JP2020518716A - 新規な生分解性金属合金の特性およびパラメータ - Google Patents

Abstract

【解決手段】本発明は生分解性金属合金、それらの調製方法、およびそれらの用途に関する。合金はマグネシウムと、イットリウム、カルシウム、ジルコニウム、および亜鉛など他の成分を含む。これらの元素は、所望の特性および特徴を有する合金を達成するために、特定の組合せおよび量で一緒に合金化される。特定の実施形態では、ストロンチウムまたはセリウムが添加材として含まれる。結果的に得られる合金は、患者の体内に埋め込むための様々な医療装置を形成するのに特に適している。【選択図】図４．２

Description

＜関連出願の相互参照＞
本願は、２０１７年４月１２日に出願された「ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ ＡＮＤ ＰＡＲＡＭＥＴＥＲＳ ＯＦ ＮＯＶＥＬ ＢＩＯＤＥＧＲＡＤＡＢＬＥ ＭＥＴＡＬＬＩＣ ＡＬＬＯＹＳ」と題する米国仮特許出願第６２／４８４，５６０号と、２０１７年４月１２日に出願された「ＵＮＩＱＵＥ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ ＡＮＤ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ ＯＦ ＮＯＶＥＬ ＢＩＯＤＥＧＲＡＤＡＢＬＥ ＭＥＴＡＬＬＩＣ ＡＬＬＯＹＳ」と題する米国仮特許出願第６２／４８４，５６４号とに対し、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく優先権を主張し、これらの出願は、参照によって本明細書の一部となる。

＜政府支援に関する陳述＞
本発明は、米国科学財団（ＮＳＦ）によって与えられた＃ＥＥＣ−０８１２３４８に基づく政府支援を受けてなされたものである。米国政府は本発明に確たる権利を有する。

本発明は、金属合金およびそれから作製された物品と、にそれらの調製方法とに関する。本発明は特に、例えば整形外科、頭蓋顔面、気管支気管、エウスタキオ管およびステントや、尿管ステントや心血管インプラント装置のような患者の体内に埋め込むための生分解性材料および医療装置の作製に使用するのに適している。

プレート、ネジ、釘、およびピンなどの金属インプラント装置は、整形外科、頭蓋顔面、および心血管インプラント手術の実施に一般的に使用される。さらに、金属ステントもまた管腔、例えば冠動脈を支持するために患者の体内に埋め込まれる。現在使用されているこれらの金属インプラント装置の多くは、ステンレス鋼、コバルトクロム（Ｃｏ−Ｃｒ）またはチタン合金から構成される。有利なことに、これらの構成材料は良好な生体力学特性を示す。しかし、不都合なことに、これらの材料から構成されたインプラント装置は長い期間が経過しても分解しない。したがって、インプラント装置の医学的必要性が無くなったとき、および様々な理由からインプラント装置を患者の体内から取り出すことが望ましい場合に、外科手術が必要になる。例えば小児への応用など、場合によっては、インプラント装置を取り除かなければ、最終的に身体によって拒絶され、患者の合併症を引き起こす懸念がある。したがって、（ｉ）インプラント装置は期間の経過により分解することのできる材料から構成され、（ｉｉ）インプラント装置は医学的必要性が無くなったときに体内に残らないように、生理的環境で溶解し、かつ（ｉｉｉ）インプラント装置を患者の体内から取り出すための外科手術が不要になることが有利であろう。

現在、整形外科、頭蓋顔面、および心血管用途に使用される生体材料は主として、周期的荷重に耐え得る能力に基づいて選択される。特に金属製生体材料は、高い強度、延性、破壊靭性、硬度、耐食性、成形性、および生体適合性などの適切な性質を有しており、耐荷重性が必要な大半の用途にとって魅力的なものになっている。耐荷重性が必要な用途で最も一般的な金属はステンレス鋼、Ｔｉ、およびＣｏ−Ｃｒ基合金であるが、それらのスチフネス、剛性、および強度は自然骨をはるかに超える。それらの弾性係数は骨とは著しく異なることから、応力遮蔽効果を引き起こし、これが骨の負荷の低下を招いて刺激が低下し、新たな骨の成長および再形成が不充分になり、インプラントの安定性を低下させる。現在の金属製生体材料はまた、腐食または摩耗により毒性金属イオンまたは粒子を放出し、インプラント部位の免疫反応を引き起こす危険性もある。それらはまた過敏症、発育不全（小児インプラントの場合に最も顕著である）、インプラント移動、および撮像干渉につながることもある。これらの合併症のため、患者の１０％は、永久的な金属製のプレートおよびネジ、ならびに不活性金属を含む他の骨関連固定装置を取り出すために二回目の手術が必要になると推定され、患者はさらなる危険に曝され、かつ外科手術に関する時間および資源の増加を招く。

少なくともこれらの問題に鑑みて、骨が治癒する間は適切な支持を提供し、期間の経過により無害に分解することを目標として、新たな種類の耐荷重性生体材料を設計し開発することが望まれている。

永久固定インプラントに関連する合併症を回避するために、分解性生体材料が最近開発されてきた。これらは通常、ポリマー系を含む。しかし、吸収性ポリマーの固定プレートおよびネジは金属に比べて強度および剛性が相対的に低く、局所的炎症反応を示してきた。さらに、それらはいかなる骨形成性も示さない。例えば、インプラント装置の構築に現在使用されている生分解性材料は、ポリヒドロキシ酸、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）等のようなポリマーを含む。しかし、これらの材料は比較的低い強度および延性を示し、ヒトの組織と反応して骨の成長を制限しうる傾向のあることが明らかになっている。

マグネシウム合金は、自然骨により近い性質を持つ整形外科用の新しい種類の生分解性材料として最近登場した。マグネシウムは生理的環境で分解する非毒性金属元素であることが知られており、したがって、生分解性インプラント装置の構築に使用するのに適した元素であると考えられる。マグネシウムは幾つかの理由から生体材料として魅力的である。それは、密度がステンレス鋼、チタン合金、およびＣｏ−Ｃｒ合金よりずっと低く、皮質骨と同様の密度であり、非常に軽量である。マグネシウムの弾性係数は、一般的に使用されている他の金属インプラントと比較して自然骨に遥かに近く、したがって、応力遮蔽とその結果生じる埋め込まれた固定システムの取出しとに関連する骨折の危険性が低下する。また、マグネシウムはヒトの代謝に不可欠であり、多くの酵素の補因子であり、ＤＮＡおよびＲＮＡの構造を安定させる。最も重要なことは、マグネシウムが分解すると可溶性で非毒性の水酸化物腐食生成物を発生し、それは尿により無害に排泄されることである。残念ながら、マグネシウム合金の加速的腐食は、インプラント周囲に水素ガスポケットの蓄積を導くと共に、分解および組織の治癒課程中に機械的性能およびインプラントの安定性が不充分になるおそれがある。生理的環境におけるマグネシウムの分解は、水酸化マグネシウムおよび水素ガスを発生する。このプロセスは当該技術分野でマグネシウム腐食として知られている。水素ガスを吸収または放出する人体の能力は限られているので、マグネシウム腐食の結果として患者の体内で発生する水素ガスは、合併症を引き起こすことがある。

当該技術分野で公知の様々な生分解性金属合金は、生体適合性が低く、かつ／または腐食速度が高いため、これらの材料はインプラント装置のような医療用に使用するには不適切である。さらに、インプラント装置用材料の組成物は、亜鉛およびアルミニウムのような毒性元素を含むべきではなく、少なくともこれらの元素は非毒性の含有量にとどめるべきである。さらに、組成物は、生理的環境すなわち患者の体内で埋込みに適した腐食速度を示すべきである。

生物医学的応用の分野では、優れた圧縮強度を有し、耐食性および生体適合性が向上した生分解性金属合金含有インプラント材料の開発が待望されている。さらに、生理的環境におけるマグネシウムの存在に関連する耐食性とそれによる水素発生とを制御することが望ましい。

一態様では、本発明は、組成物の総重量に基づいて、約４．０重量パーセントのイットリウムと、約０．５〜０．６重量パーセントのカルシウムと、約０．６〜１．０重量パーセントのジルコニウムと、約２．０重量パーセントの亜鉛と、不純物を含む残部のマグネシウムとを含む生分解性金属合金を提供する。特定の実施形態では、金属合金は、組成物の総重量に基づいて、約４．０重量パーセントのイットリウムと、約０．６重量パーセントのカルシウムと、約１．０重量パーセントのジルコニウムと、約２．０重量パーセントの亜鉛と、不純物を含む残部のマグネシウムとを含む。他の実施形態では、金属合金は、組成物の総重量に基づいて、約４．０重量パーセントのイットリウムと、約０．５〜０．６重量パーセントのカルシウムと、約０．６重量パーセントのジルコニウムと、約２．０重量パーセントの亜鉛と、不純物を含む残部のマグネシウムとを含む。

別の態様では、本発明は、組成物の総重量に基づいて、約４．０〜４．５重量パーセントの亜鉛と、約０．３〜０．５重量パーセントのジルコニウムと、不純物を含む残部のマグネシウムとを含む生分解性金属合金を提供する。特定の実施形態では、金属合金は、組成物の総重量に基づいて、約４．０重量パーセントの亜鉛と、約０．５重量パーセントのジルコニウムと、不純物を含む残部のマグネシウムとを含む。他の実施形態では、金属合金は、組成物の総重量に基づいて、約４．４重量パーセントの亜鉛と、約０．３〜０．４重量パーセントのジルコニウムと、不純物を含む残部のマグネシウムとを含む。金属合金はさらに、各々が金属合金の約０．２５〜１．０重量パーセントを構成するストロンチウムまたはセリウムを含んでよい。特定の実施形態では、ストロンチウムまたはセリウムは、金属合金の約０．２５重量パーセントまたは約１．０重量パーセントを構成する。不純物は鉄、ニッケル、および銅の一つ以上を含むことができ、総量で２０ｐｐｍ未満が金属合金に存在してよい。金属合金は固溶体単相であってよい。Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ合金系はＭｇ（ＺｎＺｒ）を含む主要相を含んでよい。Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ合金系はＭｇ_７Ｚｎ_３析出物を含む二次金属間相を含んでよく、それは金属合金において最小化または排除されてよい。

別の態様では、本発明は、生分解性金属合金を調製する方法であって、組成物の総重量に基づいて、約４．０重量パーセントのイットリウム、約０．５〜０．６重量パーセントのカルシウム、約０．５〜０．６重量パーセントのジルコニウム、約２．０重量パーセントの亜鉛、および不純物を含む残部のマグネシウムを溶融して溶融混合物を得る工程と、溶融混合物を鋳造して前記生分解性金属合金を得る工程とを含む、生分解性金属合金の調製方法を提供する。

別の態様では、本発明は、生分解性金属合金を調製する方法であって、組成物の総重量に基づいて、約４．０重量パーセントの亜鉛と、約０．５重量パーセントのジルコニウムと、不純物を含む残部のマグネシウムとを溶融して溶融混合物を得る工程と、溶融混合物を鋳造して前記生分解性金属合金を得る工程とを含む、生分解性金属合金の調製方法を提供する。特定の実施形態では、この方法はさらに、各々が金属合金の０．２５〜１．０重量パーセントを構成するストロンチウムまたはセリウムを溶融する工程を含む。

さらに別の態様では、本発明は、組成物の総重量に基づいて、約４．０重量パーセントのイットリウムと、約０．５〜０．６重量パーセントのカルシウムと、約０．５〜０．６重量パーセントのジルコニウムと、約２．０重量パーセントの亜鉛と、不純物を含む残部のマグネシウムとを含む生分解性金属合金含有物品を含む。

さらに別の態様では、本発明は、組成物の総重量に基づいて、約４．０重量パーセントの亜鉛と、約０．５重量パーセントのジルコニウムと、不純物を含む残部のマグネシウムとを含む生分解性金属合金含有物品を含む。特定の実施形態では、この金属合金はさらに、各々が金属合金の０．２５〜１．０重量パーセントを構成するストロンチウムまたはセリウムを含む。

特定の実施形態では、物品は医療装置である。医療装置は患者の体内に埋込み可能とすることができる。別の実施形態では、医療装置は整形外科用装置とすることができる。さらに別の実施形態では、医療装置は頭蓋顔面装置とすることができる。さらに別の実施形態では、医療装置は心血管装置のみならず、エウスタキオ管および栓塞棹ならびに尿管ステントをはじめ、肺および気管支気管装置用途向けの装置とすることができる。

本発明のさらなる理解は、後述する発明を実施するための形態を、添付の図面に照らし合わせて読むことから得ることができる。

本発明の特定の実施形態に係る金属合金のＸＲＤパターンを示す。 本発明の特定の実施形態に係る金属合金の光学顕微鏡写真を示す。 本発明の特定の実施形態に係るアズキャスト（as-cast）Ｍｇ合金のＳＥＭ顕微鏡写真である。 本発明の特定の実施形態に係るアズキャストＭｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ合金のナノＣＴスキャン画像である。 本発明の特定の実施形態に係る金属合金のパッシベーション層の形成を示す。 本発明の特定の実施形態に係る金属合金の腐食形態を示す。 本発明の特定の実施形態に係るＭｇ合金の引張試験後の横断面の破面写真を示す。 本発明の特定の実施形態に係るＭｇおよびＭｇ合金の１週間、２週間、および３週間の腐食速度を示す棒グラフである。 本発明の特定の実施形態に係るアズキャストＭｇ合金および溶体化処理したＭｇ合金の腐食表面の表面形態を示す。 骨芽細胞培養したＭＣ３Ｔ３細胞を示す。 固定したＭＣ３Ｔ３細胞の形態を示す。 本発明の特定の実施形態に係るＭｇならびにアズキャストＭｇ合金および溶体化処理したＭｇ合金の細胞生存率を示す棒グラフである。 本発明の特定の実施形態に係るＭｇ合金のインプラントの局所部位の組織学的画像である。 本発明の特定の実施形態に係るＭｇならびにアズキャストＭｇ合金および溶体化処理したＭｇ合金の腐食速度を示す棒グラフである。 本発明の特定の実施形態に係る金属合金のＸＲＤパターンを示す。 本発明の特定の実施形態に係るＭｇ合金のＢＳＥ顕微鏡画像を示す。 本発明の特定の実施形態に係る、７日間および３５日間のＭｇ合金の腐食速度を示す棒グラフである。 本発明の特定の実施形態に係る、ＭｇおよびＭｇ合金の細胞生存率を示す棒グラフである。 本発明の特定の実施形態に係る、７日間および１４日間のＡＬＰ活性を示す棒グラフである。 本発明の特定の実施形態に係るサンプルのＡＬＰおよびＯＰＮ遺伝子の発現を示す棒グラフである。 本発明の特定の実施形態に係るサンプル装置の埋込みを示す写真である。 本発明の特定の実施形態に係る、埋め込まれたＭｇ合金を示すＸ線画像である。 本発明の特定の実施形態に係る、埋め込まれたＭｇ合金のマイクロＣＴ画像である。 本発明の特定の実施形態に係る、２週間後および１４週間後の腐食速度および残存量を示す棒グラフである。 本発明の特定の実施形態に係る、２週間後および１４週間後の腎臓および肝臓におけるＭｇ濃度を示すグラフである。 る肝臓および腎臓の組織切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色を示しており、本発明の特定の実施形態に係る、埋込みによる組織形態が例示されている。 ラット大腿骨切片の染色を示されており、本発明の特定の実施形態に係る、典型的な骨折治癒が例示されている。 アズキャスト純ＭｇのＸＲＤパターンを示す。 ａ〜ｆ図は、本発明の特定の実施形態に係る、研磨およびエッチング後の合金の光学顕微鏡写真である。 ａ〜ｄ図は、本発明の特定の実施形態に係る、研磨およびエッチング後の合金のＳＥＭ画像である。 本発明の特定の実施形態に係る、押出合金のＸＲＤパターンである。 ａ〜ｊ図は、本発明の特定の実施形態に係る、押出比１０で押し出したＭｇ合金の微細構造を示す光学顕微鏡写真である。 ａ〜ｄ図は、本発明の特定の実施形態に係る、研磨およびエッチング後のＭｇ合金の指示位置のＳＥＭ画像およびＥＤＸ解析である。 本発明の特定の実施形態に係る、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中におけるＭｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金、アズキャスト９９．９９％純Ｍｇ、およびＡＳ３１の腐食特性を示す。 本発明の特定の実施形態に係る金属合金の表面形態を示すＳＥＭ画像である。 本発明の特定の実施形態に係る金属合金の表面形態を示すＳＥＭ画像である。 本発明の特定の実施形態に係る金属合金の表面形態を示すＳＥＭ画像である。 本発明の特定の実施形態に係る押出金属合金の平均腐食速度を示す。 本発明の特定の実施形態に係る押出金属合金の表面形態を示すＳＥＭ画像である。 本発明の特定の実施形態に係る押出金属合金の断面形態を示すＳＥＭ画像である。 本発明の特定の実施形態に係る押出Ｍｇ合金のビッカース微小硬度を示す。 本発明の特定の実施形態に係る金属合金の機械的特性を示す。 本発明の特定の実施形態に係る押出Ｍｇ合金の平均極限引張強度および歪みを示す。 本発明の特定の実施形態に係る押出Ｍｇ合金の平均引張降伏強度およびヤング率を示す。 本発明の特定の実施形態に係る鋳造および鍛造Ｍｇ合金の降伏引張強度および伸びを示す。 本発明の特定の実施形態に係る金属合金に付着させた細胞の蛍光画像を示す。 本発明の特定の実施形態に係る、研磨した押出Ｍｇ合金の表面上の細胞を示す。 本発明の特定の実施形態に係る、研磨した押出Ｍｇ合金の表面上のＭＣ３Ｔ３細胞のファロイジン染色を示す。 本発明の特定の実施形態に係る押出金属合金の表面に付着したＭＣ３Ｔ３細胞のＳＥＭ画像を示す。 本発明の特定の実施形態に係る押出Ｍｇ合金サンプルの表面のＣａおよびＰの平均重量パーセントを示す。 本発明の特定の実施形態に係る、培養したＭＣ３Ｔ３細胞の生存率を示す。 本発明の特定の実施形態に係る、培養したＭＣ３Ｔ３細胞の生存率を示す。 本発明の特定の実施形態に係る培養したＭＣ３Ｔ３細胞の増殖を示す。 本発明の特定の実施形態に係る、押出合金抽出物に曝露されたＭＣ３Ｔ３細胞の蛍光画像を示す。 ａ、ｂ、およびｃ図は、本発明の特定の実施形態に係る、それぞれ１日間、３日間、および５日間の抽出物濃度を示す棒グラフである。 本発明の特定の実施形態に係る、ｈＭＳＣの蛍光画像を示す。 ａ、ｂ、およびｃ図は、本発明の特定の実施形態に係る、それぞれ３日間、７日間、および１４日間の抽出物濃度を示す棒グラフである。 ａ、ｂ、およびｃ図は、本発明の特定の実施形態に係る、それぞれ７日間、１４日間、および２１日間培養したｈＭＳＣの遺伝子発現データを示す棒グラフである。 ａ、ｂ、およびｃ図は、本発明の特定の実施形態に係る、それぞれ１日間、３日間、および５日間培養したｈＭＳＣの増殖テータを示す棒グラフである。 本発明の特定の実施形態に係るｈＭＳＣの蛍光画像を示す。 本発明の特定の実施形態に係る、ｈＭＳＣのＳＬＰ活性を示す棒グラフである。 ａ〜ｌ図は、本発明の特定の実施形態に係る、７日後（ａ〜ｄ図）、４０日後（ｅ〜ｈ図）、および７０日後（ｉ〜ｌ図）のインプラントの上の皮膚の組織画像を示す。 本発明の特定の実施形態に係る、４０日目および７０日目の腐食速度を示す棒グラフである。 ａ〜ｄ図は、本発明の特定の実施形態に係る、埋込み７０日後の表面形態を示すＳＥＭ画像である。 ａ〜ｄ図は、本発明の特定の実施形態に係る、埋込み７０日後の表面形態を示すＳＥＭ画像である。 ａおよびｂ図は、本発明の特定の実施形態に係るピンおよびワイヤそれぞれの模式図および写真である。 ａ〜ｂ図は、特定の実施形態に係るサンプル装置を示す。 ａ〜ｇ図は、本発明の特定の実施形態に係るサンプル装置の埋込みを示す写真である。 ａ〜ｅ図は、本発明の特定の実施形態に係る、埋め込まれたマグネシウム合金のＸ線画像である。 ａ〜ｃ図は、本発明の特定の実施形態に係るインプラントのＭｇ、Ｃａ、およびＺｎそれぞれの濃度を示すグラフである。 ａ〜ｇ図は、本発明の特定の実施形態に係る、８週後（ａ、ｂ）および１６週後（ｃ、ｄ）のＨ＆Ｅ染色した腎臓の顕微鏡写真である。 ａ〜ｇ図は、本発明の特定の実施形態に係る、８週後（ａ、ｂ）および１６週後（ｃ、ｄ）のＨ＆Ｅ染色した腎臓の顕微鏡写真である。 ａ〜ｄ図は、本発明の特定の実施形態に係る、それぞれ２週目、８週目、および１４週目の分解性合金インプラントのマイクロＣＴスキャンである。 本発明の特定の実施形態に係るインプラントのそれぞれ２週目、８週目、および１４週目の腐食率を示す棒グラフである。 ａ〜ｆ図は、本発明の特定の実施形態に係る金属合金のピンによって固定された欠損部位の軟硬組織の染色切片の顕微鏡写真である。 ａ〜ｆ図は、本発明の特定の実施形態に係る金属合金のピンによって固定された欠損部位の組織のＡＬＰの局在の顕微鏡写真である。 ａ〜ｃ図は、本発明の特定の実施形態に係る金属合金のピンによって固定された欠損部位の軟硬組織の染色切片の顕微鏡写真である。

本発明は新規な生分解性金属合金に関する。さらに本発明は、本発明の生分解性金属合金から構成または製作される、患者の体内に埋め込むための医療装置などの物品に関する。さらに、本発明は、整形外科、頭蓋顔面、気管支気管、エウスタキオ管、尿管、および心血管の手術など、しかしそれらに限定されない医療用途に使用するための、これらの生分解性金属合金を含有する組成物および物品を調製する方法に関する。

本発明の金属合金は、生分解性に加えて、患者の体内でインプラント装置として使用するのに適した次の特徴、すなわち生体適合性、耐食性、細胞付着性、細胞生存率、および機械的強度の少なくとも一つを含む。

特定の実施形態では、本発明の生分解性金属合金は、マグネシウムの存在に基づいている。マグネシウムおよび追加元素の量は、結果的に得られる合金が本明細書で明らかにする所望の特性を示すように選択される。例えば、合金元素およびそれらの量は、合金が水および模擬体液の存在下で耐食性を示し、組成物をインビトロで、例えば患者の体内のような生理的環境で使用するのに適するように選択される。

他の実施形態では、本発明の生分解性金属合金は、合金が耐食性を示し、水素ガスの発生が最小限または零になるように、選択された元素を特定の量使用して調製される。水素気泡のような水素の発生は、患者の体内で合併症を引き起こすことがある。

本発明は、合金元素の導入および処理条件を通して、マグネシウム合金の腐食速度を制御し、機械的特性を改善することを含む。マグネシウムの腐食特性および機械的特性は、固溶体中の合金元素によって強く影響される。

合金元素は、固溶体単相合金をもたらすように選択される。例えば合金がマグネシウム、亜鉛、およびジルコニウムを含む場合、Ｍｇ（ＺｎＺｒ）の所望の主要相はＭｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ系に形成され、Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ系から二次相（金属間相）のＭｇ_７Ｚｎ_３析出物が形成されることがあるが、それは最小化または排除することが好ましい。マグネシウム合金の調製は粒界に沿って金属間相の形成を生じ得ることが明かになっている。本発明の金属合金は約１００μｍ未満の平均粒度を有することができる。特定の実施形態では、平均粒度は約５０〜１００μｍである。さらに、不純物の存在は最小化することが好ましい。不純物は鉄、ニッケル、および銅の一つ以上を含んでよい。特定の実施形態では、不純物の総量は合金の２０ｐｐｍ未満を構成する。

本発明の生分解性金属合金は、次の成分、すなわちイットリウム、カルシウム、ジルコニウム、亜鉛、およびマグネシウムを含む。特定の実施形態では、ストロンチウムおよび／またはセリウムを追加してもよい。また、本発明の生分解性金属合金は、次の成分、すなわち亜鉛およびマグネシウムならびに任意選択的にストロンチウムおよび／またはセリウム；およびジルコニウム、亜鉛、およびマグネシウムならびに任意選択的にストロンチウムおよび／またはセリウムをも含む。組成物におけるこれらの成分の各々の量は、変えられてよい。一般的に、これらの成分の各々の量は、結果的に得られる組成物の非毒性が許容範囲内であって、組成物が患者の体内に埋め込むのに充分な生体適合性を持ち、かつ一定期間にわたって生分解し、インプラント装置が患者の体内に長期間、例えばインプラント装置が医学的に必要である期間を超えて残存しないように、選択される。本発明に従って作製されたインプラント装置は分解してゆき、許容される期間内に完全に分解することが好ましい。例えば本発明に従って作製されたインプラント装置は、骨の治癒課程中はフィラーまたは支持材として働くことができ、この過程の完了後に、インプラント装置は許容期間内に分解し、したがって体内に長期間残存することはない。非毒性の許容範囲および分解の許容期間は変えることができ、患者の特定の身体的および生理学的特徴、インプラント装置の特定のインビボ部位、ならびにインプラント装置の特定の医療用途によって決めることができる。

特定の実施形態では、本発明の金属合金は、組成物の総重量に基づいて、約４．０重量パーセントのイットリウムと、約０．５〜０．６重量パーセントのカルシウムと、約０．６〜１．０重量パーセントのジルコニウムと、約２．０重量パーセントの亜鉛と、不純物を含む残部のマグネシウムとを含む。他の実施形態では、金属合金は、組成物の総重量に基づいて、約４．０重量パーセントのイットリウムと、約０．６重量パーセントのカルシウムと、約１．０重量パーセントのジルコニウムと、約２．０重量パーセントの亜鉛と、不純物を含む残部のマグネシウムとを含む。他の実施形態では、金属合金は、組成物の総重量に基づいて、約４．０重量パーセントのイットリウムと、約０．５〜０．６重量パーセントのカルシウムと、約０．６重量パーセントのジルコニウムと、約２．０重量パーセントの亜鉛と、不純物を含む残部のマグネシウムとを含む。

特定の実施形態では、本発明の金属合金は、組成物の総重量に基づいて、約４．０〜４．５重量パーセントの亜鉛と、約０．３〜０．５重量パーセントのジルコニウムと、不純物を含む残部のマグネシウムとを含む。特定の実施形態では、金属合金は、組成物の総重量に基づいて、約４．０重量パーセントの亜鉛と、約０．５重量パーセントのジルコニウムと、不純物を含む残部のマグネシウムとを含む。他の実施形態では、金属合金は、組成物の総重量に基づいて、約４．４重量パーセントの亜鉛と、約０．３〜０．４重量パーセントのジルコニウムと、不純物を含む残部のマグネシウムとを含む。金属合金はさらに、それぞれ金属合金の約０．２５〜１．０重量パーセントを構成するストロンチウムまたはセリウムを含んでよい。特定の実施形態では、ストロンチウムまたはセリウムは、金属合金の約０．２５重量パーセントまたは約１．０重量パーセントを構成する。

前述の通り、不純物は鉄、ニッケル、および銅の一つ以上を含むことができ、総量で２０ｐｐｍ未満が金属合金に存在してよい。金属合金は固溶体単相であってよい。金属間相は最小化または排除されてよい。

いかなる特定の理論にも束縛されることを意図するものではないが、イットリウムの存在は生分解性金属合金含有組成物の機械的強度および耐食性の向上に寄与すると考えられる。カルシウムは、合金の鋳造中の酸化を防止するために、少量使用される。ジルコニウムは結晶粒微細化剤として作用することが知られており、組成物の機械的特性を向上させるために使用される。

本明細書で先述した通り、生理的環境でマグネシウム含有組成物を使用すると、水素ガスの発生または生成を引き起こす。マグネシウムの分解は、水素が放出される過程（すなわち腐食課程）を含む。本発明では、マグネシウムおよび他の合金元素の量は、腐食速度が許容できる水素生成速度に対応するように指定されるので、大量の水素気泡が生じたり、患者の体内に蓄積することはない。

特定の実施形態では、イットリウム、カルシウム、ジルコニウム、亜鉛、およびマグネシウムの量は、次の特徴すなわち耐食性、生分解性、生体適合性、毒性、細胞付着性、機械的強度、および可撓性の少なくとも一つを制御するように指定され、調整される。他の実施形態では、亜鉛、ジルコニウム、およびマグネシウムの量は、次の特徴すなわち耐食性、生分解性、生体適合性、毒性、細胞付着性、機械的強度、および可撓性の少なくとも一つを制御するように指定され、調整される。

さらに、特定の実施形態では、結果的に得られる生分解性金属合金含有組成物に追加の特徴および特性を与えるために、他の化合物を加えてもよい。前述の通り、ストロンチウムまたはセリウムを加えてもよい。さらに、アルミニウム、マンガン、および銀の一つ以上を、抗菌特性をもたらす有効量加えてよい。特定の実施形態では、アルミニウムは、組成物の総重量に基づいて約１．０〜９．０重量パーセントの量が存在する。他の実施形態では、アルミニウムは、組成物の総重量に基づいて約２．０重量パーセントの量が存在する。特定の実施形態では、マンガンは、組成物の総重量に基づいて約０．１〜約１．０重量パーセントの量が存在する。他の実施形態では、マンガンは、組成物の総重量に基づいて約０．２重量パーセントの量が存在する。特定の実施形態では、銀は、組成物の総重量に基づいて約０．２５〜約１．０重量パーセントの量が存在する。他の実施形態では、銀は、組成物の総重量に基づいて約０．２５重量パーセントの量が存在する。

本発明の組成物および物品を使用することのできる医療装置の非限定例として、プレート、ワイヤ、チューブ、ステント、膜、メッシュ、ステープル、ネジ、ピン、タック、ロッド、縫合糸アンカ、筒状メッシュ、コイル、Ｘ線マーカー、カテーテル、内部人工器官、パイプ、シールド、ボルト、クリップまたはプラグ、歯科インプラントまたは歯科用装置、グラフト装置、骨折治癒装置、骨置換装置、関節置換装置、組織再生装置、心血管ステント、気管支気管ステント、尿管ステント、エウスタキオ管および膜、頭蓋内動脈瘤装置、気管ステント、神経ガイド、外科手術用インプラントおよびワイヤが挙げられるが、それらに限らない。好適な実施形態では、医療装置は骨固定プレートおよびネジ、顎関節、心血管ステント、および神経ガイドを含む。

本明細書に記載する医療装置は、少なくとも一つの活性物質をそれに付着させることができる。活性物質は表面に付着させるか、あるいは内部に封入することができる。本明細書で使用する場合、用語「活性物質」とは、治療活性、診断活性、生体適合性、腐食等のような一つ以上の有利な活性を示す分子、化合物、錯体、付加物、および／または複合体を記述するものである。治療活性を示す活性物質は、生物活性剤、薬学的活性剤、薬剤等を含むことができる。本発明の組成物、物品、および装置に組み込むことのできる生物活性剤の非限定例は、成長因子のような骨成長促進剤、薬剤、タンパク質、抗生物質、抗体、リガンド、アプタマ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、酵素、ビタミン、細胞等、およびそれらの組合せを含むが、それらに限らない。

本発明の生分解性金属合金含有組成物は、様々な方法およびプロセスを用いて調製することができる。一般的に、溶融および鋳造の方法およびプロセスが使用される。冶金技術の分野では、鋳造は、金属または金属混合物を溶融するまで加熱し、次いで鋳型に注湯して冷却させ、それによって固化させる製造技術であることが知られている。特定の実施形態では、溶融金属または溶湯または金属混合物は室温の軟鋼／銅製鋳型に注湯されて５００℃になる。特定の実施形態では、溶融および／または鋳造に続いて、金属合金は、約２５０℃〜３５０℃の温度でその後の熱処理を受ける。特定の実施形態では、熱処理の温度は約３００℃である。

本発明の組成物の鋳造は、砂型鋳造、重力鋳造、永久鋳型鋳造、直接チル鋳造、遠心鋳造、低圧／高圧ダイキャスト鋳造、スクイズ鋳造、連続鋳造、真空鋳造、石膏鋳型鋳造、消失模型鋳造、インベストメント鋳造、および射出成形を含むロストワックス鋳造など、しかしそれらに限らず、当該技術分野で公知の鋳造方法を使用することによって影響を受け得る。鋳造に使用される特定のプロセスは、鋳造された組成物の特性および特徴に影響を及ぼし得ると考えられる。さらに、溶融手順が実行される温度もまた、組成物に影響を及ぼし得ると考えられる。したがって、合金の所望の組成が維持されるように、温度は慎重に選択される。

本発明の特定の実施形態では、イットリウム、カルシウム、ジルコニウム、亜鉛、およびマグネシウム元素は（本明細書に記載する特定の量を）好ましくは保護雰囲気下で昇温にて加熱することによって溶融され、次いでセラミックフィルタの有無に拘わらず鋳型に注湯され、冷却され、固化される。本発明の別の実施形態では、亜鉛、ジルコニウム、およびマグネシウム元素は（本明細書に記載する特定の量を）好ましくは保護雰囲気下で昇温にて加熱することによって溶融され、次いでセラミックフィルタの有無に拘わらず鋳型に注湯され、冷却され、固化される。

特定の実施形態では、固化の前に、溶融混合物はその様々な成分の量を決定するために試験され、したがって固化の前に所望される量を調整する機会がもたらされる。

他の実施形態では、溶融および／または鋳造工程は、組成物中の成分の酸化／分解を排除、最小化、または低減するように、保護雰囲気下で実行される。特に、組成物中のマグネシウムの酸化／分解を排除、最小化、または低減することが望ましい。保護雰囲気は、アルゴン、六フッ化硫黄、二酸化炭素、乾燥空気、およびそれらの混合物など、しかしそれらに限らず、当該技術分野で公知のものから選択された化合物を含むことができる。

さらに他の実施形態では、鋳造プロセスの後、マグネシウム含有鋳造物は均質化される。いかなる特定の理論にも束縛されることを意図することなく、均質化処理は、不純物、二次相、および金属間相が存在する場合に、それらを拡散させ、あるいはより均一または一様に分布させることができると考えられる。

さらなる実施形態では、結果的に得られた鋳造物は、当該技術分野で公知の様々な成形および仕上げプロセスを受けることができる。そのようなプロセスの非限定例として、押出、鍛造、圧延、剪断押出、打抜き、深絞り、伸線、研磨（機械的かつ／または化学的手段による）、表面処理（表面に表層を形成する）、射出成形、およびそれらの組合せが挙げられるが、それらに限らない。押出が行われる特定の実施形態では、押出比は、約１０〜７００、または約１０〜１００、または約３０である。さらに、押出温度は約３５０℃〜４５０℃であってよい。

結果的に得られた鋳造物は、患者の体内に埋め込むための医療装置など医療用途に使用される物品および装置を製造するために、成形、仕上げ、機械加工、および操作することができる。さらに、これらの医療装置は整形外科、頭蓋顔面、および心血管用途に使用することができる。

溶融および鋳造プロセスを実行するための詳細な例示的手順は、以下の実施例に示される。

本発明の生分解性金属合金含有組成物は、患者の体内への埋込みに適した医療装置など、様々な物品を製造するために使用することができる。好適な実施形態では、医療用インプラント装置は整形外科、気管支気管、エウスタキオ管およびステント、尿管ステント、頭蓋顔面および心血管装置を含む。

本発明の追加の目的、利点、および新規な特徴は、例示を目的として提供するものであって限定を意図していない以下の実施例に基づいて、当業者には明らかになるであろう。

＜実施例１＞
Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ合金は、特定の鋼材およびアルミニウム材に取って代わる耐食性で軽量の構造用途に適している。その耐食性および有利な機械的特性は、生分解性金属用途に不可欠な特徴である。低量の不純物および所望の微細構造を持つ高品質のＭｇ合金を得るために、最適な処理条件は必要である。低量の不純物および微細構造は腐食および機械的特性に直接相関する。イオン（Ｆｅ）、ニッケル（Ｎｉ）、および銅（Ｃｕ）などの不純物は、腐食を開始し孔食を引き起こすための核形成部位として働き、孔食は生分解性Ｍｇ合金の不均一な分解を導く。微細構造はまた、Ｍｇ合金の機械的特性にも寄与する。溶融温度、静置時間、熱処理技術、および純インゴットの不純物レベルなどの処理条件は、不純物および微細構造に関してＭｇ合金の品質を本質的に制御する。したがって、処理条件は不純物レベルおよび微細構造に影響し、例えば制御し、細胞適合性および生体適合性と相まって許容できる耐食性、機械的特性を達成する観点から、Ｍｇ合金の評価の統合性を調整することができる。

［実験計画］
［従来の溶融および鋳造］
高純度の純Ｍｇ（ＵＳ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ、９９．９７％）、Ｚｎ（Ａｌｆａ ａｅｓａｒ、９９．９９％）、およびＺｉｒｍａｘ（Ｍｇ‐３３Ｚｒ母合金、Ｍｇ Ｅｌｅｋｔｒｏｎ、商用グレード）を使用して、最終合金インゴットの不純物レベルを最小化するように、Ｍｇ‐４重量％Ｚｎ‐０．５重量％Ｚｒ（ＺＫ４０）合金を製造した。純Ｍｇ、Ｚｎ、およびＺｉｒｍａｘを計量し、電気抵抗炉を用いて保護雰囲気下で、７００℃でステンレス鋼るつぼ内で溶融した。ステンレス鋼ロッドを用いて溶融金属を撹拌し、３０分間静置させ、５００℃に予熱した軟鋼鋳型で鋳造した。合金の溶融および鋳造後に、溶融および鋳造プロセスの結果生じたボイドおよび不純物が維持される確率を最小化するため、鋳造したインゴットの頂部、底部、および側部から１ｃｍを相応に取り除き、インゴットの残片を使用した。

［後処理］
溶質をＺＫ４０合金の微細構造のαＭｇマトリクス中に可溶化する溶体化処理を主に調査した。Ｍｇ‐Ｚｎ二元状態図に基づいて、Ｍｇ_７Ｚｎ_３の共晶組成は固化中に３２５℃でαＭｇおよびＭｇＺｎ金属間化合物に変態する。Ｍｇ_７Ｚｎ_３組成物は３２５℃より低い温度で共晶変態し、αＭｇ（Ｚｎ，Ｚｒ）固溶体と、粒界に沿って核を形成する第二相析出物として存在することのできるＭｇＺｎ金属間化合物とを形成することが知られている。これらの第二相析出物は、腐食の観点からはガルバニック腐食の一因となり、望ましくないが、機械的強度の向上には役立つ。しかしながら、加速的腐食は機械的強度の利点を上回り、したがって望ましくない。Ｔ４処理は、３２５℃より高い温度で行われる熱処理を含むので、上述の通り望ましくない第二相析出物、および大きい粒子が機械的強度の低下の一因になり得ることから同じく望ましくない結晶粒成長を引き起こし得る。したがって、ＺＫ４０合金は相応して３００℃で１時間熱処理し、続いてシリコン油中で急冷してこれらの望ましくない二次相の析出を抑制した。

