JP2021007327A - Enriched culture medium for genus listeria bacterium, and method for culturing genus listeria bacterium - Google Patents
Enriched culture medium for genus listeria bacterium, and method for culturing genus listeria bacterium Download PDFInfo
- Publication number
- JP2021007327A JP2021007327A JP2019122010A JP2019122010A JP2021007327A JP 2021007327 A JP2021007327 A JP 2021007327A JP 2019122010 A JP2019122010 A JP 2019122010A JP 2019122010 A JP2019122010 A JP 2019122010A JP 2021007327 A JP2021007327 A JP 2021007327A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- liter
- less
- listeria
- medium
- experiment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000186781 Listeria Species 0.000 title claims abstract description 87
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title abstract description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 50
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 25
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 claims description 74
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 50
- PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N Aesculin Natural products OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1Oc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N 0.000 claims description 19
- WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N Cichoriin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)c1c(O)cc2c(OC(=O)C=C2)c1 WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N 0.000 claims description 19
- XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N esculin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC(C(=C1)O)=CC2=C1OC(=O)C=C2 XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N 0.000 claims description 19
- 229940093496 esculin Drugs 0.000 claims description 19
- AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N esculin Natural products OC1OC(COc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O)C(O)C(O)C1O AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical class C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 15
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 15
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 15
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 12
- QEUYATCJHJUQML-UHFFFAOYSA-N acridine-3,6-diamine;10-methylacridin-10-ium-3,6-diamine;chloride;hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].C1=CC(N)=CC2=NC3=CC(N)=CC=C3C=C21.C1=C(N)C=C2[N+](C)=C(C=C(N)C=C3)C3=CC2=C1 QEUYATCJHJUQML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229940002707 acriflavine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 11
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 10
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 241000371296 Listeria riparia Species 0.000 claims description 9
- 108010009004 proteose-peptone Proteins 0.000 claims description 8
- 241000371298 Listeria grandensis Species 0.000 claims description 7
- 241000186806 Listeria grayi Species 0.000 claims description 6
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 claims description 5
- 241000186805 Listeria innocua Species 0.000 claims description 4
- 241000390917 Listeria newyorkensis Species 0.000 claims description 4
- 241000371304 Listeria aquatica Species 0.000 claims description 3
- 241000215688 Listeria booriae Species 0.000 claims description 3
- 241000371308 Listeria cornellensis Species 0.000 claims description 3
- 241000452253 Listeria fleischmannii Species 0.000 claims description 3
- 241000371306 Listeria floridensis Species 0.000 claims description 3
- 241000186780 Listeria ivanovii Species 0.000 claims description 3
- 241001120504 Listeria marthii Species 0.000 claims description 3
- 241001554615 Listeria rocourtiae Species 0.000 claims description 3
- 241000186807 Listeria seeligeri Species 0.000 claims description 3
- 241000186814 Listeria welshimeri Species 0.000 claims description 3
- 241001545398 Listeria weihenstephanensis Species 0.000 claims description 2
- JFGAVIUAYHTCFS-UHFFFAOYSA-N [Na].[Na].Cl Chemical compound [Na].[Na].Cl JFGAVIUAYHTCFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 165
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 114
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 109
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 57
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 56
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 52
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 50
- 239000007621 bhi medium Substances 0.000 description 48
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 41
- 241000894007 species Species 0.000 description 37
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 34
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 28
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 21
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 16
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 16
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 16
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 16
- 241000024192 Aloa Species 0.000 description 15
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 14
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 13
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 12
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 11
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 10
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 10
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 9
- KKAJSJJFBSOMGS-UHFFFAOYSA-N 3,6-diamino-10-methylacridinium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(N)C=C2[N+](C)=C(C=C(N)C=C3)C3=CC2=C1 KKAJSJJFBSOMGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940023020 acriflavine Drugs 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 8
- 239000006872 mrs medium Substances 0.000 description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 6
- 241001069991 Listeria grayi DSM 20601 Species 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 4
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 4
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000306 component Substances 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000194035 Lactococcus lactis Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L Phosphate ion(2-) Chemical compound OP([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 2
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 2
- BDRTVPCFKSUHCJ-UHFFFAOYSA-N molecular hydrogen;potassium Chemical compound [K].[H][H] BDRTVPCFKSUHCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 2
- QCQCHGYLTSGIGX-GHXANHINSA-N 4-[[(3ar,5ar,5br,7ar,9s,11ar,11br,13as)-5a,5b,8,8,11a-pentamethyl-3a-[(5-methylpyridine-3-carbonyl)amino]-2-oxo-1-propan-2-yl-4,5,6,7,7a,9,10,11,11b,12,13,13a-dodecahydro-3h-cyclopenta[a]chrysen-9-yl]oxy]-2,2-dimethyl-4-oxobutanoic acid Chemical compound N([C@@]12CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@H]5C(C)(C)[C@@H](OC(=O)CC(C)(C)C(O)=O)CC[C@]5(C)[C@H]4CC[C@@H]3C1=C(C(C2)=O)C(C)C)C(=O)C1=CN=CC(C)=C1 QCQCHGYLTSGIGX-GHXANHINSA-N 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241001221764 Liparia Species 0.000 description 1
- 241001496637 Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317 Species 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035472 Zoonoses Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000009422 growth inhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000010807 real-time PCR kit Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- -1 sodium nalidixic acid salt Chemical class 0.000 description 1
- ROKRAUFZFDQWLE-UHFFFAOYSA-M sodium;1-ethyl-7-methyl-4-oxo-1,8-naphthyridine-3-carboxylate Chemical compound [Na+].C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C([O-])=O)C(=O)C2=C1 ROKRAUFZFDQWLE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 230000007279 water homeostasis Effects 0.000 description 1
- 206010048282 zoonosis Diseases 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
本発明は、食品製造施設などにおいて問題視されるリステリア属菌を対象とする検査技術に関し、特にリステリア属菌の増菌培地に関する。 The present invention relates to an inspection technique for Listeria monocytogenes, which is regarded as a problem in food manufacturing facilities, and particularly to a enrichment medium for Listeria monocytogenes.
環境検査や食品検査などにおいて、リステリア属菌を特異的に検出することが求められている。しかしながら、リステリア属菌は、増菌が比較的困難な菌種であるため、検査において偽陰性の生じる虞が大きいものであった。
すなわち、従来、細菌のＤＮＡをＰＣＲ法により増幅して、ハイブリダイゼーションを行うことで検出を行う場合、増菌培地を用いて細菌を増殖させて、１．５×１０３ｃｆｕ／ｍＬ以上にする必要があった。また、培養法以外の検出法で用いられるキットには様々な種類のものが市販されているが、それらの多くの検出感度は１０５〜１０６ｃｆｕ／ｍＬ程度の菌量を必要とするものであった。
It is required to specifically detect Listeria monocytogenes in environmental inspections and food inspections. However, since Listeria monocytogenes is a strain that is relatively difficult to increase, there is a high possibility that false negatives will occur in the test.
That is, conventionally, when the DNA of a bacterium is amplified by the PCR method and detected by hybridization, the bacterium is grown using a enrichment medium to a concentration of 1.5 × 10 3 cfu / mL or more. I needed it. Furthermore, those of various types of kits for use in detection methods other than culture methods are commercially available, the detection sensitivity of many of them are in need of bacteria of the order of 10 5 ~10 6 cfu / mL Met.
また、リステリア属菌の一般的な迅速検査法の検出限界菌量は、１０４〜１０６ｃｆｕ／ｍＬ程度であるため、通常、前工程でリステリア属菌の増菌培養を実施して、１０４ｃｆｕ／ｍＬ以上に増菌することが行われている。
しかしながら、近年発見されたリステリア属菌の一部には、ＩＳＯ１１２９０に示されるHalf-Fraser培地（以下、ＨＦ培地と称する場合がある。）を用いた増菌の評価において、培養後の菌量が培地成分の影響により、１０４ｃｆｕ／ｍＬ以上に増加しないという問題があった。
In addition, since the detection limit of the general rapid test method for Listeria monocytogenes is about 10 4 to 10 6 cfu / mL, the enrichment culture of Listeria monocytogenes is usually carried out in the previous step, and 10 The bacteria have been increased to 4 cfu / mL or more.
However, some of the Listeria monocytogenes discovered in recent years have a bacterial mass after culturing in the evaluation of enrichment using the Half-Fraser medium (hereinafter, may be referred to as HF medium) shown in ISO11290. the influence of the medium components, there is a problem that does not increase more than 10 4 cfu / mL.
すなわち、ＨＦ培地がＩＳＯ法に収載された当所、当該培地は人畜共通感染症であるリステリア モノサイトゲネスを増菌させるために用いられていた。しかしながら、昨今、リステリア属菌において新種が多く発見され、現行のＨＦ培地では生育できない菌種が存在する状況であった。
そこで、本発明者らは、現在確認されている全１７種のリステリア属菌をいずれも１０４ｃｆｕ／ｍＬ以上に増菌可能な培地組成について研究し、本発明を完成させた。
That is, at our place where the HF medium was listed in the ISO method, the medium was used to increase the bacteria of Listeria monocytogenes, which is a zoonotic disease. However, in recent years, many new species of Listeria monocytogenes have been discovered, and there are some bacterial species that cannot grow on the current HF medium.
Accordingly, the present inventors, all 17 species of Listeria that is currently confirmed studied both enrichment possible medium composition than 10 4 cfu / mL, and completed the present invention.
ここで、特許文献１に記載のリステリアを培養するための培養培地は、本発明のリステリア属菌用増菌培地の成分の一部含んでいるが、その組成は相違しており、本発明のように全１７種のリステリア属菌をいずれも１０４ｃｆｕ／ｍＬ以上に増菌するためのものではなかった。
Here, the culture medium for culturing Listeria described in
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、リステリア属菌における全１７菌種をいずれも１０４ｃｆｕ／ｍＬ以上に増菌することが可能なリステリア属菌用増菌培地、及びリステリア属菌の培養方法の提供を目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, capable Listeria for enrichment medium to enrichment all 17 species both above 10 4 cfu / mL in Listeria, and Listeria An object of the present invention is to provide a method for culturing bacteria.
上記目的を達成するため、本発明のリステリア属菌用増菌培地は、１．０ｇ／リットル以上、４．０ｇ／リットル以下の塩化ナトリウムを含有する構成としてある。 In order to achieve the above object, the enrichment medium for Listeria monocytogenes of the present invention is configured to contain 1.0 g / liter or more and 4.0 g / liter or less of sodium chloride.
また、本発明のリステリア属菌用増菌培地を、０．１５ｇ／リットル以上、１．５ｇ／リットル以下の塩化リチウムと、０．５ｍｇ／リットル以上、５．０ｍｇ／リットル以下のナリジクス酸塩酸塩と、０．６２ｍｇ／リットル以上、６．２５ｍｇ／リットル以下のアクリフラビン塩酸塩とを含有する構成とすることが好ましい。 In addition, the enrichment medium for the genus Listeria of the present invention contains lithium chloride of 0.15 g / liter or more and 1.5 g / liter or less, and nalidix hydrochloride of 0.5 mg / liter or more and 5.0 mg / liter or less. It is preferable that the composition contains 0.62 mg / liter or more and 6.25 mg / liter or less of acriflavine hydrochloride.
また、本発明のリステリア属菌用増菌培地を、０．２５ｇ／リットル以上、２．５ｇ／リットル以下のプロテオースペプトンと、０．２５ｇ／リットル以上、２．５ｇ／リットル以下のトリプトンと、０．２５ｇ／リットル以上、２．５ｇ／リットル以下のラブレコム末と、０．２５ｇ／リットル以上、２．５ｇ／リットル以下の酵母エキスと、０．４８ｇ／リットル以上、４．８ｇ／リットル以下のリン酸水素ニナトリウムと、０．０６ｇ／リットル以上、０．６７ｇ／リットル以下のリン酸ニ水素カリウムと、０．０５ｇ／リットル以上、０．５ｇ／リットル以下のエスクリンと、０．０２ｇ／リットル以上、０．２５ｇ／リットル以下のクエン酸アンモニウムとを含有する構成とすることが好ましい。 In addition, the enrichment medium for Listeria spp. Of the present invention contains proteopeptone of 0.25 g / liter or more and 2.5 g / liter or less, and tripton of 0.25 g / liter or more and 2.5 g / liter or less. Labrecom powder of 0.25 g / liter or more and 2.5 g / liter or less, yeast extract of 0.25 g / liter or more and 2.5 g / liter or less, 0.48 g / liter or more and 4.8 g / liter or less Nisodium hydrogen phosphate, 0.06 g / liter or more, 0.67 g / liter or less potassium dihydrogen phosphate, 0.05 g / liter or more, 0.5 g / liter or less esculin, 0.02 g / liter As described above, it is preferable to have a structure containing 0.25 g / liter or less of ammonium citrate.
