JP2021032596A - Atherosclerosis marker and utilization thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、動脈硬化マーカー及びその利用に関する。 The present invention relates to an arteriosclerosis marker and its use.
動脈硬化は、本来、広く柔軟な動脈が、狭くなったり硬くなる症状であり、その代表的な因子として加齢、喫煙、肥満、高脂血症、糖尿病、高血圧等が知られている。 Arteriosclerosis is a symptom in which a wide and flexible artery is narrowed or hardened, and aging, smoking, obesity, hyperlipidemia, diabetes, hypertension and the like are known as typical factors.
従来、動脈硬化のリスク評価は、血圧、血糖値、ＬＤＬコレステロール値の測定等により行われており、ＬＤＬコレステロールは悪玉コレステロールとも呼ばれている。また、近年、例えば、光や音波を生体に照射して得た測定波に基づいて、血流量の時間変化と血管断面積の時間変化とを求め、これらの変化から動脈硬化度を求める方法も報告されている（特許文献１）。 Conventionally, the risk evaluation of arteriosclerosis is performed by measuring blood pressure, blood glucose level, LDL cholesterol level, etc., and LDL cholesterol is also called bad cholesterol. Further, in recent years, for example, a method of obtaining a time change of blood flow rate and a time change of blood vessel cross-sectional area based on a measurement wave obtained by irradiating a living body with light or sound wave, and obtaining an arteriosclerosis degree from these changes. It has been reported (Patent Document 1).
一方、ＧＡ（グリコールアルデヒド）−ピリジンが動脈硬化の指標となることは知られていない。 On the other hand, GA (glycolaldehyde) -pyridine is not known to be an indicator of arteriosclerosis.
本発明は、動脈硬化の検出に有用な新たな指標の提供等を目的とする。 An object of the present invention is to provide a new index useful for detecting arteriosclerosis.
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討を重ねていたところ、ＧＡ−ピリジンを指標として動脈硬化を検出できることを見出した。本発明は該知見に基づき更に検討を重ねた結果完成されたものであり、次の主題を包含する。 The present inventors have made extensive studies to solve the above problems, and have found that arteriosclerosis can be detected using GA-pyridine as an index. The present invention has been completed as a result of further studies based on the findings, and includes the following subjects.
項１．ＧＡ−ピリジンを指標とする、動脈硬化の検出方法。
項２．採取された試料中のＧＡ−ピリジンを検出または測定する工程を含む、項１に記載の検出方法。
項３．ＧＡ−ピリジンを指標とする、被検物質の動脈硬化抑制作用を評価する方法。
項４．ＧＡ−ピリジンを指標とする、動脈硬化抑制に有用な物質のスクリーニング方法。
項５．ＧＡ−ピリジンからなる、動脈硬化マーカー。
項６．ＧＡ−ピリジンを抗原として認識する抗体を用いた、ＧＡ−ピリジンを指標とする、動脈硬化の検出用、被検物質の動脈硬化抑制作用評価用または動脈硬化抑制に有用な物質のスクリーニング用キット。
Item 1. A method for detecting arteriosclerosis using GA-pyridine as an index.
Item 2. Item 2. The detection method according to Item 1, which comprises a step of detecting or measuring GA-pyridine in the collected sample.
Item 3. A method for evaluating the arteriosclerosis inhibitory effect of a test substance using GA-pyridine as an index.
Item 4. A screening method for substances useful for suppressing arteriosclerosis using GA-pyridine as an index.
Item 5. An arteriosclerosis marker consisting of GA-pyridine.
Item 6. A kit for detecting arteriosclerosis using an antibody that recognizes GA-pyridine as an antigen, for evaluating an arteriosclerosis inhibitory effect of a test substance, or for screening a substance useful for suppressing arteriosclerosis.
本発明によれば、ＧＡ−ピリジンを指標として動脈硬化を検出できる。このことから、本発明によれば、ＧＡ−ピリジンを指標とする動脈硬化の検出方法、ＧＡ−ピリジンを指標とする被検物質の動脈硬化抑制作用評価方法、動脈硬化抑制に有用な物質のスクリーニング方法、動脈硬化マーカー、また、動脈硬化の検出用キット、被検物質の動脈硬化抑制作用評価用キット、動脈硬化抑制に有用な物質のスクリーニング用キットが提供される。 According to the present invention, arteriosclerosis can be detected using GA-pyridine as an index. Therefore, according to the present invention, a method for detecting arteriosclerosis using GA-pyridine as an index, a method for evaluating an arteriosclerosis inhibitory effect of a test substance using GA-pyridine as an index, and screening for a substance useful for suppressing arteriosclerosis. A method, an arteriosclerosis marker, a kit for detecting arteriosclerosis, a kit for evaluating the anti-arteriosclerosis effect of a test substance, and a kit for screening substances useful for suppressing arteriosclerosis are provided.
動脈硬化の検出方法
本発明は、ＧＡ−ピリジンを指標とする、動脈硬化の検出方法を提供する。
Method for detecting arteriosclerosis The present invention provides a method for detecting arteriosclerosis using GA-pyridine as an index.
該方法は、ＧＡ−ピリジンを指標として、動脈硬化を検出する方法である。ＧＡ−ピリジンは、グリコールアルデヒドとリジンとの反応により得られる公知の物質である。 The method is a method for detecting arteriosclerosis using GA-pyridine as an index. GA-Pyridine is a known substance obtained by the reaction of glycolaldehyde with lysine.
