JP2020537487A - メチローム解析を用いる癌の検出及び分類 - Google Patents

メチローム解析を用いる癌の検出及び分類 Download PDF

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Abstract

対象における癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出する方法であって、対象由来のセルフリーＤＮＡの試料を準備する工程と、上記試料をライブラリ調製に供して、引き続く上記セルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定を可能にする工程と、第１量のフィラーＤＮＡを上記試料に加え、次いで任意選択的に上記試料を変性する工程であって、上記フィラーＤＮＡの少なくとも一部分がメチル化されている工程と、メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を使用して、セルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、捕捉された上記セルフリーのメチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来並びに別個の癌種及び亜型を有する個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程とを備える方法が本願明細書に記載される。【選択図】図１（１）

Description

関連出願
本願は、２０１７年７月１２日出願の米国仮特許出願第６２／５３１５２７号に基づく優先権を主張する。この米国仮特許出願は、参照により本願明細書に援用される。
技術分野
本発明は、癌の検出及び分類、より具体的には癌の検出及び分類のためのメチローム解析の使用に関する。
バイオマーカーのソースとしての循環セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の使用は、腫瘍学において急速に勢いを持ってきている［１］。バイオマーカーとしてのｃｆＤＮＡのＤＮＡメチル化マッピングの使用は、液体細胞診の分野で大きなインパクトを有することができよう。というのも、ｃｆＤＮＡのＤＮＡメチル化マッピングの使用により、低侵襲的に、原発組織の特定を可能にし［２］、癌の型及び亜型の分類を可能にし、そして癌患者を階層化することができると思われるからである［３］。さらには、ｃｆＤＮＡの全ゲノムＤＮＡメチル化マッピングを使用することで、疾患の証拠となるＸ線像がないステージＩ〜ＩＩＩの癌を有する患者において循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を検出する際の重大な感度の問題を克服することができよう。既存のｃｔＤＮＡ検出方法は、変異を配列決定することに基づいており、腫瘍と健常な循環ｃｆＤＮＡとの間を見分けるために利用可能な反復突然変異の数が限られていることに一部は起因して、感度に限界がある［４、５］。他方、全ゲノムＤＮＡメチル化マッピングは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を健常な循環セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）から見分けるために使用されてもよい多くのエピジェネティックな変異を活用する。例えば、上衣腫等のいくつかの腫瘍型は、何ら顕著な再発性体細胞変異もなく広範なＤＮＡメチル化異常を有することができる［６］。
セルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉する特定の方法が国際公開第２０１７／１９０２１５号パンフレットに記載されており、この特許文献は、参照により援用される。
国際公開第２０１７／１９０２１５号パンフレット
一態様では、対象における癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出する方法であって、対象由来のセルフリーＤＮＡの試料を準備する工程と、上記試料をライブラリ調製に供して、引き続く上記セルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定を可能にする工程と、第１量のフィラーＤＮＡを上記試料に加え、次いで任意選択的に上記試料を変性する工程であって、上記フィラーＤＮＡの少なくとも一部分がメチル化されている工程と、メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を使用して、セルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、捕捉された上記セルフリーのメチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程とを備える方法が提供される。
一態様では、癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出し、癌亜型を特定する方法であって、対象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定データを受け取る工程と、捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程と、癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合に、上記比較に基づいて原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定する工程とを備える方法が提供される。
一態様では、癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出し、癌亜型を特定するコンピュータ実装方法であって、少なくとも１つのプロセッサで、対象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定データを受け取る工程と、上記少なくとも１つのプロセッサで、捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、上記少なくとも１つのプロセッサで、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定し、癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合に、上記比較に基づいて原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定する工程とを備える方法が提供される。
一態様では、プロセッサ及びこのプロセッサに接続されたメモリを有する汎用性コンピュータと組み合わせて使用するためのコンピュータプログラム製品であって、コンピュータメカニズムがエンコードされたコンピュータ可読記憶媒体を含み、上記コンピュータプログラムメカニズムが上記コンピュータの上記メモリにローディングされ、上記コンピュータに本願明細書に記載される方法を実行させてもよいコンピュータプログラム製品が提供される。
一態様では、本願明細書に記載されるコンピュータプログラム製品を保存するためのデータ構造が保存されたコンピュータ可読媒体が提供される。
一態様では、癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出して癌亜型を特定するためのデバイスであって、少なくとも１つのプロセッサと、上記少なくとも１つのプロセッサと通信している電子メモリとを備え、上記電子メモリは、上記少なくとも１つのプロセッサで実行される場合に、上記少なくとも１つのプロセッサに、対象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定データを受け取ることと、捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較することと、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定し、癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合、上記比較に基づいて、原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定することとを実行させるプロセッサ実行可能なコードを保存するデバイスが提供される。
一態様では、癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出して、２以上の可能性のある器官から上記癌細胞が発生した上記癌の場所を決定する方法であって、対象由来のセルフリーＤＮＡの試料を準備する工程と、メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を使用して、上記試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、捕捉された上記セルフリーのメチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列パターンを対照個体の２以上の母集団のＤＮＡ配列パターンと比較する工程であって、上記２以上の母集団の各々は、異なる器官に限局性癌を有する工程と、上記セルフリーＤＮＡのメチル化のパターンと上記２以上の母集団のうちの１つのメチル化のパターンとの間の統計的に有意な類似性に基づいて、どの器官で上記癌細胞が発生したかを決定する工程とを備える方法が提供される。
本発明の好ましい実施形態のこれらの特徴及び他の特徴は、添付の図面が参照される以下の詳細な説明においてより明らかとなるであろう。
図１は、ｃｆＤＮＡのメチローム解析が少ない量のインプットＤＮＡの中のｃｔＤＮＡを濃縮し検出するための高感度の手法であることを示す。Ａ）ｃｔＤＮＡの濃度（列）、調べられたＤＭＲ数（行）、及びシークエンシング深度（ｘ軸）の関数としての少なくとも１つのエピ変異を検出する確率のコンピュータシミュレーション。Ｂ）血漿ｃｆＤＮＡを模倣するように断片化されたＨＣＴ１１６細胞系由来の１〜１００ｎｇのインプットＤＮＡに対するＤＮＡメチル化シグナル間の全ゲノムピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）相関。各濃度は、２つの生物的複製物を有する。 図１は、ｃｆＤＮＡのメチローム解析が少ない量のインプットＤＮＡの中のｃｔＤＮＡを濃縮し検出するための高感度の手法であることを示す。Ｃ）ＨＣＴ１１６由来の異なる濃度のインプットＤＮＡからのｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑから得られるＤＮＡメチル化プロファイル（緑色のトラック）、並びにＥＮＣＯＤＥ（ＥＮＣＳＲ０００ＤＦＳ）から得られるＲＲＢＳ（Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）ＨＣＴ１１６データ及びＧＥＯ（ＧＳＭ１４６５０２４）から得られるＷＧＢＳ（Ｗｈｏｌｅ−Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）ＨＣＴ１１６データ。ヒートマップ（ＲＲＢＳトラック）について、黄色はメチル化を意味し、青色は非メチル化を意味し、灰色はカバレッジなしを意味する。 図１は、ｃｆＤＮＡのメチローム解析が少ない量のインプットＤＮＡの中のｃｔＤＮＡを濃縮し検出するための高感度の手法であることを示す。Ｄ〜Ｅ）多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系ＭＭ１．Ｓ中へのＣＲＣ細胞系ＨＣＴ１１６の段階希釈。ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑが純粋ＨＣＴ１１６ ＤＮＡ（１００％ＣＲＣ）、純粋ＭＭ１．Ｓ ＤＮＡ（１００％ＭＭ）並びにＭＭ ＤＮＡ中に希釈された１０％、１％、０．