, sorbyl, xylose and glycerin; organic acids such as acetic acid, quenching, lactic acid, fumaric acid, maleic acid, and gluconic acid; ethanol, Alcohols such as propanol; hydrocarbons such as normal paraffin can also be used.
炭素源は、１種を単独で、または２種以上を混合して使用できる。
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、ＮＺアミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。窒素源の培地中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常約０．１〜１０（ｗ／ｖ％）とすればよい。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種を単独で、２種以上を混合して使用できる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常約０．０１〜１（ｗ／ｖ％）とすればよい。
As the carbon source, one type may be used alone, or two or more types may be mixed and used.
As the nitrogen source, inorganic or organic ammonium compounds such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate and ammonium acetate, urea, aqueous ammonia, sodium nitrate, potassium nitrate and the like can be used. Further, nitrogen-containing organic compounds such as corn steep liquor, meat extract, peptone, NZ amine, protein hydrolyzate, and amino acid can also be used. As the nitrogen source, one type may be used alone, or two or more types may be mixed and used. The concentration of the nitrogen source in the medium varies depending on the nitrogen compound used, but is usually about 0.1 to 10 (w / v%).
Examples of the inorganic salts include primary potassium phosphate, secondary potassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous nitrate, manganese sulfate, zinc sulfate, cobalt sulfate, calcium carbonate and the like. As the inorganic salt, one type can be used alone, or two or more types can be mixed and used. The concentration of the inorganic salt in the medium varies depending on the inorganic salt used, but is usually about 0.01 to 1 (w / v%).
栄養物質としては、肉エキスペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、動植物又は微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地中の濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約０．１〜１０（ｗ／ｖ）％とすればよい。
さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、イノシ卜ール、ニコチン酸等が挙げられる。培地のｐＨは約６〜８が好ましい。
Examples of the nutritional substance include meat extract peptone, polypeptone, yeast extract, dried yeast, corn steep liquor, skim milk powder, skim soybean hydrochloric acid hydrolyzate, animal and plant or microbial cell extracts and their decomposition products. The concentration of the nutrient substance in the medium varies depending on the nutrient substance used, but is usually about 0.1 to 10 (w / v)%.
Furthermore, vitamins can be added if necessary. Examples of vitamins include biotin, thiamine (vitamin B1), pyridoxine (vitamin B6), pantothenic acid, wild boar, nicotinic acid and the like. The pH of the medium is preferably about 6-8.
具体的な好ましいコリネバクテリウム グルタミ力ム用培地としては、Ａ培地〔Inui, M. et al.,Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、ＢＴ培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。 Specific preferred mediums for corynebacterium glutamicum include medium A [Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7 : 182-196 (2004)], BT medium [Omumasaba, CA et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8: 91-103 ( 2004)] and the like. In these media, the sugar concentration may be set within the above range.
反応液は、糖類又は本開示に係る形質転換体が代謝によりアセチルＣｏＡを生成し得る化合物を含有する水、緩衝液、無機塩培地等を用いることができる。
糖類としては、グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロース、又はマンニトールが好ましい。
緩衝液としては、リン酸バッフアー、卜リスバッファー、炭酸バッファーなどが挙げられる。緩衝液の濃度は約１０〜１５０ｍＭが好ましい。
無機塩培地としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等の無機塩の１種又は２種以上を含む培地が挙げられる。中でも、硫酸マグネシウムを含む培地が好ましい。無機塩培地として、具体的にはＢＴ培地等が挙げられる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約０．０１〜１（ｗ／ｖ％）とすればよい。
反応液のｐＨは約６〜８が好ましい。反応中は、アンモニア水溶液、水酸化ナトリウム水溶液などを用いて、ｐＨコントローラー（例えば、エイブル株式会社製、型式：ＤＴ−１０２３）で、反応液のｐＨを中性付近、特に約７にコントロールしながら反応させることが好ましい。
As the reaction solution, water, a buffer solution, an inorganic salt medium or the like containing a saccharide or a compound capable of producing acetyl-CoA by metabolism of the transformant according to the present disclosure can be used.
As the saccharide, glucose, fructose, mannose, xylose, arabinose, galactose, sucrose, maltose, lactose, cellobiose, xylobiose, trehalose, or mannitol are preferable.
Examples of the buffer solution include a phosphate buffer, a squirrel buffer, and a carbonic acid buffer. The concentration of the buffer solution is preferably about 10 to 150 mM.
As the inorganic salt medium, one or two kinds of inorganic salts such as primary potassium phosphate, secondary potassium phosphate, manesium sulfate, sodium chloride, ferrous nitrate, manganese sulfate, zinc sulfate, cobalt sulfate, and calcium carbonate. Examples include a medium containing the above. Of these, a medium containing magnesium sulfate is preferable. Specific examples of the inorganic salt medium include a BT medium and the like. The concentration of the inorganic salt in the medium varies depending on the inorganic salt used, but is usually about 0.01 to 1 (w / v%).
The pH of the reaction solution is preferably about 6-8. During the reaction, the pH of the reaction solution is controlled to near neutral, particularly to about 7, with a pH controller (for example, manufactured by Able Inc., model: DT-1023) using an aqueous ammonia solution, an aqueous sodium hydroxide solution, or the like. It is preferable to react.
反応条件
反応温度、即ち反応中の形質転換体の生存温度は、約２０〜５０℃が好ましく、約２５〜４７℃がより好ましい。上記温度範囲であれば効率良く１，３−ブタンジオールを製造できる。
また、反応時聞は約１〜７日聞が好ましく、約１〜３日聞がより好ましい。培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でもバッチ式が好ましい。
Reaction conditions The reaction temperature, that is, the survival temperature of the transformant during the reaction is preferably about 20 to 50 ° C, more preferably about 25 to 47 ° C. Within the above temperature range, 1,3-butanediol can be efficiently produced.
In addition, the reaction time is preferably about 1 to 7 days, more preferably about 1 to 3 days. The culture may be a batch type, a fed-batch type, or a continuous type. Of these, the batch type is preferable.
通気条件
反応は、還元条件、あるいは微好気的条件で行ってもよい。いずれの条件においてもコリネバクテリウム グルタミ力ムは実質的に増殖しない反応で行われるため、一層効率的に１，３−ブタンジオールを生産させることができる。
還元条件は、反応液の酸化還元電位で規定される。反応液の酸化還元電位は、約−２００ｍＶ〜−５００ｍＶが好ましく、−２５０ｍＶ〜−５００ｍＶがより好ましい。
反応液の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬（還元状態であれば、青色から無色への脱色）で推定できるが、正確には酸化還元電位差計（例えば、ＢＲＯＡＤＬＥＹ ＪＡＭＥＳ社製、ＯＲＰ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ）を用いて測定できる。
還元条件にある反応液の調整方法は、公知の方法を制限なく使用できる。
例えば、反応液調製用の液体媒体として、蒸留水などの代わりに反応液用水溶液を使用してもよく反応液用水溶液の調整方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の培養液調整方法（Pfennig, N. et al,(1981 ) : The dissimilatory sulfate-reducing bacteria, In The Prokaryotes, A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria Ed. By Starr, M. P. et al.,p.926-940, Berlin, Springer Verlag.）や「農芸化学実験書 第三巻、京都大学農学部 農芸化学教室編、１９９０年第２６刷、産業図書株式会社出版」などが参考となり、所望する還元条件下の水溶液を得ることができる。
具体的には、蒸留水などを加熱処理や減圧処理して溶解ガスを除去することにより、還元条件の反応液用水溶液を得ることができる。この場合、約１０ｍｍＨｇ以下、好ましくは約５ｍｍＨｇ以下、より好ましくは約３ｍｍＨｇ以下の減圧下で、約１〜６０分程度、好ましくは約５〜４０分程度、蒸留水などを処理することにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去して還元条件下の反応液用水溶液を作成することができる。
また、適当な還元剤（例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メル力プ卜酢酸、チオール酢酸、グルタチオン、硫化ソーダ等）を添加して還元条件の反応液用水溶液を調整することもできる。
これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元条件の反応液用水溶液の調製方法である。
Aeration conditions The reaction may be carried out under reducing conditions or slightly aerobic conditions. Under either condition, Corynebacterium glutamic acid is carried out in a reaction that does not substantially proliferate, so that 1,3-butanediol can be produced more efficiently.