本発明の方法は、試料においてＧＡ−ピリジンを検出または測定する工程を経ることにより実施でき、これに基づいて、動脈硬化を検出することができる。 The method of the present invention can be carried out by going through a step of detecting or measuring GA-pyridine in a sample, and based on this, arteriosclerosis can be detected.
試料は制限されず、被検体由来の血液（全血）、血清、血漿、血管、尿、唾液、涙液、汗等が例示される。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。 The sample is not limited, and examples thereof include blood (whole blood), serum, plasma, blood vessels, urine, saliva, tears, and sweat derived from the subject. These may be used individually by 1 type, and may be used in combination of 2 or more type.
被検体としては、ヒト；サル、ブタ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス等の非ヒト哺乳動物；鳥類等が例示される。前記試料は、被検体から採取された試料であってもなくてもよいが、被検体がヒトの場合、前記試料は被検体から採取された試料である。 Examples of the subject include humans; non-human mammals such as monkeys, pigs, rabbits, guinea pigs, rats, and mice; and birds. The sample may or may not be a sample taken from the subject, but when the subject is a human, the sample is a sample taken from the subject.
被検体の状態は制限されず、例えば、動脈硬化の状態にある被検体、動脈硬化になっている疑いのある被検体、動脈硬化になるリスクの高い被検体、動脈硬化を治療中の被検体、動脈硬化の有無やリスクを把握したい被検体等が挙げられる。これらの被検体は、本発明とは別の公知の方法により予め、その動脈硬化の状態や有無等が把握された被検体であってもよい。 The condition of the subject is not limited, for example, a subject who is in a state of arteriosclerosis, a subject who is suspected of having arteriosclerosis, a subject who is at high risk of developing arteriosclerosis, a subject who is being treated for arteriosclerosis. , Subjects who want to understand the presence or absence of arteriosclerosis and the risk. These subjects may be subjects whose arteriosclerosis status, presence or absence, etc. have been grasped in advance by a known method other than the present invention.
試料中のＧＡ−ピリジンの検出または測定の手段は、ＧＡ−ピリジンの検出または測定が可能である限り制限されない。ＧＡ−ピリジンは、タンパク質と糖との化学反応によってできる公知の終末糖化産物の一種である。このため、ＧＡ−ピリジンの検出または測定手段としては、ＧＡ−ピリジンを抗原とする抗原抗体反応等の従来公知の手段が例示される。 The means for detecting or measuring GA-pyridine in a sample is not limited as long as GA-pyridine can be detected or measured. GA-pyridine is a kind of known advanced glycation end product formed by a chemical reaction between a protein and a sugar. Therefore, as a means for detecting or measuring GA-pyridine, conventionally known means such as an antigen-antibody reaction using GA-pyridine as an antigen are exemplified.
本発明を制限するものではないが、例えば、抗原抗体反応としては、ＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）法（競合法、サンドイッチ法等を問わない）、ラテックス凝集免疫比濁法、ウエスタンブロッティング等の従来公知の抗原抗体反応を利用する免疫学的方法等が挙げられる。例えば、競合ＥＬＩＳＡ法においては、ＧＡ−ピリジンの受容体としても知られている終末糖化産物受容体 (receptor for Advanced Glycation End Product、ＲＡＧＥ)等を用いて、ＧＡ−ピリジンの検出、測定を行ってもよい。これらは、従来公知の手順に従い実施すればよい。 Although not limiting the present invention, for example, the antigen-antibody reaction includes an ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) method (regardless of a competitive method, a sandwich method, etc.), a latex agglutination immunoturbidity method, Western blotting, or the like. Examples thereof include an immunological method using a conventionally known antigen-antibody reaction. For example, in the competitive ELISA method, GA-pyridine is detected and measured by using an advanced glycation end product receptor (RAGE), which is also known as a GA-pyridine receptor. May be good. These may be carried out according to a conventionally known procedure.
また、このように、本発明によれば、試料中のＧＡ−ピリジン量の測定が可能であることから、本発明の方法は、試料中のＧＡ−ピリジンの定量にも有用である。定量も、従来公知の定量手段に基づき行うことができる。 Further, as described above, according to the present invention, the amount of GA-pyridine in the sample can be measured, so that the method of the present invention is also useful for the quantification of GA-pyridine in the sample. The quantification can also be performed based on a conventionally known quantification means.
抗原抗体反応は、検出、測定対象であるＧＡ−ピリジンを抗原として、ＧＡ−ピリジンを認識する抗体（抗ＧＡ−ピリジン抗体）を用いて、従来公知の抗原抗体反応手順に従い実施することができる。使用する抗体量等も従来公知の手順に従い適宜決定すればよい。抗ＧＡ−ピリジン抗体は、従来公知の方法に従い製造すればよい。抗ＧＡ−ピリジン抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、これらの抗原結合断片のいずれであってもよく、好ましくはモノクローナル抗体、その抗原結合断片である。抗原結合断片としては、例えばＦ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（single-chain Fv）、ミニボディ（minibody）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）、これらを組み合わせた構造等が挙げられる。 The antigen-antibody reaction can be carried out according to a conventionally known antigen-antibody reaction procedure using an antibody that recognizes GA-pyridine (anti-GA-pyridine antibody) using GA-pyridine as an antigen to be detected and measured. The amount of antibody to be used may be appropriately determined according to a conventionally known procedure. The anti-GA-pyridine antibody may be produced according to a conventionally known method. The anti-GA-pyridine antibody may be a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, or an antigen-binding fragment thereof, and is preferably a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof. Examples of the antigen-binding fragment include F (ab) 2 , Fab', Fab, Fv, scFv (single-chain Fv), minibody, diabody, triabody, and tetrabody. ), A structure that combines these, and the like.
