JP2021023289A - Artificial three-dimensional tissue composite, production method of artificial three-dimensional tissue composite, and production device of artificial three-dimensional tissue composite - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、人工三次元組織複合体、人工三次元組織複合体製造方法、人工三次元組織複合体製造装置に関するものである。
本願は、2019年7月31日に出願された米国特許仮出願62/880,808号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
The present invention relates to an artificial three-dimensional tissue complex, an artificial three-dimensional tissue complex manufacturing method, and an artificial three-dimensional tissue complex manufacturing apparatus.
This application claims priority based on US Patent Provisional Application No. 62 / 880,808 filed on July 31, 2019, the contents of which are incorporated herein by reference.
体外にて骨格筋組織を構築し、薬剤応答評価するための創薬モデルや工業的に生産可能な培養食肉、バイオロボットのアクチュエータ素子として利用することが試みられてきた。しかし、骨格筋組織を構築するだけでは、生体内で実現している筋組織と腱組織との筋腱複合体による機能・形態を再現することができず、生体との同等性は低かった。 Attempts have been made to construct skeletal muscle tissue outside the body and use it as a drug discovery model for evaluating drug response, industrially producible cultured meat, and an actuator element for a biorobot. However, it was not possible to reproduce the function and morphology of the muscle-tendon complex between the muscle tissue and the tendon tissue realized in the living body only by constructing the skeletal muscle tissue, and the equivalence with the living body was low.
非特許文献1には、足場材・筋細胞・腱細胞を用いて、接合部位を形成することが開示されている。非特許文献2には、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の腱細胞分化に伸展刺激を付与することが開示されている。非特許文献3には、3Dプリンタを用い左右に配置された腱組織と中央に配置された筋組織とを接合することが開示されている。 Non-Patent Document 1 discloses that a scaffolding material, muscle cells, and tendon cells are used to form a junction. Non-Patent Document 2 discloses that it imparts extension stimulation to tendon cell differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Non-Patent Document 3 discloses that a 3D printer is used to join the tendon tissues arranged on the left and right and the muscle tissue arranged in the center.
しかしながら、非特許文献1においては、皮膚線維芽細胞を用いた技術が開示されており、筋腱複合体に関する技術とは言い難い。また、生体との同等性を考慮した場合、筋組織と腱組織の配向性も必要であるが、非特許文献1には、配向性に関する記載が明示されていない。非特許文献2においては、伸展刺激の付与による配向に関する記載はあるが、コラーゲンの発現が高くなく細胞および組織が機能的であるとは言えない。非特許文献3においては、腱組織と筋組織との界面での切断が解消しきれず、また、腱組織に関する配向性について明示されていない。 However, Non-Patent Document 1 discloses a technique using skin fibroblasts, and cannot be said to be a technique relating to a muscle-tendon complex. Further, considering the equivalence with a living body, the orientation of the muscle tissue and the tendon tissue is also necessary, but Non-Patent Document 1 does not clearly describe the orientation. In Non-Patent Document 2, although there is a description regarding orientation by imparting a stretch stimulus, it cannot be said that cells and tissues are functional because the expression of collagen is not high. In Non-Patent Document 3, the cut at the interface between the tendon tissue and the muscle tissue cannot be completely eliminated, and the orientation with respect to the tendon tissue is not specified.
本発明は、以上のような点を考慮してなされたもので、機能性および生体との同等性が高い人工三次元組織複合体、人工三次元組織複合体製造方法、人工三次元組織複合体製造装置を提供することを目的とする。 The present invention has been made in consideration of the above points, and is an artificial three-dimensional tissue complex, an artificial three-dimensional tissue complex manufacturing method, and an artificial three-dimensional tissue complex having high functionality and equivalence with a living body. It is an object of the present invention to provide a manufacturing apparatus.
本発明の第1の態様に従えば、第1方向に離間して配置されそれぞれで第1細胞を含有する第1ゲル体を保持する第1領域と、離間した前記第1領域の間に配置され第2細胞を含有する第2ゲル体を保持する第2領域とを有する保持面を備え、前記第1領域のそれぞれは、前記第1方向の外側に位置し前記保持面の位置から互いに隙間をあけて突出し前記第1ゲル体を拘束可能な複数のアンカーが設けられた拘束領域と、前記拘束領域よりも前記第1方向の内側に位置し前記第1ゲル体を非拘束とする非拘束領域とを有する基材を準備する準備ステップと、前記第1領域のそれぞれに前記第1細胞を含有する液体を供給してゲル化させ前記第1ゲル体を形成するとともに、前記第2領域に前記第2細胞を含有する液体を供給してゲル化させ前記第2ゲル体を形成するゲル化ステップと、前記第1細胞を含有する前記第1ゲル体を培養して第1組織を形成するとともに、前記第2細胞を含有する前記第2ゲル体を培養して両端に前記第1組織が接続した第2組織を形成する培養ステップとを含み、前記培養ステップでは、前記第2領域で収縮により前記第1方向に配向した第2組織を形成するとともに、前記第1領域で形成された前記第1組織のうち、前記第2組織の収縮力により伸展して前記第1方向に配向した前記第1組織を前記非拘束領域で形成する人工三次元組織複合体製造方法が提供される。 According to the first aspect of the present invention, it is arranged between the first region which is arranged apart from each other in the first direction and holds the first gel body containing the first cell, and the separated first region. It has a holding surface having a second region for holding the second gel body containing the second cell, and each of the first regions is located outside the first direction and has a gap from the position of the holding surface. A restraint region provided with a plurality of anchors capable of restraining the first gel body, and a non-constraint region located inside the restraint region in the first direction and unconstraining the first gel body. In the preparatory step of preparing a base material having a region, a liquid containing the first cell is supplied to each of the first regions and gelled to form the first gel body, and the second region is formed. A gelation step of supplying a liquid containing the second cell and gelling to form the second gel body, and culturing the first gel body containing the first cell to form a first tissue. At the same time, a culture step of culturing the second gel body containing the second cell to form a second tissue in which the first tissue is connected to both ends is included, and in the culture step, contraction occurs in the second region. The second structure oriented in the first direction is formed by the method, and among the first structures formed in the first region, the first structure is stretched by the contraction force of the second structure and oriented in the first direction. Provided is a method for producing an artificial three-dimensional tissue complex in which a first structure is formed in the unconstrained region.
本発明の第2の態様に従えば、保持面を有する基材を備え、前記保持面は、第1方向に離間して配置されそれぞれで第1細胞を含有する第1ゲル体を保持する第1領域と、離間した前記第1領域の間に配置され第2細胞を含有する第2ゲル体を保持する第2領域とを有し、前記第1領域のそれぞれは、前記第1方向の外側に位置し前記保持面の位置から互いに隙間をあけて突出し前記第1ゲル体を拘束可能な複数のアンカーが設けられた拘束領域と、前記拘束領域よりも前記第1方向の内側に位置し前記第1ゲル体を非拘束とする非拘束領域とを有する人工三次元組織複合体製造装置が提供される。 According to the second aspect of the present invention, a base material having a holding surface is provided, and the holding surfaces are arranged apart from each other in a first direction and each hold a first gel body containing a first cell. It has one region and a second region that is located between the separated first regions and holds a second gel body containing a second cell, and each of the first regions is outside the first direction. A restraint region provided with a plurality of anchors located at the position of the holding surface and protruding from the position of the holding surface with a gap from each other and capable of restraining the first gel body, and a restraint region located inside the restraint region in the first direction. An artificial three-dimensional tissue complex manufacturing apparatus having an unconstrained region in which the first gel body is unconstrained is provided.
本発明の第3の態様に従えば、第1方向に離間して配置された第1組織と、前記第1方向に配向して延び、離間した前記第1組織を接続する第2組織とを有し、前記第1組織のそれぞれは、前記第1方向の外側に位置し前記第1方向に非配向の非配向部と、前記第2組織と前記非配向部との間に位置し前記第1方向に配向した配向部とを有する人工三次元組織複合体が提供される。 According to the third aspect of the present invention, the first tissue arranged apart from each other in the first direction and the second structure oriented in the first direction and extending and connecting the separated first structure are provided. Each of the first tissues is located outside the first direction and is located between the non-oriented portion that is not oriented in the first direction and the second structure and the non-oriented portion. An artificial three-dimensional tissue complex having an oriented portion oriented in one direction is provided.