The reduction conditions are defined by the redox potential of the reaction solution. The redox potential of the reaction solution is preferably about −200 mV to −500 mV, more preferably −250 mV to −500 mV.
The reduced state of the reaction solution can be easily estimated with a resazurin indicator (in the reduced state, decolorization from blue to colorless), but to be precise, a redox potentiometer (for example, ORP Electrodes manufactured by BROADLEY JAMES) is used. Can be measured.
As a method for adjusting the reaction solution under the reducing conditions, a known method can be used without limitation.
For example, as the liquid medium for preparing the reaction solution, an aqueous solution for the reaction solution may be used instead of distilled water or the like. The method for preparing the aqueous solution for the reaction solution is, for example, a culture solution for an absolutely anaerobic microorganism such as a sulfate-reducing microorganism. Adjustment method (Pfennig, N. et al, (1981): The dissimilatory sulfate-reducing bacteria, In The Prokaryotes, A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria Ed. By Starr, MP et al., P.926-940 , Berlin, Springer Verlag.) And "Agricultural Chemistry Experiment Book Volume 3, Kyoto University Faculty of Agriculture, Department of Agricultural Chemistry, 1990, 26th Print, Sangyo Tosho Co., Ltd." Obtainable.
Specifically, an aqueous solution for a reaction solution under reducing conditions can be obtained by removing the dissolved gas by heat-treating or reducing the pressure of distilled water or the like. In this case, it is dissolved by treating distilled water or the like for about 1 to 60 minutes, preferably about 5 to 40 minutes under reduced pressure of about 10 mmHg or less, preferably about 5 mmHg or less, more preferably about 3 mmHg or less. The gas, especially the dissolved oxygen, can be removed to prepare an aqueous solution for the reaction solution under reducing conditions.
In addition, an appropriate reducing agent (for example, thioglycolic acid, ascorbic acid, cystine hydrochloride, mel-powered acetic acid, thiol acetic acid, glutathione, sodium sulfide, etc.) is added to prepare an aqueous solution for a reaction solution under reducing conditions. You can also.
An appropriate combination of these methods is also a method for preparing an aqueous solution for a reaction solution under effective reducing conditions.
反応途中での還元条件を維持する場合は、反応系外からの酸素の混入を可能な限り防止することが望ましく、具体的には、反応系を窒素ガス等の不活性ガスや炭酸ガス等で封入する方法が挙げられる。酸素混入をより効果的に防止する方法としては、反応途中において本発明の好気性細菌の菌体内の代謝機能を効率よく機能させるために、反応系のｐＨ維持調整液の添加や各種栄養素溶解液を適宜添加する必要が生じる場合もあるが、このような場合には添加溶液から酸素を予め除去しておくことが有効である。
反応途中で微好気条件を維持する場合は、通気量を０．５ｖｖｍ（ｖｏｌｕｍｅ ｐｅｒ ｖｏｌｕｍｅ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ）などの低値あるいはそれ以下とし、攪拌速度を５００ ｒｐｍなどの低値あるいはそれ以下の条件で反応させることができる。場合によっては、反応開始後、適当な時間で通気を遮断し、撹拌速度を１００ｒｐｍあるいはそれ以下の条件で嫌気度を向上させた状態と組み合わせて反応することもできる。
When maintaining the reduction conditions during the reaction, it is desirable to prevent the mixing of oxygen from outside the reaction system as much as possible. Specifically, the reaction system is made of an inert gas such as nitrogen gas or carbon dioxide gas. A method of encapsulation can be mentioned. As a method for more effectively preventing oxygen contamination, in order to efficiently function the metabolic function of the aerobic bacterium of the present invention in the cells during the reaction, the pH maintenance adjusting solution of the reaction system is added or various nutrient dissolving solutions are added. It may be necessary to add oxygen as appropriate, but in such a case, it is effective to remove oxygen from the added solution in advance.
When maintaining a microaerobic condition during the reaction, the air volume should be set to a low value such as 0.5 vvm (volume per volume per minute) or less, and the stirring speed should be set to a low value such as 500 rpm or less. Can be reacted. In some cases, after the reaction is started, the aeration can be cut off at an appropriate time, and the reaction can be carried out in combination with a state in which the anaerobic degree is improved under the condition of a stirring speed of 100 rpm or less.
１，３−ブタンジオールの回収
上記のようにして培養することにより、反応液中に１，３−ブタンジオールが生産される。反応液を回収することにより１，３−ブタンジオールを回収できるが、さらに、公知の方法で１，３−ブタンジオールを反応液から分離することもできる。そのような公知の方法として、蒸留法、膜透過法、有機溶媒抽出法等が挙げられる。
Recovery of 1,3-butanediol By culturing as described above, 1,3-butanediol is produced in the reaction solution. Although 1,3-butanediol can be recovered by recovering the reaction solution, 1,3-butanediol can also be separated from the reaction solution by a known method. Examples of such known methods include a distillation method, a membrane permeation method, an organic solvent extraction method, and the like.
本開示はさらに以下の一又は複数の実施形態に関する。
〔１〕 シナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）ファミリーに属するアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子が宿主細菌に導入され、かつ、
前記宿主細菌は、下記（Ａ）〜（Ｄ）の酵素の少なくとも１つが発現可能なように又は発現誘導可能なように変異又は遺伝子が導入されている、形質転換体。
（Ａ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ
（Ｂ）アセトアセチルＣｏＡ合成酵素
（Ｃ）アセトアセチルＣｏＡ還元酵素
（Ｄ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ還元酵素
〔２〕 さらに、前記宿主細菌は、下記（Ａ’）〜（Ｄ’）の酵素の少なくとも１つが機能低下又は機能欠損している、〔１〕に記載の形質転換体。
（Ａ’）ホスホエノールピルビン酸を基質としてオキサロ酢酸を生成する反応を触媒するホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＰＣ）
（Ｂ’）ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）
（Ｃ’）アセテートキナーゼ（ＡＣＫ）
（Ｄ’）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）
〔３〕 宿主細菌が、コリネ型細菌である、〔１〕又は〔２〕に記載の形質転換体。
〔４〕 宿主細菌が、コリネバクテリウム属細菌である、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の形質転換体。
〔５〕 １，３−ブタンジオールの生産能を有する、又は、１，３−ブタンジオールの生産に使用するための、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の形質転換体。
〔６〕 シナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）ファミリーに属するアルコール脱水素酵素が、クロノバクター（Cronobacter）属、エシェリキア（Escherichia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、バチルス（Bacillus）属、又はロドコッカス（Rhodococcus）属由来のものである、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の形質転換体。
〔７〕 シナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）ファミリーに属するアルコール脱水素酵素が、クロノバクター サカザキ（Cronobacter sakazakii）、エシェリキア コリ（Escherichia coli）、コリネバクテリウム エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム テルペノタビドゥム（Corynebacterium terpenotabidum）、マイコバクテリウム スメグマティス（Mycobacterium smegmatis）、バチルス サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス メガテリウム（Bacillus megaterium）、ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、又はロドコッカス ジョスティ（Rhodococcus jostii）由来のものである、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の形質転換体。
〔８〕 コリネバクテリウム グルタミカム Ｒ−ＢＤ１株（Corynebacterium glutamicum R-BD1）（受託番号:NITE BP-03015）コリネ型細菌形質転換体。
〔８〕 形質転換体を、糖類、又は前記形質転換体が代謝によりアセチルCoAを生成し得る化合物を含む反応液中で培養する反応工程と、
反応培地中の１，３−ブタンジオールを回収する回収工程とを含み、
前記形質転換体は、シナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）ファミリーに属するアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子が宿主細菌に導入されている形質転換体である、１，３−ブタンジオールの製造方法。
〔１０〕 形質転換体が、〔１〕から〔８〕のいずれかに記載の形質転換体である、〔９〕に記載の１，３−ブタンジオールの製造方法。
〔１１〕 反応工程が、好気的、かつ形質転換体が増殖しない条件下で形質転換体を培養することを含む、〔９〕又は〔１０〕に記載の１，３−ブタンジオールの製造方法。
The present disclosure further relates to one or more embodiments below.