１％、０．０１％、及び０．００１％ＣＲＣ ＤＮＡにおいて実施された。すべてのＤＮＡが血漿ｃｆＤＮＡを模倣するように断片化された。本発明者らは、実測と予測の（Ｄ）ＤＭＲ数及び（Ｅ）これらのＤＭＲ内のＤＮＡメチル化シグナル（ＲＰＫＭ単位）にほぼ完全な線形相関（ｒ２＝０．９９、ｐ＜０．０００１）を認めた。 図１は、ｃｆＤＮＡのメチローム解析が少ない量のインプットＤＮＡの中のｃｔＤＮＡを濃縮し検出するための高感度の手法であることを示す。Ｆ）同じ希釈系列において、既知の体細胞変異は、バックグラウンドシークエンサー及びポリメラーゼエラー率を超える超深度（＞１０，０００×）標的配列決定によって１／１００対立遺伝子割合においてのみ検出可能である。ＣＲＣ細胞系における各変異の部位に各塩基又は挿入／欠失を含むリードの割合が示されている。Ｇ）２人の結直腸癌患者からの患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）を有するマウスの血漿中の総ｃｆＤＮＡ（ヒト＋マウス）に対する百分率としてのｃｔＤＮＡ（ヒト）の頻度。 図２は、血漿ｃｆＤＮＡのメチローム解析が腫瘍の分類を可能にすることを示す。Ａ）癌の分類のための機械学習分類器構築の手法を示す概略図。 図２は、血漿ｃｆＤＮＡのメチローム解析が腫瘍の分類を可能にすることを示す。Ｂ）多クラスエラスティックネット機械学習分類器内に含まれるＤＭＲのヒートマップ。これらの分類器は、健康な提供者由来の血漿ＤＮＡ試料（ｎ＝２４）、肺癌（ｎ＝２５）、乳癌（ｎ＝２５）、結直腸癌（ｎ＝２３）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（ｎ＝２８）、及び多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）（ｎ＝７１）由来の血漿ＤＮＡ試料で訓練された。階層的クラスタ分析方法：Ｗａｒｄ。 図２は、血漿ｃｆＤＮＡのメチローム解析が腫瘍の分類を可能にすることを示す。Ｃ）モデルの１０％又は２５％において特定された癌種関連ＤＭＲのｔＳＮＥ（ｔ−Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ：ｔ分布型確率的近傍埋め込み）による２Ｄ視覚化。 図２は、血漿ｃｆＤＮＡのメチローム解析が腫瘍の分類を可能にすることを示す。Ｄ）血漿ｃｆＤＮＡメチル化ベースの多癌分類器についての性能測定基準。受信者オペレータ曲線下部面積（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｏｒ ｃｕｒｖｅ：ａｕＲＯＣ）が、エラスティックネット機械学習分類器の５０分割生成の後の各癌種及び健康な提供者についてｙ軸に示されている。 図３は、独立のコホートにおける多癌分類器の検証を示す。Ａ）肺癌（ＬＵＣ）（ｎ＝５５ＬＵＣ対ｎ＝９７その他）、ＡＭＬ（ｎ＝３５ＡＭＬ対ｎ＝１１７その他）、及び健康な提供者（ｎ＝６２健康な提供者対ｎ＝９０その他）のコホートでの多癌分類器の独立の検証についてＲＯＣ曲線が示されている。 図３は、独立のコホートにおける多癌分類器の検証を示す。Ｂ）早期ＬＵＣ（ｎ＝３２ステージＩ〜ＩＩのＬＵＣ対ｎ＝９７その他）及び末期ＬＵＣ（ｎ＝２３ステージＩＩＩ〜ＩＶ ＬＵＣ対ｎ＝９７その他）での多癌分類器の独立の検証についてのＲＯＣ曲線が示されている。 図４は、血漿ｃｆＤＮＡのメチローム解析が腫瘍亜型の分類を可能にすることを示す。Ａ）癌亜型関連ＤＭＲのｔＳＮＥ（ｔ分布型確率的近傍埋め込み）による２Ｄ視覚化。乳癌亜型は、別個の遺伝子発現パターン及び転写因子活性（ＥＲ状態）並びに別個の腫瘍コピー数異常（ＨＥＲ２状態）を有する腫瘍を有する患者を見分ける能力を示す。ＡＭＬ亜型は、別個の再構成（ＦＬＴ３状態）を有する腫瘍を有する患者を見分ける能力を示す。多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）亜型は、別個の点変異（ＩＤＨ遺伝子変異状態）を有する腫瘍を有する患者を見分ける能力を示す。肺癌亜型は、予後的及び治療上の影響を有する別個の組織学（腺癌対扁平上皮癌対小細胞癌）を有する腫瘍を有する患者を見分ける能力を示す。 図４は、血漿ｃｆＤＮＡのメチローム解析が腫瘍亜型の分類を可能にすることを示す。Ｂ）乳癌血漿試料において３つの乳癌亜型の正確な区別を可能にする上位ＤＭＲを示すヒートマップ。 図４は、血漿ｃｆＤＮＡのメチローム解析が腫瘍亜型の分類を可能にすることを示す。Ｃ）ＡＭＬ患者血漿試料においてＦＬＴ３−ＩＴＤ状態の正確な区別を可能にする上位ＤＭＲを示すヒートマップ。 図４は、血漿ｃｆＤＮＡのメチローム解析が腫瘍亜型の分類を可能にすることを示す。Ｄ）多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）患者血漿試料においてＩＤＨ遺伝子変異状態の正確な区別を可能にする上位ＤＭＲを示すヒートマップ。 図４は、血漿ｃｆＤＮＡのメチローム解析が腫瘍亜型の分類を可能にすることを示す。Ｅ）肺癌血漿試料において３つの肺癌組織学の正確な区別を可能にする上位ＤＭＲを示すヒートマップ。 図５は、本願明細書に記載される１以上の実施形態を実行するためのプラットフォームを提供するように好適に構成されたコンピュータデバイス、並びに関連する通信ネットワーク、デバイス、ソフトウェア及びファームウェアを示す。 図６は、配列決定飽和分析（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）及び品質管理を示す。Ａ）この図は、血漿ｃｆＤＮＡを模倣するように断片化されたＨＣＴ１１６ ＤＮＡからの各インプット濃度に対する各複製物からのｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑデータを分析するＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＭＥＤＩＰＳの飽和分析の結果を示す。 図６（１）の続きである。 図６（２）の続きである。 図６（３）の続きである。 図６（４）の続きである。 図６は、配列決定飽和分析及び品質管理を示す。Ｂ）ＨＣＴ１１６細胞系の４つの開始ＤＮＡ濃度（１００ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ、及び１ｎｇ）の２つの複製物においてプロトコルが試験された。反応特異度は、メチル化及び非メチル化添加シロイヌナズナＤＮＡを使用して計算された。濃縮倍率比は、断片化ＨＣＴ１１６ ＤＮＡのゲノム領域（メチル化精巣特異的Ｈ２Ｂ、ＴＳＨ２Ｂ０及び非メチル化ヒトＤＮＡ領域（ＧＡＰＤＨプロモーター）のプライマー）を用いて計算された。水平の点線は２５の濃縮倍率比閾値を示す。エラーバーは、±１ｓ．ｅ．ｍを表す。Ｃ）配列決定試料のＣｐＧ濃縮スコアは、インプット対照と比べて免疫沈降試料からのゲノム領域内のＣｐＧの堅牢な濃縮を示す。ＣｐＧ濃縮スコアは、上記領域のＣｐＧの相対頻度をヒトゲノムのＣｐＧの相対頻度で除算することにより得られた。エラーバーは、±１ｓ．ｅ．ｍを表す。
以下の説明では、本発明の十分な理解を提供するために、多くの特定の細部が提示される。しかしながら、本発明はこれらの特定の細部なしで実施されてもよいということは理解される。
ＤＮＡメチル化プロファイルは、細胞型特異的であり、癌では乱れている。最少量の循環セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のメチローム解析のために設計された堅牢で高感度の方法を使用して、本発明者らは、複数の腫瘍型を互いから、及び健康な個体から見分ける数千の可変メチル化領域（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ：ＤＭＲ）を特定した。ｃｆＤＮＡのメチローム解析は、高感度であり、早期患者において循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を検出することに好適である。ｃｆＤＮＡメチロームを使用する機械学習由来の分類器は、交差検証に基づいて、５つの癌種を有する患者及び健康な提供者由来の１９６個の血漿試料を正しく分類することができた。独立の検証では、血漿ｃｆＤＮＡ中で特定された同じＤＭＲを使用して、上記分類器は、ＡＭＬ、肺癌、及び健康な提供者、並びに早期及び末期の肺癌の両方を正しく分類することができた。それゆえ、ｃｆＤＮＡのメチローム解析は、ｃｔＤＮＡの非侵襲性の早期検出のために使用することができ、癌種を堅牢に分類することができる。
一態様では、対象における癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出する方法であって、対象由来のセルフリーＤＮＡの試料を準備する工程と、上記試料をライブラリ調製に供して、引き続く上記セルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定を可能にする工程と、第１量のフィラーＤＮＡを上記試料に加え、次いで任意選択的に上記試料を変性する工程であって、上記フィラーＤＮＡの少なくとも一部分がメチル化されている工程と、メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を使用して、セルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、捕捉された上記セルフリーのメチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程とを備える方法が提供される。
出願人の共有に係る出願である、２０１６年５月３日出願の米国仮特許出願第６２／３３１，０７０号及び２０１７年５月３日出願の国際特許、出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１７／０００１０８号は、セルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉するための方法を記載しており、これらは、参照により本願明細書に援用したものとする。
癌は、慣例で起源組織によって、例えば、結直腸癌、乳癌、肺癌等と分類されてきた。臨床腫瘍学の現在の実務では、癌の亜型を種々の分子的、発生的及び機能的基礎によって見分けることができることが、ますます重要になってきている。治療上の決定は正確な癌の亜型に依ることが多く、臨床医が、治療の開始に先立って亜型を特定することが必要である場合がある。治療上の決定に影響を及ぼしうる癌の細分類の例としては、ステージ（例えば、外科手術で処置される早期肺癌対化学療法で処置される末期肺癌）、組織学（組織像）（例えば、肺癌における小細胞癌対腺癌対扁平上皮癌）、遺伝子発現パターン又は転写因子活性（例えば、乳癌におけるＥＲ状態）、コピー数異常（例えば、乳癌におけるＨＥＲ２状態）、特異的再構成（例えば、ＡＭＬにおけるＦＬＴ３）、特異的遺伝子点変異状態（例えば、ＩＤＨ遺伝子点変異）、及びＤＮＡメチル化パターン（例えば、脳癌におけるＭＧＭＴ遺伝子プロモーターのメチル化）が挙げられる（しかしこれらに限定されない）。