また、本発明のリステリア属菌用増菌培地を、１．０ｇ／リットル以上、４．０ｇ／リットル以下の塩化ナトリウムと、０．１５ｇ／リットル以上、０．６ｇ／リットル以下の塩化リチウムと、０．５ｍｇ／リットル以上、２．０ｍｇ／リットル以下のナリジクス酸塩酸塩と、０．６２ｍｇ／リットル以上、２．５ｍｇ／リットル以下のアクリフラビン塩酸塩と、０．２５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下のプロテオースペプトンと、０．２５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下のトリプトンと、０．２５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下のラブレコム末と、０．２５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下の酵母エキスと、０．４８ｇ／リットル以上、１．９２ｇ／リットル以下のリン酸水素ニナトリウムと、０．０６ｇ／リットル以上、０．２７ｇ／リットル以下のリン酸ニ水素カリウムと、０．０５ｇ／リットル以上、０．２ｇ／リットル以下のエスクリンと、０．０２ｇ／リットル以上、０．１ｇ／リットル以下のクエン酸アンモニウムとを含有する構成とすることが好ましい。 Further, the enrichment medium for the genus Listeria of the present invention contains 1.0 g / liter or more and 4.0 g / liter or less of sodium chloride, 0.15 g / liter or more and 0.6 g / liter or less of lithium chloride. Naridix hydrochloride of 0.5 mg / liter or more and 2.0 mg / liter or less, acryflavin hydrochloride of 0.62 mg / liter or more and 2.5 mg / liter or less, and 0.25 g / liter or more and 1.0 g Proteose peptone of / liter or less, tripton of 0.25 g / liter or more and 1.0 g / liter or less, Labrecom powder of 0.25 g / liter or more and 1.0 g / liter or less, and 0.25 g / liter or more , 1.0 g / liter or less yeast extract, 0.48 g / liter or more and 1.92 g / liter or less disodium hydrogen phosphate, 0.06 g / liter or more and 0.27 g / liter or less diphosphate It is preferable that the composition contains potassium hydrogen, esculin of 0.05 g / liter or more and 0.2 g / liter or less, and ammonium citrate of 0.02 g / liter or more and 0.1 g / liter or less.
また、本発明のリステリア属菌用増菌培地を、２．０ｇ／リットル以上、４．０ｇ／リットル以下の塩化ナトリウムと、０．３ｇ／リットル以上、０．６ｇ／リットル以下の塩化リチウムと、１．０ｍｇ／リットル以上、２．０ｍｇ／リットル以下のナリジクス酸塩酸塩と、１．２５ｍｇ／リットル以上、２．５ｍｇ／リットル以下のアクリフラビン塩酸塩と、０．５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下のプロテオースペプトンと、０．５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下のトリプトンと、０．５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下のラブレコム末と、０．５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下の酵母エキスと、０．９６ｇ／リットル以上、１．９２ｇ／リットル以下のリン酸水素ニナトリウムと、０．１３ｇ／リットル以上、０．２７ｇ／リットル以下のリン酸ニ水素カリウムと、０．１ｇ／リットル以上、０．２ｇ／リットル以下のエスクリンと、０．０５ｇ／リットル以上、０．１ｇ／リットル以下のクエン酸アンモニウムと、を含有する構成とすることが好ましい。 Further, the enrichment medium for the genus Listeria of the present invention contains 2.0 g / liter or more and 4.0 g / liter or less of sodium chloride, 0.3 g / liter or more and 0.6 g / liter or less of lithium chloride. 1.0 mg / liter or more and 2.0 mg / liter or less of naridix hydrochloride, 1.25 mg / liter or more and 2.5 mg / liter or less of acryflavin hydrochloride, 0.5 g / liter or more and 1.0 g Proteose peptone of / liter or less, tripton of 0.5 g / liter or more and 1.0 g / liter or less, Labrecom powder of 0.5 g / liter or more and 1.0 g / liter or less, and 0.5 g / liter or more , 1.0 g / liter or less yeast extract, 0.96 g / liter or more and 1.92 g / liter or less disodium hydrogen phosphate, 0.13 g / liter or more and 0.27 g / liter or less diphosphate It is preferable that the composition contains potassium hydrogen, esculin of 0.1 g / liter or more and 0.2 g / liter or less, and ammonium citrate of 0.05 g / liter or more and 0.1 g / liter or less.
さらに、本発明のリステリア属菌の培養方法は、上記のいずれかのリステリア属菌用増菌培地を用いて、リステリア属菌を選択的に増殖させる方法としてある。 Further, the method for culturing Listeria monocytogenes of the present invention is a method for selectively growing Listeria monocytogenes using any of the above-mentioned enrichment media for Listeria monocytogenes.
本発明によれば、リステリア属菌における全１７菌種をいずれも１０４ｃｆｕ／ｍＬ以上に増菌することが可能なリステリア属菌用増菌培地、及びリステリア属菌の培養方法の提供が可能となる。 According to the present invention, it can be provided for all 17 bacterial species capable of enrichment both above 10 4 cfu / mL of Listeria for enrichment medium, and a method of culturing Listeria in Listeria It becomes.
以下、本発明のリステリア属菌用増菌培地、及びリステリア属菌の培養方法の一実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の本実施形態及び後述する実施例の具体的な内容に限定されるものではない。 Hereinafter, an embodiment of the enrichment medium for Listeria monocytogenes and the method for culturing Listeria monocytogenes of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the specific contents of the following embodiments and examples described later.
最初に、ＩＳＯ１１２９０に示されるHalf-Fraser培地（ＨＦ培地）について、図１を参照して説明する。
ＨＦ培地は、塩化ナトリウムを２０．０ｇ／リットル、塩化リチウムを３．０ｇ／リットル、ナリジクス酸塩酸塩を１０ｍｇ／リットル、アクリフラビン塩酸塩を１２．５ｍｇ／リットル、プロテオースペプトンを５．０ｇ／リットル、トリプトンを５．０ｇ／リットル、ラブレコム末を５．０ｇ／リットル、酵母エキスを５．０ｇ／リットル、リン酸水素二ナトリウムを９．６ｇ／リットル、リン酸二水素カリウムを１．３５ｇ／リットル、エスクリンを１．０ｇ／リットル、及びクエン酸アンモニウムを０．５ｇ／リットル含有する。
First, the Half-Fraser medium (HF medium) shown in ISO11290 will be described with reference to FIG.
The HF medium was 20.0 g / liter of sodium chloride, 3.0 g / liter of lithium chloride, 10 mg / liter of naridix hydrochloride, 12.5 mg / liter of acryflavin hydrochloride, and 5.0 g / liter of proteopeptone. Liter, trypton 5.0 g / liter, labrecom powder 5.0 g / liter, yeast extract 5.0 g / liter, disodium hydrogen phosphate 9.6 g / liter, potassium dihydrogen phosphate 1.35 g / liter It contains liters, 1.0 g / liter of esculin, and 0.5 g / liter of ammonium citrate.
ＨＦ培地における塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、及びリン酸二水素カリウムの主な役割は、菌体構成成分、酵素賦活、及び培地の浸透圧調節である。
また、塩化リチウム、ナリジクス酸塩酸塩、及びアクリフラビン塩酸塩の主な役割は、非対象菌の増菌抑制である（非対象菌阻害剤、リステリア属菌選択剤）。
また、プロテオースペプトン、トリプトン、及びクエン酸アンモニウムの主な役割は、菌体のタンパク質や核酸合成に必要な窒素源の供給である。
また、ラブレコム末、及び酵母エキスの主な役割は、生育促進物質としてのビタミン類の供給である。
さらに、エスクリンの主な役割は、菌体成分の合成に必要な炭素源の供給である。
The main roles of sodium chloride, disodium hydrogen phosphate, and potassium dihydrogen phosphate in HF medium are cell constituents, enzyme activation, and osmoregulation of the medium.
In addition, the main roles of lithium chloride, nalidixate salt, and acriflavine hydrochloride are to suppress the growth of non-target bacteria (non-target bacteria inhibitor, Listeria monocytogenes selector).
In addition, the main role of proteopeptone, tryptone, and ammonium citrate is to supply the nitrogen source required for bacterial protein and nucleic acid synthesis.
In addition, the main role of labrecom powder and yeast extract is to supply vitamins as growth promoting substances.
In addition, the main role of esculin is to supply the carbon source required for the synthesis of bacterial cell components.
本実施形態のリステリア属菌用増菌培地は、１．０ｇ／リットル以上、１０．０ｇ／リットル以下の塩化ナトリウムを含有することが好ましく、１．０ｇ／リットル以上、４．０ｇ／リットル以下の塩化ナトリウムを含有することがより好ましい。
後述する実験３に示すように、塩化ナトリウムを１．０ｇ／リットル以上、１０．０ｇ／リットル以下で含む場合、増菌が困難なリステリア属３菌種（リステリア グレイ、リステリア グランデンシス、リステリア リパリア）をいずれも好適に増菌することが可能である。また、実験４，５，１１に示すように、ＨＦ培地を５倍以上に希釈した場合にこれらリステリア属３菌種をより好適に増菌することが可能である。
The enrichment medium for Listeria monocytogenes of the present embodiment preferably contains 1.0 g / liter or more and 10.0 g / liter or less of sodium chloride, and 1.0 g / liter or more and 4.0 g / liter or less. It is more preferable to contain sodium chloride.
As shown in
また、本実施形態のリステリア属菌用増菌培地は、さらに、０．１５ｇ／リットル以上、１．５ｇ／リットル以下の塩化リチウムと、０．５ｍｇ／リットル以上、５．０ｍｇ／リットル以下のナリジクス酸塩酸塩と、０．６２ｍｇ／リットル以上、６．２５ｍｇ／リットル以下のアクリフラビン塩酸塩を含有することを特徴とする。
実験３に示すように、塩化リチウム、ナリジクス酸塩酸塩、及びアクリフラビン塩酸塩をこのような範囲で含む場合、増菌が困難なリステリア属３菌種をいずれも好適に増菌することが可能になっている。
Further, the enrichment medium for the genus Listeria of the present embodiment further comprises 0.15 g / liter or more and 1.5 g / liter or less of lithium chloride, and 0.5 mg / liter or more and 5.0 mg / liter or less of nalidics. It is characterized by containing a hydrochloride salt and an acriflavine hydrochloride of 0.62 mg / liter or more and 6.25 mg / liter or less.