一実施形態として、非ヒト哺乳動物を用いて抗体を製造する方法を挙げると、例えば、ＧＡ−ピリジンを免疫原として用いて非ヒト動物を免疫する工程を含む、抗体の製造方法に従って、抗ＧＡ−ピリジン抗体を製造することができる。非ヒト哺乳動物としては、前述と同様に説明できる。該方法において、必要に応じて、免疫を経た免疫動物の脾臓やリンパ節から得た抗体産生細胞と骨髄腫細胞等の細胞とを融合させ、融合細胞（ハイブリドーマ）を作製し、該ハイブリドーマから、抗ＧＡ−ピリジン抗体、特にモノクローナル抗体を産生する細胞を選択し、このようにして得た該細胞から、抗ＧＡ−ピリジン抗体を得てもよい。 One embodiment includes a method of producing an antibody using a non-human mammal, for example, according to a method for producing an antibody, which comprises a step of immunizing a non-human animal using GA-pyridine as an immunogen. -Pyridine antibody can be produced. The non-human mammal can be described in the same manner as described above. In the method, if necessary, antibody-producing cells obtained from the spleen or lymph node of an immunized immunized animal are fused with cells such as myeloma cells to prepare fused cells (hybridoma), and the hybridoma is used as a fusion cell. A cell producing an anti-GA-pyridine antibody, particularly a monoclonal antibody, may be selected, and an anti-GA-pyridine antibody may be obtained from the cell thus obtained.
また、抗体が、抗原結合断片である場合も従来公知の方法に従い製造すればよく、例えば、前述のようにして得た抗体に対して酵素処理等を行うことにより、製造することができる。 Further, when the antibody is an antigen-binding fragment, it may be produced according to a conventionally known method. For example, it can be produced by subjecting the antibody obtained as described above to an enzyme treatment or the like.
本発明において、「動脈硬化の検出」とは、動脈硬化の状態にあることの検出、動脈硬化になるリスクの高いまたは低いことの検出、動脈硬化の状態にあったまたは動脈硬化になるリスクが高いと既に判断された被検体の動脈硬化の状態の変化（治療効果、抑制度等）の検出、動脈硬化ではないことの検出等を意味し、ＧＡ−ピリジンの検出または測定値に基づいて、これらの動脈硬化の程度を知ることができることを意味する。 In the present invention, "detection of arteriosclerosis" means detection of being in a state of arteriosclerosis, detection of high or low risk of developing arteriosclerosis, and detection of being in a state of arteriosclerosis or risk of developing arteriosclerosis. It means detection of changes in the state of arteriosclerosis (therapeutic effect, degree of inhibition, etc.) of the subject already judged to be high, detection of non-arteriosclerosis, etc., based on the detection or measured value of GA-pyridine. It means that the degree of these arteriosclerosis can be known.
本発明によれば、試料中のＧＡ−ピリジン量（被験値）と、基準となるＧＡ−ピリジン量（基準値）とを比較して、これらの値の相違等から動脈硬化の検出を行うことができる。 According to the present invention, the amount of GA-pyridine (test value) in a sample is compared with the reference amount of GA-pyridine (reference value), and arteriosclerosis is detected based on the difference between these values. Can be done.
基準値は制限されず、例えば、基準値は、動脈硬化の状態にない被検体由来の試料（健常体）のＧＡ−ピリジン量であってもよく、動脈硬化の状態にある被検体由来の試料（罹患体）のＧＡ−ピリジン量であってもよく、基準値は適宜決定すればよい。 The reference value is not limited, and for example, the reference value may be the amount of GA-pyridine of a sample (healthy body) derived from a subject that is not in an arteriosclerotic state, and is a sample derived from a subject that is in an arteriosclerotic state. The amount of GA-pyridine of the (affected body) may be used, and the reference value may be appropriately determined.
このため、本発明の一実施形態として、例えば、基準値が、健常体のＧＡ−ピリジン量である場合、被験値が基準値よりも高い場合に、動脈硬化の状態にあるか、動脈硬化になるリスクが高いと決定し、被験値が基準値と同じか低い場合に、動脈硬化の状態にないか、動脈硬化になるリスクが低いと決定することができる。このことから、本発明の動脈硬化の検出方法は、（ａ１）被験値を測定する工程と、（ｂ１）該工程（ａ１）で得た被験値と、健常体について得たＧＡ−ピリジン量（基準値）とを比較し、被験値が基準値よりも高いかどうかを判定する工程とを含有していてもよい。更に、本発明の動脈硬化の検出方法は、（ｃ１）該被験値が該基準値よりも高い場合に、動脈硬化の状態にあるか、動脈硬化になるリスクが高いと決定し、該被験値が該基準値と同じか低い場合に、動脈硬化の状態にないか、動脈硬化になるリスクが低いと決定する工程を含有してもよい。 Therefore, as one embodiment of the present invention, for example, when the reference value is the amount of GA-pyridine in a healthy body and the test value is higher than the reference value, it is in a state of arteriosclerosis or arteriosclerosis. If the test value is the same as or lower than the reference value, it can be determined that the patient is not in a state of arteriosclerosis or the risk of developing arteriosclerosis is low. From this, the method for detecting arteriosclerosis of the present invention includes (a1) a step of measuring a test value, (b1) a test value obtained in the step (a1), and an amount of GA-pyridine obtained for a healthy body (a1). It may include a step of comparing with a reference value) and determining whether or not the test value is higher than the reference value. Further, the method for detecting arteriosclerosis of the present invention (c1) determines that when the test value is higher than the reference value, it is in a state of arteriosclerosis or has a high risk of developing arteriosclerosis, and the test value is determined. May include a step of determining that the patient is not in a state of arteriosclerosis or has a low risk of developing arteriosclerosis when is equal to or lower than the reference value.