[1] A gene encoding an alcohol dehydrogenase belonging to the cinnamil alcohol dehydrogenase (CAD) family has been introduced into the host bacterium, and
The host bacterium is a transformant into which a mutation or gene has been introduced so that at least one of the enzymes (A) to (D) below can be expressed or induced.
(A) Acetyl CoA carboxylase (B) Acetoacetyl CoA synthase (C) Acetoacetyl CoA reductase (D) 3-Hydroxybutyryl CoA reductase [2] Further, the host bacteria are described in the following (A') to (A') to ( The transformant according to [1], wherein at least one of the enzymes of D') is dysfunctional or deficient.
(A') Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PPC) that catalyzes the reaction that produces oxaloacetate using phosphoenolpyruvate as a substrate.
(B') Phosphotransacetylase (PTA)
(C') Acetate Kinase (ACK)
(D') Lactate dehydrogenase (LDH)
[3] The transformant according to [1] or [2], wherein the host bacterium is a coryneform bacterium.
[4] The transformant according to any one of [1] to [3], wherein the host bacterium is a Corynebacterium genus bacterium.
[5] The transformant according to any one of [1] to [4], which has the ability to produce 1,3-butanediol or is used for the production of 1,3-butanediol.
[6] Alcohol dehydrogenases belonging to the cinnamil alcohol dehydrogenase (CAD) family include Cronobacter, Escherichia, Corynebacterium, Mycobacterium, and Bacillus. The transformant according to any one of [1] to [5], which is derived from the genus Bacillus or the genus Rhodococcus.
[7] Alcohol dehydrogenases belonging to the cinnamil alcohol dehydrogenase (CAD) family include Chronobacter sakazakii, Escherichia coli, Corynebacterium efficiens, and Corynebacterium terpenotavidum. (Corynebacterium terpenotabidum), Mycobacterium smegmatis, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Rhodococcus erythropolis (Rhodococcus erythropolis), or Rhodococcus erythropolis (Rhodococcus erythropolis) The transformant according to any one of [1] to [6].
[8] Corynebacterium glutamicum R-BD1 strain (Corynebacterium glutamicum R-BD1) (accession number: NITE BP-03015) Corynebacterium-type bacterial transformant.
[8] A reaction step of culturing the transformant in a reaction solution containing a saccharide or a compound capable of producing acetyl-CoA by metabolism of the transformant.
Including a recovery step of recovering 1,3-butanediol in the reaction medium.
A method for producing 1,3-butanediol, wherein the transformant is a transformant in which a gene encoding an alcohol dehydrogenase belonging to the cinamyl alcohol dehydrogenase (CAD) family has been introduced into a host bacterium.
[10] The method for producing 1,3-butanediol according to [9], wherein the transformant is the transformant according to any one of [1] to [8].
[11] The method for producing 1,3-butanediol according to [9] or [10], wherein the reaction step comprises culturing the transformant under conditions that are aerobic and the transformant does not grow. ..
以下、実施例を用いて本開示をさらに説明する。ただし、本開示は以下の実施例に限定して解釈されない。 Hereinafter, the present disclosure will be further described with reference to Examples. However, this disclosure is not construed as limited to the following examples.
［実施例１］
１．原核生物のシナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）ファミリーに属する中鎖アルコール脱水素酵素のデータベースからの抽出
（１）大腸菌由来ＹｊｇＢ及びマイコバクテリウム ボビス（Mycobacterium bovis）由来ＡｄｈＣ相同タンパク質の探索
ＢＬＡＳＴＰプログラムを用い、配列番号２及び１９のアミノ酸配列をクエリー配列とし、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから大腸菌由来ＹｊｇＢあるいはマイコバクテリウム ボビス（Mycobacterium bovis）由来ＡｄｈＣと相同性を有するアミノ酸配列を抽出した。抽出されたアミノ酸配列に関する情報を表１に示す。
[Example 1]
1. 1. Extraction from the database of medium-chain alcohol dehydrogenases belonging to the prokaryotic cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) family (1) Search for YjgB derived from Escherichia coli and AdhC homologous protein derived from Mycobacterium bovis Using the BLASTP program, Using the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 and 19 as query sequences, amino acid sequences having homology with YjgB derived from Escherichia coli or AdhC derived from Mycobacterium bovis were extracted from the GenBank database. Information on the extracted amino acid sequences is shown in Table 1.
（２）大腸菌ＹｊｇＢ及びマイコバクテリウム ボビス（Mycobacterium bovis）ＡｄｈＣ相同タンパク質の系統解析
表１に示すタンパク質のアミノ酸配列と、ヒト、植物、ならびに原核生物のアルコール脱水素酵素のアミノ酸配列を用い、配列比較解析を行い、系統樹を構築した。結果を図１に示す。図１において四角枠で囲まれたタンパク質がシナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）ファミリーである。この結果から表１の中鎖アルコール脱水素酵素がＣＡＤファミリーに属することが確認された。なお、図１の系統樹の酵素のタンパク質及び起源を図２に示す。
(2) Phylogenetic analysis of Escherichia coli YjgB and Mycobacterium bovis AdhC homologous protein Sequence comparison using the amino acid sequences of the proteins shown in Table 1 and the amino acid sequences of human, plant, and prokaryotic alcohol dehydrogenase. Analysis was performed and a phylogenetic tree was constructed. The results are shown in FIG. The proteins surrounded by a square in FIG. 1 are the cinamyl alcohol dehydrogenase (CAD) family. From this result, it was confirmed that the medium-chain alcohol dehydrogenase in Table 1 belongs to the CAD family. The protein and origin of the enzyme in the phylogenetic tree of FIG. 1 are shown in FIG.