本発明では、機能性および生体との同等性が高い人工三次元組織複合体を得ることができる。 In the present invention, an artificial three-dimensional tissue complex having high functionality and high equivalence with a living body can be obtained.
以下、本発明の人工三次元組織複合体、人工三次元組織複合体製造方法、人工三次元組織複合体製造装置の実施の形態を、図1ないし図17を参照して説明する。
なお、以下の実施形態は、本発明の一態様を示すものであり、この発明を限定するものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で任意に変更可能である。また、以下の図面においては、各構成をわかりやすくするために、実際の構造と各構造における縮尺や数等を異ならせている。
Hereinafter, embodiments of the artificial three-dimensional tissue complex, the artificial three-dimensional tissue complex manufacturing method, and the artificial three-dimensional tissue complex manufacturing apparatus of the present invention will be described with reference to FIGS. 1 to 17.
The following embodiments show one aspect of the present invention, do not limit the present invention, and can be arbitrarily changed within the scope of the technical idea of the present invention. Further, in the following drawings, in order to make each configuration easy to understand, the scale and number of each structure are different from the actual structure.
図1は、本発明の実施の形態を示す図であって、人工三次元組織複合体製造装置1(以下、製造装置1と称する)により人工三次元組織複合体TCが製造(培養)されて保持される外観斜視図である。 FIG. 1 is a diagram showing an embodiment of the present invention, in which an artificial three-dimensional tissue complex TC is manufactured (cultured) by an artificial three-dimensional tissue complex manufacturing apparatus 1 (hereinafter referred to as a manufacturing apparatus 1). It is an external perspective view which is held.
(人工三次元組織複合体)
まず、本発明に係る人工三次元組織複合体TCについて説明する。
図1に示すように、人工三次元組織複合体TCは、第1組織51と第2組織52とを有している。人工三次元組織複合体TCは、少なくとも一部が製造装置1における保持面11(詳細は後述)に下側から保持されている。第1組織51は、離間した状態で一対で設けられている。第2組織52は、第1組織51が離間する方向に延びている。第2組織52は、離間した第1組織51同士を接続している。
(Artificial three-dimensional tissue complex)
First, the artificial three-dimensional tissue complex TC according to the present invention will be described.
As shown in FIG. 1, the artificial three-dimensional tissue complex TC has a first tissue 51 and a second tissue 52. At least a part of the artificial three-dimensional tissue complex TC is held from below on the holding surface 11 (details will be described later) in the manufacturing apparatus 1. The first tissues 51 are provided in pairs in a separated state. The second tissue 52 extends in a direction in which the first tissue 51 is separated from each other. The second organization 52 connects the separated first organizations 51 to each other.
第1組織51のそれぞれは、互いに離間する方向の外側に位置し当該方向に非配向の非配向部51Aと、第2組織52と非配向部51Aとの間に位置し上記離間する方向に配向した配向部51Bとを有している(詳細は後述)。 Each of the first structures 51 is located outside in a direction away from each other and is not oriented in that direction, and is located between the second structure 52 and the non-oriented portion 51A and is oriented in the direction of separation. It has an oriented portion 51B (details will be described later).
なお、以下では、一対の第1組織51が離間する方向であり、第2組織52が延びる方向をY方向とし、保持面11と平行でY方向と直交する方向をX方向とし、Y方向およびX方向に直交する方向をZ方向として適宜説明する。また、Z方向については、製造装置1に対して人工三次元組織複合体TCが保持される側を上側とし、逆側を下側として適宜説明する。但し、これは、あくまで説明の便宜のために上下方向を定義したものであって、本発明に係る人工三次元組織複合体TCおよび製造装置1の相対位置を限定するものではない。 In the following, the pair of first structures 51 are separated from each other, the direction in which the second structure 52 extends is the Y direction, the direction parallel to the holding surface 11 and orthogonal to the Y direction is the X direction, and the Y direction and The direction orthogonal to the X direction will be appropriately described as the Z direction. Further, the Z direction will be appropriately described with the side on which the artificial three-dimensional tissue complex TC is held as the upper side and the opposite side as the lower side with respect to the manufacturing apparatus 1. However, this defines the vertical direction only for convenience of explanation, and does not limit the relative positions of the artificial three-dimensional tissue complex TC and the manufacturing apparatus 1 according to the present invention.
(製造装置1)
次に、本発明に係る製造装置1について、図2を参照して説明する。
図2は、製造装置1の外観斜視図である。
図2に示すように、製造装置1は、基材10および一対の保持具20を備えている。
(Manufacturing equipment 1)
Next, the manufacturing apparatus 1 according to the present invention will be described with reference to FIG.
FIG. 2 is an external perspective view of the manufacturing apparatus 1.
As shown in FIG. 2, the manufacturing apparatus 1 includes a base material 10 and a pair of holders 20.
なお、以下では、一対の保持具20が離間する方向をY方向(第1方向)とし、後述する保持面11と平行でY方向と直交する方向をX方向(第2方向)とし、Y方向およびX方向に直交する方向をZ方向として適宜説明する。また、Z方向については、製造装置1に対して人工三次元組織複合体TCが保持される側を上側とし、逆側を下側として適宜説明する。但し、これは、あくまで説明の便宜のために上下方向を定義したものであって、本発明に係る人工三次元組織複合体TCおよび製造装置1の相対位置を限定するものではない。 In the following, the direction in which the pair of holders 20 are separated is the Y direction (first direction), and the direction parallel to the holding surface 11 described later and orthogonal to the Y direction is the X direction (second direction). And the direction orthogonal to the X direction will be described as appropriate as the Z direction. Further, the Z direction will be appropriately described with the side on which the artificial three-dimensional tissue complex TC is held as the upper side and the opposite side as the lower side with respect to the manufacturing apparatus 1. However, this defines the vertical direction only for convenience of explanation, and does not limit the relative positions of the artificial three-dimensional tissue complex TC and the manufacturing apparatus 1 according to the present invention.
基材10は、一例として、エラストマーであり、シリコーンゴム、PDMS(ポリジメチルシロキサン)等の弾性変形可能な軟弾性材、及び樹脂材、金属材等の硬弾性材等、後述する人工三次元組織複合体TCの張力にて弾性変形可能な材料で形成される。
基材10は、Y方向に延びる直方体状に形成されている。なお、以下の説明では、基材10のY方向の中央部に向く側を内側と称し、内側とは逆の方向に向く側を外側と適宜称する。
As an example, the base material 10 is an elastomer, and has an artificial three-dimensional structure described later, such as a soft elastic material that is elastically deformable such as silicone rubber and PDMS (polydimethylsiloxane), and a hard elastic material such as a resin material and a metal material. It is made of a material that can be elastically deformed by the tension of the composite TC.
The base material 10 is formed in a rectangular parallelepiped shape extending in the Y direction. In the following description, the side of the base material 10 facing the center in the Y direction is referred to as the inside, and the side of the base material 10 facing in the direction opposite to the inside is appropriately referred to as the outside.
基材10は、上側に保持面11を有している。保持面11は、第1組織51と第2組織52の一部を下側から保持する。保持面11は、Y方向の外側に位置し第1組織51を培養して形成するための第1領域61と、Y方向の内側に位置し第2組織52を培養して形成するための第2領域62とを有している。 The base material 10 has a holding surface 11 on the upper side. The holding surface 11 holds a part of the first structure 51 and the second structure 52 from below. The holding surface 11 has a first region 61 located outside in the Y direction for culturing and forming the first tissue 51, and a first region 61 located inside the Y direction for culturing and forming the second tissue 52. It has two regions 62.