［相および微細構造の特性決定］
１０〜８０°の２θの範囲で４５ｋＶおよび４０ｍＡで動作するＣｕＫ_α（λ＝１．５４０５６Å）放射線を用いるＰｈｉｌｉｐｓ Ｘ’Ｐｅｒｔ Ｐｒｏシステムを利用して、Ｘ線回折（ＸＲＤ）を実施し、相の形成を確認した。合金試料をエポキシ樹脂にマウントし、９、３、１μｍダイヤモンドスラリ、および０．５μｍコロイド状シリカスラリを用いて研磨し、鏡面仕上げ面を得た。研磨した表面を後方散乱走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮像し、微細構造および析出物を観察した。ＳＥＭと共にエネルギ分散分光分析（ＥＤＳ）プローブを使用して、抽出物の元素含有量および粒子マトリクスを分析する。最終的に、研磨した表面をエッチングし、光学顕微鏡を用いて観察し、微細構造の光学画像を得た。

［不純物の特性化］
誘導結合プラズマ発光分析法（ＩＣＰ‐ＯＥＳ，ｉＣＡＰ ｄｕｏ ６５００ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いてＺＫ４０合金中の不純物を分析し、アズキャストインゴットの実際の化学組成を確認した。溶融プロセスは、鋳造インゴットの最終組成を蒸発および酸化のため変化させ得る。また、Ｆｅ、Ｎｉ、およびＣｕの存在は、前に述べた通り、Ｍｇ合金の腐食速度を上昇させ得る。したがって、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｚｒ、Ｆｅ、Ｎｉ、およびＣｕを標準として利用して、ＺＫ４０のＩＣＰ‐ＯＥＳ測定を実行した。後方散乱ＳＥＭ微細構造分析で観察された粒界に沿った析出物の含有量を、ＳＥＭに取り付けられたＥＤＳプローブを用いて評価し、望まない不純物が存在するかどうかを確認する。

［統計的考察］
様々な熱処理状態後のＺＫ４０合金の粒度は、ｔ検定を用いて分析される。ＩＣＰ分析から得た不純物レベルの含有量はＡＮＯＶＡ分析のために保存し、腐食速度がバッチ間で非常に異なることが観察された場合、腐食速度を異なるバッチ間の従属変数とした。これらの統計的分析は社会科学のための統計パッケージ（ＳＰＳＳ）１７．０（ＩＢＭ）を用いて実施した。相応して結果の有意性をｐ＜０．０５で判定した。

［予想される結果］
アズキャストインゴットの微細構造では、第二相の析出が制限された単相形のＭｇ、αＭｇが予想される。相応して、Ｆｅ、Ｎｉ、およびＣｕの不純物レベルが低い（２０ｐｐｍ未満）ことも予想される。機械的強度を維持するために、粒子成長もまた１００μｍより低い粒度範囲になるように制限される。したがって、不純物レベルを最適化し、所望の微細構造を達成するために、溶融温度、保護ガス、熱処理温度および期間を調査した。処理条件もまた耐食性、機械的特性、および生体適合性と相関させ、さらに生分解性Ｍｇ‐Ｚｎ基合金の開発中に最適化した。

［Ｍｇ合金の溶融および鋳造］
Ｍｇ（ＵＳ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｉｎｃ． ９９．９７％）、Ｚｎショット（Ａｌｆａ−Ａｅｓａｒ ９９．９９％）の純元素インゴットを、電気抵抗炉（Ｗｅｎｅｓｃｏ Ｉｎｃ．）内の軟鋼るつぼの中で溶融した。典型的な溶融物サイズは２００ｇであった。マグネシウムの燃焼および損失を防止するために、溶融物を（０．５％ＳＦ６＋残部Ａｒ）保護ガス雰囲気で覆った。所望の溶融温度（７００℃）に達すると、Ｚｉｒｍａｘ（登録商標）（Ｍｇ‐３３．３重量％Ｚｒ）母合金（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｅｌｅｋｔｒｏｎ Ｌｔｄ．）を用いて同量のジルコニウムを追加した。ジルコニウム添加後の液状溶融物を、１分および５分の間隔を置いた後、１０秒間攪拌し、ジルコニウム粒子を溶融物中に均等に溶解かつ分散させた。さらに、溶融物を７００℃で３０分間維持し、次いで５００℃に予熱した軟鋼鋳型（直径４４．５ｍｍ×８２．５ｍｍ）に注湯した。

［熱処理］
得られたアズキャストインゴットを、ＡｒおよびＳＦ_６の保護雰囲気下で、ゲッタとしてマグネシウム粉末で被覆された管状炉内で、３００℃で１時間溶体化処理し（Ｔ４）、次いで水中で急冷した。

［Ｘ線回折］
Ｘ線回折を用いて合金を相形成について特性決定した。したがって、１０〜８０°の２θの範囲で４５ｋＶおよび４０ｍＡで動作するＣｕＫ_α（λ＝１．５４０５６Å）放射線を使用するＰｈｉｌｉｐｓ ＸＰＥＲＴ ＰＲＯシステムを用いて、Ｘ線回折（ＸＲＤ）を実施した。

［微細構造分析］
光学顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ ４０ＭＡＴ，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、アズキャストおよび溶体化処理された（Ｔ４）ＺＫ４０合金の微細構造を観察した。正方形の試料をエポキシ（ＥｐｏｘｉＣｕｒｅ， Ｂｕｅｈｌｅｒ）内にマウントし、半自動研磨システム（Ｔｅｇｒａｍｉｎ−２０，Ｓｔｒｕｅｒｓ，Ｂａｌｌｅｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して９、３、および１μｍダイヤモンドスラリに続いて０．５μｍのコロイド状シリカを用いて機械的に研磨し、鏡面仕上げを得た。研磨後、試料は、５ｍＬの酢酸、６ｇのピクリン酸、１０ｍＬの水、および１００ｍＬのエタノールの溶液中で化学的にエッチングし、イソプロパノールを用いてすぐに洗浄して粒界を明瞭に露呈させた。粒度はＡＳＴＭ Ｅ１１２リニアインターセプト法に従って算出し、ＡＳＴＭ結晶粒数Ｇを平均粒度に変換した。合金をさらに特性化し、ナノコンピュータ断層撮影を用いてボイド／不純物／酸化物スケールの有無を観察した。相応して、タングステンフィラメントを装備したＰｈｏｅｎｉｘ Ｎａｎｏｔｏｍ−ｍ １８０ｋＶ／１５Ｗ Ｘ線ナノＣＴ（登録商標）システムを用いて、ナノコンピュータ断層撮影（ナノＣＴ）画像を撮影した。アズキャストＭｇ−４％Ｚｎ−０．５％Ｚｒ合金から直径１．５ｍｍ×高さ３ｍｍの円板状サンプルを切り出し、〜３００ｎｍの最小ボクセル解像度でｎａｎｏＣＴ画像を撮影して微細構造の細部をより明瞭に示した。

［元素分析］
誘導結合プラズマ発光分析法（ＩＣＰ‐ＯＥＳ， ｉＣＡＰ ｄｕｏ ６５００ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって決定された合金の名目組成を、表１．１に記載する。

［動電位分極（ＰＤＰ）測定］
電気化学ワークステーション（ＣＨＩ６０４Ａ，ＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）により、１ｍＶ／秒の走査速度および開路電位（ＯＰ）の上下５００ｍＶ内の電位窓で、動電位分極（ＰＤＰ）試験を実施した。正方形のサンプル（表面積〜１ｃｍ^２）を、銀エポキシを用いて銅線に接続し、エポキシ樹脂にマウントした。マウントされたサンプルを３２０、６００、および１２００グリットのＳｉＣ研磨紙を用いて機械的に研磨し、イソプロピルアルコール中で超音波洗浄し、空気乾燥させた。電気化学腐食試験に三電極セルセットアップを使用し、プラチナを対電極、Ａｇ／ＡｇＣｌを基準電極、エポキシにマウントされたサンプルを作用電極とした。試験は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが添加されたダルベッコ変法イーグル培地（４．５ｇ／Ｌのグルコース、Ｌ−グルタミン、およびピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ、Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）中で、ｐＨ７．２±０．２で、３７．４℃に維持された温度で実施された。各測定の前に、電圧の安定性をもたらすために、サンプルを開路電位で１５分間ＤＭＥＭに浸漬した。生成されたターフェルプロットのカソードおよびアノード分岐を線形外挿して、腐食電位Ｅ_ｃｏｒｒおよび腐食電流密度ｉ_ｃｏｒｒを計算した。これらの三つのサンプル測定の平均および標準偏差を報告し、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、０．０５未満のｐ値で有意な平均差を決定した。試験測定後の腐食サンプルは、次に周囲温度で２００ｇ／Ｌのクロム酸および１０ｇ／ＬのＡｇＮＯ_３溶液に１０分間浸漬することによって洗浄して、腐食生成物を除去し、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて腐食面を特性決定した。

［結果と考察］
［相分析］
図１．１は、純（pure）Ｍｇ、Ｍｇ−４％Ｚｎ−０．５％Ｚｒ（ＺＫ４０）のアズキャスト（as-cast）サンプルおよび溶体化処理されたサンプルのＸ線回折（ＸＲＤ）パターンを示す。純Ｍｇの場合、全てのピークは、六方稠密（ｈｃｐ）結晶構造を持つ単相αＭｇマトリクスにインデックスされた。興味深いことに、Ｍｇ‐４％Ｚｎ‐０．５％Ｚｒの場合、アズキャストサンプルおよび溶体化処理されたサンプルの両方とも、αＭｇのピークだけが見られた。このように明瞭に示されたＸＲＤパターンは、最終微細構造に観察されるべきαＭｇ（Ｚｎ、Ｚｒ）固溶体単相が固化中に形成されたことを示す。しかし、観察された最高回折ピーク強度はピラミッド面に対応しており、それはαＭｇ（Ｚｎ、Ｚｒ）固溶体単相の配向が溶融および固化中に純αＭｇマトリクスと比較して変化したことを示唆し、核形成部位として働く溶融物を含む、るつぼ内の合金元素または偏析元素いずれかの影響で、好適な面内で固化元素の優先配列が生じたことを示唆している。

図１．２に、アズキャストおよび溶体化処理されたＭｇ‐４％Ｚｎ‐０．５％Ｚｒ合金の対応する光学顕微鏡写真を示す。アズキャスト合金および溶体化処理された合金の両方の微細構造が、主要なαＭｇマトリクスおよび粒界に沿って析出したマイナーな二次相を含むことが分かる。アズキャスト合金および溶体化処理された合金の平均粒度はそれぞれ５０±１０μｍおよび８７±１０μｍであった。結晶粒は、微細構造全体で一様かつ等軸であり、おそらく、液状溶融物の固化中に加えられたＺｒ接種剤の優れた結晶粒微細化能力を示唆している。Ｚｒがマグネシウムのための優れた結晶粒微細化剤であり、溶質（ここでは亜鉛）の存在下で、核形成のための有効なバリアがおそらくずっと低減され、多数の臨界サイズのジルコニウム核が核形成のための活性部位として働くことにつながり、したがって構造を有効に微細化することはよく知られている。溶質として存在する亜鉛はまた、組成的過冷却中に成長粒子の固相／液相界面の前方の拡散層で分離する傾向があり、それはαＭｇ粒子のさらなる成長を抑制するのに役立つ。溶質の結晶粒微細化の有効性は、発育不全因子（ＧＲＦ）によって決定することができる。ＺｒおよびＺｎはそれぞれ３８．２９および５．３１のＧＲＦ値を有することが突き止められており、したがって、それらは一緒に、結果的に得られる合金の強力な結晶粒微細化効果をもたらし、観察される微細構造を実証する。Ｔ４処理されたサンプルの平均粒度のわずかな上昇は、三叉粒界領域に沿ったより小さい粒子の合体、および析出物がマトリクス中に溶解した後の最終的な過飽和αＭｇ（Ｚｎ、Ｚｒ）固溶体の形成が原因と思われた。アズキャスト合金および溶体化処理された合金のＳＥＭも、後方散乱電子（ＢＳＥ）モードを用いて撮影され、ＭｇとＺｎおよびＺｒとの原子番号の大きい差のため、組成コントラストを明瞭に露呈した。図１．３（ａ）は、アズキャストＺＫ４０合金のＢＳＥモードのＳＥＭ顕微鏡写真を示す。Ｚｎ／Ｚｒに富む第二相が粒界領域に沿って連続的に分散されることを観察することができる。図１．３（ａ）に示すＺｎおよびＺｒに富む第二相のエネルギ分散スペクトル（ＥＤＳ）分析は、析出物の元素組成がＭｇ_７Ｚｎ_３であることを明らかにした。マグネシウム−亜鉛状態図によれば、３２５℃までＭｇ_７Ｚｎ_３の共晶組成が存在し、それは固化中に最終的にαＭｇおよびＭｇＺｎ金属間化合物に変態する。Ｍｇ_７Ｚｎ_３は共晶変態を受け、σＭｇ（Ｚｎ、Ｚｒ）固溶体と、粒界に沿って観察される第二相であるＭｇＺｎ金属間化合物とを形成すると考えられる。同様に、溶体化処理した合金の場合、粒界に沿ってＭｇＺｎ金属間化合物が観察された（図１．３ｂ参照）。しかし、溶体化処理中にＭｇＺｎ金属間化合物がαＭｇ粒子に急速に溶解したために、第二相の体積パーセントが減少したことは明白であった。

図１．４（ａ）はアズキャストＭｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ合金のナノＣＴスキャン画像を示す。それは鋳造欠陥／内包物の不在を明瞭に示し、Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ合金組成物の優れた鋳造性およびこの試験に採用した溶融および鋳造方法の清浄性を示唆している。図１．４（ｂ）に示す高解像度ナノＣＴスキャンには、粒内部と粒界との間の平均距離が示されている。また、表１．１に、合金組成物のＩＣＰデータを示す。このデータは、液状溶融物の不純物レベルが非常に低く（Ｆｅ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｃｕ、およびＳｉを含む合計不純物レベルは〜４４０ｐｐｍであった）、この合金の生理的環境における生体適合性および分解特性の向上が確実であることをさらに実証している。

純Ｍｇおよびアズドローン（as‐drawn）ＡＺ３１合金と共に、アズキャスト状態および溶体化処理された（solution treated）状態の両方のＺＫ４０の動電位分極（ＰＤＰ）挙動は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓの生理学的条件下で広範囲にわたって研究されてきた。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓの組成を表１．２に記載する。〜１ｍＶ／秒の走査速度（scan rate）で記録された様々なサンプルおよび純Ｍｇの動電位分極曲線（ターフェルプロット）を図１．５に示す。一般的に、ターフェルプロットのカソード分岐が還元プロセスによる水素発生を示す一方、アノード分岐は酸化によるマグネシウム溶解を表す。

純Ｍｇのカソードプラトーは、水素発生のための腐食電位Ｅ_ｃｏｒｒがＡｇ／ＡｇＣｌ基準電極に対して−１．６２Ｖで発生することを示唆する。純Ｍｇの算出された腐食電流密度ｉ_ｃｏｒｒ（表１．３に示す）は〜２９．２６μＡｃｍ^−２であり、一般腐食が表面に発生したと仮定した場合の〜０．７ｍｍ／年の腐食速度に相当する。他方、アズキャストＺＫ４０サンプルと、予想通りアズドローンＡＺ３１サンプルとは、純Ｍｇと比較して、改善された腐食電位と、より貴方向に変位したＥ_ｃｏｒｒ値を示した。亜鉛は腐食電位の上昇に寄与し、したがって腐食速度を改善することがすでに知られている。アズキャストＺＫ４０合金およびＡＺ３１合金の腐食電位は、それぞれ−１．４９Ｖおよび−１．４８Ｖであると決定された。アズキャストＺＫ４０およびＡＺ３１の算出された腐食速度ｉ_ｃｏｒｒ値（ターフェル外挿によって決定された）はそれぞれ〜０．９０ｍｍ／年および０．４３ｍｍ／年であった。溶体化処理されたＺＫ４０合金の腐食電位は−１．５５Ｖであり、カソード方向に少し移動したが、アズキャストサンプルを超える腐食速度の改善があった。溶体化処理されたＺＫ４０サンプルの腐食速度ｉ_ｃｏｒｒは０．８７ｍｍ／年である。アズキャスト状態と比較して溶体化処理されたＺＫ４０合金の腐食電流密度（〜３９．３２μＡｃｍ^−２）および腐食速度の改善は主に、先に述べた通りアズキャストサンプルで粒界に沿って不連続析出が観察された第二相（Ｍｇ_７Ｚｎ_３）金属間化合物の減少によるものである。３００℃で１時間のアズキャストサンプルの溶体化処理は、共晶変態の結果発生する第二相［Ｍｇ_７Ｚｎ_３→αＭｇ（Ｚｎ、Ｚｒ）＋ＭｇＺｎ］の体積分率を低減させ、αＭｇ（Ｚｎ、Ｚｒ）主要相の量の増大を引き起こし、したがって結果的に腐食電位の突然の降下をもたらす。

図１．５はまた、分極プロットのアノード分岐におけるパッシベーション層の形成を示す。純Ｍｇ、ＡＺ３１、アズキャストおよび溶体化処理された（solution treated）ＺＫ４０サンプルの破壊電圧（breakdown potential）Ｅ_ｂは、それぞれ−１．４１Ｖ、−１．３５Ｖ、−１．４１Ｖ、および−１．３３Ｖであった。ＡＺ３１および溶体化処理されたＺＫ４０サンプルのＥ_ｂは、純Ｍｇより高く、したがってより優れていたことを見ることができ、これは、純Ｍｇが保護酸化物層の分裂による局所的腐食を生じやすいことを示唆している。他方、ＡＺ３１および溶体化処理されたＺＫ４０は両方とも、公知のパッシベーション現象により局所的腐食に対する耐性を示す。興味深いことに、アズキャストＺＫ４０合金は低い破壊電圧（−１．４１Ｖ）を示した。一般的に、分極曲線のアノード分岐は、破壊電圧（Ｅ_ｂ）として知られる勾配の変化を表すアノード電流の突然の降下によって特徴付けられる。アノード分極中に、表面に形成された不動態被膜は、腐食電流を低い値に維持して腐食損傷の程度を最小化する、保護バリアを提供する。効果的な保護層は、パッシベーション層の破壊に対する強い抵抗をもたらすものによって明らかに特徴付けられる。電位が上昇すると、腐食が発生する最下電圧である破壊電圧（Ｅ_ｂ）と呼ばれる特定の電圧値で表面破壊を介する腐食が始まる。腐食は酸化速度の増加に関係するので、Ｅ_ｂは、測定されたアノード電流の対応する増加によって決定される。Ｅ_ｂの増加は耐食性の向上に関連付けられる。破壊電圧は不動態被膜の分裂を引き起こし、したがって表面の露出部位を、攻撃の傾向が非常に高く合金の加速的腐食の一因となる攻撃的な生理的環境に曝露させる。

図１．６は、サンプルの動電位分極試験中に発生した腐食生成物をＣｒＯ_３およびＡｇＮＯ_３処理によってそれぞれ洗浄した後の腐食形態を示す。従前の科学的研究は、多相合金では、腐食速度が主として次の因子、すなわちａ）純度、ｂ）マトリクスの組成、ｃ）第二相の組成および微細構造中のその分布によって制御されることを示してきた。純Ｍｇの場合、第二相が存在しないので、腐食メカニズムは主として存在する総純度および弱い粒界領域の存在によって影響された。図１．６（ａ）は、表面全体に横方向に広がった主として不規則な局所的腐食孔が明白であったことを示す。微細構造における小さい離散孔の存在は、純マグネシウムの場合、不純物の存在が局所的腐食に役割を果たしていることを示唆する。ところが、ＡＺ３１サンプルの場合、Ｍｇ_１７Ａｌ_１２（β相）は粒界に沿って存在する顕著な第二相である。第二相の存在は、隣接するαＭｇマトリクスの腐食を加速させる。図１．６（ｂ）は、腐食面全体に小さい相互接続孔が存在することによって明らかなように、孔食が支配的な腐食メカニズムであったＡＺ３１の腐食面を示す。図１．６（ｃ）は、アズキャスト状態のＺＫ４０サンプルの腐食面を示し、ここで表面の不規則な孔の存在は孔食が実際に支配的な腐食メカニズムであったことを明瞭に示唆する。３．３．１節に概説したＺＫ４０アズキャストサンプルの微細構造の調査は、Ｍｇ_７Ｚｎ_３およびＭｇＺｎの二次相が粒界に沿って存在し、おそらくαＭｇマトリクスの加速的腐食を引き起こすことを示している。しかし、溶体化処理されたＺＫ４０サンプルの場合、図１．６（ｄ）に示す通り、明らかに表面孔が腐食面に観察されないので、第二相の百分率は腐食速度および変態に直接影響を及ぼす溶体化処理により減少する。

［結論］
アズキャストおよび溶体化処理されたＭｇ‐４重量％Ｚｎ‐０．５重量％ＺｒまたはＺＫ４０合金の光学およびＳＥＭによる微細構造分析は、微細構造全体において平均粒度がそれぞれ５０±１０μｍおよび８７±１０μｍの一様な等軸粒子の形成を示唆している。アズキャストＺＫ４０合金の後方散乱モードで実施されたＳＥＭおよびＥＤＳ分析の実施は、粒界に沿ってＭｇ_７Ｚｎ_３の金属間相が存在することを明瞭に示し、それは３００℃で１時間の溶体化処理中に共晶変態を受け、結果的にαＭｇ（Ｚｎ、Ｚｒ）主要相およびＭｇＺｎ二次相が形成され、耐食性の向上に寄与する。

＜実施例２＞
[インビトロ特性決定法を用いたＭｇ‐Ｚｎ基合金の生分解性システムとしての潜在的能力の確認]
[理論的根拠]
耐食性、機械的特性、および細胞適合性は、整形外科用途に対する生分解性Ｍｇ合金の安全性および機能を証明するために包括的に評価することを要求される三つの主要な判定基準である。生分解性Ｍｇ合金のインビトロ評価は、生理的環境を模倣し、異なるＭｇ合金のインビボ分解の傾向を再現することを重視するように計画される。純ＭｇならびにＡＺ３１およびＷＥ４３のような様々な市販のＭｇ合金は、インビボおよびインビトロ実験の初期段階で適切な耐食性、機械的特性、および生体適合性を示すことが報告されてきた。したがって、純ＭｇおよびＡＺ３１は、ＺＫ４０合金のインビトロ特性を評価するための良好な陰性対照であり、その結果によりＺＫ４０合金を理解するためにインビボでの実験が必要であることを決定することができる。ＺＫ４０のインビトロでの耐食性、機械的特性、および細胞毒性を理解することにより、整形外科用途向けのＭｇ‐Ｚｎ基合金の開発における有用な方向性がもたらされる。

［実験計画］
［腐食測定］
生分解性Ｍｇ合金の腐食測定は、質量損失浸漬、水素発生、電気化学的インピーダンス分光法（ＥＩＳ）、および動電位分極（ＰＤＰ）など様々な方法を用いて達成することができる。この実験では、質量損失浸漬および動電位分極（ＰＤＰ）を実施して、様々な時点における腐食特性を評価した。質量損失浸漬はまた、Ｍｇ合金の分解傾向が、インビボ皮下埋込みモデルでの観察と比較して、類似していることを示した。試料は、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中で３７．４℃で釣り糸を使用して細胞培養培地に浸漬した。表面積に対する培地体積の比は、ＡＳＴＭＧ３１‐７２標準に従って２０ｍｌ／ｃｍ^２に維持した。サンプルを１週間、２週間、および３週間の浸漬後に取り出し、蒸留水に洗浄し、室温で乾燥した。さらに、サンプルの腐食生成物層をクロム酸とＡｇＮＯ_３の溶液混合物で洗浄した。浸漬後の重量差を記録し、ＡＳＴＭＧ３１‐７２に従って分解速度（単位はｍｍ／年）を得た。

［定／動電位分極（ＰＤＰ）］
ＰＤＰを実施して、Ｍｇ合金の露出金属表面の電気化学的安定性を測定した。電気化学的腐食試験のために三電極セルセットアップを使用し、プラチナを対電極、Ａｇ／ＡｇＣｌを基準電極、エポキシマウントサンプルを作用電極として使用した。３７．４℃に維持されたｐＨ７．２±０．２の同一の培養培地で試験を実施した。各測定の前に、電圧安定性をもたらすために、サンプルを開路電位（ＯＣＰ）で１５分間培地に浸漬した。生成されたターフェルプロットのカソードおよびアノード分岐を線形外挿して、腐食電位Ｅ_ｃｏｒｒおよび腐食電流密度ｉ_ｃｏｒｒを算出した。

［機械的検査］
引張試験および圧縮試験を、引張試験のＡＳＴＭ‐Ｅ８‐０４および圧縮試験のＡＳＴＭ‐Ｅ９‐０９のＡＳＴＭ標準方法に従って室温で実施した。引張試験の場合、ゲージ長１２．７ｍｍおよびゲージ断面３×３ｍｍの標準ドッグボーン試料を１．３ｍｍ／分のクロスヘッド速度を使用して機械加工し、破損するまで引っ張った。圧縮試験用の試料は直径１０ｍｍおよび長さ２０ｍｍの寸法に相当した。試料をインゴットの長軸から適切に機械加工し、２ｍｍ／分の率で破損するまで荷重を加えた。引張および圧縮応力ひずみ曲線を利用して、各合金試料の降伏強度（ＹＳ）、極限引張強度（ＵＴＳ）、引張中のヤング率（Ｅ）、総伸び率（％）、圧縮降伏強度、および総圧縮率（％）を求めた。

［細胞毒性］
マウスの骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ｐ／ｓを含むダルベッコ変法イーグル培地（αＭＥＭ）中で５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中で３７．４℃で培養した。細胞を試料表面に播種し、７２時間培養した。その後、市販のキットで生死判別アッセイを実施し、蛍光顕微鏡を使用して、細胞の生存率／細胞毒性を決定した。蛍光撮像後に、試料上の細胞を２．５％グルタルアルデヒドで固定し、エタノールで脱水した。固定した細胞をパラジウムスパッタリング後に走査電子顕微鏡で撮像した。ＭＴＴ（３‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐ｙｌ）‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウム臭化物）アッセイを使用して、培養培地に試料を７２時間浸漬した後、分解性生成物の細胞毒性を評価した。２４時間培養したＭＣ３Ｔ３細胞に１×、２×、４×、および１０×の希釈度の抽出物培地を加え、７２時間後にＭＴＴアッセイを実施する。

［統計的考察］
グラフィック統計および要約統計を含む一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、分解速度、機械的特性、および細胞毒性結果を評価した。陰性対照（細胞培養プラスチック）によってＭＴＴ細胞毒性試験を正規化し、異なる合金群の間で細胞毒性レベルを比較した。したがって、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して生死判別アッセイ画像の細胞数を調べ、分析の正当性をさらに高めた。

［予想される結果］
純ＭｇおよびアズドローンＡＺ３１と比較して、ＺＫ４０合金は、分解速度に関して、純ＭｇおよびＡＺ３１に匹敵する特性を示すことが予想される。純ＭｇおよびＡＺ３１は優れた耐食性を有することが報告されており、アズキャストおよび熱処理したＺＫ４０合金は同様に機能することが予想される。機械的特性に関して、ＺＫ４０合金は純Ｍｇより良好に機能することが予想される。しかし、延伸手法はかなり高レベルの粒子微細化をもたらすため、ＺＫ４０合金が市販のアズドローンＡＺ３１の機械的特性に匹敵するとは予想されない。他方、ＺＫ４０合金の細胞毒性結果は、ＡＺ３１より優れ、かつＭＴＴおよび生死判別アッセイの両方に続いて純Ｍｇと同程度に良好であると予想される。

［材料および方法］
［引張試験および圧縮試験］
引張試験は、ＡＺ３１および純ＭｇのみならずアズキャストおよびＴ４処理したＺＫ４０合金の両方に対し、引張試験のＡＳＴＭ‐Ｅ８‐０４のＡＳＴＭ標準方法に従って室温で、５０ｋＮロードセルを備えたＭＴＳ１１フレームおよびＬＸ５００レーザ伸縮計（ＭＴＳ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｄｅｎ Ｐｒａｉｒｉｅ，ＭＮ，ＵＳＡ）を使用して、ＯｒｔｈｏＫｉｎｅｔｉｃ（登録商標）試験技術によって実施した。ゲージ長１２．７ｍｍおよびゲージ断面３×３ｍｍの標準ドッグボーン試料を機械加工し、引張試験に使用した。サンプルを１．３ｍｍ／分のクロスヘッド速度で破損するまで適切に引っ張った。引張応力ひずみ曲線を利用して、各合金試料の降伏強度（ＹＳ）、極限引張強度（ＵＴＳ）、引張中のヤング率（Ｅ）、および総伸び率（％）を決定した。三つのサンプルの測定値の平均を報告した。

［浸漬腐食測定］
浸漬腐食測定をＡＳＴＭ Ｇ３１‐７２に準拠して実施した。純Ｍｇ、アズキャストＺＫ４０、およびＴ４処理したＺＫ４０の試料を１０×１０×１ｍｍの寸法で作製し、ＳｉＣ研磨紙を用いて１２００グリットまで研磨した。浸漬試験の前に各試料の表面積および重量を慎重に記録した。試料は超音波浴を用いてアセトン中で完全に洗浄し、次いで両面を３０分間ＵＶ滅菌する。滅菌後に、試料を、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中で３７．４℃で釣り糸を使用してＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンに浸漬した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地の表面積に対する体積の比は、ＡＳＴＭＧ３１‐７２標準に従って２０ｍｌ／ｃｍ^２であった。試料は１週間、２週間、および３週間の浸漬後に取り出し、蒸留水で洗浄し、室温で乾燥した。さらに、試料を、２００ｇ／Ｌのクロム酸および１０ｇ／ＬのＡｇＮＯ_３溶液で１０分間洗浄して、腐食生成物を取り除いた。浸漬前後の重量差を記録し、ＡＳＴＭＧ３１‐７２に従って分解速度（単位はｍｍ／年）を得た。したがって、次式によって腐食速度が求められる。
腐食速度＝（Ｋ×Ｗ）／（Ａ×Ｔ×Ｄ）．．．式（１）
式中、時間変換係数Ｋ＝８．７６×１０^４であり、Ｗは浸漬前後の重量差（ｇ）であり、Ａは溶液に曝露されるサンプルの面積（ｃｍ^２）であり、Ｔは曝露時間（ｈ）であり、Ｄは材料の密度（ｇｃｍ^−３）である。浸漬試験中の溶液のｐＨ値も記録した。三つのサンプル測定の平均および標準偏差を報告し、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、各時点に対し０．０５未満のｐ値で有意な平均差を決定した。

［間接ＭＴＴ細胞生存率アッセイ］
純Ｍｇ、アズキャストＺＫ４０、およびＴ４処理ＺＫ４０の試料は１０×１０×１ｍｍの寸法になるように切り出し、ＳｉＣ研磨紙で１２００グリットまで研磨し、イソプロパノール中で超音波洗浄し、抽出物の調製前に紫外線放射により３０分間滅菌した。試料は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加した変法イーグル培地アルファ（αＭＥＭ）で５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中で３７℃で７２時間インキュベートした。抽出培地に対する試料の重量比は、ＥＮ ＩＳＯ標準１０９９３：１２に従って０．２ｇ／ｍＬに維持した。この抽出比を１００％抽出物として指定し、より低濃度の抽出物は、１００％の抽出物をそれぞれ５０％、２５％、および１０％の抽出物溶液に希釈することによって調製した。次いで抽出物は、細胞に加える前に、０．２μｍのシリンジフィルタを用いて滅菌濾過した。

さらに、マウスの骨芽細胞株（ＭＣ３Ｔ３‐Ｅ１，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）をインビトロ細胞毒性実験に使用し、変法イーグル培地アルファ（αＭＥＭ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン中で、５％ＣＯ_２加湿雰囲気中で３７．４℃で培養した。細胞を９６ウェルプレートの中で６０００細胞／ウェルの細胞密度で播種し、抽出培地を加える前に、２４時間インキュベートして付着させた。対照は、抽出物を含まない培養培地を陰性対照として使用し、１０％ＤＭＳＯ培養培地を陽性対照として使用した。前培養した細胞を含む細胞培養培地は、抽出物希釈度が１ｘ、２ｘ、４ｘ、および１０ｘの２００μｌの抽出物培地と交換し、細胞培養条件下で７２時間インキュベートした。ＭＴＴアッセイを使用して抽出物の細胞毒性を試験した。抽出物中のマグネシウムイオンの干渉がテトラゾリウム塩と相互作用するのを防止するために、培地および抽出物を新鮮な細胞培養培地と交換した。ＭＴＴアッセイはＶｙｂｒａｎｔ ＭＴＴ細胞増殖キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って、最初に、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）中に溶解した１２ｍＭ３‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐ｙｌ）‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）を各ウェルに１０μｌ加えることによって実施した。ＭＴＴ塩を５ｍｇ／ｍＬの比率でＰＢＳに溶解し、１：１１の比率でフェノールレッドを含まない培地中で希釈して、青色ホルマザン測定との干渉を避けるためマグネシウムイオンを含む培地に代わって使用した。７２時間の培養後に抽出物培地を、ＭＴＴ溶液とフェノールレッドを含まない培地の混合物に交換し、細胞培養条件下でさらに４時間インキュベートした。１ｍｇ／１０ｍＬ（ＳＤＳ‐ＨＣｌ）の比率で０．０１Ｍ塩酸に溶解したドデシルスルフィドナトリウムを使用して、ホルマザン結晶を可溶化した。各ウェルに１００μｌのＳＤＳ‐ＨＣｌを加え、細胞培養条件下で１２時間インキュベートした。次いでウェルプレートをＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーにより、６３５ｎｍを基準波長として５７０ｎｍの波長で分析した。三つのサンプルの測定値の平均および標準偏差を報告し、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、抽出物培地の各希釈係数に対し０．０５未満のｐ値で有意な平均差を決定した。

[生死判別細胞生存率アッセイ]
マウスの骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（αＭＥＭ）で、３７．４℃、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気で培養した。細胞を試料表面上に４×１０^４細胞／ｍＬの細胞密度で播種し、各ウェルは２ｍＬの培地を含み、試料を完全に覆った。７２時間のインキュベーション後に、市販のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ判別生存率／細胞毒性キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、生細胞および死細胞を蛍光顕微鏡下で４９５ｎｍの励起波長でそれぞれ緑色（エチジウムホモダイマ‐１）および赤色（カルセインＡＭ）に発光するように染色して、生死判別アッセイを実施した。蛍光撮像後に、試料上の細胞を２．５％グルタルアルデヒドで１５分間固定し、その後、希釈係数ごとに試料を７０、８０、９０、９５、および１００％の希釈エタノール中に１５分間浸漬することによって脱水した。固定した細胞を含む試料を空気乾燥し、ＳＥＭによって撮像した。

［インビボマウス皮下試験］
純Ｍｇ、アズドローンＡＺ３１、およびアズキャストＺＫ４０サンプルの急性宿主反応を調べるために、インビボマウス皮下試験を実施した。マウス埋込みをシンシナティ大学でその動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）の承認を得て、Ｄｒ．Ｚｈｏｎｇｈｙｕｎ Ｄｏｎｇと連携して実施した。この試験のために、直径５ｍｍおよび厚さ１．４ｍｍの円板をアズキャストＺＫ４０、純Ｍｇ、およびＡＺ３１合金試料から切り出した。次いで、円板状のサンプルをアセトン中で超音波洗浄し、空気乾燥し、さらにＵＶ放射線によって滅菌した。健康なヌードマウスを管理された条件下で飼育し、標準的飼料および水で維持した。マウスをイソフルランで麻酔し、皮下領域に円板を埋め込むために小さい皮膚切開を行った。外科用ステープルを使用して切開を閉じた。４０日後および７０日後に、ＣＯ_２ガスチャンバを用いて動物を屠殺し、円板状サンプルを取り出し、続いて頸椎脱臼を行った。円板状インプラントを周囲の組織ごと回収し、組織から慎重に分離し、洗浄し、空気乾燥し、計量した。周囲の皮下組織を採取し、１０％ＰＢＳホルマリン液を使用して固定し、パラフィン包埋し、ヘマトキシリン‐エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色のために切片化（４μｍ／切片）した。

［結果と考察］
［Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ合金の機械的特性］
表２．１は、自然骨との直接比較と共に本研究のために調査された純Ｍｇのみならずアズキャストおよび溶体化処理されたＭｇ‐４％Ｚｎ‐０．５％Ｚｒ（ＺＫ４０）合金の両方、および市販のアズドローンＡＺ３１の機械的特性をまとめたものである。純Ｍｇと比較して、亜鉛および少量のジルコニウムの添加は引張強度の値に劇的な効果を有する。アズキャストＭｇ‐４％Ｚｎ‐０．５％Ｚｒの降伏強度および極限引張強度（ＵＴＳ）はそれぞれ９６ＭＰａおよび１７６ＭＰａであった。しかし、溶体化処理されたＭｇ‐４％Ｚｎ‐０．５％Ｚｒ合金の降伏強度およびＵＴＳの値は、おそらく平均粒度の増大のため、アズキャスト合金と比較してわずかに低下した。平均粒度が増大すると、物理冶金学の文献で周知の通り、降伏強度は必ず低下する。アズドローンＡＺ３１は、ここで調査した全ての合金の中で最も高い５５ＭＰａの降伏強度および２０２ＭＰａのＵＴＳを示した。純マグネシウムの弾性係数は低く、〜５ＧＰａであったが、Ｍｇ‐４％Ｚｎ‐０．５％Ｚｒ合金は優れた弾性係数（〜６４ＧＰａ）を示し、合金が引張試験下で高い強度を有することを示唆した。同様に、アズドローンＡＺ３１もまた高いスチフネス値を示した。純マグネシウムを除き、ここで試験した全ての合金が自然骨と比較して高い弾性係数値を有することは注目すべきである。純マグネシウムおよびアズドローンＡＺ３１サンプルの破断までの総伸び率（％）はそれぞれ７％および１２％であった。

対照的に、アズキャスト状態および溶体化処理された状態のＭｇ‐４％Ｚｎ‐０．５％Ｚｒ合金の張力下で破断までの総伸び率は、それぞれ４％および３％であることが観察された。アズキャストおよび溶体化処理されたＭｇ‐４％Ｚｎ‐０．５％Ｚｒ合金両方の破断までの伸び率の低い値はおそらく、合金の硬度および強度を高める一方で破断までの総伸び率を低下させる第二相（Ｍｇ_７Ｚｎ_３）の存在のためである。同様の観察は文献に報告されており、そこでは５重量％を超える亜鉛を添加すると、固化中に粒界に沿って析出する複数のＭｇＺｎ金属間相が存在するため、合金の機械的特性にマイナスの効果が生じることが観察された。市販のアズドローンＡＺ３１合金は、ここで調査した全ての合金と比較して、より高い降伏強度および引張強度を示した。４％の亜鉛および０．５％のジルコニウムを純マグネシウムに加えることによる降伏値および引張強度の増加は主に、Ｈａｌｌ‐Ｐｅｔｃｈ関係に基づいている合金の微細構造に対するジルコニウムの強力な粒子微細化効果に起因する。Ｍｇ‐Ｚｎの確立された状態図によれば、マグネシウムにおける亜鉛の最大固溶度は室温で１．６重量％である。したがって、亜鉛は主として主要相αＭｇに溶解し、固溶体をもたらし、合金の鋳造性の改善を強化する。また、Ｍｇ‐４％Ｚｎ‐０．５％Ｚｒ合金の粒界領域に沿ってＭｇ_７Ｚｎ_３金属間化合物が存在すると、塑性変形中に転位運動が阻害され、所望の可塑性を犠牲にして合金の強度が増大することに注意を向けることも重要である。しかし、粒界に沿って形成される不連続な析出物は時々、応力集中装置として働き、引張荷重下で合金の脆性破壊を導くことがある。