また、別の実施形態として、例えば、基準値が、罹患体のＧＡ−ピリジン量である場合、被験値が基準値と同等以上である場合に、動脈硬化の状態にあるか、動脈硬化になるリスクが高いと決定し、被験値が基準値よりも低い場合に、動脈硬化の状態にないか、動脈硬化になるリスクが低いと決定することができる。このことから、本発明の動脈硬化の検出方法は、（ａ２）被験値を測定する工程と、（ｂ２）該工程（ａ２）で得た被験値と、罹患体について得たＧＡ−ピリジン量（基準値）とを比較し、被験値が基準値よりも高いかどうかを判定する工程とを含有していてもよい。更に、本発明の動脈硬化の検出方法は、（ｃ２）該被験値が該基準値と同じか高い場合に、動脈硬化の状態にあるか、動脈硬化になるリスクが高いと決定し、被験値が基準値よりも低い場合に、動脈硬化の状態にないか、動脈硬化になるリスクが低いと決定する工程を含有していてもよい。 In another embodiment, for example, when the reference value is the amount of GA-pyridine in the affected body, and when the test value is equal to or higher than the reference value, the patient is in a state of arteriosclerosis or becomes arteriosclerosis. If the risk is determined to be high and the test value is lower than the reference value, it can be determined that the patient is not in a state of arteriosclerosis or has a low risk of developing arteriosclerosis. From this, the method for detecting arteriosclerosis of the present invention includes (a2) a step of measuring a test value, (b2) a test value obtained in the step (a2), and an amount of GA-pyridine obtained for an affected body (a2). It may include a step of comparing with a reference value) and determining whether or not the test value is higher than the reference value. Further, the method for detecting arteriosclerosis of the present invention (c2) determines that when the test value is the same as or higher than the reference value, it is in a state of arteriosclerosis or has a high risk of developing arteriosclerosis, and the test value. May include a step of determining that is not in a state of arteriosclerosis or has a low risk of developing arteriosclerosis when is lower than the reference value.
該決定は、動脈硬化の状態と基準値との関係に基づいて容易に行うことができる。 The determination can be easily made based on the relationship between the state of arteriosclerosis and the reference value.
本発明によれば、ＧＡ−ピリジン量に基づいて動脈硬化を検出することができる。これは、動脈硬化の検出のための新しい手段を提供する。 According to the present invention, arteriosclerosis can be detected based on the amount of GA-pyridine. This provides a new means for the detection of arteriosclerosis.
被検物質の動脈硬化抑制作用を評価する方法
本発明は更に、ＧＡ−ピリジンを指標とする、被検物質の動脈硬化抑制作用を評価する方法を提供する。
Method for Evaluating Arteriosclerosis Inhibitory Effect of Test Substance The present invention further provides a method for evaluating the arteriosclerosis inhibitory effect of a test substance using GA-pyridine as an index.
ＧＡ−ピリジンは前述の通りである。 GA-pyridine is as described above.
被検物質は制限されず、通常、動脈硬化抑制に有用であるかどうかについて知りたい物質が例示される。 The test substance is not limited, and usually examples of substances for which one wants to know whether it is useful for suppressing arteriosclerosis.
前述の通り、ＧＡ−ピリジンを指標として動脈硬化を検出することができる。このため、例えば、動脈硬化の状態にある被検体に、被検物質を投与した場合であって、該被検物質投与後の該被検体に由来する試料中のＧＡ−ピリジン量が、該被検物質投与前の該被検体に由来する試料中のＧＡ−ピリジン量よりも、減少した場合に、該被検物質は、ＧＡ−ピリジン発現量を抑制する作用を有すると決定でき、これにより、該被検物質は、動脈硬化抑制作用を有すると判断できる。また、例えば、このように被検物質を投与した場合であって、該被検物質投与後の該被検体に由来する試料中のＧＡ−ピリジン量が、該被検物質投与前の該被検体に由来する試料中のＧＡ−ピリジン量よりも、増加した場合、または、ＧＡ−ピリジン量に変化がない場合に、該被検物質は、ＧＡ−ピリジン発現量を抑制する作用を有さないと決定でき、これにより、該被検物質は、動脈硬化抑制作用を有さないと判断できる。 As described above, arteriosclerosis can be detected using GA-pyridine as an index. Therefore, for example, when the test substance is administered to a subject in a state of arteriosclerosis, the amount of GA-pyridine in the sample derived from the test substance after the administration of the test substance is the subject. When the amount of GA-pyridine in the sample derived from the test substance before administration of the test substance is smaller than the amount of GA-pyridine, it can be determined that the test substance has an action of suppressing the expression level of GA-pyridine. It can be determined that the test substance has an arteriosclerosis inhibitory effect. Further, for example, in the case where the test substance is administered in this way, the amount of GA-pyridine in the sample derived from the subject after the administration of the test substance is the amount of the subject before the administration of the test substance. When the amount of GA-pyridine is higher than the amount of GA-pyridine in the sample derived from, or when the amount of GA-pyridine does not change, the test substance must have no effect of suppressing the expression level of GA-pyridine. It can be determined, and thus it can be determined that the test substance does not have an arteriosclerosis inhibitory effect.