本願明細書に記載される方法は、実に様々な癌に適用可能であり、それら癌としては、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ｃｎｓ腫瘍、乳癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎癌、咽頭癌及び下咽頭癌、白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病）、肝癌、肺癌（非小細胞、小細胞、肺カルチノイド）、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔癌及び副鼻腔癌、上咽頭（鼻咽頭）癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔癌及び中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、陰茎癌、下垂体部腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、成人軟部組織癌（成人軟部肉腫）、皮膚癌（基底細胞癌及び扁平上皮癌、黒色腫、メルケル細胞癌）、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣内癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びそれに続くＳａｎｇｅｒ（サンガー）シークエンシング等、種々の配列決定技法が当業者に知られている。高スループット配列決定としても知られる次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技法も利用可能であり、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技法としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シークエンシング、Ｒｏｃｈｅ ４５４シークエンシング、Ｉｏｎ ｔｏｒｒｅｎｔ：Ｐｒｏｔｏｎ／ＰＧＭシークエンシング、ＳＯＬｉＤシークエンシング等、種々の配列決定技術が挙げられる。ＮＧＳは、従来使用されているＳａｎｇｅｒシークエンシングよりもはるかに速くて安価に、ＤＮＡ及びＲＮＡの配列決定を可能にする。いくつかの実施形態では、上記配列決定は、ショートリード配列決定のために最適化されている。
用語「対象」は、本願明細書で使用する場合、動物界の任意のメンバー、好ましくはヒト、最も好ましくは前立腺癌を有しているか、前立腺癌を有していたか、又は前立腺癌を有していると疑われるヒトを指す。
セルフリーのメチル化ＤＮＡは、血流の中を自由に循環しているＤＮＡであって、ＤＮＡの種々の既知の領域でメチル化されているＤＮＡである。セルフリーのメチル化ＤＮＡを分析するために、試料、例えば、血漿試料が採取されてもよい。従って、いくつかの実施形態では、上記試料は、対象の血液又は血漿である。
本願明細書で使用する場合、「ライブラリ調製」は、リスト末端修復（ｌｉｓｔ ｅｎｄ−ｒｅｐａｉｒ）、Ａテーリング、アダプターライゲーション、又は後続のＤＮＡ配列決定を可能にするためにセルフリーＤＮＡ上で行われる任意の他の調製を含む。
本願明細書で使用する場合、「フィラーＤＮＡ」は非コードＤＮＡとすることができ、又はフィラーＤＮＡは増幅産物（アプリコン）からなることができる。
ＤＮＡ試料は、例えば、十分な熱を使用して変性されていてもよい。
いくつかの実施形態では、上記比較工程は、統計的分類器を使用するフィットに基づく。ＤＮＡメチル化データを使用する統計的分類器が、試料を癌種又は亜型等の特定の病状に振り分けるために使用されてもよい。癌種又は亜型の分類の目的では、分類器は、統計モデル内で１以上のＤＮＡメチル化変数（すなわち、特徴量）からなるであろうし、統計モデルの出力は、別個の病状を見分けるための１以上の閾値を有することになろう。統計的分類器で使用される特定の特徴量（１若しくは複数）及び閾値（１若しくは複数）は、癌種若しくは亜型の先行知識に、最も情報が豊富であると思われる特徴量の先行知識に、機械学習に、又はこれらの手法のうちの２以上のものの組み合わせに由来することができる。
いくつかの実施形態では、上記分類器は機械学習由来である。好ましくは、上記分類器は、エラスティックネット（ｅｌａｓｔｉｃ ｎｅｔ）分類器、ｌａｓｓｏ、サポートベクターマシン、ランダムフォレスト、又はニューラルネットワークである。
分析されるゲノム空間は、全ゲノムであってもよく、又は好ましくは調節領域（すなわち、ＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー（ＦＡＮＴＯＭ５ ｅｎｈａｎｃｅｒ）、ＣｐＧアイランド（ＣｐＧ Ｉｓｌａｎｄ）、ＣｐＧショア（ＣｐＧ ｓｈｏｒｅ）及びＣｐＧシェルフ（ＣｐＧ Ｓｈｅｌｆ））に限定されてもよい。
好ましくは、回収された添加メチル化ＤＮＡの百分率は、プルダウン効率変数を制御するための共変量として含まれる。
複数の癌種（又は亜型）を互いから見分けることができる分類器のために、分類器は、好ましくは、注目する各種（又は亜型）の一対比較からの可変メチル化領域からなるであろう。
いくつかの実施形態では、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列は、健康な個体と癌性個体との間の可変メチル化領域（ＤＭＲ）のデータベースに含まれる。
いくつかの実施形態では、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列は、血清、脳脊髄液、尿糞便、痰、胸水、腹水、涙、汗、パップスメア液、内視鏡検査ブラッシング液等の体液から、好ましくは血漿からのセルフリーＤＮＡ由来のＤＮＡにおいて健康な個体と癌性個体との間で差次的にメチル化されている対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列に限定される。
いくつかの実施形態では、上記試料は、１００ｎｇ未満、７５ｎｇ未満、又は５０ｎｇ未満のセルフリーＤＮＡを有する。
いくつかの実施形態では、上記第１量のフィラーＤＮＡは、約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のメチル化フィラーＤＮＡを含み、残部は非メチル化フィラーＤＮＡであり、好ましくは５％〜５０％、１０％〜４０％、又は１５％〜３０％がメチル化フィラーＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、上記第１量のフィラーＤＮＡは、２０ｎｇ〜１００ｎｇ、好ましくは３０ｎｇ〜１００ｎｇ、より好ましくは５０ｎｇ〜１００ｎｇである。
いくつかの実施形態では、上記試料由来のセルフリーＤＮＡ及び上記第１量のフィラーＤＮＡは、合わせて少なくとも５０ｎｇの総ＤＮＡ、好ましくは少なくとも１００ｎｇの総ＤＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、上記フィラーＤＮＡは、５０ｂｐ〜８００ｂｐ長、好ましくは１００ｂｐ〜６００ｂｐ長、及びより好ましくは２００ｂｐ〜６００ｂｐ長である。
いくつかの実施形態では、上記フィラーＤＮＡは二本鎖である。上記フィラーＤＮＡは二本鎖である。例えば、フィラーＤＮＡは、ジャンクＤＮＡであってもよい。また、フィラーＤＮＡは、内在ＤＮＡでも外来ＤＮＡでもよい。例えば、フィラーＤＮＡは非ヒトＤＮＡであり、好ましい実施形態では、λＤＮＡである。本願明細書で使用する場合、「λＤＮＡ」は腸内細菌ファージλＤＮＡを指す。いくつかの実施形態では、フィラーＤＮＡは、ヒトＤＮＡに対するアラインメントを有しない。
いくつかの実施形態では、上記結合剤は、メチルＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質である。１つのこのような例示的タンパク質はＭＢＤ２タンパク質である。本願明細書で使用する場合、「メチルＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）」は、およそ７０残基長でありかつ１以上の対称的メチル化ＣｐＧを含むＤＮＡに結合するタンパク質及び酵素の特定のドメインを指す。ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ４及びＢＡＺ２のＭＢＤは、ＤＮＡへの結合を媒介し、ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１及びＭＢＤ２の場合には、メチル化ＣｐＧへの結合を優先的に媒介する。ヒトタンパク質ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３及びＭＢＤ４は、メチルＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）の各々における存在によって関連づけられる核タンパク質のファミリーを含む。これらのタンパク質の各々は、ＭＢＤ３を除いて、メチル化ＤＮＡに特異的に結合することができる。
他の実施形態では、上記結合剤は抗体であり、セルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉することは、その抗体を使用してセルフリーのメチル化ＤＮＡを免疫沈降させることを含む。本願明細書で使用する場合、「免疫沈降」は、特定の抗原（ポリペプチド及びヌクレオチド等）に特異的に結合する抗体を使用してその抗原を溶液から沈降させる技法を指す。このプロセスは、特定のタンパク質又はＤＮＡを試料から単離及び濃縮するために使用することができ、そして抗体がその手順のある時点で固体基質に結合されることを必要とする。固体基質としては、例えばビーズ、例えば磁気ビーズが挙げられる。他の種類のビーズ及び固体基質は当該技術分野で公知である。
１つの例示的抗体は５−ＭｅＣ抗体である。免疫沈降手順については、いくつかの実施形態では、少なくとも０．０５μｇのこの抗体が試料に加えられ、より好ましい実施形態では、少なくとも０．１６μｇのこの抗体が試料に加えられる。免疫沈降反応を確認するために、いくつかの実施形態では、本願明細書に記載される方法は、第２量の対照ＤＮＡを上記試料に加える工程をさらに備える。
いくつかの実施形態では、当該方法は、免疫沈降反応を確認するために、第２量の対照ＤＮＡを上記試料に加える工程をさらに備える。
本願明細書で使用する場合、「対照」は陽性対照及び陰性対照の両方、又は少なくとも陽性対照を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、当該方法は、セルフリーのメチル化ＤＮＡの捕捉を確認するために、第２量の対照ＤＮＡを上記試料に加える工程をさらに備える。
いくつかの実施形態では、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定することは、上記原発癌細胞組織を特定することをさらに備える。
いくつかの例では、腫瘍組織サンプリングは、困難である場合があり、又は重大なリスクを伴う場合があり、いずれの場合も、腫瘍組織サンプリングの必要なしに癌を診断及び／又は細分類することが所望される可能性がある。例えば、肺腫瘍組織サンプリングは、縦隔鏡検査、開胸術、又は経皮の針生検等の侵襲的手技を必要とする可能性があり、これらの手技・手順は、入院、胸腔チューブ、人工呼吸、抗生物質、又は他の医療行為の必要を生じる可能性がある。一部の個体は、併存疾患のため、又は好みによって腫瘍組織サンプリングのために必要な侵襲的手技を受けない可能性がある。いくつかの例では、腫瘍組織の調達のための現実の手順は、疑われる癌亜型に依存する可能性がある。他の例では、癌亜型は、同じ個体の中で経時的に発生する可能性があり、侵襲的腫瘍組織サンプリング手法を用いる連続的な評価は、実施不可能であることが多く、患者に十分に許容されるものではない。従って、血液検査による非侵襲的な癌の細分類は、臨床腫瘍学の実務において多くの有利な応用例を有することができよう。
従って、いくつかの実施形態では、上記原発癌細胞組織を特定することは、癌亜型を特定することをさらに備える。好ましくは、癌亜型は、ステージ（例えば、外科手術で処置される早期肺癌対化学療法で処置される末期肺癌）、組織学（例えば、肺癌における小細胞癌対腺癌対扁平上皮癌）、遺伝子発現パターン又は転写因子活性（例えば、乳癌におけるＥＲ状態）、コピー数異常（例えば、乳癌におけるＨＥＲ２状態）、特異的再構成（例えば、ＡＭＬにおけるＦＬＴ３）、特異的遺伝子点変異状態（例えば、ＩＤＨ遺伝子点変異）、及びＤＮＡメチル化パターン（例えば、脳癌におけるＭＧＭＴ遺伝子プロモーターのメチル化）に基づいて癌を識別する。
いくつかの実施形態では、工程（ｆ）の比較は全ゲノムにわたって実施される。
他の実施形態では、工程（ｆ）の比較は、全ゲノムから、特定の調節領域へ、例えば、限定されないが、ＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー、ＣｐＧアイランド、ＣｐＧショア、ＣｐＧシェルフ、又はこれらのいずれかの組み合わせに限定される。
いくつかの実施形態では、特定の工程は、コンピュータプロセッサにより実施される。
