JP2021019528A - ナイーブ型多能性幹細胞の増殖能亢進用培地および多能性幹細胞の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ナイーブ型多能性幹細胞の増殖能を亢進させることができる培地、および上記培地を用いて増殖能が亢進された多能性幹細胞の製造方法を提供すること。【解決手段】本発明によれば、下記（１）〜（３）の要件を満たす、ナイーブ型多能性幹細胞の増殖能亢進用培地が提供される。（１）ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤とＧＳＫ３β阻害剤とを含む。（２）プロテインキナーゼＣ阻害剤、Ｗｎｔシグナル阻害剤、およびＳＴＡＴ３活性化剤からなる群から選択されるいずれかを含む。（３）ＨＩＦ阻害剤を含む。さらに、本発明によれば、上記培地中でナイーブ型多能性幹細胞を培養する工程を含む、多能性幹細胞の製造方法が提供される。【選択図】なし

Description

本発明は、ナイーブ型多能性幹細胞の増殖能亢進用培地に関する。本発明は、上記培地を使用する多能性幹細胞の製造方法に関する。

多能性幹細胞としては、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｉＰＳ細胞とも言う）、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞とも言う）などが知られている。再生医療分野においては、特にｉＰＳ細胞の実用化に向けた研究が進められている。

ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞には、ナイーブ型の細胞とプライム型の細胞とが存在することが知られている。ナイーブ型の細胞は、発生初期の状態に近く、プライム型の細胞は、ナイーブ型の細胞に比較して、より発生が進んだ細胞である。

特許文献１には、ヒト幹細胞をよりナイーブな状態にリセットする方法であって、（ａ）初期化されるべきヒト幹細胞を提供すること、（ｂ）（ｉ）所望により１以上の異種の初期化因子を細胞に発現または導入し、（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤を含み、さらに所望によりＳＴＡＴ３活性化剤、および所望により１以上のさらなる阻害剤を含むリセット培地中で細胞を培養することにより、よりナイーブな状態を誘発すること、（ｃ）ＭＥＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤および所望によりＧＳＫ３インヒビター、およびＳＴＡＴ３活性化剤を含むナイーブ培地中に細胞を維持することを含む方法が記載されている。

国際公開ＷＯ２０１６／０２７０９９号

従来、ヒト多能性幹細胞はプライム型でありやや分化が進んだ状態でしか維持できなかったが、ナイーブ型の開発により、さらに未分化な多能性幹細胞が誘導可能になった。しかし、ナイーブ型多能性幹細胞は、プライム型多能性幹細胞と比較して増殖速度が遅いため、同じ収率を得るために時間とコストがかかることが課題であった。

本発明は、ナイーブ型多能性幹細胞の増殖能を亢進させることができる培地、および上記培地を用いて増殖能が亢進された多能性幹細胞の製造方法を提供することを解決すべき課題とする。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ナイーブ型多能性幹細胞を、特定の化合物の存在下で培養することにより、増殖能が亢進された細胞を製造することに成功した。本発明は、上記の知見に基づいて完成したものである。

即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］下記（１）〜（３）の要件を満たす、ナイーブ型多能性幹細胞の増殖能亢進用培地。
（１）ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤とＧＳＫ３β阻害剤とを含む。
（２）プロテインキナーゼＣ阻害剤、Ｗｎｔシグナル阻害剤、およびＳＴＡＴ３活性化剤からなる群から選択されるいずれかを含む。
（３）ＨＩＦ阻害剤を含む。
［２］プロテインキナーゼＣ阻害剤がＧｏ６９８３である、［１］記載の培地。
［３］Ｗｎｔシグナル阻害剤がＸＡＶ９３９である、［１］または［２］に記載の培地。
［４］ＳＴＡＴ３活性化剤が白血病阻止因子である、［１］から［３］の何れか一に記載の培地。
［５］ＨＩＦ阻害剤がＮ−［［４−ヒドロキシ−２−オキソ−１−（フェニルメチル）−１，２−ジヒドロ−３−キノリニル］カルボニル］グリシン、およびＮ−［［１−（２−シクロプロピルエチル）−６−フルオロ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３−キノリニル］カルボニル］グリシンからなる群から選択されるいずれか１つ以上である、［１］から［４］の何れか一に記載の培地。

［６］Ｎ−［［４−ヒドロキシ−２−オキソ−１−（フェニルメチル）−１，２−ジヒドロ−３−キノリニル］カルボニル］グリシンを濃度１μｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で含む、［５］に記載の培地。
［７］Ｎ−［［１−（２−シクロプロピルエチル）−６−フルオロ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３−キノリニル］カルボニル］グリシンを濃度１μｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で含む、［５］に記載の培地。
［８］［１］から［７］の何れか一に記載の培地中でナイーブ型多能性幹細胞を培養する工程を含む、多能性幹細胞の製造方法。
［９］ナイーブ型多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、［８］に記載の製造方法。

本発明によれば、増殖能が亢進されたナイーブ型多能性幹細胞を製造することができる。

図１は、実施例１の未処理の細胞または処理済の細胞におけるＮＡＮＯＧおよびＫＬＦ１７遺伝子の発現を示す。図中のＡ、ＢおよびＣは細胞株である。 図２は、ＩＯＸ２またはＧＳＫ３６０Ａ添加３日後のナイーブ型ｉＰＳ細胞の細胞数の、対照群の細胞数に対する割合を示す。図中のＡ、ＢおよびＣは細胞株である。図中のＣｏｎｔｒｏｌは対照群として用いたＤＭＳＯコントロールを示す。 図３は、ナイーブ型ｉＰＳ細胞にＩＯＸ２またはＧＳＫ３６０Ａを添加して３日後のＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１およびＫＬＦ１７遺伝子の発現を示す。図中のＣｏｎｔｒｏｌは対照群として用いたＤＭＳＯコントロールを示す。

以下、本発明を実施するための形態を、詳細に説明する。
本明細書における略号は以下の意味を有する。
ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）：塩基性線維芽細胞成長因子

ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）：ダルベッコ改変イーグル培地
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＤＭＥＭ Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２）：ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ−１２ハム
ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）：ジメチルスルホキシド
ＤＮＭＴ３Ｂ（ＤＮＡ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ−５−）−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ３ ｂｅｔａ）：ＤＮＡ（シトシン‐５‐）メチルトランスフェラーゼ３ベータ
Ｄｎｍｔ３Ｌ（ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ３ Ｌｉｋｅ）：ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３様
ＥＣＡＴ（ＥＳ ｃｅｌｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ）：ＥＳ細胞関連転写因子
ＥＲａｓ（ＥＳ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｒａｓ）：ＥＳ細胞で発現するＲａｓ
Ｅｒｋ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｋｉｎａｓｅ）：細胞外シグナル調節キナーゼ

ＥＳＧ（Ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ）：胚性幹細胞特異的遺伝子
Ｆｂｘ１５（Ｆ−Ｂｏｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ １５）：Ｆボックス タンパク質１５
ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）：線維芽細胞増殖因子
ＦＯＸＡ２（ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ２）：フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２
Ｆｔｈｌ１７（Ｆｅｒｒｉｔｉｎ ｈｅａｖｙ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−ｌｉｋｅ １７）：フェリチン重鎖ポリペプチド様１７
ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）：グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
Ｇｄｆ３（Ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ−３）：増殖分化因子３

Ｇｒｂ２（Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｏｕｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）：増殖因子受容体結合タンパク質２
ＧＳＫ（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｋｉｎａｓｅ）：グリコーゲン合成酵素キナーゼ
ＨＩＦ（Ｈｙｐｏｘｉａ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｆａｃｔｏｒ）：低酸素誘導因子
ＩＧＦＢＰ４（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）：インスリン様増殖因子結合タンパク質４
Ｋｌｆ（Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ）：クルッペル様因子

ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）：白血病阻止因子
ＭＡＰ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）：分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ
Ｎｒ５ａ１（ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ５，ｇｒｏｕｐ Ａ，ｍｅｍｂｅｒ １）：核内受容体サブファミリー５、グループＡ、メンバー１
Ｎｒ５ａ２（ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ５，ｇｒｏｕｐ Ａ，ｍｅｍｂｅｒ ２）：核内受容体サブファミリー５、グループＡ、メンバー２
Ｏｃｔ（ｏｃｔａｍｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）：オクタマー結合性転写因子
ＰＡＸ６（ｐａｉｒｅｄ ｂｏｘ ６）：ペアードボックス６
ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）：ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＤＧＦＲＡ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ）：血小板由来増殖因子受容体α
ＰＫＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ）：プロテインキナーゼＣ

ＰＯＵ５Ｆ１（ＰＯＵ ｄｏｍａｉｎ， ｃｌａｓｓ ５， ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １）：ＰＯＵドメイン、クラス５、転写因子１
Ｐｒｄｍ１４（ＰＲ／ＳＥＴ ｄｏｍａｉｎ ｆａｍｉｌｙ １４）：ＰＲ／ＳＥＴドメインファミリー１４
Ｒｅｘ１（Ｒｅｄｕｃｅｄ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ １）：低発現タンパク質−１
ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ）：Ｒｈｏ結合コイルドコイル形成キナーゼ
ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）：逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
Ｓａｌｌ４（Ｓａｌ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）：Ｓａｌ様タンパク質４

Ｓｏｘ：ＳＲＹ （ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ）−ｂｏｘ：ＳＲＹ（Ｙ染色体性決定遺伝子）ボックス
Ｓｔａｔ３（Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ３）：シグナル伝達兼転写活性化因子３
Ｔ：Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ：Ｔ 遺伝子にコードされたブラキウリ
Ｔｃｌ１（Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ／ｌｙｍｐｈｏｍａ １Ａ）：Ｔ細胞白血病／リンパ腫１Ａ
Ｔｅｒｔ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）：テロメラーゼ逆転写酵素
ＵＴＦ１（Ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １）未分化胚性幹細胞転写因子１

多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｇｅｒｍ Ｃｅｌｌ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等を挙げることができるが、分化多能性および増殖能（自己複製能）を併せ持つ細胞である限り、これに限定されない。ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を用いることが好ましく、ｉＰＳ細胞を用いることがより好ましい。

「人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）」は、初期化因子の導入等により体細胞をリプログラミングすることによって作製される、分化多能性（多分化能）と増殖能を有する細胞である。ｉＰＳ細胞の作製に使用する体細胞としては、特に限定されず、任意の体細胞を利用することができる。例えば、胎児期の体細胞のほか、成人由来の体細胞（即ち、成熟した体細胞）を用いてもよい。体細胞としては、例えば、（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）線維芽細胞（皮膚細胞等）、上皮細胞、肝細胞、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞）、内皮細胞、筋肉細胞、毛細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞、皮膚細胞等の分化した細胞が挙げられる。体細胞の由来となる生体としては、特に限定されないが、例えば、ヒト、非ヒト動物（例えば、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス）が挙げられる。好ましくは、ヒトである。

体細胞に導入される初期化因子としては特に限定されないが、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ２、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ５、Ｌｉｎ２８、Ｔｅｒｔ、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−１、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、β−カテニン、ＥＣＡＴ１、Ｅｓｇ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌｌ４、Ｒｅｘ１、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔａｔ３、Ｇｒｂ２、Ｐｒｄｍ１４、Ｎｒ５ａ１、Ｎｒ５ａ２、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎが挙げられる。ここで、これらの遺伝子群の中から２以上の遺伝子を選択して任意に組み合わせて導入することができる。なかでも、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃを少なくとも有する組み合わせ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびＬ−Ｍｙｃを少なくとも有する組み合わせ、またはＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８を少なくとも有する組み合わせが好ましい。

また、導入する遺伝子の種は、導入先の細胞の種と同一であることが好ましい。例えば、ヒト由来の細胞へ導入される遺伝子はヒト遺伝子であることが好ましい。例えば、ヒトＯＣＴ３／４、ヒトＳＯＸ２、ヒトＫＬＦ４およびヒトＭＹＣを少なくとも有する組み合わせ、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびL−ＭＹＣを少なくとも有する組み合わせ、またはヒトＯＣＴ３／４、ヒトＳＯＸ２、ヒトＮＡＮＯＧおよびヒトＬＩＮ２８を少なくとも有する組み合わせが好ましい。