このことから、本発明の評価方法は、（ａ３）被検物質投与後の被検体に由来する試料中のＧＡ−ピリジン量（被験値）を測定する工程と、（ｂ３）該工程（ａ３）で得た被験値と、被検物質投与前の被検体に由来する試料中のＧＡ−ピリジン量（基準値）とを比較し、被験値が基準値よりも低いかどうかを判定する工程とを含有していてもよい。更に、本発明の評価方法は、（ｃ３）該被験値が該基準値よりも低い場合に、被検物質は動脈硬化抑制作用を有すると決定し、該被験値が該基準値と同じか高い場合に、被検物質は動脈硬化抑制作用を有さないと決定する工程を含有していてもよい。 From this, the evaluation method of the present invention includes (a3) a step of measuring the amount of GA-pyridine (test value) in the sample derived from the subject after administration of the test substance, and (b3) the step (a3). The step of comparing the test value obtained in 1) with the amount of GA-pyridine (reference value) in the sample derived from the subject before administration of the test substance and determining whether the test value is lower than the reference value. It may be contained. Further, the evaluation method of the present invention (c3) determines that the test substance has an arteriosclerosis inhibitory effect when the test value is lower than the reference value, and the test value is the same as or higher than the reference value. In some cases, the test substance may include a step of determining that it does not have an arteriosclerosis inhibitory effect.
本発明の評価方法において、被検体、試料等は前述と同様に説明される。例えば、この場合も、前述と同様に、試料は、被検体から採取された試料であってもなくてもよい。ＧＡ−ピリジン量は、前述と同様にして、従来公知の手順に従い、ＧＡ−ピリジンを検出または測定することにより決定することができる。 In the evaluation method of the present invention, the subject, the sample and the like will be described in the same manner as described above. For example, in this case as well, the sample may or may not be a sample taken from the subject, as described above. The amount of GA-pyridine can be determined by detecting or measuring GA-pyridine in the same manner as described above according to a conventionally known procedure.
また、前述の投与は、経口、非経口を問わない。経口投与は、経口摂取も意味し、被検物質は、例えば、医薬に使用される物質、食品に使用される物質、飼料に使用される物質等の別を問わない。また、該被検物質は、１種単独であっても２種以上を組み合わせたものであってもよく、すなわち、組成物（飲料を含み、また、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、サプリメント等を含む）、病者用食品等を含む）の形態にあってもよい。 In addition, the above-mentioned administration may be oral or parenteral. Oral administration also means oral ingestion, and the test substance may be, for example, a substance used in medicine, a substance used in food, a substance used in feed, or the like. Further, the test substance may be one kind alone or a combination of two or more kinds, that is, a composition (including a beverage and a health functional food (food for specified health use, nutritional function). It may be in the form of (including foods, foods with functional claims, supplements, etc.), foods for the sick, etc.).
該方法によれば、被検物質が動脈硬化抑制作用を有するかどうかについて容易に評価することができる。また、該方法によれば、被検物質とＧＡ−ピリジン量、また、動脈硬化抑制との関係を把握できることから、該方法によれば、更に、該被検物質をどのような量で提供すればより効果的な動脈硬化抑制作用が得られるのか、該被検物質をどのような投与（摂取）間隔で提供すればより効果的な動脈硬化抑制作用が得られるのか、また、どのような投与形態、投与経路であればより効果的な動脈硬化抑制作用が得られるのか等についても、知ることができる。 According to this method, it is possible to easily evaluate whether or not the test substance has an arteriosclerosis inhibitory effect. Further, according to the method, the relationship between the test substance, the amount of GA-pyridine, and the suppression of arteriosclerosis can be grasped. Therefore, according to the method, what amount of the test substance should be further provided. If more effective arteriosclerosis inhibitory effect can be obtained, what kind of administration (intake) interval should be provided to obtain more effective arteriosclerosis inhibitory effect, and what kind of administration It is also possible to know whether a more effective arteriosclerosis inhibitory effect can be obtained if the form and administration route are used.
また、このように、該方法によれば、被検物質の動脈硬化抑制作用を評価することができることから、該方法は、ＧＡ−ピリジンを指標とする、被検物質が動脈硬化抑制作用を有するかどうかについての品質管理方法を提供するともいえる。 Further, as described above, according to the method, the arteriosclerosis inhibitory effect of the test substance can be evaluated. Therefore, in the method, the test substance has an arteriosclerosis inhibitory effect using GA-pyridine as an index. It can also be said to provide a quality control method as to whether or not.
動脈硬化抑制に有用な物質のスクリーニング方法
本発明は更に、ＧＡ−ピリジンを指標とする、動脈硬化抑制に有用な物質のスクリーニング方法を提供する。
Method for screening substances useful for suppressing arteriosclerosis The present invention further provides a method for screening substances useful for suppressing arteriosclerosis using GA-pyridine as an index.
ＧＡ−ピリジンは前述の通りである。 GA-Pyridine is as described above.
物質は制限されず、通常、動脈硬化抑制に有用であるかどうかについて知りたい物質が例示され、前述の被検物質と同様に説明される。 The substance is not limited, and usually the substance for which one wants to know whether it is useful for suppressing arteriosclerosis is exemplified and explained in the same manner as the above-mentioned test substance.