一態様では、癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出し、癌亜型を特定する方法であって、対象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定データを受け取る工程と、捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程と、癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合に、上記比較工程に基づいて原発の上記癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定する工程とを備える方法が提供される。
一態様では、癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出して、２以上の可能性のある器官から上記癌細胞が発生した上記癌の場所を決定する方法であって、対象由来のセルフリーＤＮＡの試料を準備する工程と、メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を使用して、上記試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、捕捉された上記セルフリーのメチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列パターンを対照個体の２以上の母集団のＤＮＡ配列パターンと比較する工程であって、上記２以上の母集団の各々は、異なる器官に限局性癌を有する工程と、上記セルフリーＤＮＡのメチル化のパターンと上記２以上の母集団うちの１つのメチル化のパターンとの間の統計的に有意な類似性に基づいて、どの器官で上記癌細胞が発生したかを決定する工程とを備える方法が提供される。
本発明のシステム及び方法は種々の実施形態で実施されてよい。好適に構成されたコンピュータデバイス、及び関連する通信ネットワーク、デバイス、ソフトウェア及びファームウェアは、１以上の上記の実施形態を実行するためのプラットフォームを提供してもよい。例として、図５は、記憶装置１０４に、及びランダムアクセスメモリ１０６に接続された中央処理装置（「ＣＰＵ」）１０２を備えてもよい一般的なコンピュータデバイス１００を示す。ＣＰＵ１０２は、オペレーティングシステム１０１、アプリケーション・プログラム１０３、及びデータ１２３を処理してもよい。オペレーティングシステム１０１、アプリケーション・プログラム１０３、及びデータ１２３は、記憶装置１０４に保存され、必要に応じてメモリ１０６にロードされてもよい。コンピュータデバイス１００は、ＣＰＵ１０２から集中的な画像処理計算の負荷を減らしてこれらの計算をＣＰＵ１０２と並行して実行するために、ＣＰＵ１０２に、及びメモリ１０６に作動可能に接続されているグラフィック処理装置（ＧＰＵ）１２２をさらに備えてもよい。操作者１０７は、ビデオインターフェース１０５によって接続されたビデオディスプレー１０８、並びにＩ／Ｏインターフェース１０９によって接続されたキーボード１１５、マウス１１２、及びディスクドライブ又は半導体ドライブ１１４等の種々の入／出力装置を使用して、コンピュータデバイス１００と対話してもよい。公知のように、マウス１１２は、ビデオディスプレー１０８におけるカーソルの移動を制御し、ビデオディスプレー１０８に現れる種々のグラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）コントロールをマウスボタンで操作するように構成されていてもよい。ディスクドライブ又は半導体ドライブ１１４は、コンピュータ可読媒体１１６を受け入れるように構成されていてもよい。コンピュータデバイス１００は、ネットワークインターフェース１１１を介してネットワークの一部を形成して、コンピュータデバイス１００が他の好適に構成されたデータ処理システム（図示せず）と通信することを可能にしてもよい。種々のソースからの入力を受信するために、１以上の異なる種類のセンサ１３５が使用されてもよい。
本発明のシステム及び方法は、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、タブレットコンピュータ又はワイヤレスの手持ち式のものを含めた事実上任意の態様のコンピュータデバイスで実施されてよい。本発明のシステム及び方法は、１以上のコンピュータデバイスに本発明に係る方法における種々の工程の各々を実行することを可能にするためのコンピュータプログラムコードを備えるコンピュータ可読／可用媒体として実行されてもよい。複数のコンピュータデバイスが全体のオペレーションを実施する場合には、このオペレーションの種々の工程を分散させるために、それらのコンピュータデバイスはネットワーク化される。コンピュータ可読媒体又はコンピュータ可用媒体という用語は、プログラムコードの物理的実施形態の任意のタイプの１以上を含むということは理解される。特に、このコンピュータ可読／可用媒体は、１以上の携帯用の記憶用製品（例えば光ディスク、磁気ディスク、テープ等）に、コンピュータ及び／又は記憶システムに付随したメモリ等の計算装置の１以上のデータ記憶部分に内蔵されたプログラムコードを含むことができる。
一態様では、癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出し、癌亜型を特定するコンピュータ実装方法であって、少なくとも１つのプロセッサで、対象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定データを受け取る工程と、上記少なくとも１つのプロセッサで、捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、上記少なくとも１つのプロセッサで、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程と、癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合、上記比較工程に基づいて上記原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定する工程とを備える方法が提供される。
一態様では、プロセッサ及びこのプロセッサに接続されたメモリを有する汎用性コンピュータと組み合わせて使用するためのコンピュータプログラム製品であって、コンピュータメカニズムがエンコードされたコンピュータ可読記憶媒体を含み、上記コンピュータプログラムメカニズムが上記コンピュータの上記メモリにローディングされ、上記コンピュータに、本願明細書に記載される方法を実行させてもよいコンピュータプログラム製品が提供される。
一態様では、本願明細書に記載されるコンピュータプログラム製品を保存するためのデータ構造が保存されたコンピュータ可読媒体が提供される。
一態様では、癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出して癌亜型を特定するためのデバイスであって、少なくとも１つのプロセッサと、上記少なくとも１つのプロセッサと通信している電子メモリとを備え、上記電子メモリは、上記少なくとも１つのプロセッサで実行される場合に、上記少なくとも１つのプロセッサに、対象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定データを受け取ること、捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較すること、上記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定すること、並びに癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合に、上記比較工程に基づいて、上記原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定することを実行させるプロセッサ実行可能なコードを保存するデバイスが提供される。
本願明細書で使用する場合、「プロセッサ」は、いずれのタイプのプロセッサ、例えば、いずれのタイプの汎用性マイクロプロセッサ又はマイクロコントローラ（例えば、Ｉｎｔｅｌ（商標）ｘ８６、ＰｏｗｅｒＰＣ（商標）、ＡＲＭ（商標）プロセッサ等）、デジタル信号処理（ＤＳＰ）プロセッサ、集積回路、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、又はこれらのいずれかの組み合わせであってもよい。
本願明細書で使用する場合、「メモリ」は、内部に又は外部に置かれるいずれのタイプのコンピュータメモリ、例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、コンパクトディスク読み出し専用メモリ（ＣＤＲＯＭ）、電気光学メモリ、磁気光学メモリ、消去可能なプログラマブル読み出し専用メモリ（ＥＰＲＯＭ）、及び電気的消去可能プログラム可能読み出し専用メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）等のうちの好適な組み合わせを含んでもよい。メモリ１０２の一部分は、従来のファイルシステムを使用して組織化され、デバイスの動作全体を支配するオペレーティングシステムにより制御され管理されてもよい。
本願明細書で使用する場合、「コンピュータ可読記憶媒体」（コンピュータ可読プログラムコードが内蔵された機械可読媒体、プロセッサ可読媒体又はコンピュータ可用媒体とも呼ばれる）は、コンピュータ又は機械によって可読のフォーマットでデータを保存することができる媒体である。機械可読媒体は、磁気的、光学的又は電気的な記憶媒体を含めたいずれの好適な有形の、非一過性の媒体、例えばディスケット、コンパクトディスク読み出し専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）、メモリ素子（揮発性又は不揮発性）、又は類似の保存メカニズムであってよい。このコンピュータ可読記憶媒体は、実行されるときに、プロセッサに本開示の一実施形態に係る方法における工程を実行させる種々のセットの命令、コード配列、構成情報、又は他のデータを内蔵することができる。当業者は、記載された実行形態を実行するために必要な他の命令及びオペレーション（操作）は、コンピュータ可読記憶媒体に保存されることも可能であるということはわかるであろう。コンピュータ可読記憶媒体に保存された命令は、プロセッサ又は他の好適な処理装置によって実施されてよく、記載されたタスクを実行するための電気回路と整合されることが可能である。
本願明細書で使用する場合、「データ構造」は、データが効率的に使用することができるように、コンピュータにおいてデータを組織化する特定の方法である。データ構造は、データ構造上で実行することができるオペレーション及びそれらのオペレーションの計算複雑性を特定する１以上の特定の抽象データ型（ＡＤＴ）を実行することができる。比較で、データ構造は、ＡＤＴによって与えられる仕様の具体的な実行形態である。
本発明の利点は、以下の実施例によりさらに例証される。本明細書中に示される実施例及びそれらの特定の詳細は、例証のためにのみ提示されており、本発明の特許請求の範囲に対する限定と解釈されるべきではない。
方法及び材料
提供者募集及び試料入手
ＣＲＣ、乳癌、及びＧＢＭの試料をＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ ＢｉｏＢａｎｋから得て、ＡＭＬ試料をＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ＢｉｏＢａｎｋから得て、最後に、健康な対照をカナダ、トロントのＭｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＭＳＨ；マウントサイナイ病院）のＦａｍｉｌｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｅｎｔｒｅを通して募集した。すべての試料を患者の承諾を得て集め、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｂｏａｒｄ（研究倫理委員会）から、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ及びカナダ、トロントのＭｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌから、機関承認を得て入手した。
