JP2021016724A - リン酸カルシウムに対するタンパク質集積方法およびタンパク質を集積したリン酸カルシウム - Google Patents
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Abstract
Description
ウシ血清アルブミン(BSA)の吸着は、OCP相に関して飽和条件下でラングミュア型単層吸着モデルによって十分に説明することができる(例えば、非特許文献11参照)。同様のモデルを用いて、HAへの唾液タンパク質およびアミノ酸の吸着が説明された(例えば、非特許文献12、13参照)。
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
(1.1 OCPの調製)
OCPは、湿式合成法(非特許文献2参照)にしたがって、酢酸カルシウムとリン酸水素ナトリウムの水溶液とを混合することによって合成された。溶液から回収した沈殿物を、脱イオン水を用いて洗浄した。沈殿物が105℃で乾燥した後、沈殿物を粉砕し試験用篩(270メッシュ)を通過させ、直径53μm未満および比表面積16m2・g-1のOCPの顆粒を得た(非特許文献7参照)。
HAおよびOCPに関して異なる過飽和度(DS)を有する溶液を得るため、CaCl2・2H2O、K2HPO4、およびトリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)(富士フィルム和光純薬社製)超純水に添加し、1.5mM(M=mol・L-1)のカルシウムイオン(Ca2+)および1.0mMの無機リン酸(Pi)イオンまたは3.0mMのCa2+および1.0mMのPiイオンを含有する150mMのTris−HCl緩衝液を調製した。緩衝液のpHはHCl溶液を用いてpH7.4(37℃)に調整した。続いて各緩衝液に、0、0.20、0.25、0.50、0.75、1.0、 1.5mg・mL-1のウシ血清アルブミン(BSA、分子量:66kDa(Sigma−Aldrich社製))を添加した(調製用液)。
カルシウムEテストワコーおよびホスファCテストワコー(富士フイルム和光純薬社)のそれぞれを用いて、OCPの存在下および非存在下でのインキュベーション前後の、調製溶液中のCa2+およびPiイオンそれぞれの濃度を測定した。
調製溶液中でインキュベートしたOCPの顆粒を超純水で数回洗浄した後、凍結乾燥した。
(2.1 異なるDSを有する溶液中のOCPへのBSA集積容量の測定)
図1には、各調製溶液における、BSAの平衡濃度に対するOCPの単位面積当たりの吸着量が示されている。値は独立した3回の実験から得られた平均値を用いグラフのエラーバーは標準偏差値(SD)を示している。図1に示されている破線は、本発明者らによって報告された、37℃、pH7.4におけるOCPについての飽和状態でのOCPへのBSAの吸着等温線を表わしており、ラングミュア式(関係式(2)参照)に基づいて得られた吸着定数から算出した結果のプロットである。(非特許文献11参照)。
(2.3.1 XRD分析)
図2Aに、Ca1.5P1.0の調製溶液中でのインキュベーション前後のOCPのXRDパターンを示す。また、図2Bは、Ca3.0 P1.0の調製溶液中でのインキュベーション前後のOCPのXRDパターンである。OCP結晶構造の(100)、(010)および(002)面に対応するピークは、それぞれ2θ=4.7°、9.8°および26°に検出される。OCPの(100)に対応するピークの強度はわずかに減少したが、これらの特徴的なOCPのピークは、調製溶液のDS値およびBSA濃度にかかわらず、インキュベーション後にも検出された。また、インキュベーション後のパターンでは、HAなどの他のリン酸カルシウムの結晶相に起因するピークは認められなかった。
図3A、3Bにはそれぞれ、Ca1.5P1.0およびCa3.0P1.0でのインキュベーション前後のOCPの1500〜1800cm-1の範囲のラマンスペクトルを示した。インキュベーション後のスペクトルは代表としてBSA0およびBSA0.50のものを示した。図3Aおよび図3Bからわかるように、BSAを含む調製溶液に浸漬したOCPのスペクトルでは、BSAのアミドIII、トリプシンおよびフェニルアラニンのアミノ酸、ならびにアミドIに起因するピークが、1548cm-1、1604cm-1および1653cm-1のそれぞれにおいて認められた(非特許文献18参照)。
図4A、図4Bのそれぞれには、インキュベーション前のOCPおよび0.50mg・mL-1のBSAを含有するCa3.0P1.0でのインキュベーション後のOCPの明視野像が示されている。図4Aの弱拡大像に示されているように、OCP結晶の典型的な形態である板状構造を有する粒子が観察された。図4Bの弱拡大像に示されているように、この板状構造はインキュベーション後でも維持されていた。図4Aの強拡大像に示されているように、インキュベーション前のOCPは平滑な表面を有していた。これに対し、図4Bの強拡大像に示されているように、調製溶液中でインキュベーションされたOCPの表面に多数の凹凸が観察された。
上記のインキュベーション後の調製溶液中のカルシウムイオンおよび無機リン酸イオン濃度の減少、XRDパターン、TEM像の結果から、TEM像で見られる表面の多数の凹凸は微細なOCP結晶であることが示唆される。
この結晶は核形成を経て、元の結晶あるいは新たに析出した結晶のいずれかが成長したものであると考えられる。
本発明がラングミュア式で示される吸着等温線を超え効率よくタンパク質を集積させることができるのは、上記によって新たにタンパク質の吸着サイトが出現し、あるいは析出の際にタンパク質を取り込むことによるためであると考えられる。
Claims (10)
- 生体材料としての機能向上を目的としてタンパク質が集積されていることを特徴とするリン酸カルシウム
- 新生骨の形成を促進することを目的としてタンパク質が集積されていることを特徴とするリン酸カルシウム
- 請求項1または2においてラングミュア式から予測しうる量を超える量のタンパク質が集積されていることを特徴とするリン酸カルシウム
- 元の結晶表面に新たなOCP結晶が生じることにより誘導されるタンパク質吸着能を有することを特徴とするリン酸カルシウム
- 請求項1、2、3または4においてリン酸カルシウムにリン酸八カルシウム、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、アモルファスリン酸カルシウムおよびそれらの複合体を用いている生体材料
- 請求項1、2、3または4においてリン酸カルシウムにリン酸八カルシウムおよびリン酸八カルシウムを含む複合体を用いている生体材料
- 生体材料としての機能向上を目的として、リン酸カルシウムに対しタンパク質を集積させる方法
- 請求項7においてリン酸八カルシウムおよびリン酸八カルシウムを含む複合体に対しタンパク質を集積する方法
- リン酸カルシウムにタンパク質を集積させる方法であって、
1〜5mMのカルシウムイオンおよび0.5〜3mMの無機リン酸イオンを含有し、25〜45℃でpH6〜8に調整された緩衝液を調製する緩衝液調製工程と、
前記緩衝液のカルシウムイオン含有量が1〜5mMの場合には0.01〜1.5mg・mL-1の範囲でタンパク質を前記緩衝液に溶解し、タンパク質含有緩衝液を調製するタンパク質含有緩衝液調製工程と、
前記タンパク質含有緩衝液にリン酸カルシウムを接触させるリン酸カルシウム接触工程と、を含んでいることを特徴とする方法。 - 請求項1記載の方法において、
前記細胞活性化タンパク質含有緩衝液調整工程において、0.01〜0.5mg・mL-1の範囲でタンパク質を前記緩衝液に溶解することによりタンパク質含有緩衝液を調製することを特徴とする方法。
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