前述の通り、ＧＡ−ピリジンを指標として動脈硬化を検出することができる。このため、例えば、動脈硬化の状態にある被検体に、物質を投与した場合であって、該物質投与後の該被検体に由来する試料中のＧＡ−ピリジン量が、該物質投与前の該被検体に由来する試料中のＧＡ−ピリジン量よりも、減少した場合に、該物質は、ＧＡ−ピリジン発現量を抑制する作用をすると決定でき、これにより、該物質は、動脈硬化抑制作用を有すると判断でき、これにより、動脈硬化抑制に有用な物質をスクリーニングすることができる。また、このように物質を投与した場合であって、該物質投与後の該被検体に由来する試料中のＧＡ−ピリジン量が、該物質投与前の該被検体に由来する試料中のＧＡ−ピリジン量よりも、増加した場合、または、ＧＡ−ピリジン量に変化がない場合に、該物質は、ＧＡ−ピリジン発現量を抑制する作用を有さないと決定でき、これにより、該物質は、動脈硬化抑制作用を有さないと判断できる。 As described above, arteriosclerosis can be detected using GA-pyridine as an index. Therefore, for example, when a substance is administered to a subject in a state of arteriosclerosis, the amount of GA-pyridine in the sample derived from the subject after the administration of the substance is the amount before the administration of the substance. When the amount is less than the amount of GA-pyridine in the sample derived from the subject, it can be determined that the substance has an action of suppressing the expression level of GA-pyridine, whereby the substance has an action of suppressing arteriosclerosis. It can be determined that it has, and thereby, a substance useful for suppressing arteriosclerosis can be screened. Further, in the case where the substance is administered in this way, the amount of GA-pyridine in the sample derived from the subject after the administration of the substance is the GA-pyridine in the sample derived from the subject before the administration of the substance. When the amount of GA-pyridine is increased above the amount of pyridine, or when the amount of GA-pyridine is unchanged, it can be determined that the substance has no effect of suppressing the expression level of GA-pyridine. It can be judged that it does not have an arteriosclerosis inhibitory effect.
このことから、該スクリーニング方法は、（ａ４）物質投与後の被検体に由来する試料中のＧＡ−ピリジン量（被験値）が、該物質投与前の該被検体に由来する試料中のＧＡ−ピリジン量（基準値）よりも低い場合に、該物質を動脈硬化抑制に有用な物質または候補物質として選択する工程を含むといえる。また、該方法は、更に、（ｂ４）物質投与後の被検体に由来する試料中のＧＡ−ピリジン量（被験値）を測定する工程と、（ｃ４）該工程（ｂ４）で得た被験値と、該物質投与前の被検体に由来する試料中のＧＡ−ピリジン量（基準値）とを比較し、被験値が基準値よりも低いかどうかを判定する工程とを含有していてもよい。該工程（ｂ４）は、通常、前記工程（ａ４）よりも前に実施される。 Therefore, in the screening method, (a4) the amount of GA-pyridine (test value) in the sample derived from the subject after administration of the substance is the GA-pyridine in the sample derived from the subject before administration of the substance. When it is lower than the amount of pyridine (reference value), it can be said that it includes a step of selecting the substance as a substance useful for suppressing arteriosclerosis or a candidate substance. Further, the method further comprises (b4) a step of measuring the amount of GA-pyridine (test value) in the sample derived from the subject after administration of the substance, and (c4) the test value obtained in the step (b4). And the step of comparing the amount of GA-pyridine (reference value) in the sample derived from the subject before administration of the substance with the amount of GA-pyridine (reference value) and determining whether the test value is lower than the reference value may be included. .. The step (b4) is usually performed before the step (a4).
被検体、試料、投与等は、前述と同様に説明される。例えば、この場合も、前述と同様に、試料は、被検体から採取された試料であってもなくてもよい。ＧＡ−ピリジン量は、前述と同様にしてＧＡ−ピリジンを検出または測定することにより決定することができる。 The subject, sample, administration and the like will be described in the same manner as described above. For example, in this case as well, the sample may or may not be a sample taken from the subject, as described above. The amount of GA-pyridine can be determined by detecting or measuring GA-pyridine in the same manner as described above.
該方法によれば、動脈硬化抑制に有用な物質を容易にスクリーニングすることができる。また、該方法によれば、物質と動脈硬化抑制との関係を把握できることから、更に、該物質をどのような量で提供すればより効果的な動脈硬化抑制作用が得られるのか、該物質をどのような投与（摂取）間隔で提供すればより効果的な動脈硬化抑制作用が得られるのか、また、どのような投与形態、投与経路であればより効果的な動脈硬化抑制作用が得られるのか等についても、知ることができる。 According to this method, substances useful for suppressing arteriosclerosis can be easily screened. Further, according to the method, since the relationship between the substance and the suppression of arteriosclerosis can be grasped, further, what amount of the substance should be provided to obtain a more effective effect of suppressing arteriosclerosis? What kind of administration (intake) interval should be provided to obtain a more effective arteriosclerosis inhibitory effect, and what kind of administration form and route should be used to obtain a more effective arteriosclerosis inhibitory effect? You can also know about such things.
前述の方法は、本発明者らが、ＧＡ−ピリジンを指標として動脈硬化を検出できることを見出すことにより完成されたものであり、すなわち、ＧＡ−ピリジンを動脈硬化マーカーとして利用できることを見出すことにより完成されたものである。このことから、本発明は、ＧＡ−ピリジンからなる動脈硬化マーカーを提供するともいえる。 The above method was completed by the present inventors finding that arteriosclerosis can be detected using GA-pyridine as an index, that is, by finding that GA-pyridine can be used as an arteriosclerosis marker. It was done. From this, it can be said that the present invention provides an arteriosclerosis marker composed of GA-pyridine.