２．中鎖アルコール脱水素酵素の単離及び発現
（１）染色体ＤＮＡの調整・入手
Escherichia coli K-12 MG1655、Cronobacter sakazakii JCM 1233、Corynebacterium efficiens NBRC100395、Corynebacterium terpenotabidum JCM10555、Mycobacterium smegmatis ATCC700084、Bacillus subtilis NBRC14144、Bacillus megaterium JCM2506、Rhodococcus erythropolis ATCC27854、及びRhodococcus jostii JCM11615の染色体ＤＮＡは、菌株入手機関の情報に従って培養した後、ＤＮＡゲノム抽出キット（商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製）を用いて調製した。
2. Isolation and expression of medium-chain alcohol dehydrogenase (1) Preparation and acquisition of chromosomal DNA
Escherichia coli K-12 MG1655, Cronobacter sakazakii JCM 1233, Corynebacterium efficiens NBRC100395, Corynebacterium terpenotabidum JCM10555, Mycobacterium smegmatis ATCC700084, Bacillus subtilis NBRC14144, Bacillus megaterium JCM2506, Rhodococcus After culturing according to the above, the cells were prepared using a DNA genome extraction kit (trade name: Genomic Prep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, manufactured by Amasham).
（２）中鎖アルコール脱水素酵素遺伝子の単離
目的の酵素遺伝子の単離に用いたプライマー配列を表２に示す。ＰＣＲは、GeneAmp PCR System 9700（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてTks Gflex DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いた。
(2) Isolation of medium-chain alcohol dehydrogenase gene Table 2 shows the primer sequences used for isolation of the target enzyme gene. For PCR, GeneAmp PCR System 9700 (manufactured by Applied Biosystems) was used, and Tks Gflex DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was used as a reaction reagent.
ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片をＰｌｄｈＡプロモーターを有するクローニングベクターＬｌｄｈ４に導入した。
得られたプラスミド名を表３に示す。
The PCR-amplified DNA fragment was introduced into the cloning vector Lldh4 having the PldhA promoter.
The names of the obtained plasmids are shown in Table 3.
（３）中鎖アルコール脱水素酵素発現株の構築
表３のプラスミドを用いて、コリネバクテリウム グルタミカムＲ株の形質転換を行った。
得られた中鎖アルコール脱水素酵素発現株を表４に示す。
(3) Construction of medium-chain alcohol dehydrogenase-expressing strain Corynebacterium glutamicum R strain was transformed using the plasmid shown in Table 3.
The obtained medium-chain alcohol dehydrogenase expression strains are shown in Table 4.
３．中鎖アルコール脱水素酵素発現株の１，３−ブタンジオール酸化活性の測定
実施例１において作成したコリネバクテリウム グルタミカム Ｒ＿ＣｓＹｊｇＢ、Ｒ＿ＥｃＹｊｇＢ、Ｒ＿ＣｔＡｄｈＣ、Ｒ＿ＭｓＡｄｈＣ、Ｒ＿ＢｍＡｄｈＣ、及びＲ＿ＲｅＡｄｈＣ株を、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＡ寒天培地［（ＮＨ2）2ＣＯ ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、０．０６％（ｗ／ｖ）Ｆｅ2ＳＯ4・７Ｈ2Ｏ＋０．０４２％（ｗ／ｖ）ＭｎＳＯ4・２Ｈ2Ｏ １ｍｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ビオチン水溶液 １ｍｌ、０．０１％（ｗ／ｖ）チアミン水溶液 ２ｍｌ、酵母エクストラクト ２ｇ、ｖｉｔａｍｉｎ ａｓｓａｙカザミノ酸 ７ｇ、グルコース ４０ｇ、寒天 １５ｇを蒸留水１Ｌに懸濁］に塗布し、３０℃、２４時間暗所に静置した。対照区としてベクター導入株を同様に培養した。
3. 3. Measurement of 1,3-Butanediol Oxidation Activity of Medium-Chain Alcohol Dehydrogenase-Expressing Strain The corinebacterium glutamicum R_CsYjgB, R_EcYjgB, R_CtAdhC, R_MsAdhC, R_BmAdhC, and R_ReAdhC strains prepared in Example 1 containing 50 μg / ml of canamicin. A agar medium [(NH 2) 2 CO 2g , (NH 4) 2 SO 4 7g, KH 2 PO 4 0.5g, K 2 HPO 4 0.5g, MgSO 4 · 7H 2 O 0.5g, 0.06 % (w / v) Fe 2 SO 4 · 7H 2 O + 0.042% (w / v) MnSO 4 · 2H 2 O 1ml, 0.02% (w / v) biotin solution 1ml, 0.01% (w / v) 2 ml of an aqueous thiamine solution, 2 g of yeast extract, 7 g of vitamin assay casamino acid, 40 g of glucose, and 15 g of agar were suspended in 1 L of distilled water] and allowed to stand in a dark place at 30 ° C. for 24 hours. The vector-introduced strain was similarly cultured as a control group.
上記のプレートで生育したコリネバクテリウム グルタミカムＲ＿ＣｓＹｊｇＢ、Ｒ＿ＥｃＹｊｇＢ、Ｒ＿ＣｔＡｄｈＣ、Ｒ＿ＭｓＡｄｈＣ、Ｒ＿ＢｍＡｄｈＣ、Ｒ＿ＲｅＡｄｈＣ株、及びベクター導入株（ＥＶ）を、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含有したＡ液体培地２．５ｍｌの入った試験管に一白金耳植菌し、３０℃にて２０時間、好気的に振盪培養を行った。このようにして培養増殖されたそれぞれの菌体は、遠心分離（４℃、４，０００×ｇ、７分）により菌体を回収した。 Corinebacterium glutamicum R_CsYjgB, R_EcYjgB, R_CtAdhC, R_MsAdhC, R_BmAdhC, R_ReAdhC strain, and vector-introduced strain (EV) grown on the above plate were contained in 2.5 ml of A liquid medium containing 50 μg / ml of kanamycin. The cells were inoculated into loop loops and aerobically shake-cultured at 30 ° C. for 20 hours. Each of the cells cultured and propagated in this manner was collected by centrifugation (4 ° C., 4,000 × g, 7 minutes).
得られた菌体を１ｍｌの菌体抽出用緩衝液［２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）、５ｍＭ ジチオスレイトール、１５％ グリセロール］に懸濁し、安井器械株式会社製マルチビーズショッカーを用いて菌体を破砕した。遠心分離（４℃、２０，０００×ｇ、１０分）により不純物を除いた上清を無細胞抽出液とした。 The obtained cells were suspended in 1 ml of a buffer for extracting cells [20 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.2), 5 mM dithiothreitol, 15% glycerol], and using a multi-bead shocker manufactured by Yasui Kikai Co., Ltd. The cells were crushed. The supernatant from which impurities were removed by centrifugation (4 ° C., 20,000 × g, 10 minutes) was used as a cell-free extract.
酵素活性（酸化活性）の測定は、５０ｍＭの１，３−ブタンジオール、０．２ｍＭのＮＡＤＰ+、及び無細胞抽出液を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌの反応液を３０℃で３０分間反応させ、その間の３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行い、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰ+をＮＡＤＰＨに還元する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。図３に示すとおり、解析した全てのＹｊｇＢ及びＡｄｈＣ相同タンパク質発現株において、１，３−ブタンジオール酸化活性が検出された。対照区として用いたベクター導入株（ＥＶ）由来のサンプルでは、１，３−ブタンジオール酸化活性は検出されなかった。これらの結果からＹｊｇＢ及びＡｄｈＣ相同タンパク質が１，３−ブタンジオール酸化活性を有することが確認された。
なお、図１の系統樹でＣＡＤファミリーに属さないタンパク質（ＥｃｙｑｈＤ、ＭｍｙｑｈＤ、ＬｐＰＤＤＨ、及びＰｏＰＤＤＨ）を同様に形質転換した株では、ベクター導入株（ＥＶ）程度の１，３−ブタンジオール酸化活性しか確認できなかった。
The enzyme activity (oxidative activity) was measured by using 1 ml of a 50 mM Tris-hydrogen buffer (pH 7.2) containing 50 mM 1,3-butanediol, 0.2 mM NADP +, and a cell-free extract at 30 ° C. The enzyme activity of reducing 1 μmol of NADP + to NADPH in 1 minute was defined as 1 unit. As shown in FIG. 3, 1,3-butanediol oxidizing activity was detected in all the YjgB and AdhC homologous protein expression strains analyzed. No 1,3-butanediol oxidizing activity was detected in the sample derived from the vector-introduced strain (EV) used as the control group. From these results, it was confirmed that the YjgB and AdhC homologous proteins have 1,3-butanediol oxidizing activity.