As shown in
また、本実施形態のリステリア属菌用増菌培地は、さらに、０．２５ｇ／リットル以上、２．５ｇ／リットル以下のプロテオースペプトンと、０．２５ｇ／リットル以上、２．５ｇ／リットル以下のトリプトンと、０．２５ｇ／リットル以上、２．５ｇ／リットル以下のラブレコム末と、０．２５ｇ／リットル以上、２．５ｇ／リットル以下の酵母エキスと、０．４８ｇ／リットル以上、４．８ｇ／リットル以下のリン酸水素ニナトリウムと、０．０６ｇ／リットル以上、０．６７ｇ／リットル以下のリン酸ニ水素カリウムと、０．０５ｇ／リットル以上、０．５ｇ／リットル以下のエスクリンと、０．０２ｇ／リットル以上、０．２５ｇ／リットル以下のクエン酸アンモニウムを含有すること（図１の組成１）を特徴とする。
実験３に示すように、プロテオースペプトン、トリプトン、ラブレコム末、酵母エキス、リン酸水素ニナトリウム、リン酸ニ水素カリウム、エスクリン、及びクエン酸アンモニウムをこのような範囲で含む場合、増菌が困難なリステリア属３菌種をいずれも好適に増菌することが可能になっている。
Further, the enrichment medium for Listeria spp. Of the present embodiment further includes proteopeptone of 0.25 g / liter or more and 2.5 g / liter or less, and 0.25 g / liter or more and 2.5 g / liter or less. Tripton, 0.25 g / liter or more and 2.5 g / liter or less Labrecom powder, 0.25 g / liter or more and 2.5 g / liter or less yeast extract, 0.48 g / liter or more and 4.8 g / liter Nisodium hydrogen phosphate of 0.06 g / liter or more, 0.67 g / liter or less of potassium dihydrogen phosphate, 0.05 g / liter or more and 0.5 g / liter or less of esculin, 0. It is characterized by containing ammonium citrate of 02 g / liter or more and 0.25 g / liter or less (
As shown in
また、本実施形態のリステリア属菌用増菌培地は、１．０ｇ／リットル以上、４．０ｇ／リットル以下の塩化ナトリウムと、０．１５ｇ／リットル以上、０．６ｇ／リットル以下の塩化リチウムと、０．５ｍｇ／リットル以上、２．０ｍｇ／リットル以下のナリジクス酸塩酸塩と、０．６２ｍｇ／リットル以上、２．５ｍｇ／リットル以下のアクリフラビン塩酸塩と、０．２５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下のプロテオースペプトンと、０．２５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下のトリプトンと、０．２５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下のラブレコム末と、０．２５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下の酵母エキスと、０．４８ｇ／リットル以上、１．９２ｇ／リットル以下のリン酸水素ニナトリウムと、０．０６ｇ／リットル以上、０．２７ｇ／リットル以下のリン酸ニ水素カリウムと、０．０５ｇ／リットル以上、０．２ｇ／リットル以下のエスクリンと、０．０２ｇ／リットル以上、０．１ｇ／リットル以下のクエン酸アンモニウムを含有する構成（図１の組成２）とすることも好ましい。
The enrichment medium for Listeria spp. Of the present embodiment contains 1.0 g / liter or more and 4.0 g / liter or less of sodium chloride and 0.15 g / liter or more and 0.6 g / liter or less of lithium chloride. , 0.5 mg / liter or more and 2.0 mg / liter or less, and 0.62 mg / liter or more and 2.5 mg / liter or less of acryflabin hydrochloride, and 0.25 g / liter or more and 1. Proteose peptone of 0 g / liter or less, tripton of 0.25 g / liter or more and 1.0 g / liter or less, Labrecom powder of 0.25 g / liter or more and 1.0 g / liter or less, and 0.25 g / liter The yeast extract of 1.0 g / liter or less, disodium hydrogen phosphate of 0.48 g / liter or more and 1.92 g / liter or less, and phosphoric acid of 0.06 g / liter or more and 0.27 g / liter or less. A configuration containing potassium dihydrogen, esculin of 0.05 g / liter or more and 0.2 g / liter or less, and ammonium citrate of 0.02 g / liter or more and 0.1 g / liter or less (
また、本実施形態のリステリア属菌用増菌培地は、２．０ｇ／リットル以上、４．０ｇ／リットル以下の塩化ナトリウムと、０．３ｇ／リットル以上、１．５ｇ／リットル以下の塩化リチウムと、１．０ｍｇ／リットル以上、５．０ｍｇ／リットル以下のナリジクス酸塩酸塩と、１．２５ｍｇ／リットル以上、６．２５ｍｇ／リットル以下のアクリフラビン塩酸塩と、０．５ｇ／リットル以上、２．５ｇ／リットル以下のプロテオースペプトンと、０．５ｇ／リットル以上、２．５ｇ／リットル以下のトリプトンと、０．５ｇ／リットル以上、２．５ｇ／リットル以下のラブレコム末と、０．５ｇ／リットル以上、２．５ｇ／リットル以下の酵母エキスと、０．９６ｇ／リットル以上、４．８ｇ／リットル以下のリン酸水素ニナトリウムと、０．１３ｇ／リットル以上、０．６７ｇ／リットル以下のリン酸ニ水素カリウムと、０．１ｇ／リットル以上、０．５ｇ／リットル以下のエスクリンと、０．０５ｇ／リットル以上、０．２５ｇ／リットル以下のクエン酸アンモニウムを含有する構成とすることも好ましい。 The enrichment medium for Listeria spp. Of the present embodiment contains sodium chloride of 2.0 g / liter or more and 4.0 g / liter or less, and lithium chloride of 0.3 g / liter or more and 1.5 g / liter or less. , 1.0 mg / liter or more and 5.0 mg / liter or less, 1.25 mg / liter or more and 6.25 mg / liter or less of acryflabin hydrochloride, 0.5 g / liter or more, 2. Proteose peptone of 5 g / liter or less, tripton of 0.5 g / liter or more and 2.5 g / liter or less, Labrecom powder of 0.5 g / liter or more and 2.5 g / liter or less, and 0.5 g / liter The yeast extract of 2.5 g / liter or less, disodium hydrogen phosphate of 0.96 g / liter or more and 4.8 g / liter or less, and phosphoric acid of 0.13 g / liter or more and 0.67 g / liter or less. It is also preferable to have a configuration containing potassium dihydrogen, esculin of 0.1 g / liter or more and 0.5 g / liter or less, and ammonium citrate of 0.05 g / liter or more and 0.25 g / liter or less.
実験３、４、５に示すように、本実施形態のリステリア属菌用増菌培地の組成をこれらのようにすると、増菌が困難なリステリア属３菌種をいずれも好適に増菌することができ、かつ非対象菌の増菌を好適に抑制することが可能である。
As shown in
また、本実施形態のリステリア属菌用増菌培地は、２．０ｇ／リットル以上、４．０ｇ／リットル以下の塩化ナトリウムと、０．３ｇ／リットル以上、０．６ｇ／リットル以下の塩化リチウムと、１．０ｍｇ／リットル以上、２．０ｍｇ／リットル以下のナリジクス酸塩酸塩と、１．２５ｍｇ／リットル以上、２．５ｍｇ／リットル以下のアクリフラビン塩酸塩と、０．５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下のプロテオースペプトンと、０．５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下のトリプトンと、０．５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下のラブレコム末と、０．５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下の酵母エキスと、０．９６ｇ／リットル以上、１．９２ｇ／リットル以下のリン酸水素ニナトリウムと、０．１３ｇ／リットル以上、０．２７ｇ／リットル以下のリン酸ニ水素カリウムと、０．１ｇ／リットル以上、０．２ｇ／リットル以下のエスクリンと、０．０５ｇ／リットル以上、０．１ｇ／リットル以下のクエン酸アンモニウムを含有する構成（図１の組成３）とすることも好ましい。
実験４、５に示すように、本実施形態のリステリア属菌用増菌培地の組成をこのようにすると、増菌が困難なリステリア属３菌種をいずれも好適に増菌することができ、かつ非対象菌の増菌をより一層好適に抑制することが可能である。
In addition, the enrichment medium for Listeria spp. Of the present embodiment contains sodium chloride of 2.0 g / liter or more and 4.0 g / liter or less, and lithium chloride of 0.3 g / liter or more and 0.6 g / liter or less. , 1.0 mg / liter or more and 2.0 mg / liter or less, 1.25 mg / liter or more and 2.5 mg / liter or less of acryflabin hydrochloride, 0.5 g / liter or more, 1. Proteose peptone of 0 g / liter or less, tripton of 0.5 g / liter or more and 1.0 g / liter or less, Labrecom powder of 0.5 g / liter or more and 1.0 g / liter or less, and 0.5 g / liter The yeast extract of 1.0 g / liter or less, disodium hydrogen phosphate of 0.96 g / liter or more and 1.92 g / liter or less, and phosphoric acid of 0.13 g / liter or more and 0.27 g / liter or less. A configuration containing potassium dihydrogen, esculin of 0.1 g / liter or more and 0.2 g / liter or less, and ammonium citrate of 0.05 g / liter or more and 0.1 g / liter or less (
As shown in
さらに、本実施形態のリステリア属菌用増菌培地は、４．０ｇ／リットルの塩化ナトリウムと、０．６ｇ／リットルの塩化リチウムと、２．０ｍｇ／リットルのナリジクス酸塩酸塩と、２．５ｍｇ／リットルのアクリフラビン塩酸塩と、１．０ｇ／リットルのプロテオースペプトンと、１．０ｇ／リットルのトリプトンと、１．０ｇ／リットルのラブレコム末と、１．０ｇ／リットルの酵母エキスと、１．９２ｇ／リットルのリン酸水素ニナトリウムと、０．２７ｇ／リットルのリン酸ニ水素カリウムと、０．２ｇ／リットルのエスクリンと、０．１ｇ／リットルのクエン酸アンモニウムを含有する構成とすることも好ましい。
実験４、５に示すように、本実施形態のリステリア属菌用増菌培地の組成をこのようにすると、増菌が困難なリステリア属３菌種をいずれも好適に増菌することができ、かつ非対象菌の増菌を最も好適に抑制することが可能である。
Further, the enrichment medium for the genus Listeria of the present embodiment contains 4.0 g / liter of sodium chloride, 0.6 g / liter of lithium chloride, 2.0 mg / liter of naridixate, and 2.5 mg. 1 / liter of acryflabin hydrochloride, 1.0 g / liter of proteopeptone, 1.0 g / liter of trypton, 1.0 g / liter of labrecom powder, 1.0 g / liter of yeast extract, 1 The composition shall contain .92 g / liter of disodium hydrogen phosphate, 0.27 g / liter of potassium dihydrogen phosphate, 0.2 g / liter of esculin, and 0.1 g / liter of ammonium citrate. Is also preferable.
As shown in
本実施形態のリステリア属菌用増菌培地により増菌する対象であるリステリア属菌は、少なくとも（１）リステリア アクアティカ（Listeria aquatica）、（２）リステリア ボオリアエ（Listeria booriae）、（３）リステリア コーネレンシス（Listeria cornellensis）、（４）リステリア フレッシュマンニ（Listeria fleischmannii）、（５）リステリア フロリデンシス（Listeria floridensis）、（６）リステリア グランデンシス（Listeria grandensis）、（７）リステリア グレイ（Listeria grayi）、（８）リステリア イノキュア（Listeria innocua）、（９）リステリア イバノビ（Listeria ivanovii）、（１０）リステリア マルティ（Listeria marthii）、（１１）リステリア モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、（１２）リステリア ニュヨークネンシス （Listeria newyorkensis）、（１３）リステリア リパリア（Listeria riparia）、（１４）リステリア ロコゥティエ（Listeria rocourtiae）、（１５）リステリア シリゲリ（Listeria seeligeri）、（１６）リステリア ウェヘンステップハネンシス（Listeria weihenstephanensis）、（１７）リステリア ウェルシメリ（Listeria welshimeri）のいずれかであり、これらが現在確認されている全１７種のリステリア属菌である。 The Listeria monocytogenes to be enriched by the enrichment medium for Listeria monocytogenes of the present embodiment are at least (1) Listeria aquatica, (2) Listeria booriae, and (3) Listeria Cornelensis. (Listeria cornellensis), (4) Listeria fleischmannii, (5) Listeria floridensis, (6) Listeria grandensis, (7) Listeria grayi, (8) Listeria Innocua (Listeria innocua), (9) Listeria ivanovii, (10) Listeria marthii, (11) Listeria monocytogenes, (12) Listeria newyorkensis, (13) Listeria riparia, (14) Listeria rocourtiae, (15) Listeria seeligeri, (16) Listeria weihenstephanensis, (17) Listeria Welsimeri It is one of (Listeria welshimeri), and these are all 17 species of Listeria monocytogenes currently confirmed.
以上のような本実施形態のリステリア属菌用増菌培地によれば、リステリア属菌における全１７菌種をそれぞれ培養した際に、いずれも１０４ｃｆｕ／ｍＬ以上に増菌することが可能である。 According to Listeria for enrichment medium of the present embodiment described above, all 17 species of Listeria when cultured respectively, both may be enrichment than 10 4 cfu / mL is there.
また、本実施形態のリステリア属菌の培養方法は、上記リステリア属菌用増菌培地を用いて、リステリア属菌を選択的に増殖させることを特徴とする。
リステリア属菌の培養方法をこのようにすれば、リステリア属菌の培養終了後の菌数を増加させることができ、かつ検査に使用する培地原料を減少することができるため、１回あたりの資材コストを低減させることが可能である。
In addition, the method for culturing Listeria monocytogenes of the present embodiment is characterized in that Listeria monocytogenes is selectively grown using the enrichment medium for Listeria monocytogenes.
If the method for culturing Listeria monocytogenes is carried out in this way, the number of bacteria after the completion of the culture of Listeria monocytogenes can be increased, and the medium raw material used for the test can be reduced. It is possible to reduce the cost.
以下、本発明の実施形態に係るリステリア属菌用増菌培地、及びリステリア属菌の培養方法を開発するために行った実験、及びこれらの効果を確認するために行った実験について、具体的に説明する。 Hereinafter, the enrichment medium for Listeria monocytogenes according to the embodiment of the present invention, the experiment conducted for developing the culture method for Listeria monocytogenes, and the experiment conducted for confirming the effects thereof will be specifically described. explain.
［実験１］
まず、ＩＳＯ１１２９０に示されるＨＦ培地を用いて、全１７種のリステリア属菌の培養実験を以下のように行った。リステリア属菌の供試菌株は、次の通りである。
(1)Listeria aquatica DSM26686
(2)Listeria booriae DSM28860
(3)Listeria cornellensis DSM26689
(4)Listeria fleischmannii subsp. fleischmannii DSM25003
(5)Listeria floridensis DSM26687
(6)Listeria grandensis DSM26688
(7)Listeria grayi ATCC19120
(8)Listeria innocua ATCC11288
(9)Listeria ivanovii ATCC BAA-139
(10)Listeria marthii DSM23813
(11)Listeria monocytogenes NCTC11994
(12)Listeria newyorkensis DSM28861
(13)Listeria riparia DSM26685
(14)Listeria rocourtiae DSM 22097
(15)Listeria seeligeri ATCC35967
(16)Listeria weihenstephanensis DSM24698
(17)Listeria welshimeri ATCC35897
[Experiment 1]
First, using the HF medium shown in ISO11290, a culture experiment of all 17 species of Listeria monocytogenes was carried out as follows. The test strains of Listeria monocytogenes are as follows.
(1) Listeria aquatica DSM26686
(2) Listeria booriae DSM28860
(3) Listeria cornellensis DSM26689
(4) Listeria fleischmannii subsp. Fleischmannii DSM25003
(5) Listeria floridensis DSM26687
(6) Listeria grandensis DSM26688
(7) Listeria grayi ATCC19120
(8) Listeria innocua ATCC11288
(9) Listeria ivanovii ATCC BAA-139
(10) Listeria marthii DSM23813
(11) Listeria monocytogenes NCTC11994
(12) Listeria newyorkensis DSM28861
(13) Listeria riparia DSM26685
(14)
(15) Listeria seeligeri ATCC35967
(16) Listeria weihenstephanensis DSM24698
(17) Listeria welshimeri ATCC35897
これらは、それぞれ次の機関から入手した。以下の実験においても同様である。
ATCC: American Type Culture Collection
DSM: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
NCTC: National Collection of Type Cultures
These were obtained from the following institutions, respectively. The same applies to the following experiments.