基材10は、保持面11に開口する凹部12を有している。凹部12は、第1凹部13と第2凹部14とを有している。第1凹部13は、Y方向の両端側に基材10のY方向の中心から等距離の位置に設けられている。第1凹部13は、X方向に延びており基材10のX方向の両側の側面に開口している。第1凹部13は、X方向と直交する断面が矩形状である。第1凹部13は、保持具20の一部が着脱自在に嵌合可能である。 The base material 10 has a recess 12 that opens into the holding surface 11. The recess 12 has a first recess 13 and a second recess 14. The first recesses 13 are provided on both ends in the Y direction at equidistant positions from the center of the base material 10 in the Y direction. The first recess 13 extends in the X direction and opens on both side surfaces of the base material 10 in the X direction. The first recess 13 has a rectangular cross section orthogonal to the X direction. A part of the holder 20 can be detachably fitted to the first recess 13.
第2凹部14は、第1凹部13のX方向の中央からY方向の内側に延びている。すなわち、第1凹部13および第2凹部14は、上側から視たときにT字状に形成されている。第2凹部14の内側の端部の位置は、第1領域61と第2領域62との境界よりも外側である。第2凹部14は、Y方向と直交する断面が矩形状である。第2凹部14は、保持具20の一部が着脱自在に嵌合可能である。 The second recess 14 extends inward in the Y direction from the center of the first recess 13 in the X direction. That is, the first recess 13 and the second recess 14 are formed in a T shape when viewed from above. The position of the inner end of the second recess 14 is outside the boundary between the first region 61 and the second region 62. The second recess 14 has a rectangular cross section orthogonal to the Y direction. A part of the holder 20 can be detachably fitted to the second recess 14.
保持具20は、上側から視たときにT字状に形成されている。保持具20はX方向に延びる第1部分20Aと、第1部分20AのX方向の中央からY方向の内側に延びる第2部分20Bとを有している。第1部分20Aは、第1凹部13に着脱自在に嵌合可能であり、第1凹部13に嵌合したときにY方向に位置決めされる。第2部分20Bは、第2凹部14に着脱自在に嵌合可能であり、第2凹部14に嵌合したときにX方向に位置決めされる。保持具20は、一例として、エポキシやアクリル等の樹脂材で形成される。 The holder 20 is formed in a T shape when viewed from above. The holder 20 has a first portion 20A extending in the X direction and a second portion 20B extending inward in the Y direction from the center of the first portion 20A in the X direction. The first portion 20A can be detachably fitted into the first recess 13, and is positioned in the Y direction when fitted into the first recess 13. The second portion 20B can be detachably fitted into the second recess 14, and is positioned in the X direction when fitted into the second recess 14. As an example, the holder 20 is made of a resin material such as epoxy or acrylic.
各保持具20は、第2保持面22と、第2保持面22に互いに隙間をあけて設けられ、+Z側に突出する複数のアンカー21とを有している。第2保持面22は、保持具20が凹部12に嵌合して装着されたときに保持面11と面一である。 Each holder 20 has a second holding surface 22 and a plurality of anchors 21 provided on the second holding surface 22 with a gap from each other and projecting to the + Z side. The second holding surface 22 is flush with the holding surface 11 when the holder 20 is fitted and mounted in the recess 12.
アンカー21は断面形状が円形の円柱状であり、一例として、直径が数十〜数百μm、長さが1mm程度に形成されている。アンカー21は、一例として、マトリクス状に配列されている。アンカー21は、格子状あるいは千鳥状に配列されている。第1組織51をY方向に拘束する観点から、アンカー21は、X方向に間隔をあけて並ぶ列に対してY方向で隣の列が半ピッチずれた状態で並ぶ千鳥状であることがより好ましい。保持具20は、少なくとも第2保持面22及びアンカー21の表面が細胞に悪影響を与えない材料、一例として、ポリパラキシリレン(所謂、パリレン)で被覆されている。 The anchor 21 is a columnar shape having a circular cross-sectional shape, and is formed as an example having a diameter of several tens to several hundreds μm and a length of about 1 mm. The anchors 21 are arranged in a matrix as an example. The anchors 21 are arranged in a grid pattern or a staggered pattern. From the viewpoint of restraining the first tissue 51 in the Y direction, the anchors 21 are more staggered in that the adjacent rows are arranged in a half pitch offset in the Y direction with respect to the rows arranged at intervals in the X direction. preferable. The holder 20 is coated with at least the surface of the second holding surface 22 and the anchor 21 with a material that does not adversely affect cells, for example, polyparaxylylene (so-called parylene).
上記第1組織51を培養して形成するための第1領域61は、Y方向の外側でアンカー21が配置された領域に位置しアンカー21により第1組織51が拘束される拘束領域71と、Y方向でアンカー21が配置された領域より内側に位置し第1組織51をアンカー21に対して非拘束とする非拘束領域72とを有している。拘束領域71には、上記凹部12が形成されている。 The first region 61 for culturing and forming the first tissue 51 is located in the region where the anchor 21 is arranged outside in the Y direction, and the restraint region 71 in which the first tissue 51 is restrained by the anchor 21 and It has an unconstrained region 72 that is located inside the region where the anchor 21 is arranged in the Y direction and makes the first structure 51 unconstrained with respect to the anchor 21. The recess 12 is formed in the restraint region 71.
続いて、上記の製造装置1により人工三次元組織複合体TCを製造する方法について説明する。
本発明に係る人工三次元組織複合体製造方法は、第1方向に離間して配置されそれぞれで第1細胞を含有する第1ゲル体を保持する第1領域61と、離間した第1領域61の間に配置され第2細胞を含有する第2ゲル体を保持する第2領域62とを有する保持面11を備え、第1領域61のそれぞれは、第1方向の外側に位置し保持面11の位置から互いに隙間をあけて突出し第1ゲル体を拘束可能な複数のアンカー21が設けられた拘束領域71と、拘束領域71よりも第1方向の内側に位置し第1ゲル体を非拘束とする非拘束領域72とを有する基材10を準備する準備ステップと、第1領域61のそれぞれに第1細胞を含有する液体を供給してゲル化させ前記第1ゲル体を形成するとともに、第2領域62に第2細胞を含有する液体を供給してゲル化させ前記第2ゲル体を形成するゲル化ステップと、第1細胞を含有する第1ゲル体を培養して第1組織を形成するとともに、第2細胞を含有する第2ゲル体を培養して両端に第1組織51が接続した第2組織52を形成する培養ステップとを含み、培養ステップでは、第2領域62で収縮により第1方向に配向した第2組織52を形成するとともに、第1領域61で形成された第1組織51のうち、第2組織52の収縮力により伸展して第1方向に配向した第1組織51を非拘束領域72で形成する。
Subsequently, a method of manufacturing the artificial three-dimensional tissue complex TC by the above-mentioned manufacturing apparatus 1 will be described.
In the method for producing an artificial three-dimensional tissue complex according to the present invention, a first region 61, which is arranged apart from each other in the first direction and holds a first gel body containing a first cell, and a separated first region 61, respectively. The holding surface 11 has a second region 62 which is arranged between the two and holds the second gel body containing the second cell, and each of the first regions 61 is located outside in the first direction and holds the holding surface 11. A restraint region 71 provided with a plurality of anchors 21 that protrude from each other with a gap from each other and can restrain the first gel body, and a restraint region 71 that is located inside the restraint region 71 in the first direction and does not restrain the first gel body. In addition to the preparatory step of preparing the base material 10 having the non-restraint region 72, and supplying a liquid containing the first cells to each of the first regions 61 to gel them to form the first gel body. The gelation step of supplying a liquid containing the second cells to the second region 62 and gelling the gel to form the second gel body, and culturing the first gel body containing the first cells to form the first tissue. Including a culture step of culturing a second gel body containing the second cells to form a second tissue 52 in which the first tissue 51 is connected to both ends, the culture step contracts in the second region 62. A second tissue 52 oriented in the first direction is formed by the above method, and of the first tissue 51 formed in the first region 61, the first structure 51 is extended by the contraction force of the second tissue 52 and oriented in the first direction. The tissue 51 is formed in the unconstrained region 72.