In the phylogenetic tree of FIG. 1, the strains similarly transformed with proteins (EcyqhD, MyqhD, LpPDDH, and PoPDDH) that do not belong to the CAD family have only 1,3-butanediol oxidative activity equivalent to that of the vector-introduced strain (EV). I couldn't confirm.
［実施例２］
１．１，３−ブタンジオール生産株の構築
（１）染色体ＤＮＡの調整・入手
上記［実施例１］２．（１）で調製した染色体ＤＮＡに加え、Corynebacterium glutamicum R (FERM P-18976)、Clostridium beijerinckii DSM 6422の染色体ＤＮＡを、菌株入手機関の情報に従って培養した後、ＤＮＡゲノム抽出キット（商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製）を用いて調製した。
[Example 2]
1. Construction of 1,3-butanediol-producing strain (1) Preparation and acquisition of chromosomal DNA [Example 1] 2. In addition to the chromosomal DNA prepared in (1), the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum R (FERM P-18976) and Clostridium beijerinckii DSM 6422 was cultured according to the information of the strain acquisition institution, and then the DNA genome extraction kit (trade name: GenomicPrep Cells). And Tissue DNA Isolation Kit (manufactured by Amasham).
（２）１，３−ブタンジオール生産関連遺伝子の単離
目的の酵素遺伝子の単離に用いたプライマー配列を表５に示す。ＰＣＲは、GeneAmp PCR System 9700（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてTks Gflex DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いた。ストレプトマイセス テンダエ（Streptomyces tendae）由来のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子ａａｃｓ、及びラクトバチルス ブレビス（Lactobacillus brevis）由来のアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子ｅｕｔＥは、コリネバクテリウム グルタミカムにおける発現のためコドン最適化した遺伝子を人工合成により作成した（配列番号５５及び５６）。
なお、１，３−ブタンジオール生産関連遺伝子がコードする酵素は以下の通り。
ａｃｃ：アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ
ａａｃｓ：アセトアセチルＣｏＡ合成酵素
ｈｂｄ：β―ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ
ｅｕｔＥ：アルデヒドデヒドロゲナーゼ
(2) Isolation of 1,3-butanediol production-related genes Table 5 shows the primer sequences used for isolation of the target enzyme gene. For PCR, GeneAmp PCR System 9700 (manufactured by Applied Biosystems) was used, and Tks Gflex DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was used as a reaction reagent. The acetoacetyl CoA synthase gene aax from Streptomyces tendae and the acetoaldehyde dehydrogenase gene euteE from Lactobacillus brevis artificially synthesize codon-optimized genes for expression in corynebacterium glutamicum. (SEQ ID NOS: 55 and 56).
The enzymes encoded by the genes related to 1,3-butanediol production are as follows.
acc: Acetyl-CoA carboxylase aacs: Acetyl-acetyl-CoA synthase hbd: β-hydroxybutyryl CoA dehydrogenase eutE: Aldehyde dehydrogenase
ａａｃｓ遺伝子、ａｃｃＢＣ遺伝子、ａｃｃＤ１遺伝子、及びａｃｃＥ遺伝子はＰｔａｃプロモーターを含有するクローニングベクターＬｔａｃ５に導入した。ｈｂｄ遺伝子ならびにｅｕｔＥ遺伝子はＰｇａｐＡプロモーターを有するクローニングベクターＬｇａｐ１０に導入した。得られたプラスミドを表６に示す。
ｙｊｇＢ遺伝子及びａｄｈＣ遺伝子はＰｌｄｈＡプロモーターを有するクローニングベクターＬｌｄｈ４に導入した（上記表３）。
The aacs gene, accBC gene, accD1 gene, and accE gene were introduced into the cloning vector Ltac5 containing the Ptac promoter. The hbd gene and the eutE gene were introduced into the cloning vector Lgap10 having the PgapA promoter. The obtained plasmid is shown in Table 6.
The yjgB gene and the adhC gene were introduced into the cloning vector Lldh4 having the PldhA promoter (Table 3 above).
（３）１，３−ブタンジオール生産関連遺伝子発現プラスミドの構築
Ｌｔａｃ５Ｓｔａａｃｓ、Ｌｇａｐ１０ＬｂｅｕｔＥ、Ｌｌｄｈ４ＣｓｙｊｇＢ、Ｌｌｄｈ４ＥｃｙｊｇＢ、Ｌｌｄｈ４ＣｔａｄｈＣ、Ｌｌｄｈ４ＭｓａｄｈＣ、Ｌｌｄｈ４ＢｍａｄｈＣ、及びＬｌｄｈ４ＲｅａｄｈＣからプロモーター及びターミネーターを含む各遺伝子配列を、クローニングベクターｐＣＲＢ２２に導入した。
Ｌｔａｃ５ＣｇａｃｃＢＣ、Ｌｔａｃ５ＣｇａｃｃＤ１、及びＬｔａｃ５ＣｇａｃｃＥからプロモーター及びターミネーターを含む各遺伝子配列を、クローニングベクターｐＣＲＢ５５に導入した。
得られたプラスミドを表７に示す。
(3) Construction of 1,3-butanediol production-related gene expression plasmid Ltac5Stacs, Lgap10LbutE, Lldh4CsyjgB, Lldh4EcyjgB, Lldh4CtadhC, Lldh4MsadhC, Lldh4MsadhC, Lldh4MsadhC, Lldh4MsadhC, Lldh4MsadhC, Lldh4MsadhC, Lldh4MsadhC, Lldh4MsadhC, Lldh4MsadhC
Each gene sequence containing a promoter and a terminator from Ltac5CgaccBC, Ltac5CgaccD1 and Ltac5CgaccE was introduced into the cloning vector pCRB55.
The obtained plasmid is shown in Table 7.
（４）１，３−ブタンジオール生産関連遺伝子染色体導入用プラスミドの構築
Ｌｇａｐ１０Ｃｂｈｂｄからプロモーター及びターミネーターを含む遺伝子配列を、マーカーレス染色体遺伝子導入用ベクターＬＫＳｉｎｄ１−４に導入した。
得られたプラスミドを表８に示す。
(4) Construction of plasmid for 1,3-butanediol production-related gene chromosome transfer A gene sequence containing a promoter and a terminator was introduced from Lgap10Cbhbd into a markerless chromosome gene transfer vector LKSind1-4.
The obtained plasmids are shown in Table 8.