図２．１は、引張試験後の断面の破面写真を提供する。アズドローンＡＺ３１合金試料（図２．１ａ参照）の破断面は、破断面全体にディンプルが存在する延性モード破断を示す。他方、図２．１ｂのアズキャストＺＫ４０の引張試験試料は、粒間割れおよび劈開パターンを含む混合破断モードを示す。劈開および擬似劈開パターンの存在は、Ｍｇ‐４％Ｚｎ合金には一般的であり、それは他者により検証されてきた。粒界に沿った金属間相の存在は引張荷重下で亀裂の伝播を導き、結果として脆性破壊を引き起こすことがある。しかし、溶体化処理されたＺＫ４０合金は、劈開面およびディンプルの存在によって支持される脆性‐延性両方の破壊モードを示した。破断面で観察されたディンプルの数（図２．１ｃ）は最小限であり、おそらく溶体化処理中に第二相がαＭｇマトリクス中に再溶解したときに現われたものであり、粒子を軟化させ、延性モード破壊の可能性を導く。

［Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ合金の浸漬腐食特性］
純Ｍｇ、アズドローンＡＺ３１、アズキャストおよび溶体化処理されたＺＫ４０合金の平均重量損失を図２．２に示す。純ＭｇおよびＡＺ３１の平均腐食速度は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳへの７日間の静的浸漬後に、それぞれ０．６９±０．１３および０．６６±０．０５ｍｍ／年であることが決定された。腐食速度は、１４日間および２１日間の浸漬試験中にさらに低下した。それは文献に報告された数値と一致する。平均重量損失速度の低下はおそらく、腐食をさらに遅らせる表面上のパッシベーション層の形成のためであった。しかし、アズキャストおよび溶体化処理されたＺＫ４０サンプルの場合、逆の傾向が観察された。腐食速度は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳへの７日間、１４日間、および２１日間の静的浸漬の順序で増大した。７日間の浸漬後のアズキャストおよびＴ４処理したＺＫ４０合金の平均重量損失は、それぞれ０．３９±０．０５ｍｍ／年および０．５３±０．１２ｍｍ／年であった。アズキャストＺＫ４０サンプルの場合、腐食速度は１４日間および２１日間の浸漬中にそれぞれ１．０７±０．２６ｍｍ／年および１．５３±０．２５ｍｍ／年に劇的に増大した。

腐食速度の増大は、静的浸漬中に表面に形成される保護層［Ｍｇ（ＯＨ）_２］が安定せず、さらなる腐食に寄与することを示唆する。上記の知見は、アズキャストＺＫ４０合金の破壊電圧Ｅ_ｂ（−１．４１Ｖ）が腐食電位Ｅ_ｃｏｒｒ（−１．４９Ｖ）に近く、結果的に腐食生成物の急速な腐食および溶解が同時に起きることを突き止めた電気化学的腐食の研究と一致した。溶体化処理されたＺＫ４０合金の平均腐食速度は、７日間後の０．５３±０．１２ｍｍ／年から１４日間後の０．４６±０．０３ｍｍ／年までわずかに減少したが、２１日間の静的浸漬後に再び０．８９±０．０９ｍｍ／年に増大した。この変則的な腐食速度の正確な理由はまだ不明であり、さらなる調査の課題である。考えられる説明として、溶体化処理のため形成された水酸化物の性質から、亜鉛がＭｇのα相に溶解し、ＭｇＺｎ金属間相が形成されることが挙げられる。Ｚｎの取込みのため水酸化マグネシウムの安定性が２１日の期間に変化し、おそらく微細な析出物が形成され、固溶度を増大させ腐食速度の増大が観察された可能性が高いと思われる。しかし、これらは現時点ではほとんど推論であり、さらなる研究が必要である。

２１日間の静的浸漬後のアズキャストおよび溶体化処理されたＺＫ４０合金の腐食面の表面形態を図２．３に示した。アズキャストおよび溶体化処理されたＺＫ４０合金は両方とも一様に腐食したように見える。しかし、大きい穴の存在の原因は、細胞培養培地に存在するＣｌ⁻、ＨＣＯ_３ ⁻、ＳＯ_４ ^２イオン等によって局所的に攻撃される傾向のある第二相の析出物の存在ゆえに弱点個所となる粒界領域に沿った厳しい孔食のためである可能性が高かった。

［Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ合金の細胞適合性］
［生死判別アッセイを使用する直接ＭＣ３Ｔ３細胞適合性］
純Ｍｇ、ＡＺ３１、アズキャストおよび溶体化処理されたＺＫ４０サンプルの細胞生存率を、抽出物の３日間の細胞培養時間により調査した。図２．４は、直接αＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で３日間培養し、次いでカルセインＡＭおよびＥｔｈＤ‐１で染色した骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３‐Ｅ１を示す。生細胞は細胞内エステラーゼ活性によりカルセインＡＭを緑色蛍光カルセインに変換する一方、ＥｔｈＤ‐１は損傷した膜を持つ細胞に侵入し、そこで核酸と結合して明るい赤色蛍光を発する。アズキャストサンプルと同様に溶体化処理されたＺＫ４０サンプルも、ＡＺ３１および純マグネシウムと比較して、細胞密度がより高くかつ均等に分布していることが明瞭であるので、改善された細胞生存率を示す。対照群と調査サンプル群との間で生細胞（緑色）の形状に有意な差はなかった。各群にほんのわずかなアポトーシス細胞（核の赤色蛍光）が観察された。

図２．５は、αＭＥＭ中で３日間インキュベートした後、２．５％グルタルアルデヒド溶液中で１５分間固定したＭＣ３Ｔ３‐Ｅ１細胞の形態を示す。細胞がサンプルの表面に付着するのを観察することができ、また細胞が表面上で増殖し始めることも明白である。糸状仮足が形成され、細胞の拡散は均等であることを観察することができ、Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒサンプルが生理的環境で安定しており、保護層が形成されている可能性が高く、放出されるイオン濃度（Ｍｇ^２＋、Ｚｎ^２＋）が阻害され、細胞の成長および増殖を促進していることが示唆される。

［ＭＴＴアッセイを使用する間接ＭＣ３Ｔ３細胞適合性］
図２．６は、ＭＣ３Ｔ３‐Ｅ１細胞および３日抽出物のＭＴＴアッセイを使用して実施した間接細胞毒性試験の結果を示す。３日間の培養期間の場合、細胞生存率は陰性対照と比較して、非希釈抽出物（１００％）濃度ではほとんど無きに等しかった。しかし、腐食培地の抽出物を５０％、２５％、および１０％に希釈し、新鮮な培地を細胞に加えると、細胞生存率は増加した。細胞生存率レベルは、アズキャストおよび純マグネシウムレベルの場合、５０％の希釈レベルで〜８０％と記録され、ＺＫ４０合金の良好な細胞適合性が示唆された。細胞適合性レベルは２５％の抽出物希釈でさらに改善した。アズキャストおよび溶体化処理されたＺＫ４０ならびに純Ｍｇの三つのサンプルは全て、陰性対照に対して、５０％および２５％の抽出物希釈で７５％を超える細胞生存率を示した。上記の研究結果は、抽出物濃度が高いと本質的に細胞毒性が高く、放出されるイオン濃度のため浸透圧衝撃を招くという、文献に報告されている最近の研究結果とよく一致しており、１０倍の抽出物希釈は様々なマグネシウム合金間の細胞毒性レベルを決定するのにより適しており、おそらく充分であることを示唆している。細胞毒性試験のＩＳＯプロトコルもまた７５％以上の細胞生存率を非細胞毒性の指標としており、したがってここでの結果は、調査したＺＫ４０合金材料の生体適合性を示唆している。

［Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒのインビボ生体適合性］
図２．７は、４０日および７０日後にアズキャストＺＫ４０、純Ｍｇ、およびＡＺ３１の周囲のマウス皮下組織で採取されたインプラントの局所部位の組織学的画像を示す。４０日後にアズキャストＺＫ４０の埋込みの周囲に、ある可視量のガスポケットが観察され、動物を屠殺し、合金試料を取り出した後、純ＭｇおよびＡＺ３１と比較して、アズキャストＺＫ４０の有意な質量損失を測定した。Ｈ＆Ｅ組織学的検査結果に軽度の炎症反応が観察された（図２．７参照）。線維芽細胞の豊富な集団がＭｇ合金サンプルの周囲に観察された。アズキャストＺＫ４０の分解は、純ＭｇおよびアズドローンＡＺ３１より次第に目立つようなることが観察された（図２．８参照）。しかし、試料に明瞭な急性炎症反応は無かったが、より詳細で正確かつ説得力のある説明を提供するためには、分解分析と共に長期反応の分析が必要である。これらの研究は近い将来に計画される。

［結論］
本試験では、アズキャストおよび溶体化処理されたＺＫ４０合金を、整形外科および頭蓋顔面に適用可能な潜在的生分解性合金として調査した。ＺＫ４０合金は、純ＭｇおよびアズドローンＡＺ３１に匹敵する腐食速度を有する。しかし、静的浸漬技術による長期腐食は、アズキャストおよび溶体化処理されたＺＫ４０合金の腐食傾向が実際には、純ＭｇおよびＡＺ３１と逆であることを示している。純ＭｇおよびＡＺ３１の平均重量損失速度は、７日間の浸漬後に安定化し、１４日間および２１日間の静的浸漬後に徐々に低下するが、アズキャストＺＫ４０合金の平均重量損失速度は、おそらく腐食面で同時に起きる保護層の形成および溶解のため、平均重量損失速度の増加を示すことが観察された。マウス骨芽ＭＣ３Ｔ３細胞を使用する直接生死判別アッセイおよび間接ＭＴＴアッセイによるインビトロ分析は、純ＭｇおよびＡＺ３１と比較して良好な細胞生存率を示す。マウス皮下モデルにおけるアズキャストＺＫ４０サンプルの直接移植もまた急性炎症反応を示さず、かつ４０日後および７０日後に移植部位に沿って健康な線維芽細胞の形成が示され、ＺＫ４０合金を潜在的生分解性インプラントとして使用できることが示唆される。さらに、押出／圧延、および昇温での等チャネル角プレスは、アズキャストインゴットに存在するボイド、固化収縮等を除去することが可能であり、機械的強度および腐食特性を改善することが報告されている。したがって、熱間押出または熱間圧延について、Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ合金を潜在的生分解性インプラント材料として使用するための潜在的工程として調査した。

＜実施例３＞
［Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ合金の分解特性、機械的特性、および生物学的特性に対するＳｒおよびＣｅの添加の影響］
［理論的根拠］
各合金カテゴリについて上述したように、ここで考察する新たな種類の系は、ＳｒおよびＣｅを含有する合金である。前に述べた通り、ＳｒおよびＣｅは両方とも骨に自然に存在しており、骨のｈＭＳＣ分化に関してそれらの生物学的影響が報告されてきた。他方、Ｓｒは粒子微細化効果を有することが知られ、ＣｅはＭｇ合金により強力な金属腐食保護層をもたらすことが知られており、したがって結果的に得られる合金の品質および予想される性能を著しく向上する。Ｍｇ合金の分解中のＳｒおよびＣｅの放出は、かくして骨組織の再生をさらに増強する潜在的可能性を有する。したがって、少量であるが目立つ量のＳｒおよびＣｅが合金元素としてベースＭｇ‐Ｚｎ基合金に添加され、これらの元素の影響が調査されてきた。こうしてＳｒおよびＣｅの添加量を０．２５重量％および１重量％に決定し、添加量と主要な三つの特性との相関のみならず骨形成能についても体系的に調査する。

［実験計画］
上記の実施例１で記載したのと同じ実験セットアップを使用して、Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒ‐ＺｒおよびＭｇ‐Ｚｎ‐Ｃｅ‐Ｚｒ（Ｓｒ、Ｃｅ＝１、０．２５）合金を溶融し、鋳造した。したがって、Ｍｇ‐ＳｒおよびＭｇ‐Ｃｅ母合金を使用して、溶融中にＳｒおよびＣｅを添加した。ＳＥＭを用いた微細構造および不純物の分析後に、熱処理条件を最適化した。処理後にパラメータを決定し、生分解性Ｍｇ合金に必要な基本的特性を理解するために、実施例２の実験計画に従ってインビトロでの腐食特性、機械的特性、および生物学的特性の測定を実行した。

さらに、アルカリホスファターゼおよび石灰化アッセイを使用して、Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒ‐ＺｒおよびＭｇ‐Ｚｎ‐Ｃｅ‐Ｚｒ合金の骨形成能を評価した。Ｍｇ、Ｓｒ、およびＣｅイオンを添加した分化培地でｈＭＳＣを培養し、直接細胞付着性に関わることなく、分解生成物の影響を試験した。アルカリ性リン酸塩アッセイをＤＮＡ定量化によって正規化した。１週間、２週間、３週間の培養後に、ｈＭＳＣ溶解物をｐニトロフェニルリン酸塩（ｐＮＰＰ）溶液および基質容積と混合し、インキュベートし、４０５ｎｍの吸光度で観察した。２週間および３週間の培養後に、アリザリンレッドアッセイを使用して骨芽細胞の石灰化を測定した。アリザリンレッド染色後に定量分析を実施し、染色した細胞を溶解して、プレートリーダーを使用して６０５ｎｍの吸光度で定量した。

［統計的考察］
Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒ‐ＺｒおよびＭｇ‐Ｚｎ‐Ｃｅ‐Ｚｒ合金に実施される繰り返し実験のために、明確な目的１（Specific Aim 1）および明確な目的２（Specific Aim 2）の同じ統計分析を使用した。したがって、ＡＬＰおよび石灰化の調査に対し、群および時間の独立変数を持つ二方向ＡＮＯＶＡを使用した。ＳｒまたはＣｅの添加が骨形成能に効果を有するかどうかを立証するために、ｐ＜０．５で設定した有意水準を設定した。

[予想される結果]
上で概説したように、ＺＫ４０合金へのＣｅおよびＳｒの添加は耐食性を低下させるとは予想されないが、これらの合金元素は少量でも、粒界に沿ってまたは親Ｍｇマトリクス相の内部に小さい析出物を形成する可能性が高い。機械的特性は相応して変化するが、引張強度については依然としてＺＫ４０合金の８０％を維持すると予想される。Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒ‐ＺｒおよびＭｇ‐Ｚｎ‐Ｃｅ‐Ｚｒ合金は、ＡＬＰ活性および石灰化がかなり向上すると予測される一方、合金の細胞毒性についてはＺＫ４０との有意差は無いであろう。

[材料および方法]
[合金の設計および合成]

表３．１は、本章で調査するＭｇ‐Ｚｎ合金の省略表記および化学組成を一覧にする。Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒ‐ＺｒおよびＭｇ‐Ｚｎ‐Ｃｅ‐Ｚｒ（Ｓｒ、Ｃｅ＝１、０．２５）合金を、電気抵抗炉を用いて軟鋼るつぼ内で溶融し、５００℃に予熱した軟鋼鋳型で鋳造した。Ｍｇ（ＵＳ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｉｎｃ．，９９．９７％）、Ｚｎショット（Ａｌｆａ‐Ａｅｓａｒ，９９．９９％）、およびＭｇ‐３０Ｓｒ／Ｍｇ‐３０Ｃｅ母合金の純元素インゴットを表に従って計量し、７００℃で均質化して、Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒ‐ＺｒおよびＭｇ‐Ｚｎ‐Ｃｅ‐Ｚｒ合金を２５０ｇのバッチサイズで合成した。平衡状態で、Ｚｉｒｍａｘ（登録商標）Ｍｇ‐３３．３重量％Ｚｒ（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｅｌｅｋｔｒｏｎ，ＵＫ）を溶融混合物に添加した。１分後および５分後に１０秒間の攪拌を行って、溶融物中のジルコニウム粒子の一様な分散および溶解を達成した。最終的に、温度を７００℃に３０分間維持し、次いで鋳造した。３００℃で１時間溶体化処理した後、ノースカロライナＡ＆Ｔ大学（Ｇｒｅｅｎｓｂｏｒｏ，ＮＣ）で３０：１の押出比を用いて、熱間押出を行った。

［Ｘ線回折］
Ｓｉ検出器を備えＣｕ Ｋ_α（λ＝１．５４０５６Å）放射線源を用いるＰｈｉｌｉｐｓ ＸＰＥＲＴ ＰＲＯシステムを使用して、Ｘ線回折（ＸＲＤ）位相分析を実施した。Ｘ線発生装置は４５ｋＶおよび４０ｍＡで１０〜８０°の２θ範囲で動作した。Ｘ’Ｐｅｒｔ ＨｉｇｈＳｃｏｒｅ Ｐｌｕｓバージョン３．５ソフトウェアを使用し、ＩＣＳＤデータベースと比較してＸＲＤパターンを同定した。

［ＩＣＰ分析］
誘導結合プラズマ発光分析法（ＩＣＰ‐ＯＥＳ，ｉＣＡＰ ｄｕｏ ６５００，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、合金組成物に対する元素分析を実施した。ＺＫ４０、ＺＪ４０／４１およびＺＹ４０／４１合金試料を１％硝酸中で溶解した。次いで、公知の標準を使用して、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｚｒ、Ｃｅ、Ｓｒ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ａｌ、およびＣｕの濃度について溶液を分析した。

[微細構造解析]
熱処理（Ｔ６）および押出ししたＺＫ４０、ＺＪ４０／４１、およびＺＹ４０／４１合金の微細構造は、エポキシ樹脂（ＥｐｏｘｉＣｕｒｅ，Ｂｕｅｈｌｅｒ）にマウントし、半自動研磨システム（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｅｈｌｅｒ）を用いて、９μｍ、３μｍおよび１μｍのダイヤモンドスラリにより、次いで０．５μｍのコロイド状シリカにより機械的に研磨して鏡面仕上げを達成した。次いで試料を、５ｍＬの酢酸、６ｇのピクリン酸、１０ｍＬの水、および１００ｍＬのエタノールの溶液中で化学的にエッチングし、その直後にイソプロパノールを使用して洗浄して表面をきれいにした。熱処理（Ｔ６）および押出ししたＺＫ４０、ＺＪ４０／４１、およびＺＹ４０／４１合金の微細構造は、光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）を使用して観察した。また、ＺＫ４０、ＺＪ４０／４１、およびＺＹ４０／４１合金試料の研磨されエッチングされた微細構造を、粒界内の二次析出物を同定するために、エネルギ分散分光計（ＩＮＣＡ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を備えた走査電子顕微鏡（ＪＳＭ ６６１０ＬＶ，ＪＥＯＬ，Ｊａｐａｎ）も使用して分析した。コンピュータ断層撮影（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｎａｎｏｔｏｍ‐ｍ １８０ｋＶ／１５Ｗ Ｘ線ナノＣＴ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ，ＧＥ）画像も最小ボクセル解像度〜８０μｍで取り込み、アズキャスト焼鈍インゴット内に内包物、ボイド、および二次析出物が無いか分析した。

［浸漬腐食測定］
熱処理（Ｔ６）および押出ししたＺＫ４０、ＺＪ４０／４１、およびＺＹ４０／４１合金の浸漬腐食特性をＡＳＴＭ Ｇ３１‐７２に準拠して評価した。熱処理（Ｔ６）および押出ししたＺＫ４０、ＺＪ４０／４１、およびＺＹ４０／４１合金は、直径５ｍｍおよび厚さ１．５ｍｍの円板状に調製した。これらの円板はＳｉＣ研磨紙を用いて１２００グリットまで研磨した。浸漬試験の前に各試料の表面積および重量を測定した。試料は次いで超音波洗浄器を用いてアセトン中で洗浄し、両面をＵＶにより３０分間滅菌した。滅菌後、試料を３７．４℃のハンクス液（ＨＢＳＳ）中に１週間、３週間、および５週間浸漬した。ＨＢＳＳ培地は体積対表面積比を２０ｍｌ／ｃｍ^２に維持した。浸漬した試料はその後、各時点でＨＢＳＳ培地から取り出し、蒸留水で洗浄し、室温で乾燥した。さらに、各試料の分解生成物を２００ｇ／Ｌのクロム酸および１０ｇ／ＬのＡｇＮＯ_３溶液で１０分間洗浄し、３章および４章に記載した手順と同様に質量損失を評価した。浸漬前後の質量の差を記録し、ＡＳＴＭＧ３１‐７２に従って質量損失、密度、および表面積を用いて分解速度を算出した。三つのサンプルの測定値の平均および標準偏差を報告し、Ｔｕｋｅｙのｐｏｓｔ‐ｈｏｃテストによる一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、各時点について０．０５未満のｐ値で有意な平均差を決定した。

［引張試験］
ＡＳＴＭ‐Ｅ８‐０４ｍに従って引張試験を実施した。ＺＫ４０、ＺＪ４０／４１、およびＺＹ４０／４１合金を、ゲージ長が１３．５ｍｍ、幅が３ｍｍ、厚さ３ｍｍの標準ドッグボーン形状に機械加工した。５ｋＮのロードセルを用いたＩｎｓｔｒｏｎマシンを使用して、室温で１．３ｍｍ／分のクロスヘッド速度で一軸引張試験を実施した。各試料に対して得られた応力‐歪み曲線から、降伏強度（ＹＳ）、極限引張強度（ＵＴＳ）、ヤング率（Ｅ）、および伸び率（％）を得た。ヤング率は曲線の初期直線部分からも決定した。これら三つのサンプルの測定値の平均および標準偏差は、この後に続く結果の節で報告する。三つのサンプルの測定値の平均および標準偏差を報告し、Ｔｕｋｅｙのｐｏｓｔ‐ｈｏｃテストによる一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、各時点について０．０５未満のｐ値で有意な平均差を決定した。

［ＭＴＴ細胞生存率試験］
押出ししたＺＫ４０、ＺＪ４０／４１、およびＺＹ４０／４１合金の細胞適合性を調査するために、マウスの骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を、合金試料を培養培地に浸漬し、それらを７２時間インキュベートすることによって調製した抽出物培地を用いて培養した。１０％のＦＢＳおよび１００Ｕｍｌ^−１のペニシリン‐ストレプトマイシンを含む変法イーグル培地アルファ（αＭＥＭ）を細胞培養培地として使用した。合金試料を直径１０ｍｍおよび厚さ５ｍｍの円板状に機械加工し、ＳｉＣ研磨紙を用いて１２００グリットまで研磨した。試料の重量に対する培養培地の体積の比は、ＥＮ ＩＳＯ１０９９３：１２に準拠して１ｍＬ：０．２ｇに維持された。抽出物培地を０．２μｍの膜を用いて濾過し、このオリジナル抽出物を１００％抽出物とみなす。１００％抽出物中のＭｇ、Ｚｎ、Ｚｒ、Ｓｒ、およびＣｅの化学的濃度は、前に３章および４章に記載した手順と同様に、誘導結合プラズマ発光分析法（ＩＣＰ‐ＯＥＳ）を使用して測定した。１００％抽出物はさらに希釈して５０％、２５％、および１０％の抽出物溶液にした。ＭＣ３Ｔ３細胞を９６ウェルプレートに６０００細胞／ウェルの細胞密度で播種し、２４時間インキュベートした。ＭＣ３Ｔ３細胞を１００％、５０％、２５％、および１０％の抽出物培地でさらにインキュベートした。７２時間のインキュベーション後、Ｖｙｂｒａｎｔ ＭＴＴ細胞増殖キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して細胞生存率を評価した。ＭＴＴアッセイの前に、Ｍｇイオンと３‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐ｙｌ）‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）との間の干渉を防止するために、抽出物培地を新鮮な培養培地に交換した。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１．２ｍＭのＭＴＴを１１０μＬずつ各ウェルに加え、４時間インキュベートした。次いでドデシル硫酸ナトリウム‐塩酸溶液を加え、１２時間インキュベートして、ホルマザン結晶を可溶化した。次いで、前に述べた手順と同様に、Ｓｙｎｅｒｇｙ ２マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用して、５７０ｎｍの波長でホルマザン染料の吸光度を測定した。三つのサンプルの測定値の平均および標準偏差を報告し、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、抽出物培地の各希釈係数について０．０５未満のｐ値で有意な平均差を決定した。

［食塩水によるヒト間葉系幹細胞の培養］
ヒト間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ，Ａｌｌｅｎｄａｌｅ ＮＪ）を使用して、ｈＭＳＣの骨形成分化に対するＭｇ、Ｓｒ、およびＣｅイオンの効果を評価した。三番目の継体細胞は、Ｍｇ、Ｃｅ、およびＳｒイオンを含む成長培地および分化培地の両方で培養した。２０％のＦＢＳおよび１００Ｕｍｌ^−１ｍｐペニシリン−ストレプトマイシンを含む変法イーグル培地アルファ（αＭＥＭ）を成長培地として使用した。１００ｎＭのデキサメタゾン、５０μｍのアスコルビン酸、および１０ｍＭのβグリセロリン酸塩をさらに成長培地に添加し、骨形成培地を生成した。加えて、表３．２に示すように、１０ｍＭのＭｇＳＯ_４、０．１／１ｍＭのＳｒＣｌ_２、または０．１／１ｍＭのＣｅＣｌ_３を分化培地に添加した。ｈＭＳＣを６０００細胞／ｃｍ^２の細胞密度で播種し、成長培地で７日間培養した。これに続いて、成長培地をサンプル培地に交換し、さらに７日間および１４日間培養して、アルカリホスファターゼ活性および骨形成遺伝子発現を調査した。三つのサンプルの測定値の平均および標準偏差を報告し、Ｔｕｋｅｙのｐｏｓｔ‐ｈｏｃテストによる一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、各時点について０．０５未満のｐ値で有意な平均差を決定した。

［アルカリホスファターゼの測定］
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性は、酵素アッセイを使用し、ホスファターゼ基質としてのｐニトロフェニルリン酸塩（ｐＮＰＰ）の変換を測定して評価した。ｈＭＳＣ細胞はＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液（ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｍ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して溶解し、ＡＬＰを含有する細胞溶解物を調製した。ｐＮＰＰ基質溶液を細胞溶解物に添加して、酵素反応を評価した。３０分間のインキュベーション後、次いで０．３ＮのＮａＯＨ溶液を添加して、酵素反応を停止させ、４０５ｎｍで吸光度を測定した。ｐＮＰＰ基質溶液を０．０２ＮのＮａＯＨ溶液で希釈することによって、異なる濃度のｐＮＰＰ標準溶液を調製した。吸光度を標準曲線と比較することによってＡＬＰ活性を決定し、総二重鎖ＤＮＡによって正規化した。

[ｑＲＴ−ＰＣＲを使用した遺伝子発現調査]

ｈＭＳＣは、５．２．８節で上述した様々な合金元素塩を含む成長培地および分化培地で培養した。市販のＲＮＡ抽出キット（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）を使用して、これらのｈＭＳＣにＲＮＡの単離を実施した。２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの波長でマイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ ２，ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、ＲＮＡ濃度を測定した。各逆転写反応に対し約５０ｎｇのＲＮＡを使用した。逆転写は市販のキット（Ｉｍｐｒｏｍ‐ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して行った。その後、相補ＤＮＡは、ＳＹＢＲ緑色マスターミックス（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩ，Ａｇｉｌｅｎｔ）および表３．３に記載したプライマーを使用して、ｑＰＣＲ反応に供された。

［結果］
［位相および元素分析］
図３．１は、押出し後のベース合金Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ（ＺＫ４０）、Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒ‐Ｚｒ、およびＭｇ‐Ｚｎ‐Ｃｅ‐Ｚｒ合金のＸ線回折（ＸＲＤ）パターンを示す。パターンは純Ｍｇのｈｃｐ結晶構造を持つ単相αＭｇマトリクスと同定された。Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ、Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒ‐Ｚｒ、およびＭｇ‐Ｚｎ‐Ｃｅ‐Ｚｒ合金は、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｃｅ、Ｓｒ、またはＺｒと組み合わされた明瞭な金属間相が存在しないことを示した。ＸＲＤパターンは、種々の合金系の全てにαＭｇ固溶体単相が形成され、検出可能な量の金属間化合物は観察されないことを明確に示した。しかし、純Ｍｇとは異なり、Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ、Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒ‐Ｚｒ、およびＭｇ‐Ｚｎ‐Ｃｅ‐Ｚｒ合金の最高ピーク強度がピラミッド面に観察された。この観察は、αＭｇ固溶体単相の配向が合金の合成および処理中に変化したことを示唆する。

様々な合金元素の影響を示し、合金マトリクスおよび析出物の元素分析を行うために、後方散乱電子（ＢＳＥ）顕微鏡法を使用して押出Ｍｇ合金の微細構造を観察した。図３．２では、Ｍｇ合金のＢＳＥ画像が、Ｍで示されたマトリクスとＰで示された析出物とで分析されて、粒界に沿った高いコントラスト領域として金属間化合物析出物が存在すること明らかにした。析出量の増加がＳｒおよびＣｅの量の増加と共に観察された（図３．２ａ対図５．２ｂ〜ｅ）。Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒは、その名目組成に近い固溶体の形成と、３章でＺＫ４０合金について記載した場合と同様のＺｎ‐リッチＭｇ_７Ｚｎ_３析出物とを示した。Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒへの０．２５重量％のＳｒの追加は合金マトリクスに影響しなかったが、析出物中にＳｒおよびより少ない含有量のＺｎの存在をもたらした（図３．２ｂ）。Ｓｒの含有量をさらに追加してＳｒを１重量％増量しても、固溶体または析出物は同様の組成範囲を示し、組成が大きく変化することはないようであった。しかし、析出部位の数の増大が観察された（図３．２ｄ）。セリウムの追加はまた、析出物に対しても同様の効果を示し、Ｃｅの存在およびＭｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒと比較してＺｎの量の低下が示唆された（図３．２ｃ、ｅ）。Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｃｅ‐Ｚｒは、Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒ‐Ｚｒと比較してより多くの析出物を示した（図３．２ｂ、ｄ対図３．２ｃ、ｅ）。したがってＣｅの追加は、ＣｅとＭｇの固溶限界がより高いため、Ｓｒの追加と比較してより多くの析出物をもたらすことが観察された。

［浸漬腐食測定］
Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ合金の耐食性に対するＣｅおよびＳｒをマイクロ合金元素として追加することの影響は、ＨＢＳＳでの７日間および３５日間の浸漬腐食測定を使用することによって調査した。図３．３では、Ｍｇ合金の質量損失は、４章で前述の通り、ミリメートル／年（ｍｍｐｙ）単位の浸漬腐食速度に変換された。Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒ‐Ｚｒ合金は、Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒと比較して腐食速度に有意な差を示さない。他方、Ｍｇ‐Ｚｎ‐１Ｃｅ‐Ｚｒは、３５日間の浸漬後に腐食速度についてかなりの増加を示すが、Ｍｇ‐Ｚｎ‐０．２５Ｃｅ‐Ｚｒは依然として他のＭｇ合金に匹敵する耐食性を維持した。５．３．１節においてＢＳＥ画像で観察し考察したように、Ｍｇ‐Ｚｎ‐１Ｃｅ‐Ｚｒの場合、より多くの二次相含有量は結果的に、粒界に沿ったＭｇ‐Ｚｎ‐Ｃｅ混合物から開始する破局的腐食を招く。全体として、０．２５重量％および１重量％のＳｒの追加は、０．２５重量％のＣｅの追加と同様に、市販のＡＺ３１と比較して耐食性を著しく劣化させることはなかった。

［引張機械的特性］
引張試験を使用して種々の合金の機械的特性を決定し、その結果を表３．４に示す。Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ合金（ＺＫ４０）は４５．８ＧＰａの弾性係数、２８６．６ＭＰａの降伏強度（ＹＳ）、および３２７．２ＭＰａの極限引張強度（ＵＴＳ）、および９．３％の伸び率を示した。０．２５重量％および１重量％のＳｒをＭｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒに追加しても、結果はＵＴＳがわずかに増加して３１７．３ＭＰａおよび３２０．９ＭＰａになっただけである。弾性係数、ＹＳ、および伸び率に有意な差は無かった。他方、０．２５重量％および１重量％のＣｅをＭｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒに追加した場合、ＵＴＳは有意な増加を示し、それぞれ３３５．２ＭＰａおよび３４１ＭＰａになった。Ｍｇ‐Ｚｎ−１Ｃｅ‐Ｚｒの場合、９．３％から７．６％への伸び率の有意の低下も観察された。

［ＭＴＴアッセイ］
Ｍｇ基合金の分解生成物を含有する抽出物培地で細胞を１日間および３日間培養した後、ＭＴＴアッセイを用いてＭＣ３Ｔ３の細胞生存率を評価した。陰性対照としての成長培地と比較して、ＭＴＴアッセイの結果を図３．４に示すようにプロットした。Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ、Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒ‐Ｚｒ、およびＭｇ‐Ｚｎ‐Ｃｅ‐Ｚｒ合金の１００％抽出物培地は予想通り、市販のＡＺ３１Ｂまたは純Ｍｇとは対照的に、１日間の培養後でもすぐに１０％未満の細胞生存率を示した（図３．４ａ）。しかし、これらの合金の細胞生存率は、５０％の抽出物培地で〜５０％まで回復し、２５％および１０％の抽出物培地では〜９０％まで増加した。図３．４ｂは、ＭＣ３Ｔ３を抽出物培地で３日間培養後した後のＭＴＴアッセイに対し、同様の細胞生存率パターンを示した。４章で考察したように、総金属塩濃度の浸透圧衝撃によって誘発される細胞壊死を引き起こす静的培養の性質上、１０％の抽出物培地は生分解性Ｍｇ合金の細胞毒性を決定するのに適していることが示唆される。ＩＳＯ １０９９３：５プロトコルは、７５％以上の細胞生存率の達成は一般的に非細胞毒性とみなされると規定している。したがって、１０％の抽出物培地の細胞生存率は、これらの合金が実際にｓＭＣ３Ｔ３細胞株との細胞適合性を持つことを示唆している。

［ＡＬＰ活性の測定］
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を成長培地で７日間培養した。合金元素を含む骨形成分化培地でｈＭＳＣを７日間および１４日間培養した後、ＡＬＰ発現レベルを測定した（図３．５）。全ての塩濃度で成長培地と比較して、より高いＡＬＰレベルが観察されたが、合金元素塩を加えた分化培地群では、ＡＬＰの発現に有意な改善は無かった。ＣｅＣｌ_３を含む分化培地では７日後により低いレベルのＡＬＰ活性が観察されたが、ＡＬＰレベルは１４日後には分化培地と比較して回復した。ＭｇおよびＳｒイオンを加えることによって、ＡＬＰの発現に他の有意な差が生じることは無かった。

［遺伝子発現］
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＬ）およびオステオポンチン（ＯＰＮ）遺伝子発現を図３．６に示す。ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子の発現を減算し、かつ成長培地群の平均を減算することによって、ＡＬＰＬおよびＯＰＮの倍率変化が得られた。ＡＬＰＬの発現はＤＭ‐Ｍｇ‐１Ｓｒ群の有意な増加を示すものであった。ＯＰＮの場合、Ｍｇ、０．１／１ｍＭのＳｒ、および０．１ｍＭのＣｅを添加した培地は、発現レベルの有意な増加を示したが、Ｃｅを添加した培地は有意な改善を示さなかった。

［考察］
［耐食性および機械的特性に対するＳｒおよびＣｅの効果］
ＳｒおよびＣｅをＭｇ基合金、特にＭｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ系に加えることによる効果を調査した。加えて、耐食性、機械的特性、細胞適合性について調査し、生分解性Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ合金にＳｒおよびＣｅを徐々に加えることを取り込んだ場合の骨形成反応について調査した。Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒは、構造用途のために開発され使用された市販のＭｇ合金系である。それは適切な耐食性、機械的特性、および細胞適合性を有する。Ｍｇ‐Ｚｎ（Ｍｇ_７Ｚｎ_３）二次相析出物は粒界領域で形成することが観察される。これらの析出物はガルバニック腐食を受けやすく、孔食のイニシエータとして働く。したがって、ＳｒおよびＣｅは、これらの析出物の組成を変えるマイクロ合金元素として選択されてきた。ストロンチウム（Ｓｒ）はＭｇ合金の粒度を微細化し、Ｃｅは、酸化セリウムを形成するための結合エネルギおよび結合強度ならびに親和性が高いため、安定酸化物を形成することができ、したがって、Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ合金を腐食から保護するように働く。加えて、ＳｒおよびＣｅは、ヒト間葉系幹細胞の増殖および骨形成分化に対し肯定的な効果を有することが報告されている。

ストロンチウム（Ｓｒ）およびセリウム（Ｃｅ）はどちらもマイクロ合金元素として０．２５重量％および１重量％の量を使用した。ＳｒおよびＣｅの合金元素の固溶限度は低く、それを超えるとより多くの二次相析出物が形成されて、耐食性の低下を招き、ガルバニック腐食が発生し得るので、ごく少量のＳｒおよびＣｅを使用した。Ｘ線回折を用いてＭｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒ／Ｃｅ合金系に位相分析を実施した。図３．１に示すように、Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ、Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒ‐Ｚｒ、およびＭｇ‐Ｚｎ‐Ｃｅ‐Ｚｒ合金系に、明らかな第二相、非合金単元素、または多相合金もしくは化合物は観察されなかった。しかしながら、Ｍｇ合金の粒界に沿った第二相析出物が依然として存在することが、図３．２に示すように後方散乱走査電子（ＢＳＥ）顕微鏡下で明らかになった。これは、おそらく溶融物を完全に均質化処理するための充分な時間を与えない溶融および鋳造の処理条件であったため、あるいは、おそらく合金の押出中に、選択された時間、温度、およびリダクション比が悪くなって、析出物の不安定を引き起こし、粒界内部および粒界の周りにおける析出粒子のさらなる破壊および分布を招いたためである。

Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ合金系の析出物の組成は、したがって析出物組成をＭｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒ／Ｃｅ‐Ｚｒ合金系のＭｇ、Ｚｎ、およびＳｒ／Ｃｅの三成分混合物に変態させ、したがってＭｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒ‐Ｚｒ系の場合Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒの析出物、Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ‐Ｃｅ系ではＭｇ‐Ｚｎ‐Ｃｅの析出物が生じる。析出物の化学組成は各合金におけるベース合金（Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ（ＺＫ４０）系）の組成と同様であったが、ＢＳＥ画像ではより多くの析出物が観察された。Ｃｅの添加は、Ｓｒの添加と比較して粒界析出物を形成する傾向がより高かった（図３．２ｂ、ｄおよび図３．２ｃ、ｄを対比して参照されたい）。ＳｒおよびＣｅの添加によるこれらの析出物の結果、浸漬腐食の測定は耐食性の有意の改善を示した。Ｍｇ‐Ｚｎ‐１Ｃｅ‐Ｚｒ合金組成の場合を除き、他の全ての組成でＳｒおよびＣｅを添加した場合、全般的に腐食速度は市販のＡＺ３１に匹敵し、有意な差を示すことは無かった。Ｍｇ‐Ｚｎ‐１Ｃｅ‐Ｚｒは実際、ＢＳＥ画像から分かるように形成される析出物の量が大きいため、３５日間の浸漬後に腐食速度の増加を示した。

粒界における析出物は、文献で知られているように、転位運動を妨げるようにも働くことができ、Ｍｇ合金の機械的強度の向上につながる。

析出硬化が日常的に使用されて、合金元素または内包物または不純物相からの第二相析出物の析出を、時間温度変態（ＴＴＴ）図を介して特定の合金元素の融点より高い熱処理を実行することによって増大させることは、物理冶金学的原理からよく知られている。そのような最適化は本研究では実施されなかったが、本書に提示する最初の結果は、ＳｒおよびＣｅの添加についてのこれらの最適化研究の潜在的可能性を実際に得るために、そのような最適化を実行することができることを明らかに示している。それでもなお、ＳｒをＭｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒに添加しても、引張特性に有意な差は示されないことが分かった。他方、極限引張強度は、Ｃｅをそれぞれ０．２５重量％および１重量％添加することにより、３３５ＭＰａおよび３４２ＭＰａへと有意に改善した。しかし、Ｃｅを１重量％添加した場合によく見られる通り、通常通り、伸び率が低下して粒界強化が相殺された。

［Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ合金へのＳｒおよびＣｅによる細胞適合性および骨形成能］
生体材料の毒性は、インビボ実験を開始する前にしばしばインビトロ実験を用いて調査される。これに関連して、ＩＳＯ １０９９３プロトコルは、ＭＴＴアッセイを用いて示される細胞生存率に基づいてポリマー製および金属製の生体材料をスクリーニングするために開発され、使用されてきた。Ｆｉｓｃｈｅｒらは最初に、ＭＴＴアッセイの後に行ったＭｇ合金材料による直接細胞培養について、活発に腐食するＭｇイオンにより生じるホルマザン塩変換がアッセイ結果と干渉するように働いたため、結果が偽陽性になり得ることを報告した。動物に埋め込まれたＭｇ合金が有意な組織損傷を示さないのに、細胞に浸透圧衝撃を引き起こすＭｇイオンのオスモル濃度の問題が知られている。したがって、本研究では、１０％抽出物培地による細胞生存率を示し、Ｍｇ合金の毒性を格付けするためのより優れた許容可能な標識として役立つ、間接ＭＴＴアッセイ結果に研究の焦点を合わせた。静的浸漬試験中にＭｇによって示されたインビトロでの分解および細胞適合性が実際には、生分解性Ｍｇ合金のインビボ移植反応を表していないことは、広く受け入れられてきた。他方、Ｍｇ合金はインビボ移植中に分解速度が大きく低下し、したがって最小限の炎症反応を示す傾向がある。

修正を伴うＩＳＯ標準に準拠して、ＭＣ３Ｔ３細胞株を使用してＭｇ合金の細胞適合性を調べてきた。ＭＣ３Ｔ３細胞を１０％抽出物培地で３日間培養した後、ＭＴＴアッセイは、純Ｍｇと比較して、調査した全てのＭｇ合金で良好な細胞適合性を示した。純Ｍｇおよび市販のＡＺ３１は実験対照群として使用され、１００％抽出物培地を使用したとき、７５％より高い細胞生存率を示した。

細胞適合性に加えて、Ｍｇ、Ｓｒ、およびＣｅなどの合金元素の骨形成効果を、ＭｇＳＯ_４、ＳｒＣｌ_２、およびＣｅＣｌ３を添加した骨形成培地でヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を培養することによって調査した。しかし、ｈＭＳＣの骨形成分化に対するＺｒまたはＺｎイオンの影響についてのレポートは無かったので、ＺｒまたはＺｎイオンは本研究では考慮しなかった。ＭｇＳＯ_４の濃度は、ｈＭＳＣの増殖に最適であると報告されていたことから、１０ｍＭに維持した。Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒ／Ｃｅ‐Ｚｒ合金中のＳｒおよびＣｅの含有量は本研究では１重量％に制限されることから、ＳｒＣｌ_２およびＣｅＣｌ_３は、１ｍＭまたは０．１ｍＭの濃度に達するように１０ｍＭのＭｇＳＯ_４を含む骨形成培地に溶解される。さらに、ｈＭＳＣは複数の系統に分化する能力を有するが、ＭＣ３Ｔ３はすでに骨芽細胞の初期段階にあるので、ｈＭＳＣがＭＣ３Ｔ３の代わりに使用される。ｈＭＳＣを骨形成培地中で１４日間培養した後に成熟骨芽細胞を得ることができるので、集密なｈＭＳＣを添加培地で７日間および１４日間培養した。

アルカリホスファターゼはｈＭＳＣの骨形成分化の早期マーカーであるので、ｈＭＳＣを７日間および１４日間培養した後、アルカリホスファターゼを測定した。成長培地と比較して、骨形成培地および添加培地はより高いＡＬＰ活性を示した。しかし、Ｍｇ、Ｓｒ、またはＣｅを添加した骨形成培地では、ＡＬＰ活性の有意な向上は観察されなかった（図３．５参照）。したがって、これらの元素の骨形成効果を調べるために、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して遺伝子発現を定量化した。ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子によって正規化されたＡＬＰＬの発現は、図３．６に示すように、１ｍＭのＳｒを含有する培地では有意に上方制御されているようであった。しかしながら、全般的に、Ｍｇ、Ｓｒ、およびＣｅイオンを添加された骨形成培地は、ＡＬＰ活性およびｍＲＮＡの発現にさらなる改善を示さなかった。

［結論］
ＳｒおよびＣｅをマイクロ合金元素として生分解性Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ合金に添加する効果は、腐食および機械的特性のみならず、石灰化に寄与しかつ骨形成能を示すこれらの合金元素の生物学的影響の観点からも調査された。これらのマイクロ合金元素を使用して、第二相析出物が形成されることが観察された。Ｚｒの存在下でも同様に相応してＭｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒ／Ｃｅ三元相析出物を形成するため、二元Ｍｇ‐Ｚｎ相系におけるＳｒおよびＣｅの固溶度のおかげで、析出物は無事に形成されたようである。残念ながら、追加の合金元素を導入したことで、粒界に沿ってより多くの析出物の形成が誘発されたようである。したがって、耐食性の有意な改善は、予想されたが、観察されなかった。他方、ＳｒおよびＣｅを追加した場合のＭｇ‐Ｚｎ‐ＳｒおよびＭｇ‐Ｚｎ‐Ｃｅ析出物の形成を示す後方散乱ＳＥＭ分析によって確認された、大量の析出物の形成のため、機械的特性は改善された。Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒの細胞適合性は、ＳｒまたはＣｅの追加によって影響されないことが明らかになった。しかし、Ｚｎは、培養培地に溶解した塩化物塩の形の異なる合金元素によりＭＣ３Ｔ３細胞を培養した後、細胞生存率に低い耐性を示した。したがって、Ｍｇ‐Ｚｎ‐（Ｓｒ／Ｃｅ）‐Ｚｒ合金のＺｎ含有量は一定であるため、ＭＴＴアッセイで同様の細胞生存率が得られた。ＡＬＰ活性およびＡＬＰＬ遺伝子発現は有意な改善を示さなかったが、ＯＰＮ遺伝子はＭｇ、Ｓｒ、およびＣｅ塩を添加した骨形成培地でｈＭＳＣを培養した後、いくらか改善を示し、合金元素が合金系の石灰化能力に対し潜在的悪影響を持たないことを表した。しかし、ＺｎおよびＺｒに加えてＳｒおよびＣｅをも含むこれらの合金系の真の骨形成能を確認するには、インビボ試験が必要であろう。

＜実施例４＞
［Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒ‐Ｚｒ合金の髄内ピンを使用したラット大腿骨骨折修復］
[理論的根拠]
生分解性Ｍｇ‐Ｚｎ合金は、様々な整形外科用途に望まれる適切な分解特性、機械的特性、および生体適合性特性を示すことが期待される。生分解性Ｍｇ‐Ｚｎインプラント装置が経験する荷重に応じて、分解速度が異なり、したがって埋め込まれた装置の破損が突然の炎症反応を誘発する可能性があることはよく知られている。機械的応力がＭｇ‐Ｚｎ基合金の生分解性および石灰化反応に及ぼす影響を示すために、ラット大腿骨骨折モデルを選択し、耐荷重条件下でＭｇ‐Ｚｎ合金の生体適合性および石灰化能を調査する。Ｍｇ‐Ｚｎ合金は潜在的に髄内ロッドとして使用することが可能であるが、合金は髄内領域に埋め込まれて、癒着不良部を支持かつ固定し、骨折した大腿骨の治癒をもたらし、再結合させる。それに対応して、Ｍｇ‐Ｚｎ合金およびその分解生成物の生体適合性が、血液検査のみならず肝臓および腎臓の組織学的検査をも使用して評価される。骨の治癒および局所的毒性は、骨の組織学的検査および筋肉の元素分析を用いて評価される。

［実験計画］
上述したラット大腿骨骨折モデルにおける合金の有効性を実証するために、インビトロでの耐食性および機械的特性に基づいてＭｇ‐Ｚｎ合金の単一組成を慎重に選択した。同時に、Ｔｉ合金を対照群として使用し、骨の固定に現在使用されている最先端の臨床生体材料で観察される毒性レベルを模倣した。したがって、髄内ピンは同じ寸法に対応して機械加工した。各ピンは、骨切り術後に、各Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラットの右大腿骨の髄内領域に挿入した。ＭｇピンおよびＴｉピンの生体適合性を評価するために、インプラント装置を埋め込んだ動物を全て、２週間、８週間、および１４週間後に屠殺した。

［血液検査］
全血サンプルを全血球数パネルについて適切に分析した。血清サンプルを分析して、代謝および化学プロファイルの包括的全体像を得た。化学プロファイルを使用して、血中のリンおよびマグネシウムのレベルを本質的に評価した。

［マイクロＣＴ分析］
オリジナルのインプラントおよび採取した骨に対して、マイクロＣＴ撮像も実施した。それに応じて、体積損失から分解速度を算出した。最後に、ＣＴ画像に基づいて、骨治癒応答を決定し、評価した。

［組織学的検査］
また、それに応じて、肝臓および腎臓の組織を、中性緩衝ホルマリンを使用して固定し、パラフィンに包埋し、ミクロトームを使用して切片化した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色を実施して、組織の損傷または異常な反応が無いか検査した。次いで採取した大腿骨をその後非脱灰骨として処理し、プラスチックに包埋した。包埋した組織は相応して切片化され、ゴールドナーのマッソントリクロームおよびトルイジンブルーを含む様々な染色法にさらされた。

[統計的考察]
二方向ＡＮＯＶＡ統計分析を使用して、独立変数の時間および群に関して、分解速度および血液検査の平均比較を決定した。ＳｒまたはＣｅの添加が実際、骨形成能に対し効果を有することを立証するために、有意水準をｐ＜０．５に設定した。主観的肯定的な結果のみを正当化するために、組織学的検査の結果についても相応に慎重に検討した。

［予想される結果］
１４週間後、Ｍｇピンの５０％超の体積が分解後に残ると予想される。また骨折部位にカルス形成も起こり、固定の安定性の維持を助けることが予想される。血液検査結果および組織学的検査結果から、群および時点の間に有意な差は予想されない。化学パネル分析の分析後にＭｇのレベル上昇がおそらく予想され得る。しかし、レベルは正常範囲内に維持されることが予想される。

［大腿骨ピンの合金処理および作製］
電気抵抗炉（Ｗｅｎｅｓｃｏ Ｉｎｃ．）を用いてＭｇ‐４Ｚｎ‐０．１Ｓｒ‐０．５Ｚｒ（Ｍｇ‐Ｚｎ）合金を合成した。純Ｍｇ（ＵＳ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｉｎｃ． ９９．９７％）、Ｚｎショット（Ａｌｆａ‐Ａｅｓａｒ ９９．９９％）、Ｍｇ‐３０Ｓｒ母合金を軟鋼るつぼ内で溶融した。総金属量は２５０ｇであった。溶融マグネシウム合金を酸素から保護するために、０．５％ＳＦ６＋残部Ａｒの保護ガス雰囲気を用いて溶融プロセスを実施した。Ｍｇ、Ｚｎ、およびＳｒの溶融混合物を、７００℃で均質化し、Ｚｉｒｍａｘ（登録商標）（Ｍｇ‐３３．３重量％Ｚｒ）母合金（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｅｌｅｋｔｒｏｎ Ｌｔｄ．）を用いてジルコニウム成分を添加した。１分後および５分後に、液状溶融物は、ジルコニウム粒子を均等に溶解かつ分散させるために１０秒間攪拌することによって、さらに均質化した。溶融物を７００℃で３０分間維持し、次いで溶融液を５００℃に予熱した軟鋼鋳型（直径４４．５ｍｍ×８２．５ｍｍ）に注湯した。

頂部、側部、および底部の除去後のアズキャストＭｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒ‐Ｚｒ（Ｍｇ‐Ｚｎ）合金の中間部分を、旋盤を用いることによって直径３７．６ｍｍおよび高さ６０ｍｍの寸法に機械加工した。アズキャストＭｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒ‐Ｚｒ（Ｍｇ‐Ｚｎ）合金を３００℃で１時間熱処理し、油中で急冷し、２０５℃で１２時間焼鈍した。熱処理後、ノースカロライナＡ＆Ｔ大学（Ｇｒｅｅｎｓｂｏｒｏ，ＮＣ）で、３０：１の押出比を用いて熱間押出を実施した。

［動物実験計画］
動物実験はピッツバーグ大学の実験動物委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルに従って実施した。行われた外科処理の概要を図４．１に示す。本章に関係する群、時点、および動物の数は表４．１に示す。体重約２５０ｇのＳｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラットを３０匹使用した。Ｔｉ合金（Ti alloy）の埋込み用に１５匹のラットを無作為に選択し、残りのラットにはＭｇ合金ピンを埋め込んだ。各インプラント材料について、１０匹のラットはピン（pin）を２週間および１４週間埋め込み、５匹はカフ（cuff）を１４週間埋め込んだ。埋め込む各ピンについて、各ラットの右大腿骨に側方から接近し、ダイヤモンドホイールブレード付きドレメルドリルを使用して大腿骨の真ん中に骨切り術を実施した。ＴｉまたはＭｇ合金のピンを髄内領域内に挿置して、骨折した大腿骨の安定した再結合を達成した。骨折治癒および毒性分析のために、埋込みから２週間後または１４週間後にＴｉ群およびＭｇ群の両方から５匹を屠殺した。各カフインプラントについて、ＴｉまたはＭｇ‐Ｚｎ合金のカフは、１４週間後に毒性分析のために、骨折していない大腿骨の周りに埋め込んだ。

［放射線撮影およびコンピュータ断層撮影分析］
７日後に全動物のＸ線画像を取得し、インプラント位置および骨折した大腿骨のアラインメントを観察した。埋込み前のＭｇ‐Ｚｎ合金ピンを、マイクロコンピュータ断層撮影（ｍｉｃｒｏＣＴ）（ＶｉｖａＣＴ４０；Ｓｃａｎｃｏ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用してスキャンした。採取した大腿骨もまた、プラスチックに包埋した後、マイクロＣＴを使用してスキャンした。マイクロＣＴ画像の分析はＭｉｍｉｃｓ（Ｍａｔｅｒｉａｌｉｓｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して実施し、Ｍｇ合金ピンの分解速度を算出し、骨折治癒を評価した。５つのサンプルの測定値の平均および標準偏差を報告し、ｔ検定を使用して、様々な時点のＭｇ‐Ｚｎピン群について０．０５未満のｐ値で有意な平均差を決定した。

［血液検査］
手術前と２週間目および１４週間目の安楽死後に血液サンプルを取得した。Ｋ２‐ＥＤＴＡで採取されたサンプルは、血液学的分析のためにマーチフィールドラボ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）に送られた。赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、血小板数、および白血球数は、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＴ２０００ｉ自動血液分析装置（Ｓｙｓｍｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎ）を用いて分析された。生化学分析のために、血液サンプルは３０分間室温に維持して凝固させ、２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みの血清サンプルはＯｌｙｍｐｕｓ ＡＵ化学分析装置（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎ）を使用して分析した。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、総タンパク質、アルブミン、総および直接ビリルビン、コレステロール、グルコース、尿素、クレアチニン、リン、塩化物、カリウム、ナトリウム、およびマグネシウムを適切に測定した。三つのサンプルの測定値の平均を報告し、各パラメータの基準範囲と比較した。

[ＩＣＰ分析]
採取した肝臓および腎臓の組織を７０℃のオーブンで一晩乾燥させた。乾燥した組織サンプルを次いで、乳鉢と乳棒を用いて粉砕した。粉砕した組織０．５ｇを濃硝酸５ｍＬに溶解し、それを１３０℃で１４時間加熱し続け、３０％過酸化水素１ｍＬを添加した。次いでサンプル溶液を１０倍に希釈し、誘導結合プラズマ発光分析法（ＩＣＰ‐ＯＥＳ，ｉＣＡＰ ｄｕｏ６５００ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を分析対象の様々な元素の標準溶液と共に使用して測定した。三つのサンプルの測定値の平均および標準偏差が報告され、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、全ての他の群について０．０５未満のｐ値で有意な平均差を決定した。

［軟組織の組織学的検査］
採取した肝臓および腎臓の組織を、１０％中性緩衝ホルマリンで４８時間固定した。固定した組織は小片に切り出し、７０％〜１００％のエチルアルコールシリーズで脱水し、キシレン代替品を使用して洗浄し、パラフィンに包埋した。次いでパラフィン組織ブロックは回転ミクロトームを使用して切片化した。組織切片は温水浴で適切に皺を取り除き、ガラススライドに移した。乾燥後、組織スライドは、ヘマトキシリンおよびエオシン（染料）で染色し、マウント溶液を使用してマウントした後、光学顕微鏡を使用して撮像した。

[骨組織の組織学的検査]
非脱灰埋込みを使用して、インプラントを含む採取した大腿骨の組織学的検査分析を実施した。採取した大腿骨を７０％エチルアルコールで７２時間固定した。固定した大腿骨を次いで、７０％の希釈から連続して１００％まで希釈したエチルアルコールで脱水した。大腿骨をキシレンで洗浄し、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）（ＯｓｔｅｏＢｅｄ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に包埋した。タングステンカーバイドブレード付き回転ミクロトームを使用して、包埋した大腿骨から７〜１０μｍの組織切片を得た。切片を、切片作製中の破壊を防止するためにテープに接着した。切片はゴールドナーのマッソントリクロームおよびアルカリホスファターゼ染色を受けた。染色した切片を、グリセロール溶液を使用してガラススライド上にマウントし、光学顕微鏡下で観察した。

［結果］
［マグネシウム‐亜鉛‐ジルコニウム‐ストロンチウム（Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ‐Ｓｒ）合金ピンのインビトロ分解］
図４．２は、骨切り手術から１週間後のＴｉピンおよびＭｇ‐Ｚｎピンを埋め込まれたラットの代表的なＸ線画像を示す。画像を使用して、骨折した大腿骨の固定の質に基づいて各動物を安楽死させる時点を決定した。Ｘ線画像では、図４．２ｂおよび図４．２ｃに示すように、Ｍｇ‐Ｚｎインプラントの周囲に目に見える幾らかの水素ガスの発生が観察された。ＴｉピンおよびＭｇ‐Ｚｎピンの両方を埋め込まれたラットは、正常な運動および歩行挙動を示した。

採取した大腿骨は髄内ピンによる正常な骨折治癒反応を示した。傷の周囲にカルス形成が観察された。ＴｉピンおよびＭｇ‐Ｚｎピンの両方で大腿骨に形成されたカルスに、目に見える違いは示されなかった。しかし、埋込みから８週間後および１２週間後に大腿骨に形成されたカルスは、埋込みから２週間後のカルスと比較して、より硬くなった。Ｍｇ‐Ｚｎピンを含む骨折大腿骨は、Ｔｉピンを含む大腿骨ほど直線状に整列していなかった。

図４．３は、ＴｉピンまたはＭｇ‐Ｚｎピンを含むラット大腿骨のプラスチック包埋後の代表的なマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）画像を示す。Ｍｇ‐Ｚｎピンが破損した大腿骨は、骨折した骨の位置ずれが生じた。２週間後、五本のＭｇ‐Ｚｎピンのうち三本は二つに割れた。他方、Ｔｉピンには荷重による破断や損傷は無かった。破損したＭｇ‐Ｚｎピンによる大腿骨の変形癒合は、骨折治癒に大きな違いをもたらし得る。しかし、図４．３に示した、埋め込まれたＴｉピンおよびＭｇ‐Ｚｎピン両方のマイクロＣＴ画像は、１４週間後に骨折治癒過程が完了していないことを示した。埋込みの２週間後、Ｍｇ‐Ｚｎピンの周囲に、マイクロＣＴでは区別できない水素気泡がより多く発生したが、後述するように組織学的検査では目立っていた。しかし、１４週間後、気泡はマイクロＣＴ画像では区別できなかった。

髄内領域のＭｇ‐Ｚｎピンの残量をマイクロＣＴ画像から分析した（図４．４ｂ参照）。埋込みから２週間後のＭｇ‐Ｚｎピンの残量は８７．７％であった。１４週間後、残量は４２．０％に大幅に減少した。Ｍｇ‐Ｚｎピンの腐食速度を、図４．４ａに示すように体積損失および元の表面積から算出した。埋込みから２週間後のＭｇ‐Ｚｎピンは、０．９１±０．６５ｍｍｐｙの腐食速度を示した。Ｍｇ‐Ｚｎピンは２週の時点で最大の機械的応力にさらされるので、２週の時点における腐食速度は他の時点より高いと予想された。埋込みから１４週間のＭｇ‐Ｚｎピンは分解し続け、より大きい表面積が曝露されて、結果的に０．７７±０．３０ｍｍｐｙの腐食速度となる。

［血液検査結果］
表４．２は、ＴｉおよびＭｇ‐Ｚｎのピン／カフを２週間および１４週間埋め込んだ場合の骨切り手術前後のラットの血液検査結果をまとめたものである。赤血球、ヘモグロビン、および血小板数は、異なるインプラントおよび異なる期間の群の間で有意な差を示さなかった。Ｔｉピンの埋込みから２週間後の白血球数は、Ｍｇ‐Ｚｎ群と比較して著しく高かった。しかし、それは依然として基準範囲内にとどまった。

ＴｉおよびＭｇ‐Ｚｎのピン／カフの２週間および１４週間の埋込みに対する骨切り手術前後のラットの生化学分析結果を表４．３に記載する。２週間の埋込み後のＡＬＴは、ＴｉピンおよびＭｇ‐Ｚｎピンの両方とも、他の時点のインプラントと比較してかなり高いレベルを示した。しかし、これらのＡＬＴ値は依然として基準範囲内にとどまる。ＡＬＰ、ＴＢＩＬ、ＴＰ、ＡＬＢ、ＵＡ、ＣＲ、およびＧＬＢについては、全ての群がインプラントおよび埋込み期間の間で有意な差を示さず、Ｍｇ‐Ｚｎピンの分解による肝臓または腎臓の損傷の徴候が無いことを示唆した。

埋込みの前と後の血清中のカルシウム、ナトリウム、塩化物、リン、およびマグネシウムイオンレベルを表４．４に示す。インプラントまたは埋込み期間の間でこれらのイオンレベルに有意な差はみられなかった。全ての値は基準範囲内にとどまり、Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ‐Ｓｒ合金ピンの埋込みおよびその結果として生じる分解による全身イオン濃度の変化が無いことを示唆した。

［肝臓および腎臓のＩＣＰ分析］
肝臓または腎臓のＩＣＰ分析を実施して、Ｍｇ‐Ｚｎ合金ピンおよびカフの埋込み後の組織におけるあらゆる形態のＭｇ蓄積を、Ｔｉ対照と比較して調べた。図４．５ａでは、Ｍｇ‐Ｚｎインプラントを含む実験群から採取した腎臓で決定されたＭｇ濃度は、未手術群の腎臓の濃度と比較したときに、Ｍｇの蓄積を示さなかった。図４．５ｂは、未手術対照(non-operated control)の肝臓組織で観察されたＭｇ濃度が、乾燥組織１グラム当たり５２１μｇの範囲内であることを示す。埋込み時間に関係無く、ピンを埋め込んだＭｇ‐Ｚｎ合金群は、肝臓サンプルのＭｇ濃度に対照レベルとの有意な差を示さなかった。観察は血液検査結果と一致しており、上述したラット大腿骨モデルにおけるＭｇ‐Ｚｎ合金ピンおよびカフの埋込みが全身毒性を示さないことを示唆した。

［肝臓および腎臓のＨ＆Ｅ染色］
ＴｉピンおよびＭｇ‐Ｚｎピンの埋込みによる組織形態の組織学的違いを可視化するために、肝臓および腎臓の組織切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色を実施した。図４．６に示す埋込みの２週間後および１４週間後のＴｉ群およびＭｇ‐Ｚｎ群両方の肝臓切片は、核および中心静脈がはっきりと見える肝細胞の正常な分布を示した。腎臓の組織学的検査では、１４週間の埋込み後にＴｉ対照とＭｇ‐Ｚｎ群との間に、糸球体の形態、ボーマン嚢腔、毛細管、および曲尿細管の目に見える違いは、観察されなかった。全ての実験群の肝臓および腎臓の組織の組織学的形態は、未手術対照と同様の形態を示し、データは示されないが、群間または異なる時点間で違いは観察されなかった。ＩＣＰおよび血液検査の結果に加えて、Ｈ＆Ｅ染色は、生分解性Ｍｇ‐Ｚｎピンの埋込み後の分解による重要な腎臓および肝臓器官の損傷は確認されなかった。Ｈ＆Ｅ染色はＭｇの蓄積を決定するために使用することはできないが、組織学的検査が正常で機能的な組織を示すということは、蓄積に関連する損傷が腎臓および肝臓組織に存在しない可能性が高く、または時間の経過と共に、体内で一般的に行われる正常な排泄プロセスに従ってＭｇが確実に除去されることが可能であることを示唆するのに役立つ。しかしながら、埋め込まれた合金ピンに存在するＭｇ、Ｚｎ、Ｚｒ、およびＳｒの決定的な蓄積を確認するためには、より高度な技術が必要になるであろう。

［骨組織の組織学的検査］
プラスチック包埋後のラット大腿骨切片のゴールドナーのマッソントリクローム染色は、図４．７に示すように、典型的な骨折治癒反応を明らかにした。埋込みの２週間後、ＴｉピンおよびＭｇ‐Ｚｎ合金ピンを含む大腿骨は、骨折の周囲に軟骨内の骨発生および線維組織の形成を示した。埋込みの２週間後のＭｇ‐Ｚｎ合金ピンを含む大腿骨の骨組織の切片は、Ｍｇ‐Ｚｎピンの分解によるガスポケットを示した。しかしながら、埋込みの１４週間後に、ＴｉピンおよびＭｇ‐Ｚｎ合金ピンを備えた大腿骨は両方とも、骨再形成および膜内骨形成を示した。さらに、Ｍｇ‐Ｚｎピンを含む大腿骨のガスポケットは線維組織で満たされた。いずれにしても、ＴｉまたはＭｇ‐Ｚｎ群のどちらも、埋込みの１４週間後に骨修復は完了しなかった。

［考察］
生分解性Ｍｇ合金は、生分解性ポリマーおよび恒久的な生体不活性金属装置と比較して、骨折の修復と骨固定において同等またはさらに改善された利点を提供する潜在的可能性について、かなりの注目を集めてきた。Ｍｇは、ヒトの自然骨に合った機械的特性によって特徴付けられる。したがって、酸性の副産物をもたらす傾向があり、さらに容認できる骨足場システムとして機能するために望ましい骨形成能が欠如している生分解性ポリマーと比較して、合金は、自然骨とさらによく一致する機械的特性を示しながら、生体適合性がさらに高い分解生成物により時宜にかなった望ましい腐食速度を示すように設計される。生分解性Ｍｇ合金の急速な腐食は、水素ガスの発生および未熟な機械的破損を引き起こす可能性があり、機械的強度を維持しながら腐食速度を制御するために、改善された合金設計および他の表面工学戦略が必要になることは当然である。したがって、Ｍｇ合金のインビボでの分解および毒性試験は、埋込型装置の候補生体材料としてずっと望ましいバイオセイフティおよび有効性を実証する可能性がある。整形外科用装置は、しばしば耐荷重状態で使用され、よく知られた応力腐食メカニズムを介して応力が加えられたとき、金属はしばしばより急速に腐食する傾向がある。これは一般的なフィクスチャであり、かつ、応力に誘発される腐食、摩耗、および破片形成も見せる永久的な金属装置で、往々にしてこれまで多く観察された問題の様相である。

本研究では、Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒ‐Ｚｒ合金の耐荷重条件下の分解特性および生体適合性を試験した。Ｍｇ合金は、体内で分解することが知られているので、大腿骨ロッドとしての使用は意図していない。しかし、髄内ピンを使用する大腿骨骨折モデルは、骨治癒、炎症反応、および全身毒性のような関連のある生理学的反応を調べるために、インプラント材料に大きな負荷をかけて、応力に誘発される腐食を引き起こすことができ、したがって応力の存在下で治癒を研究するのに理想的なモデルシステムとして役立つ。したがって、この骨折モデルを使用して、一群のラットに大腿骨カフを１４週間埋め込んで、埋込み部位による全身毒性の差異を比較した。

Ｍｇ‐Ｚｎピンおよびカフのインビボでの分解を、手術の１週間後にＸ線画像を使用して評価した。早期時点で水素気泡が発生し、２〜３週間で速度論的に低下する傾向があることは広く受け入れられている。大きい負荷無く骨に埋め込まれたＭｇ合金も分解が遅く、気泡が見られない一方、皮下領域のＭｇ合金は、周囲の血管新生および血流の存在のため、かなりの気泡を示すことが報告されている。Ｍｇ‐Ｚｎ合金ピンおよびカフは両方とも、周囲の組織で水素ガスに包囲されることが観察された。骨組織学的検査結果もまた、Ｍｇ‐Ｚｎピン埋込みの２週間後の画像の骨折部位付近にガスポケットを示すＸ線画像と一致した（図４．２参照）。Ｘ線画像および骨組織学的検査結果は、ラット大腿骨におけるＭｇ‐Ｚｎ合金インプラントの腐食が気泡を発生させるのに充分急速であったことを示唆する。しかし、骨組織の組織画像に示されるように、埋込みの１４週間後に気泡は消えるようである。

骨折の治癒を行い、分解速度を定量的に決定するために、コンピュータ断層撮影を使用した。埋込みの２週間後に、骨折した大腿骨にＭｇ‐Ｚｎ合金ピンの破損が観察された。しかし、１４週間後、骨折部位の周囲にカルス形成および骨再形成が見られた。ＴｉピンおよびＭｇ‐Ｚｎ合金ピンを含む大腿骨は両方とも、同様の骨修復反応を見せた。ラット大腿骨骨折モデルは典型的には、骨折治癒過程を完了するまで最大五か月を要する。Ｍｇ‐Ｚｎピンを１４週間埋め込んだ五匹のうち三匹のラットの大腿骨には、即時手術の後、ラットを歩き回らせて古典的な応力腐食骨折モデルとして役立つかなりの負荷をその領域に与えて、動物が経験する過度の応力によるピンの破損の結果生じた結合不良が観察された。それにも拘わらず、他の大腿骨が合同で示唆するように、インプラントが許容できる有利な骨治癒反応を示し、より多くの骨再形成および皮質骨上の結合カルス形成が行われて、より良好な骨治癒が見られたことは注目すべきである。この結果は、潜在的な整形外科用途向けの合金系の潜在的安全性および有効性を実証するのに役立つ。前に説明した通り、明らかにＭｇ‐Ｚｎ合金ピンの加速的な腐食速度は、応力腐食の結果生じる。文献によると、非耐荷重条件下で、Ｍｇ‐Ｚｎ合金は実際、Ｍｇ合金と比較して、より高い腐食速度で分解することが知られている。ここに報告しかつ上述した分析に基づくと、耐荷重条件下のＭｇ‐Ｚｎ合金ピンの急速な腐食は、有害な局所組織反応の観点から、骨折修復に大きく影響しなかった。しかし、Ｍｇ合金の機械的強度は腐食と共に低下することでＭｇ‐Ｚｎ合金ピンは不具合を生じ、それは骨折治癒の結果に悪影響を及ぼす可能性はあったが、合金および処理パラメータのさらなる最適化によれば、必ずしもシステムの整形外科用途への潜在的適用性を否定するように働くわけではない。

インプラントの総体積の１５％および５５％が再吸収された埋込みの２週間後および１４週間後に、Ｍｇ‐Ｚｎ合金ピンを使用したラットの全身毒性を評価した（図４．４参照）。さらに、一群のＭｇ‐Ｚｎ合金カフを評価し、骨および筋肉の両方と接触するＭｇ‐Ｚｎ合金の毒性を査定した。１４週間後、カフは完全に再吸収された。血液および血清の検査は、血液、肝臓および腎臓の組織状態に破壊があればそれを検出するために、血液学的および生化学的分析に焦点を合わせた。赤血球数および生化学的パラメータは基準範囲に維持され、Ｔｉ、Ｍｇ‐Ｚｎ、および対照群の間に有意な差は無かった。最近の文献もまた、Ｍｇ合金のインビボでの分解後の血液検査結果に重大な異常は無かったことを報告している。血清分析からのＢＵＮ、ＣＲ、およびＵＡもまた、腎機能に有意な変化が無いことを示している。消化された組織に行われた誘導結合プラズマ分析の後、肝臓および腎臓にはＭｇの蓄積も見つからなかった。肝臓および腎臓の組織学的検査もまた、健康な組織を反映する組織形態学的パターンを示した。体内の過剰なＭｇは、腎濾過後に尿中に排泄されることが知られている。しかし、許容限度を超える身体Ｍｇ濃度は腎不全を引き起こす可能性がある。これまでに発表された文献に基づいて、体内の高用量のＭｇは肝臓または腎臓以外の特定の器官に局所蓄積を引き起こさないので、本明細書に記載した毒性試験方法は有効である。他の器官におけるＭｇの局所蓄積を追跡するために、バイオセンサまたは量子ドット染色法を使用して、蓄積の正確な位置および蓄積量を特定することを考慮することができる。全体的に、血液検査、Ｍｇ濃度、および組織学的検査結果からの観察は、ここで考慮されるＭｇ‐Ｚｎ合金インプラントおよびそれらの分解生成物が、耐荷重条件下で可能な整形外科用インプラントとしての潜在的用途に対し実際に生体適合性があることを、一貫して示している。

［結論］
Ｍｇ‐Ｚｎ合金は、対照としてのＴｉ合金と比較して、ラット大腿骨骨折モデルを使用して、耐荷重条件下で大腿骨ピンとして検査された。Ｍｇ‐Ｚｎ合金ピンの加速的な分解は、応力腐食のため発生した。したがって、初期に水素ガスポケットが観察されており、一部のピンは埋込み２週間の早期段階でそれらの機械的安定性を失う傾向がある。しかし、骨組織学的分析の後、正常な骨治癒が示された。Ｍｇ‐Ｚｎ合金インプラント装置の周辺の局所組織にも、線維性被膜の形成または有害な免疫反応は観察されなかった。さらに、Ｍｇ‐Ｚｎインプラントの分解は血液パネル検査を用いて評価した血液学的または生化学的マーカーに有意な変化を生じなかった。特定の合金元素についての組織の元素分析の後、肝臓および腎臓のマグネシウム濃度もまたこれらの器官にＭｇの蓄積が無いことを実証した。肝臓および腎臓の組織学的検査もまた、Ｍｇ‐Ｚｎ合金インプラントによる器官の損傷が無いことを示した。全体的に、結果は、Ｍｇ‐Ｚｎ合金が耐荷重条件下で有利な生体適合性を実証することを示唆している。

［一般的結論］
Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ合金は最初、整形外科用途向けの生分解性金属として使用する潜在的可能性を調べるために研究された。アズキャストおよび溶体化処理されたＭｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒは両方とも、電気抵抗炉で溶融し、軟鋼鋳型で鋳造し、箱型炉で熱処理の後処理を行うことによって合成された。アズキャストおよび溶体化処理したＭｇ‐Ｚｎ‐ＺｒのＸ線回折パターンは、金属間化合物の明確なピークの無いαＭｇ相を示した。しかし、後方散乱電子顕微鏡法は粒界に沿ったＭｇ／Ｚｎ金属間析出物を明らかにした。Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒの溶体化処理は、これらの析出物の相変態を引き起こしてＭｇ‐Ｚｎ析出物とαＭｇ材料との間のガルバニック腐食を低減させるために行われた。Ｍｇ‐Ｚｎ析出物は、合金の名目組成により近いＭｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ相混合物に無事に変態した。しかし、動電位分極測定では、腐食電位または電流密度の有意な改善は見られなかった。

アズキャストおよび溶体化処理したＭｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒは次いで、耐食性、機械的特性、および細胞適合性についてインビトロでの評価を受けた。Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒの腐食は、溶体化処理後、析出物の相変態のため改善した。溶体化処理したＭｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒの浸漬腐食速度は、アズキャストＭｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒより低いことが観察された。アズキャストおよび溶体化処理したＭｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ両方の引張強度および圧縮強度は、純Ｍｇより高いが、市販のアズドローンＡＺ３１とは比べものにならないことが観察された。Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ合金の細胞適合性は、生分解性金属について変更したＩＳＯ １０９９３標準を使用して評価された。ＭＣ３Ｔ３マウス前骨芽細胞の優れた細胞生存率がアズキャストおよび溶体化処理したＭｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ合金の両方で示された。有望な予備インビボ分解および組織適合性結果もまた、アズキャストＭｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒペレットがヌードマウスモデルの皮下に埋め込まれたときに、これらの合金によって示された。

粒界析出物中のＺｎリッチ金属間相を低減することによって耐食性をさらに改善するために、ＳｒおよびＣｅをマイクロ合金元素としてＭｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ合金に添加することについて調査した。後方散乱電子顕微鏡を用いた微細構造分析は、析出物の相変態を明瞭に示した。マイクロ合金元素の導入は、Ｍｇ中のＳｒおよびＣｅの固有の固溶度が低いため、０．２５％および１％の添加がＭｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ系に導入されただけであるが、より多くの析出物を生成した。鋳造および押出を行う前の合金溶融物の均質化処理に要求されるＣｅの融点がより高いため、ＣｅはＳｒに比べて、粒界に沿って析出物を形成する傾向があった。全体的に、Ｍｇ‐Ｚｎ‐０．２５Ｓｒ‐Ｚｒ、Ｍｇ‐Ｚｎ‐１Ｓｒ‐Ｚｒ、およびＭｇ‐Ｚｎ‐０．２５Ｃｅ‐Ｚｒの耐食性は、Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒと比較して有意な差を示さなかった。しかし、Ｍｇ‐Ｚｎ‐１Ｃｅ‐Ｚｒは、ハンクス緩衝液に３５日間浸漬した後、より高い腐食速度を示した。引張試験では、アズエクストルーデッド（ａｓ−ｅｘｔｒｕｄｅｄ）Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｚｒ、Ｍｇ‐Ｚｎ‐Ｓｒ‐Ｚｒ、およびＭｇ‐Ｚｎ‐Ｃｅ‐Ｚｒは、市販のＡＺ３１を上回った。より多くの析出物は転位障害に寄与し、強度の増大を導くため、極限引張強度はＣｅの添加により増大した。Ｍｇ‐Ｚｎ合金はＭＣ３Ｔ３との良好な細胞適合性をも示した。ＭＣ３Ｔ３を用いてＭｇ、Ｚｎ、Ｓｒ、およびＣｅイオンレベルの耐性を調べ、最高０．１ｍＭの低いＺｎ耐性が観察された。Ｍｇ、Ｓｒ、およびＣｅの骨形成分化能をヒト間葉系幹細胞でさらに調査した。ＡＬＰ活性およびＡＬＰＬ遺伝子発現は、分化培地対照と比較して大きい変化を示さなかった。しかし、ＯＰＮ遺伝子発現は、分化培地にＭｇ、Ｓｒ、およびＣｅイオンを添加することにより、幾らかの改善を示した。