以下、人工三次元組織複合体TCの製造方法について、図3乃至図6を参照して詳細に説明する。図3乃至図6は、人工三次元組織複合体TCの製造に係る工程を示す外観斜視図である。
準備ステップでは、上述したように、保持具20が基材10の凹部12に嵌合した製造装置1を準備する。
Hereinafter, a method for producing the artificial three-dimensional tissue complex TC will be described in detail with reference to FIGS. 3 to 6. 3 to 6 are external perspective views showing a process related to the production of the artificial three-dimensional tissue complex TC.
In the preparation step, as described above, the manufacturing apparatus 1 in which the holder 20 is fitted in the recess 12 of the base material 10 is prepared.
続くゲル化ステップでは、図3に示すように、まず、第1領域61における保持面11および保持具20の第2保持面22のそれぞれに第1細胞31を含有する液体を供給した後にゲル化させる(固める)。 In the subsequent gelation step, as shown in FIG. 3, first, a liquid containing the first cell 31 is supplied to each of the holding surface 11 in the first region 61 and the second holding surface 22 of the holder 20, and then gelation is performed. Let (harden).
第1細胞31としては、一例として、腱線維芽細胞を用いている。腱線維芽細胞を含有する液体としては、細胞培養用の細胞外マトリックス成分が好適に用いられる。細胞外マトリックス成分としては、特に限定されないが、例えば、コラーゲン(I型、II型、III型、V型、XI型など)、マウスEHS腫瘍抽出物(IV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどを含む)より再構成された基底膜成分(商品名:マトリゲル)、ゼラチン、寒天、アガロース、フィブリン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカンなどを例示することができる。 As the first cell 31, tendon fibroblasts are used as an example. As the liquid containing tendon fibroblasts, an extracellular matrix component for cell culture is preferably used. The extracellular matrix component is not particularly limited, and for example, collagen (type I, type II, type III, type V, type XI, etc.), mouse EHS tumor extract (type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan, etc.) can be used. Examples thereof include basement membrane components (trade name: Matrigel) reconstituted from (including), gelatin, agar, agarose, fibrin, glycosaminoglycan, hyaluronic acid, proteoglycan and the like.
本実施形態では、ゲル化前の液体としてフィブリンとマトリゲル(登録商標)の混合液を用いている。保持具20の第2保持面22に載せられた第1細胞31を含む液体は、複数のアンカー21の周囲を囲むように、アンカー21の間の隙間に充填される。 In this embodiment, a mixed solution of fibrin and Matrigel (registered trademark) is used as the liquid before gelation. The liquid containing the first cells 31 placed on the second holding surface 22 of the holder 20 is filled in the gap between the anchors 21 so as to surround the periphery of the plurality of anchors 21.
腱線維芽細胞が含有される密度としては、1×105 cells/ml 以上、1×106 cells/ml 以下であることが好ましい。
腱線維芽細胞が含有される密度が1×105 cells/ml 未満の場合、体積に対して十分なコラーゲンが産出されず疎な組織となってしまう。
腱線維芽細胞が含有される密度が1×106 cells/ml を超えた場合、腱線維芽細胞から産出されたコラーゲンの配向が不十分になる可能性がある。そのため、腱線維芽細胞が含有される密度を1×105 cells/ml 以上、1×106 cells/ml 以下とすることにより、成熟した密な組織であり、産出されたコラーゲンの束が配向して整列した腱組織を形成することができる。
The density of tendon fibroblasts is preferably 1 × 10 5 cells / ml or more and 1 × 10 6 cells / ml or less.
If density tendon fibroblasts are contained is less than 1 × 10 5 cells / ml, resulting in a sparse structure, sufficient collagen is produced to volume.
If the density of tendon fibroblasts are contained exceeds 1 × 10 6 cells / ml, there is a possibility that the orientation of the collagen produced from tendon fibroblasts becomes insufficient. Therefore, by setting the density of tendon fibroblasts to 1 × 10 5 cells / ml or more and 1 × 10 6 cells / ml or less, it is a mature and dense tissue, and the produced collagen bundles are oriented. Can form aligned tendon tissue.
供給された第1細胞31を含有する液体は、基材10の保持面11および保持具20の第2保持面22に保持される。この後、製造装置1を所定温度(例えば、37℃)に加温する。これにより、腱線維芽細胞を含有する細胞外マトリックス成分は、第1領域61においてゲル化され第1ゲル体41が形成される。このとき、第1ゲル体41のうち、拘束領域71に位置する第1ゲル体41は、アンカー21により拘束された状態となる。 The supplied liquid containing the first cells 31 is held on the holding surface 11 of the base material 10 and the second holding surface 22 of the holder 20. After that, the manufacturing apparatus 1 is heated to a predetermined temperature (for example, 37 ° C.). As a result, the extracellular matrix component containing the tendon fibroblasts is gelled in the first region 61 to form the first gel body 41. At this time, of the first gel body 41, the first gel body 41 located in the restraint region 71 is in a state of being restrained by the anchor 21.
ゲル化されて培養前の第1ゲル体41は、Y方向の長さをLとし、X方向の長さをWとすると、0.4≦W/L≦0.55の関係を満足する。当該関係を満足することにより、培養後の腱組織を配向させることができる(詳細は後述)。一例として、Y方向の長さLは5〜7mmであり、X方向の長さWは3mm程度(2.5mm以上、4mm未満)である。 The gelled first gel body 41 before culturing satisfies the relationship of 0.4 ≦ W / L ≦ 0.55, where L is the length in the Y direction and W is the length in the X direction. By satisfying this relationship, the tendon tissue after culturing can be oriented (details will be described later). As an example, the length L in the Y direction is 5 to 7 mm, and the length W in the X direction is about 3 mm (2.5 mm or more and less than 4 mm).
ゲル化ステップにおいて、第1ゲル体41が形成された後に、図4に示すように、保持面11において離間する第1ゲル体41の間の第2領域62に、第2細胞32を含有する液体を供給しゲル化させる。第2細胞32としては、一例として、筋芽細胞を用いている。筋芽細胞を含有する液体としては、上記細胞外マトリックス成分が好適に用いられる。 In the gelation step, after the first gel body 41 is formed, the second cell 32 is contained in the second region 62 between the first gel bodies 41 separated on the holding surface 11 as shown in FIG. A liquid is supplied and gelled. As the second cell 32, myoblasts are used as an example. As the liquid containing myoblasts, the extracellular matrix component is preferably used.
この後、製造装置1を所定温度(例えば、37℃)に加温する。これにより、第1ゲル体41と同様に、筋芽細胞を含有する細胞外マトリックス成分は、第2領域62においてゲル化され第2ゲル体42が形成される。第2ゲル体42は、Y方向両端が第1ゲル体41に接した状態である。
これにより、ゲル化ステップが完了する。
After that, the manufacturing apparatus 1 is heated to a predetermined temperature (for example, 37 ° C.). As a result, similarly to the first gel body 41, the extracellular matrix component containing myoblasts is gelled in the second region 62 to form the second gel body 42. The second gel body 42 is in a state where both ends in the Y direction are in contact with the first gel body 41.
This completes the gelling step.
ゲル化ステップが完了すると、本実施形態では、第1ゲル体41および第2ゲル体42を保持面11から離脱させる離脱ステップに移行する。
具体的には、まず、保持具20を上方に移動させて、図5に示すように、基材10の凹部12から離脱させる。これにより、加温によるゲル化時に基材10の保持面11に接着していた第1ゲル体41および離間した第1ゲル体41の間に懸架された第2ゲル体42が保持面11から離れる。
When the gelation step is completed, in the present embodiment, the process proceeds to a detachment step in which the first gel body 41 and the second gel body 42 are separated from the holding surface 11.
Specifically, first, the holder 20 is moved upward to be separated from the recess 12 of the base material 10 as shown in FIG. As a result, the first gel body 41 that was adhered to the holding surface 11 of the base material 10 at the time of gelation by heating and the second gel body 42 suspended between the separated first gel bodies 41 are separated from the holding surface 11. Leave.