（５）染色体遺伝子組換えによる１，３−ブタンジオール生産株の構築
マーカーレス染色体遺伝子導入用ベクターＬＫＳｉｎｄ１−４は、コリネバクテリウム グルタミカムＲ内で複製できない。ＬＫＳｉｎｄ１−４に導入した染色体上の相同領域と当該ベクター由来のプラスミド間の一重交叉により生じる組換え株は、ＬＫＳｉｎｄ１−４上のカナマイシン耐性遺伝子及びバチルス サブチリス（Bacillus subtilis）由来のｓａｃＲ−ｓａｃＢ遺伝子の発現により、カナマイシン耐性及びスクロース感受性を示す。当該組換え株より派生する二重交叉株は、ＬＫＳｉｎｄ１−４由来のカナマイシン耐性遺伝子及びｓａｃＲ−ｓａｃＢ遺伝子の脱落により、カナマイシン感受性及びスクロース耐性を示す。従って、目的遺伝子導入株は、カナマイシン感受性及びスクロース耐性を示す。
ＬＫＳｉｎｄ１−４Ｃｂｈｂｄを用い、上記の手法により、ｈｂｄ染色体導入株を構築した。さらに、同様の原理に基づき、マーカーレス遺伝子破壊用ベクターｐＣＲＡ７２５を用いて、ｌｄｈＡ、ｐｔａ、ａｃｋ、及びｐｐｃ遺伝子のマーカーレス破壊を行った。
これらの遺伝子がコードする酵素は以下の通り。
ｌｄｈＡ：乳酸脱水素酵素
ｐｔａ：ホスホトランスアセチラーゼ
ａｃｋ：アセテートキナーゼ
ｐｐｃ：ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
得られた菌株を表９に示す。
(5) Construction of 1,3-butanediol-producing strain by chromosomal gene recombination The markerless chromosomal gene transfer vector LKSind1-4 cannot replicate in Corynebacterium glutamicum R. The recombinant strain generated by the single crossover between the homologous region on the chromosome introduced into LKSind1-4 and the plasmid derived from the vector is the kanamycin resistance gene on LKSind1-4 and the sacR-sacB gene derived from Bacillus subtilis. By expression, it exhibits kanamycin resistance and plasmid sensitivity. The double crossed strain derived from the recombinant strain exhibits kanamycin sensitivity and sucrose resistance due to the loss of the kanamycin resistance gene and the sacR-sacB gene derived from LKSind1-4. Therefore, the target gene-introduced strain exhibits kanamycin sensitivity and sucrose resistance.
Using LKSind1-4Cbhbd, an hbd chromosome-introduced strain was constructed by the above-mentioned method. Furthermore, based on the same principle, markerless disruption of ldhA, pta, ack, and ppc genes was performed using the markerless gene disruption vector pCRA725.
The enzymes encoded by these genes are:
ldhA: Lactate dehydrogenase pta: Phosphotrans acetylase ac: Acetate kinase ppc: Phosphoenolpyrvate carboxylase The obtained strains are shown in Table 9.
（６）１，３−ブタンジオール生産関連遺伝子発現プラスミド導入株の構築
表ｘ５に示す染色体遺伝子組換え株に表３に示す２つの１，３−ブタンジオール生産関連遺伝子発現プラスミドを導入することにより、１，３−ブタンジオール生産株を構築した。また、対照実験用としてｙｊｇＢ及びａｄｈＣを欠く１３ＢＤ０株を構築した。
構築した株について表１０に示す。
コリネバクテリウム グルタミカム１３ＢＤ７８株は、Corynebacterium glutamicum R-BD1株として、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室（郵便番号292-0818）の独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センターに寄託した（受託日：2019年8月13日、受託番号：NITE BP-03015）。
(6) Construction of 1,3-Butanediol Production-Related Gene Expression plasmid-Introduced Strain By introducing the two 1,3-butanediol production-related gene expression plasmids shown in Table 3 into the chromosomal gene recombination strain shown in Table x5. , 1,3-Butanediol-producing strain was constructed. In addition, a 13BD0 strain lacking yjgB and adhC was constructed for control experiments.
Table 10 shows the constructed strains.
Corynebacterium glutamicum 13BD78 strain is a Corynebacterium glutamicum R-BD1 strain, which is a patented organism of the National Institute of Technology and Evaluation, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan (postal code 292-0818). Deposited at the Deposit Center (Deposit date: August 13, 2019, Deposit number: NITE BP-03015).
２．１，３−ブタンジオール生産試験（１０ｍｌスケール）
ｙｊｇＢ、ａｄｈＣ導入効果の検証
コニカルチューブを用いた好気フェドバッチ反応における１，３−ブタンジオール生産試験を以下に述べる方法により行った。実験には、上記１．において作成したコリネバクテリウム グルタミカム １，３−ブタンジオール生産株１３ＢＤ０、１３ＢＤ７８、１３ＢＤ１１４、１３ＢＤ１１６、１３ＢＤ１１７、１３ＢＤ１１８、１３ＢＤ１１９、及び１３ＢＤ１２０を用いた。
2.1,3-Butanediol production test (10 ml scale)
Verification of the effect of introducing yjgB and adhC A 1,3-butanediol production test in an aerobic fed-batch reaction using a conical tube was carried out by the method described below. In the experiment, the above 1. The Corynebacterium glutamicum 1,3-butanediol-producing strains 13BD0, 13BD78, 13BD114, 13BD116, 13BD117, 13BD118, 13BD119, and 13BD120 prepared in 1 above were used.
各菌株をカナマイシン５０μｇ／ｍｌ、及びゼオシン２５μｇ／ｍｌを含むＡ寒天培地［（ＮＨ2）2ＣＯ ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、０．０６％（ｗ／ｖ）Ｆｅ2ＳＯ4・７Ｈ2Ｏ＋０．０４２％（ｗ／ｖ）ＭｎＳＯ4・２Ｈ2Ｏ １ｍｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ビオチン水溶液 １ｍｌ、０．０１％（ｗ／ｖ）チアミン水溶液 ２ｍｌ、酵母エクストラクト ２ｇ、ｖｉｔａｍｉｎ ａｓｓａｙカザミノ酸 ７ｇ、グルコース ４０ｇ、寒天 ２０ｇを蒸留水１Ｌに懸濁］に塗布し、３０℃、７２時間暗所に静置した。
上記のプレートで生育した株を、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、及びゼオシン２５μｇ／ｍを含有したＡ液体培地２．５ｍｌの入った試験管に一白金耳植菌し、３０℃にて２４時間、好気的に振盪培養を行った。
上記条件で培養した菌体を、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、及びゼオシン２５μｇ／ｍｌを含有したＡ液体培地１００ｍｌの入ったフラスコにＯＤ610＝０．１になるように植菌し、３０℃にて１７時間、好気的に振盪培養を行った。
Each strain kanamycin 50 [mu] g / ml, and A agar medium [(NH 2) 2 CO 2g containing zeocin 25μg / ml, (NH 4) 2 SO 4 7g, KH 2 PO 4 0.5g, K 2 HPO 4 0. 5g, MgSO 4 · 7H 2 O 0.5g, 0.06% (w / v) Fe 2 SO 4 · 7H 2 O + 0.042% (w / v) MnSO 4 · 2H 2 O 1ml, 0.02% ( w / v) 1 ml of biotin aqueous solution, 2 ml of 0.01% (w / v) thiamine aqueous solution, 2 g of yeast extract, 7 g of vitamin assay casamino acid, 40 g of glucose, and 20 g of agar are suspended in 1 L of distilled water]. The mixture was allowed to stand in a dark place at ° C for 72 hours.
The strain grown on the above plate was inoculated into a test tube containing 2.5 ml of A liquid medium containing 50 μg / ml of kanamycin and 25 μg / m of zeocin, and aerobic at 30 ° C. for 24 hours. Shaking culture was carried out.
The cells cultured under the above conditions were inoculated into a flask containing 100 ml of A liquid medium containing 50 μg / ml of canamycin and 25 μg / ml of zeocin so that OD 610 = 0.1, and the cells were inoculated at 30 ° C. 17 Shake culture was performed aerobically for hours.