検査試料加工−ｃｆＤＮＡ
ＥＤＴＡ及びＡＣＤ血漿試料は、ＢｉｏＢａｎｋｓから、及びカナダ、トロントのＭｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＭＳＨ）のＦａｍｉｌｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｅｎｔｒｅから得た。すべての試料を、使用まで−８０℃で、又は気相液体窒素中で保存した。セルフリーＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（キアゲン））を使用して０．５〜３．５ｍｌの血漿から抽出した。抽出したＤＮＡは、使用に先立ってＱｕｂｉｔにより定量した。
検査試料加工−ＰＤＸ ｃｆＤＮＡ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ ＮｅｔｗｏｒｋのＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｂｏａｒｄにより承認されたとおり、患者の同意を得てＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｂｉｏｂａｎｋから得たヒト結直腸腫瘍組織を、コラゲナーゼＡを使用して単一細胞へと消化した。単一細胞を、４〜６週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤ雄マウスに皮下注射した。心臓穿刺による採血の前にＣＯ２吸入によりマウスを安楽死させ、採取した血液をＥＤＴＡ採血管に保存した。採取した血液試料から血漿を単離し、−８０Ｃで保存した。セルフリーＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して０．３〜０．７ｍｌの血漿から抽出した。すべての動物研究は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ ＮｅｔｗｏｒｋのＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（動物管理委員会）によって承認された倫理規制を遵守して実施した。
ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ
ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑプロトコルの概略図は、国際公開第２０１７／１９０２１５号パンフレットに記載されている。ｃｆＭｅＤＩＰに先立って、上記ＤＮＡ試料をＫａｐａ Ｈｙｐｅｒ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するライブラリ調製に供した。製造業者のプロトコルにいくらか変更を加えてそのプロトコルに従った。手短に言えば、注目するＤＮＡを０．２ｍＬのＰＣＲチューブに加え、末端修復（エンドリペア）及びＡ−テーリングに供した。その後に、ＮＥＢＮｅｘｔアダプター（Ｉｌｌｕｍｉｎａキット用ＮＥＢＮｅｘｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｏｌｉｇｏｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、から）を０．１８１μＭの最終濃度で使用してアダプターライゲーションを行い、２０℃で２０分間インキュベーションし、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで精製した。溶出したライブラリを、ＵＳＥＲ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｃａｎａｄａ）を使用して消化し、その後、ＭｅＤＩＰに先立ってＱｉａｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。
調製したライブラリを、１００ｎｇの最終ＤＮＡ量に、プールしたメチル化／非メチル化λＰＣＲ産物と合わせ、Ｔａｉｗｏら、２０１２［７］からのプロトコルをいくらか変更を加えて使用してＭｅＤＩＰに供した。手短に言えば、ＭｅＤＩＰのために、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ ＭａｇＭｅＤＩＰキット（カタログ番号Ｃ０２０１００２１）を、製造業者のプロトコルにいくらか変更を加えてそのプロトコルに従って使用した。０．３ｎｇの対照メチル化シロイヌナズナＤＮＡ及び０．３ｎｇの対照非メチル化シロイヌナズナＤＮＡ、フィラーＤＮＡ（ＤＮＡの全量［ｃｆＤＮＡ＋フィラー＋対照］を１００ｎｇにするため）及び緩衝液を、アダプターライゲーションしたＤＮＡが入っているＰＣＲチューブに添加した後、この試料を９５℃に１０分間加熱し、直後に氷水浴の中へ１０分間入れた。各試料を、２つの０．２ｍＬのＰＣＲチューブに小分けし、一方は、１０％インプット対照のためのものであり、他方は、免疫沈降にかけることになる試料のためのものであった。ＭａｇＭｅＤＩＰキットからの含まれた５−ｍＣモノクローナル抗体３３Ｄ３（カタログ番号Ｃ１５２０００８１）を、希釈した抗体混合物を生成する前に１：１５に希釈し、上記試料に加えた。洗浄した磁気ビーズ（製造業者の使用説明書に従った）も加え、その後に４℃で１７時間インキュベーションした。この試料を、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ ｉＰｕｒｅ Ｋｉｔを使用して精製し、５０μｌのＢｕｆｆｅｒ Ｃで溶出した。反応（ＱＣ１）の成功は、添加したシロイヌナズナＤＮＡの存在を検出するためのｑＰＣＲにより検証し、非メチル化添加ＤＮＡの％回収＜１％及び反応の％特異度＞９９％（１−［添加非メチル化対照ＤＮＡの回収／添加メチル化対照ＤＮＡの回収］として算出）を確認して、その後で次の工程に進んだ。各ライブラリを増幅するための最適サイクル数は、ｑＰＣＲの使用により決定し、この後でＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘを使用して試料を増幅し、０．３μＭの最終濃度までＮＥＢＮｅｘｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｏｌｉｇｏｓを加えた。このライブラリを増幅するために使用したＰＣＲ設定は以下のとおりであった：９５℃で３分間の活性化、次いで９８℃で２０秒間、６５℃で１５秒間及び７２℃で３０秒間及び７２℃で１分間の最終伸長の所定のサイクル。増幅したライブラリは、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製カラムを使用して精製し、次いで、ゲルサイズを３％ Ｎｕｓｉｅｖｅ ＧＴＧアガロースゲルを用いて選択して、アダプター二量体があればそれを除去した。配列決定に供する前に、メチル化ヒトＤＮＡ領域（精巣特異的Ｈ２Ｂ、ＴＳＨ２Ｂ）及び非メチル化ヒトＤＮＡ領域（ＧＡＰＤＨプロモーター）の濃縮倍率を、セルフリーＤＮＡ（ＡＴＣＣから得られる細胞系、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（マイコプラズマ）フリー）を模倣するように剪断されたＨＣＴ１１６細胞系ＤＮＡから生成されるＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ及びｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑライブラリについて測定した。最終ライブラリをＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ分析に供した後、ＵＨＮ Ｐｒｉｎｃｅｓｓ Ｍａｒｇａｒｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＣｅｎｔｒｅにおいてＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００で配列決定した。
点変異検出のための超深度標的配列決定
本発明者らは、ＱＩＡｇｅｎ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄキットを使用して、Ｐｒｉｎｃｅｓｓ Ｍａｒｇａｒｅｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｒｅにおいて初期臨床試験での登録前に作成された対応腫瘍組織分子プロファイリングデータを有する患者由来の約２０ｍＬの血漿（４〜５×１０ｍＬのＥＤＴＡ採血管）からセルフリーＤＮＡを単離した。細胞系（ＣＲＣ及びＭＭ細胞系の希釈）からＰｕｒｅＧｅｎｅ Ｇｅｎｔｒａキットを使用してＤＮＡを抽出し、Ｃｏｖａｒｉｓ超音波処理器を使用して約１８０ｂｐに断片化し、より大きいサイズの断片をＡｍｐｕｒｅビーズを使用して排除して、セルフリーＤＮＡの断片サイズを模倣した。ＤＮＡ配列決定ライブラリを、ＮＥＸＴｆｌｅｘ−９６ ＤＮＡ Ｂａｒｃｏｄｅアダプター（Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、オースチン（Ａｕｓｔｉｎ）、テキサス州）アダプターを利用するＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）、マサチューセッツ州）を使用して８３ｎｇの断片化ＤＮＡから構築した。既知の変異を含むＤＮＡ断片を単離するために、本発明者らは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｎｅｌを使用して臨床検査室によって試験された４８の遺伝子から変異ホットスポットを標的にしたビオチン化ＤＮＡ捕捉プローブ（ｘＧｅｎ Ｌｏｃｋｄｏｗｎ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｒｏｂｅ Ｍｉｎｉ Ｐｏｏｌ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、コーラルビル（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ）、アイオワ州）を設計した。バーコードライブラリをプールし、次いでカスタムハイブリッド捕捉ライブラリを製造業者の使用説明書（ＩＤＴ ｘＧＥＮ Ｌｏｃｋｄｏｗｎプロトコルバージョン２．１）に従って適用した。これらの断片を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００機器を使用して＞１０，０００×リードカバレッジまで配列決定した。得られたリードをｂｗａ−ｍｅｍを使用して整列（配列比較）し、変異をｓａｍｔｏｏｌｓ及びｍｕＴｅｃｔバージョン１．１．４を使用して検出した。
腫瘍特異的特徴の数とシークエンシング深度による検出確率との間の関係のモデル化
本発明者らは、１４５，０００個のシミュレートされたゲノムを作成した。癌特異的メチル化ＤＭＲの割合は、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％及び１０％に設定し、それぞれ１、１０、１００、１０００及び１００００個の独立したＤＭＲからなった。本発明者らは、１４，５００個の二倍体ゲノム（１００ｎｇのＤＮＡに相当する）をこれらの最初の混合物から採取し、１０、１００、１０００及び１００００リード／遺伝子座をさらに採取して、これらの深さにおける配列決定カバレッジを表した。このプロセスを、カバレッジ、存在量及び特徴数の各組み合わせで１００回繰り返した。本発明者らは、パラメータの各組み合わせで少なくとも１つのＤＭＲの検出成功頻度を推定し、確率曲線をプロットして（図１Ａ）、シークエンシング深度を条件とする検出成功確率に対する特徴数の影響を視覚的に評価した。