ATCC: American Type Culture Collection
DSM: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
NCTC: National Collection of Type Cultures
＜ハーフフレーザーブイヨン（ＨＦ培地）の調製＞
３００ｍＬの蒸留水（富士フイルム和光純薬株式会社製）を、１２１℃で１５分間高圧蒸気殺菌を行い、人肌程度に冷却後、２２５ｍＬの上記滅菌済蒸留水とＲｅａｄｙ ｂａｇ ＨＦ培地顆粒（Ｍｅｒｃｋ社製）１２．５ｇを加え、マグネチックスタラーバーなどを用いて撹拌した。顆粒溶解後、ＨＦ培地１０ｍＬずつを滅菌済み栓付き試験管に分注した。
<Preparation of half-flazer bouillon (HF medium)>
300 mL of distilled water (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is sterilized by high-pressure steam at 121 ° C. for 15 minutes, cooled to about human skin, and then 225 mL of the above sterilized distilled water and Ready bag HF medium granules (Merck). (Manufactured) 12.5 g was added, and the mixture was stirred using a magnetic stirrer bar or the like. After dissolving the granules, 10 mL each of HF medium was dispensed into a sterilized test tube with a stopper.
＜ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ培地）の調製＞
ＢＨＩ培地（ＢＤ社(Becton, Dickinson and Company)製）を定法に従い作成し、試験管に１０ｍＬずつ分注して、１２１℃で１５分間滅菌した。なお、ＢＨＩ培地は、一般に、凍結保存されたリステリア属菌を生育させるための復元培地として用いられる。
<Preparation of Brain Heart Infusion (BHI medium)>
BHI medium (manufactured by BD company (Becton, Dickinson and Company)) was prepared according to a conventional method, 10 mL each was dispensed into a test tube, and sterilized at 121 ° C. for 15 minutes. The BHI medium is generally used as a restoration medium for growing cryopreserved Listeria monocytogenes.
＜供試用菌液における菌数の測定＞
供試菌株をＢＨＩ培地にて３０℃で２４時間静置培養し、菌液を滅菌生理食塩水にて１０倍段階希釈し、標準寒天培地に滅菌コンラージ棒を使用して塗抹した。
そして、３０℃、２４時間後、培地上のコロニー数を計数した。計数値をもとに、培養液における培養後の供試菌株の菌数（培養終了後菌数）を算出した。なお、増菌培養液はＨＦ培地への接種に使用するため、冷蔵庫にて４℃で保管した。
<Measurement of the number of bacteria in the test bacterial solution>
The test strain was statically cultured in BHI medium at 30 ° C. for 24 hours, the bacterial solution was diluted 10-fold with sterile physiological saline, and smeared on standard agar medium using a sterile spreader.
Then, after 24 hours at 30 ° C., the number of colonies on the medium was counted. Based on the counted value, the number of strains of the test strain after culturing in the culture solution (number of bacterium after completion of culturing) was calculated. The enriched culture solution was stored at 4 ° C. in a refrigerator for use in inoculating the HF medium.
＜菌液の接種＞
次に、４℃にて保管した増菌培養液を生理食塩水にて希釈し、１０〜１００ｃｆｕ／サンプルを接種するために調製した。その調製液を上記で調製した１０ｍＬのＨＦ培地が分注された試験管へ接種した。
<Inoculation of bacterial solution>
Next, the enriched culture solution stored at 4 ° C. was diluted with physiological saline and prepared for inoculation with 10 to 100 cfu / sample. The prepared solution was inoculated into a test tube to which 10 mL of HF medium prepared above was dispensed.
＜ＨＦ培地での培養＞
ＨＦ培地により３０℃で２２時間静置培養を行った。
<Culture in HF medium>
The HF medium was used for 22 hours of static culture at 30 ° C.
＜ＡＬＯＡ培地の調製＞
ＡＬＯＡ培地（ビオメリュー社製）を定法に従い作成し、プラスチックシャーレに１８〜２０ｍＬずつ分注した。
<Preparation of ALOA medium>
ALOA medium (manufactured by BioMérieux) was prepared according to a conventional method, and 18 to 20 mL each was dispensed into a plastic petri dish.
＜培養終了後の菌数測定準備＞
培養終了後、菌液を滅菌生理食品水で１０倍段階希釈し、ＡＬＯＡ培地に０．１ｍＬをそれぞれ接種後、滅菌コンラージ棒を使用して塗抹した。
<Preparation for measuring the number of bacteria after culturing>
After completion of the culture, the bacterial solution was diluted 10-fold with sterile physiological food water, 0.1 mL of each was inoculated into ALOA medium, and the cells were smeared using a sterile spreader.
＜リステリア属菌の菌数算出＞
３０℃、２４〜４８時間後のコロニーが緑色を示したものをリステリア属菌として計数した。計数値をもとに、培養終了後の菌数を算出した。
<Calculation of the number of Listeria monocytogenes>
Those whose colonies showed green color after 24 to 48 hours at 30 ° C. were counted as Listeria monocytogenes. Based on the counted value, the number of bacteria after the completion of culturing was calculated.
その結果、図２に示すように、リステリア グランデンシス（Listeria grandensis）、リステリア グレイ（Listeria grayi）、リステリア リパリア（Listeria riparia）の３菌種（これらをリステリア属３菌種と称する場合がある。）については、１０４ｃｆｕ／ｍＬ以上の菌量に増菌することができかなった。 As a result, as shown in FIG. 2, about three bacterial species of Listeria grandensis, Listeria grayi, and Listeria riparia (these may be referred to as three species of the genus Listeria). became either able to enrichment in bacteria of not less than 10 4 cfu / mL.
［実験２］
ＨＦ培地には炭素源としてエスクリンが含有されている。リステリア属菌はエスクリンを加水分解して生成したグルコースを炭素源として利用し生育する。実験１の培養条件（３０℃、２２時間）ではエスクリンの加水分解が遅かったか、又はグルコース生成量が少なかったために、生育に必要な炭素源が不足した結果、リステリア属３菌種の培養終了後の菌数が低菌数になった可能性があると考えられた。
そこで、本実験では、当該リステリア属３菌種の培養終了後の菌数を増加させることを目標とし、各種濃度のグルコース添加ＨＦ培地を用いて、リステリア属３菌種の増菌について確認した。
[Experiment 2]
The HF medium contains esculin as a carbon source. Listeria monocytogenes grows using glucose produced by hydrolyzing esculin as a carbon source. Under the culture conditions of Experiment 1 (30 ° C., 22 hours), the hydrolysis of esculin was slow or the amount of glucose produced was low, resulting in a shortage of carbon sources required for growth. As a result, after the culture of the three Listeria species was completed. It was considered possible that the number of bacteria in the strain was low.
Therefore, in this experiment, we aimed to increase the number of bacteria after the completion of culturing of the three species of Listeria, and confirmed the enrichment of the three species of Listeria using glucose-added HF medium of various concentrations.
本実験で使用したリステリア属菌の供試菌株は、次の３種類である。
Listeria grayi ATCC19120
Listeria grandensis DSM26688
Listeria riparia DSM26685
The test strains of Listeria monocytogenes used in this experiment are the following three types.
Listeria grayi ATCC19120
Listeria grandensis DSM26688
Listeria riparia DSM26685
＜グルコース添加ＨＦ培地の調製＞
３００ｍＬのグルコース溶液（濃度：０．１５％、０．３％、０．７％）を、１２１℃で１５分間高圧蒸気殺菌を行い、人肌程度に冷却後、各グルコース溶液２２５ｍＬとＲｅａｄｙ ｂａｇ ＨＦ培地顆粒（Ｍｅｒｃｋ社製）１２．５ｇを加え、マグネチックスタラーバーなどを用いて撹拌した。顆粒溶解後、ＨＦ培地１０ｍＬずつを滅菌済み栓付き試験管に分注した。また、グルコースを添加しないサンプルを同様に準備した。
<Preparation of glucose-added HF medium>
300 mL of glucose solution (concentration: 0.15%, 0.3%, 0.7%) is sterilized by high pressure steam at 121 ° C. for 15 minutes, cooled to about human skin, and then 225 mL of each glucose solution and Ready bag HF. 12.5 g of medium granules (manufactured by Merck) was added, and the mixture was stirred using a magnetic stirrer bar or the like. After dissolving the granules, 10 mL each of HF medium was dispensed into a sterilized test tube with a stopper. In addition, a sample to which glucose was not added was prepared in the same manner.
グルコースを添加しないものをサンプル１、グルコースを１．５ｇ／Ｌ添加したものをサンプル２、グルコースを３．０ｇ／Ｌ添加したものをサンプル３、グルコースを７．０ｇ／Ｌ添加したものをサンプル４とした。また、図３において、各サンプルのエスクリン及びグルコースのモル濃度（ｍＭ）、並びに総炭素源濃度（ｍＭ）を示した。
ＢＨＩ培地の調製、供試用菌液における菌数の測定、菌液の接種、改変ＨＦ培地での培養、ＡＬＯＡ培地の調製、培養終了後の菌数測定準備、及びリステリア属菌の菌数算出を、それぞれ実験１と同様の方法で実施した。
Preparation of BHI medium, measurement of bacterial count in test bacterial solution, inoculation of bacterial solution, culture in modified HF medium, preparation of ALOA medium, preparation for bacterial count measurement after completion of culture, and calculation of bacterial count of Listeria spp. , Each was carried out in the same manner as in
その結果、図３に示すように、サンプル２〜４において、リステリア属３菌種の培養終了後の菌数が大きく増加する効果は確認できず、菌数は概ね１０４未満であった。
なお、サンプル１（ＨＦ培地）においてリステリア リパリア（Listeria riparia）の菌数が１０４以上となったが、実験１のＨＦ培地では１０４未満となり、安定的に１０４以上に増菌できてはいない。
As a result, as shown in FIG. 3, in the sample 2-4, the effect of number of bacteria is greatly increased after the completion of Listeria third species culture can not be confirmed, the number of bacteria was generally less than 10 4.
Although the number of bacteria samples 1 (HF medium) in Listeria Riparia (Listeria riparia) becomes 10 4 or more, less than 10 4 in HF medium in
［実験３］
実験２により、リステリア属菌の生育には炭素源濃度よりも他の培地成分が関係していることが推察された。具体的には、非対象菌阻害剤（塩化リチウム、ナリジクス酸、アクリフラビン）や塩化ナトリウムなどが対象菌の生育を阻害していると推測されたため、本実験では、ＨＦ培地を希釈した培地を用いることにより、実験２で用いたリステリア属３菌種の増菌について確認した。一般に、ＨＦ培地はＩＳＯ１１２９０に示された基準で調製し、必要に応じて各種成分を添加して使用されるものであるため、希釈ＨＦ培地を用いるという概念は、従来はなかった。
[Experiment 3]
From
＜希釈ＨＦ培地の調製＞
３００ｍＬの蒸留水（富士フイルム和光純薬株式会社製）を、１２１℃で１５分間高圧蒸気殺菌を行い、人肌程度に冷却後、２２５ｍＬの蒸留水とＲｅａｄｙ ｂａｇ ＨＦ培地顆粒（Ｍｅｒｃｋ社製）１２．５ｇを加え、マグネチックスタラーバーなどを用いて撹拌した。顆粒溶解後、総量が１０ｍＬとなるように滅菌済み栓付き試験管内で、各希釈濃度に対応するようにＨＦ培地と蒸留水を分注した。希釈濃度は、２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍とした。なお、希釈しないＨＦ培地を分注したものも準備した。
<Preparation of diluted HF medium>
300 mL of distilled water (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is sterilized by high-pressure steam at 121 ° C. for 15 minutes, cooled to about human skin, and then 225 mL of distilled water and Ready bag HF medium granules (manufactured by Merck) 12 .5 g was added, and the mixture was stirred using a magnetic stirrer bar or the like. After dissolving the granules, HF medium and distilled water were dispensed in a sterilized test tube with a stopper so that the total volume was 10 mL, corresponding to each dilution concentration. The dilution concentration was 2 times, 5 times, 10 times, 15 times, and 20 times. In addition, an undiluted HF medium was also prepared.
ＢＨＩ培地の調製、供試用菌液における菌数の測定、及び菌液の接種を、それぞれ実験１と同様の方法で実施した。
また、ＨＦ培地／希釈ＨＦ培地での培養は、それぞれの培地により３０℃で２２時間静置培養を行った。
さらに、ＡＬＯＡ培地の調製、培養終了後の菌数測定準備、及びリステリア属菌の菌数算出を、それぞれ実験１と同様の方法で実施した。
Preparation of BHI medium, measurement of the number of bacteria in the test bacterial solution, and inoculation of the bacterial solution were carried out in the same manner as in
In addition, for culturing in HF medium / diluted HF medium, static culture was carried out at 30 ° C. for 22 hours in each medium.