培養後の菌体を遠心分離（４℃、４０００ｘｇ、７分）により回収し、ＢＴ−Ｕ培地［（ＮＨ4）2ＳＯ4７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、０．０６％（ｗ／ｖ） Ｆｅ2ＳＯ4・７Ｈ2Ｏ＋０．０４２％（ｗ／ｖ） ＭｎＳＯ4・２Ｈ2Ｏ １ｍｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ビオチン水溶液 １ｍｌ、０．０１％（ｗ／ｖ） チアミン水溶液 ２ｍｌを蒸留水１Ｌに懸濁］を用いて洗菌した。洗菌後の菌体を、２５０ｍｇのＣａＣＯ3及び５％グルコースを含有するＢＴ−Ｕ培地１０ｍｌの入ったコニカルチューブに、ＯＤ610＝５０になるように植菌し、３３℃にて２４時間、好気的に振盪培養を行った。必要に応じ、培養途中で培養液にグルコースを添加した。培養液を遠心分離（４℃、１６０００ｘｇ、１０分）して得た培養上清液中の１，３−ブタンジオール濃度を、高速液体クロマトグラフィーシステム［ACQUITY UPLC H-Class(Waters)、Unison UK-C18（Ｉｍｔａｋｔ）、移動相に２０ｍＭリン酸を用いて分離］を用いて分析した結果を表１１に示す。
本実験の結果から、ＹｊｇＢならびにＡｄｈＣの導入が１，３−ブタンジオール生産に有効であることが示された。
Centrifugation (4 ℃, 4000xg, 7 minutes) the cells after culture were collected by, BT-U medium [(NH 4) 2 SO 4 7g, KH 2 PO 4 0.5g, K2HPO4 0.5g, MgSO4 · 7H 2 O 0.5g, 0.06% ( w / v) Fe 2 SO 4 · 7H 2 O + 0.042% (w / v) MnSO 4 · 2H 2 O 1ml, 0.02% (w / v) biotin 1 ml of aqueous solution and 2 ml of 0.01% (w / v) thiamine aqueous solution were suspended in 1 L of distilled water]. The washed cells were inoculated into a conical tube containing 10 ml of BT-U medium containing 250 mg of CaCO 3 and 5% glucose so that OD 610 = 50, and the cells were inoculated at 33 ° C. for 24 hours. Shake culture was performed aerobically. If necessary, glucose was added to the culture solution during the culture. The concentration of 1,3-butanediol in the culture supernatant obtained by centrifuging the culture solution (4 ° C., 16000 xg, 10 minutes) was measured by high performance liquid chromatography system [ACQUITY UPLC H-Class (Waters), Unison UK. -C18 (Imtaket), separated using 20 mM phosphoric acid for the mobile phase] is shown in Table 11.
The results of this experiment showed that the introduction of YjgB and AdhC was effective for 1,3-butanediol production.
３．１，３−ブタンジオール生産試験（１０ｍｌスケール）
ｐｐｃ破壊効果の検証
上記２．と同様の手法を用い、コニカルチューブを用いた好気フェドバッチ反応における１，３−ブタンジオール生産試験を行った。実験には、上記１．において作成したコリネバクテリウム グルタミカム １，３−ブタンジオール生産株１３ＢＤ１１４及び１３ＢＤ７８を用いた。
3.1,3-Butanediol production test (10 ml scale)
Verification of ppc destruction effect 2. Using the same method as above, a 1,3-butanediol production test was carried out in an aerobic fed-batch reaction using a conical tube. In the experiment, the above 1. Corynebacterium glutamicum 1,3-butanediol-producing strains 13BD114 and 13BD78 prepared in the above were used.
各菌株をカナマイシン５０μｇ／ｍｌ、及びゼオシン２５μｇ／ｍｌを含むＡ寒天培地に塗布し、３０℃、７２時間暗所に静置した。
上記のプレートで生育した株を、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、及びゼオシン２５μｇ／ｍｌを含有したＡ液体培地２．５ｍｌの入った試験管に一白金耳植菌し、３０℃にて２４時間、好気的に振盪培養を行った。
上記条件で生育した株を、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、及びゼオシン２５μｇ／ｍｌを含有したＡ液体培地１００ｍｌの入ったフラスコにＯＤ610＝０．１になるように植菌し、３０℃にて１７時間、好気的に振盪培養を行った。
Each strain was applied to A agar medium containing 50 μg / ml of kanamycin and 25 μg / ml of zeocin, and allowed to stand in the dark at 30 ° C. for 72 hours.
The strain grown on the above plate was inoculated into a test tube containing 2.5 ml of A liquid medium containing 50 μg / ml of canamycin and 25 μg / ml of zeocin, and aerobic at 30 ° C. for 24 hours. Shaking culture was carried out.
The strain grown under the above conditions was inoculated into a flask containing 100 ml of A liquid medium containing 50 μg / ml of kanamycin and 25 μg / ml of zeocin so that OD 610 = 0.1, and the cells were inoculated at 30 ° C. for 17 hours. , Aerobic shaking culture was performed.
培養後の菌体を遠心分離（４℃、４０００ｘｇ、７分）により回収し、ＢＴ−Ｕ培地を用いて洗菌した。洗菌後の菌体を、２５０ｍｇのＣａＣＯ3及び５％グルコースを含有するＢＴ−Ｕ培地１０ｍｌの入ったコニカルチューブに、ＯＤ610＝５０になるように植菌し、３３℃にて２４時間、好気的に振盪培養を行った。必要に応じ、培養途中で培養液にグルコースを添加した。培養液を遠心分離（４℃、１６０００ｘｇ、１０分）して得た培養上清液中の１，３−ブタンジオール濃度を高速液体クロマトグラフィーシステム［ACQUITY UPLC H-Class(Waters)、Unison UK-C18（Ｉｍｔａｋｔ）、移動相に２０ｍＭリン酸を用いて分離］を用いて分析した。
また、培養上清液中のグルコース濃度を多機能バイオセンサＢＦ−５（王子計測機器株式会社）を用いて分析し、得られたデータをもとに１，３−ブタンジオール対糖収率を算出した。生産実験終了時の１，３−ブタンジオール濃度ならびに対糖収率を表１２に示す。
本実験の結果から、ｐｐｃ破壊により１，３−ブタンジオールの生成量ならびに対糖収率が向上することが示された。
After culturing, the cells were collected by centrifugation (4 ° C., 4000 xg, 7 minutes) and washed with BT-U medium. The washed cells were inoculated into a conical tube containing 10 ml of BT-U medium containing 250 mg of CaCO 3 and 5% glucose so that OD 610 = 50, and the cells were inoculated at 33 ° C. for 24 hours. Shake culture was performed aerobically. If necessary, glucose was added to the culture solution during the culture. High-performance liquid chromatography system [ACQUITY UPLC H-Class (Waters), Unison UK- C18 (Imtaket), separated using 20 mM phosphoric acid in the mobile phase] was used for analysis.
In addition, the glucose concentration in the culture supernatant was analyzed using a multifunctional biosensor BF-5 (Oji Measuring Instruments Co., Ltd.), and based on the obtained data, the yield of 1,3-butanediol vs. sugar was determined. Calculated. Table 12 shows the 1,3-butanediol concentration and the sugar yield at the end of the production experiment.
From the results of this experiment, it was shown that the amount of 1,3-butanediol produced and the yield against sugar were improved by the destruction of ppc.