次いで、離脱させた保持具20を下降させて凹部12に再度嵌合させる。このとき、保持面11から離れた第1ゲル体41および第2ゲル体42は、再度保持面11に接触するものの、一旦保持面11から離れたことで接着はしない。そのため、第1ゲル体41および第2ゲル体42は、保持面11と接着している場合のように、不具合が生じることなくこの後の培養により収縮することができる。 Next, the detached holder 20 is lowered and refitted into the recess 12. At this time, the first gel body 41 and the second gel body 42 separated from the holding surface 11 come into contact with the holding surface 11 again, but once separated from the holding surface 11, they do not adhere to each other. Therefore, the first gel body 41 and the second gel body 42 can be contracted by the subsequent culture without causing any trouble as in the case where the first gel body 41 and the second gel body 42 are adhered to the holding surface 11.
また、保持具20に第2部分20Bが設けられておらず第1部分20Aで構成される場合、保持具20は基材10の凹部12に嵌合することでY方向に位置決めされるがX方向には位置決めされない。この場合、離脱させた保持具20を下降させて凹部12に再度嵌合させた際に、一対の保持具20のX方向の相対位置が保持具20の離脱前に対して変動してゲル体の培養(人工三次元組織複合体の製造精度)に悪影響を及ぼす可能性がある。本実施形態では、保持具20に第2部分20Bが設けられており、第2部分20Bが基材10の第2凹部14に嵌合することにより、保持具20がX方向に位置決めされるため、一対の保持具20の離脱前と再嵌合させた後との相対位置を保持することができる。そのため、本実施形態では、ゲル体の培養(人工三次元組織複合体の製造精度)に悪影響が及ぶことを回避できる。 Further, when the holder 20 is not provided with the second portion 20B and is composed of the first portion 20A, the holder 20 is positioned in the Y direction by fitting into the recess 12 of the base material 10, but X. Not positioned in the direction. In this case, when the detached holder 20 is lowered and refitted into the recess 12, the relative positions of the pair of retainers 20 in the X direction fluctuate with respect to before the retainer 20 is detached, and the gel body. May adversely affect the culture (manufacturing accuracy of artificial three-dimensional tissue complex). In the present embodiment, the holder 20 is provided with the second portion 20B, and the holder 20 is positioned in the X direction by fitting the second portion 20B into the second recess 14 of the base material 10. , The relative positions of the pair of holders 20 before being detached and after being refitted can be maintained. Therefore, in the present embodiment, it is possible to avoid adversely affecting the culture of the gel body (the accuracy of producing the artificial three-dimensional tissue complex).
第1ゲル体41および第2ゲル体42が保持面11と接着することを阻害するために、例えば、保持面11にMPC(2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン)ポリマー等をコーティングしてもよい。 In order to prevent the first gel body 41 and the second gel body 42 from adhering to the holding surface 11, for example, the holding surface 11 may be coated with an MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) polymer or the like.
上記離脱ステップの実施は、ゲル化ステップの完了直後であってもゲル化ステップの完了後の培養ステップであってもよい。培養ステップの中途に離脱ステップを実施する場合は、第1ゲル体41および第2ゲル体42の培養が進んで収縮が始まる前であることが好ましい。 The withdrawal step may be carried out immediately after the completion of the gelation step or the culture step after the completion of the gelation step. When the withdrawal step is carried out in the middle of the culturing step, it is preferable that the culturing of the first gel body 41 and the second gel body 42 proceeds before the contraction starts.
培養ステップでは、第1細胞31を含有する第1ゲル体41および第2細胞32を含有する第2ゲル体42を、例えば、37℃の温度下で所定期間(例えば、数日)培養する。培養により第1細胞31および第2細胞32は、それぞれ細胞同士の接着が進むことにより、図6に示すように、第1ゲル体41および第2ゲル体42は収縮する。 In the culturing step, the first gel body 41 containing the first cell 31 and the second gel body 42 containing the second cell 32 are cultured at a temperature of, for example, 37 ° C. for a predetermined period (for example, several days). As the cells of the first cell 31 and the second cell 32 adhere to each other by culturing, the first gel body 41 and the second gel body 42 contract as shown in FIG.
第2ゲル体42については、第1ゲル体41に両端が接続されているため、収縮に伴って細くなる。一方、非拘束領域72の第1ゲル体41は、保持具20のアンカー21に拘束されないため収縮に伴って細くなるが、拘束領域71の第1ゲル体41は、アンカー21に拘束されるため細くならない。 Since both ends of the second gel body 42 are connected to the first gel body 41, the second gel body 42 becomes thinner as it shrinks. On the other hand, the first gel body 41 of the non-restraint region 72 is not restrained by the anchor 21 of the holder 20, and thus becomes thinner with contraction, but the first gel body 41 of the restraint region 71 is restrained by the anchor 21. It doesn't get thinner.
さらに培養が進み第1ゲル体41において第1細胞31同士の接着が進むと、図1に示したように、第1領域61に第1組織51として腱組織(以下、腱組織51と称する)が形成される。また、培養が進み第2ゲル体42において第2細胞32同士の接着が進むと、第2領域62に第2組織52として筋組織(以下、筋組織52と称する)が形成される。 As the culture further progresses and the first cells 31 adhere to each other in the first gel body 41, as shown in FIG. 1, the tendon tissue (hereinafter referred to as tendon tissue 51) is used as the first tissue 51 in the first region 61. Is formed. Further, as the culture progresses and the second cells 32 adhere to each other in the second gel body 42, muscle tissue (hereinafter referred to as muscle tissue 52) is formed as the second tissue 52 in the second region 62.
筋組織52は、培養時に両端が第1ゲル体41に接続された状態での収縮により、Y方向に張力が付与されるため、Y方向に配向した状態となる。一方、腱組織51のうち、拘束領域71の腱組織51は、アンカー21に拘束され筋組織52の収縮により伸展しないため、Y方向に配向しない。腱組織のうち、非拘束領域72の腱組織51は、アンカー21に拘束された腱組織51に外側においてつながっており、収縮した筋組織52に内側においてつながっているため、筋組織52の収縮力が張力として作用することで内側に伸展する。その結果、非拘束領域72の腱組織51は、Y方向に配向した状態となる。これにより、図1に示した人工三次元組織複合体TCが製造される。 The muscle tissue 52 is in a state of being oriented in the Y direction because tension is applied in the Y direction by contraction in a state where both ends are connected to the first gel body 41 during culturing. On the other hand, of the tendon tissues 51, the tendon tissue 51 in the restraint region 71 is restrained by the anchor 21 and does not extend due to the contraction of the muscle tissue 52, so that it is not oriented in the Y direction. Of the tendon tissues, the tendon tissue 51 of the non-restraint region 72 is connected to the tendon tissue 51 restrained by the anchor 21 on the outside and is connected to the contracted muscle tissue 52 on the inside, so that the contractile force of the muscle tissue 52 Extends inward by acting as tension. As a result, the tendon tissue 51 of the unrestrained region 72 is in a state of being oriented in the Y direction. As a result, the artificial three-dimensional tissue complex TC shown in FIG. 1 is manufactured.
図7は、腱組織51および筋組織52の培養状態を撮像した写真図である。図7においては、1日培養後(Day1)、3日培養後(Day3)、5日培養後(Day5)および7日培養後(Day7)の培養状態が示されている。なお、培養時間が短くゲル体が組織化していない状態でも便宜上腱組織51および筋組織52と称して説明する。 FIG. 7 is a photograph of the cultured state of the tendon tissue 51 and the muscle tissue 52. In FIG. 7, the culture states after 1-day culture (Day 1), 3-day culture (Day 3), 5-day culture (Day 5), and 7-day culture (Day 7) are shown. Even in a state where the culture time is short and the gel body is not organized, it will be referred to as tendon tissue 51 and muscle tissue 52 for convenience.