Further, preparation of ALOA medium, preparation for measurement of the number of bacteria after the completion of culture, and calculation of the number of bacteria of the genus Listeria were carried out in the same manner as in
その結果、図４に示すように、リステリア属３菌種は、ＨＦ培地を用いて培養するよりも、希釈ＨＦ培地を用いる方が、より多く培養できることが明らかとなった。このことから、ＨＦ培地由来の非対象菌阻害剤などが、リステリア属３菌種の生育をも阻害している可能性があると推察された。 As a result, as shown in FIG. 4, it was clarified that the three strains of the genus Listeria can be cultured more in the diluted HF medium than in the HF medium. From this, it was speculated that a non-target bacterial inhibitor derived from the HF medium may also inhibit the growth of the three species of Listeria.
［実験４］
食品や食品製造環境等の検査場面においては、一般に、大腸菌や乳酸菌などの非対象菌が多く存在している。希釈ＨＦ培地に非対象菌が含まれている場合、非対象菌が増加して、リステリア属３菌種の増菌が抑制される可能性がある。
そこで、本実験では、希釈ＨＦ培地に過剰量の非対象菌を添加して、リステリア属３菌種の増菌について確認した。
[Experiment 4]
In general, many non-target bacteria such as Escherichia coli and lactic acid bacteria are present in the inspection scene of foods and food manufacturing environments. When the diluted HF medium contains non-target bacteria, the non-target bacteria may increase and the enrichment of the three Listeria species may be suppressed.
Therefore, in this experiment, an excessive amount of non-target bacteria was added to the diluted HF medium, and the enrichment of the three species of Listeria was confirmed.
リステリア属３菌種としては、実験２で用いたものと同じものを使用した。また、非対象菌としては、大腸菌（Escherichia coli NBRC8739）を使用した。これは、独立行政法人製品評価技術基盤機構から入手した。
そして、希釈ＨＦ培地の調製、及びＢＨＩ培地の調製を、それぞれ実験３と同様の方法で実施した。
As the
Then, the preparation of the diluted HF medium and the preparation of the BHI medium were carried out in the same manner as in
＜供試用菌液における菌数の測定＞
リステリア属菌、及び大腸菌をＢＨＩ培地により３０℃で２４時間静置培養し、菌液を滅菌生理食塩水にて希釈し、標準寒天培地に滅菌コンラージ棒を使用して塗抹した。
そして、３０℃、２４時間後、培地上のコロニー数を計数した。計数値をもとに、培養終了後菌数を算出した。なお、増菌培養液はＨＦ培地への接種に使用するため、冷蔵庫にて４℃で保管した。
<Measurement of the number of bacteria in the test bacterial solution>
Listeria monocytogenes and Escherichia coli were statically cultured on BHI medium at 30 ° C. for 24 hours, the bacterial solution was diluted with sterile physiological saline, and smeared on standard agar medium using a sterile spreader.
Then, after 24 hours at 30 ° C., the number of colonies on the medium was counted. Based on the counted value, the number of bacteria was calculated after the completion of culturing. The enriched culture solution was stored at 4 ° C. in a refrigerator for use in inoculating the HF medium.
＜菌液の接種＞
リステリア属菌については、菌数の算出後、４℃で保管した増菌液を生理食塩水にて希釈し、１０〜１００ｃｆｕ／サンプルを接種するために調製した。その調製液を上記で調製した１０ｍＬのＨＦ培地が分注された試験管へ接種した。
大腸菌については、菌数の算出後、４℃にて保管した増菌液を生理食塩水にて希釈し、５．１×１０７ｃｆｕ／サンプルを接種するために調製した。その調製液を上記で調製した１０ｍＬのＨＦ培地が分注された試験管へ接種した。
<Inoculation of bacterial solution>
For Listeria monocytogenes, after calculating the number of bacteria, the enrichment solution stored at 4 ° C. was diluted with physiological saline and prepared for inoculation with 10 to 100 cfu / sample. The prepared solution was inoculated into a test tube to which 10 mL of HF medium prepared above was dispensed.
For E. coli, after the calculation of the number of bacteria, the enrichment solution and stored at 4 ° C. and diluted with physiological saline to prepare to inoculate 5.1 × 10 7 cfu / sample. The prepared solution was inoculated into a test tube to which 10 mL of HF medium prepared above was dispensed.
ＨＦ培地／希釈ＨＦ培地での培養、ＡＬＯＡ培地の調製、培養終了後の菌数測定準備、及びリステリア属菌の菌数算出を、それぞれ実験１と同様の方法で実施した。
Culturing in HF medium / diluted HF medium, preparation of ALOA medium, preparation for measuring the number of bacteria after the culture was completed, and calculation of the number of bacteria of the genus Listeria were carried out in the same manner as in
その結果、図５に示すように、希釈倍率２〜２０倍の希釈ＨＦ培地を用いた場合にリステリア属３菌種の十分な生育が確認され、特に希釈倍率５倍の希釈ＨＦ培地を用いた培養結果が最も高い値を示した。上述の通り、非対象菌阻害剤がリステリア属３菌種の生育阻害効果をも有していると推察されるところ、当該阻害剤が希釈され、かつ対象菌の生育に必要な栄養分が残存していたため、リステリア属３菌種の生育が促進したと考えられた。
また、実験３の結果と比較すると、本実験では、対象菌の菌数が減少している。これは大腸菌の生育により、対象菌の生育が阻害されたためと推察された。
As a result, as shown in FIG. 5, sufficient growth of the three species of the genus Listeria was confirmed when a diluted HF medium having a dilution ratio of 2 to 20 times was used, and in particular, a diluted HF medium having a dilution ratio of 5 times was used. The culture result showed the highest value. As described above, it is presumed that the non-target bacterium inhibitor also has the effect of inhibiting the growth of the three species of Listeria genus, but the inhibitor is diluted and the nutrients necessary for the growth of the target bacterium remain. Therefore, it was considered that the growth of the three species of Listeria was promoted.
Moreover, as compared with the result of
［実験５］
本実験では、希釈ＨＦ培地に過剰量の非対象菌を添加して、リステリア属３菌種の増菌について確認した。
リステリア属３菌種としては、実験２で用いたものと同じものを使用した。また、非対象菌としては、乳酸菌（Lactococcus lactis subsp cremoris NBRC100676）を使用した。
そして、希釈ＨＦ培地の調製、及びＢＨＩ培地の調製を、それぞれ実験３と同様の方法で実施した。
[Experiment 5]
In this experiment, an excessive amount of non-target bacteria was added to the diluted HF medium, and the enrichment of 3 species of Listeria was confirmed.
As the
Then, the preparation of the diluted HF medium and the preparation of the BHI medium were carried out in the same manner as in
＜ラクトバチルスＭＲＳ培地の調製＞
ＭＲＳ培地(BD社（Becton, Dickinson and Company）製)を定法に従い作成し、試験管に１０ｍＬずつ分注し、１２１℃で１５分間滅菌した。
<Preparation of Lactobacillus MRS medium>
MRS medium (manufactured by BD (Becton, Dickinson and Company)) was prepared according to a conventional method, 10 mL each was dispensed into a test tube, and sterilized at 121 ° C. for 15 minutes.
＜供試用菌液における菌数の測定＞
リステリア属菌については、ＢＨＩ培地により３０℃で２４時間静置培養し、菌液を滅菌生理食塩水にて希釈し、標準寒天培地に滅菌コンラージ棒を使用して塗抹した。
乳酸菌については、ＭＲＳ培地により３０℃で２４時間静置培養し、菌液を滅菌生理食塩水にて希釈し、ＭＲＳ寒天培地に滅菌コンラージ棒を使用して塗抹した。
そして、３０℃、２４時間後、培地上のコロニー数を計数した。計数値をもとに、培養終了後菌数を算出した。なお、増菌培養液はＨＦ培地への接種に使用するため、冷蔵庫にて４℃で保管した。
<Measurement of the number of bacteria in the test bacterial solution>
Listeria monocytogenes was statically cultured on BHI medium at 30 ° C. for 24 hours, the bacterial solution was diluted with sterile physiological saline, and smeared on standard agar medium using a sterile spreader.
Lactic acid bacteria were statically cultured in MRS medium at 30 ° C. for 24 hours, the bacterial solution was diluted with sterile physiological saline, and smeared on MRS agar medium using a sterile spreader.
Then, after 24 hours at 30 ° C., the number of colonies on the medium was counted. Based on the counted value, the number of bacteria was calculated after the completion of culturing. The enriched culture solution was stored at 4 ° C. in a refrigerator for use in inoculating the HF medium.
＜菌液の接種＞
リステリア属菌については、菌数の算出後、４℃で保管した増菌液を生理食塩水にて希釈し、１０〜１００ｃｆｕ／サンプルを接種するために調製した。その調製液を上記で調製した１０ｍＬのＨＦ培地が分注された試験管へ接種した。
乳酸菌については、菌数の算出後、４℃にて保管した増菌液を生理食塩水にて希釈し、１．０×１０７ｃｆｕ／サンプルを接種するために調製した。その調製液を上記で調製した１０ｍＬのＨＦ培地が分注された試験管へ接種した。
<Inoculation of bacterial solution>
For Listeria monocytogenes, after calculating the number of bacteria, the enrichment solution stored at 4 ° C. was diluted with physiological saline and prepared for inoculation with 10 to 100 cfu / sample. The prepared solution was inoculated into a test tube to which 10 mL of HF medium prepared above was dispensed.
The lactic acid bacteria, after the calculation of the number of bacteria, the enrichment solution and stored at 4 ° C. and diluted with physiological saline to prepare to inoculate 1.0 × 10 7 cfu / sample. The prepared solution was inoculated into a test tube to which 10 mL of HF medium prepared above was dispensed.
ＨＦ培地／希釈ＨＦ培地での培養、ＡＬＯＡ培地の調製、培養終了後の菌数測定準備、及びリステリア属菌の菌数算出を、それぞれ実験１と同様の方法で実施した。
Culturing in HF medium / diluted HF medium, preparation of ALOA medium, preparation for measuring the number of bacteria after the culture was completed, and calculation of the number of bacteria of the genus Listeria were carried out in the same manner as in
その結果、図６に示すように、希釈倍率２〜２０倍の希釈ＨＦ培地を用いた場合にリステリア属３菌種の十分な生育が確認され、特に希釈倍率５倍〜１０倍の希釈ＨＦ培地を用いた培養結果が最も高い値を示した。
このように、非対象菌である乳酸菌が存在する場合に、リステリア属菌の増菌が反って促進され、希釈倍率５倍〜１０倍の希釈ＨＦ培地を用いた場合にその効果が最も高くなっていた。
As a result, as shown in FIG. 6, sufficient growth of the three species of the genus Listeria was confirmed when a diluted HF medium having a dilution ratio of 2 to 20 times was used, and in particular, a diluted HF medium having a dilution ratio of 5 to 10 times was confirmed. The results of culturing using the medium showed the highest value.
In this way, in the presence of lactic acid bacteria, which are non-target bacteria, the enrichment of Listeria monocytogenes is promoted in a warped manner, and the effect is highest when a diluted HF medium having a dilution ratio of 5 to 10 times is used. Was there.
［実験６］
本実験では、希釈ＨＦ培地を用いる場合、ＨＦ培地を用いる場合に比較して、大腸菌と乳酸菌の生育阻害効果が弱まるか否かについて確認した。すなわち、実験４では、大腸菌の生育により対象菌の生育が抑制されたと推察され、実験５では、乳酸菌の生育により対象菌の生育が促進されたと推察された。そこで、本実験では、希釈ＨＦ培地を用いて、非対象菌の増菌について確認した。
[Experiment 6]
In this experiment, it was confirmed whether or not the growth inhibitory effect of Escherichia coli and lactic acid bacteria was weakened when the diluted HF medium was used as compared with the case where the HF medium was used. That is, in
大腸菌は実験４で使用したものと同じものを使用した。また、乳酸菌は実験５で使用したものと同じものを使用した。
希釈ＨＦ培地の調製、及びＢＨＩ培地の調製を、実験４と同様の方法で実施した。また、ラクトバチルスＭＲＳ培地の調製を、実験５と同様の方法で実施した。
The same E. coli used in
Preparation of diluted HF medium and preparation of BHI medium were carried out in the same manner as in
＜供試用菌液における菌数の測定＞
大腸菌については、ＢＨＩ培地により３０℃で２４時間静置培養し、菌液を滅菌生理食塩水にて希釈し、標準寒天培地に滅菌コンラージ棒を使用して塗抹した。
乳酸菌については、ＭＲＳ培地により３０℃で２４時間静置培養し、菌液を滅菌生理食塩水にて希釈し、ＭＲＳ寒天培地に滅菌コンラージ棒を使用して塗抹した。
そして、３０℃、２４時間後、培地上のコロニー数を計数した。計数値をもとに、培養終了後菌数を算出した。なお、増菌培養液はＨＦ培地へ接種に使用するため、冷蔵庫にて４℃で保管した。
<Measurement of the number of bacteria in the test bacterial solution>
Escherichia coli was statically cultured on BHI medium at 30 ° C. for 24 hours, the bacterial solution was diluted with sterile physiological saline, and smeared on standard agar medium using a sterile spreader.