４．１，３−ブタンジオール生産試験（ジャーファーメンター、８０ｍｌスケール）
ジャーファーメンターを用いた好気フェドバッチ反応における１，３−ブタンジオール生産試験を以下に述べる方法により行った。実験には、上記１．において作成したコリネバクテリウム グルタミカム １，３−ブタンジオール生産株１３ＢＤ７８を用いた。
4.1,3-Butanediol production test (Jarfermenter, 80 ml scale)
A 1,3-butanediol production test in an aerobic fed-batch reaction using a jar fermenter was carried out by the method described below. In the experiment, the above 1. Corynebacterium glutamicum 1,3-butanediol-producing strain 13BD78 prepared in the above was used.
１３ＢＤ７８をカナマイシン５０μｇ／ｍｌ、及びゼオシン２５μｇ／ｍｌを含むＡ寒天培地に塗布し、３０℃、７２時間暗所に静置した。
上記のプレートで生育した株を、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、及びゼオシン２５μｇ／ｍｌを含有したＡ液体培地２．５ｍｌの入った試験管に一白金耳植菌し、３０℃にて２４時間、好気的に振盪培養を行った。
上記条件で培養した菌体を、１００ｍｌ容量のジャーファーメンター培養槽内の、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、ゼオシン２５μｇ／ｍｌ、５％グルコース、及び消泡剤アデカノールＬ１２６ ３ｇ／ｌを含有したＡ−Ｕ培地［（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、０．０６％（ｗ／ｖ）Ｆｅ2ＳＯ4・７Ｈ2Ｏ＋０．０４２％（ｗ／ｖ）ＭｎＳＯ4・２Ｈ2Ｏ １ｍｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ビオチン水溶液１ｍｌ、０．０１％（ｗ／ｖ）チアミン水溶液２ｍｌ、酵母エクストラクト２ｇ、ｖｉｔａｍｉｎ ａｓｓａｙカザミノ酸７ｇを蒸留水１Ｌに懸濁］８０ｍｌにＯＤ610＝０．１となるように植菌し、ジャーファーメンターを用いて、培養温度３０℃、ｐＨ７、攪拌速度４００ｒｐｍ、培養液量に対する１分間あたりの通気容量を０．４ｖｖｍに制御し、培養を行った。
13BD78 was applied to A agar medium containing 50 μg / ml of kanamycin and 25 μg / ml of zeocin, and allowed to stand in the dark at 30 ° C. for 72 hours.
The strain grown on the above plate was inoculated into a test tube containing 2.5 ml of A liquid medium containing 50 μg / ml of canamycin and 25 μg / ml of zeocin, and aerobic at 30 ° C. for 24 hours. Shaking culture was carried out.
A—U medium containing 50 μg / ml of casamino acid, 25 μg / ml of zeosin, 5% glucose, and 3 g / l of the antifoaming agent Adecanol L126 in a 100 ml volume of jar fermenter culture tank. [(NH 4) 2 SO 4 7g, KH 2 PO 4 0.5g, K 2 HPO 4 0.5g, MgSO 4 · 7H 2 O 0.5g, 0.06% (w / v) Fe 2 SO 4 · 7H 2 O + 0.042% (w / v) MnSO 4 · 2H 2 O 1ml, 0.02% (w / v) biotin solution 1ml, 0.01% (w / v ) thiamine solution 2 ml, yeast extract 2g, 7 g of vitamin assay casamino acid is suspended in 1 L of distilled water] 80 ml is inoculated so that OD 610 = 0.1, and the culture temperature is 30 ° C., pH 7, stirring speed 400 rpm, and the amount of culture solution using a jar fermenter. The aeration capacity per minute was controlled to 0.4 vvm, and the cells were cultured.
上記条件で１８時間培養した後、培養条件を、培養温度３３℃、ｐＨ７、攪拌速度３００ｒｐｍ、培養液量に対する１分間あたりの通気容量を０．４ｖｖｍに変更し、１，３−ブタンジオール生産実験を開始した。必要に応じ、培養途中で培養液にグルコースを添加した。培養液を遠心分離（４℃、１６０００ｘｇ、１０分）して得た培養上清液中の１，３−ブタンジオール濃度を高速液体クロマトグラフィーシステム［ACQUITY UPLC H-Class(Waters)、Unison UK-C18（Ｉｍｔａｋｔ）、移動相に２０ｍＭリン酸を用いて分離］を用いて分析した。生産実験開始から２４時間までの１，３−ブタンジオール濃度の経時変化を図４に示す。 After culturing for 18 hours under the above conditions, the culture conditions were changed to a culture temperature of 33 ° C., a pH of 7, a stirring speed of 300 rpm, and an aeration capacity per minute with respect to the amount of the culture solution was changed to 0.4 vvm, and a 1,3-butanediol production experiment was conducted. Started. If necessary, glucose was added to the culture solution during the culture. High-performance liquid chromatography system [ACQUITY UPLC H-Class (Waters), Unison UK- C18 (Imtaket), separated using 20 mM phosphoric acid in the mobile phase] was used for analysis. FIG. 4 shows the time course of the 1,3-butanediol concentration from the start of the production experiment to 24 hours.
図４に示すように、本試験の結果から、ジャーファーメンターを用いた好気フェドバッチ反応において、１，３−ブタンジオールの効率的な生産が可能であることが示された。 As shown in FIG. 4, from the results of this test, it was shown that efficient production of 1,3-butanediol is possible in the aerobic fed-batch reaction using a jar fermenter.
本開示によれば、微生物を用いて糖原料から１，３−ブタンジオールを製造することができる。 According to the present disclosure, 1,3-butanediol can be produced from a sugar raw material using a microorganism.
Claims (11)
前記宿主細菌は、下記（Ａ）〜（Ｄ）の酵素の少なくとも１つが発現可能なように又は発現誘導可能なように変異又は遺伝子が導入されている、形質転換体。
（Ａ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ
（Ｂ）アセトアセチルＣｏＡ合成酵素
（Ｃ）アセトアセチルＣｏＡ還元酵素
（Ｄ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ還元酵素 A gene encoding an alcohol dehydrogenase belonging to the cinamyl alcohol dehydrogenase (CAD) family has been introduced into the host bacterium and
The host bacterium is a transformant into which a mutation or gene has been introduced so that at least one of the enzymes (A) to (D) below can be expressed or induced.
(A) Acetyl CoA carboxylase (B) Acetoacetyl CoA synthase (C) Acetoacetyl CoA reductase (D) 3-Hydroxybutyryl CoA reductase
（Ａ’）ホスホエノールピルビン酸を基質としてオキサロ酢酸を生成する反応を触媒するホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＰＣ）
（Ｂ’）ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）
（Ｃ’）アセテートキナーゼ（ＡＣＫ）
（Ｄ’）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ） The transformant according to claim 1, wherein the host bacterium has at least one of the following enzymes (A') to (D') dysfunctional or deficient.
(A') Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PPC) that catalyzes the reaction that produces oxaloacetate using phosphoenolpyruvate as a substrate.
(B') Phosphotransacetylase (PTA)
(C') Acetate Kinase (ACK)
(D') Lactate dehydrogenase (LDH)
反応培地中の１，３−ブタンジオールを回収する回収工程とを含み、
前記形質転換体は、シナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）ファミリーに属するアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子が宿主細菌に導入されている形質転換体である、１，３−ブタンジオールの製造方法。 A reaction step of culturing the transformant in a reaction solution containing a saccharide or a compound capable of producing acetyl-CoA by metabolism of the transformant.
Including a recovery step of recovering 1,3-butanediol in the reaction medium.
A method for producing 1,3-butanediol, wherein the transformant is a transformant in which a gene encoding an alcohol dehydrogenase belonging to the cinamyl alcohol dehydrogenase (CAD) family has been introduced into a host bacterium.
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