図7に示すように、腱組織51および筋組織52は3日培養後あたりで収縮し、筋組織52の変色が観察された。また、5日培養後から7日培養後にかけて、さらに収縮が進み、筋組織52と、図7中で筋組織52よりも色が薄い非拘束領域72の腱組織51とが剥離することなく構築された人工三次元組織複合体TCが製造されたことが観察された。 As shown in FIG. 7, the tendon tissue 51 and the muscle tissue 52 contracted after about 3 days of culturing, and discoloration of the muscle tissue 52 was observed. Further, from the 5-day culture to the 7-day culture, the contraction further progressed, and the muscle tissue 52 and the tendon tissue 51 of the unrestrained region 72, which is lighter in color than the muscle tissue 52 in FIG. 7, were constructed without peeling. It was observed that the artificial three-dimensional tissue complex TC was produced.
図8乃至図11は、細胞外マトリックス成分中に腱線維芽細胞が含有される密度と、当該密度で製造された非拘束領域72の腱組織51のHE染色像およびヘキスト染色像を示す図である。図8および図9に示されるように、腱線維芽細胞が含有される密度が、1×105 cells/ml 以上、1×106 cells/ml 以下の場合は、良好なコラーゲン配向度の腱組織51が観察された。一方、図10および図11に示されるように、腱線維芽細胞が含有される密度が、1×107 cells/ml 以上、1×108 cells/ml 以下の場合は、空隙が多くなり良好とはいえないコラーゲン配向度の腱組織51が観察された。 8 to 11 are diagrams showing the density of tendon fibroblasts contained in the extracellular matrix component and the HE-stained image and Hoechst-stained image of the tendon tissue 51 of the non-restraint region 72 produced at the density. is there. As shown in FIGS. 8 and 9, when the density of tendon fibroblasts contained is 1 × 10 5 cells / ml or more and 1 × 10 6 cells / ml or less, the tendon has a good collagen orientation. Tissue 51 was observed. On the other hand, as shown in FIGS. 10 and 11, when the density of tendon fibroblasts contained is 1 × 10 7 cells / ml or more and 1 × 10 8 cells / ml or less, the number of voids increases, which is good. A tendon tissue 51 having a collagen orientation degree of not so much was observed.
図12は、拘束領域71の腱組織51のHE染色像およびヘキスト染色像を示す図である。図12においては、腱線維芽細胞が含有される密度が、1×105 cells/ml で培養された腱組織51が示されている。図12に示されるように、培養時に拘束された拘束領域71の腱組織51では、コラーゲンの配向を確認できなかった。
上記の観察結果から、腱組織51は、Y方向の外側に位置する拘束領域71にY方向に非配向の非配向部51Aを有し、図7に示されるように、非配向部51Aと筋組織52との間の非拘束領域72に位置しY方向に配向した配向部51Bとを有することを確認できた。
FIG. 12 is a diagram showing an HE-stained image and a Hoechst-stained image of the tendon tissue 51 of the restraint region 71. In Figure 12, the density of tendon fibroblasts are contained in, 1 × 10 5 cells / ml in culture tendon tissue 51 is shown. As shown in FIG. 12, the orientation of collagen could not be confirmed in the tendon tissue 51 of the restraint region 71 restrained during culturing.
From the above observation results, the tendon tissue 51 has a non-oriented portion 51A that is non-oriented in the Y direction in the restraint region 71 located outside in the Y direction, and as shown in FIG. 7, the non-oriented portion 51A and the muscle It was confirmed that the unconstrained region 72 between the tissue 52 and the tissue 52 had an oriented portion 51B located in the Y direction and oriented in the Y direction.
図13は、腱組織51および筋組織52の破断強度を示す図である。腱組織51については、腱線維芽細胞が含有される密度(cells/ml)が、1×105 、5×105 、1×106、のサンプルについてそれぞれ測定した。筋組織52については、筋芽細胞が含有される密度(cells/ml)が1×108 のサンプルについて測定した。
図13に示されるように、筋組織52よりも破断強度が大きな腱組織51を製造できたことが確認された。
FIG. 13 is a diagram showing the breaking strength of the tendon tissue 51 and the muscle tissue 52. For the tendon tissue 51, the density (cells / ml) containing the tendon fibroblasts was measured for each sample having a density of 1 × 10 5 , 5 × 10 5 , and 1 × 10 6. For muscle tissue 52, density myoblasts is contained (cells / ml) were measured for samples of 1 × 10 8.
As shown in FIG. 13, it was confirmed that the tendon tissue 51 having a higher breaking strength than the muscle tissue 52 could be produced.
図14は、腱組織51における培養日数と径の変化率との関係を示す図である。
図14においては、腱線維芽細胞が含有される密度(cells/ml)をサンプルA:5×106 cells/ml、サンプルB:1×106 cells/ml、サンプルC:5×105 cells/ml、サンプルC:1×105 cells/mlのそれぞれについて測定した。図14に示されるように、細胞の密度に拘わらず、14日の培養でおよそ20%に縮むことを確認できた。
FIG. 14 is a diagram showing the relationship between the number of days of culture and the rate of change in diameter in the tendon tissue 51.
In FIG. 14, the density (cells / ml) containing the tendon fibroblasts is sample A: 5 × 10 6 cells / ml, sample B: 1 × 10 6 cells / ml, sample C: 5 × 10 5 cells. / ml, sample C: was measured for each of the 1 × 10 5 cells / ml. As shown in FIG. 14, it was confirmed that the cells shrank to about 20% after 14 days of culture regardless of the cell density.
図15は、拘束領域71の腱組織51のヘキスト染色像を示す図である。図15においては、ゲル化されて培養前の第1ゲル体41がX方向の長さW=4mmとX方向の長さW=3mmのサンプルの像が示されている。いずれのサンプルもY方向の長さL=6mmであった。図15に示されるように、0.4≦W/L≦0.55の関係を満足する長さW=3mmのサンプルでは良好なコラーゲン配向度の腱組織51が観察された。一方、0.4≦W/L≦0.55の関係を満足しない長さW=4mmのサンプルでは空隙が多くなり良好とはいえないコラーゲン配向度の腱組織51が観察された。 FIG. 15 is a diagram showing a Hoechst-stained image of the tendon tissue 51 of the restraint region 71. In FIG. 15, an image of a sample in which the first gel body 41 gelled and before culturing has a length W = 4 mm in the X direction and a length W = 3 mm in the X direction is shown. Each sample had a length L = 6 mm in the Y direction. As shown in FIG. 15, a tendon tissue 51 having a good degree of collagen orientation was observed in a sample having a length W = 3 mm satisfying the relationship of 0.4 ≦ W / L ≦ 0.55. On the other hand, in the sample having a length W = 4 mm that does not satisfy the relationship of 0.4 ≦ W / L ≦ 0.55, a tendon tissue 51 having a collagen orientation degree which is not good due to many voids was observed.
図16および図17は、腱組織51および筋組織52を有する人工三次元組織複合体TCと筋組織とを用い、一定の周期で電気刺激を付与したときの時間と、電気刺激による組織の移動量との関係を示す図である。図16には、Y方向(収縮方向、配向方向)の移動量が示されている。図17には、X方向(径方向)の移動量が示されている。電気刺激は、1Hz、電場1V/mmで付与した。 16 and 17 show the time when electrical stimulation is applied at regular intervals and the movement of tissue by electrical stimulation using an artificial three-dimensional tissue complex TC having tendon tissue 51 and muscle tissue 52 and muscle tissue. It is a figure which shows the relationship with the quantity. FIG. 16 shows the amount of movement in the Y direction (contraction direction, orientation direction). FIG. 17 shows the amount of movement in the X direction (diameter direction). The electrical stimulation was applied at 1 Hz and an electric field of 1 V / mm.