また、このことから、本発明は、ＧＡ−ピリジンに対して特異的に結合する物質を含む、ＧＡ−ピリジンを指標とする、動脈硬化検出用キット、被検物質の動脈硬化抑制作用評価用キット、動脈硬化抑制に有用な物質のスクリーニング用キットを提供するともいえる。 Further, from this, the present invention includes a kit for detecting arteriosclerosis using GA-pyridine as an index, and a kit for evaluating the inhibitory effect on arteriosclerosis of the test substance, which contains a substance that specifically binds to GA-pyridine. , It can be said that a kit for screening substances useful for suppressing arteriosclerosis is provided.
ここで、該キットにおいて、ＧＡ−ピリジンに対して特異的に結合する物質としては、ＧＡ−ピリジンを抗原として認識する抗体等が例示される。 Here, examples of the substance that specifically binds to GA-pyridine in the kit include an antibody that recognizes GA-pyridine as an antigen.
本発明のキットには、ＧＡ−ピリジンに対して特異的に結合する物質以外に、前述のＧＡ−ピリジンの検出手段または測定手段に利用可能な、検量線用コントロールペプチド、検量線用コントロール抗体、他の抗体（２次抗体等）、マスキング剤、ブロッキング剤、蛍光色素、酵素、基質、反応停止剤、緩衝液、分子量マーカー、ウェルや磁気ビーズ等の固相、ＲＡＧＥ等の競合成分、使用説明書等が必要に応じて含まれていても良い。 In addition to the substance that specifically binds to GA-pyridine, the kit of the present invention includes a calibration line control peptide and a calibration line control antibody that can be used as the above-mentioned GA-pyridine detection means or measurement means. Other antibodies (secondary antibodies, etc.), masking agents, blocking agents, fluorescent dyes, enzymes, substrates, reaction terminators, buffers, molecular weight markers, solid phases such as wells and magnetic beads, competing components such as RAGE, instructions for use A book or the like may be included as necessary.
該キットによれば、ＧＡ−ピリジンの検出または測定が一層容易になり、これにより、前述の動脈硬化検出、被検物質の動脈硬化抑制作用評価、また、動脈硬化抑制に有用な物質のスクリーニングが一層容易になる。 According to the kit, the detection or measurement of GA-pyridine becomes easier, whereby the above-mentioned arteriosclerosis detection, evaluation of the arteriosclerosis inhibitory effect of the test substance, and screening of substances useful for arteriosclerosis inhibition can be performed. It will be easier.
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
試験例１
試料の採取
動脈硬化内膜剥離術で切除したヒト腹部大動脈血管の一部を切り出し、動脈硬化部位（黄色く、硬くなっている部位）を動脈硬化血管試料１とした。また、該ヒト腹部大動脈血管の別の一部を切り出し、動脈硬化部位（黄色く、硬くなっている部位）を動脈硬化血管試料２とした。また、前記の通り切り出したヒト腹部大動脈血管の一部のうち、非動脈硬化部位、つまり正常な部位を、非動脈硬化血管試料（正常血管試料）とした。動脈硬化部位は、黄色く、硬かったのに対して、非動脈硬化部位は、赤く、弾力があった。
Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
Test Example 1
Sample collection A part of the human abdominal aortic blood vessel excised by arteriosclerotic intimal dissection was cut out, and the arteriosclerotic site (yellow and hardened site) was designated as the arteriosclerotic blood vessel sample 1. In addition, another part of the human abdominal aortic blood vessel was cut out, and the arteriosclerotic site (yellow and hardened site) was used as the arteriosclerotic blood vessel sample 2. Further, among a part of the human abdominal aortic blood vessels cut out as described above, a non-arteriosclerotic site, that is, a normal site was designated as a non-arteriosclerotic blood vessel sample (normal blood vessel sample). The arteriosclerotic site was yellow and hard, while the non-arteriosclerotic site was red and elastic.
試料の処理
動脈硬化血管試料１、２、正常血管試料をそれぞれ、２ｍｌのＰＢＳ（１．３７Ｍ ＮａＣｌ、２７ｍＭ ＫＣｌ、８１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１４．７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）と共に、５ｍｌのチューブに入れ、低温（０〜４℃）で１５分間撹拌した。次いで、チューブ内のＰＢＳを除き、ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳ（ＰＢＳ ２００ｍｌとＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １ｍｌの混合液）を各チューブに添加し、ポリトロンホモジナイザーで試料を破砕した。破砕後、遠心分離装置にて４℃で１５０００ｒｐｍ、３０分程遠心し、上清のみを回収し、タンパク量を定量した。
Processing arteriosclerosis vascular samples 1 and 2 of the sample, normal vascular samples each, 2 ml of PBS (1.37M NaCl, 27mM KCl, 81mM Na 2 HPO 4 · 12H 2 O, 14.7mM KH 2 PO 4, pH7.4 ), And the mixture was placed in a 5 ml tube and stirred at a low temperature (0 to 4 ° C.) for 15 minutes. The PBS in the tube was then removed and washed 3 times with PBS. Then, 0.5% Triton-X / PBS (a mixture of 200 ml of PBS and 1 ml of Triton-X) was added to each tube, and the sample was disrupted with a polytron homogenizer. After crushing, the mixture was centrifuged at 4 ° C. at 15,000 rpm for about 30 minutes with a centrifuge device, and only the supernatant was collected to quantify the amount of protein.