Ｍｇ‐Ｚｎ合金の生体適合性を実証するために、応力腐食環境を形成するように意図されたラット大腿骨骨折モデルに対し、Ｍｇ‐Ｚｎ‐０．２５Ｓｒ‐Ｚｒ（Ｍｇ‐Ｚｎ）合金を選択した。骨切り術の後、Ｍｇ‐ＺｎおよびＴｉ合金対照の髄内ピンを埋め込み、耐荷重条件下で分解および毒性を評価した。極端な応力腐食環境でＭｇ‐Ｚｎ合金およびその分解生成物の毒性を試験するために選択されたモデルのため、応力腐食によるＭｇ‐Ｚｎ合金の加速的腐食が予想された。Ｍｇ‐Ｚｎピンの埋込みから１週間後のＸ線画像には、急速な腐食のため、埋込み部位の周囲に水素ガスポケットが見られた。マイクロコンピュータ断層撮影分析は、Ｍｇ‐Ｚｎ合金のインビトロ腐食速度と比較して、Ｍｇ‐Ｚｎピンのより高い腐食速度を示した。しかし、埋込みから１４週間後の骨組織学的検査およびＣＴ分析で、Ｍｇ‐Ｚｎピンの周囲のガスポケットが線維組織で満たされていることが明らかになり、Ｔｉ合金対照と比較して、正常な骨折治癒が観察された。Ｍｇ‐Ｚｎ‐０．２５Ｓｒ‐ＺｒおよびＴｉ合金のカフをラット大腿骨に埋め込み、これらのインプラントが骨および軟組織の両方と接触したときの局所組織反応または全身毒性に差がでるかどうかを調査した。どちらのシナリオでも、Ｍｇ‐ＺｎおよびＴｉ装置の埋込みから２週間後および１４週間後の血液パネル検査および肝臓および腎臓のヘマトキシリン＆エオシン染色に、有害な毒性反応は観察されなかった。消化された器官に対し誘導結合プラズマ分析を使用することによって、肝臓および腎臓におけるＭｇの蓄積は確認されなかった。したがって、四つの明確な目的の全てに基づき、調査は本質的に、Ｍｇ‐Ｚｎ合金系が実際に極めて有望であり、効果的に処理した場合、制御された量のＳｒおよびＣｅを添加することにより、改善された腐食、状況に応じた機械的強度、およびおそらく期待される骨形成能をももたらすことができることを示す。

実施された実施例に基づいて、インビトロおよびインビボ両方の条件下でＭｇ‐Ｚｎ合金の望ましいバイオセイフティは明確に実証されたと解釈することができる。生分解性Ｍｇ‐Ｚｎ装置には、マイクロアーク酸化（ＭＡＯ）、層状（ＬｂＬ）高分子電解質コーティング、合成および天然ポリマーの使用、ならびに多種多様な金属コーティングなど、様々なコーティング技術を適用することができる。これらの戦略は、急速な腐食および早期の機械的破損を防止する一方で、成長因子および信号伝達分子の送達を増強し、足場としてだけでなく薬剤および生体分子の送達システムとしても働く「スマートな（smart）」足場およびインプラントシステムを生成するのに役立つことができる。

＜実施例５＞
［新規なＭｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ基合金の合成と、材料特性化の実施と合金元素の添加および後処理処置後の微細構造の変化の評価］
Ｍｇ合金の加速的腐食は、インプラント周囲の水素ガスポケットの蓄積のためだけでなく、分解中および組織の治癒過程中の不充分な機械的性能およびインプラント安定性のためもあり、生体材料としてのその採用が制限されてきた。純Ｍｇの耐食性を向上し、機械的特性を高めるために、この目的のための理論的根拠として概説したように、適切な合金元素Ｙ、Ｃａ、Ｚｒ、およびＺｎの添加が導入された。

Ｍｇの合金化では、生物適合性合金元素の選択肢は限られており、Ａｌ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃａ、Ｌｉ、Ｚｒ、Ｙ、および希土類（ＲＥ）元素の中から選択することができ、Ｍｇインプラント材料を生成するために使用され、一般的にＭｇ合金の機械的特性および材料特性に影響を及ぼす。Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金は、耐酸化性を改善する能力のため、耐着火性合金として成功裏に製造されている。Ｙの導入は、それがマグネシウム合金の粒界強化に寄与しかつＭｇと合金化するときに３％より高い重量％で耐食性をも向上する能力によって、正当化することができる。Ｙと同様にＣａも、密度汎関数理論計算によって示されるように、安定で化学反応性の低い水酸化物層の形成を助け、高い耐食性をもたらす。Ｃａはまた、石灰化した自然骨の主成分であり、人体で最も豊富なミネラルであり、最高１重量％まで添加したときにＭｇ合金の耐食性および機械的特性を改善することが知られている。他方、Ｚｒは、粒界強化および耐食性をもたらすことによって効果的な粒子微細化剤として働く。Ｚｒはまた、強力な鉄除去剤でもあり、通常、Ｚｒ含有マグネシウム合金の鉄の含有量を２０ｐｐｍ未満に減らすのを助け、こうして鉄不純物による腐食のリスクを低減する。さらに、ＣａをＺｒ含有合金に添加すると溶質の過冷却が促進され、それがまた、Ｚｒ核の適切なサイズが効果的な核生成部位となるのを容易にし、粒度をさらに低減する。Ｚｎはまた、人体で最も豊富な必須元素の一つでもあり、Ｍｇ合金の耐食性および機械的特性のみならず、より大量（２重量％超）の鋳造性をも向上することができる。Ｍｇ合金中のＹおよびＺｎの組合せは、結果的に特定の構造、すなわち原子のｃ軸に沿った最密面の周期的スタックから成る長周期積層（ＬＰＳＯ）構造の形成をもたらし、高い強度および延性が得られることも示されている。

予備研究で使用した元のＭｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金系を変形かつ強化して、本論文で考察する第二合金群を作製した。第一に、Ｚｒの含有量を０．４重量％から１重量％に増やした。それは、ＩＣＰ‐ＯＥＳ測定から、溶液中に溶解するＺｒの量がＭｇ‐合金鋳造インゴットで予想されるよりずっと低いことが示されたためである。Ｚｒの量のこの減少は一般的に、Ｚｒ粒子がるつぼの底部のＺｒリッチ層に沈降するために観察されるものであり、溶融Ｍｇ溶液に残存するＺｒだけが粒子微細化プロセスに影響を及ぼす。したがってＺｒは、溶融、汚染、鉄のピックアップ、析出等の間の損失を補償し、さらなる処理無しで適切なレベルを維持するために、最終的な所望の重量パーセントを超える量が添加される。Ｍｇ合金に対するＹの添加の効果をさらに決定するために、Ｙを含まない合金（Ｍｇ‐１Ｚｒ‐０．６Ｃａ）も合成し、Ｙを含有する合金と比較した。

ＹおよびＺｒを含有する合金は、新規冠動脈病変の患者の薬剤溶出ステントおよび外反母趾手術におけるネジ（これらは欧州内で医療用途向けの医療装置のＣＥマークを受けている）に使用され、臨床的成功を収めてきた。両方の装置は、吸収性のポリマーおよび金属材料に代わるものとして良好な安全性プロファイルおよび性能を実証した。

合金元素の選択に加えて、処理方法もまた、合金の微細構造およびしたがって合金の特性に大きく影響する。本研究では、αＭｇマトリクス内への拡散を促進するべく推進力を提供することによって、二次相の体積分率を低減するために、５２５℃で８時間のＴ４溶体化処理を試みた。粒子の微細化をもたらすための手段として、熱間押出も実施した。これは実際、均質で微細な粒子を生成するには、圧延および鍛造など展伸用Ｍｇを製造するための他の方法より効果的な方法である。

様々な合金の名目組成、およびこの明確な目的で考慮される合金を生成するために使用される処理方法を、表５．１に記載する。本明細書で考察する合金を指定するために使用する表５．１に示された合金の略語は、コード化に関するＡＳＴＭ Ｂ２７５標準を用いて決定されたものであり、量が最も多い二つの合金元素を表す二つ以下の文字が記載されている。Ｗはイットリウムを表し、Ｘはカルシウムを表し、ＫはＺｒを表し、ＺはＺｎを表す。アズキャストおよびＴ４熱処理形態のコード表記ＷＸ１１およびＷＸ４１合金は、１．０重量％Ｚｒの添加後に、それが二番目に多く存在する合金元素となったので、カルシウムを表すＸがジルコニウムを表すＫに置き換えられ、ＷＫ１１およびＷＫ４１と変更された。

［材料および方法］
［Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ基合金の冶金処理］
Ｍｇ（ＵＳ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｉｎｃ．，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ、９９．９７％）、Ｃａ（Ａｌｆａ‐Ａｅｓａｒ，Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ，ＭＡ、９９．５％）、およびＺｎ（Ａｌｆａ‐Ａｅｓａｒ、９９．９９％）の元素インゴットを名目組成に従って計量し、電気抵抗炉（Ｗｅｎｅｓｃｏ Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を用いて軟鋼るつぼ内で溶融し、純元素の酸化を回避するために超高純度（ＵＨＰ）Ａｒをパージし真空を引いた誘導炉（ＭＴＩ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を用いて、黒鉛るつぼ内で溶融して調製した純ＭｇおよびＹ（Ａｌｆａ‐Ａｅｓａｒ、９９．９９％）から溶融させたＭｇ‐３０Ｙ重量％母合金を添加した。母合金および純元素は徹底的に洗浄して残留物および酸化物スケールを除去し、Ａｒ＋０．５％ＳＦ６カバーガスの保護下でＷｅｎｅｓｃｏ電気抵抗炉を用いて軟鋼るつぼ内で溶融した。溶融注湯温度は７５０℃であり、この温度に達した後、Ｚｉｒｍａｘ（Ｍｇ‐３３．３％Ｚｒ）母合金（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｅｌｅｋｔｒｏｎ Ｌｔｄ．，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）を使用して、同量のジルコニウムを加えた。Ｍｇ‐Ｚｒ母合金を加えた後、溶融物を１分および５分の間隔で１０秒間攪拌して、ジルコニウム粒子を溶融物中に均等に溶解かつ分散させた。溶融物をさらに３０分間維持し、５００℃に予熱した直径４４．５ｍｍ×長さ８２．５ｍｍの円筒状軟鋼鋳型に注湯した。Ｚｒ粒子をＺｉｒｍａｘ母合金から放出させるための保持および攪拌時間は、溶融物中のＺｒのより高い固溶度および最適な粒子微細化を達成するために不可欠であった。アズキャストサンプルを溶体化処理したサンプルと比較するために、５２５℃で６時間の（Ｔ４）の熱処理が、連続ＵＨＰアルゴン流下で被覆された管状炉の内部で合金インゴットに対し実施され、室温の水中で急冷された。

押出合金は、付属書類Ｂに示すように、合金の延性を高め、二次相を均質化する一方で、結晶粒成長を引き起こさないように、最初に溶体化処理を４００℃で２０時間適用し、室温の水中で急冷することによって、アズキャスト合金から調製した。旋盤を使用してインゴットの直径を３７．８ｍｍに縮小した後、合金は１０および３０の押出比で以下の温度で熱間押出を行った。

報告する試験で、合金を、アズキャストＭｇ（ＵＳ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｉｎｃ．）、アズドローン９９．９％純Ｍｇ（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ Ｃｏｒｐ．，Ｃｏｒａｏｐｏｌｉｓ，ＰＡ）、およびアズドローンＡＺ３１（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ Ｃｏｒｐ．）と比較した。誘導結合プラズマ発光分析法（ＩＣＰ‐ＯＥＳ，ｉＣＡＰ ｄｕｏ ６５００ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、合金サンプルを１５％硝酸に溶解し、水で５倍に希釈し、溶解した合金を含む溶液の合金元素および不純物元素の濃度を測定することによって、合金の組成および不純物の有無を実験的に確認した。

［Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ基合金の相特性化］
相形成を決定するために、Ｓｉ検出器（Ｘ’ｃｅｌｅｒａｔｏｒ）を有しており、ＣｕＫ_α（λ＝１．５４０５６Å）放射線を使用するＰｈｉｌｉｐｓ Ｘ’Ｐｅｒｔ ＰＲＯ 回折計を用いて、Ｘ線回折（ＸＲＤ）を行った。Ｘ線発生装置は１０〜８０°の２θの範囲で４５ｋＶおよび４０ｍＡで動作した。ピーク同定はＸ’Ｐｅｒｔ Ｈｉｇｈ Ｓｃｏｒｅ Ｐｌｕｓソフトウェアを使用して行われた。

［Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ基合金の微細構造分析］
Ｍｇ合金のサンプルはエポキシにマウントし、アルミナスラリーと共に１２００グリットのＳｉＣ研磨紙により０．０５μｍまで機械的に研磨し（Ｔｅｇｒａｍｉｎ‐２０，Ｓｔｒｕｅｒｓ，Ｂａｌｌｅｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、５ｍＬの酢酸、６ｇのピクリン酸、１０ｍＬの水、および１００ｍＬのエタノールの溶液中で化学的にエッチングした。微細構造は光学顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ ４０ ＭＡＴ，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ，ＪＥＯＬ ＪＳＭ‐６６１０，ＪＥＯＬ Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して観察し、エネルギ分散Ｘ線（ＥＤＸ、ＥＤＡＸ Ｇｅｎｅｓｉｓ，Ｍａｈｗａｈ，ＮＪ）で元素分析を行った。ＡＳＴＭ Ｅ１１２に準拠して、各計算に最大７０グレインまでを考慮してエイブラムズ三円法に従って平均粒度を測定した。

［結果］
［アズキャストおよび溶体化処理されたＭｇ‐Ｙ‐０．６Ｃａ‐０．４Ｚｒ基合金の材料特性］
誘導結合プラズマ発光分析法（ＩＣＰ‐ＯＥＳ）による測定（表５．３）は、合金元素が、おそらく再溶融プロセスのため、それらの計量された名目組成から幾らか減少することを示した。Ｚｒの減少は、主として液状溶融物中の大きいジルコニウム粒子およびクラスタが沈降するためであり、溶融時により多くのＺｒを加え、含有量を予備研究における０．４重量％（ＷＸ１１およびＷＸ４１合金）から１．０重量％（ＫＸ１１、ＷＫ１１、ＷＫ４１、およびＷＺ４２合金）に増やすことによって対抗した。実質的なガルバニック腐食を回避するために必要に応じて、低い不純物レベルが観察された。

図５．１に示すように、Ｍｇ合金における様々な相の存在は、Ｘ線回折（ＸＲＤ）によって特徴付られた。ＸＲＤパターンは、非合金Ｙ、Ｃａ、Ｚｒ、または金属間相の存在を検出することなく、全ての合金がｈｃｐのαＭｇから構成されたことを示す。しかし、おそらくＺｒの存在が粒子微細化のための核生成部位として働き、可能な優先配向をもたらしたため、典型的なＭｇ（００２）面が最も強いピークであることを示すアズキャスト純Ｍｇと比較して、合成されたアズキャストおよび溶体化処理合金の全てにＭｇ面の明らかな優先配向が存在した。

図５．１は、アズキャスト純Ｍｇ、ＷＸ１１、およびＷＸ４１のＸＲＤパターンを示す。

図５．２は、αＭｇの結晶粒子を含むアズキャストおよび溶体化処理されたＷＸ１１およびＷＸ４１合金の微細構造の光学顕微鏡画像を示しており、粒界に二次相（暗い領域）があり、マトリクス内に析出物がある。

合金の平均粒度は、アズキャストＷＸ１１が７９μｍ、Ｔ４処理ＷＸ１１が９８μｍ、アズキャストＷＸ４１が９８μｍ、Ｔ４ＷＸ４１が２００μｍであり、微細構造全体で均一等軸αＭｇ粒子の存在が支配的であった。予想通り、溶体化処理は粒度の増大をもたらした。しかし、暗い二次相が明らかに無くなった図５．２ｅに示すように、合金元素の添加は、高純度Ｍｇと比較して、粒度を大幅に低減させた。市販の引抜きプロセスのため粒子の微細化を受けたアズドローンＡＺ３１は、Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金ＷＸ１１およびＷＸ４１、ならびにバルク形成プロセスを受けていない純Ｍｇと比較して、（図５．２ｆに示すように）はるかに微細な粒度を示した。

ＳＥＭおよびＥＤＸ（図５．３に示す）は、ＷＸ１１およびＷＸ４１アズキャスト合金が粒界および多量のＹおよびＣａ（図５．２ａおよびｃに示す）の析出物を含むという光学顕微鏡画像を確認し、少量のＹ、Ｃａ、およびＺｒを含むが、鋳造の一般的な現象である固化中の析出物の偏析のため、大部分がＹから成る組成の二次相が粒界に存在することを示唆した。Ｔ４溶体化処理はこれらの二次相をバルクαＭｇに成功裏に溶解させ、アズキャスト合金の部分的な均質化処理をもたらした。Ｙリッチ金属間粒子は約７５％重量％Ｙを含み、αＹを形成し、それはＴ４溶体化処理後も依然として存在することが観察された（図５．３ｂおよびｄに示す通り）。ＷＸ４１合金は、そのＹ含有量がＷＸ１１と比較して高いため、より高い体積分率の第二相粒子が観察された。Ｔ４溶体化処理後の粒度の増大は、熱処理後に予想されるように、三点粒界領域に沿ってより小さい粒子の合体を推進するエネルギ、および析出物がマトリクスに溶解した後の過飽和αＭｇ固溶体の形成のためと思われた。

［押出とＭｇ‐Ｙ‐１Ｚｒ‐０．６Ｃａ基合金へのＹおよびＺｎの添加による相および微細構造の変化］
修正されたＭｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金系は１．０重量％のＺｒを含有した。Ｙを含まない合金（Ｍｇ‐１Ｚｒ‐０．６Ｃａ）およびＺｎを含む合金（Ｍｇ‐４Ｙ‐２Ｚｎ‐１Ｚｒ‐０．６Ｃａ）をも合成し、Ｍｇ‐Ｙ‐Ｚｒ‐Ｃａ合金に対して材料特性およびインビトロ特性を比較した。これらの合金は１０の押出比（初期断面積÷最終断面積）で表５．２に示す温度で押し出され、さらなる分析を受けた。

図５．１は、押し出されたＫＸ１１、ＷＫ１１、ＷＫ４１、およびＷＺ４２のＸＲＤパターンを示す。Ｍｇ合金のＸＲＤ（図５．１）は、ＫＸ１１、ＷＫ１１、およびＷＫ４１の場合、押出後に合金が依然として主として単相Ｍｇから成ることを示す。Ｙの添加は、ＹをＭｇのｈｃｐ格子内に導入したことによって生じた格子膨張のため、全てのピーク位置に、特に〜３７°２値の配向ピークに、ずれをもたらした。同様の好適な配向はここでは、Ｚｒの含有量の増加によって影響されないことが分かる。予想通り、ＹおよびＺｎを含むＷＺ４２合金には、ＬＰＳＯ相Ｍｇ_１２ＹＺｎが存在した。

図５．５は、押出比１０で押し出されたＭｇ合金の微細構造を示す光学顕微鏡写真を示しており、ａ）、ｆ）はＫＸ１１、ｂ）、ｇ）はＷＫ１１、ｃ）、ｈ）はＷＫ４１、ｄ）、ｉ）はＷＺ４２を示し、かつ押出比３０では、ｅ）、ｊ）がＷＺ４２を示し、断面は横断面（上部、ａ〜ｅ）および縦断面（下部、ｆ〜ｊ）である。

押出後に、Ｍｇ合金は、微細構造の光学顕微鏡画像に示されるように、粒子がかなり微細化した（図５．５に示す通り）。図５．２に示すアズキャストおよびＴ４処理合金の微細構造と比較して、熱間押出後に、粒度は低減して５０μｍよりはるかに低くなった。ＷＺ４２合金は小さい粒子と大きい粒子の両方を含んでいたが、１０と比較して３０の押出比で押し出された場合、最大２０〜４０μｍまでの大きい粒子の多くが、横方向に１５μｍ未満のより微細化された粒子に破砕される結果となった。

ＳＥＭおよびＥＤＸを使用して、微細構造のさらなる調査を行なった（図５．６に示す通り）。後方散乱ＳＥＭ画像の明るい領域は、Ｍｇ、Ｃａ、Ｙ、およびＺｒのみならず不純物元素のＡｌからも成る金属間相を明らかにしたが、表５．３でＩＣＰ‐ＯＥＳを使用して合金中のＡｌの極めて低い濃度が測定されているので、ＥＤＸによって検出されたＡｌは、研磨中に使用したアルミナスラリーから生じた可能性がある。ＫＸ１１およびＷＫ１１には合金元素を含む非平衡相が存在した（図５．６ａおよびｂに示す通り）。ＷＫ４１は（図５．６ｃに示す通り）、〜１重量％のＹしか含まないＷＫ１１と比較して、より多い〜４重量％のＹを含むので、Ｍｇ_２Ｙ相を含んでいた。ＷＺ４２合金では、Ｙの１２倍の原子パーセントのＭｇを含むＭｇ_１２ＹＺｎにおおまかに対応するＭｇ、Ｚｎ、およびＹから成る独自のＬＰＳＯ相が、図５．２ｄに示すＳＥＭおよびＥＤＸ分析によって確認された。合金中の析出物の明るい領域の量は、ＫＸ１１＜ＷＫ１１＜ＷＫ４１＜ＷＺ４２の順番に、Ｍｇ溶液に添加される合金元素の量が高くなるにつれて増大した。ＷＺ４２合金のＬＰＳＯ相を除き、二次相のサイズは一般的に小さく、２μｍ未満であり、図５．３に示すアズキャストおよびＴ４熱処理合金と比較して、図５．６に示す押出合金中により多く分散されるようであった。

図５．２は、研磨およびエッチング後のマグネシウム合金、すなわちａ）ＫＸ１１、ｂ）ＷＫ１１、ｃ）ＷＫ４１、ｄ）１０の押出比で押し出された後のＷＺ４２の指示位置におけるＳＥＭ画像およびＥＤＸ解析を示す。押出方向の横断面を断面とした。スケールバー＝１０μｍ。

［考察］
合金元素はマグネシウム合金の微細構造および機械的特性に強い影響を及ぼす。Ｙの含有量が高ければ粒子が粗くなると報告されており、それはＷＸ１１とＷＸ４１合金を比較したときに、図５．２にわずかに観察された。表５．３に示す通り、測定されたＺｒの含有量もまたＷＸ４１合金で低減したが、それは、ＷＸ１１と比較してより高い粒度に寄与した可能性もある。〜７５％のＹ重量％を持つＹリッチ金属間粒子は、Ｍｇ‐Ｙ二元合金で観察されたように、Ｍｇ‐Ｙ‐Ｚｒ‐Ｃａ合金で観察されたが、Ｔ４溶体化処理の実現は粒界からの第二相析出物の溶解および粒子の粗大化を引き起こした。

調査した合金組成は、アズキャストＭｇ‐Ｙ基合金を使用する初期研究後に修正され、拡張された。第一に、ＹおよびＺｎの添加の効果をさらに調査するために、Ｙを含まない組成物を添加してＹ含有合金と比較し、かつＺｎを添加してＭｇ_１２ＹＺｎ金属間化合物のＬＰＳＯ相の効果を調査した。アズキャスト合金中に観察されたＺｒが溶融中に失われ、それぞれＷＸ１１およびＷＸ４１合金についてＩＣＰ‐ＯＥＳによって測定したときに、Ｚｒ含有量が０．４０％の名目濃度から０．１３％および０．０７４％の重量％に減少したため、初期溶融物に添加されるＺｒの量を増大した。Ｚｒの損失は、Ｚｒとの飽和に達した後、Ｚｒがるつぼ由来の鉄および他の汚染物質と反応し、また水素と水素化物を形成し、Ｍｇ溶液から連続的に失われるために発生した。したがって、発生する損失を補償するために、活性Ｚｒを溶融物に過剰に添加することが重要である。実現された他の変化は、熱処理のための温度を低下したことであった。図５．２ｂおよび図５．２ｄに示す通り、ＷＸ１１およびＷＸ１１合金に５２５℃で熱処理を実施した後、著しい結晶粒成長が観察され、Ｚｒの添加によってもたらされた粒子微細化のプラス効果が低減された。溶体化処理の温度を４００℃に下げる一方、時間を８時間から２０時間に延長したが、それでも腐食速度を低下させ、顕著な結晶粒成長を回避しながら、依然として析出物の拡散をもたらした。

この修正された合金系は次いで熱間押し出しされ、それは合金の微細構造を劇的に変化させた。Ｘ線回折パターンは、ＬＰＳＯ Ｍｇ_１２ＹＺｎを含むＷＺ４２以外の全ての合金で、依然として単相Ｍｇを含んでいたが、押出後に粒度は劇的に低下した。Ｍｇ合金の押出プロセスは、作業温度および押出比によって影響される熱機械処理である。押出温度を上げると、動的再結晶化のため、変形中に核生成および新しい結晶の成長が発生し、粒度が増大する。しかし、粒度に対する押出比の影響については矛盾した結果が生じたこともあり、押出比の増加により粒度が低減するという報告がある一方で、逆の報告もあった。ここでは、大きいＬＰＳＯ相粒子の破壊が観察されたが、全体的に、縦断面に見られる粒子は劇的に変化しないようであった。押出の方向に沿って細長く伸びたこの繊維状のＬＰＳＯ相の発生は、他のＭｇ‐Ｚｎ‐Ｙ含有合金で観察され、押出比３０のＷＺ４２合金に非常に効果的に見られるように、高い押出比は押出中により多くの熱を発生し、動的再結晶をもたらす。この効果は、合金が１０の押出比で押し出されるときの４２５℃とは対照的に、押出比３０で実施される押出に使用される高い温度（４５０℃）が、粒子を再結晶しかつ成長させるように作用する一方、より高い変形が粒度を低減させるように働くという、矛盾する影響による可能性がある。全ての合金は、微細な等軸粒子と、元の溶体化処理された微細構造から維持された細長い粒子との組み合わせによる部分的な動的再結晶を受けるように思われた。

＜実施例６＞
［マグネシウム‐イットリウム‐カルシウム‐ジルコニウムの腐食挙動と機械的特性に対するイットリウムおよび亜鉛の添加と後処理の効果の特徴決定］
本研究のＭｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ基合金を深く理解するために不可欠なことは、腐食挙動の機能特性および機械的特性による微細構造と組成との間の関係を引き出すことであった。整形外科用生体材料の場合、装置の有効性を決定する上で両方の特性が不可欠である。

生分解性骨接合反応を発現させる上で第一の主要な課題は、永久的金属インプラントの機械的特性とおそらく同程度の範囲の機械的特性を達成することであった。生分解性材料は、張力、圧縮、および流体剪断応力を含む様々な機械的荷重の組合せに耐えて、複雑なインビボ環境で安定性を維持しなければならない。分解性ポリマーは、知識および製造方法の進歩により１９８０年代から改善してきたが、それらの機械的特性は依然として永久金属の機械的特性に近づいていない。したがって、生分解性ポリマーから作られる装置は、より大きく、より分厚い設計の使用を通して、強度および合成の欠如を補うように設計される。当然のことながら、骨格損傷の場所はインプラントおよび材料の機械的要件をしばしば決定づける。材料が分解するにつれて、強度の低下が着実に進み、それは予測可能かつ繰返し可能であるべきであり、結果的に負荷は周囲および新たに形成される骨に徐々に移行し、骨の成長は増大する荷重によって促される。

整形外科用装置の埋込材料の分解性は、自然組織の成長のための余地を提供しながら、二番目の手術で装置を取り出す必要性が排除されるという点でも興味深い。インプラント残渣は残すべきではないが、分解生成物は、所与の用途のために負荷を維持するように適切な速度で人体によって代謝することができる。

前に述べた通り、合金元素は、機械的特性および耐食性の改善に寄与するように添加された。それらを組み込むことの一般的な効果は、固溶体の強化、析出強化、および粒界強化をもたらすことであった。二次相を拡散させるための熱処理の後処理技術は、アノードαＭｇマトリクスがどの二次相より低い腐食電位を有し、ガルバニック対として優先的に腐食する、マイクロガルバニック腐食の範囲を限定する。熱間押出を介して達成される粒子微細化もまた、粒界強化によって機械的強度を改善することが期待された。この目的は、高強度で耐腐食性の合金を達成するための最適な処理条件を決定するために、結果として得られるＭｇ合金系の機械的特性および分解に対する、これらの合金添加の効果、すなわちＹの含有量およびＺｎの取込みを徐々に増加する効果のみならず、熱処理および押出の効果をも評価しようとしたものであった。

［材料および方法］
［Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ基合金の腐食試験］
動電位分極技術を使用して、ＷＸ１１およびＷＸ４１アズキャストおよびＴ４処理合金の腐食を試験した。サンプルは銀エポキシを用いて銅線に接続し、エポキシ樹脂内に包埋した。寸法が１０ｍｍ×１０ｍｍ×１ｍｍのマウントしたサンプルを機械的に研磨し、イソプロピルアルコール中で超音波洗浄し、空気乾燥した。動電位腐食調査は、電気化学ワークステーション（ＣＨ‐６０４Ａ，ＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いて、１ｍＶ／秒の走査速度および開路電位より５００ｍＶ上または下の電位窓で実施した。三電極セルを使用し、プラチナを対電極、Ａｇ／ＡｇＣｌを基準電極、サンプルを作用電極とした。試験は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが添加されたダルベッコ変法イーグル培地（４．５ｇ／ｌグルコース、Ｌ‐グルタミン、およびピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ、Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）中で、ｐＨ７．２±０．２で、３７．４℃に維持された温度で実施された。各測定の前に、安定性をもたらすためにサンプルを腐食培地に浸漬した。生成されたターフェルプロットのカソードおよびアノード部分を線形的に当てはめて、腐食電位Ｅ_ｃｏｒｒおよび腐食電流密度ｉ_ｃｏｒｒの算出を可能にした。

腐食液中の質量損失を使用してＭｇ合金の腐食をも測定した。アズキャストおよびＴ４処理したＷＸ１１およびＷＸ４１の研磨されたサンプルを、３７℃で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中に浸漬する一方、押し出されたＫＸ１１、ＷＫ１１、ＷＫ４１、およびＷＺ４２合金は３７℃のＨＢＳＳに浸漬した。浸漬の最長５週間後に取り出したサンプルは室温で乾燥し、それらの表面および表面断面をＳＥＭおよびＥＤＸを用いて分析し、表面層の組成および形態を分析した。２００ｇ／Ｌのクロム酸および１０ｇ／ＬのＡｇＮＯ_３を含む溶液に１分間浸漬して、腐食生成物を除去した後、サンプルの質量を測定した。腐食速度は、ＡＳＴＭ Ｇ３１‐７２に従って、次の式を用いて算出した。
Ｃ＝（Ｋ×Ｗ）／（Ａ×Ｔ×Ｄ）
式中、Ｃは腐食速度（ｍｍ年^−１、ｍｍｐｙ）であり、定数Ｋは８．７６ｘ１０^４であり、Ｗは質量損失（ｇ）であり、Ａは溶液に曝露されたサンプル面積（ｃｍ^２）であり、Ｔは曝露時間（時間）であり、Ｄは材料の密度（ｇ・ｃｍ^−３）である。

［Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ基合金の微小硬度試験］
微細構造のために研磨しエッチングしたサンプルに１００ｇの荷重を１０秒間加え、光学顕微鏡法を使用して、四角錐ダイヤモンド圧子により形成された圧痕を測定することによって、ビッカース微小硬度を測定した。ビッカースピラミッドナンバー（ＨＶ）をＦ／Ａによって決定した。ここでＦはダイヤモンド圧子に加えられる力（重量キログラム単位）であり、Ａは結果的に生じた圧痕の表面積（平方ミリメートル単位）である。Ａは次式によって決定された。
Ａ＝ｄ^２／｛２ｓｉｎ（１３６°／２）｝
ここで、ｄは、圧子によって残された対角線の平均長さ（ミリメートル単位）である。そうするとＨＶナンバーは次式によって算出される。
ＨＶ＝Ｆ／Ａ＝｛２ｓｉｎ（１３６°／２）Ｆ｝／ｄ^２
ここでＦはｋｇｆ単位である。

［Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ基合金の機械的検査］
機械的検査のために、サンプルは、引張試験のためのＡＳＴＭ‐Ｅ８‐０４および圧縮試験のためのＡＳＴＭ‐Ｅ９‐０９に準拠する寸法のＭｇ合金インゴットおよび押出ロッドの長軸に沿って機械加工した。３×３ｍｍのゲージ面積および１２ｍｍの長さを持つ引張棒サンプルを引張サンプル用に機械加工した。直径１０ｍｍ×長さ２０ｍｍの圧縮筒状サンプルを機械加工した。アズキャストおよびＴ４溶体化処理合金ＷＸ１１およびＷＸ４１の圧縮および引張試験は、ＯｒｔｈｏＫｉｎｅｔｉｃ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ（Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ）によって、室温で、レーザ伸縮計付きのＭＴＳ１１−５０ｋＮ電子機械荷重フレーム（ＭＴＳ，Ｅｄｅｎ Ｐｒａｉｒｉｅ，ＭＮ）を使用して実施された。静的アキシャルクリップオン伸縮計付きＩｎｓｔｒｏｎ ５５６６機械的検査システム（Ｉｎｓｔｒｏｎ，Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ）を使用して、押出合金ＫＸ１１、ＷＫ１１、ＷＫ４１、およびＷＺ４２に対する引張試験が実施された。引張試験は室温で、１．３ｍｍ／分のクロスヘッド速度で行われたが、圧縮試験は２ｍｍ／分の速度で行われた。応力‐歪み曲線から工学的降伏強度、極限強度、ヤング率（Ｅ）、伸び率を得た。合金の極限強度は応力‐歪み曲線から最大引張応力として決定された。降伏強度は引張試験中の降伏点における応力として決定された。

［統計分析］
統計分析はＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ １７．０（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を使用して行われた。群のサイズが均一であればＴｕｋｅｙのテスト、群のサイズが不均一であればガブリエルのペアワイズテストを用いて、ｐｏｓｔ‐ｈｏｃテストによる一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、群間の差を分析した。Ｐ＜０．０５は平均間の統計的有意差として受け入れられたものであり、図に示されている。図内の誤差バーは標準偏差を表す。

［結果］
［ＹおよびＺｎを添加した結果としてのＭｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ基合金の腐食挙動］
アズキャスト純ＭｇおよびアズドローンＡＺ３１と比較したアズキャストおよびＴ４Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金（ＷＸ１１およびＷＸ４１）の腐食速度は、浸漬後の質量損失のみならず、動電位分極測定にも基づいて算出したものであり、腐食電位および浸漬溶液に放出されたＭｇイオンの濃度と共に図６．１に示されている。ＷＸ４１合金の腐食電位（図６．１ｂ）は、ＷＸ１１合金ならびに対照材料の純ＭｇおよびＡＺ３１それぞれより高かった。アズキャストＷＸ１１およびＷＸ４１合金に対して５２５℃で行われたＴ４溶体化処理合金もまた、それらに対応するアズキャスト合金と比較して、より高い腐食電位および破壊電圧を示した。ＷＸ４１合金の動電位腐食速度はＷＸ１１合金より低く、かつ市販のＡＺ３１のそれと同様であった。溶体化処理はＷＸ１１合金の動電位腐食速度を増大させたが、ＷＸ４１には影響しなかった。

図６．１ａは、質量損失浸漬試験から算出した合金の腐食速度が２週間の浸漬後に安定化し始めたようであることを示す。２週間の浸漬後、ＷＸ４１アズキャストの腐食速度はＷＸ１１合金のそれより著しく低かった。ＷＸ４１合金の２週間の腐食速度も高純度Ｍｇと有意な差はなかった。３週間の浸漬後、再びＷＸ４１アズキャスト合金は、ＷＸ１１と比較して低い腐食速度を示し、高純度Ｍｇとは同様であった。Ｔ４溶体化処理は浸漬腐食速度に大きい影響を持たないようであった。質量損失腐食実験に使用した腐食培地は、溶液中に放出されたＭｇの１週間後、２週間後、および３週間後の濃度を決定するために使用した（図６．１ｃ）。ＷＸ４１合金はここでも、アズキャスト純Ｍｇおよび市販のＡＺ３１と比較して、各時点でより低い濃度のＭｇを放出し、ＷＸ１１と比較して高い耐食性を示した。熱処理は放出されるＭｇイオンに影響しないようであった。

図６．１は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中のＭｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金、アズキャスト９９．９９％純Ｍｇ、およびＡＺ３１の腐食特性を示す。ａ）１週間、２週間、および３週間の浸漬後の質量損失を使用して測定した腐食速度（ｎ＝３／群／時点）および動電位腐食（ｎ＝１／群）。＊と＊＊の間、†と‡の間、§間の有意差（ｐ＜０．０５）。ｂ）腐食電位および破壊電圧（ｎ＝１／群）；ｃ）１週間、２週間、および３週間の浸漬後に腐食培地に放出されたＭｇの濃度（ｎ＝３／群／時点）。＊と＊＊の間、†と‡の間の有意差（ｐ＜０．０５）。

図６．２は、ＣｒＯ_３／ＡｇＮＯ_３溶液で洗浄して腐食生成物を除去した状態の動電位分極試験後のＭｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金のＳＥＭ顕微鏡写真を示す。全てのサンプルが、Ｙ含有合金を含めてＭｇ合金で一般的に現れる現象である局部孔食を示したが、アズキャスト合金（図６．２ａおよびｃ）もまた、より高い二次相の局在化のため腐食し易い粒界領域（矢印）に発生する腐食を示す。

図６．２は、１０％ＦＢＳを含む３７℃のＤＭＥＭでの動電位分極およびＣｒＯ_３／ＡｇＮＯ_３溶液による洗浄後のａ）ＷＸ１１アズキャスト；ｂ）ＷＸ１１Ｔ４熱処理；ｃ）ＷＸ４１アズキャスト；ｄ）ＷＸ４１Ｔ４熱処理；ｅ）純Ｍｇ；ｆ）ＡＺ３１の表面形態を示すＳＥＭ画像を示す。矢印は粒界の腐食を表す。

３週間の浸漬後の乾燥サンプルの顕微鏡写真は、腐食をさらに評価するためにＳＥＭを使用して取得した（図６．３）。局部腐食は、ＣおよびＯを豊富に含む腐食生成物の堆積と共に腐食面上に観察された（ＥＤＸは図６．３ａおよびｂに示す）。これらの腐食堆積物を直接取り囲む領域は一般的にＭｇが豊富である（図６．３ａおよびｅ）。最後に、サンプルの表面の大部分は、Ｏ、Ｃａ、Ｐ、およびＭｇを豊富に含む層に被覆された。骨の不可欠な成分であるＣａおよびＰは、インビボで分解後に希土類含有合金上に一層の非晶質リン酸カルシウム層を形成すると報告されてきた。腐食生成物の除去後、図６．４に示したＳＥＭは、３週間の浸漬腐食サンプルが全ての材料で連結腐食キャビティを示したことを明らかにした。

図６．３は、１０％ＦＢＳを含む３７℃のＤＭＥＭで３週間の静的浸漬後のａ）ＷＸ１１アズキャスト；ｂ）ＷＸ１１Ｔ４熱処理；ｃ）ＷＸ４１アズキャスト；ｄ）ＷＸ４１Ｔ４熱処理；ｅ）純Ｍｇ；ｆ）ＡＺ３１の表面形態を示したＳＥＭ画像を示す。ＥＤＸは、矢印で示すように様々なスポットで実施された。

図６．４は、１０％ＦＢＳを含む３７℃のＤＭＥＭで３週間の静的浸漬およびＣｒＯ_３／ＡｇＮＯ_３溶液による洗浄後のａ）ＷＸ１１アズキャスト；ｂ）ＷＸ１１Ｔ４熱処理；ｃ）ＷＸ４１アズキャスト；ｄ）ＷＸ４１Ｔ４熱処理；ｅ）純Ｍｇ；ｆ）ＡＺ３１の表面形態を示したＳＥＭ画像を示す。

押出合金もまた、３７℃で１週間、３週間、および５週間溶液に浸漬した後、腐食試験を行い、平均値を図６．５に記載した。大部分の合金の腐食速度は１週間の分解後はＡＺ３１と大きく異ならないにも拘わらず、市販の対照材料と比較して、合金は、純Ｍｇより著しく低いが、ＡＺ３１より一般的に高く、内製したＡＺ３１とは同等またはそれより低い腐食速度を示した。他の新規な合金（内製ＡＺ３１）と同じ条件を使用して生成され、また１０の比で押し出されたＡＺ３１合金は、Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ基合金と同様またはそれより高い腐食速度で、市販のＡＺ３１より急速に腐食した。最後に、３０の押出比で押し出されたＷＺ４２は、同じ組成の合金がより低い１０の押出比で押し出された場合より、腐食速度が高くなり、この結果は、３０の押出比に要求される２５℃の追加温度により、金属間化合物がさらに析出されるため、潜在的に悪化した。一般的に、Ｙの含有量を増大することによって腐食速度が低減するという傾向が観察された。ＷＫ４１とＺｎ（ＷＺ４２）の合金化は腐食速度に大きい影響を及ぼさなかった。腐食速度と浸漬時間との間に明確な相関性は観察されなかった。

押出合金の浸漬腐食速度をアズキャストおよび溶体化処理された合金と比較すると（図６．１）、どちらの群の合金も、押し出された市販のＡＺ３１と比較して、より速く分解した。さらに、アズキャスト／溶体化処理合金および押出合金の両方とも、Ｙの含有量の増加が腐食速度を低下させ、Ｙの量の導入および増加の重要な一面であった。

図６．５は、押し出されたＭｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ基合金の平均腐食速度を、押し出された純ＭｇおよびＡＺ３１（市販品および内製品）と比較して示す。＊のマークが付いた群はその時点で相互に有意な差（ｐ＜０．０５）があり、†のマークが付いた群はその時点で他の全ての群と有意な差（ｐ＜０．０５）があった。全ての群の全ての時点でｎ＝３である。

質量損失を測定するために分解生成物を取り除いた後、１週間浸漬したサンプルは、それらの表面形態を調べるために撮像し（図６．６）、５週間の浸漬後にＳＥＭを使用して断面を撮像した（図６．７）。全てのＭｇ合金の表面はピットの存在を伴う糸状腐食を明らかにした。それでも、１週間後の表面は腐食をほとんど受けず、ほぼ均一のままであった。しかしながら、純Ｍｇはより深刻な孔食を受け、図６．７ａに示される不連続な表面にピットが生じていた。合金のかなり均一な表面の形成は５週間後の断面画像に見られ、ＷＫ１１、純Ｍｇ、および内製ＡＺ３１では、ピットが散らばった平坦に見える領域が最も多かった。ＥＲ１０によるＷＺ４２における腐食の深さは、ＥＲ３０の場合より大きいように見えたが、後者の形の合金の表面は表面層に目に見える亀裂があり、より不連続であるように見えた。市販のＡＺ３１と比較して内製のＡＺ３１のより急速な腐食は図６．７ｃに示される深いピットに見ることができた。

図６．６は、３７℃のＨＢＳＳで１週間静的に浸漬し、ＣｒＯ_３／ＡｇＮＯ_３溶液で洗浄した後の、押し出されたａ）純Ｍｇ(pure Mg)、ｂ）市販の（commercial）ＡＺ３１、１０の押出比で押し出された内製の（in-house）合金、ｃ）ＡＺ３１、ｄ）ＫＸ１１、ｅ）ＷＫ１１、ｆ）ＷＫ４１、およびｇ）ＷＺ４２の表面形態を示した、５０倍および２５０倍のＳＥＭ画像を示す。

図６．７は、３７℃のＨＢＳＳで５週間静的に浸漬し、ＣｒＯ_３／ＡｇＮＯ_３溶液で洗浄した後の、押し出されたａ）純Ｍｇ、ｂ）市販のＡＺ３１、ｃ）内製のＡＺ３１、ｄ）ＫＸ１１、ｅ）ＷＫ１１、ｆ）ＷＫ４１、およびｇ）押出比１０で押し出されたＷＺ４２合金、およびｈ）押出比３０で押し出されたＷＺ４２の断面形態を示した、１００倍および２５０倍のＳＥＭ画像を示す。サンプル金属およびマウント用エポキシの位置は、ａ）に示される。

［ＹおよびＺｎを添加した結果としてのＭｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ基合金の微小硬度］
図６．８に示す微小硬度結果は、合金元素の添加による純Ｍｇを超える顕著な増加値を実証した。さらに、Ｙ含有合金にＺｎを添加することにより、微小硬度の顕著な増加が観察された。３０と比較して１０の押出比で押し出されたＷＺ４２合金の微小硬度には、変化が観察されなかった。

図６．８は押し出されたＭｇ合金のビッカース微小硬度を示す。＊のマークが付いた群は他の全ての群とは有意な差があり（ｐ＜０．０５）、†のマークが付いた群は他の全ての群とは有意な差があった（ｐ＜０．０５）が、相互同士に有意な差はなかった。ＥＲ＝押出比である。全ての群の全ての時点でｎ＝５である。

［ＹおよびＺｎの添加および押出の結果としてのＭｇ−Ｙ−Ｃａ−Ｚｒ基合金の機械的特性］
アズキャストおよび熱処理合金の圧縮および引張機械特性を図６．９に示す。アズキャストＷＸ１１およびＷＸ４１合金の極限圧縮歪み（図６．９ａ）は、アズキャスト純ＭｇおよびアズドローンＡＺ３１のそれより著しく大きかった。アズキャスト実験合金の極限圧縮強度（図６．９ａ）もまたアズキャスト純Ｍｇより大きかったが、引抜きプロセスによってもたらされる著しい加工硬化および粒子微細化のため、ＡＺ３１は試験した他の全ての材料より著しく大きい極限圧縮強度を示した。アズキャスト合金に５２５℃で加えられたＴ４溶体化処理は、圧縮強度および歪みの著しい低下をもたらしたが、Ｙの含有量の増加による圧縮降伏強度（図６．９ｂ）の増加が観察された。アズキャストＷＸ４１は、アズキャストＷＸ１１よりかなり高い極限引張強度（図６．９ｃ）を実証した。圧縮試験結果と同様に、５２５℃でアズキャストＭｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金に加えられるＴ４溶体化の適用は、アズキャスト合金と比較して極限引張強度および引張降伏強度の低下をもたらしたが、熱処理後に引張応力に対する有意な効果は観察されなかった。ＡＺ３１は他の試験材料よりずっと高い引張強度および歪みを示した。Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金の引張特性は、大幅に改善されるか、あるいは純Ｍｇのそれに匹敵するようになることが観察された。試験した合金のヤング率（図６．９ｄ）の値は、ＡＺ３１（４２ＧＰａ）の測定値と同様に、３４〜６０ＧＰａの間で変化し、群内で高い分散が観察された。

図６．９は、Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金、純Ｍｇ、およびＡＺ３１の機械的特性、すなわちａ）極限圧縮強度および極限圧縮歪み；＊と他の全ての群つまり†、‡、およびその他の群との間の有意差（ｐ＜０．０５）；ｂ）圧縮降伏強度；＊と他の全ての群つまり†、‡、およびその他の群との間の有意差（ｐ＜０．０５）；ｃ）極限引張強度および極限引張応力；＊、§と他の全ての群つまり†、‡とその他の群との間の有意差（ｐ＜０．０５）；ｄ）引張降伏強度およびヤング率；§と他の全ての群つまり†、‡とその他の群との間の有意差（ｐ＜０．０５）を示す。全ての群の全ての時点でｎ≦３である。

押出合金の引張機械特性を図６．１０および図６．１１に報告する。本研究で作製された全ての押出Ｍｇ合金の極限引張強度（図６．１０）は、市販の対照、すなわち押し出された純ＭｇおよびＡＺ３１よりかなり高かった。極限引張強度はＫＸ１１、ＷＫ１１、およびＷＫ４１については同様のままであるが、ＷＺ４２の形で組成物にＺｎを添加すると、それは劇的に改善され、ＥＲ１０対３０で押し出された場合、その強度は著しく高くなった。測定された全ての押出材料の極限引張応力は、ＫＸ１１の場合を除いて全て同様であり、ＫＸ１１は、ＡＺ３１を除く他の全ての群よりかなり高い伸びを有した。

押出合金ＫＸ１１、ＷＫ１１、ＷＫ４１、およびＷＺ４２の降伏強度（図６．１１）は、市販の純Ｍｇおよび市販の押出ＡＺ３１より高く、ＷＫ４１はそのシステムでこれらの合金の間で最も低い降伏強度を有したが、再びＷＺ４２合金はかなり高い強度を有した。試験した全ての合金のヤング率には互いに有意な差が無く、４０〜６０ＧＰａの範囲であった。

図６．１０は押出Ｍｇ合金の平均極限引張強度および歪みを示す。＊のマークが付いた極限引張応力の測定値は、互いに有意な差（ｐ＜０．０５）があった。†のマークが付いた極限引張応力の測定値は、他の全ての群とは有意な差（ｐ＜０．０５）があったが、互いの間ではそれが無かった。†のマークが付いた極限引張応力の測定値は、他の全ての群とは有意な差があった。ＥＲ＝押出比である。全ての群の全ての時点でｎ＝５である。

図６．１１は、押出Ｍｇ合金の平均引張降伏強度およびヤング率を示す。＊のマークが付いた降伏強度の測定値は、他の全ての群とは有意な差（ｐ＜０．０５）があった。†および‡のマークが付いた群は、他の全ての群とは有意な差（ｐ＜０．０５）があったが、互いの間ではそれが無かった。ＥＲ＝押出比であり、全ての群の全ての時点でｎ＝５である。

［考察］
この明確な目的において、三つの主要な変更、すなわち１）合金組成（Ｙの量およびＺｎの添加を増やす）、２）押出対非押出、および３）アズキャスト対Ｔ４溶体化処理について、腐食挙動および機械的特性に対するそれらの効果を調査した。

耐食性は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌを超える生理学的塩化物環境に曝露された場合だけでなく、低水素過電圧部位でも、深刻な孔食がＭｇ合金に観察されるため、マグネシウム合金の研究における主要な関心事であった。微細構造および粒度は腐食の制御に重要な役割を果たし、粒度の増大は耐食性を変化させるという報告がある。押出合金（図６．５）の浸漬腐食速度をアズキャストおよび溶体化処理合金（図６．１ａ）と比較した場合、どちらの群の合金も、市販の押出ＡＺ３１と比べて、より速く分解した。押出合金の腐食速度は、ここで検討したアズキャストおよびＴ４処理合金より大幅には改善せず、複数の原因が考えられる。一方では、ＡＺ３１Ｂ‐Ｈ２４を様々な温度で熱処理することにより粒度が増大すると、粒界が物理的腐食バリアとして作用することによって説明されるように、腐食速度が増大することが実証されている。Ｍｇ‐Ｙ‐ＲＥの摩擦攪拌処理およびＡＺ３１の等チャネル角プレス（ＥＣＡＰ）によって処理した微粒合金の微細構造はまた、微粒合金の結果としてより良好な腐食挙動をも示した。小さい粒度は、合金が生理学的培地に曝露されたときに、リン含有化合物および水酸化マグネシウムのより緻密な層の存在によって、より高い耐食性をもたらし、塩化物イオンの作用から保護するように働き、結果的に電荷移動抵抗が高くなると共に、微細な粒度のためピットが小さくなり腐食がより均一になることが示唆された。しかしながら、他方では、矛盾する研究は、粒子微細化剤の添加またはＥＣＡＰにより、粒界で腐食が始まりかつ伝播し、粒界経路に従って腐食フィラメントが生じ、マイクロガルバニック腐食部位として作用する結果、粒度の低下が耐食性の低下をもたらすことを示してきた。粒度の変化による腐食の顕著な変化の欠如は、微細構造のばらつきによる腐食へのこのような矛盾する効果の組合せに起因していることが予想される。

腐食速度を制御する別の方法は、Ｔ４溶体化処理を適用することによって、αＭｇマトリクスへの拡散により二次相の体積分率を低減し、こうして、アノードαＭｇマトリクスの腐食電位が二次相より低くガルバニック対として優先的に腐食する、マイクロガルバニック腐食の程度を制限することであった。これは、図６．１でアズキャスト合金の腐食面を溶体化熱処理合金と比較する際に観察されたものであり、粒界の二次相濃度が高いアズキャスト合金ではこれらの粒界に目視可能な腐食が生じていたが、溶体化処理合金では見られなかった。

Ｍｇ合金のＹ含有量が変わると、Ｌｉｕおよび同僚らによって報告されたように、腐食挙動に影響する可能性がある。Ｙ含有量を増加することによって、Ｙ含有金属間相の体積分率が増加し、それによりマイクロガルバニック腐食が増強される。他方、Ｌｉｕらは、Ｙを３％超に増やすと、より保護的なＹ_２Ｏ_３のパッシベーション層が形成され、かつカソード電流が低下する可能性があることを突き止め、それは理論的にも突き止められた。

Ｙの含有量が増大した合金の強化されたパッシベーションは、アズキャストおよびＴ４処理バージョンのＷＸ１１と比較して、アズキャストおよびＴ４処理ＷＸ４１の高くなった腐食電位（図６．１ｂ）に示された。Ｔ４溶体化処理はまた、粒界に沿った金属間化合物粒子の固溶体への還元のため、Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金の腐食電位をより貴な電位にシフトすることも観察され、Ｍｇ‐Ｚｎ‐ＲＥ‐Ｚｒ合金の熱処理後に、おそらく保護酸化物層が合金表面のより大きい領域を被覆することが可能になった。溶体化処理後に、Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金のより多くの正の破壊電圧も観察され、不動態被膜の破壊および孔食の開始に対する耐性が高いことが示された。動電位腐食速度（図６．１ａ）は、Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金の腐食電流密度を用いて計算した通り、Ｙ含有量の増加により低下し、それは腐食過程におけるカソード反応の抑制により発生する。浸漬腐食（図６．１ａ）およびＭｇ濃度測定（図６．１ｃ）は、ＷＸ１１からＷＸ４１合金への腐食速度のこの低下を確認した。押出合金では、Ｙ含有量の増加は同様に、図６．５の結果に示されるように、腐食速度の低下を招いた。より均一な表面（図６．６）を示したＹを含む合金と比較して、Ｙを含まずに処理された合金、ＫＸ１１は、最も高い腐食速度を示したが、表面が腐食によって最も大きく影響されることをも示した。Ｍｇ‐Ｙ含有合金では、糸状腐食が観察された。それは、表面の不均一な水酸化物膜が活発な腐食の場所を維持させるため発生し、それは伝播することができる。この活発な腐食部位は高濃度の局所Ｍｇ^２＋を生成し、それは塩化物イオンを引き付けて、糸状腐食が無作為の方向に維持されることを可能にする。この腐食メカニズムは、図６．７ｄ〜ｈの実験合金の断面画像に見られるように腐食がＭｇサンプルの内部に伝播することを防止する、Ｍｇ（ＯＨ）_２の形成、およびＹ_２Ｏ_３など他の不動態化生成物の形成のため、表面に限定された。

アズキャスト合金ＷＸ１１およびＷＸ４１の溶体化処理は、ＷＸ１１の動電位腐食速度を大幅に増大させたが、ＷＸ４１では腐食速度のわずかな増大が観察されただけであった。しかし、これらの傾向は、浸漬腐食およびＭｇ濃度の測定には反映されず、ここではＴ４処理は腐食速度に際立った変化または低下をもたらさなかった。これは、金属間相を溶解し、マイクロガルバニック腐食を低減させる一方、粒度の増大をも引き起こし、パッシベーション速度を遅らせる可能性のある、Ｔ４処理の組合せによるものであった。合金の表面に見られる連結腐食キャビティは一般的に、腐食したＭｇ合金に観察される。

動電位分極曲線から算出した腐食速度は、浸漬中の質量損失から算出した腐食速度より低かったが、それはおそらく、Ｍｇの腐食メカニズムが中間工程として反応するごく少量のユニポジティブＭｇイオンを含み、化学的に反応するだけでなく、部分的に電気化学的にも反応するため、重量損失法または水素発生法と比較して、電気化学的測定では腐食速度が過少評価されるためであった。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で３週間の浸漬期間にわたって形成された腐食生成物（図６．３）は、カルシウム含有腐食生成物の凝集の観察と一致する、沈殿物中の大量のＣａおよびＰを明らかにした（図６．３ａおよびｂのＥＤＸ）。ＣａおよびＰを含有するカチオンの存在は、リン酸塩および炭酸塩の析出のため、（図６．２に示すように）パッシベーションおよびピット形成をもたらす可能性がある。

興味深いことに、市販のＡＺ３１と、ＡＺ３１アズキャストを熱処理し、押出比１０で押し出して内製したものとの間に、明らかなコントラストが観察された。同様に、生産プロセスにも相違があり、内製ＡＺ３１を作製するために使用された実験室規模の作業と比較して、より管理された環境で大量に生産する産業規模の方法では、不純物が少なくより均質なＡＺ３１が得られる。これらの不純物、欠陥、および内包物は、我々のＡＺ３１のより急速な腐食を招いたようであった。

群内における浸漬腐食速度のばらつきをもたらした実験誤差の伝播は、機械加工および研磨に起因するサンプルの均質性と表面仕上げとの間のばらつきに加えて、目盛に起因する重量測定のばらつき、機械加工誤差による表面積のばらつき、および浸漬時間のわずかな差のために生じた可能性がある。

Ｍｇ合金の機械的特性は、より微細な粒子が粒界強化をより高めるというホールぺッチの関係に従って、微細構造の変化に敏感であることが知られている。本研究では、アズキャスト合金に対しＴ４溶体化処理を実施した後、粒度は増大したが、熱間押出を実施した後、減少した。的確には、溶体化処理から生じた粒子の粗大化後の合金と比較して、アズキャストＭｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金は、より高い圧縮および引張強度、ならびにより高い圧縮歪みを維持した。アズキャストＭｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金における二次相の高い存在感は、塑性変形中の転位運動に対する障害として働くことによって析出強化に寄与したと思われる。この現象は固溶体強化と同様に、ＲＥ含有合金で利用されてきたものであり、Ｙ含有量がより高いアズキャスト合金のわずかにより高い引張強度を説明するかもしれない。アズドローンＡＺ３１は微細粒度で固化して産業用途向けの機械的特性要件を満たすが、アズキャスト高純度Ｍｇは合金元素を含まず、比較的低い機械的特性を示し、固溶体強化または析出強化の欠如を免れない。押出純Ｍｇもまた、試験した全ての合金と比較してかなり低い強度を示した。押出後、かなりの粒子微細化が発生し、強度にかなりの増加をもたらし、アズキャストおよびＴ４処理合金の極限引張強度は、押出前の１７５ＭＰａ以下から、熱間押出後の合金では２８６ＭＰａ超にまで増大した。ＷＸ１１と対比してアズキャストＷＸ４１（図６．９）のＹの含有量を増加した後に見られた強度の増加とは異なり、押出合金ではＹを増加しても強度は増加しなかった。高い割合の合金元素および析出物であるにも拘わらず、４重量％のＹを含む押出ＷＫ４１は、それぞれ０重量％および１重量％を含むＫＸ１１およびＷＫ１１より高い強度を示さなかった。これは、ＷＫ４１の場合、鋳型を通過できるようにインゴットを軟化させるために要求される、押出中に保持される合金スラグを予熱するためのより高い温度が原因である可能性が高く、それにより合金が動的再結晶化および結晶粒成長を受ける度合いが高まり、したがって強度が低下する。Ｚｎが導入され、それによりＷＺ４２合金にＬＰＳＯ相が導入されると、ホールペッチの関係、および複合材料のような短繊維強化メカニズムを介して硬化相として機能する押出方向に沿ったＬＰＳＯ相の整列により、中程度の伸びを伴う高い微小硬度および強度が観察された。３０の押出比で押し出されたＷＺ４２は、熱間押出中のより高い変形および温度上昇のため、さらなる動的再結晶化が生じ、極限引張強度のわずかな低下が見られた。最後に、固溶体および析出物中のＹの含有量が高いと合金の延性が低下するため、Ｙの高い含有量は延性の低下につながるが、Ｙを含まないＫＸ１１合金では、かなり高い伸びが実験的に確認された。

試験した合金のヤング率は全て、自然骨（６〜２４ＧＰａ）のヤング率に近かったので、整形外科用途向けにステンレス鋼またはチタンより適した、同様の範囲内にあった。これは、従来使用されている永久金属と比較して、応力遮蔽のリスクを低減するであろう。

群内の機械的検査結果にばらつきをもたらす実験誤差は、サンプル間の均質性の差異に加えて、機械加工誤差に起因するサンプル寸法のわずかなばらつき、機械的検査装置によって測定された力および歪みのデータ収集のばらつき、ならびにサンプルを配置するときのサンプルの位置合わせのばらつきにより発生したものと考えられる。

文献で報告されている他の合金と比較しても、ＷＺ４２合金の高い強度は特に遜色がない。生分解性金属の包括的な記述において（図６．１２）、ＷＺ４２は、これまでに報告された他のどのＭｇ合金よりはるかに高く、鍛鉄のそれに近い降伏引張強度を示し、中程度の伸びは〜１５％である。高い強度および適度な延性のため、この合金は、明確な目的４で詳述したインビボでのラット動物試験用の最適な候補として選択された。他の押出合金、ＫＸ１１、ＷＫ１１、ＷＫ４１も、比較的高い強度と中程度の伸びを示した。アズキャストＷＸ１１およびＷＸ４１合金は図に含まれる他のキャストＭｇ合金と同様の機械的特性を示した。

図６．１２は、本明細書の合金、すなわちアズキャストの形態のＷＸ１１およびＷＸ４１、ならびに１０の押出比で押し出されたＫＸ１１、ＷＫ１１、ＷＫ４１、およびＷＺ４２を含めて、鋳鍛造Ｍｇ合金の降伏引張強度および伸びを示す。

＜実施例７＞
［前骨芽細胞およびヒト間葉系幹細胞の細胞生存率および増殖に対するイットリウムおよび亜鉛の添加、後処理、および合金元素塩の効果を評価し、さらに骨芽細胞分化マーカーの発現およびマウス皮下組織における生体適合性を評価する。］
［序論］
Ｍｇ合金の分解は金属カチオン、酸化物、水酸化物、リン酸塩、および炭酸塩を生じさせる一方、局所ｐＨの変化および水素ガスの発生も引き起こし、動物に埋め込まれるとガスポケットの形成をまねく。閾値濃度未満では、これらの分解生成物は人体に許容可能とみなされ、患者の生命の損失につながる壊滅的な結果をもたらすことはない。局所細胞および組織に対する分解生成物の影響、およびそれらが身体により除去される能力は、水溶液中のそれらの固溶度に大きく依存する。Ｍｇ合金分解の最も一般的で、これまで最も安定な副産物は、８．９×１０^−１２の適度な固溶度（Ｋ_ｓｐ）を有するＭｇ（ＯＨ）_２であり、水酸化物が塩に変換することによって形成される次の生成物は、対照的に極めて高い水溶性のＭｇＣｌ_２である。Ｍｇ合金の潜在的毒性を完全に理解するために、他の合金元素およびそれらの塩の毒性についても考慮しなければならない。重要なことは、Ｍｇ合金の分解生成物の毒性およびそれに対する細胞反応を理解することだけでなく、インプラントの表面と局所細胞との間の直接的な相互作用を考慮し、細胞がＭｇインプラント表面に付着して増殖することを確実にすることも、極めて重要である。

骨に適用する場合、インプラント材料は周囲の骨組織の成長を可能にし、それによってインプラントの緩みの発生を減らさなければならない。この観点から、Ｍｇは、Ｍｇインプラントの周囲でそれと接触している骨の形成を刺激し、インプラントの安定性の向上、周囲の骨との一体化、および天然組織による生体材料の置換を可能にするという利点を示してきた。高価で時間のかかる動物実験を進める前に、様々な材料およびそれらの特徴を比較し、かつこれらの試験の倫理的負担を軽減するために、インビトロ試験を使用して、適切なインプラント材料候補を事前選択する。

合金自体の試験に加えて、細胞反応に対する影響への各合金元素の個々の寄与を評価することも求められた。表６．１は、本研究で使用したＭｇおよび合金元素に関する毒性および耐性情報を掲載する。この目的のために、合金元素塩のこれらの試験を進展させる一方で、合金抽出物をも前骨芽細胞およびヒト間葉系幹細胞に添加して、それらの生存率、増殖、および骨芽細胞系統への分化について評価することが決定された。加えて、予備的マウス皮下インプラントモデルを使用して、インビボ生体適合性パイロット研究として、ＷＸ１１およびＷＸ４１アズキャストサンプルを局所毒性および腐食について比較した。

［材料および方法］
［細胞培養および維持］
ＭＣ３Ｔ３前骨芽細胞株およびヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を使用して、研究対象の合金の細胞適合性を試験した。これら二つの細胞株を使用して、骨芽細胞前駆細胞であるｈＭＳＣ、およびさらに分化した間葉系細胞である前骨芽細胞の両方に対する合金の効果を、完全な骨芽細胞の成熟前に試験した。それらの培養条件を以下に記載する。

［マウス前骨芽細胞株（ＭＣ３Ｔ３‐Ｅ１）］
マウス前骨芽細胞株（ＭＣ３Ｔ３‐Ｅ１，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）は、変法イーグル培地アルファ（αＭＥＭ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンから成る成長培地で３７℃で、５％ＣＯ_２を含む相対湿度９５％の環境で培養した。全ての実験で四代継代後の細胞を５０，０００細胞・ｍＬ^−１の播種密度で使用した。骨形成分化の研究では、１００ｎＭのデキサメタゾン、５０μｍのアスコルビン酸、および１０ｍＭのβ‐グリセロリン酸エステルを添加した、分化誘導培地としても知られるＭＣ３Ｔ３‐Ｅ１成長培地を使用した。

［ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）］
正常なヒト骨髄（Ｌｏｎｚａ，Ａｌｌｅｎｄａｌｅ，ＮＪ）から得たｈＭＳＣは、２０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加えたαＭＥＭの成長培地で３７℃で、５％のＣＯ_２を含む相対湿度９５％の環境で培養した。三代継代後の細胞を使用した。骨形成分化の研究では、成長培地には、分化誘導培地として１００ｎＭのデキサメタゾン、５０μｍのアスコルビン酸、および１０ｍＭのβ‐グリセロリン酸エステルを添加した。

［直接ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存率および付着性試験］
ＭＣ３Ｔ３‐Ｅ１細胞は直接、Ｍｇ合金上で、すなわちアズキャストおよび押出純マグネシウム、ならびに押出ＡＺ３１上で培養した。厚さ１ｍｍのサンプルを１２００グリットまで研磨し、イソプロピルアルコール中で超音波洗浄し、空気乾燥し、１時間ＵＶ滅菌した。合金サンプルは細胞培養培地中で１０分間インキュベートし、その後、細胞を４×１０^４細胞／ｍＬの密度でサンプル上に播種した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生死判別／細胞毒性試験キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、製造者のプロトコルに従って、１日目および３日目の細胞生存率を評価した。このキットは、生細胞と死細胞を二つの異なる波長の蛍光顕微鏡で区別することによって、細胞生存率を決定する。簡単に述べると、ＭＣ３Ｔ３‐Ｅ１細胞を付着させたＭｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐ＺｒサンプルをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中に２μｍｏｌ／Ｌのエチジウムホモダイマ^−１および４μｍｏｌ／ＬのカルセインＡＭにより室温で３０分染色した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ溶液中で室温で３０分間インキュベートした後、蛍光顕微鏡を使用して生細胞および死細胞の画像を取得した。

［固定細胞のＦアクチンおよび核染色、ＳＥＭ／ＥＤＸ撮像］
合金上に播種し７２時間培養したＭＣ３Ｔ３細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．１％のＴｗｅｅｎ２０溶液で透過処理した。Ｆアクチン染色はテトラメチルローダミンイソチオシアネート結合ファロイジンを用いて実施し核染色はＤＡＰＩを用いて実施した。蛍光画像は蛍光顕微鏡で可視化した。蛍光撮像後に、サンプルは、勾配エタノール／ＰＢＳ混合液（３０％、５０％、７０％、９０％、９５％、１００％）で各々約１０分間脱水し、乾燥した。細胞を付着させたサンプル表面を次いでＳＥＭにより観察し、ＥＤＸを使用して表面の元素組成を測定した。

［間接インビトロ試験の合金分解生成物の抽出物の回収］
Ｍｇ合金サンプル、すなわちアズキャストおよび押出純マグネシウム、ならびに押出ＡＺ３１は、１２００グリットまで研磨し、イソプロピルアルコール中で超音波洗浄し、空気乾燥し、紫外線放射により１時間滅菌した。試料は、ＭＣ３Ｔ３成長培地、ｈＭＳＣ成長培地または分化培地中で３７℃で、５％のＣＯ_２を含む加湿雰囲気で７２時間インキュベートした。アズキャストおよびＴ４処理されたＷＸ１１およびＷＸ４１の場合、サンプル重量対抽出培地の比率は、ＥＮ ＩＳＯ標準１０９３３：１２に従って０．２ｇ／ｍＬであったが、押出ＫＸ１１、ＷＫ１１、ＷＫ４１、およびＷＺ４２を含む研究の場合、使用した比率は、さらなる希釈をもたらすために、〜０．８ｃｍ^２／ｍｌの培地とした。この開始抽出比は１００％抽出物と指定され、より広範囲の濃度を調べるために、１００％抽出物を５０％、２５％、および１０％、または２５％、１０％、１％、および０．１％の濃度に希釈することによって、より低濃度の抽出物が調製された。抽出物は、以下のＭＴＴ、ＣｙＱＵＡＮＴ、アルカリホスファターゼアッセイで細胞に添加する前に、０．２μｍシリンジフィルタを通して滅菌濾過した。

［ＭＴＴ細胞毒性試験］
ＭＣ３Ｔ３細胞を、９６ウェル細胞培養プレートの各ウェルの６×１０^３細胞／２００μｌの培地に播種し、２４時間インキュベートした。抽出物を含まない培養培地は陰性対照として働き、１０％ＤＭＳＯ培養培地は陽性対照として働く。２４時間のインキュベーション後に、培地を様々な濃度の２００μｌの抽出培地と交換し、１日および３日間インキュベートした。腐食抽出物の細胞毒性は、ＭＴＴアッセイを使用して試験した。培地および抽出物は、抽出物中のマグネシウムがテトラゾリウム塩と干渉するのを防止するために、新鮮な細胞培養培地と交換した。ＭＴＴアッセイは、ＶｙｂｒａｎｔＭＴＴ細胞増殖キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）に従って、最初に、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に溶解した１０μｌの１２ｍＭ３‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐ｙｌ）‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）を各ウェルに加えることによって実施した。サンプルをＭＴＴにより４時間インキュベートし、その後、１００μｌのホルマザン可溶化ＳＤＳ‐ＨＣｌ溶液を各ウェルに加え、最長１２時間インキュベートした。サンプルの吸光度を、Ｓｙｎｅｒｇｙ２マルチモードマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用して５７０ｎｍの波長で測定した。平均陽性対照を減算したサンプルの吸光度を、平均陰性対照から減算した平均陽性対照の吸光度で割って、対照と比較した細胞のパーセント生存率を決定した。新鮮な培地で培養された細胞は１００％細胞生存率を構成した。

［ＣｙＱＵＡＮＴ増殖試験］
ＭＣ３Ｔ３およびｈＭＳＣ細胞を、９６ウェル細胞培養プレートで各ウェルにて６×１０^３細胞／２００μｌ培地に播種し、２４時間インキュベートした。抽出物を含まない培養培地は陰性対照として働き、１０％ＤＭＳＯ培養培地は陽性対照として働いた。２４時間のインキュベーション後に、培地を様々な濃度の２００μｌの抽出培地に交換し、１日、３日および５日間インキュベートした。腐食抽出物からの細胞増殖に対する影響をＣｙＱＵＡＮＴアッセイを用いて試験した。ＣｙＱＵＡＮＴ色素結合溶液は、高度に規制されかつ細胞数に密接に比例する細胞ＤＮＡに結合する。培地を除去し、細胞をダルベッコリン酸緩衝整理食塩水（ＤＰＢＳ）ですすいだ。ＤＰＢＳを除去した後、５０μＬのＣｙＱＵＡＮＴ染料結合溶液を各ウェルに加え、次いでカバーをかけ、３７℃で３０分間インキュベートし、４８５ｎｍで励起し、５３０ｎｍで発光検出するマイクロプレートリーダーを使用して、各サンプルウェルの蛍光強度を測定した。サンプルの蛍光強度を平均陰性対照（新鮮な培地で培養した細胞）の強度で割って、対照と比較した細胞のパーセント生存率を決定した。新鮮な培地で培養された細胞は、１００％正常な増殖を構成する。測定後に、〜４９４ｎｍの励起波長を持ち〜５１７ｎｍで発光する蛍光顕微鏡を使用して、細胞の撮像も行った。

［アルカリホスファターゼ活性］
アルカリホスファターゼは、有機リン酸塩基質を加水分解して石灰化促進剤である遊離無機リン酸塩を放出し、鉱物形成の阻害剤である細胞外ピロリン酸の濃度を低減することによって、石灰化プロセスに重要な役割を果たす。ＡＬＰ活性を、リン酸ｐニトロフェノール（ｐＮＰＰ）技術を使用して定量化した。成長培地で収集した異なる抽出物培地でｈＭＳＣを３日間、７日間、および１４日間培養した後、細胞をＤＰＢＳですすぎ、細胞溶解物を使用して２０分間溶解させた（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ）。ＡＬＰ活性は、製造者のプロトコルに従ってｐＮｐｐを基質として使用して測定した。基質溶液を細胞溶解上澄みと共に３７℃で１時間、光に曝さずにインキュベートし、その後、０．５ＭのＮａＯＨを加えることによって反応を停止させた。生成されたｐＮｐｐをマイクロプレートリーダーを使用して４１０ｎｍで測定し、Ｑｕａｎｔ‐ｉＴ ＤＮＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して測定された総ＤＮＡ含有量に対して正規化した。ＡＬＰ活性を成長培地および分化培地で培養したｈＭＳＣと比較した。

［定量的実時間ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ‐ＰＣＲ）］
骨形成培地での培養後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ，Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，Ｐａ）を使用して、製造者のプロトコルに従って、ＲＮＡ抽出を実施した。マイクロプレートリーダーを使用して２６０ｎｍおよび２８０ｎｍで吸光度を測定することによって、ＲＮＡの濃度および純度を決定した。次いで、ＩｍＰｒｏｍ ＩＩ Ｐｒｏｍｅｇａ逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、製造者のプロトコルに従って逆転写を実行した。ｑＲＴ−ＰＣＲ実験（表６．２）では、ヒトグリセルアルデヒド３‐リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ラント関連転写因子２（ＲＵＮＸ２）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、およびオステオカルシン（ＯＣＮ）のプライマーを使用した。ＲＵＮＸ２は、間葉系細胞を未成熟骨芽細胞に誘導するために必要な最初の転写因子であり、そこでその発現は増加する。ＡＬＰは、骨芽細胞分化のマトリクス成熟段階で最大限に発現する重要な酵素であり、鉱物沈着部位に高濃度のリン酸塩を提供する。ＯＣＮは、骨芽細胞によって合成される骨特異的タンパク質であり、骨形成の成熟を示し、骨の石灰化およびカルシウムイオンの恒常性を暗示する。

［インビボマウス皮下試験］
マウス皮下試験のための全ての実験手順は、シンシナティ大学の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。健康なヌードマウスを管理された条件下で飼育し、標準的なペレット飼料および水で維持した。イソフルランを使用し、ノーズコーンを通してマウスに麻酔をかけた。皮膚切開を行って、マウスの背中に皮下ポケットを形成した。寸法が直径５ｍｍ×厚さ１．４ｍｍの純Ｍｇ、ＡＺ３１、ならびにＷＸ１１およびＷＸ４１アズキャスト合金をポケット内に挿入し、外科用ステープルによって切開を閉じた。７日、４０日、および７０日後に、マウスをＣＯ_２チャンバで屠殺し、続いて頸椎脱臼を行った。Ｍｇ／Ｍｇ合金インプラントを周囲の組織と共に回収し、組織から慎重に分離し、洗浄し、空気乾燥し、最終質量を測定して、腐食による質量の変化を決定し、０章に示した質量損失方程式に従って腐食速度を算出した。インプラントの周囲の組織はＰＢＳ中１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、ヘマトキシリン‐エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色のために切片化した（４μｍ／切片）。７０日間の外植サンプルも、腐食生成物を除去する前後にＳＥＭを使用して撮像し、ＥＤＸを使用して分析した。

［結果］
［Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ基合金の表面の細胞生存率および付着性］
図７．１は、直接ＷＸ１１およびＷＸ４１合金上で１日および３日間培養し、次いでカルセインＡＭ（生細胞で緑色の蛍光）およびエチジウムホモダイマ‐１（死細胞で赤色蛍光）で染色した前骨芽細胞のＭＣ３Ｔ３‐Ｅ１細胞を示す。１日および３日間の培養後、ＷＸ１１およびＷＸ４１のアズキャストおよびＴ４熱処理合金（図７．１ａ〜ｄ、ｈ〜ｋ）は両方とも、純Ｍｇ（図７．１ｅおよびｌ）およびＡＺ３１（図７．１ｆおよびｍ）と比較して、同等の生細胞密度を示した。生細胞に比べて比較的少数のアポトーシス細胞が各材料で観察され、一般的に良好な細胞生存率を示した。組織培養プラスチックは、Ｍｇ系材料と比較してより高い細胞生存率を示した。異なる群の間で細胞形態に有意な差は観察されなかった。１日の場合と比較して、３日間の培養後も、Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金の間の細胞密度は依然として高く、細胞が腐食環境に長時間直接曝露されることによって大きく影響されないことを示した。

図７．１は、１日および３日間の培養後に以下のサンプルに付着しているＭＣ３Ｔ３‐Ｅ１細胞の生細胞（緑色）および死細胞（赤色）の蛍光画像を示す。ａおよびｈ）ＷＸ１１アズキャスト；ｂおよびｉ）Ｔ４熱処理したＷＸ１１；ｃおよびｊ）ＷＸ４１アズキャスト；ｄおよびｋ）Ｔ４熱処理したＷＸ４１；ｅおよびｌ）純Ｍｇ；ｆおよびｍ）ＡＺ３１アズドローン；ｇおよびｎ）組織培養プラスチック。

押出合金の直接生死判別アッセイ（図７．２）は、１日および３日間の培養後に押出合金上に付着している生きたＭＣ３Ｔ３細胞の高い細胞密度を示した。生細胞および正常な細胞形態と比べて、比較的少ないアポトーシス細胞が各合金で観察され、高い細胞生存率を示した。１日後のＷＺ４２合金上の細胞密度は、組織培養プラスチック（tissue culture plastic）のそれと同様であるように見え、かつ他の合金より高いように見えた。３日間の培養後に、ＷＫ４１およびＷＺ４２合金上の生細胞の付着性は非常に高く、組織培養プラスチック上のそれと同様であった。１日から３日間の合金上の細胞密度を比較すると、増大する数字は健康な細胞増殖を示していた。図７．３のＦアクチンおよび核染色に示された細胞形態は、フィラメントが明瞭に観察される、健康な、伸展した細胞形態を示し、良好な細胞付着性を実証している。

図７．２は、１日（上）および３日間（下）の培養後の研磨された押出Ｍｇ合金の表面上ＭＣ３Ｔ３細胞の生細胞（緑色）および死細胞（赤色）を示す。スケールバー＝２００μｍ。

図７．３は、３日間の培養後の研磨した押出Ｍｇ合金表面のＭＣ３Ｔ３細胞のＦアクチン（赤色）のファロイジン染色および細胞核（青色）のＤＡＰＩ染色を示す。スケールバー＝２０μｍ。

ＭＣ３Ｔ３細胞が表面に付着した合金サンプルは次に、ＳＥＭを使用して撮像した（図７．４）。特にＷＫ４１およびＷＺ４２合金のサンプルに見られた高い細胞付着性が、ＫＸ１１合金に付着した比較的低い細胞数と共に確認された。腐食生成物の沈着は、ＳＥＭ画像のより明るい領域に示されるように、腐食したＭｇ合金の表面でも観察された。

図７．４は、押し出されたａ）市販のＡＺ３１、ｂ）純Ｍｇ、ｃ）ＫＸ１１、ｄ）ＷＫ１１、ｅ）ＷＫ４１、およびｆ）３日間の培養後のＷＺ４２の表面に付着したＭＣ３Ｔ３細胞のＳＥＭ画像を示す。

ＳＥＭでの撮像中にサンプル全体の様々な領域で、フルフレームＥＤＸ分析も実施した。カルシウムおよびリンの重量パーセントは図７．５にグラフで示され、これは、ＷＺ４２合金中に存在する最大限のＣａおよびＰの含有量を示すが、ＫＸ１１合金の表面の濃度は最小限である。基質表面に存在するパーセンテージＰは、合金にＹを添加することにより上昇した。

図７．５は、ＥＤＸで決定された、ＭＣ３Ｔ３細胞を３日間培養した後の押出Ｍｇ合金サンプルの表面上のＣａおよびＰの平均重量％を示す。＊のマークが付いた群は互いに有意差があった。各群でｎ＝４である。

［Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ基合金の分解生成物に間接的に曝露された細胞の生存率および増殖］
図７は、ＭＣ３Ｔ３‐Ｅ１細胞およびＭＴＴアッセイを使用して実施したＷＸ１１サンプルの間接細胞毒性結果を示す。両方の培養期間で、細胞生存率は予想通り１００％の抽出物濃度で最も大きく低下し、抽出物の割合が減少するにつれて上昇した。抽出物による１日の培養後（図７．ａ）、細胞生存率の低下は観察されず、２５％および１０％の抽出物濃度では細胞毒性は観察されなかった。３日間の培養後（図７．ｂ）、２５％および１０％の抽出物濃度で、細胞生存率は７０％超まで低下した。これは、高濃度の抽出物が細胞毒性であり、浸透圧衝撃を引き起こすことを示す知見と一致しており、１０倍の抽出物希釈がアズキャストマグネシウム材料の許容可能な細胞適合性応答のための指標として使用されることを示唆している。ＷＸ１１アズキャストもまた、抽出物培地で１日および３日後にＷＸ１１Ｔ４、ＷＸ４１アズキャスト、ＷＸ４１Ｔ４、および純Ｍｇと比較して、５０％の抽出物濃度でかなり高い細胞生存率を示した。しかし、抽出物で１日培養した後、ＷＸ１１およびＷＸ４１のアズキャストおよびＴ４処理合金は、２５％の抽出物濃度で純Ｍｇと比較して、かなり高い細胞生存率を示したが、それらの間の違いは３日間の培養後には観察することができなかった。

図７．６は、アズキャストおよびＴ４熱処理ＷＸ１１およびＷＸ４１合金ならびにアズキャスト純Ｍｇからの抽出物培地で、ａ）１日、およびｂ）３日間培養したＭＣ３Ｔ３細胞の生存率を示す。＊と他の群または接続されたままとの間の有意差（ｐ＜０．０５）。抽出物濃度毎、群毎、時点毎にｎ＝５。

ＭＣ３Ｔ３細胞と押出合金からの抽出物により行われたＭＴＴアッセイ（図７．６）は、合金抽出物の低毒性を示し、全ての抽出物希釈液で少なくとも７０％の細胞生存率が観察された。細胞生存率の３０％を超える低下は、ＥＮ ＩＳＯ １０９９３：５によれば細胞毒性効果と考えられ、したがって合金は非細胞毒性であるとみなされる可能性がある。合金を比較すると、ＷＫ１１およびＷＫ４１は、１００％の抽出物濃度で３日間の培養後に生存率がわずかに低下することが観察されたが、生存率は３日間の培養後に回復した。

図７．６は、押出合金ならびに市販のＡＺ３１および純Ｍｇからの分解生成物を含む抽出物培地で、ａ）１日、およびｂ）３日間培養したＭＣ３Ｔ３細胞の生存率を示す。＊のマークが付いた群は相互に有意差がある（ｐ＜０．０５）。†のマークが付いた群は‡のマークが付いた群とは有意差がある（ｐ＜０．０５）。抽出物濃度毎、群毎、時点毎にｎ＝４。

［Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ基合金の分解生成物に間接的に曝される前骨芽細胞およびヒト間葉系幹細胞の増殖］
ＭＣ３Ｔ３細胞の増殖はＣｙＱＵＡＮＴアッセイを用いて評価された。それはピコグリーン蛍光色素を利用してｄｓＤＮＡに結合し、増殖の相対的なレベルを示す。押出合金抽出物によりＭＣ３Ｔ３細胞を３日間培養した後（図７．７）、増殖は再び１００％の抽出物濃度で最も大きく減少し、抽出物の割合が低下するにつれて増加した。１００％の抽出物濃度では、ＷＺ４２は他の群と比較してかなり高い増殖をもたらした。全ての合金が他の全ての濃度で同様の増殖を示した。しかし、市販の押出ＡＺ３１から収集した抽出物は、１％および０．１％に希釈された場合、他の群と比較して低い増殖をもたらした。一方、１０：１の比率で押し出された内製のＡＺ３１は、市販のＡＺ３１よりはるかに高い増殖を示し、他のＭｇ合金とは同様の増殖であった。ＤＮＡ結合染料を組み込んだ細胞を示す蛍光画像は図７．８に示されており、合金抽出物に曝露された細胞の安定した増殖を確認し、抽出物濃度が低下するにつれて、細胞密度は一般的に高くなる。

図７．７は、ＡＺ３１、ＫＸ１１、ＷＫ１１、ＷＫ４１、およびＷＺ４２の２５％、１０％、１％、および０．１％に希釈された押出合金抽出物で３日間培養したＭＣ３Ｔ３細胞の増殖を、市販の純ＭｇおよびＡＺ３１と比較して、通常の抽出物培地で培養した対照細胞の百分率として示す。＊のマークが付いた群は、同一抽出物濃度でも、他の群とは有意差がある（ｐ＜０．０５）。抽出物濃度毎、群毎、時点毎に、ｎ＝４。

図７．８は、ＤＮＡに結合するＣｙＱＵＡＮＴ染料を用いて、３日間の培養後に２５％、１０％、１％、および０．１％に希釈した押出合金抽出物に曝露したＭＣ３Ｔ３細胞の蛍光画像を示す。スケールバー（右下部、全ての画像で同じ）＝２００μｍ。

細胞増殖についても、ｈＭＳＣを使用して１日、３日、および５日間培養して試験した（図７．９）。試験した合金の場合、抽出物を含まない成長培地対照と比較して、１００％近くまたはそれを超える増殖が三つの全ての時点で観察された。細胞数も、１日の培養後にＡＺ３１と比較して、かつ１００％の抽出物濃度時に３日間および５日間の培養後に、著しく高かった。５日間の培養後にＤＮＡ結合染料を取り込んだ細胞を示す蛍光画像。合金抽出物に曝された細胞の増殖の付着を確認する。

図７．９は、市販の純ＭｇおよびＡＺ３１と比較して、ＡＺ３１、ＫＸ１１、ＷＫ１１、ＷＫ４１、およびＷＺ４２の押出合金抽出物を５０％、２５％、および１０％に希釈して、ａ）１日、ｂ）３日、およびｃ）５日間培養したｈＭＳＣの増殖を通常の抽出物培地で培養した対照細胞の百分率として示す。＊のマークが付いた群は、互いに有意差がある（ｐ＜０．０５）。†のマークが付いた群は、その時点において他の群とは有意差がある（ｐ＜０．０５）。‡のマークが付いた群は、その時点において、ＷＫ４１を除き、他の全ての群と有意差がある。抽出物濃度毎、群毎、時点毎にｎ＝４。

図７．１０は、ＤＮＡに結合するＣｙＱＵＡＮＴ染料を用いて、５日間の培養後に、５０％、２５％、および１０％に希釈した押出合金抽出物に曝露したｈＭＳＣの蛍光画像を示す。スケールバー（右下、全ての画像で同じ）＝２００μｍ。

［Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ基合金の分解生成物に間接的に曝露したヒト間葉系幹細胞の分化］
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は、成長培地で収集されたＭｇ合金の分解生成物に曝され、それらのＡＬＰ活性は、抽出物での３日、７日、および１４日間の培養後に、新鮮な成長培地および分化培地で培養した細胞と適切に比較された（図７．１１）。全体的に、抽出物の濃度が低ければ、ＡＬＰ活性が高くなることが観察され、ｈＭＳＣの最も高いＡＬＰ活性は、１０％の抽出物培地に曝されたときに発生した。１０％および２５％などの低い濃度のＭｇ合金抽出物に曝された細胞のＡＬＰ活性は、３日後に通常の成長培地で培養された細胞のそれと同様であったが、全ての群は予想通り、分化培地で培養された細胞より低いＡＬＰ活性を示した。３日後に、合金抽出物間でＡＬＰ活性の差は観察されなかった。Ｍｇ合金ＷＺ４２では、７日目に市販のＡＺ３１および純Ｍｇと比較して、５０％、２５％、および１０％の抽出物濃度でより高いＡＬＰ活性が観察された。１４日間の培養後に、合金抽出物群と成長培地対照との間にＡＬＰ活性の有意差は観察されなかった。

図７．１１は、５０％、２５％、および１０％に希釈した抽出物で、ａ）３日、ｂ）７日、およびｃ）１４日間の培養後に、押し出されたＭｇ合金に対し、間接法でｈＭＳＣを用いて行うＡＬＰの定量化（ＤＮＡで正規化）を示す。ＧＭ＝成長培地対照；ＤＭ＝分化培地対照。＊のマークが付いた群は互いに有意差がある（ｐ＜０．０５）。†のマークが付いた群はその時点で他の全ての群と有意差がある（ｐ＜０．０５）。抽出物濃度毎、群毎、時点毎にｎ＝４。

ｈＭＳＣ分化培地で収集された１０％希釈抽出物に７日、１４日、および２１日間曝露した後、間葉系幹細胞の分化におけるアップレギュレーションの段階にほぼ基づく骨形成分化マーカー、すなわち初期（ＲＵＮＸ２）、中期（ＡＬＰ）、および後期（ＯＣＮ）を測定して、ｈＭＳＣの分化に対するＭｇ合金の分解生成物の影響を決定した（図７．１２）。ＷＺ４２は、骨形成マーカーのアップレギュレーションをもたらすようであることが観察された唯一の合金であった。ＡＬＰの抽出物を含まない分化培地で培養した細胞と比較して、培養７日後および２１日後にはより高い倍数の増加があり、１４日後にはより高いオステオカルシンの発現が観察された。１４日目および２１日目の後期骨形成分化マーカーであるオステオカルシンの厳しいダウンレギュレーションは、ＡＺ３１および純Ｍｇの抽出生成物に曝された細胞に観察された。これらの対照材料、すなわちＡＺ３１および純Ｍｇと比較して、試験した新規な合金は、７日後にＲＵＮＸ２の、１４日後にＡＬＰ（ＷＫ１１を除く）の、そして２１日後にＯＣＮのアップレギュレーションを示した。しかしながら、本研究はｎ＝１について完了しただけであり、大きいサンプルサイズの追加的実験が必要である。

図７．１２は、成長培地（growth media）で培養した細胞に対して正規化された分化培地（differentiation media）で希釈された１０％抽出物により、ａ）７日間、ｂ）１４日間、およびｃ）２１日間培養したｈＭＳＣでＲＵＮＸ２、ＡＬＰ、およびＯＣＮの発現を示したｑＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現データを、培地が抽出物を含まない分化培地群と比較して示す。全ての群に対して、ｎ＝１。

［Ｍｇ、Ｙ、Ｃａ、Ｚｒ、Ｚｎ、およびＡｌの塩に曝されるヒト間葉系幹細胞の増殖］
Ｍｇ（５０ｍＭ、２０ｍＭ、１０ｍＭ、および１ｍＭの濃度）ならびにＹ、Ｃａ、Ｚｒ、Ｚｎ、およびＡｌ（１ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、および０．００１ｍＭの濃度）の成長培地中で塩化物塩と共に培養されたｈＭＳＣは、１日、３日、および５日間の培養後にＣｙＱＵＡＮＴアッセイを用いて増殖について評価され、通常の成長培地に対して正規化された。１日の培養後（図７．１３ａ）、Ｃａ、Ｙ、Ｚｒ、およびＡｌの存在下での増殖は一般的に、全ての濃度で金属塩の存在によって影響されなかった。ＭｇおよびＺｎの場合、試験した高い濃度では（Ｍｇは５０ｍＭ、Ｚｎは１ｍＭ）どちらも、ｈＭＳＣの増殖の低下を示したが、これはさらに希釈することで回復した。培養の３日目に（図７．１３ｂ）、再び高濃度のＭｇおよびＺｎは細胞数を減らしたが、高い濃度のＹ、Ｚｒ、およびＡｌでは細胞数の増加が観察された。これらの傾向は５日間の培養後も維持された。染色した細胞は撮像され、図７．１４に示されており、定量化された細胞数の変化が図７．１３で確認される。

図７．１３は、成長培地に溶解したＭｇ（５０ｍＭ、２０ｍＭ、１０ｍＭ、および１ｍＭの濃度）ならびにＹ、Ｃａ、Ｚｒ、Ｚｎ、およびＡｌ（１ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、および０．００１ｍＭの濃度）の塩化物塩と共に、ａ）１日、ｂ）３日、およびｃ）５日間培養したｈＭＳＣの増殖を、成長培地および分化培地で培養された対照細胞の百分率として示す。＊のマークが付いた群は、新鮮な成長培地で培養された対照細胞とは有意差がある（ｐ＜０．０５）。抽出物濃度毎、群毎、時点毎にｎ＝３。

図７．１４は、成長培地に溶解したＭｇ（５０ｍＭ、２０ｍＭ、１０ｍＭ、および１ｍＭの濃度）ならびにＹ、Ｃａ、Ｚｒ、Ｚｎ、およびＡｌ（１ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、および０．００１ｍＭの濃度）の合金元素塩化物塩に曝されたｈＭＳＣの５日間の培養後の蛍光画像を、ＤＮＡに結合するＣｙＱＵＡＮＴ染料を使用して示す。スケールバー（右下、全ての画像で同じ）＝２００μｍ。

［Ｍｇ、Ｙ、Ｃａ、Ｚｒ、Ｚｎ、およびＡｌの塩に曝されたヒト間葉系幹細胞の分化］
Ｍｇ合金に存在する元素の金属塩に曝されたｈＭＳＣのＡＬＰ活性は、１４日間の培養後に、新鮮な成長培地および分化培地で培養された細胞に匹敵した（図７．１５）。成長培地と比較して、塩すなわち２０ｍＭおよび１０ｍＭのＭｇ、０．０１ｍＭのＣａ、および１ｍＭのＺｎが溶解している希釈液では、細胞のＡＬＰ活性は成長培地より高く、分化培地で培養されたｈＭＳＣの場合と同程度となった。高濃度のＡｌ（１ｍＭおよび０．１ｍＭ）はＡＬＰの細胞発現を低減した。

図７．１５は、成長培地に１４日間溶解しているＭｇ（５０ｍＭ、２０ｍＭ、１０ｍＭ、および１ｍＭの濃度）ならびにＹ、Ｃａ、Ｚｒ、Ｚｎ、およびＡｌ（１ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、および０．００１ｍＭの濃度）の塩化物塩で培養中のｈＭＳＣを使用して行うＡＬＰの定量化（ＤＮＡで正規化）を示す。＊のマークが付いた群と成長培地対照との間のＡＬＰ活性に有意差がある。ＧＭ＝成長培地対照；ＤＭ＝分化培地対照。抽出物濃度毎、群毎、時点毎にｎ＝３。

［インビボマウス皮下試験］
ヌードマウスの皮下組織におけるＭｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒアズキャスト合金、純Ｍｇ、およびＡＺ３１の埋込の局所部位のＨ＆Ｅ染色を図７．１６ａ〜ｌに示す。周囲組織に対する埋め込まれた合金の最小限の毒性が観察されたが、インプラントの周囲の領域は、正常な組織修復を受けているように見えた。炎症細胞の有意な蓄積は観察されなかったが、ピンク色に染色されたコラーゲン線維および反応性線維芽細胞から構成される一層の組織が７日後に見られた。この時点で、アズキャストＷＸ１１およびＷＸ４１合金ペレットに隣接する組織における比較的高密度の線維芽細胞は、それらの存在が埋込部位の正常な治癒反応を阻害しなかったことを示唆している。埋込の４０日後および７０日後に、高密度の慢性炎症細胞が存在することなく、密なコラーゲン性結合組織がＭｇインプラントの位置の周囲に見られた。正常な脂肪細胞が真皮を過ぎてかすかに認められた。

図７．１６は、ヌードマウスの皮下組織におけるａ、ｅ、ｉ）ＷＸ１１、およびｂ、ｆ、ｊ）ＷＸ４１アズキャスト合金、ｃ、ｇ、ｋ）純Ｍｇ、およびｄ、ｈ、ｌ）ＡＺ３１のインプラントの上の皮膚の７日後（ａ〜ｄ）、４０日後（ｅ〜ｈ）、および７０日後（ｉ〜ｌ）のａ〜ｌ）組織画像（Ｈ＆Ｅ染色）を示す。

アズキャストＷＸ４１の質量損失（図７．１７）を通して決定されたインビボ腐食は、７０日後に、アズキャストＷＸ１１よりはるかに低く、純Ｍｇと同程度であり、ＡＺ３１と比較してわずかに高かった。この結果は、Ｙの含有量が高いＹ含有合金つまりＷＸ４１がＷＸ１１より遅く腐食したＭｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金のインビトロ腐食挙動と合致している。

図７．１７は、マウス皮下埋込の前後の、４０日目および７０日目におけるペレットサンプルの質量損失によって算出した腐食速度を示す。各群に対してｎ＝１。

埋込の７０日後に取り出されたサンプルを、乾燥させ、ＳＥＭを用いて撮像し、形成された腐食生成物（図７．１８）を静的浸漬後に形成されたもの（図６．３）と比較して評価した。インビボ腐食後に、腐食生成物の元素マップから見ることができることは、浸漬の研究からの結果と同様に、ＣおよびＯが豊富な層が合金の表面上に形成されていることが観察されたことである。亀裂のある腐食層は、腐食堆積物の凝集体と比較して、より高いＣａおよびＰの含有量を含むことが分かった。腐食生成物を取り除くと、腐食の広がりが明らかになり、図７．１９に示すように、取り出した合金材料の全てに凸凹した表面トポグラフィーが生じていた。

図７．１８は、マウス皮下組織への埋込から７０日後のａ）ＷＸ１１アズキャスト；ｂ）ＷＸ４１アズキャスト；ｃ）純Ｍｇ；ｄ）ＡＺ３１の表面形態を示したＳＥＭ画像を示す。矢印によって示すように様々なスポットでＥＤＸを実施した。

図７．１９は、マウス皮組織への埋込から７０日後、ＣｒＯ_３／ＡｇＮＯ_３溶液で洗浄した、ａ）ＷＸ１１アズキャスト；ｂ）ＷＸ４１アズキャスト；ｃ）純Ｍｇ；ｄ）ＡＺ３１の表面形態を示したＳＥＭ画像を示す。

［考察］
本研究で使用した合金元素は全て、文献に基づいて、かつ毎日の許容量および毒性を示した表６．１にも示されるように、生体適合性があることが示された。Ｙは長寿研究で非毒性であり、非肝毒性であることが示されており、吸収性金属ステントおよび外反母趾手術におけるシェブロン骨切り術用の固定ネジとして臨床的に充分耐えられる合金に組み込まれてきた。Ｙはまた、有機マトリクス形成につながるイベントを介して、骨の骨芽細胞活性領域に対する高い親和性をも有し、それぞれ１×１０^−９〜１×１０^−４Ｍおよび１×１０^−７Ｍの濃度で骨芽細胞の増殖および分化を促進する可能性があり、それは変性ビトロネクチンおよびコラーゲンの立体構造および生物活性に関係がある可能性がある。Ｃａはよく知られており、骨の不可欠な成分であるが、骨に取り込むためにはＭｇが必要である。Ｚｒイオンは細胞毒性が低く、ジルコニウムコーティングはインビボで金属インプラントの骨結合を改善することを実証してきた。上述したＭｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金によるインビトロ細胞適合性、増殖、および分化に対する影響は、１）マウス前骨芽細胞およびヒト間葉系幹細胞を材料の分解生成物を含む培地に曝し、２）細胞を合金に直接播種し、かつ生死判別アッセイを介して生死細胞密度を観察し、３）様々な濃度の合金元素塩を含む培地を細胞に加えることによって決定された。

図７および図７．６は、ＭＴＴアッセイからの結果を提示しており、高い抽出物濃度では（１００％および５０％）、図７のアズキャストおよびＴ４処理合金だけでなく、押出ＷＫ１１合金でも１日目に、細胞生存率は低下し、ＷＫ１１およびＷＫ４１合金でも１００％の抽出物濃度で３日目に低下した。これは、おそらく、高い抽出物濃度が細胞の浸透圧衝撃を引き起こすという報告のためであり、アズキャストマグネシウム材料に受け入れられる希釈液として、１０倍の抽出物希釈が示唆される。実際、抽出物の濃度が低ければ（アズキャストおよびＴ４処理ＷＸ１１およびＷＸ４１合金では２５％および１０％、全ての押出合金では５０％、２５％、および１０％）、合金に高い細胞生存率が観察され、高い合金の分解生成物が低い細胞毒性をもたらすことが示唆された。１日の培養後にＷＸ１１およびＷＸ４１アズキャストおよびＴ４処理合金の２５％および１０％抽出物から、１００％より高い細胞生存率が観察され、それは腐食生成物の水酸化マグネシウムの存在下で、高まる骨芽細胞活性によって促進される可能性がある。同様に、細胞をＭｇ合金基質上で直接培養することによって、図７．１および図７．２で、Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金の表面に付着した高密度の生細胞が観察され、アッセイは、細胞付着性および細胞生存率に対する水素ガスの発生、ｐＨレベルの上昇、および腐食生成物の局所濃度の影響を定性的に示す。しかしながら、腐食速度に見られた差異は、インビトロ細胞適合性結果に影響を与えないようであり、全てのアズキャストおよびＴ４処理したＭｇ合金には同様の数の活性細胞が付着したようであるが、組織培養プラスチックと比較すると細胞密度は低くなるようであった。これは、１００％および５０％の抽出物濃度で細胞生存率が対照より低くなる、これらの合金の３日間のＭＴＴ結果と一致する。１日および３日間両方の培養後のＭｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金上の接着細胞の細長く広がった形態は、細胞付着性を阻害するほど腐食速度が速くない合金の細胞適合性を確認した。高い密度は腐食速度が比較的遅い合金（ＫＸ１１と比較してＷＫ４１およびＷＺ４２）に存在するようであり、細胞が付着しているそれらの表面に堆積するＣａおよびＰの百分率が高くなることも明らかになった（図７．５）。これは、腐食安定性とＭｇ合金の表面に形成される多量のＣａＰ堆積物との相関性を示している可能性があり、チタンの表面のＣａＰコーティングで観察されてきたように、骨芽細胞の接着および増殖を改善させるかもしれない。

本研究では、細胞適合性は、サンプルをαＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに浸漬し、ＭＣ３Ｔ３‐Ｅ１細胞を用いて実施し、提示される結果は異なる細胞株の使用およびそれぞれの細胞培養培地により変化する可能性がある。ＤＭＥＭなど他の培地で培養された細胞は、マグネシウムイオンのキレート剤として機能するＤＭＥＭ中のＬグルタミン含有量が高い場合、ＤＭＥＭに浸漬された合金からのＭｇイオンの放出が潜在的に増加し、αＭＥＭと比較して異なる細胞適合性結果を示すことがあり得る。したがって、ここに提示する得られた細胞適合性結果は、αＭＥＭを使用する細胞培養条件下でのみ考慮すべきであり、ＤＭＥＭまたはＨＢＳＳなど他の培地の場合、培養細胞に異なる局所環境を与え、試験対象合金の腐食速度はもっと高くなる可能性が高いであろう。

押出合金の増殖もまた、ＤＮＡ定量化のＣｙＱＵＡＮＴアッセイを使用して測定した。ＭＴＴアッセイで見られた生存率の低下と同様に、増殖は、図７．７でＭｇ合金抽出物の濃度が高くなるにつれて低減した。他方、ｈＭＳＣの増殖は、抽出物培地の存在下でＭＣ３Ｔ３細胞より高かった。これはｈＭＳＣの耐性がＭＣ３Ｔ３細胞と比較して高いことを示唆している。培養５日後のｈＭＳＣでは、増殖は通常の成長培地で培養した細胞より高かった。Ｍｇ−２Ｃａ合金と比較して増殖に対する優れた効果を有するＭｇ‐１Ｙ（重量％）合金では、ｈＭＳＣの増殖の増加が観察された。増殖の増加はＳＭＡＤ依存性シグナル伝達経路を介して影響され、ＳＭＡＤ４の最大の増加はＹ含有合金で観察された。Ｙ^３＋イオンはマウス骨芽細胞の増殖をも促進した。しかし、ＡＺ３１はＭＣ３Ｔ３細胞およびｈＭＳＣ両方の増殖を低減し、細胞生存率に対するこの負の効果はＡＺ３１およびＡＺ９１を調べる他の群でも観察されている。Ｍｇ合金抽出物培地の存在による分化の誘発は、ＡＬＰ活性（図７．１１）ならびにＲＵＮＸ２、ＡＬＰ、およびＯＣＮの発現（図７．１２）によって測定したが、ほとんど観察されず、ＷＺ４２合金は、骨形成分化を促進するために調査している他のＭｇ合金および純Ｍｇ群と比較して、高い傾向を示した。これは、この合金が、低濃度で骨芽細胞への分化を促進するＹを含有する一方、１〜２５μＭの濃度で試験するとＡＬＰ活性およびコラーゲン濃縮を刺激し、他の合金で除外されているＺｎをも含んでいるためかもしれない。Ｍｇ‐Ｙはまた、他のＭｇ合金および純Ｍｇと比較して、ｈＭＳＣのＡＬＰレベルを高めることも明らかになった。

細胞に合金を添加することの影響を解明するために、各合金元素を塩化物塩の形で、細胞培養および評価のために使用する培地に個別に溶解することも検討された。試験される濃度範囲（０．００１ｍＭ〜１ｍＭ）のＣａ、Ｙ、Ｚｒ、およびＡｌでは、細胞増殖は影響を受けなかった一方、高濃度のＭｇ（５０ｍＭ）およびＺｎ（１ｍＭ）では増殖は低減したが、さらに希釈すると増殖の低下が回復することが分かった。５０ｍＭのＭｇ濃度は、ＭＧ‐６３骨芽細胞の生存率を約５０％低下させたことが文献で観察された１０ｍＭのＭｇイオンを超えるものであった。１ｍＭのＺｎ濃度もまた、ＭＣ３Ｔ３およびＬ９２９細胞に対し、文献で報告された０．０９ｍＭのＩＣ５０のＩＣ５０を超えていた。また文献は、ＺｒについてＭＣ３Ｔ３細胞のＩＣ５０を２．８３ｍＭ、Ａｌについては２．９２ｍＭと報告しており、最大１ｍＭ超を使用しても、増殖の損失は起きなかった。しかし、Ｙに曝されたＭＣ３Ｔ３細胞のＩＣ５０は０．１４２ｍＭであった。本研究では、図７．１０に示すように、１ｍＭのＹ塩濃度はｈＭＳＣの増殖の低下を招かなかった。

合金元素塩によるｈＭＳＣの骨芽細胞分化の促進も調査され、濃度１０〜２０ｍＭのＭｇは分化培地の細胞のＡＬＰ活性を高めると結論した。５ｍＭおよび１０ｍＭのＭｇＳＯ４の濃度はヒト骨髄間質細胞（ｈＢＭＳＣ）からのＥＣＭの石灰化を増強させることが観察され、ＨＩＦ‐２αおよびＰＧＣ‐１αを介して１０ｍＭのＭｇで骨形成因子は最大限促進された。ＡＬＰ活性はＤＮＡ量に正規化されるので、１ｍＭ濃度のＺｎの活性の増加は、図７．１３に示すようにＺｎの添加がもたらす細胞数の減少による分化への好ましい影響を示唆するものではないかもしれない。

この明確な目的のために行われた様々なインビトロ細胞テストの変動は、複数の因子による可能性がある。第一に、細胞数はウェルによって異なる場合がある一方、合金サンプルの寸法および表面仕上げのばらつきが大きくなり、細胞が曝される分解生成物の局所環境に差が生じた可能性がある。試薬および培地の分注量の変動もまた、マイクロプレートリーダーのような測定の方法と同様に、わずかな実験誤差を招いた可能性がある。

過去の研究は、インビボでの埋込時のＲＥ含有Ｍｇ合金の受入れ可能な宿主反応および生体適合性を示してきた。０．４％Ｃａの有無に拘わらずＭｇ−１．５％Ｎｄ−０．５％Ｙ−０．５％Ｚｒ合金の皮下埋込は、Ｔｉ‐６Ａｌ‐４Ｖ対照インプラントとして、適切なＭｇ代謝、腎機能、および宿主組織反応を示した。選択された材料すなわちＷＸ１１アズキャスト、ＷＸ４１アズキャスト、純Ｍｇ、およびＡＺ３１のインビボ腐食および局所組織反応を比較するために、ここでマウス皮下試験を実施した。Ｈ＆Ｅを用いて染色した組織学的スライド（図７．１６）は、Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金が周囲の組織に対し毒性または過度の炎症反応を誘発せず、受入れ可能な宿主反応を呈し、組織修復過程で新しい細胞外マトリクスを形成するためにコラーゲン線維を沈着する、高密度の線維芽細胞の存在下で見られるような、自然な創傷治癒が発生することを示した。この密な結合組織は、全ての時点でＭｇ合金 インプラントに隣接して観察され、様々な大きさの合金分解における生体適合性を示している。試験したＭｇ合金のインビボ質量損失腐食速度（図７．１７）は、インビトロ浸漬から測定した場合より低かった。インビトロの場合と比較してインビボの腐食速度の４桁の減少を観察した後、インビトロ腐食試験はインビボ腐食速度を正確に予測できないと結論付けられた。異なる環境条件、インプラントの周囲の動的な血流、およびｐＨの変動のみならず、緩衝イオンの局所的化学環境もまた、矛盾を説明するために提供することのできる理由の中に含めることができた。インビトロに対しインビボで測定される低い腐食速度は、モルモットの大腿骨およびＬｅｗｉｓラットの皮下環境に髄内移植されたＭｇ合金の調査と一致した。外植サンプルは、浸漬試験からのサンプルと同様の腐食生成物の形成および形態を示した。図７．１８および図７．１９に示す表面のＳＥＭ画像から理解できるように、埋込７０日後のインビボ腐食の範囲は明らかに３週間後のインビトロより大きい。同時に、ＣａおよびＰの存在と共にＣおよびＯに富む腐食生成物が依然として確認された。インビトロおよびインビボ両方に見られる、亀裂のある腐食層の上に腐食生成物が堆積した腐食生成物形態は、他の調査で明らかになった結果と一致する。

それでもなお、埋込みから４０日後および７０日後のインビボ腐食速度はアズキャストＷＸ４１の場合、アズキャストＷＸ１１の場合より低く、かつ７０日後の純ＭｇおよびＡＺ３１の場合と同等であり、それは測定されたインビトロ腐食速度（図６．１）と一致した。この結果は、インビトロ腐食試験がインビボで見られるものを現在は正確に予測できないが、Ｍｇ合金の相対的耐食性を評価するための比較的安価なスクリーニング方法として役立つ可能性があるという確立された知識と一致する。したがって、より安定な系と比較して速く腐食する合金組成物は、インビボ条件下でもより速い腐食を示す可能性があるので、インビボで有利な反応を潜在的にもたらすことのできる合金を選択するのに役立てることができる。絶対的な尺度で、所与のマグネシウム合金の腐食反応に影響を及ぼし得る局所化学的および生物学的環境のみならず材料の様々な因子のため、同じ結論を導き出すことは容易ではないかもしれない。

＜実施例８＞
［ラット大腿骨骨切りモデルでマグネシウム‐イットリウム‐亜鉛‐カルシウム‐ジルコニウム合金のインビボ腐食、骨形成、および宿主反応を評価］
［序論］
マグネシウム基合金は、この千年紀になってそれが生物医学研究に再導入されて以来ずっと、整形外科用途向けの医療製品の分野で最も注目を集めてきた。小動物（例えばマウス、ラット、モルモット、およびウサギ）、大型動物（例えばヒツジおよびヤギ）、およびヒトによる多くの研究は全体的に、マグネシウム合金が骨内または骨の周囲に埋め込まれた場合にその良好な生体適合性を示してきた。これは、Ｍｇの高い強度対重量比およびその分解能と相まって、永久金属ハードウェアに対して行われるような二次的除去手術の必要性を低減し、ＭｇおよびＭｇ合金を、現在の最新技術の不活性金属および生分解性ポリマーの整形外科用装置の大勢的優位性に挑戦する最前線に立つ魅力的な選択肢にする。実証されてきたマグネシウムの他の重要な特性は、Ｍｇ合金に隣接してまたはその近辺で増強される骨形成、Ｃａ‐Ｐ鉱物の高度な堆積、およびＭｇの分解生成物層と新しい骨との間の直接接触を含む。

Ｍｇ合金の骨内への埋込みを含む様々な研究の中で、大多数の研究は、Ｍｇ合金のロッド、ピン、またはネジを大腿骨幹に埋め込むことを含むものであり（〜８）、大腿顆および髄腔への埋込は少数であった。Ｚｈｅｎｇらによって検討された、Ｍｇ合金が骨に埋め込まれる２３の論文では、いずれも耐荷重モデルを表しておらず、いずれも場合も、骨に穴が事前にあけられ、次いでインプラントが圧入されるかねじ込まれるものであった。骨折した骨を固定するために荷重を支えるようにＭｇインプラントが使用された唯一の事例は、Ｃｈａｙａらによって行われたプレートおよびネジの研究であった。これらの研究では、ニュージーランド白ウサギの尺骨に完全な骨折が形成され、骨折を安定させるためにプレートおよびネジを配置できるように、骨折した尺骨の両側に穴が事前にあけられた。これらの研究はＭｇの整形外科用インプラントを評価する唯一の荷重骨折環境のアセスメントであるにも拘わらず、全てのウサギの橈骨は治癒中に無傷のままであり、それは骨折に追加的な支持をもたらし、プレートおよびネジの支持を補完した。

本研究では、ラット大腿骨の完全骨折がＭｇ合金であるＭｇ‐Ｙ‐Ｚｎ‐Ｚｒ‐Ｃａ（ＷＺ４２）のインプラントピンのみを使用して固定される完全耐荷重モデルを追及することを決定した。この合金の材料および生物学的特性は前の節に記載されており、一般的な医療用チタン合金であるＴｉ６Ａｌ４Ｖの性能と比較された。骨の治癒に対する応力腐食環境の影響を評価しながら、合金の安全性および毒性をも評価するために、意図的にピンを動かなくするための追加的な支持体は使用しなかった。選択されたこのモデルは、最適な骨治癒のために要求される解剖学的調和および生体力学的安定性を維持するために骨折フラグメントに貫通させる細いロッドであるキルシュナーワイヤ（Ｋワイヤ）およびスタインマンピンのような整形外科用固定装置に似た概念的な類似性を有する。残念ながら、現在使用されているＫワイヤは骨の治癒後に取り出す必要があり、二次的な処置が必要になる。容易に取り出すことを可能にするために、ワイヤの両端は通常、皮膚の外側に残され、感染および他の合併症を引き起こす導管として作用する「ピントラクト（pin-tract）」を形成する。しかしながら、これらの一般的な整形外科用装置のこのような欠点は、生分解性Ｍｇ合金のＫワイヤを使用することにより、回避することができる。

髄内骨折固定ピンに加えて、別の動物では、骨折していない大腿骨の中骨幹領域の周りにＷＺ４２ワイヤを巻き付けてカフを形成し、異なる領域（髄内ｖｓ皮質骨上）に埋め込まれたＭｇ合金に対する分解および組織反応を比較した。さらに、本研究の別の目標は、完全な血液プロファイルだけでなく、腎臓および肝臓を含む器官および組織分析をも通して、全身毒性を評価することであった。

[材料および方法]
[Ｍｇ‐Ｙ‐Ｚｎ‐Ｃａ‐Ｚｒインプラントの調製]
Ｍｇ‐４．０％Ｙ‐２．０％Ｚｎ‐１．０％Ｚｒ‐０．６％Ｃａ（重量％）の名目組成で、ＷＺ４２合金を溶融し、鋳造した。鋳造後に、４００℃の溶体化処理を２０時間適用し、インゴットを、合金の延性を高めかつ二次相を均質化するために、室温水で急冷した。４５０℃に加熱しながら３０の押出比で押し出すことができるように、インゴットの直径が３７．８ｍｍになるまで旋盤を使用して機械加工した。直径〜６．９ｍｍの押出ＷＺ４２ロッドおよび直径５ｍｍのＴｉ６Ａｌ４Ｖロッドの対照材料（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｏｒａｏｐｏｌｉｓ，ＰＡ）を、寸法が長さ１５ｍｍ×直径１．６６ｍｍのピンおよび長さ２０ｍｍ、直径０．６８ｍｍのワイヤになるまで旋盤を使用して機械加工した。機械加工されたピンおよびワイヤカフの略図および写真を図８．２０に示す。インプラントをアセトンおよびイソプロパノールの洗浄液中で超音波洗浄し、ガンマ線（２×１０６ｃＧｙ、２３．５Ｇｙ／分、セシウム１３７線源、Ｍａｒｋ Ｉ ６８、ＪＬ Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓａｎ Ｆｅｒｎａｎｄｏ，ＣＡ）によって滅菌する前に乾燥させた。

図８．２０。大腿骨髄内キャビティに挿入されたピン（下）、および中骨幹領域に巻き付けられたワイヤカフ（上）の略図（ａ）および写真（ｂ）。ａ）では、ワイヤは直線状に機械加工され、次いで手術中に大腿骨に巻き付けられた。

［動物モデル］
全ての動物実験は、ピッツバーグ大学の実験動物委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。手術前に、鎮静の開始のために、体重約２５０〜３００ｇの雌のＳｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラットに、鎮静の開始のために濃度２〜５％、および維持のために０．２５〜４％のイソフルランの吸入によって麻酔をかけた。各ラットは右後肢のみで手術を受けた。外科的処置の写真を図８．２１に示す。最初に、右後肢の毛を剃り、消毒し、図８．２１ａに示す位置で右大腿骨に約２ｃｍの切開を施した。側方アプローチを介して右大腿の皮膚および中骨幹領域を露出させた。完全な大腿骨骨切り術はハンドヘルドドリルを使用して行われた（図８．２１（ｂ））。ＷＺ４２またはＴｉ６Ａｌ４Ｖの固定ピンを最初に骨折した大腿骨の遠位端部の髄内空間に挿入し（図８．２１ｃ）、次いで大腿近位部の髄内空間に挿入し（図８．２１ｄ）、図８．２１ｅに示すように骨折を接合した。ワイヤカフの場合、右大腿は切開せず、骨幹の中間部にワイヤを巻き付け、大腿骨の骨幹軸に沿って平行移動または移動を回避するように骨に押し付けた（図８．２１ｇ）。サンプルを埋め込んだ後、ＶＩＣＲＹＬ（Ｊ３１５）で筋膜および筋肉を閉じ、非吸収性モノフィラメントポリアミド縫合糸を用いて皮膚を閉じた。

術後の痛みと苦痛について、ストレスの表出や行動異常、運動、食物、および水分摂取の変化が無いか毎日観察した。さらに、感染の徴候またはガスポケットの存在について右後肢を視覚的に観察した。

図８．２１。金属製サンプルを埋め込むために使用した外科的処置：ａ）大腿骨髄内キャビティに挿入されたピンの写真（下）、および中骨幹領域の周りに巻き付けられたワイヤカフの写真（上）。ピンモデル−ａ）線は、大腿骨を露出させるために切開が行われた位置を示す；ｂ）丸鋸を用いてラット大腿骨に骨折を形成する；ｃ）骨折した大腿骨の片側の髄空間にピンを挿入する；ｄ）骨折した大腿骨に橋をかけるように、大腿骨の反対側にピンを挿入する；ｅ）ピンで位置合わせと固定を維持しながら骨折部を閉じる；ｆ）手術部位を完全に閉じ、縫合する。カフモデル−ｇ）切開して大腿骨を露出させた後、骨切り術を行わず、骨を無傷のままにしておき、大腿骨の中央部の周囲にワイヤを巻き付けた。

表８．３に示すように、ＷＺ４２ピンおよびＴｉ６Ａｌ４Ｖピンの両方について５匹の動物の群を、血液、肝臓、腎臓、組織学的、およびマイクロＣＴの分析の２週間、８週間、および１４週間の各時点に使用し、かつ６匹の動物の群に１４週間の単一時点でワイヤカフを埋め込んだ。ラットは二酸化炭素を徐々に過剰投与して屠殺した後、頸椎脱臼させた。屠殺直後に、肝臓、腎臓、および実験群大腿骨を回収し、以下の節で述べるようにさらなる分析のために保存した。手術を受けなかった３匹のラットもまた、手術対照群として役立てるために屠殺した。

［Ｘ線撮像］
インプラントの位置および骨折の安定性を調べるために、手術後１週間でラットのＸ線撮像を実施した。

［血球数および血清の生化学的測定］
血液サンプルを、動物から手術前に麻酔下で、テールスニップによって、かつ終末的に（埋込の２、８、および１４週間後）に心穿刺および吸引によって採取した。血球数を決定するために、血液はＫ２‐ＥＤＴＡチューブに採取され、分析は、Ｍａｒｓｈｆｉｅｌｄ Ｌａｂｓ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）によって、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＴ０００ｉ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｙｓｍｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｋｏｂｅ，Ｊａｐａｎ）を用いて実施された。血清サンプルは、採取した血液を２０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離することによって得た。血清生化学検査は、Ｍａｒｓｈｆｉｅｌｄ Ｌａｂｓによって、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ化学分析装置（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して実施された。

［マイクロコンピュータ断層撮影］
プラスチック包埋したラット大腿骨を使用して、高解像度マイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）スキャンを行った。サンプルは、埋込前および手術後２、８、および１４週間の回収直後に、連続回転μＣＴにより、１０．５μｍのボクセルサイズでスキャンした。再構築したデータセットを使用して３Ｄボリュームを生成し、密度に基づくグレー値のヒストグラムを使用することによって、周囲の分解生成物および骨から残留金属ロッドを区別した。金属ピンの密度閾値を使用して、残留マグネシウム合金の堆積を周囲の物質から分離し、埋込前のピンの堆積と比較して、次の式を用いてインビボ腐食速度を推算した。
Ｃ＝（Ｋ×Ｖ）／（Ａ×Ｔ）
式中、Ｃは腐食速度（ｍｍ・年^−１、ｍｍｐｙ）であり、定数Ｋは８．７６×１０^４であり、Ｖは堆積損失（ｃｍ^３）であり、Ａは露出した初期サンプル面積（ｃｍ^２）であり、Ｔは露出時間（時）である。

［組織学的標本作製および分析］
肝臓および腎臓の試料を、１０％の中性緩衝ホルマリンで固定し、脱水し、パラフィンに湿潤させ、包埋した。次いでそれをヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色により検査して、ＷＺ４２合金の分解が重要な内蔵器官に何らかの病理学的変化をもたらすか否かを評価した。

大腿骨を７０％エタノールで固定し、脱水し、Ｏｓｔｅｏ‐Ｂｅｄ Ｐｌｕｓメタクリル酸メチルベースの包埋キット（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）で湿潤させ、包埋した。プラスチックブロックは回転ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ ＲＭ２２５５、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）により切片化し、ゴールドナーのトリクロームおよびアルカリホスファターゼ染料を使用して染色した。

［組織の消化および元素分析］
肝臓および腎臓組織を、元素の濃度測定ができるようにＩＣＰ‐ＯＥＳを使用して消化させた。最初に、組織を７０℃で２４時間乾燥させ、次いで均質化して計量した。次にサンプルを２０ｍｌ硝酸／ｇ組織に７０℃で６時間浸漬し、続いて４ｍｌの過酸化水素／ｇ組織を１時間、４ｍｌの硫酸／ｇ組織を１時間加えることによって消化させた。次いでサンプルをＭｉｌｌｉ‐Ｑシステム（１８ＭΩ・ｃｍ脱イオン水、Ｍｉｌｌｉ‐Ｑ Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で精製した水で５０倍に希釈し、０．４５μｍシリンジフィルタで濾過し、ＩＣＰ‐ＯＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によってＭｇ濃度を分析した。

[結果]
[Ｍｇ‐Ｙ‐Ｚｎ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金ピンを使用する大腿骨欠損の固定]
大腿骨の中央部に完全な骨切り術の固定を提供するために、尖った端部を持つピンをＷＺ４２合金およびＴｉ６Ａｌ４Ｖ合金から作製し、断片化した大腿骨の二つの半部分の髄内キャビティに挿入した。加えて、ＷＺ４２およびＴｉ６Ａｌ４Ｖのワイヤを自然大腿骨の中央部の周りに巻き付けて、骨に挿入した生体材料の組織反応を、骨の外表面における組織反応と比較した。ピンは手術中に全ての大腿骨内に無事に挿入され、ｗｉｔｈ一部の事例では（図８．２２ｃ、赤い矢印）ピンの直径と髄内キャビティの直径との間にわずかな不一致が見られ、小さい間隙が生じるにも拘わらず、図８．２２ａおよびｂの７日目のＸ線画像に見られるように、断片は接合される。ワイヤカフによっては埋込中にスナップ止めされるものもあったが、図８．２２ｄおよびｅに示すように、全てが大腿骨の周りに固定状態に維持された。

図８．２２は、ラットの右大腿骨に埋め込まれたＷＺ４２マグネシウム合金（ａ）およびＴｉ６Ａｌ４Ｖ（ｂ）のＫワイヤ（白矢印で指定）の１週間のＸ線画像を示す。ｃ）一部のＸ線画像では、断片の位置ずれ（赤矢印）およびＷＺ４２インプラント付近の空の空間（黄矢印、丸で囲まれている）が観察された。ラットの右大腿骨に埋め込まれたＷＺ４２マグネシウム合金（ｄ）およびＴｉ６Ａｌ４Ｖ（ｅ）のワイヤカフ（白矢印で指定）の１週間のＸ線画像。

図８．２２ｃに示されるように、黄矢印で指摘した空の空間の小さいポケットは、ＷＺ４２合金ピンまたはカフを埋め込まれたラットの７５％のＸ線画像で観察された。原因は、Ｍｇインプラントの分解から発生した水素ガスによる可能性が高い。Ｘ線画像におけるそれらの存在にも拘わらず、頻繁に行われたラットの目視検査中に、ラット後肢に皮膚の膨隆は観察されなかった。ラットは手術後７日までに移動性を回復した。

［Ｍｇ‐Ｙ‐Ｚｎ‐Ｃａ‐Ｚｒインプラントの全身毒性］
総血球数を下の表８．４に列挙するが、これは概ね血球数の乱れを示さず、パラメータは基準範囲内か、手術前のレベルに近い状態を維持した。ＷＺ４２のカフ、ならびにＷＺ４２およびＴｉ６Ａｌ４Ｖのピンでは、１４週で低血小板数から基準範囲または未手術レベルとの小さい差が観察される一方、ＷＺ４２およびＴｉ６Ａｌ４Ｖのピン両方で２週目に術後白血球数の上昇が見られた。

同様に、血清生化学パラメータを表８．５に示す。腎機能はクレアチニンおよび尿素レベルによって測定され、肝機能はアルブミン、アルカリホスファターゼ、ビリルビン、およびグルコースによって測定される。全てのパラメータは基準範囲内か、手術前のレベルを維持し、腎臓および肝臓の機能および代謝に対する埋め込まれた合金材料の影響がほとんど無いことを実証した。

血清サンプルから電解質パラメータ（カルシウム、ナトリウム、塩化物、リン、およびマグネシウム）を測定した。それらを表８．６に示す。重要なことは、マグネシウムレベルが基準範囲の下限内を維持し、採取した血液中にインプラントから分解したＭｇの蓄積が見られないことを示していることである。他の全ての電解質も同様に、未手術ラットおよび規定された許容基準範囲との一致を維持した。

酸消化された肝臓および腎臓（図８．２３）のＩＣＰ‐ＯＥＳ結果は、未手術対照ラットで見られる正常レベルを超えるＭｇの蓄積がＷＺ４２またはＴｉ６Ａｌ４Ｖ群で採取された肝臓および腎臓の組織に観察されないことを実証した。肝臓および腎臓におけるＣａおよびＺｎの濃度もまた、正常レベルを逸脱しなかった。消化された肝臓および腎臓から測定された他の合金元素（ＹおよびＺｒ）の濃度も、低すぎて正常レベルと区別できないと判断され、Ｙについては、肝臓および腎臓の両方に＜０．７μｇ／ｇ乾燥質量が存在し、Ｚｒについては、肝臓および腎臓の両方に＜２．２μｇ乾燥質量が存在した。

図８．２３は、ＷＺ４２およびＴｉ６Ａｌ４Ｖの大腿骨ピンおよびカフを埋め込んだラットの消化された肝臓および腎臓サンプル中の８週および１４週のＭｇ（ａ）、Ｃａ（ｂ）、およびＺｎ（ｃ）の平均濃度を、未手術対照ラットと比較して示す。ＷＺ４２ピンを埋め込んだラットの腎臓の８週のＭｇ濃度と未手術対照ラットとの間の有意差＊（ｐ＜０．０５）、ならびにＷＺ４２ピンおよびカフを埋め込んだラットの腎臓の８週のＺｎ濃度との有意差†（ｐ＜０．０５）。抽出物濃度毎、群毎、時点毎に、ｎ≦３。

［肝臓および腎臓の組織学的検査］
８週および１４週で屠殺されたＳｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラットから外植された肝臓および腎臓は、病理切片に加工し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。光学顕微鏡画像（腎臓は図８．２４、肝臓は図８．２５）は、肝臓および腎臓の細胞組織が炎症細胞による形態学的変化または浸潤を受けなかったことを明らかにした。明らかな異常の徴候は、器官切片のいずれにおいても観察されなかった。

図８．２４は、大腿骨をＷＺ４２（ａ、ｃ）およびＴｉ６Ａｌ４Ｖ（ｂ、ｄ）のピンで固定したラットの８週後（ａ、ｂ）および１６週後（ｃ、ｄ）のＨ＆Ｅ染色腎臓の顕微鏡写真を示す。骨の周りに巻き付けるＷＺ４２（ｅ）およびＴｉ６Ａｌ４Ｖ（ｆ）のワイヤカフを埋め込んだラットの１４週間の腎臓の染色画像。手術を受けなかったラットの顕微鏡写真（ｇ）。スケールバー＝５０μｍ。

図８．２５は、大腿骨をＷＺ４２（ａ、ｃ）およびＴｉ６Ａｌ４Ｖ（ｂ、ｄ）のピンで固定したラットの８週（ａ、ｂ）後および１６週（ｃ、ｄ）後のＨ＆Ｅ染色肝臓の顕微鏡写真を示す。骨の周りに巻き付けるＷＺ４２（ｅ）およびＴｉ６Ａｌ４Ｖ（ｆ）のワイヤカフを埋め込んだラットの１４週間の肝臓の染色画像。手術を受けなかったラットの顕微鏡写真（ｇ）。スケールバー＝５０μｍ。

［Ｍｇ‐Ｙ‐Ｚｎ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金ピンのインビボ腐食および周囲の骨の形態］
大腿骨‐インプラント複合体から得たマイクロＣＴスライスの例を図８．２６に示す。

図８．２６は、分解するＷＺ４２合金の体積を決定する。ピンは、埋込みからａ）２週、ｂ）８週、ｃ）１４週後に、緑色で強調表示された代表的実施例で密度の閾値化に基づいて、マイクロＣＴスキャンで周囲の骨から区別された。カフは１４週後（ｄ）に完全に分解したが、ワイヤが占めていた領域に新生骨形成が見られた（矢印）。

２週後に、ピンは図８．２６ａに示すように破損した。これらのピンの破損は大腿骨の骨折部位で発生し、機能不全をもたらす。加えて、腐食部位は機械加工中にピンがコレットに固締された接合部で発生した。腐食／破損が発生したこれら二つの領域は両方とも、応力が高い領域に対応していた。ピン全体の漸進的な分解は８週および１４週で観察された（図８．２６ｂおよびｃ）。皮質骨によって囲まれたピンの領域は、より低速度分解するように見えた。骨幹の中央部にＷＺ４２ワイヤカフが巻き付けられた無傷の大腿骨のマイクロＣＴスキャン（図８．２６ｄ）は、カフが１４週後に完全に分解し、埋め込まれたＭｇ合金の有利な反応を示しているにも拘わらず、分解するカフの周囲の領域に新生骨形成のように見えるものを明らかにした。

周囲の分解生成物および骨から残留しているＷＺ４２ピンをセグメント化した後、ピンの３Ｄ再構築を形成し、そこから体積を再計算した。この残留体積は、図８．２７に示すように、２週、８週、および１４週の終わりに、腐食速度を算出するために使用した。

図８．２７は、ラット大腿骨に埋め込まれたＷＺ４２ピンの２週間、８週間、および１４週間の腐食速度および残留体積％を示す。群毎、時点毎に、ｎ≧２。＊および†は他の時点に行われた測定と比較した有意差（ｐ＜０．０５）を表す。

分解は最初、２週間でより速く発生することが明らかになり、その後は、８週および１４週で認識されたより低い腐食速度によって示されるように、腐食は低減し、安定化するように見えた。これは、ＷＺ４２合金のパッシベーションおよび仮骨形成に関係しており、骨治癒の早期段階後に分解する合金への流体曝露を制限する可能性がある。

［Ｍｇ‐Ｙ‐Ｚｎ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金ピンへの局所組織反応］
２週、８週、および１４週後に大腿骨外植物を回収し、ＷＺ４２ピンおよびカフへの局所組織反応を評価し、骨折の治癒を観察した。ピンを含む大腿骨からの骨の切片はゴールドナーのトリクロームを使用して染色した。それを図８．２８に示す。

２週後に、ＷＺ４２合金を埋め込んだラットで、骨折部位の骨上の線維組織に空のポケットが観察された。これはＴｉ６Ａｌ４Ｖピンでは観察されないので、分解するマグネシウム合金からガスポケット（ＧＰ）を形成する水素ガスの蓄積が原因の可能性が高い。インプラントと骨の境界面を画定する破線によって示される骨折部位を包囲する線維組織（Ｆｔ）と共に、骨を包囲するオステオイド（Ｏｄ）の存在が観察された。８週後、骨折部位のガスポケットは、潜在的に腐食速度の低下、ガスの消散、および線維組織の内方成長のため、顕著とは認識されなかった。骨膜領域でオステオイドの存在のみならず新生骨形成（Ｎｂ）についても、８週および１４週後に漸進的な増大が観察された。１４週後、ＷＺ４２またはＴｉ６Ａｌ４Ｖピンのいずれかで固定された場合、骨折はまだ完治していなかった。

図８．２８は、ＷＺ４２マグネシウム合金（ａ、ｃ、ｅ）およびＴｉ６Ａｌ４Ｖ（ｂ、ｄ、ｆ）のピンで固定された欠損部位の、埋込みの２週後（ａ、ｂ）、８週後（ｃ、ｄ）、および１４週後（ｅ、ｆ）の軟硬組織のゴールドナーのトリクローム染色切片の顕微鏡写真（４０×）を示す。ｇ）欠損部位で縦断面に沿って撮像された関心領域を表す。細胞質、フィブリン、筋肉、およびオステオイドは赤色で表す。コラーゲンおよび骨は緑色で表す。破線はインプラントピンと骨の境界面を略示する。スケールバー＝２００μｍ。略語：ＧＰはガスポケット；Ｏｄはオステオイド；ＦＴは線維組織；Ｎｂは生成骨。

欠損部の周りの領域における骨芽細胞活性および新生骨形成のプロセスを示すために、アルカリホスファターゼ染色を行った。骨芽細胞活性は、Ｔｉ６Ａｌ４Ｖを含む大腿骨（図８．２９ｂ、ｄ、ｆ）と比較して、ＷＺ４２を含む大腿骨の骨折の周囲（図８．２９ａ、ｃ、ｅ）の方がより多かった。ＷＺ４２群の場合、骨芽細胞の存在は８週目がピークのようであった。

図８．２９は、ＷＺ４２マグネシウム合金（ａ、ｃ、ｅ）およびＴｉ６Ａｌ４Ｖ（ｂ、ｄ、ｆ）のピンで固定された欠損部位の組織の埋込みから２週後（ａ、ｂ）、８週後（ｃ、ｄ）、および１４週後（ｅ、ｆ）のＡＬＰの局在性の４０×および１００×（差込み図）の顕微鏡写真を示す。スケールバー＝２００μｍ（４０×画像）、１００μｍ（１００×画像）。ピンは全ての図で画像の左側に位置する。

ワイヤカフ埋込み部位付近の組織のゴールドナーのトリクローム染色切片において（図８．３０）、明るい青緑色で示された新生骨のみならず、線維組織もまたＭｇ合金カフインプラントの周囲に見られた（図８．３０ａ）。他方、不活性なＴｉ６Ａｌ４Ｖカフ付近には新生骨形成は見られなかった（図８．３０ｂ）。

図８．３０は、ＷＺ４２マグネシウム合金（ａ）およびＴｉ６Ａｌ４Ｖ（ｂ）のワイヤカフが埋込みから１４週間骨の周りに巻き付けられた場合のインプラントと骨の境界面の軟硬組織のゴールドナーのトリクローム染色切片（４０×）の顕微鏡写真を示す。ｃ）欠損部位で縦断面に沿って撮像された関心領域を表す。細胞質、フィブリン、筋肉、およびオステオイドは赤色で表す。コラーゲンおよび骨は緑色で表す。破線はＷＺ４２ワイヤの位置を略示する。スケールバー＝２００μｍ。略語：ＦＴは線維組織；Ｎｂは生成骨；Ｍは筋肉；ＴｉはＴｉ６Ａｌ４Ｖワイヤ。

［考察］
この明確な目的のために、生体適合性および全身毒性、分解挙動、ならびに局所組織反応および治癒の観点から、ＷＺ４２マグネシウム合金の効果を調査した。この動物モデル、すなわち髄内ピンによって安定化した閉鎖大腿骨骨折は、骨および軟骨マトリクス成分ならびに成長因子の遺伝子の発現、サイトカインの生成、細胞増殖、ならびにアポトーシスを研究している様々なグループによって、永久金属による骨治癒および石灰化について金属を比較するために、特徴付けられてきた。これらの場合にラットの完全骨切りを固定するためにステンレス鋼およびＮｉ‐Ｔｉ合金が使用されるにも拘わらず、腐食に有利に働く大きい動的応力の顕現を表すそのような攻撃的モデルは、マグネシウム合金では試験されたことが無かった。実際、完全耐荷重のモデルは今日まで、マグネシウムから製造された骨折固定装置に適用されたことが無かった。この攻撃的モデルでＭｇの安全性を確認し、Ｍｇピンにかかる高い応力の結果としての分解挙動を分析することも意図した。

ＷＺ４２インプラントの安全性を評価するために、血液および血清の生化学分析も行った。１４週のＷＺ４２およびＴｉ６Ａｌ４Ｖピン群、および同じく１４週のＷＺ４２ワイヤカフ群の予想より低い血小板レベルは、分析した多くのサンプルで報告されたサンプル中の血小板の凝集による可能性が高かった。ＷＺ４２およびＴｉ合金両方の手術２週後の白血球のレベル上昇は、外科的処置が実施された後に見られる正常な炎症の一般的な徴候を表す。後の時点で測定された血球数は、白血球数の正常レベルへの回復を示し、即時感染または長期炎症反応の徴候が無かったことを示唆した。血液で測定された一貫した電解質レベル、および消化された腎臓および肝臓で測定された安定したＭｇ濃度は、ＷＺ４２の分解が身体の正常な機能のために必要な電解質の均衡の乱れを引き起こさなかったことを意味する。他の研究も同様に、骨に埋め込まれたときに、血液生化学ならびに肝機能および腎機能がマグネシウム合金の分解によって影響されなかったことを明らかにし、分解Ｍｇ合金の一般的な安全性を示した。血液検査に観察されるばらつきは、予想通り動物の個体毎に異なり、溶血、血餅、および脂肪血など血液サンプルの品質の差に起因する追加的な誤差もある。

変化しない血清パラメータが肝機能および腎機能がＷＺ４２合金の分解によって影響されないことを示唆すると共に、肝臓および腎臓中のＭｇ、Ｃａ、およびＺｎ（ＷＺ４２合金の含有元素）の濃度は、未手術ラットで測定されたレベルより高く上昇せず（図８．２３）、ＹおよびＺｒは低すぎてベースラインから区別することができなかった。濃度は、同じ時点で比較すると、Ｔｉ６Ａｌ４Ｖサンプルを埋め込んだラットとも一致した。動物間の予想される固体差、組織の潜在的に不完全な酸中溶解、およびＩＣＰ‐ＯＥＳ測定値のばらつきは、群内のイオン濃度のばらつきをもたらした可能性がある。

全身生体適合性をさらに実証すると、肝臓および腎臓のＨ＆Ｅ染色法は臓器障害の徴候を一切示さなかった。腎臓組織内では、集中的な石灰化の黒い堆積物、急性炎症細胞、または壊死は全く観察されなかった。肝臓内では、炎症細胞の集合体や、凝固壊死の不規則でムラのある範囲のような肝細胞壊死の特徴は観察されなかった。これらの結果は、ＷＺ４２合金の分解成分が優れた全身生体適合性を有することを明白に示唆している。Ｈａｒｔｗｉｇは、高濃度のＭｇイオンを摂取しても、腎臓の排出系の高い能力と、骨からの貯蔵緩衝機能とによって身体が血清マグネシウムの均衝を保てるため、反作用を生じることはないと述べている。

図８．２６（ａ〜ｃ）に示すインプラント断面積の減少に見られるように、また、図８．２７に示す算出された腐食速度および体積損失からわかるように、髄内のＷＺ４２ピンでは緩徐な分解が観察された。分解は優先的に、埋め込んだピンに作用する応力が最も大きいことが認められた骨折部位にて破砕に対し垂直に生じるようである。この機械的荷重と周囲にある体液がもたらす腐食環境との共同作用により、周知の応力腐食割れ（ＳＣＣ）機構を介してインプラントの突然の破砕を引き起こすことが示されている。この脆化現象は、材料の降伏強度を超えない応力を付与しただけでも起こり得るので、破断のための時間が短縮され、早期の易破砕性を招く。マグネシウム、孔食の害、ＳＣＣが発達し得る原因は、塩化物溶液中および疑似体液中でのＳＣＣに対する脆さを示した。例えば図８．２６ａのピンの端部付近のような、その他の局所的な腐食領域は、加工中にできた既存の欠陥により生じ、これがＳＣＣに対する脆さを増大させる。破砕部位での分解も、流体剪断応力を生成し、局所的にＯＨ⁻イオンを除去して、パッシベーション層からの保護を低減するように働く周囲の流体電解質への露出が多くなることにより、やはり促進された。最初の２週間の時点後における腐食速度の低減は、Ｍｇの骨内への埋め込みのその他の研究で観察されたように、ＭＧインプラントの表面が予想どおりに不動態化し、線維組織および新形成骨内に封入されたときに生じた。測定は時点毎に異なるサンプルから取られたため、残部のパーセンテージ体積は２週間と８週間の間で著しく変化しなかった。８週間目の測定を算出するために用いたインプラントでは、腐食速度は遅かったので、時間の経過と共に、残部体積が、２週間目に測定されたはるかに早い速度で分解したサンプルと著しく変わらない結果となった。別の意味において、８週間目のサンプルの腐食速度は２週間目の腐食速度のほぼ１／４であったが、残部体積は４倍の述べ時間にわたって調合されたため、残部体積はあまり変化しなかった。２週間目と８週間目のサンプルにおける分解の違いにより生じるサンプル間のばらつきは、ピンが破損した場合や、ピンが皮質骨によって完全に包囲されていないことでより多くの周囲流体に露出してしまった結果、腐食が加速した場合の可変性により起こり得る。

Ｍｇ合金の分解が周囲の組織に与える影響を、Ｇｏｌｄｎｅｒ’ｓ ＴｒｉｃｈｒｏｍｅおよびＡＬＰ染色法を用いて、ＷＺ４２およびＴｉ６Ａｌ４Ｖ髄内ピンならびに皮質外カフの埋め込みの２週間後、８週間後、および１４週間後に調査した。ラットにＷＺ４２合金を埋め込んだ２週間後（図８．２２ａ、図８．２８ａ）、骨折部位にかけてガスポケット（ＧＰ）を観察し、このガスポケットは周囲の線維組織内に空洞を形成していた。これは、Ｔｉ６Ａｌ４Ｖピンでは観察されていないため、分解中のマグネシウム合金からの水素ガスが蓄積したものと考えられる。骨折部位が線維組織（Ｆｔ）または皮膚硬結で包囲された状態の類骨（Ｏｄ）の存在を骨付近に観察したが、これは正常な骨治癒過程の一部である。８週間後（図８．７ｃ）に、骨折部位上のガスポケットは、潜在的に、腐食速度の遅速化、ガスの散逸、および線維組織の内植により、それほど顕著ではなかった。８週間後と１４週間後には、髄膜領域内に類骨ならびに新生骨形成（Ｎｂ）がより多く存在していることを徐々に観察した。ＷＺ４２またはＴｉ６Ａｌ４Ｖピンのどちらかで固定した場合には、１４週間後で（図８．２８ｅ）骨折はまだ完全には治癒していなかった。８週間目および１４週間目には、ＷＺ４２群内に上昇した新生骨形成が見られ、これをＡＬＰ染色法でさらに確認した。ＡＬＰ染色法が示す骨芽細胞活性は、欠損部を包囲する領域内の、骨折の治癒部分の先端にて新生骨形成が促進されていることを実証した。ＷＺ４２群の場合、骨芽細胞の存在は８週間目でピークに達したが、これはＴｉ６Ａｌ４Ｖ群と比べてより急速な活性である。皮質骨上に配置したワイヤカフのケース（図８．３０ａ）では、不活性なＴｉ６Ａｌ４Ｖと比較し、Ｍｇ合金カフインプラントを包囲する領域内に青色で示す新生骨形成が見つかった。髄内固定の不安定さのために骨折が完全に治癒していないにも拘わらず、治癒過程は妨げられていないようであった。実際、石灰化した新生骨に見られるような新生骨形成の普及、および両タイプのＭｇ合金インプラント付近の領域における骨芽細胞活性は、Ｍｇの細胞活性に関連した、またマグネシウムベースのインプラントの表面に形成されるリン酸皮膜の骨伝導性による、Ｍｇベースのインプラントの周囲での新生骨形成の増進を報告する多数の研究結果を確証するものである。加えて、優れた生体適合性を示している他のＭｇ足場の報告に見られるような埋め込み部位での炎症細胞の異常な存在を伴わない、手術部位を封入する線維嚢の正常な治癒反応を一貫して観察した結果、Ｍｇ合金の局所的なバイオセイフティが示された。

総体的に、確実な生体互換性と、新生骨形成による治癒の徴候とは、ＷＺ４２合金が整形外科適用への適切な候補であることを示す。しかし、インプラント上に配置する機械応力を制御する注意を払う必要があり、また、急速な腐食の発現と、応力腐食割れによりもたらされる潜在的な破損の発現とを減少させるように機械加工することで、合金の安定した表面仕上がりを達成できる。本明細書で試験したモデルは、動的応力が著しくに高い開始因子を埋め込み部位上に表しており、これで大腿骨に荷重をかけ、荷重をＭｇ髄内ピンに完全に伝播させて、非常に大胆な荷重と腐食状態へ意図的に導いた結果、最終的にピンが破損する。それでも、この積極的な荷重モデルは、過激なイベントとして認識されかねないこうした積極的な状態を有するにも拘わらず、合金の局所的および全体の安全性はこのような高い応力の下でも依然として維持されるので、合金は腐食を加速させる。この分解成分の解放にも拘わらず、水素ガス形成は外側からは気付かない程であったので、周囲組織の反応、腎臓、肝臓および血液のパラメータは全て正常を保った。そのため、整形外科的損傷の治療に必要であるように一時的に荷重を解除すると、ＷＺ４２合金が破損する危険が減少する傾向にあるが、それでも、合金を有望な整形外科インプラント材料にし、他の医療装置用途における可能性を探求することを可能にする。要するに、記述した結果により実証されたとおりの、本モデルの高い応力および加速する腐食状態を提供する攻撃的な性質をまず考慮すると、骨治癒が観察された事実、ならびにより重要なことに、全ての結晶および血液の病理的プロフィールが、生命を維持する臓器（肝臓および腎臓）の組織学的分析と組み合わせて正常であるという事実は、整形外科的な固定用途にとって、特定の合金つまりＷＺ４２が有望であることを示している。優れた強度と望ましいインビトロでの結果は、さらに本明細書で述べたインビボでの結果を補完し、本システムが他の医療装置用途においてその有効性を探求できる有望性を示す。半荷重または無荷重環境を整形外科のＭｇインプラント上に配置し、これらの設定にてその安全性と効率を実証した後に、インプラントを動的な機械応力に晒すより要求の高い用途を対象にするというのが発明者の意見である。通常、整形外科的損傷は処置の早期に固定されるので、本明細書のモデルに見られるようにＭｇ装置の故障の危険が低減するはずである。すでに、この抵抗が低減する過程は、必要最小限の要求で済む骨固定に使用されるＳｙｎｔｅｌｌｉｘ ａｎｄ Ｋ−Ｍｅｔのネジで観察されている。さらに合金を向上させるべく、類似の、機械応力の必要性が低い用途を対象とするために、応力腐食の影響を最小にするように外部固定具または不動化装置を用いて、その対象の応答を研究する。

＜総体的結論＞
特性を向上させるために、様々な合金設計パラメータを改良した。この改良は、０〜４．０重量％の多様な量のイットリウムを追加すること、Ｚｎを追加すること、溶体化処理を適用すること、および多様な押出比での熱間押出を用いて合金を熱間加工することを含む。本明細書で提示するこの研究は医療装置用の新規の合金材料の開発を表し、これには、動物研究で試験した整形外科用インプラント向けの材料を審査することを最終的な目的として、合金材料成分を選択しし、様々な試験のために、分解可能金属に採用されたＦＤＡ、ＩＳＯ、およびＡＳＴＭ規格に基づいて所望の性質を分析することが包含される。本明細書で記述および説明したこの一貫した工程は、他の分解可能金属に適用されて、吸収性の整形外科用装置を試験する材料の基礎として役立つことができる。

分解速度を制御し、機械特性を向上させ、インビトロおよびインビボ研究にて低い毒性を維持する目的で、様々なＭｇ基の合金の処理を実施した。アズキャストと、１重量％および４重量％のＹを含有する溶液熱処理したＭｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｒ合金を調査した最初の研究では、ＷＸ４１中の高いＹの含有量が粒度の増加に寄与する一方で、Ｔ４溶液処理も粗粒化をもたらすことがわかった。鋳造合金と熱処理合金に押出を適用したところ、熱間加工工程と動的再結晶化工程を介して粒度が劇的に減少した。Ｘ線解析は、アズキャストＷＺ４２中に観察されたＬＰＳＯ相を除く単相マグネシウムが全ての合金中に存在し、Ｙ、Ｃａ、Ｚｒ、Ｚｎの合金元素を含有する二次相析出物が、全ての合金中の、粒界と粒子中との両方に存在することを示した。これらの析出物は、熱処理されて押出中に破壊された後にはさらに分散した。ＹおよびＺｎを含有するＷＺ４２合金は二次相Ｍｇ_１２ＹＺｎ金属間化合物も含有し、これによって特性が向上した。

合金を合成および処理した後に、Ｍｇ基合金の腐食特性と機械特性を調査した。押出または熱処理を通して粒度が変化することで、二次相が溶解または破裂してマイクロガルバニック腐食部位が分散した、より均一な腐食が得られた。以前に群内で実施されたＭｇ合金におけるＹの安定性についての第１原理の研究で報告されているように、Ｍｇ基合金中のＹ含有量を増加させることでより静的な層が形成された。アズキャストフォーム中のＹの含有量を増やすことで合金の強度も向上したが、押出合金では、押出により高い温度が必要なため、Ｙを追加しても強度は著しく増加せず、動的再結晶化と粒成長をもたらし、さらに、押出の粒研磨効果と二次相の析出強度を部分的に無効にした。顕著な押出および粒研磨が付与されたことで、強度と伸長性が劇的に向上したが、その発生の仕方はＨａｌｌ‐Ｐｅｔｃｈ関係を用いて説明したとおりである。全ての合金の中からとりわけ商業用の純ＭｇおよびＡＺ３１材料を試験した。ＷＺ４２（Ｍｇ‐Ｙ‐Ｚｎ‐Ｚｒ‐Ｃａ）合金は著しく高い強度を実証して、文献に報告されたＭｇ合金のトップに位置付けられたが、試験を受けたものの中でも比較的遅い分解速度を維持した。

先行の章における結果は、骨芽細胞と、そして、合金と直接接触しているときにインビトロで、先に述べた合金の分解生成物および合金元素塩化物塩を含んだ培地がある場合には間接的に培養したヒト間葉系幹細胞とに与える効果を明確にした。特に押出状態での合金の高い実行可能性はＭＴＴおよび生死判別アッセイで確認された。間接的な研究のインスピレーションは、インプラント材料から抽出物を採取して細胞に曝露されるＦＤＡによるＩＳＯ１０９９３：１２の利用の推奨と、分解可能材料の信頼性の高いインビトロ細胞毒性結果を入手するためには、採取した抽出物を少なくとも１０倍に希釈することを要するとの報告とに基づいている。合金抽出と合金元素塩化物塩の両方を試験する場合は、Ｍｇ−Ｙ合金分解生成物とＹ塩が増殖とＡＬＰ活性を向上させ、骨形成分化の促進を示唆した。特にＷＺ４２合金は最大の増殖と骨形成分化を可能にした。

材料開発からインビボ安全性の評価への遷移を計算するには、破砕したラット大腿骨の髄内空洞にＷＺ４２ピンを埋め込み、未変化の大腿骨の中間部分の周囲にワイヤを巻き付け、合金をＴｉ６Ａｌ４Ｖと比較した。２週間目、８週間目、１４週間目にラットを屠殺し、材料性能を、（１）血液検査、肝臓、腎臓の細胞学、分解生成物蓄積によって分析した全身毒性と、（２）残っているＷＺ４２インプラントのマイクロＣＴ再構成によって測定した分解と、（３）局所骨および周囲の軟組織の病理組織学によって評価した局所組織反応とに基づいて評価した。埋め込みが成功し、１週間後にＸ線で破砕安定性の維持を確認した後、発生した分解により、髄内ピンが、腐食に関連する確認された高い応力で故障したことがわかった。２週間以後のマイクロＣＴ分析から、応力腐食割れが高い機械荷重がかかる骨切り術部位にて発生するという仮説を、合金ピンの分解および破砕が確証することが明らかになった。しかし、ＷＺ４２合金は、依然として、血液、肝臓、腎臓内にＭｇまたは合金元素の認識可能な蓄積を生じず、血球数、代謝、または腎臓および肝臓機能に有害作用を及ぼさないことがわかった。最終的に、埋め込み部位における局所範囲の組織学は、正常な骨折治癒と新生骨形成を示した。インプラント周囲には異常な炎症反応は観察されなかった。

総体的に、Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｎ‐Ｚｒ合金、特にＷＺ４２合金の、奨励される機械特性、生体腐食特性、および生物学的特性は、整形外科および頭蓋顔面に適用可能なインプラント生体材料としてのその潜在性を示している。Ｍｇ‐Ｙ‐Ｃａ‐Ｚｎ‐Ｚｒ系の様々な合金は、密接に関係し合いかつ重要で多様な整形外科医療装置での使用に適しており、また、低荷重、半荷重の下で、ならびに、腐食と機械反応の均衝を取って所望の生体的成果を得るように適切に対象とされた耐荷重条件下で使用するのに適している。

Claims (15)

1. 組成物の総重量に基づいて、
   約４．０重量パーセントのイットリウムと、
   約０．５〜０．６重量パーセントのカルシウムと、
   約０．６〜１．０重量パーセントのジルコニウムと、
   約２．０重量パーセントの亜鉛と、
   不純物を含む残部のマグネシウムと、
   から構成される生分解性金属合金。
2. カルシウムは約０．６重量パーセントを占めており、ジルコニウムは約１．０重量パーセントを占めている、請求項１に記載の金属合金。
3. ジルコニウムは約０．６重量パーセントを占めている、請求項１に記載の金属合金。
4. 組成物の総重量に基づいて、
   約４．０〜４．５重量パーセントの亜鉛と、
   約０．３〜０．５重量パーセントのジルコニウムと、
   不純物を含む残部のマグネシウムと、
   から構成される生分解性金属合金。
5. 亜鉛は約４．０重量パーセントを占めており、ジルコニウムは約０．５重量パーセントを占めている、請求項４に記載の金属合金。
6. 亜鉛は約４．４重量パーセントを占めており、ジルコニウムは約０．３〜０．４重量パーセントを占めている、請求項４に記載の金属合金。
7. ストロンチウムおよびセリウムから成る群から選択された元素をさらに含む、請求項４に記載の金属合金。
8. 前記元素は、金属合金の約０．２５〜１．０重量パーセントを占める、請求項７に記載の金属合金。
9. 前記元素は約０．２５重量パーセントを占める、請求項８に記載の金属合金。
10. 前記元素は約１．０重量パーセントを占める、請求項８に記載の金属合金。
11. 不純物は、鉄、ニッケル、および銅の一つ以上を含む、請求項１に記載の金属合金。
12. 不純物は２０ｐｐｍ以下を占める、請求項１に記載の金属合金。
13. 前記合金は固溶体単相である、請求項１に記載の金属合金。
14. 生分解性金属合金を調製する方法であって、
    組成物の総重量に基づいて、約４．０重量パーセントのイットリウムと、約０．５〜０．６重量パーセントのカルシウムと、約０．６〜１．０重量パーセントのジルコニウムと、約２．０重量パーセントの亜鉛と、不純物を含む残部のマグネシウムとを溶融させる工程と、
    溶融混合物を得る工程と、
    生分解性金属合金を得るために前記溶融混合物を鋳造する工程と、
    を含む方法。
15. 鋳造する工程の後に、合金が約２５０℃〜３５０℃の温度の熱処理を受ける、請求項１４に記載の方法。