組織特有の特徴の誘導、多組織分類器の開発及び４５０ｋデータでの検証
ｃｆＤＮＡ ＭｅＤＩＰプロファイルを、ＭＥＤＩＰＳ Ｒパッケージ［８］を使用して定量し、ＲＰＫＭに換算し、その後、ｌｏｇ２カウントパーミリオン（ｃｏｕｎｔｓ−ｐｅｒ−ｍｉｌｌｉｏｎ）に変換した。その後、線形モデルを、ＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー、ＣｐＧアイランド、ＣｐＧショア及びＣｐＧシェルフにマッピングした特徴のマトリクス上でｌｉｍｍａ−ｔｒｅｎｄ［９］を使用してフィッティングした。回収した添加メチル化ＤＮＡの百分率は、プルダウン効率変動量を制御するための共変量として含めた。ペアワイズ対比を組織種の各対について評価し、上位１５０及び下位１５０のＤＭＲをエラスティックネット分類器訓練及び癌種特異性の検証のために選択した。性能測定基準は、交差検証における最高κ値を有するモデル、Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｙらにおいて以前に用いられたヒューリスティクス［１０］から、ｏｕｔ−ｏｆ−ｆｏｌｄ（データ外のデータ）のコールについてのクラス多数決（ｍａｊｏｒｉｔｙ ｃｌａｓｓ ｖｏｔｅ）によって導かれた。
分類精度の評価のための機械学習分析
モデル訓練及び発見コホート上での評価
高い計算コストをかけずに腫瘍分類におけるｃｆＭｅＤＩＰデータの性能を評価するために、本発明者らは、可能性のある候補特徴量の初期セットを、ＣｐＧアイランド、ショア、シェルフ及びＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー（本明細書中では「規制特徴量」とラベルする）を包含するウィンドウ（範囲）に限縮し、１９６個の試料及び５０５，０２７個の特徴量のマトリクスを得た。本発明者らは、次に、ｃａｒｅｔ Ｒパッケージを使用して、発見コホートデータを８０％−２０％方式で５０の独立の訓練セット及びテストセットに分割した（図２Ａ）。この分割を行ったが、発見コホートにわたるクラス割合を維持した。次いで、本発明者らは、各クラス対他クラスについてｌｉｍｍａ−ｔｒｅｎｄを使用して、訓練データパーティションでの調整ｔ統計量（１５０過剰メチル化、１５０低メチル化）により上位３００のＤＭＲを選択した。次に、Ｃｏｈｅｎ（コーエン）のκ（カッパ）を性能測定基準として使用して、混合パラメータの値（α（アルファ）、値＝０、０．２、０．５、０．８及び１）及びペナルティ（λ（ラムダ）、値＝０．０１の増分で０〜０．０５）を最適化するために、これらのＤＭＲを使用して（最大３００ＤＭＲ×７個の他クラス＝２１００特徴量）、１０分割交差検証（ＣＶ）の３回の反復の使用により二項ＧＬＭｎｅｔを訓練した。各訓練セットについて、これは、一群の６つの１クラス対他クラスの二項分類器を与えた。
次に、本発明者らは、ＡＵＲＯＣ（受信者動作特性曲線下部面積）を使用して、ホールドアウトテストセットで分類性能を推定した。これらの推定値は、分類の不偏尺度を表す。というのも、このホールドアウトテストセット試料は、ＤＭＲ事前選択にもＧＬＭｎｅｔの訓練及びチューニングにも使用されなかったからである。上記５０個の独立の訓練セット及びテストセットも、訓練セットバイアスに起因して楽観的推定の最小化を可能にした。
検証コホートでのモデル評価
各検証コホートｃｆＭｅＤＩＰ試料について、本発明者らは、上記発見コホート内の上記５０個の異なる訓練セットで訓練したＡＭＬ、ＬＵＣ及び健常の一対他の二項分類器についてクラス確率を推定した。上記５０個のモデルからの確率を平均して単一スコアを生成し、この単一スコアを次にＡＵＲＯＣ推定のために使用した。本発明者らは、早期ＬＵＣ試料（ステージＩ及びＩＩ）又は末期ＬＵＣ試料（ステージＩＩＩ及びＩＶ）のいずれかが一対他分類器のために残されたときにＡＵＲＯＣを推定することにより、疾患のステージが性能に影響を及ぼすかも評価した。
結果と考察
本発明者らは、０．００１％〜１０％まで異なる割合のｃｔＤＮＡを有する混合物を生物情報学的にシミュレーションした（図１Ａ、列の面）。本発明者らは、ｃｔＤＮＡが１、１０、１００、１０００、又は１００００のＤＭＲ（可変メチル化領域）を有する状況も健常のｃｆＤＮＡと比べてシミュレーションした（図１Ａ、行の面）。次いで、リードを様々なシークエンシング深度で各遺伝子座においてサンプリングした（１０×、１００×、１０００×、及び１００００×）（図１Ａ、ｘ軸）。本発明者らは、癌ｃｔＤＮＡの存在量が少なく、カバレッジが浅いときでも、ＤＭＲ数が増加すると少なくとも１つの癌特異的イベントの検出確率が高くなることを見出した（図１Ａ）。
さらに、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）からのｐａｎ−ｃａｎｃｅｒデータは、事実上すべての腫瘍型にわたって腫瘍組織と健常組織との間に多くのＤＭＲを示した［１１］。それゆえ、これらの知見は、癌特異的ＤＮＡメチル化異常をｃｔＤＮＡから成功裏に回収するアッセイが、低配列決定関連コストで悪性疾患を検出、分類及び追跡するための非常に感度が高いツールとして役立つことができることを強調した。
しかしながら、血漿ｃｆＤＮＡ中のＤＮＡメチル化の全ゲノムマッピングは、循環中のＤＮＡの非常に少ない量及び断片化に起因して困難である［１２］。結果として、ｃｆＤＮＡのメチル化プロファイリングに向けたこれまで試みは、結直腸癌スクリーニングのためのＦＤＡ承認のＳＥＰＴ９メチル化アッセイ［１３］等、主に遺伝子座特異的なＰＣＲベースのアッセイに限られてきた［２、３］。最近の試みは、断片化されたｃｆＤＮＡのｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを実施するためになされているが［１４〜１６］、ＣｐＧの低い全ゲノム存在量は、配列決定から入手できる有用なメチル化関連情報の量を減らす可能性が高い。それゆえ、血漿ＤＮＡに対するＷＧＢＳに関する主な問題は、高コストであり、低効率であり、そして亜硫酸水素塩変換に伴うＤＮＡの損失である。他方、メチル化しやすいＣｐＧリッチな特徴を選択的に濃縮する方法は、リードあたりに利用可能な有用な情報の量を最大にし、コストを下げ、ＤＮＡ損失を減らす可能性が高い。
ｃｆＤＮＡメチル化マッピングに好適な全ゲノム方法
本発明者らは、セルフリーＤＮＡを使用して全ゲノムＤＮＡメチル化マッピングを行うための、ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ（セルフリーのメチル化ＤＮＡ免疫沈降及び高スループット配列決定）と呼ぶ新しい方法を開発した。ここで記載するｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ方法は、本発明者らの経験では１００ｎｇのインプットＤＮＡまで非常に堅牢である既存の低インプットＭｅＤＩＰ−ｓｅｑプロトコル［７］の改変によって開発された。しかしながら、血漿試料の大部分は、１００ｎｇよりはるかに少ないＤＮＡを与える。この難題を克服するために、本発明者らは、開始ＤＮＡの量を１００ｎｇまで人為的に高めるために、外来λＤＮＡ（フィラーＤＮＡ）をアダプターライゲーションしたｃｆＤＮＡライブラリに添加した。これは、抗体による非特異的結合の量を最少にし、プラスチック製品との結合のために失われるＤＮＡの量も最少にする。フィラーＤＮＡは、アダプターライゲーションしたｃｆＤＮＡライブラリにサイズが類似した増幅産物からなり、異なるＣｐＧ密度の非メチル化ＤＮＡ及びインビトロメチル化ＤＮＡで構成された。異なる患者は異なる量のｃｆＤＮＡを与えることになるので、このフィラーＤＮＡの添加は実用にも役立ち、インプットＤＮＡ量を１００ｎｇに規準化することが可能になる。これによって、利用可能なｃｆＤＮＡの量にかかわらず、すべての試料について下流のプロトコルが全く同じのままであるということが確保される。
本発明者らは、まず、ｃｆＤＮＡで認められたものと類似の断片サイズに剪断されたヒト結直腸癌細胞系ＨＣＴ１１６からのＤＮＡを使用して、ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑプロトコルを検証した。公的なＤＮＡメチル化データが利用可能であるため、ＨＣＴ１１６を選んだ。本発明者らは、１００ｎｇの剪断細胞系ＤＮＡを使用する至適基準（ゴールドスタンダード）ＭｅＤＩＰ−ｓｅｑプロトコル［７］と１０ｎｇ、５ｎｇ及び１ｎｇの同じ剪断細胞系ＤＮＡを使用するｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑプロトコルを同時に実施した。これを２つの生物的複製物において実施した。すべての条件で、本発明者らは、９９％超の反応特異度（１−［添加非メチル化対照ＤＮＡの回収／添加メチル化対照ＤＮＡの回収］）、及び非メチル化領域（ＧＡＰＤＨ）に対する既知のメチル化領域（ＴＳＨ２Ｂ０）の非常に高い濃縮を得た（図６Ｂ）。
上記ライブラリを、約３０００〜７０００万リード／ライブラリ（補遺の表１）で飽和まで配列決定した（図６Ａ）。生のリードをヒトゲノム及び上記λゲノムの両方と整列させ、λゲノムと事実上アラインメントがないことが判明した（補遺の表１）。それゆえ、フィラーＤＮＡとしての外来λＤＮＡの添加は、配列決定データの生成を妨げなかった。最後に、本発明者らは、免疫沈降工程の品質管理手段としてＣｐＧ濃縮スコアを計算する［８］。すべてのライブラリはＣｐＧに対して類似の濃縮を示したが、インプット対照は、予想通り、濃縮を示さず（図６Ｃ）、極低インプット（１ｎｇ）でも本発明者らの免疫沈降の有効性を確認した。
異なるインプットＤＮＡレベルを比較する全ゲノム相関推定によれば、ＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ（１００ｎｇ）法とｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ（１０、５及び１ｎｇ）法の両方が極めて堅牢であり、ピアソン相関が任意の２つの生物的複製物間で少なくとも０．９４であった（図１Ｂ）。この分析の更に示すところによれば、５ｎｇ及び１０ｎｇのインプットＤＮＡにおけるｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑは、従来のＭｅＤＩＰ−ｓｅｑによって１００ｎｇで得られるメチル化プロファイルを堅牢に再現することができる（少なくとも０．９のペアワイズピアソン相関）（図１Ｂ）。１ｎｇのインプットＤＮＡにおけるｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑの性能は、１００ｎｇにおけるＭｅＤＩＰ−ｓｅｑと比べて低下するが、それでも＞０．７の強いピアソン相関を示す（図１Ｂ）。本発明者らは、ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑプロトコルが、至適基準であるＲｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＲＢＳ）及びＷｈｏｌｅ−Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＷＧＢＳ）を用いたＨＣＴ１１６のＤＮＡメチル化プロファイルを再現することも認めた（図１Ｃ）。要するに、本発明者らのデータが示唆するところによれば、ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑは、循環ｃｆＤＮＡ等の断片化された低インプットＤＮＡ材料の全ゲノムメチル化マッピングの堅牢なプロトコルである。
ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑは、腫瘍由来のｃｔＤＮＡの検出で高感度を示す
ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑプロトコルの感度を評価するために、本発明者らは、結直腸癌（ＣＲＣ）ＨＣＴ１１６細胞系ＤＮＡを多発性骨髄腫（ＭＭ）ＭＭ１．Ｓ細胞系ＤＮＡに段階希釈した。どちらもｃｆＤＮＡサイズを模倣するように剪断した。本発明者らは、ＣＲＣ ＤＮＡを１００％、１０％、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％から０％に希釈し、これらの希釈物の各々についてｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑを行った。本発明者らは、同じ試料における３点変異の検出のために超深度（１０，０００×中央値（メジアン）カバレッジ）標的配列決定も行った。５％偽陽性率（ＦＤＲ：Ｆａｌｓｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ）閾値を用いた、純粋ＭＭ ＤＮＡに対する各ＣＲＣ希釈ポイントで特定されたＤＭＲの観察数は、希釈倍率に基づくＤＭＲの予想数と０．００１％希釈までほぼ完全に線形（ｒ２＝０．９９、ｐ＜０．０００１）であった（図１Ｄ）。さらに、これらのＤＭＲ内のＤＮＡメチル化シグナルも、観察対予想シグナルでほぼ完全な線形性を示す（ｒ２＝０．９９、ｐ＜０．０００１）（図１Ｅ；補遺の表２Ｂ）。それに対して、１％希釈を超えると、超深度標的配列決定は、ＰＣＲ又は配列決定誤差のために、ＣＲＣ特異的変異体と偽変異体を確実に見分けることができなかった（図１Ｆ；補遺の表２Ａ）。従って、ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑは、癌由来のＤＮＡの検出感度に優れ、標準プロトコルを用いた超深度標的配列決定による変異体検出の性能を超える。
癌ＤＮＡは、ＣｐＧリッチ領域において頻繁に過剰メチル化される［１７］。ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑはメチル化ＣｐＧリッチ配列を特異的に標的にするので、本発明者らは、ｃｔＤＮＡが免疫沈降手順中に優先的に濃縮されると仮定した。これを試験するために、本発明者らは、２人の結直腸癌患者から患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）を生成し、マウス血漿を収集した。腫瘍由来のヒトｃｆＤＮＡは、インプット試料中の総ｃｆＤＮＡプール内で１％未満の頻度で存在し、免疫沈降後２倍の存在量で存在した（図１Ｇ；補遺の表３）。これらの結果の示唆するところによれば、ｃｔＤＮＡの偏りのある配列決定によって、ｃｆＭｅＤＩＰ手順は、ｃｔＤＮＡ検出感度を更に増加させることができた。
循環血漿ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルは複数の癌種と健康な提供者とを見分けることができる
ＤＮＡメチル化パターンは、組織特異的であり、多くの他の癌種の中でもとりわけ、神経膠芽腫［１８］、上衣腫［６］、結直腸癌［１９］、及び乳癌［２０、２１］において癌患者を臨床的に関連する疾患部分群へと階層化するために使用されてきた。本発明者らは、ｃｆＤＮＡ関連プロファイルが複数の腫瘍型に対して原発組織を特定するために使用することができるのではないかと疑問を持った。この目的のために、本発明者らは、５つの異なる腫瘍型由来の１９６個の試料及び早期及び末期の腫瘍由来の健常対照の特性を明らかにした。本発明者らは、線形モデル化を使用して、各一対比較のために、ＣｐＧショア、シェルフ、アイランド及びＦＡＮＴＯＭ５エンハンサーへの上位３００のＤＭＲのマッピングを特定し、全体で２，１００個のユニークなＤＭＲを導いた（図２Ａ）。これらの特徴量のメチル化状態に基づく上記１９６個の血漿試料のｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔＳＮＥ）［２２］に基づく密度クラスタ分析により、原発組織及び腫瘍型に基づく試料の別個のクラスタリングが明らかになった（図２Ｂ、図２Ｃ）。これらの特徴量とのエラスティックネット多癌分類器フィット（図２Ａ）を使用して、本発明者らは、異なる腫瘍型の間の非常に正確な区別を観察した（図２Ｄ）。
疾患亜型の区別
本発明者らは、ｃｆＤＮＡ ＭｅＤＩＰプロファイルが、５つの別個のケース − 遺伝子発現パターン（乳癌におけるＥＲ状態）、コピー数異常（乳癌におけるＨＥＲ２状態）、再構成（ＡＭＬにおけるＦＬＴ３ ＩＴＤ状態）、点変異（ＧＢＭにおけるＩＤＨ変異）、及び最後に肺癌における組織学 − における疾患亜型を区別する能力を評価した。いずれの場合も、線形モデルを使用して、これまでに記載したように特徴を選択しランク付けした。いずれの場合も、階層的クラスタ分析を使用して、試料のグループ分けを評価した。選択した特徴量のメチル化状態に基づくｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔＳＮＥ）［２２］に基づく密度クラスタ分析により、癌亜型分類のこれらの５つの別個の例の各々に基づく試料の別個のクラスタリングが明らかになった。
機械学習を用いる癌の検出及び癌種の分類
ｃｆＭｅＤＩＰプロファイルが癌を検出しさらに癌種を分類する能力を厳密に評価するために、本発明者らは、次に、本発明者らの発見コホートで一連の機械学習分析を行った。高速の計算解析を可能にするために、本発明者らは、最初に、本発明者らのｃｆＭｅＤＩＰ発見コホートをＣｐＧアイランド、ショア、シェルフ及びＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー（ｎ＝５０５，０２７ウィンドウ）への特徴量マッピングに限縮した。本発明者らは、次に、本発明者らの発見コホート試料で、訓練セットバイアスを考慮しつつ、性能の不偏推定量を誘導するための戦略を実行した。
本実施例では、本発明者らは、発見コホートをバランスよく訓練セット及びテストセットに分割した（８０％訓練セット、２０％テストセット）。上記訓練セットの試料のみを使用して、本発明者らは、ｌｉｍｍａ−ｔｒｅｎｄ検定統計量に基づいて、各クラス（試料の種類）対他クラスに対して上位３００のＤＭＲを選択し、上記訓練セットのデータ上でこれらの特徴量を使用して一連の一対他クラスＧＬＭｎｅｔを訓練した。訓練手順は、Ｃｏｈｅｎのκに対して最適化したα及びλの値のグリッドにわたる３ラウンドの１０分割交差検証（ＣＶ）からなっていた。多ラウンドの１０分割ＣＶの使用は、より一般化可能なモデルチューニングのためにさらなるランダム化を活用したいという考えに動機づけられたものであった。
次に、（ＤＭＲ選択工程及びその後のＧＬＭｎｅｔ訓練／チューニング工程のあいだホールドアウトした）テストセット試料に由来するＡＵＲＯＣ（受信者動作特性曲線下部面積）を使用して性能を評価した。訓練セットバイアスの影響を緩和するために、このプロセスを、発見コホートの訓練セット及びテストセットへの５０個の異なる分割を用いて繰り返した。これは、結果的に、各一対他クラス比較に対して５０個のモデル（全部で４８０個のモデル）のコレクションを生じた。ここでは、本発明者らは、このモデルのコレクションをＥ５０と称する。
その後、本発明者らは、追加の１５２の血漿試料：ＡＭＬ（ｎ＝３５）、肺癌（ｎ＝５５）及び健康な対照（ｎ＝６２）の試料の検証コホート、を生成することによりバッチ間で性能を評価した。各クラスに対して、本発明者らは、Ｅ５０において上記モデルにより出力されたクラス確率を平均し、１クラス対すべての他クラスに対するＡＵＲＯＣを推定した（図３Ａ）。この分類器は、ＡＭＬ対その他（０．９９３）、ＬＵＣ対その他（０．９４３）及び健常対その他（１．０００）の分類に対して高いＡＵＲＯＣ値を示した。このことは、機械学習手法と組み合わせたｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑが腫瘍型を正確に検出し分類する能力をさらに裏付けた。最後に、本発明者らは、この分類器が早期試料（０．９５０）において末期試料（０．９３４）と同程度に正確であること（図３Ｂ）を観察し、このことは、この手法が癌の早期検出並びに早期及び末期の両方で癌の検出に応用可能であるということを示唆した。
ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑを用いるｃｆＤＮＡメチロームプロファイリングのさらなる利点
ｃｆＤＮＡメチル化パターンが原発組織を正確に表す能力は、変異ベースのアッセイの限界も克服し、原発組織に対する特異性は、異なる組織における癌にわたる多くの潜在的なドライバー変異の再発性に起因して低い可能性がある［２３］。変異ベースのアッセイも、腫瘍のクローン構造により低感度になる可能性があり、サブクローナルドライバーはｃｔＤＮＡ中の低存在量のために検出しにくい可能性がある［２４］。変異ベースのｃｔＤＮＡ手法は、良性組織におけるドライバー変異による潜在的な交絡に対しても脆弱であり、このことは観察されており［２５］、正の選択の根拠を提示すると文献に記載されている［２６］。
これらを合わせると、− これまでに誘導されたうちで癌ｃｆＤＮＡメチロームの最大のコレクションに基づく − 本発明者らの知見は、ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑを、癌の管理及び早期検出に影響を及ぼす潜在能力を有する効率的で費用効率が高いツールとして確立する。ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑの精度及び多用途性は、耐性がエピジェネティックな変異に相関する状況、例えば前立腺癌におけるアンドロゲン受容体阻害への感受性［２７］等における治療上の決定を伝えるために有用でありうる。早期の診断及びスクリーニングに対する潜在的な機会は、肺癌において特に明らかである可能性がある。というのも、この肺癌は、スクリーニングがすでに臨床上の有用性を示している疾患であり、既存のスクリーニング試験（すなわち、低線量ＣＴスキャン）が電離放射線曝露及び高偽陽性率等の重大な制限を有する疾患であるからである。
結論として、本発明者らの知見は、非侵襲性の、費用効率が高い、高感度の、非常に正確な早期の腫瘍検出、多癌分類、及び癌亜型分類のための基礎としてのｃｆＤＮＡメチル化プロファイルの有用性を強調する。
本発明の好ましい実施形態が本願明細書に記載されたが、本発明の趣旨又は添付の特許請求の範囲から逸脱せずに上記の実施形態に変更がなされてもよいことは当業者に理解されよう。以下の参考文献リストにあるものを含め、本願明細書に開示されるすべての文献は、参照により援用される。
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２７． Ｂｅｌｔｒａｎ，Ｈ．ら， Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｃｌｏｎａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ． ２０１６．２２（３）：２９８−３０５頁。

Claims (38)

  1. 対象における癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出する方法であって、
    （ａ）対象由来のセルフリーＤＮＡの試料を準備する工程と、
    （ｂ）前記試料をライブラリ調製に供して、引き続く前記セルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定を可能にする工程と、
    （ｃ）第１量のフィラーＤＮＡを前記試料に加え、次いで任意選択的に前記試料を変性する工程であって、前記フィラーＤＮＡの少なくとも一部分がメチル化されている工程と、
    （ｄ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を使用して、セルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、
    （ｅ）捕捉された前記セルフリーのメチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、