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット
得られた上清中のタンパク量２０μｇのアプライ量となるように、定法に従い上清を、１０％アクリルアミドゲルを用いて電気泳動に供した。泳動後のゲルをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写した。次いで、ＰＶＤＦ膜を１次抗体（モノクローナル抗ＧＡ−ピリジン抗体）にて反応させ、１次抗体反応後のＰＶＤＦ膜を、該１次抗体に結合する２次抗体（ヤギ標識抗ウサギＩｇＧ二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識済み）、インビトロジェン社）にて反応させた。次いで、ＰＶＤＦ膜をＨＲＰ発色用試薬にて２次抗体を検出した。
SDS-PAGE and Western blot The supernatant was subjected to electrophoresis using a 10% acrylamide gel according to a conventional method so that the amount of protein in the obtained supernatant was 20 μg. The gel after electrophoresis was transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. Next, the PVDF membrane is reacted with a primary antibody (monoclonal anti-GA-pyridine antibody), and the PVDF membrane after the primary antibody reaction is bound to the primary antibody (goat-labeled anti-rabbit IgG secondary antibody). (Western wasabi peroxidase (HRP) labeled), Invitrogen). Next, the PVDF film was detected with a secondary antibody using an HRP color-developing reagent.
結果
結果を図１に示す。
Results The results are shown in FIG.
図中、「Ｍ．Ｗ．」は分子量マーカー、「正常」は正常血管試料、「動脈硬化１」は動脈硬化血管試料１、「動脈硬化２」は動脈硬化血管試料２をアプライした結果である。動脈硬化１及び２では、分子量３０ｋＤａ前後のＧＡ−ピリジンを含む修飾タンパク質のバンドを検出したが、正常ではほとんど検出されなかった。これは、動脈硬化血管ではＧＡ−ピリジンの発現が認められ、また、正常な血管ではＧＡ−ピリジンの発現量が動脈硬化血管における発現量よりも低いことを示す。このことから、ＧＡ−ピリジンは動脈硬化の検出等の指標とできることが分かった。 In the figure, "MW" is a molecular weight marker, "normal" is a normal blood vessel sample, "arteriosclerosis 1" is an arteriosclerosis blood vessel sample 1, and "arteriosclerosis 2" is a result of applying an arteriosclerosis blood vessel sample 2. .. In arteriosclerosis 1 and 2, a band of a modified protein containing GA-pyridine having a molecular weight of about 30 kDa was detected, but it was hardly detected normally. This indicates that the expression of GA-pyridine is observed in arteriosclerotic blood vessels, and the expression level of GA-pyridine in normal blood vessels is lower than the expression level in arteriosclerotic blood vessels. From this, it was found that GA-pyridine can be used as an index for detecting arteriosclerosis.
なお、ここで使用した抗ＧＡ−ピリジン抗体は、図２に示す通り、ＧＡ−ピリジンに特異的に結合できる抗体であった。 As shown in FIG. 2, the anti-GA-pyridine antibody used here was an antibody capable of specifically binding to GA-pyridine.
ここで使用した抗ＧＡ−ピリジン抗体は、常法のハイブリドーマ作製法によって独自に得たモノクローナル抗体である。図２は、ＧＡ−ピリジン、ＧＬＡＰ（Glyceraldehyde-related Pyridinium（グリセルアルデヒド由来ピリジニウム））、リジンの共存下で、抗ＧＡ−ピリジン抗体を用いて、競合ＥＬＩＳＡ法に従い、抗原抗体反応を行った結果であり、ＧＡ−ピリジンとＧＬＡＰは構造異性体である。図２は、競合ＥＬＩＳＡ法において、９６ウェルプレートにコーティングしたＧＡ−ピリジンと抗ＧＡ−ピリジンモノクローナル抗体の結合が、添加するＧＡ−ピリジンの濃度依存的に阻害されたことを示し、また、該結合が、ＧＡ−ピリジンと構造が類似する、ＧＬＡＰやリジンを添加しても阻害されなかったことを示す。このことから、抗ＧＡ−ピリジン抗体は、ＧＡ−ピリジン特異的に結合することが分かった。 The anti-GA-pyridine antibody used here is a monoclonal antibody originally obtained by a conventional hybridoma production method. FIG. 2 shows the results of an antigen-antibody reaction using an anti-GA-pyridine antibody in the presence of GA-pyridine, GLAP (Glyceraldehyde-related Pyridinium), and lysine according to a competitive ELISA method. GA-Pyridine and GLAP are structural isomers. FIG. 2 shows that in the competitive ELISA method, the binding between GA-pyridine coated on a 96-well plate and the anti-GA-pyridine monoclonal antibody was inhibited in a concentration-dependent manner of the added GA-pyridine, and the binding was also inhibited. However, it is shown that the addition of GLAP or lysine, which is similar in structure to GA-pyridine, did not inhibit it. From this, it was found that the anti-GA-pyridine antibody binds specifically to GA-pyridine.
このほか、競合ＥＬＩＳＡ法を用いてＧＡ−ピリジンに対する抗ＧＡ−ピリジン抗体の結合性を調べたところ、抗ＧＡ−ピリジン抗体の濃度依存的に、ＧＡ−ピリジンが検出された。このことからも、抗ＧＡ−ピリジン抗体は、ＧＡ−ピリジンの検出に有用であることが理解できた。 In addition, when the binding property of the anti-GA-pyridine antibody to GA-pyridine was examined using the competitive ELISA method, GA-pyridine was detected depending on the concentration of the anti-GA-pyridine antibody. From this, it was understood that the anti-GA-pyridine antibody is useful for the detection of GA-pyridine.
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