Lactic acid bacteria were statically cultured in MRS medium at 30 ° C. for 24 hours, the bacterial solution was diluted with sterile physiological saline, and smeared on MRS agar medium using a sterile spreader.
Then, after 24 hours at 30 ° C., the number of colonies on the medium was counted. Based on the counted value, the number of bacteria was calculated after the completion of culturing. The enriched culture solution was stored in a refrigerator at 4 ° C. for use in inoculating the HF medium.
＜菌液の接種＞
菌数の算出後、４℃で保管した増菌液を生理食塩水にて希釈し、１０〜１００ｃｆｕ／サンプルを接種するために調製した。その調製液を上記で調製した１０ｍＬのＨＦ培地が分注された試験管へ接種した。
<Inoculation of bacterial solution>
After calculating the number of bacteria, the enrichment solution stored at 4 ° C. was diluted with physiological saline and prepared for inoculation with 10 to 100 cfu / sample. The prepared solution was inoculated into a test tube to which 10 mL of HF medium prepared above was dispensed.
ＨＦ培地／希釈ＨＦ培地での培養、ＡＬＯＡ培地の調製、及び培養終了後の菌数測定準備を、それぞれ実験１と同様の方法で実施した。
Culturing in HF medium / diluted HF medium, preparation of ALOA medium, and preparation for measuring the number of bacteria after completion of culturing were carried out in the same manner as in
＜大腸菌の菌数算出＞
３０℃、２４〜４８時間後に標準寒天培地でコロニーが確認されたものを大腸菌として計数した。計数値をもとに、培養終了後の菌数を算出した。
<Calculation of E. coli count>
Escherichia coli in which colonies were confirmed on a standard agar medium at 30 ° C. for 24 to 48 hours was counted. Based on the counted value, the number of bacteria after the completion of culturing was calculated.
＜乳酸菌の菌数算出＞
３０℃、２４〜４８時間後にラクトバチルスＭＲＳ寒天培地でコロニーが確認されたものを乳酸菌として計数した。計数値をもとに、培養終了後の菌数を算出した。
<Calculation of the number of lactic acid bacteria>
Colonies confirmed on Lactobacillus MRS agar medium at 30 ° C. after 24 to 48 hours were counted as lactic acid bacteria. Based on the counted value, the number of bacteria after the completion of culturing was calculated.
その結果、図７に示すように、２０倍希釈の希釈ＨＦ培地を用いた場合でも、大腸菌及び乳酸菌の増菌は抑制されていた。 As a result, as shown in FIG. 7, the enrichment of Escherichia coli and lactic acid bacteria was suppressed even when a diluted HF medium diluted 20-fold was used.
［実験７］
本実験では、非対象菌阻害剤である塩化リチウムを様々な濃度で含むＢＨＩ培地を用いた場合におけるリステリア属２菌種と大腸菌及び乳酸菌の増菌について確認した。すなわち、実験３において、ＨＦ培地では対象菌の生育が阻害された可能性があると推察されたため、阻害要因物質を追究するために、本実験を行った。
[Experiment 7]
In this experiment, it was confirmed that two species of Listeria genus and Escherichia coli and lactic acid bacteria were enriched when BHI medium containing lithium chloride, which is a non-target bacterium inhibitor, was used at various concentrations. That is, in
本実験で使用したリステリア属菌、大腸菌及び乳酸菌の供試菌株は、実験４，実験５と同じものを用いた。なお、実験３において、リステリア グレイは生育阻害の可能性が認められたリステリア属菌であり、リステリア モノサイトゲネスは生育阻害の可能性が認められなかったリステリア属菌である。
Listeria grayi ATCC19120
Listeria monocytogenes NCTC11994
Escherichia coli NBRC8739
Lactococcus lactis NBRC100676
The test strains of Listeria monocytogenes, Escherichia coli and lactic acid bacteria used in this experiment were the same as those used in
Listeria grayi ATCC19120
Listeria monocytogenes NCTC11994
Escherichia coli NBRC8739
Lactococcus lactis NBRC100676
＜塩化リチウム添加ＢＨＩ培地の調製＞
５００ｍＬの蒸留水とＢＨＩ培地の１Ｌ使用量を混合し、加温溶解後、５ｍＬずつを試験管に分注し、１２１℃で１５分間高圧蒸気殺菌を行った。そして、総量が１０ｍＬとなるように、滅菌済み栓付き試験管内で各希釈濃度に対応するようにＢＨＩ培地と滅菌済み塩化リチウム溶液を分注した。
塩化リチウムの希釈濃度は、０倍（ＨＦ培地と同量、3000mg/L）、２倍（1500mg/L）、５倍（600mg/L）、１０倍（300mg/L）とし、それぞれサンプル１、２、３、４とした。また、塩化リチウム無添加のＢＨＩ培地をサンプル５とした。
<Preparation of BHI medium containing lithium chloride>
500 mL of distilled water and 1 L of BHI medium were mixed, and after heating and dissolving, 5 mL each was dispensed into a test tube, and high-pressure steam sterilization was performed at 121 ° C. for 15 minutes. Then, the BHI medium and the sterilized lithium chloride solution were dispensed in a sterilized stoppered test tube so as to correspond to each dilution concentration so that the total volume was 10 mL.
The dilution concentration of lithium chloride was 0-fold (same amount as HF medium, 3000 mg / L), 2-fold (1500 mg / L), 5-fold (600 mg / L), and 10-fold (300 mg / L), respectively. It was set to 2, 3, and 4. In addition, BHI medium without lithium chloride was used as
ＢＨＩ培地の調製を、実験１と同様の方法で実施した。また、ラクトバチルスＭＲＳ培地の調製、及び供試用菌液における菌数の測定を、それぞれ実験５と同様の方法で実施した。さらに、菌液の接種を、実験１と同様の方法で実施し、E.coliについては４ｃｆｕ／サンプルを接種した。
そして、塩化リチウム添加／無添加ＢＨＩ培地を用いて、３０℃、２２時間静置で培養した。
また、ＡＬＯＡ培地の調製を、実験１と同様の方法で実施した。
Preparation of BHI medium was carried out in the same manner as in
Then, using the lithium chloride-added / non-added BHI medium, the cells were cultured at 30 ° C. for 22 hours.
In addition, the ALOA medium was prepared in the same manner as in
＜培養終了後の菌数測定準備＞
リステリア属菌の培養終了後、菌液を滅菌生理食品水で１０倍段階希釈し、ＡＬＯＡ培地に０．１ｍＬをそれぞれ接種後、滅菌コンラージ棒を使用して塗抹した。
また、大腸菌の培養終了後、菌液を滅菌生理食品水で１０倍段階希釈し、標準寒天培地に０．１ｍＬをそれぞれ接種後、滅菌コンラージ棒を使用して塗抹した。
さらに、乳酸菌の培養終了後、菌液を滅菌生理食品水で１０倍段階希釈し、ＭＲＳ寒天培地に０．１ｍＬをそれぞれ接種後、滅菌コンラージ棒を使用して塗抹した。
<Preparation for measuring the number of bacteria after culturing>
After completion of the culture of Listeria monocytogenes, the bacterial solution was serially diluted 10-fold with sterile physiological food water, 0.1 mL of each was inoculated into ALOA medium, and smeared using a sterile spreader.
After the Escherichia coli culture was completed, the bacterial solution was diluted 10-fold with sterile physiological food water, 0.1 mL of each was inoculated on a standard agar medium, and the cells were smeared using a sterile spreader.
Further, after the culture of lactic acid bacteria was completed, the bacterial solution was diluted 10-fold with sterile physiological food water, 0.1 mL of each was inoculated on MRS agar medium, and smeared using a sterile spreader.
リステリア属菌の菌数算出を、実験１と同様の方法で実施した。また、大腸菌の菌数算出、及び乳酸菌の菌数算出を、それぞれ実験６と同様の方法で実施した。
The number of Listeria monocytogenes was calculated in the same manner as in
その結果、図８に示すように、５倍希釈ＨＦ培地相当と同量（600mg/L）以上の塩化リチウムが含有されていれば（サンプル１〜３）、大腸菌の生育を阻害できることが分かった。一方、乳酸菌は、塩化リチウムによる生育の阻害は見られなかった。
また、１０倍希釈ＨＦ培地相当と同量（300mg/L）の塩化リチウムが含有されている場合には（サンプル４）、大腸菌の生育阻害が弱まることが確認された。
As a result, as shown in FIG. 8, it was found that the growth of Escherichia coli can be inhibited if the amount (600 mg / L) or more of lithium chloride equivalent to that of the 5-fold diluted HF medium is contained (
Further, it was confirmed that the growth inhibition of Escherichia coli was weakened when the same amount (300 mg / L) of lithium chloride as that equivalent to the 10-fold diluted HF medium was contained (Sample 4).
［実験８］
本実験では、非対象菌阻害剤であるナリジクス酸を様々な濃度で含むＢＨＩ培地を用いた場合におけるリステリア属２菌種と大腸菌及び乳酸菌の増菌について、実験７と同様にして確認した。
[Experiment 8]
In this experiment, the enrichment of 2 species of Listeria monocytogenes and Escherichia coli and lactic acid bacteria when BHI medium containing nalidixic acid, which is a non-target bacterium inhibitor, was used at various concentrations was confirmed in the same manner as in
＜ナリジクス酸添加ＢＨＩ培地の調製＞
５００ｍＬの蒸留水とＢＨＩ培地の１Ｌ使用量を混合し、加温溶解後、５ｍＬずつを試験管に分注し、１２１℃で１５分間高圧蒸気殺菌を行った。そして、総量が１０ｍＬとなるように、滅菌済み栓付き試験管内で各希釈濃度に対応するようにＢＨＩ培地と滅菌済みナリジクス酸ナトリウム塩溶液を分注した。
ナリジクス酸の希釈濃度は、０倍（ＨＦ培地と同量、9.1mg/L）、２倍（4.6mg/L）、５倍（1.8mg/L）、１０倍（0.9mg/L）とし、それぞれサンプル１、２、３、４とした。また、ナリジクス酸無添加のＢＨＩ培地をサンプル５とした。
<Preparation of BHI medium with nalidixic acid>
500 mL of distilled water and 1 L of BHI medium were mixed, and after heating and dissolving, 5 mL each was dispensed into a test tube, and high-pressure steam sterilization was performed at 121 ° C. for 15 minutes. Then, the BHI medium and the sterilized sodium nalidixate solution were dispensed in a sterilized stoppered test tube so as to correspond to each dilution concentration so that the total volume was 10 mL.
The dilution concentration of nalidixic acid was 0-fold (same amount as HF medium, 9.1 mg / L), 2-fold (4.6 mg / L), 5-fold (1.8 mg / L), and 10-fold (0.9 mg / L).
ナリジクス酸ナトリウム塩からナリジクス酸への換算は、ナリジクス酸ナトリウム塩添加量×（232.24（ナリジクス酸分子量）/254.2（ナリジクス酸ナトリウム塩分子量））の換算式を用いて、サンプル番号ごとに次表の通り行った。
ＢＨＩ培地の調製を、実験１と同様の方法で実施した。また、ラクトバチルスＭＲＳ培地の調製、及び供試用菌液における菌数の測定を、それぞれ実験５と同様の方法で実施した。さらに、菌液の接種を、実験１と同様の方法で実施し、E.coliについては４ｃｆｕ／サンプルを接種した。
そして、ナリジクス酸添加／無添加ＢＨＩ培地を用いて、３０℃、２２時間静置で培養した。
また、ＡＬＯＡ培地の調製を、実験１と同様の方法で実施した。
Preparation of BHI medium was carried out in the same manner as in
Then, the cells were cultured in a BHI medium with / without nalidixic acid at 30 ° C. for 22 hours.
In addition, the ALOA medium was prepared in the same manner as in
培養終了後の菌数測定準備を、実験７と同様の方法で実施した。また、ステリア属菌の菌数算出を、実験１と同様の方法で実施した。さらに、大腸菌の菌数算出、及び乳酸菌の菌数算出を、それぞれ実験６と同様の方法で実施した。
Preparation for measuring the number of bacteria after the completion of the culture was carried out in the same manner as in
その結果、図９に示すように、５倍希釈ＨＦ培地相当と同量（1.8mg/L）以上のナリジクス酸が含有されていれば（サンプル１〜３）、大腸菌の生育を阻害できることが分かった。一方、乳酸菌は、ナリジクス酸による生育の阻害は見られなかった。
また、１０倍希釈ＨＦ培地相当と同量（0.9mg/L）のナリジクス酸が含有されている場合には（サンプル４）、大腸菌の生育阻害が弱まることが確認された。
As a result, as shown in FIG. 9, it was found that the growth of Escherichia coli can be inhibited if the amount of nalidixic acid (1.8 mg / L) or more equivalent to that of the 5-fold diluted HF medium is contained (
Further, it was confirmed that the growth inhibition of Escherichia coli was weakened when the same amount (0.9 mg / L) of nalidixic acid as that equivalent to the 10-fold diluted HF medium was contained (Sample 4).