    （ｆ）前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、
    （ｇ）前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程と
    を備える方法。
  2. 前記試料が、前記対象の血液又は血漿に由来する請求項１に記載の方法。
  3. 比較工程（ｆ）が、統計的分類器を使用するフィットに基づく請求項１又は請求項２に記載の方法。
  4. 前記分類器が機械学習由来である請求項３に記載の方法。
  5. 前記分類器が、エラスティックネット分類器、ｌａｓｓｏ、サポートベクターマシン、ランダムフォレスト、又はニューラルネットワークである請求項４に記載の方法。
  6. 健康な個体及び癌性個体由来の前記対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列が、健康な個体と癌性個体との間の可変メチル化領域（ＤＭＲ）のデータベースに含まれる請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 健康な個体及び癌性個体由来の前記対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列が、セルフリーＤＮＡ由来のＤＮＡにおいて健康な個体と癌性個体との間で差次的にメチル化されている対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列に限定される請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列が、血漿由来のＤＮＡにおいて健康な個体と癌性個体との間で差次的にメチル化されている請求項７に記載の方法。
  9. 前記試料が、１００ｎｇ未満、７５ｎｇ未満、又は５０ｎｇ未満のセルフリーＤＮＡを有する請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記第１量のフィラーＤＮＡが、約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のメチル化フィラーＤＮＡを含み、残部が非メチル化フィラーＤＮＡであり、好ましくは５％〜５０％、１０％〜４０％、又は１５％〜３０％がメチル化フィラーＤＮＡである請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記第１量のフィラーＤＮＡが２０ｎｇ〜１００ｎｇ、好ましくは３０ｎｇ〜１００ｎｇ、より好ましくは５０ｎｇ〜１００ｎｇである請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記試料由来のセルフリーＤＮＡ及び前記第１量のフィラーＤＮＡが、合わせて少なくとも５０ｎｇの総ＤＮＡ、好ましくは少なくとも１００ｎｇの総ＤＮＡを含む請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記フィラーＤＮＡが５０ｂｐ〜８００ｂｐ長、好ましくは１００ｂｐ〜６００ｂｐ長、より好ましくは２００ｂｐ〜６００ｂｐ長である請求項１から請求項１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記フィラーＤＮＡが二本鎖である請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記フィラーＤＮＡがジャンクＤＮＡである請求項１又は請求項２に記載の方法。
  16. 前記フィラーＤＮＡが内在ＤＮＡ又は外来ＤＮＡである請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記フィラーＤＮＡが非ヒトＤＮＡ、好ましくはλＤＮＡである請求項１６に記載の方法。
  18. 前記フィラーＤＮＡがヒトＤＮＡに対するアラインメントを有しない請求項１から請求項１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記結合剤が、メチルＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質である請求項１から請求項１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記タンパク質がＭＢＤ２タンパク質である請求項１から請求項１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 工程（ｄ）が、抗体を使用して前記セルフリーのメチル化ＤＮＡを免疫沈降させることを含む請求項１から請求項２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 免疫沈降のために少なくとも０．０５μｇ、好ましくは少なくとも０．１６μｇの前記抗体を前記試料に加えることを含む請求項２１に記載の方法。
  23. 前記抗体が５−ＭｅＣ抗体である請求項２１に記載の方法。
  24. 前記免疫沈降反応を確認するために、工程（ｃ）後に第２量の対照ＤＮＡを前記試料に加える工程をさらに備える請求項２１に記載の方法。
  25. セルフリーのメチル化ＤＮＡの捕捉を確認するために、工程（ｃ）後に第２量の対照ＤＮＡを前記試料に加える工程をさらに備える請求項１から請求項２３のいずれか一項に記載の方法。
  26. 癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程が、原発癌細胞組織を特定することをさらに備える請求項１から請求項２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記原発癌細胞組織を特定することが、癌亜型を特定することをさらに備える請求項２６に記載の方法。
  28. 前記癌亜型が、ステージ、組織学、遺伝子発現パターン、コピー数異常、再構成、又は点変異状態に基づいて前記癌を識別する請求項２７に記載の方法。
  29. 工程（ｆ）の比較が全ゲノムにわたって実施される請求項１から請求項２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 工程（ｆ）の比較が全ゲノムから特定の調節領域に限定される請求項１から請求項２８のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記調節領域が、ＦＡＮＴＯＭ５エンハンサー、ＣｐＧアイランド、ＣｐＧショア、ＣｐＧシェルフ、又はこれらのいずれかの組み合わせである請求項３０に記載の方法。
  32. 工程（ｆ）及び工程（ｇ）がコンピュータプロセッサにより実施される請求項１から請求項３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出し、癌亜型を特定する方法であって、
    ａ． 対象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定データを受け取る工程と、
    ｂ． 捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、
    ｃ． 前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定する工程と、
    ｄ． 工程ｃ．からの癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合、工程ｂの比較に基づいて、原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定する工程と
    を備える方法。
  34. 癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出し、癌亜型を特定するコンピュータ実装方法であって、
    ａ． 少なくとも１つのプロセッサで、対象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定データを受け取る工程と、
    ｂ． 前記少なくとも１つのプロセッサで、捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較する工程と、
    ｃ． 前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、前記少なくとも１つのプロセッサで、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定し、工程ｃ．からの癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合、工程ｂの比較に基づいて、原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定する工程と
    を備える方法。
  35. プロセッサ及び前記プロセッサに接続されたメモリを有する汎用性コンピュータと組み合わせて使用するためのコンピュータプログラム製品であって、コンピュータメカニズムがエンコードされたコンピュータ可読記憶媒体を含み、前記コンピュータプログラムメカニズムが前記コンピュータの前記メモリにローディングされ、前記コンピュータに請求項３４に記載の方法を実行させてもよいコンピュータプログラム製品。
  36. 請求項３５に記載のコンピュータプログラム製品を保存するためのデータ構造が保存されたコンピュータ可読媒体。
  37. 癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出して癌亜型を特定するためのデバイスであって、
    少なくとも１つのプロセッサと、
    前記少なくとも１つのプロセッサと通信している電子メモリと
    を備え
    前記電子メモリは、前記少なくとも１つのプロセッサで実行される場合に、前記少なくとも１つのプロセッサに、
    ａ． 対象試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列決定データを受け取ることと、
    ｂ． 捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列を、健康な個体及び癌性個体由来の対照のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列と比較することと、
    ｃ． 前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの１以上の配列と癌性個体由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡ配列との間に統計的に有意な類似性がある場合に、癌細胞由来のＤＮＡの存在を特定し、癌細胞由来のＤＮＡが特定される場合に、工程ｂの比較に基づいて、原発癌細胞組織及び癌亜型をさらに特定することと
    を実行させるプロセッサ実行可能なコードを保存するデバイス。
  38. 癌細胞由来のＤＮＡの存在を検出して、２以上の可能性のある器官から前記癌細胞が発生した前記癌の場所を決定する方法であって、
    （ａ）対象由来のセルフリーＤＮＡの試料を準備する工程と、
    （ｂ）メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を使用して、前記試料由来のセルフリーのメチル化ＤＮＡを捕捉する工程と、
    （ｃ）捕捉された前記セルフリーのメチル化ＤＮＡを配列決定する工程と、
    （ｄ）前記捕捉されたセルフリーのメチル化ＤＮＡの配列パターンを対照個体の２以上の母集団のＤＮＡ配列パターンと比較する工程であって、前記２以上の母集団の各々は、異なる器官に限局性癌を有する工程と、
    （ｅ）前記セルフリーＤＮＡのメチル化のパターンと前記２以上の母集団のうちの１つのメチル化のパターンとの間の統計的に有意な類似性に基づいて、どの器官で前記癌細胞が発生したかを決定する工程と
    を備える方法。
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