初期化因子の遺伝子は、遺伝子発現ベクターを用いて体細胞に導入することができる。遺伝子発現ベクターとしては、特に限定されないが、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、人工染色体ベクター、トランスポゾンベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、センダイウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。

ｉＰＳ細胞は、体細胞に初期化因子を導入することによって自ら作製してもよいが、研究機関や企業から提供または販売されている細胞を入手してもよい。

例えば、京都大学ｉＰＳ細胞研究所から提供されている２０１Ｂ７、２５３Ｇ１、２５３Ｇ４、１２０１Ｃ１、１２０５Ｄ１、１２１０Ｂ２、１２３１Ａ３、１３８３Ｄ２、１３８３Ｄ６、ｉＰＳ−ＴＩＧ１２０−３ｆ７、ｉＰＳ−ＴＩＧ１２０−４ｆ１、ｉＰＳ−ＴＩＧ１１４−４ｆ１、ＣｉＲＡ０８６Ａｉ−ｍ１、ＣｉＲＡ１８８Ａｉ−Ｍ１、またはｉＲＡ１８８Ａｉ−Ｗ１を入手して、使用することができる。

また、ＮＩＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）やＣａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂａｎｋ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ等が作成しているｉＰＳ細胞バンクから入手することもできる。

多能性幹細胞には、ナイーブ型多能性幹細胞およびプライム型多能性幹細胞という２つの異なる状態の細胞が知られている。ナイーブ型多能性幹細胞およびプライム型多能性幹細胞は、分子特徴および細胞特徴により区別することができる。
ナイーブ型多能性幹細胞は、典型的には、未分化性因子Ｏｃｔ４（Ｐｏｕｆ５１と同義である）、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、およびナイーブ因子Ｋｌｆ４、Ｓｔｅｌｌａ、Ｋｌｆ１７などを発現し、ＬＩＦ／ＳＴＡＴ３または２ｉ（ＥＲＫｉ／ＧＳＫｉ）のいずれかに応答して自己再生し、ＦＧＦ／ＥＲＫに応答して分化し、ＸａＸａのＸ染色体状態を呈するという特徴を有する（Ｔａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｃｅｌｌ １５８：１２５４−１２６９， Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ６（４）：４３７−４４６）。プライム型多能性幹細胞は、典型的には、未分化性因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇを発現するがナイーブ因子は発現せず、ＬＩＦ／ＳＴＡＴ３に応答せず、ＦＧＦ／ＥＲＫに応答して自己再生し、ＸａＸｉのＸ染色体活性化状態を呈するという特徴を有する（Ｎｉｃｈｏｌｓ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４（６）：４８７−４９２）。なお、Ｘａは活性型Ｘ染色体を示し、Ｘｉは不活性型Ｘ染色体を示す。本明細書中、ナイーブ型多能性幹細胞およびプライム型多能性幹細胞を、それぞれナイーブ型細胞およびプライム型細胞という場合がある。

プライム型多能性幹細胞は、フィーダー細胞をコートしたプレートまたはマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）などの足場をコートしたプレート上で、適当な培地にて維持培養することができる。フィーダー細胞としては、特に限定されないが、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ細胞）、マウス胎児線維芽細胞（ＳＴＯ細胞）が挙げられる。維持培養の際の培地としては、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）などの市販の培地を使用することができる。あるいはまた、例えば、基礎培地として、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭとＦ１２の混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＝１：１）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ^ＴＭ Ｄ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などが挙げられ、代替血清（ＫＳＲ；Ｋｎｏｃｋｏｕｔ^ＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、Ｌ−グルタミン、２−メルカプトエタノール、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン、ピューロマイシン、マイトマイシン）、ｂＦＧＦ等の添加成分を任意に組み合わせて、上記いずれかの基礎培地に添加したものも、維持培養の際の培地として挙げることができる。維持培養の際の培地は、アスコルビン酸を含まないことが好ましい。維持培養の培養条件は、３７℃、５％ＣＯ_２、１０％Ｏ_２条件下などが好ましいが、特に限定されない。

（増殖能亢進用培地）
本発明のナイーブ型多能性幹細胞の増殖能亢進用培地は、下記（１）〜（３）の要件を満たす培地である。
（１）ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤とＧＳＫ３β阻害剤とを含む。
（２）プロテインキナーゼＣ阻害剤、Ｗｎｔシグナル阻害剤、およびＳＴＡＴ３活性化剤からなる群から選択されるいずれかを含む。
（３）ＨＩＦ阻害剤を含む。

特許文献１には、ヒト幹細胞をよりナイーブな状態にリセットする方法が記載されている。しかしながら、特許文献１には、ナイーブ型多能性幹細胞の増殖速度については記載されていない。

本発明においては、ナイーブ型多能性幹細胞を、ＨＩＦ阻害剤を含む培地で培養することにより、細胞の未分化性およびナイーブ性を維持したまま増殖能を亢進させることに成功したものである。よって、最終的な分化細胞の生産効率が向上し、コスト削減が可能となった。

細胞の増殖能の亢進とは、細胞の増殖速度が速くなることを意味する。例えば、本発明の増殖能亢進用培地で培養して、細胞の増殖速度が速くなることにより、培養前の同細胞あるいは他の培地で培養した同細胞と比較して、短期間でより多くの細胞数に増殖することを意味する。「他の培地」とは、比較する増殖能亢進用培地からＨＩＦ阻害剤のみを除いた培地であることが好ましい。「細胞の未分化性およびナイーブ性を維持したまま増殖能を亢進させる」という記載中の「細胞の未分化性およびナイーブ性の維持」とは、増殖能亢進用培地で培養する前のナイーブ型多能性幹細胞と同程度の未分化性およびナイーブ性を有することを意味する。

本発明のナイーブ型多能性幹細胞について、その製造方法は特定のものに限定されず、従来報告されている方法や、将来開発される任意の方法により製造することができる。例えば、ナイーブ型多能性幹細胞は、プライム型多能性幹細胞を、特定の化合物の存在下で、ナイーブ型多能性幹細胞に変換することにより得ることができる。プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に変換する方法の具体例については、後記する。