［実験９］
本実験では、非対象菌阻害剤であるアクリフラビンを様々な濃度で含むＢＨＩ培地を用いた場合におけるリステリア属２菌種と大腸菌及び乳酸菌の増菌について、実験７と同様にして確認した。
[Experiment 9]
In this experiment, the enrichment of 2 species of Listeria monocytogenes and Escherichia coli and lactic acid bacteria when BHI medium containing acriflavine, which is a non-target bacterium inhibitor, was used at various concentrations was confirmed in the same manner as in
＜アクリフラビン添加ＢＨＩ培地の調製＞
５００ｍＬの蒸留水とＢＨＩ培地の１Ｌ使用量を混合し、加温溶解後、５ｍＬずつを試験管に分注し、１２１℃で１５分間高圧蒸気殺菌を行った。そして、総量が１０ｍＬとなるように、滅菌済み栓付き試験管内で各希釈濃度に対応するようにＢＨＩ培地と滅菌済みアクリフラビン塩酸塩溶液を分注した。
アクリフラビンの希釈濃度は、０倍（ＨＦ培地と同量、4.8mg/L）、２倍（2.4mg/L）、５倍（1.0mg/L）、１０倍（0.5mg/L）とし、それぞれサンプル１、２、３、４とした。また、アクリフラビン無添加のＢＨＩ培地をサンプル５とした。
<Preparation of Acriflavine-added BHI medium>
500 mL of distilled water and 1 L of BHI medium were mixed, and after heating and dissolving, 5 mL each was dispensed into a test tube, and high-pressure steam sterilization was performed at 121 ° C. for 15 minutes. Then, the BHI medium and the sterilized acriflavine hydrochloride solution were dispensed in a sterilized stoppered test tube so as to correspond to each dilution concentration so that the total volume was 10 mL.
The dilution concentration of acriflavine was 0-fold (same amount as HF medium, 4.8 mg / L), 2-fold (2.4 mg / L), 5-fold (1.0 mg / L), and 10-fold (0.5 mg / L).
アクリフラビン塩酸塩からアクリフラビンへの換算は、アクリフラビン塩酸塩添加量×（224.28（アクリフラビン分子量）/578.36（アクリフラビン塩酸塩分子量））の換算式を用いて、サンプル番号ごとに次表の通り行った。
ＢＨＩ培地の調製を、実験１と同様の方法で実施した。また、ラクトバチルスＭＲＳ培地の調製、及び供試用菌液における菌数の測定を、それぞれ実験５と同様の方法で実施した。さらに、菌液の接種を、実験１と同様の方法で実施し、E.coliについては４ｃｆｕ／サンプルを接種した。
そして、アクリフラビン添加／無添加ＢＨＩ培地を用いて、３０℃、２２時間静置で培養した。
また、ＡＬＯＡ培地の調製を、実験１と同様の方法で実施した。
Preparation of BHI medium was carried out in the same manner as in
Then, the cells were cultured in BHI medium with / without acriflavine at 30 ° C. for 22 hours.
In addition, the ALOA medium was prepared in the same manner as in
培養終了後の菌数測定準備を、実験７と同様の方法で実施した。また、ステリア属菌の菌数算出を、実験１と同様の方法で実施した。さらに、大腸菌の菌数算出、及び乳酸菌の菌数算出を、それぞれ実験６と同様の方法で実施した。
Preparation for measuring the number of bacteria after the completion of the culture was carried out in the same manner as in
その結果、図１０に示すように、ＨＦ培地相当と同量（4.8mg/L）アクリフラビンが含有されていれば、乳酸菌の生育を阻害できることが分かった。一方、大腸菌は、アクリフラビンによる生育の阻害は見られなかった。 As a result, as shown in FIG. 10, it was found that the growth of lactic acid bacteria could be inhibited if the same amount (4.8 mg / L) of acriflavine as that of the HF medium was contained. On the other hand, Escherichia coli was not inhibited by acriflavine.
［実験１０］
本実験では、各種濃度の塩化ナトリウム添加ＢＨＩ培地を用いて、リステリア属２菌種の増菌について確認した。
本実験で使用したリステリア属菌は、次の通りである。
Listeria grayi ATCC19120
Listeria monocytogenes NCTC11994
[Experiment 10]
In this experiment, enrichment of 2 species of Listeria was confirmed using BHI medium containing various concentrations of sodium chloride.
The Listeria monocytogenes used in this experiment are as follows.
Listeria grayi ATCC19120
Listeria monocytogenes NCTC11994
＜塩化ナトリウム添加ＢＨＩ培地の調製＞
５００ｍＬの蒸留水とＢＨＩ培地の１Ｌ使用量を混合し、加温溶解後、５ｍＬずつを試験管に分注し、１２１℃で１５分間高圧蒸気殺菌を行った。そして、総量が１０ｍＬとなるように、滅菌済み栓付き試験管内で各希釈濃度に対応するようにＢＨＩ培地と滅菌済み塩化ナトリウム溶液を分注した。
塩化ナトリウムの希釈濃度は、０倍（ＨＦ培地と同量、5g/L(ＢＨＩ培地含有量)+15g/L=20g/L)）、２倍（5g/L(ＢＨＩ培地含有量)+5g/L=10g/L)）とし、それぞれサンプル１、２とした。また、塩化ナトリウム無添加のＢＨＩ培地（5g/Lは元から含有）をサンプル３とした。
<Preparation of BHI medium containing sodium chloride>
500 mL of distilled water and 1 L of BHI medium were mixed, and after heating and dissolving, 5 mL each was dispensed into a test tube, and high-pressure steam sterilization was performed at 121 ° C. for 15 minutes. Then, the BHI medium and the sterilized sodium chloride solution were dispensed in a sterilized stoppered test tube so as to correspond to each dilution concentration so that the total volume was 10 mL.
The dilution concentration of sodium chloride is 0 times (same amount as HF medium, 5 g / L (BHI medium content) + 15 g / L = 20 g / L)), 2 times (5 g / L (BHI medium content) + 5 g. / L = 10g / L)), and
ＢＨＩ培地の調製、供試用菌液における菌数の測定、及び菌液の接種を、それぞれ実験１と同様の方法で実施した。
そして、塩化ナトリウム添加／無添加ＢＨＩ培地を用いて、３０℃、２２時間静置で培養した。
Preparation of BHI medium, measurement of the number of bacteria in the test bacterial solution, and inoculation of the bacterial solution were carried out in the same manner as in
Then, using the sodium chloride-added / non-added BHI medium, the cells were cultured at 30 ° C. for 22 hours.
ＡＬＯＡ培地の調製、培養終了後の菌数測定準備、及びリステリア属菌の菌数算出を、それぞれ実験１と同様の方法で実施した。
Preparation of ALOA medium, preparation for measurement of the number of bacteria after the completion of culture, and calculation of the number of bacteria of the genus Listeria were carried out in the same manner as in
その結果、図１０に示すように、ＨＦ培地相当と同量の塩化ナトリウムが含有されていた場合に、リステリア グレイ（Listeria grayi）の培養後終了の菌数が無添加の場合と比較して、生育がやや抑制されていることが確認された。 As a result, as shown in FIG. 10, when the same amount of sodium chloride as that of the HF medium was contained, the number of bacteria of Listeria grayi completed after culturing was not added, as compared with the case where no addition was added. It was confirmed that the growth was slightly suppressed.
［実験１１］
上記の各実験結果を踏まえて、本実験では、５倍希釈ＨＦ培地を用いて、全１７種のリステリア属菌の培養実験を以下のように行った。本実験で使用したリステリア属菌の供試菌株は、実験１と同様である。
[Experiment 11]
Based on the results of each of the above experiments, in this experiment, a culture experiment of all 17 species of Listeria monocytogenes was carried out using a 5-fold diluted HF medium as follows. The test strain of Listeria monocytogenes used in this experiment is the same as in
＜希釈ＨＦ培地の調製＞
４５００ｍＬの蒸留水（富士フイルム和光純薬株式会社製）を、１２１℃で１５分間高圧蒸気殺菌を行い、人肌程度に冷却後、４５００ｍＬの蒸留水とＲｅａｄｙ ｂａｇ ＨＦ培地顆粒（Ｍｅｒｃｋ社製）５０．０ｇを加え、マグネチックスタラーバーなどを用いて撹拌した。顆粒溶解後、総量が２２５ｍＬとなるように、食品検査用バッグに分注した。
<Preparation of diluted HF medium>
4500 mL of distilled water (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is sterilized by high-pressure steam at 121 ° C. for 15 minutes, cooled to about human skin, and then 4500 mL of distilled water and Ready bag HF medium granules (manufactured by Merck) 50. .0 g was added, and the mixture was stirred using a magnetic stirrer bar or the like. After the granules were dissolved, they were dispensed into a food inspection bag so that the total volume was 225 mL.
ＢＨＩ培地の調製、供試用菌液における菌数の測定、菌液の接種、希釈ＨＦ培地での培養、ＡＬＯＡ培地の調製、培養終了後の菌数測定準備、及びリステリア属菌の菌数算出を、それぞれ実験１と同様の方法で実施した。
Preparation of BHI medium, measurement of bacterial count in test bacterial solution, inoculation of bacterial solution, culture in diluted HF medium, preparation of ALOA medium, preparation for bacterial count measurement after completion of culture, and calculation of bacterial count of Listeria spp. , Each was carried out in the same manner as in
その結果、図１２に示すように、全１７種のリステリア属菌の培養後菌数は、いずれも１０４ｃｆｕ／ｍＬ以上であった。すなわち、実験１において１０４ｃｆｕ／ｍＬ以上の菌量に増菌することができかなったリステリア グランデンシス（Listeria grandensis）、リステリア グレイ（Listeria grayi）、リステリア リパリア（Listeria riparia）の３菌種についても、１０４ｃｆｕ／ｍＬ以上の菌量に増菌することができた。
As a result, as shown in FIG. 12, cell count after culturing for all 17 species of Listeria is were all 10 4 cfu / mL or more. That is, Listeria Gurandenshisu (Listeria grandensis) became one can enrichment in bacteria of not less than 10 4 cfu / mL in
［実験１２］
本実験では、希釈ＨＦ培地を用いてリステリア属２菌種を培養し、迅速検査法による陽性陰性判定を行った。迅速検査法は、リアルタイムＰＣＲキット（Genus Listeria、Hygiena社製)を用いて説明書に従って行った。
本実験で使用したリステリア属菌は、次の通りである。
Listeria grayi ATCC19120
Listeria monocytogenes NCTC11994
[Experiment 12]
In this experiment, two species of Listeria genus were cultured in diluted HF medium, and a positive / negative judgment was made by a rapid test method. The rapid test method was performed using a real-time PCR kit (Genus Listeria, manufactured by Hygiena) according to the instructions.
The Listeria monocytogenes used in this experiment are as follows.
Listeria grayi ATCC19120
Listeria monocytogenes NCTC11994
＜ＨＦ培地の調製＞
３００ｍＬの蒸留水（富士フイルム和光純薬株式会社製）を、１２１℃で１５分間高圧蒸気殺菌を行い、人肌程度に冷却後、２２５ｍＬの蒸留水とＲｅａｄｙ ｂａｇ ＨＦ培地顆粒（Ｍｅｒｃｋ社製）１２．５ｇを加え、マグネチックスタラーバーなどを用いて撹拌した。顆粒溶解後、総量が２２５ｍＬとなるように、食品検査用バッグに分注した。
また、５倍希釈ＨＦ培地を実験１１と同様に調製した。
<Preparation of HF medium>
300 mL of distilled water (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is sterilized by high-pressure steam at 121 ° C. for 15 minutes, cooled to about human skin, and then 225 mL of distilled water and Ready bag HF medium granules (manufactured by Merck) 12 .5 g was added, and the mixture was stirred using a magnetic stirrer bar or the like. After the granules were dissolved, they were dispensed into a food inspection bag so that the total volume was 225 mL.
In addition, a 5-fold diluted HF medium was prepared in the same manner as in
ＢＨＩ培地の調製、供試用菌液における菌数の測定、菌液の接種、希釈ＨＦ培地での培養、ＡＬＯＡ培地の調製、培養終了後の菌数測定準備、及びリステリア属菌の菌数算出を、それぞれ実験１と同様の方法で実施した。
そして、迅速検査法による評価を実施した。
Preparation of BHI medium, measurement of bacterial count in test bacterial solution, inoculation of bacterial solution, culture in diluted HF medium, preparation of ALOA medium, preparation for bacterial count measurement after completion of culture, and calculation of bacterial count of Listeria spp. , Each was carried out in the same manner as in
Then, the evaluation by the rapid inspection method was carried out.
その結果、図１３に示すように、ＨＦ培地を用いた場合、リステリア グレイ（Listeria grayi）の培養後終了の菌数は、１０４未満であり、迅速検査法の結果は陰性となり、偽陰性となった。
これに対して、５倍希釈ＨＦ培地を用いた場合、同菌の培養後終了の菌数は、７．８×１０８で、迅速検査法の結果は陽性となり、偽陰性となることを防止することができた。
As a result, as shown in FIG. 13, when using HF medium, the number of bacteria after the completion culture Listeria gray (Listeria grayi) is less than 10 4, the result of the rapid test becomes negative, and false-negative became.