図16に示すように、Y方向(収縮方向、配向方向)については、グラフEで示す人工三次元組織複合体TCと、グラフFで示す筋組織の双方で収縮時に移動する結果が得られた。移動量については、筋組織のみの場合よりも人工三次元組織複合体TCの方が大きい結果が得られた。一方、図17に示すように、X方向(径方向)については、人工三次元組織複合体TCは収縮時に移動する(膨らむ)結果が得られたが、筋組織のみの場合は収縮時にほとんど移動しない結果が得られた。これにより、人工三次元組織複合体TCは、両端が固定された状態でも、生体と同等に長さが変化して運動可能であることを確認できた。 As shown in FIG. 16, in the Y direction (contraction direction, orientation direction), the results of movement during contraction were obtained in both the artificial three-dimensional tissue complex TC shown in Graph E and the muscle tissue shown in Graph F. .. Regarding the amount of movement, the result was obtained that the artificial three-dimensional tissue complex TC had a larger amount than that of the muscle tissue alone. On the other hand, as shown in FIG. 17, in the X direction (diameter direction), the artificial three-dimensional tissue complex TC was found to move (swell) during contraction, but in the case of only muscle tissue, it almost moved during contraction. No results were obtained. From this, it was confirmed that the artificial three-dimensional tissue complex TC can move with a change in length equivalent to that of a living body even when both ends are fixed.
以上説明したように、本実施形態では、いずれも配向性を有し機能性、生体との同等性に優れた腱組織51および筋組織52を有する人工三次元組織複合体TCを得ることができる。 As described above, in the present embodiment, it is possible to obtain an artificial three-dimensional tissue complex TC having tendon tissue 51 and muscle tissue 52, both of which have orientation and are excellent in functionality and equivalence with a living body. ..
以上、添付図面を参照しながら本発明に係る好適な実施形態について説明したが、本発明は係る例に限定されないことは言うまでもない。上述した例において示した各構成部材の諸形状や組み合わせ等は一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲において設計要求等に基づき種々変更可能である。 Although the preferred embodiments according to the present invention have been described above with reference to the accompanying drawings, it goes without saying that the present invention is not limited to the above examples. The various shapes and combinations of the constituent members shown in the above-mentioned example are examples, and can be variously changed based on design requirements and the like within a range not deviating from the gist of the present invention.
例えば、上記実施形態では、腱組織の培養・製造と筋組織の培養・製造とをほぼ同時に開始する手順を例示したが、この手順に限定されない。例えば、腱組織は、成熟した最適な状態となるまでの時間が筋組織よりも長い。そのため、腱組織が成熟した状態となった時点で、筋組織は成熟した状態となった後に放置された状態となり、劣化する可能性がある。そのため、成熟した状態となるまでの時間差が大きい複数の組織を培養・製造する際には、成熟した状態となるまでに要する時間が長い方の組織(例えば、腱組織)の培養を先に開始し、上記時間差が経過した後に成熟した状態となるまでに要する時間が短い方の組織(例えば、腱組織)の培養を開始することが好ましい。これにより、双方の組織が成熟した最適な状態となった人工三次元組織複合体TCを容易に得ることができる。 For example, in the above embodiment, a procedure for starting the culture / production of tendon tissue and the culture / production of muscle tissue at almost the same time has been exemplified, but the procedure is not limited to this procedure. For example, tendon tissue has a longer time to mature and optimal than muscle tissue. Therefore, when the tendon tissue becomes mature, the muscle tissue becomes mature and then left unattended, which may deteriorate. Therefore, when culturing and producing a plurality of tissues having a large time difference until they reach a mature state, the tissue (for example, tendon tissue) that takes a longer time to reach a mature state is first started to be cultured. However, it is preferable to start culturing the tissue (for example, tendon tissue) that takes less time to reach a mature state after the above time difference elapses. As a result, it is possible to easily obtain an artificial three-dimensional tissue complex TC in which both tissues are matured and in an optimum state.
例えば、腱組織の培養を開始した後に筋組織の培養を開始する場合、上述したように、Y方向に離間した第1領域61のそれぞれで腱組織の培養を開始した後に、第2領域62で筋組織の培養を開始する手順であってもよいし、第1領域61および第2領域62の全てで腱組織の培養を開始した後に、第2領域62の腱組織を切除した空間で筋組織の培養を開始する手順であってもよい。 For example, when culturing muscle tissue after starting culturing tendon tissue, as described above, after starting culturing tendon tissue in each of the first regions 61 separated in the Y direction, in the second region 62. It may be a procedure for starting the culture of the muscle tissue, or after starting the culture of the tendon tissue in all of the first region 61 and the second region 62, the muscle tissue is excised in the space where the tendon tissue of the second region 62 is excised. It may be a procedure for starting the culture of.
また、上記実施形態では、腱組織および筋組織を有する人工三次元組織複合体を製造する構成を例示したが、この構成に限定されず他の組織も含めて形成する構成であってもよい。例えば、腱組織の外側に接続された骨(軟骨等)の組織に加えて腱組織および筋組織を有する人工三次元組織複合体を製造する構成であってもよい。 Further, in the above embodiment, a configuration for producing an artificial three-dimensional tissue complex having a tendon tissue and a muscle tissue has been exemplified, but the configuration is not limited to this configuration, and a configuration may be formed including other tissues. For example, it may be configured to produce an artificial three-dimensional tissue complex having tendon tissue and muscular tissue in addition to bone (cartilage or the like) tissue connected to the outside of the tendon tissue.
また、上記実施形態では、第1細胞31として腱線維芽細胞を用いて腱組織を製造し、第2細胞32として筋芽細胞を用いて筋組織を製造する構成を例示したが、この構成に限定されない。例えば、軟骨細胞を用いて散骨組織を製造し、靱帯細胞を用いて軟骨組織の間に靱帯組織を製造する構成にも適用可能である。 Further, in the above embodiment, a configuration in which tendon tissue is produced using tendon fibroblasts as the first cell 31 and myoblasts are produced as the second cell 32 has been exemplified. Not limited. For example, it can be applied to a configuration in which chondrocytes are used to produce bone-cutting tissue and ligament cells are used to produce ligament tissue between cartilage tissues.
1…人工三次元組織複合体製造装置(製造装置)、 10…基材、 11…保持面、 12…凹部、 20…保持具、 20A…第1部分、 20B…第2部分、 21…アンカー、 22…第2保持面、 31…第1細胞、 32…第2細胞、 41…第1ゲル体、 42…第2ゲル体、 51…第1組織(腱組織)、 51A…非配向部、 51B…配向部、 52…第2組織(筋組織)、 61…第1領域、 62…第2領域、 71…拘束領域、 72…非拘束領域、 TC…人工三次元組織複合体 1 ... Artificial three-dimensional tissue complex manufacturing equipment (manufacturing equipment), 10 ... Base material, 11 ... Holding surface, 12 ... Recessed, 20 ... Holder, 20A ... 1st part, 20B ... 2nd part, 21 ... Anchor, 22 ... 2nd holding surface, 31 ... 1st cell, 32 ... 2nd cell, 41 ... 1st gel body, 42 ... 2nd gel body, 51 ... 1st tissue (tendon tissue), 51A ... non-oriented part, 51B … Orientation part, 52… 2nd tissue (muscle tissue), 61… 1st region, 62… 2nd region, 71… restraint region, 72… non-restraint region, TC… artificial three-dimensional tissue complex
Claims (12)
前記第1領域のそれぞれに前記第1細胞を含有する液体を供給してゲル化させ前記第1ゲル体を形成するとともに、前記第2領域に前記第2細胞を含有する液体を供給してゲル化させ前記第2ゲル体を形成するゲル化ステップと、
前記第1細胞を含有する前記第1ゲル体を培養して第1組織を形成するとともに、前記第2細胞を含有する前記第2ゲル体を培養して両端に前記第1組織が接続した第2組織を形成する培養ステップとを含み、
前記培養ステップでは、前記第2領域で収縮により前記第1方向に配向した第2組織を形成するとともに、前記第1領域で形成された前記第1組織のうち、前記第2組織の収縮力により伸展して前記第1方向に配向した前記第1組織を前記非拘束領域で形成する人工三次元組織複合体製造方法。 A second gel body arranged apart from each other in the first direction and holding a first gel body containing a first cell, and a second gel body arranged between the separated first regions and containing a second cell body. Each of the first regions is located outside the first direction and protrudes from the position of the holding surface with a gap from each other to restrain the first gel body. A preparatory step for preparing a substrate having a restraint region provided with a plurality of possible anchors and a non-constraint region located inside the restraint region in the first direction and unconstraining the first gel body. When,
A liquid containing the first cells is supplied to each of the first regions and gelled to form the first gel body, and a liquid containing the second cells is supplied to the second region to gel. In the gelation step of forming the second gel body,
The first gel body containing the first cell is cultured to form a first tissue, and the second gel body containing the second cell is cultured and the first tissue is connected to both ends. Including a culture step to form two tissues
In the culture step, a second tissue oriented in the first direction is formed by contraction in the second region, and the contraction force of the second tissue among the first tissues formed in the first region A method for producing an artificial three-dimensional tissue complex in which the first structure that is stretched and oriented in the first direction is formed in the unconstrained region.
前記第1組織の培養に要する時間と前記第2組織の培養に要する時間との時間差が経過した後に、培養に要する時間が短い方の組織について前記ゲル化ステップおよび前記培養ステップを開始する、
請求項1に記載の人工三次元組織複合体製造方法。 The gelling step and the culturing step are started first for the tissue of the first tissue and the second tissue, whichever takes longer to culture.
After the time difference between the time required for culturing the first tissue and the time required for culturing the second tissue has elapsed, the gelation step and the culture step are started for the tissue having the shorter time required for culturing.
The method for producing an artificial three-dimensional tissue complex according to claim 1.
請求項1または2に記載の人工三次元組織複合体製造方法。 In the culture step, tendon fibroblasts in the extracellular matrix component are cultured in the first region to form tendon tissue, and myoblasts in the extracellular matrix component are cultured in the second region to form muscle tissue. Form,
The method for producing an artificial three-dimensional tissue complex according to claim 1 or 2.
請求項3に記載の人工三次元組織複合体製造方法。 The density of the tendon fibroblasts is 1 × 10 5 cells / ml or more and 1 × 10 6 cells / ml or less.
The method for producing an artificial three-dimensional tissue complex according to claim 3.
0.4≦W/L≦0.55
の関係を満足する、
請求項3または4に記載の人工三次元組織複合体製造方法。 Let L be the length of the gelled extracellular matrix component containing the tendon fibroblasts in the first direction, and let W be the length of the second direction parallel to the holding surface and orthogonal to the first direction. ,
0.4 ≤ W / L ≤ 0.55
Satisfy the relationship,
The method for producing an artificial three-dimensional tissue complex according to claim 3 or 4.
前記保持具には、前記凹部に嵌合したときに前記保持面と面一となる第2保持面と、前記第2保持面から互いに隙間をあけて突出する前記アンカーとが設けられ、
前記ゲル化ステップの後に、前記保持具を前記凹部から離脱させて前記アンカーに拘束された前記第1ゲル体と、離間した前記第1ゲル体の間に懸架された前記第2ゲル体とを前記保持面から離間させるステップと、離脱させた前記保持具を前記凹部に再度嵌合させるステップとを含む、
請求項1から5のいずれか一項に記載の人工三次元組織複合体製造方法。 The base material is formed of an elastomer having a recess provided in the restraint region and a holder detachably fitted in the recess.
The holder is provided with a second holding surface that is flush with the holding surface when fitted into the recess, and an anchor that projects from the second holding surface with a gap from each other.
After the gelation step, the first gel body in which the holder is separated from the recess and is restrained by the anchor, and the second gel body suspended between the separated first gel bodies are formed. A step of separating the holder from the holding surface and a step of refitting the detached holder into the recess are included.
The method for producing an artificial three-dimensional tissue complex according to any one of claims 1 to 5.
前記凹部に嵌合した前記保持具は、前記基材に対して前記第1部分で前記第1方向に位置決めされ、前記第2部分で前記第2方向に位置決めされている、
請求項6に記載の人工三次元組織複合体製造方法。 The holder includes a first portion parallel to the holding surface and extending in a second direction orthogonal to the first direction, and the second region side of the first portion from the middle of the second direction to the first direction. Has a second part that extends to
The holder fitted in the recess is positioned in the first direction in the first portion and in the second direction in the second portion with respect to the base material.
The method for producing an artificial three-dimensional tissue complex according to claim 6.
前記保持面は、第1方向に離間して配置されそれぞれで第1細胞を含有する第1ゲル体を保持する第1領域と、離間した前記第1領域の間に配置され第2細胞を含有する第2ゲル体を保持する第2領域とを有し、
前記第1領域のそれぞれは、前記第1方向の外側に位置し前記保持面の位置から互いに隙間をあけて突出し前記第1ゲル体を拘束可能な複数のアンカーが設けられた拘束領域と、前記拘束領域よりも前記第1方向の内側に位置し前記第1ゲル体を非拘束とする非拘束領域とを有する人工三次元組織複合体製造装置。 It has a base material with a holding surface
The holding surface is arranged between the first region which is arranged apart from each other in the first direction and holds the first gel body containing the first cell, and the first region which is separated and contains the second cell. Has a second region that holds the second gel body
Each of the first regions is a restraint region located outside the first direction and protruding from the position of the holding surface with a gap from each other, and a restraint region provided with a plurality of anchors capable of restraining the first gel body. An artificial three-dimensional tissue complex manufacturing apparatus having an unconstrained region located inside the first direction with respect to the constrained region and having the first gel body unconstrained.
前記保持具には、前記凹部に嵌合したときに前記保持面と面一となる第2保持面と、前記第2保持面から互いに隙間をあけて突出する前記アンカーとが設けられている、
請求項8に記載の人工三次元組織複合体製造装置。 The base material is formed of an elastomer having a recess provided in the restraint region and a holder detachably fitted in the recess.
The holder is provided with a second holding surface that is flush with the holding surface when fitted into the recess, and an anchor that projects from the second holding surface with a gap from each other.
The artificial three-dimensional tissue complex manufacturing apparatus according to claim 8.
前記凹部に嵌合した前記保持具は、前記基材に対して前記第1部分で前記第1方向に位置決めされ、前記第2部分で前記第2方向に位置決めされている、
請求項9に記載の人工三次元組織複合体製造装置。 The holder includes a first portion parallel to the holding surface and extending in a second direction orthogonal to the first direction, and the second region side of the first portion from the middle of the second direction to the first direction. Has a second part that extends to
The holder fitted in the recess is positioned in the first direction in the first portion and in the second direction in the second portion with respect to the base material.
The artificial three-dimensional tissue complex manufacturing apparatus according to claim 9.
前記第1方向に配向して延び、離間した前記第1組織を接続する第2組織とを有し、
前記第1組織のそれぞれは、前記第1方向の外側に位置し前記第1方向に非配向の非配向部と、前記第2組織と前記非配向部との間に位置し前記第1方向に配向した配向部とを有する人工三次元組織複合体。 With the first tissue arranged apart in the first direction,
It has a second tissue oriented and extending in the first direction and connecting the first tissues separated from each other.
Each of the first structures is located outside the first direction and is located between the non-oriented portion that is not oriented in the first direction and the second structure and the non-oriented portion and is located in the first direction. An artificial three-dimensional tissue complex having an oriented oriented portion.
前記第2組織は筋組織である、
請求項11に記載の人工三次元組織複合体。 The first tissue is a tendon tissue
The second tissue is muscle tissue,
The artificial three-dimensional tissue complex according to claim 11.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201962880808P | 2019-07-31 | 2019-07-31 | |
US62/880,808 | 2019-07-31 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2021023289A true JP2021023289A (en) | 2021-02-22 |
Family
ID=74664980
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020129635A Pending JP2021023289A (en) | 2019-07-31 | 2020-07-30 | Artificial three-dimensional tissue composite, production method of artificial three-dimensional tissue composite, and production device of artificial three-dimensional tissue composite |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2021023289A (en) |
-
2020
- 2020-07-30 JP JP2020129635A patent/JP2021023289A/en active Pending
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