本発明のナイーブ型多能性幹細胞の増殖能亢進用培地は、（１）ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤とＧＳＫ３β阻害剤とを含む。ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤（ＭＥＫ阻害剤ともいう）としては、特に限定されないが、例えば、ＰＤ０３２５９０１（Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド；ＣＡＳ登録番号：３９１２１０−１０−９）、Ｕ０１２６（１，４−ジアミノ−２，３−ジシアノ−１，４−ビス［２−アミノフェニルチオ］ブタジエン；ＣＡＳ登録番号：１０９５１１−５８−２）、ＰＤ９８０５９（２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン；ＣＡＳ登録番号：１６７８６９−２１−８）、ＰＤ１８４３５２（２−(２−クロロ−４−ヨードフェニルアミノ)−Ｎ−シクロプロピルメトキシ−３，４−ジフルオロベンズアミド；ＣＡＳ登録番号：２１２６３１−７９−３が挙げられる。なかでも、ＰＤ０３２５９０１が好ましい。培地におけるＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤の濃度は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤の種類などに応じて適宜設定することができる。例えば、ＰＤ０３２５９０１の場合には、好ましくは０．３μｍｏｌ／Ｌ〜５．０μｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．６μｍｏｌ／Ｌ〜３．０μｍｏｌ／Ｌである。これはＰＤ０３２５９０１を濃度０．６μｍｏｌ／Ｌ以上含む培地で培養することにより、ＤＮＡがより脱メチル化されるためである。本発明の一実施態様では、ＤＮＡ変異を最小限に抑えるためにはＰＤ０３２５９０１を０．８μｍｏｌ／Ｌ〜２．０μｍｏｌ／Ｌで添加することが望ましい。

ＧＳＫ３β阻害剤としては、特に限定されないが、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ登録番号：２５２９２７−０６−９）が好ましい。培地におけるＧＳＫ３β阻害剤の濃度は、ＧＳＫ３β阻害剤の種類などに応じて適宜設定することができる。例えば、ＣＨＩＲ９９０２１の場合には、好ましくは０．０１μｍｏｌ／Ｌ〜１．０μｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは０．１μｍｏｌ／Ｌ〜０．５μｍｏｌ／Ｌの範囲である。

本発明のナイーブ型多能性幹細胞の増殖能亢進用培地は、（２）プロテインキナーゼＣ阻害剤、Ｗｎｔシグナル阻害剤、およびＳＴＡＴ３活性化剤からなる群から選択されるいずれかを含む。

プロテインキナーゼＣ阻害剤（ＰＫＣ阻害剤ともいう）としては、特に限定されないが、例えば、Ｇｏ６９８３（３−［１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−５−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；ＣＡＳ登録番号：１３３０５３−１９−７）、ＧＦ１０９２０３Ｘ（３−（１−（３−ジメチルアミノ）プロピル）−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；ＣＡＳ登録番号：１３３０５２−９０−１）が挙げられる。なかでも、Ｇｏ６９８３が好ましい。培地におけるＰＫＣ阻害剤の濃度は、ＰＫＣ阻害剤の種類などに応じて適宜設定することができる。例えば、Ｇｏ６９８３の場合には、好ましくは５０ｎｍｏｌ／Ｌ〜１００μｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは１００ｎｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌの範囲である。

Ｗｎｔシグナル阻害剤としては、特に限定されないが、ＸＡＶ９３９（ｔａｎｋｙｒａｓｅ阻害剤）（ＣＡＳ登録番号：２８４０２８−８９−３）、ＩＷＰ−１、ＩＷＰ−２、ＩＷＰ−３、ＩＷＰ−４、ＩＷＲ−１、５３ＡＨ（以上ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ阻害剤）、ＫＹ０２１１１などの低分子化合物およびそれらの誘導体や、ＩＧＦＢＰ４、ＤＫＫ１、Ｗｎｔ−Ｃ５９などのタンパク質が挙げられる。なかでも、ＸＡＶ９３９が好ましい。培地におけるＷｎｔシグナル阻害剤の濃度は、Ｗｎｔシグナル阻害剤の種類などに応じて適宜設定することができる。例えば、ＸＡＶ９３９の場合には、好ましくは５０ｎｍｏｌ／Ｌ〜１００μｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは１００ｎｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌの範囲である。

ＳＴＡＴ３活性化剤としては、特に限定されないが、白血病阻止因子（ＬＩＦ）を挙げることができる。とくに、ヒト白血病阻止因子が好ましい。培地におけるＳＴＡＴ３活性化剤の濃度は、ＳＴＡＴ３活性化剤の種類などに応じて適宜設定することができる。例えば、ＬＩＦの場合には、好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬの範囲であり、より好ましくは０．２ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲である。

本発明のナイーブ型多能性幹細胞の増殖能亢進用培地は、（２）プロテインキナーゼＣ阻害剤、Ｗｎｔシグナル阻害剤、およびＳＴＡＴ３活性化剤からなる群から選択されるいずれかを単独で含有してもよいし、または２種もしくは３種を含有してもよい。本発明の一実施態様において、ナイーブ型多能性幹細胞の増殖能亢進用培地は、（２）プロテインキナーゼＣ阻害剤、Ｗｎｔシグナル阻害剤、およびＳＴＡＴ３活性化剤からなる群から選択される全てを含むものであってもよい。

本発明のナイーブ型多能性幹細胞の増殖能亢進用培地は、（３）ＨＩＦ阻害剤を含む。ＨＩＦ阻害剤としては、特に限定されないが、Ｎ−［［４−ヒドロキシ−２−オキソ−１−（フェニルメチル）−１，２−ジヒドロ−３−キノリニル］カルボニル］グリシン、Ｎ−［［１−（２−シクロプロピルエチル）−６−フルオロ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３−キノリニル］カルボニル］グリシン、ＬＷ６、ＭＫ−８６１７、ＦＧ−２２１６、Ｍｏｌｉｄｕｓｔａｔ（ＢＡＹ８５−３９３４）、ＫＣ７Ｆ２、Ｒｏｘａｄｕｓｔａｔ（ＦＧ−４５９２）および２−Ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａｄｉｏｌ等が挙げられる。

Ｎ−［［４−ヒドロキシ−２−オキソ−１−（フェニルメチル）−１，２−ジヒドロ−３−キノリニル］カルボニル］グリシンで表される化合物は、ＩＯＸ２（ＣＡＳ登録番号９３１３９８−７２−０）として知られており、本明細書中、ＩＯＸ２とも記載する。ＩＯＸ２の構造式は下記である。

Ｎ−［［１−（２−シクロプロピルエチル）−６−フルオロ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３−キノリニル］カルボニル］グリシンで表される化合物は、ＧＳＫ３６０Ａ（ＣＡＳ登録番号９３１３９９−１９−８）として知られており、本明細書中、ＧＳＫ３６０Ａとも記載する。ＧＳＫ３６０Ａの構造式は下記である。

ＨＩＦ阻害剤は、好ましくはＩＯＸ２またはＧＳＫ３６０Ａである。培地におけるＨＩＦ阻害剤の濃度は、ＨＩＦ阻害剤の種類などに応じて適宜設定することができるが、好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ〜１００μｍｏｌ／Ｌの範囲であり、さらに好ましくは、１μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌの範囲である。例えば、ＩＯＸ２の場合には、好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ〜１００μｍｏｌ／Ｌの範囲であり、さらに好ましくは、１μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌの範囲である。例えば、ＧＳＫ３６０Ａの場合には、好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ〜１００μｍｏｌ／Ｌの範囲であり、さらに好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌの範囲である。

本発明のナイーブ型多能性幹細胞の増殖能亢進用培地は、ＩＯＸ２およびＧＳＫ３６０Ａの何れかを単独で含有してもよいし、ＩＯＸ２およびＧＳＫ３６０Ａを組み合わせて含有してもよい。

本発明のナイーブ型多能性幹細胞の増殖能亢進用培地は、上記（１）から（３）の要件を満たすほか、基礎培地に、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｂ２７（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｎ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、１−チオグリセロール、およびＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）またはＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）などの添加成分を任意に組み合わせて（好ましくは上記の添加成分の全てを組み合わせて）添加した培地であってもよい。上記基礎培地としては、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭとＦ１２の混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＝１：１）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ^ＴＭ Ｄ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などを挙げることができる。

（多能性幹細胞の製造方法）
本発明の多能性幹細胞の製造方法は、上記ナイーブ型多能性幹細胞の増殖能亢進用培地中でナイーブ型多能性幹細胞を培養する工程を含む。上記ナイーブ型多能性幹細胞の増殖能亢進用培地中におけるナイーブ型多能性幹細胞の培養期間は、特に限定されず、例えば、１日以上であればよい。また、培養期間の長さは、例えば４週間以内、３週間以内または２週間以内とすることができるが、これに限定されない。培養条件は、当業者には自明であり、一例としては、３７℃、５％ＣＯ_２、５％Ｏ_２条件下を挙げることができる。ナイーブ型多能性幹細胞は、好ましくはヒトｉＰＳ細胞である。なお、本発明において、同じ培養条件で同一の操作をした細胞は、個体として別であっても同一の性質を持つ細胞とみなす。

本発明の多能性幹細胞の製造方法を実施することにより、未分化性およびナイーブ性を維持したまま増殖能が亢進した細胞を得ることができる。増殖能の亢進は、一定期間における細胞数の増加割合を、対照群と試験群とを比較することにより、評価することができる。細胞数の増加割合は、後記の実施例２に準じて、培養３日目にＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ２．０（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＥｎＳｐｉｒｅ（登録商標）マルチプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により細胞数を定量し算出すればよい。また、細胞数の定量はこの方法に限らず、Ｖｉ−ＣＥＬＬ（ベックマンコールター）やＬＵＮＡ（Ｌｏｇｏｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などのセルカウンターや、血球計算板を用いて計測することもできる。本発明の増殖能亢進用培地で培養した細胞について、上記方法で解析した細胞数の増加割合は、対照群と比べて、１．１〜１００倍上昇することが好ましく、１．２〜５０倍上昇することがさらに好ましく、１．５〜１０倍上昇することが最も好ましい。対照群としては、例えば、上記ナイーブ型多能性幹細胞の増殖能亢進用培地で培養していない細胞、または特にＨＩＦ阻害剤の溶媒であるＤＭＳＯを添加した培地を使用した以外は同条件で培養した細胞（ＤＭＳＯコントロール）を用いることができる。

細胞の未分化性およびナイーブ性が維持されているかどうかは、特に限定されないが、未分化性およびナイーブ性を定義する遺伝子の発現を測定することにより評価することができる。未分化性およびナイーブ性を定義する遺伝子の発現の測定方法は特に限定されないが、例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定を行うことができる。ＲＴ−ＰＣＲは、測定対象となるｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅する方法である。定量的ＲＴ−ＰＣＲとしては、例えば、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素が結合されたプライマーを用いてＰＣＲを行って各サイクル毎に増幅産物量を定量し、検出される蛍光強度が急激に増大するサイクル数から、試料中の鋳型ＤＮＡ量を測定する方法（リアルタイムＰＣＲ）等を挙げることができる。定量的ＲＴ−ＰＣＲの手法は本技術分野において周知であり、市販のキットを使用して実施することもできる。定量的ＲＴ−ＰＣＲによれば、遺伝子の発現量またはコピー数を、対照となるハウスキーピング遺伝子（例えば、ＧＡＰＤＨ遺伝子）の発現量またはコピー数に対する相対値として測定することができる。なお、遺伝子のｍＲＮＡの測定は、通常のＲＴ−ＰＣＲなどによりｍＲＮＡの増幅を行うことにより得た増幅産物をゲル電気泳動にかけ、染色後、バンド強度を測定することによっても行うことができる。あるいは、ＤＮＡチップを用いて遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを検出または定量することもできる。

未分化性を定義する遺伝子としては、特に限定されないが、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＬＩＮ２８、ＳＯＸ２、ＤＮＭＴ３Ｂなどを挙げることができ、ナイーブ性を定義する遺伝子としては、特に限定されないが、ＳＴＥＬＬＡおよびＫＬＦ１７などを挙げることができる。本発明の製造方法により得られた細胞における未分化性を定義する遺伝子の発現量が、対照群（例えばＤＭＳＯコントロール）における同じ遺伝子の発現量と同等であるか、またはそれ以上である場合に未分化性が維持されていると定義し、同等とは対照群における同じ遺伝子の発現量の８０〜１１０％とする。同様に、本発明の製造方法により得られた細胞におけるナイーブ性を定義する遺伝子の発現量が、対照群（例えばＤＭＳＯコントロール）における同じ遺伝子の発現量と同等であるか、またはそれ以上である場合にナイーブ性が維持されていると定義し、同等とは対照群における同じ遺伝子の発現量の８０〜１１０％とする。

好ましくは、本発明の製造方法により得られた細胞におけるＮＡＮＯＧの発現量は、対照群におけるＮＡＮＯＧの発現量と同等であるか、またはそれ以上である。
好ましくは、本発明の製造方法により得られた細胞におけるＰＯＵ５Ｆ１の発現量は、対照群におけるＰＯＵ５Ｆ１の発現量と同等であるか、またはそれ以上である。
好ましくは、本発明の製造方法により得られた細胞におけるＫＬＦ１７の発現量は、対照群におけるＫＬＦ１７の発現量と同等であるか、またはそれ以上である。

さらに好ましくは、本発明の多能性幹細胞の製造方法により得られた増殖能が亢進した細胞は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の全てに分化することができる細胞である。

［分化誘導について］
本発明の多能性幹細胞の製造方法により得られた増殖能が亢進した細胞を分化誘導することにより得られる細胞の種類は、特に限定されない。所望により、内胚葉系細胞、中胚葉系細胞、または外胚葉系細胞に分化誘導することができる。

本発明の多能性幹細胞の製造方法により得られた増殖能が亢進した細胞を分化誘導する方法は、特に限定されない。例えば、市販のＳｔｅｍＤｉｆｆ(登録商標)Ｔｒｉｌｉｎｅａｇｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、内胚葉、中胚葉および外胚葉のそれぞれに分化誘導することができる。

各種細胞への分化誘導の培養条件（培養温度など）は、動物細胞の培養において一般に採用されている条件を採用することができる。すなわち、例えば３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で培養することができる。また、基礎培地として、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ＧＩＢＣＯ社等）、ハムＦ１２培地（ＨａｍＦ１２）（ＳＩＧＭＡ社、Ｇｉｂｃｏ社等）、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）（ナカライテスク株式会社、シグマ社、Ｇｉｂｃｏ社等）、グラスゴー基本培地（Ｇｉｂｃｏ社等）、ＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。二種以上の基礎培地を併用することにしてもよい。培地に添加可能な成分の例としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、抗生物質、２−メルカプトエタノール、ＰＶＡ、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、インスリン、トランスフェリン、セレニウムを挙げることができる。典型的には培養皿などを用いて二次元的に細胞を培養する。但し、ゲル状の培養基材あるいは３次元培養プレートなどを用いた３次元培養を実施することにしてもよい。

本発明の多能性幹細胞の製造方法により得られた増殖能が亢進した細胞は、内胚葉系細胞分化条件にて培養することにより、内胚葉系細胞へ分化することができる。内胚葉系細胞としては、特に限定されないが、例えば、消化器系細胞（肝細胞、肝類洞内皮細胞、クッパー細胞、肝星細胞、ピット細胞、胆管細胞、中皮細胞、膵内分泌細胞、腺房細胞、導管細胞、吸収細胞、杯細胞、パネート細胞、腸内分泌細胞等）、肺、甲状腺等の組織の細胞が挙げられる。

本発明の多能性幹細胞の製造方法により得られた増殖能が亢進した細胞は、上記以外の中胚葉系細胞分化条件にて培養することにより、中胚葉系細胞へ分化することができる。中胚葉系細胞としては、特に限定されないが、血球・リンパ球系細胞（造血幹細胞、赤血球、血小板、マクロファージ、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、Ｂリンパ球等）、脈管系細胞（血管内皮細胞等）、心筋細胞（例えば心房筋細胞、心室筋細胞等）、骨芽細胞、骨細胞，軟骨細胞，腱細胞，脂肪細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。

本発明の多能性幹細胞の製造方法により得られた増殖能が亢進した細胞は、上記以外の外胚葉系細胞分化条件にて培養することにより、外胚葉系細胞へ分化することができる。外胚葉系細胞としては、特に限定されないが、神経系細胞、感覚器細胞（水晶体、網膜、内耳など）、皮膚表皮細胞、毛包などが挙げられる。

本発明において、本発明の多能性幹細胞の製造方法により得られた増殖能が亢進した細胞を用いて分化誘導した細胞は、各種疾患の治療用医薬品候補化合物のスクリーニングに用いることができる。例えば、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて、医薬品候補化合物を、分化誘導した細胞に添加することによって、細胞の形態または機能的な変化、各種因子の増減、遺伝子発現プロファイリング等を検出することにより、評価を行うことができる。ここで、細胞は、治療対象となる疾患と同様の表現型を有する細胞が好ましく、より好ましくは、疾患に罹患した患者に由来する体細胞を用いて本発明の方法により製造した細胞から分化誘導した細胞である。

本発明において、本発明の多能性幹細胞の製造方法により得られた増殖能が亢進した細胞を用いて分化誘導した分化細胞から組織を作製して、再生医療の分野で使用することができる。作製した組織の患者への移植方法としては、当業者であれば自明である。また、本発明の方法で作成したｉＰＳ細胞またはｉＰＳ細胞から分化させた細胞の別の用途として各種のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが提供される。例えば、ｉＰＳ細胞由来分化細胞を用いて被験物質のスクリーニングなどを行うことができる。

［プライム型多能性幹細胞のナイーブ型細胞への変換処理］
プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に変換処理することは、例えば、後記の実施例１の手順に準じて、プライム型多能性幹細胞を、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤およびＳＴＡＴ３活性化剤を含む培地で培養し（第一培養工程）、その後、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含まずに、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤、Ｗｎｔシグナル阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、およびＳＴＡＴ３活性化剤を含む培地で培養すること（第二培養工程）により実施することができる。

第一培養工程のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤、およびＳＴＡＴ３活性化剤を含む培地は、基礎培地に、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｂ２７（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｎ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、１−チオグリセロール、およびＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）またはＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）などの添加成分を任意に組み合わせて（好ましくは上記の添加成分の全てを組み合わせて）添加し、さらに、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤、およびＳＴＡＴ３活性化剤を添加した培地であってもよい。上記基礎培地としては、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭとＦ１２の混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＝１：１）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ^ＴＭ Ｄ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などを挙げることができる。

ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としては、バルプロ酸またはその塩（バルプロ酸ナトリウムなど）、酪酸またはその塩（酪酸ナトリウムなど）、トリコスタチンＡ、およびアピシジンなどを使用することができるが、特に限定されない。培地におけるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の濃度は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の種類などに応じて適宜設定することができる。例えば、バルプロ酸の場合には、好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは０．２ｍｍｏｌ／Ｌ〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、さらに好ましくは０．５ｍｍｏｌ／Ｌ〜２ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。

ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤の具体例は上記（増殖能亢進用培地）の項に記載のものと同様であり、濃度についても上記（増殖能亢進用培地）の項に記載のとおり、適宜設定することができる。ＳＴＡＴ３活性化剤の具体例は上記（増殖能亢進用培地）の項に記載のものと同様であり、濃度についても上記（増殖能亢進用培地）の項に記載のとおり、適宜設定することができる。

第一培養工程における培養条件は、当業者には自明であり、一例としては、３７℃、５％ＣＯ_２、５％Ｏ_２条件下を挙げることができる。特に、低酸素（５％Ｏ_２）の条件下で培養することが好ましい。第一培養工程における培養期間は特に限定されないが、例えば、１日〜５日間、好ましくは２日〜４日間培養することができる。

第二培養工程のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含まずに、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤、Ｗｎｔシグナル阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、およびＳＴＡＴ３活性化剤を含む培地は、基礎培地に、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｂ２７（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｎ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、１−チオグリセロール、およびＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）またはＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）などの添加成分を任意に組み合わせて（好ましくは上記の添加成分の全てを組み合わせて）添加し、さらに、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤、Ｗｎｔシグナル阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、およびＳＴＡＴ３活性化剤を添加した培地であってもよい。上記基礎培地としては、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭとＦ１２の混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＝１：１）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ^ＴＭ Ｄ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などを挙げることができる。

ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤の具体例は上記（増殖能亢進用培地）の項に記載のものと同様であり、濃度についても上記（増殖能亢進用培地）の項に記載のとおり、適宜設定することができる。プロテインキナーゼＣ阻害剤の具体例は上記（増殖能亢進用培地）の項に記載のものと同様であり、濃度についても上記（増殖能亢進用培地）の項に記載のとおり、適宜設定することができる。Ｗｎｔシグナル阻害剤の具体例は上記（増殖能亢進用培地）の項に記載のものと同様であり、濃度についても上記（増殖能亢進用培地）の項に記載のとおり、適宜設定することができる。ＧＳＫ３β阻害剤の具体例は上記（増殖能亢進用培地）の項に記載のものと同様であり、濃度についても上記（増殖能亢進用培地）の項に記載のとおり、適宜設定することができる。ＳＴＡＴ３活性化剤の具体例は上記（増殖能亢進用培地）の項に記載のものと同様であり、濃度についても上記（増殖能亢進用培地）の項に記載のとおり、適宜設定することができる。

第二培養工程における培養条件は、当業者には自明であり、一例としては、３７℃、５％ＣＯ_２、５％Ｏ_２条件下を挙げることができる。特に、低酸素（５％Ｏ_２）の条件下で培養することが好ましい。なお、第一および第二培養工程において、培地はアスコルビン酸を含まないことが好ましい。

第二培養工程は、さらに２つの培養工程に分けて実施することができる。２つの培養工程は、それぞれ、ＧＳＫ３β阻害剤の添加の有無について異なる培地を使用することができる。すなわち、第二培養工程は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含まずに、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤、Ｗｎｔシグナル阻害剤、およびＳＴＡＴ３活性化剤を含む培地で培養した後、この培地にＧＳＫ３β阻害剤を加えた培地で培養を行う工程であってもよい。

第二培養工程における培養期間は特に限定されないが、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含まずに、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤、Ｗｎｔシグナル阻害剤、およびＳＴＡＴ３活性化剤を含む培地で、例えば、３から８日間、好ましくは４から７日間培養した後、この培地にＧＳＫ３β阻害剤を加えた培地で、例えば、３から１０日間、好ましくは４から９日間培養することができる。

プライム型多能性幹細胞に対して、上記変換処理を実施することにより、ナイーブ型多能性幹細胞を得ることができる。上記変換処理を実施することにより得られたナイーブ型多能性幹細胞では、未分化状態は維持されており、且つプライム型多能性幹細胞と比較して特定の分化細胞に分化する能力が亢進されている。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

（実施例１）
ナイーブ型多能性幹細胞を誘導するために以下の実験を行った。
［方法］
＜細胞＞
ヒトｉＰＳ細胞株について、ＡからＣ株は、ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＦＣＤＩ）より分譲を受けた。
＜プライム型ｉＰＳ細胞のナイーブ型変換＞
ヒトｉＰＳ細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（マトリゲル）（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）をコートした６ウェルプレート上でＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）培地にて３７℃、５％ＣＯ_２、１０％Ｏ_２条件下で維持培養した。ここで得られた細胞は、プライム型多能性幹細胞である。また、ここで得られた細胞を、「未処理の細胞」とする。

０日目：培養中のヒトｉＰＳ細胞をＴｒｙｐＬＥ^ＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３７℃、５分間の処理により剥離し、シングルセル化した。マウス胎仔由来線維芽細胞（ＭＥＦ、Ｌｏｎｚａ）を０．５ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）で播種済またはマトリゲルコート済のウェルに、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＳｔｅｍＦｌｅｘ（登録商標）にＹ−２７６８４（１０μｍｏｌ／Ｌ、Ｗａｋｏ）を添加した培地を入れ、シングルセル化ヒトｉＰＳ細胞を１ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、以降９日目まで３７℃、５％ＣＯ_２、５％Ｏ_２条件下で培養した。
１日目：表１の培地１に培地を交換した。
２〜３日目：新たな培地１に半量交換した。
４〜８日目：表１の培地２に培地を交換し、８日目まで１日おきに同培地に交換した。
９日目：ＴｒｙｐＬＥ^ＴＭ Ｓｅｌｅｃｔで３７℃で５分処理して細胞を剥離し、培地３にＹ−２７６３２（１０μｍｏｌ／Ｌ、Ｗａｋｏ）を添加した培地でＭＥＦを播種済またはマトリゲル（登録商標）コートしたプレートに継代した。以降、培地３により、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２、５％Ｏ_２条件下で維持培養した。ここで得られた細胞を、「処理済の細胞」とする。

＜遺伝子発現解析＞
前述の処理により誘導したｉＰＳ細胞がナイーブ型であることを確認するために、ＡからＣ株について、未処理の細胞または処理済の細胞における未分化マーカーＮＡＮＯＧとナイーブマーカーＫＬＦ１７の遺伝子発現を測定した。回収した細胞から、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡからＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ-ｔｏ-ｃＤＮＡ^ＴＭ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｃ）によりｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型に、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ１７、およびＧＡＰＤＨについてＶｉｉａ７^ＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、内部標準遺伝子ＧＡＰＤＨで発現量を補正した。表２のＰｒｏｂｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔに示すものは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社のＴａｑｍａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙにてある遺伝子のＰＣＲを行うためのＰｒｏｂｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔのコード名である。

［結果］
実施例１の誘導処理を実施したＡからＣ株の細胞（処理済の細胞）における未分化マーカーＮＡＮＯＧ及びナイーブマーカーＫＬＦ１７の遺伝子発現は、未処理の細胞と比較して有意に上昇していた（図１）。以上の結果から、実施例１の誘導処理を実施した細胞は未分化性およびナイーブ性をもつことが示された。また、プライム型のｉＰＳ細胞ではナイーブマーカーＫＬＦ１７の発現がほぼ検出できないことが示された。

実施例２
＜化合物処理と細胞増殖能の評価＞
実施例１で得られたナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞ＡからＣ株を、ＭＥＦまたはＭａｔｒｉｇｅｌ（マトリゲル）（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）をコートした６ウェルプレートに再播種し、表３に記載の化合物の何れかを添加した表１の培地３で３７℃、５％Ｏ_２条件下で培養した。
また、対照群としては、上記化合物の代わりにＤＭＳＯ（２００倍希釈）を添加した以外は、同じ条件にてナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞を培養した。培養３日目にＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）２．０（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＥｎＳｐｉｒｅ（登録商標）マルチプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により細胞数を定量した。

［結果］
ナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞にＩＯＸ２またはＧＳＫ３６０Ａを１０μｍｏｌ／Ｌ添加し３日目の細胞数を定量した結果、全３株において、対照群と比較して、ＩＯＸ２またはＧＳＫ３６０Ａを添加した群で細胞数が増加した（図２）。すなわち、ＩＯＸ２添加群およびＧＳＫ３６０Ａ添加群において、ナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞の増殖能が亢進された。

実施例３
＜遺伝子発現解析＞
Ａ株について、実施例２の化合物添加から培養３日目の細胞を回収し、ナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞における未分化マーカーＮＡＮＯＧおよびＰＯＵ５Ｆ１、並びにナイーブマーカーＫＬＦ１７の遺伝子発現を測定した。回収した細胞から、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡからＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ-ｔｏ-ｃＤＮＡ^ＴＭ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｃ）によりｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型に、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ１７、およびＧＡＰＤＨについてＶｉｉａ７^ＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、内部標準遺伝子ＧＡＰＤＨで発現量を補正した。表４のＰｒｏｂｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔに示すものは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社のＴａｑｍａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙにてある遺伝子のＰＣＲを行うためのＰｒｏｂｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔのコード名である。

[結果]
ＩＯＸ２およびＧＳＫ３６０Ａ未添加群の細胞は、実施例１でナイーブ型に誘導した細胞と同様の性質をもち、未分化性およびナイーブ性を有している。ＩＯＸ２添加群およびＧＳＫ３６０Ａ添加群のＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１，ＫＬＦ１７の発現レベルは対照群と比較して、同等以上であった（図３）。従って、ＩＯＸ２またはＧＳＫ３６０Ａを添加したナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞は未分化性およびナイーブ性を維持していた。

Claims (9)

1. 下記（１）〜（３）の要件を満たす、ナイーブ型多能性幹細胞の増殖能亢進用培地。
   （１）ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤とＧＳＫ３β阻害剤とを含む。
   （２）プロテインキナーゼＣ阻害剤、Ｗｎｔシグナル阻害剤、およびＳＴＡＴ３活性化剤からなる群から選択されるいずれかを含む。
   （３）ＨＩＦ阻害剤を含む。
2. プロテインキナーゼＣ阻害剤がＧｏ６９８３である、請求項１に記載の培地。
3. Ｗｎｔシグナル阻害剤がＸＡＶ９３９である、請求項１または２に記載の培地。
4. ＳＴＡＴ３活性化剤が白血病阻止因子である、請求項１から３の何れか一項に記載の培地。
5. ＨＩＦ阻害剤がＮ−［［４−ヒドロキシ−２−オキソ−１−（フェニルメチル）−１，２−ジヒドロ−３−キノリニル］カルボニル］グリシン、およびＮ−［［１−（２−シクロプロピルエチル）−６−フルオロ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３−キノリニル］カルボニル］グリシンからなる群から選択されるいずれか１つ以上である、請求項１から４の何れか一項に記載の培地。
6. Ｎ−［［４−ヒドロキシ−２−オキソ−１−（フェニルメチル）−１，２−ジヒドロ−３−キノリニル］カルボニル］グリシンを濃度１μｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で含む、請求項５に記載の培地。
7. Ｎ−［［１−（２−シクロプロピルエチル）−６−フルオロ−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３−キノリニル］カルボニル］グリシンを濃度１μｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で含む、請求項５に記載の培地。
8. 請求項１から７の何れか一項に記載の培地中でナイーブ型多能性幹細胞を培養する工程を含む、多能性幹細胞の製造方法。
9. ナイーブ型多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、請求項８に記載の製造方法。