In contrast, when using a 5-fold dilution HF medium, bacterial count after the end the culture of this fungus is a 7.8 × 10 8, the result of the rapid test becomes positive, prevents the false-negative We were able to.
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、上記のリステリア属菌用増菌培地において、その他の栄養分等を含有させたり、図１の組成１〜３に示す各成分の数値範囲を様々に組み合わせて別個の組成割合にするなど、適宜変更することが可能である。
It goes without saying that the present invention is not limited to the above embodiments and examples, and various modifications can be made within the scope of the present invention.
For example, in the above-mentioned enrichment medium for Listeria monocytogenes, other nutrients and the like may be contained, or the numerical ranges of the respective components shown in the
本発明は、環境検査、食品検査等において、リステリア属菌を特異的に検出する場合に好適に利用することが可能である。 The present invention can be suitably used when specifically detecting Listeria monocytogenes in environmental inspections, food inspections and the like.
Claims (8)
０．５ｍｇ／リットル以上、５．０ｍｇ／リットル以下のナリジクス酸塩酸塩と、
０．６２ｍｇ／リットル以上、６．２５ｍｇ／リットル以下のアクリフラビン塩酸塩と、を含有することを特徴とする請求項１記載のリステリア属菌用増菌培地。 With lithium chloride of 0.15 g / liter or more and 1.5 g / liter or less,
With 0.5 mg / liter or more and 5.0 mg / liter or less of nalidixate salt,
The enrichment medium for Listeria monocytogenes according to claim 1, which contains acriflavine hydrochloride of 0.62 mg / liter or more and 6.25 mg / liter or less.
０．２５ｇ／リットル以上、２．５ｇ／リットル以下のトリプトンと、
０．２５ｇ／リットル以上、２．５ｇ／リットル以下のラブレコム末と、
０．２５ｇ／リットル以上、２．５ｇ／リットル以下の酵母エキスと、
０．４８ｇ／リットル以上、４．８ｇ／リットル以下のリン酸水素ニナトリウムと、
０．０６ｇ／リットル以上、０．６７ｇ／リットル以下のリン酸ニ水素カリウムと、
０．０５ｇ／リットル以上、０．５ｇ／リットル以下のエスクリンと、
０．０２ｇ／リットル以上、０．２５ｇ／リットル以下のクエン酸アンモニウムと、を含有することを特徴とする請求項２記載のリステリア属菌用増菌培地。 Proteose peptone of 0.25 g / liter or more and 2.5 g / liter or less,
With tryptone of 0.25 g / liter or more and 2.5 g / liter or less,
Labrecom powder of 0.25 g / liter or more and 2.5 g / liter or less,
With yeast extract of 0.25 g / liter or more and 2.5 g / liter or less,
Disodium hydrogen phosphate of 0.48 g / liter or more and 4.8 g / liter or less,
With potassium dihydrogen phosphate of 0.06 g / liter or more and 0.67 g / liter or less,
With esculin of 0.05 g / liter or more and 0.5 g / liter or less,
The enrichment medium for Listeria monocytogenes according to claim 2, which contains ammonium citrate of 0.02 g / liter or more and 0.25 g / liter or less.
０．１５ｇ／リットル以上、０．６ｇ／リットル以下の塩化リチウムと、
０．５ｍｇ／リットル以上、２．０ｍｇ／リットル以下のナリジクス酸塩酸塩と、
０．６２ｍｇ／リットル以上、２．５ｍｇ／リットル以下のアクリフラビン塩酸塩と、
０．２５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下のプロテオースペプトンと、
０．２５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下のトリプトンと、
０．２５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下のラブレコム末と、
０．２５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下の酵母エキスと、
０．４８ｇ／リットル以上、１．９２ｇ／リットル以下のリン酸水素ニナトリウムと、
０．０６ｇ／リットル以上、０．２７ｇ／リットル以下のリン酸ニ水素カリウムと、
０．０５ｇ／リットル以上、０．２ｇ／リットル以下のエスクリンと、
０．０２ｇ／リットル以上、０．１ｇ／リットル以下のクエン酸アンモニウムと、を含有することを特徴とする請求項３記載のリステリア属菌用増菌培地。 Sodium chloride of 1.0 g / liter or more and 4.0 g / liter or less,
Lithium chloride of 0.15 g / liter or more and 0.6 g / liter or less,
With 0.5 mg / liter or more and 2.0 mg / liter or less of nalidixate salt,
With acriflavine hydrochloride of 0.62 mg / liter or more and 2.5 mg / liter or less,
Proteose peptone of 0.25 g / liter or more and 1.0 g / liter or less,
Tryptone of 0.25 g / liter or more and 1.0 g / liter or less,
With Labrecom powder of 0.25 g / liter or more and 1.0 g / liter or less,
With yeast extract of 0.25 g / liter or more and 1.0 g / liter or less,
Disodium hydrogen phosphate of 0.48 g / liter or more and 1.92 g / liter or less,
With potassium dihydrogen phosphate of 0.06 g / liter or more and 0.27 g / liter or less,
With esculin of 0.05 g / liter or more and 0.2 g / liter or less,
The enrichment medium for Listeria monocytogenes according to claim 3, which contains ammonium citrate of 0.02 g / liter or more and 0.1 g / liter or less.
０．３ｇ／リットル以上、０．６ｇ／リットル以下の塩化リチウムと、
１．０ｍｇ／リットル以上、２．０ｍｇ／リットル以下のナリジクス酸塩酸塩と、
１．２５ｍｇ／リットル以上、２．５ｍｇ／リットル以下のアクリフラビン塩酸塩と、
０．５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下のプロテオースペプトンと、
０．５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下のトリプトンと、
０．５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下のラブレコム末と、
０．５ｇ／リットル以上、１．０ｇ／リットル以下の酵母エキスと、
０．９６ｇ／リットル以上、１．９２ｇ／リットル以下のリン酸水素ニナトリウムと、
０．１３ｇ／リットル以上、０．２７ｇ／リットル以下のリン酸ニ水素カリウムと、
０．１ｇ／リットル以上、０．２ｇ／リットル以下のエスクリンと、
０．０５ｇ／リットル以上、０．１ｇ／リットル以下のクエン酸アンモニウムと、を含有することを特徴とする請求項４記載のリステリア属菌用増菌培地。 Sodium chloride of 2.0 g / liter or more and 4.0 g / liter or less,
Lithium chloride of 0.3 g / liter or more and 0.6 g / liter or less,
With 1.0 mg / liter or more and 2.0 mg / liter or less of nalidixate salt,
Acriflavine hydrochloride of 1.25 mg / liter or more and 2.5 mg / liter or less,
With proteopeptone of 0.5 g / liter or more and 1.0 g / liter or less,
Tryptone of 0.5 g / liter or more and 1.0 g / liter or less,
With Labrecom powder of 0.5 g / liter or more and 1.0 g / liter or less,
With yeast extract of 0.5 g / liter or more and 1.0 g / liter or less,
Disodium hydrogen phosphate of 0.96 g / liter or more and 1.92 g / liter or less,
With potassium dihydrogen phosphate of 0.13 g / liter or more and 0.27 g / liter or less,
With esculin of 0.1 g / liter or more and 0.2 g / liter or less,
The enrichment medium for Listeria monocytogenes according to claim 4, which contains ammonium citrate of 0.05 g / liter or more and 0.1 g / liter or less.
A method for culturing Listeria monocytogenes, which comprises selectively growing Listeria monocytogenes using the enrichment medium for Listeria monocytogenes according to any one of claims 1 to 7.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019122010A JP7322550B2 (en) | 2019-06-28 | 2019-06-28 | Enrichment medium for Listeria spp. and method for culturing Listeria spp. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019122010A JP7322550B2 (en) | 2019-06-28 | 2019-06-28 | Enrichment medium for Listeria spp. and method for culturing Listeria spp. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2021007327A true JP2021007327A (en) | 2021-01-28 |
| JP7322550B2 JP7322550B2 (en) | 2023-08-08 |
Family
ID=74198702
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2019122010A Active JP7322550B2 (en) | 2019-06-28 | 2019-06-28 | Enrichment medium for Listeria spp. and method for culturing Listeria spp. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7322550B2 (en) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5145786A (en) * | 1990-09-21 | 1992-09-08 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Preenriched broth medium for the simultaneous sampling of foods for salmonella and listeria |
| JP2004524017A (en) * | 2001-01-05 | 2004-08-12 | アライン ランバッチ | Medium for detecting Listeria bacteria |
| US20080020445A1 (en) * | 2004-02-12 | 2008-01-24 | Olstein Alan D | Selective Growth Medium for Listeria Spp |
| JP2014520536A (en) * | 2011-07-13 | 2014-08-25 | フードチェク・システムズ・インコーポレイテッド | Culture medium, method for culturing Listeria, and method for detecting Listeria |
| JP2016521996A (en) * | 2013-06-19 | 2016-07-28 | サンプルシックス テクノロジーズ，インコーポレイティド | Phage-based bacterial detection assay |
-
2019
- 2019-06-28 JP JP2019122010A patent/JP7322550B2/en active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5145786A (en) * | 1990-09-21 | 1992-09-08 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Preenriched broth medium for the simultaneous sampling of foods for salmonella and listeria |
| JP2004524017A (en) * | 2001-01-05 | 2004-08-12 | アライン ランバッチ | Medium for detecting Listeria bacteria |
| US20080020445A1 (en) * | 2004-02-12 | 2008-01-24 | Olstein Alan D | Selective Growth Medium for Listeria Spp |
| JP2014520536A (en) * | 2011-07-13 | 2014-08-25 | フードチェク・システムズ・インコーポレイテッド | Culture medium, method for culturing Listeria, and method for detecting Listeria |
| JP2016521996A (en) * | 2013-06-19 | 2016-07-28 | サンプルシックス テクノロジーズ，インコーポレイティド | Phage-based bacterial detection assay |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MISCHA E. FRIEDMAN AND WILLIAM G. ROESSLER, JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 82, no. 4, JPN6023015252, October 1961 (1961-10-01), pages 528 - 533, ISSN: 0005044373 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP7322550B2 (en) | 2023-08-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Williams et al. | Energy sources of non-starter lactic acid bacteria isolated from Cheddar cheese | |
| KR101602286B1 (en) | Culture medium, method for culturing listeria, and method for detecting listeria | |
| Arioli et al. | Streptococcus thermophilus urease activity boosts Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus homolactic fermentation | |
| JP5940780B2 (en) | Lactic acid bacteria isolated from traditional fermented foods in Ishikawa Prefecture, their cultures and their use | |
| CN106459882B (en) | Use of uric acid for culturing oxygen tension sensitive bacteria | |
| Sasaki et al. | NADH oxidase of Streptococcus thermophilus 1131 is required for the effective yogurt fermentation with Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 2038 | |
| Schneebeli et al. | A defined, glucose-limited mineral medium for the cultivation of Listeria spp | |
| Breidt et al. | Characterization of cucumber fermentation spoilage bacteria by enrichment culture and 16S rDNA cloning | |
| Leclercq | Atypical colonial morphology and low recoveries of Listeria monocytogenes strains on Oxford, PALCAM, Rapid'L. mono and ALOA solid media | |
| Penna et al. | Production of nisin by Lactococcus lactis in media with skimmed milk | |
| US20200157490A1 (en) | Polyvalent culture medium for anaerobic bacteria under aerobic conditions | |
| JP7322550B2 (en) | Enrichment medium for Listeria spp. and method for culturing Listeria spp. | |
| Beumer et al. | Optimization of haemolysis in enhanced haemolysis agar (EHA) _a selective medium for the isolation of Listeria monocytogenes | |
| CN114276951B (en) | Lactobacillus plantarum capable of producing antibacterial peptide with broad-spectrum antibacterial activity | |
| Donnelly et al. | Conventional methods to detect and isolate Listeria monocytogenes | |
| RU2435845C1 (en) | METHOD OF Shewanella BACTERIA RECOVERY AND IDENTIFICATION | |
| JP5658973B2 (en) | Medium for detecting lactic acid bacteria | |
| WO2015111598A1 (en) | Method for culturing lactic acid bacteria at high concentration | |
| Thierry et al. | Influence of thermophilic lactic acid bacteria strains on propionibacteria growth and lactate consumption in an Emmental juice-like medium | |
| CA2549706A1 (en) | Rapid enrichment for listeria | |
| US6165776A (en) | Selective and differential medium for isolation of Listeria Monocytogenes | |
| CN114752525B (en) | Lactobacillus casei with blood pressure lowering effect and application thereof | |
| CN113999796B (en) | Universal separation culture medium for improving marine rose bacilli and application thereof | |
| JP2012170378A (en) | New lactic acid bacterium | |
| Green | Utilization of Protective Cultures to Reduce Late Gas Formation by Paucilactobacillus wasatchensis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220511 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230425 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230530 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230627 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230710 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7322550 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |