JP2020517264A - ヒトｐｄ−１抗原とそのリガンドの結合を拮抗・阻害するモノクローナル抗体およびその製造方法と使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、抗体軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３、配列番号４および配列番号５で示されるアミノ酸配列であり、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号８、配列番号９および配列番号１０で示されるアミノ酸配列であるヒトＰＤ−１抗原とそのリガンドの結合を拮抗・阻害するモノクローナル抗体またはその誘導体を公開する。また、当該抗体のヒト化の製造過程および当該ヒト化抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列を公開する。

Description

本発明は、生物技術のモノクローナル抗体の分野に属する。本発明は、プログラム細胞死受容体ＰＤ−１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ−１）とそのリガンドの結合を拮抗・阻害するモノクローナル抗体およびそのコード配列ならびにその製造方法と使用に関する。

長い間、生物医学界では、腫瘍の発生・発達は生体内の免疫機能と密接に関連するとされてきた。体内の免疫系は通常の状態において変異した腫瘍細胞の増殖を監視（Ｉｍｍｕｎｅ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）し、腫瘍の転移・再発を抑制する機能を発揮する。免疫系に機能の抑制または低下が現れると、腫瘍の増殖または転移・再発が加速され、深刻な場合、命の危険もある。そのため、生体自体の免疫機能を調節することによって直接腫瘍を攻撃または滅殺することを目的とする「腫瘍免疫療法（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）」は腫瘍の臨床治療分野で求められる大きな目標の一つである。２０１１年以来、免疫療法は腫瘍の臨床治療分野で一連の革命的な変化を伴う（ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｉｚｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）重要なブレークスルーをもたらした（Ｔｏｐａｌｉａｎ ＳＬら：Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｃｏｍｅｓ ｏｆ ａｇｅ． ＪＣＯ ２０１１；２９：４８２８−４８３６；Ｐａｒｄｏｌｌ ＤおよびＤｒａｋｅ Ｃ：Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｅａｒｎｓ ｉｔｓ ｓｐｏｔ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｋｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０１２；２０９：２０１−２０９；Ｐａｇｅ ＤＢ，Ｐｏｓｔｏｗ ＭＡ，Ｃａｌｌａｈａｎ ＭＫ，Ａｌｌｉｓｏｎ ＪＰ ａｎｄ Ｗｏｌｃｈｏｋ ＪＤ：Ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ ２０１４；６５：１８５−２０２を参照のこと）。このような革命的なブレークスルーは、主に、免疫学の基礎研究の分野における進展およびハイブリドーマ／遺伝子組み換え抗体などをはじめとする現代生物技術の出現と発展によるものである。

免疫学の基礎研究により、胸腺から発生するＴ細胞を介した細胞免疫が腫瘍細胞に対する認識・監視および／または直接攻撃・消滅の過程において非常に重要な役割を果たすことが示された。Ｔ細胞は、機能によって、免疫機能の調節を主とするヘルパーＴ細胞（Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ）と抗原の認識および標的細胞の攻撃・殺傷に直接関与する細胞傷害性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ、ＣＴＬ）の２種類に大別されている。

ヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性化、増殖およびその標的抗原の除去と標的細胞の攻撃・殺傷などの免疫機能の段階において、一般的に、いずれも２つのシグナル経路の協同作用が必要である。協同シグナル経路１は、Ｔ細胞における特異的に異なる抗原を認識する受容体タンパク質（Ｔ細胞受容体、Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴｃＲ）と腫瘍の標的細胞または抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ、ＡＰＣ）に発現する、対応する特異的抗原ポリペプチド（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｅｐｔｉｄｅ）−ＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）の結合を介して伝達する抗原特異的なものである。協同シグナル経路２は、Ｔ細胞における共刺激分子（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）または共抑制分子（ｃｏ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）とそれに対応する標的細胞または抗原提示細胞（Ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ、ＡＰＣ）に発現するリガンドの結合を介して伝達する、抗原非特異的なものである。Ｔ細胞は、一般的に、協同シグナル経路１と協同シグナル経路２が同時に存在する場合にのみ、増殖の活性化と標的抗原の除去および標的細胞の殺滅の作用を果たす。

免疫機能をアップレギュレートする共刺激分子は、主に、ＣＤ２８とそのリガンドであるＢ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＣＤ４０とそのリガンドであるＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７（４−１ＢＢとも呼ばれる）とそのリガンドであるＣＤ１３７−Ｌ、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ、Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔ−ｃｅｌｌ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ、誘導性Ｔ細胞共刺激分子）とそのリガンドであるＩＣＯＳ−Ｌなどを含む。

免疫機能をダウンレギュレートする共抑制分子（免疫抑制チェックポイント分子（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）とも呼ばれる）は、主に、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ−４）とそのリガンドであるＢ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、プログラム細胞死受容体ＰＤ−１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ−１）とそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子３、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ−３）とそのリガンド、ＴＩＭ−３（Ｔ細胞免疫グロブリン領域およびムチンドメイン３、Ｔ−ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ Ｍｕｃｉｎ ｄｏｍａｉｎ ３）とそのリガンド、ＢＴＬＡ（ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター、Ｂ ａｎｄ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）とそのリガンドなどを含む。これらの共刺激／共抑制分子は、分子構造において類似し、いずれも免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである（Ｃｈｅｎ ＬＰ：Ｃｏ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｂ７−ＣＤ２８ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４，３３６−３４７を参照のこと）。

理論的には、少なくとも２つの異なる経路によって体内における免疫機能をアップレギュレートまたは向上させる目的を実現することができる。

経路１は、ＣＤ２８などの共刺激分子を活性化することによって直接免疫機能をアップレギュレートする効果を実現する。

経路２は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３またはＢＴＬＡなどの因子が介在する免疫抑制を低下または遮断させることによって、間接的に免疫機能をアップレギュレートする効果を実現する。

ＣＤ２８などの共刺激分子を活性化すると、直接免疫機能をアップレギュレートする効果を実現することができるが、２００６年に英国で行われた番号ＴＧＮ１４１２の抗ＣＤ２８モノクローナル抗体薬物の臨床Ｉ期の研究において、６名の健康な被験者は当該抗体薬物を注射された当日に非常に深刻な副作用が生じた（Ｓｕｎｔｈａｒａｌｉｎｇａｍ Ｇら，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００６；３５５：１０１８−１０２８）ため、現在、医学界では、一般的に、作動型抗ＣＤ２８抗体系薬物は臨床の応用において安全上高いリスクがあり、将来の開発と上市の見通しについて多くの懸念と不確実性がある。

逆に、現在、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１などの因子が介在する免疫抑制作用を除去または低下させる拮抗型モノクローナル抗体薬物は、世界中で行われた多くの臨床研究のいずれにおいても非常に顕著な抗腫瘍治療効果および許容できる安全性を示すため、世界的に腫瘍薬物の研究と開発の分野で最も成功したホットスポットになっている。中でも、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１を標的とするモノクローナル抗体薬物の開発は特に注目されている（Ｑｕｅｚａｄａ ＳＡおよびＰｅｇｇｓ ＫＳ：Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ２０１３；１０８：１５６０−１５６５；Ｆｌｅｍｍｉｎｇ Ａ： Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１２，１１：６０１）。

ＰＤ−１遺伝子は、日本の科学者Ｔａｓｕｋｕ Ｈｏｎｊｏおよびその同僚によって１９９２年に初めて発見されクローニングされたものであり、その細胞外領域に１つのＩｇＶ様ドメインがあり、ＣＴＬＡ−４と２３％の相同性を有する（Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．，Ａｇａｔａ，Ｙ．，Ｓｈｉｂａｈａｒａ，Ｋ．およびＨｏｎｊｏ，Ｔ．：ＥＭＢＯ Ｊ．１９９２；１１：３８８７）。

ＰＤ−１は主に活性化したＴ細胞、Ｂ細胞、単核細胞などの免疫細胞に発現する（Ｙａｓｕｔｏｓｈｉ Ａｇａｔａら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９６；８：６７５）。ＰＤ−１の受容体またはリガンドは２つあり、それぞれＰＤ−Ｌ１（Ｆｒｅｅｍａｎ ＧＪら，ＪＥＭ ２０００；１９２：１０２７−１０３４）、またはＢ７−Ｈ１（Ｄｏｎｇ Ｈら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９９；５：１３６５−１３６９）とＰＤ−Ｌ２（Ｌａｔｃｈｍａｎ Ｙら，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；２：２６１−２６８）、またはＢ７−ＤＣ（Ｔｓｅｎｇ ＳＹら，ＪＥＭ ２００１；１９３：８３９−８４５）である。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は主に腫瘍などの標的細胞または抗原提示細胞に発現する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＲＨら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００６；６６：３８８１−３８８５）。

ＰＤ−１が体内における免疫機能の負のダウンレギュレーションに関与するという現象はＴａｓｕｋｕ Ｈｏｎｊｏおよびその同僚によってＰＤ−１遺伝子ノックアウトマウスにおいて観察された。彼らは、ＰＤ−１遺伝子がノックアウトされたマウスはＣ５７ＢＬ／６の遺伝子背景では、ループス糸球体腎炎や関節炎が生じたが（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｈら：Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９９；１１：１４１）、Ｂａｌｂ／ｃの遺伝子背景では、高力価の抗心筋組織抗体が発生し、それによって深刻な自己免疫性心筋疾患を引き起こす（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｈ．ら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１；２９１：３１９）ことを見出した。

体内の正常組織の細胞では、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２遺伝子が発現して周囲のリンパ球の不当な攻撃または殺傷・拒絶から保護される（Ｋｅｉｒ Ｍ．Ｅ．ら：Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２００６；２０３：８８３−８９５；Ｋｅｉｒ ＭＥ，Ｂｕｔｔｅ ＭＪ，Ｆｒｅｅｍａｎ ＧＪ，Ｓｈａｒｐｅ ＡＨ ：Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ２００８；２６：６７７−７０４）。

残念なことに、変異した腫瘍細胞もＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２遺伝子の発現を向上させることによってリンパ球上のＰＤ−１受容体との結合を介して、リンパ球の活性を抑制することで、免疫攻撃または免疫殺傷・拒絶反応を回避して増殖し続けることができる（Ｄｏｎｇ Ｈら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００２；８：７９３−８００；Ａｚｕｍａ Ｔら，Ｂｌｏｏｄ ２００８；１１１：３６３５−３６４３）。体内で中和ＰＤ−１抗体またはＰＤ−Ｌ１抗体を投与してリンパ球上のＰＤ−１と腫瘍細胞におけるＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２の結合を遮断すると、リンパ球の変異した腫瘍細胞を免疫的に認識して殺傷する能力が回復し、よって腫瘍の成長を抑制し、そして腫瘍を完全に消滅・拒絶する、良好な効果を実現する（Ｉｗａｉ Ｙら，ＰＮＡＳ ２００２；９９：１２２９；Ｈｉｒａｎｏ Ｆら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；６５：１０８９−１０９６）。

これらの予備的な基礎研究と励みとなる臨床前の動物実験の結果に基づき、多くの国際的な製薬企業、例えば、米国Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ（ＢＭＳ）／Ｍｅｄａｒｅｘ（メダレクス）社、米国Ｍｅｒｃｋ社、米国Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社は２００３年前後にすでにＰＤ−１とそのリガンド（ＰＤ−Ｌ１）の結合を遮断するための抗体新薬の研究に着手し、そして関連特許を出願し始めた。

例えば、米国Ｍｅｄａｒｅｘ（メダレクス）社および日本の小野薬品工業株式会社は特許された特許番号がＮｏ８，００８，４４９の米国発明特許の書類で、ＣＨＯ細胞の形質転換およびそれによって発現する全長または細胞外領域を含むヒトＰＤ−１タンパク質を混合抗原とし、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）が導入された遺伝子工学マウス（ＨｕＭＡｂ Ｍｏｕｓｅ）を交差免疫し、スクリーニングして得られた複数の抗ヒトＰＤ−１抗体のハイブリドーマおよびそれによって分泌される抗体タンパク質、抗体タンパク質をコードするヌクレオチド配列、ならびにＰＤ−１タンパク質の検出および腫瘍などの疾患の治療における当該抗体の使用を公開した。

米国Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ社（以下、Ｍｅｒｃｋ社と略す）も、特許された特許番号がＮｏ８，１６８，７５７の米国発明特許の書類で、ＰＤ−１遺伝子を含むＤＮＡ分子でマウスを免疫し、スクリーニングして得られた複数の抗ヒトＰＤ−１抗体のハイブリドーマおよびその抗体タンパク質、そのコードヌクレオチド配列、ならびに生体内における免疫機能を強化することによって、腫瘍および感染性疾患を治療するための当該抗体の使用を公開した。

米国Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社は、特許された特許番号がＮｏ８，２１７，１４９の米国発明特許の書類で、ファージ抗体ディスプレイ遺伝子ライブラリー（ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙ）からスクリーニングして増幅して得られた複数の抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体の抗体タンパク質断片、そのコードヌクレオチド配列およびその使用を公開した。

中国でも、これらの国際的な製薬企業は相次いで国家知識産権局にＰＤ−１抗体に関する発明特許の出願を提出した。その中で、例えば、米国Ｍｅｄａｒｅｘ（メダレクス）社は国際ＰＣＴ出願（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２６０４６）を介して中国に移行した名称が「抗プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）」のヒトモノクローナル抗体」の出願書類番号：２００６８００２８２３８．９の特許出願書類で、免疫マウスからスクリーニングして得られた高親和力で特異的にヒトＰＤ−Ｌ１と結合するモノクローナル抗体、そのコードＤＮＡ配列ならびに癌および伝染病を含む様々な疾患を治療する方法における当該抗体の使用を開示した。

米国Ｗｅｙｔｈｅ（ワイス）社およびＭｅｄｉｍｍｕｎｅ（メディミューン）社は、名称が「抗ＰＤ−１抗体およびその使用」の出願書類番号が２０１０１０１７００２２．４の発明特許出願書類で、ファージｓｃＦｖ遺伝子ディスプレイライブラリーからスクリーニングして得られた抗ヒトＰＤ−１抗体の断片、そのコードＤＮＡ配列および薬物成分として自己免疫疾患、アレルギー反応、癌などを含む免疫系に関連する疾患を治療するための当該抗体の使用を開示した。

海外の製薬企業のほか、２０１３年から、国内でもすでにいくつかの研究開発機構および企業が相次いで国家知識産権局にＰＤ−１抗体に関するＰＣＴまたは中国発明特許の出願を提出した。国内機構で最も早く提出されたＰＤ−１モノクローナル抗体に関する特許出願は、鄭州大学によって２０１３年５月２７日に提出された書類名称が「全ヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体およびその製造方法と使用」（特許出願番号：ＣＮ２０１３１０１９９９４７．５、出願公開書類番号：ＣＮ１０３２４２４４８Ｂ）である。当該特許出願書類では、ＰＤ−１に高い親和力と低い免疫原性を有する全ヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体およびその重鎖と軽鎖のアミノ酸配列が公開された。また、当該書類では、当該全ヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は特異的にＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ抑制シグナルを遮断し、そして生体における不活性化したエフェクター細胞の生物学的機能の回復を増強・促進し、リンパ球の腫瘍抗原、外から侵入したウイルスなどに対する殺傷力を強化し、生体の免疫力を向上させ、速やかに腫瘍細胞とウイルスを除去するためのその使用が記載された。当該特許の法律状態は、最初に２０１５年１月１４日に特許されたが、２０１６年７月２０日に年金の未納により特許権が消滅した。

国内で先に出願した他の研究開発機構と企業のいくつかのＰＤ−１モノクローナル抗体に関する発明特許出願は順に以下の通りである。

２０１３年６月２６日に上海君実生物医薬科技有限公司および蘇州君盟生物医薬科技有限公司によって共同で出願された書類名が「抗ＰＤ−１抗体およびその使用」の発明（特許出願番号：ＣＮ２０１３１０２５８２８９、特許出願公開書類番号：ＣＮ１０４２５０３０２Ａ）では、新規なＰＤ−１抗体またはその機能性断片が提出された。また、当該書類は腫瘍を治療する薬物の製造における前記抗体の使用にも関する。

２０１３年９月１３日に百済神州有限公司によって提出された出願書類名が「抗ＰＤ−１抗体および治療剤と診断剤としてのその使用」の発明（出願番号：ＣＮ２０１３８００７９５８１．６、特許出願公開書類番号：ＣＮ１０５５３１２８８Ａ）では、特異的にプログラム細胞死−１（ＰＤ１、Ｐｄｃｄ−１またはＣＤ２７９）に結合し、免疫細胞におけるＰＤ１が介在する細胞シグナル伝達および活性を抑制し、かつＰＤ１のリガンドに必要な一連のアミノ酸残基と結合する抗体、ならびにＰＤ−１が介在する機能によって調節される癌、伝染性疾患または他の病状を治療または診断するためのこれらの抗体の使用が提供された。

２０１３年１０月２５日に蘇州思坦維生物技術有限責任公司によって書類名が「プログラム細胞死受容体ＰＤ−１とそのリガンドの結合を拮抗・阻害するモノクローナル抗体およびそのコード配列と使用」の発明（出願番号：ＣＮ２０１３１０５１２５１２．１、特許出願公開書類番号：ＣＮ１０４５５８１７７Ａ）が提出された。当該発明では、ＰＤ−１とそのリガンドの結合を拮抗・阻害するマウスモノクローナル抗体およびその重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列が公開された。また、当該発明では、当該抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ分子ヌクレオチド配列が公開された。また、当該発明では、当該抗体のヒト−マウスキメラ抗体およびその誘導体の製造方法、ならびにＰＤ−１タンパク質の検出におけるその使用が公開された。

２０１３年１１月１４日に上海恒瑞医薬有限公司および江蘇恒瑞医薬株式会社股分有限公司によって書類名が「ＰＤ−１抗体、その抗原結合断片および医薬におけるその使用」の発明（特許出願番号：ＣＮ２０１４８００１１００８．６、特許出願公開書類番号：ＣＮ１０５０２６４２８Ａ）が提出された。

上記特許出願およびその後のＰＤ−１抗体の特許出願は、現在、いずれも書類公開または実質審査の段階である。

２０１５年１０月２８日に小野薬品工業株式会社（Ｏｎｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）／米国Ｍｅｄａｒｅｘ（メダレクス）社によって提出された名称が「プログラム細胞死−１（ＰＤ−１）のヒトモノクローナル抗体および抗ＰＤ−１抗体で癌を治療する方法」の特許出願が正式に中国国家知識産権局によって特許された（特許番号：ＣＮ１０３０５９１３８Ｂ）。当該特許によって保護されるのは、ＣＤＲ配列を限定した具体的な抗体構造のプログラム細胞死−１（ＰＤ−１）のヒトモノクローナル抗体および当該ＰＤ−１抗体で癌を治療する方法である。

しかし、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１薬物の世界的な開発分野において、今のところ、以下の３つの抗体薬物のみが連続して米国ＦＤＡによって承認され市販されている。

１）オプジーボ（Ｏｐｄｉｖｏ）（一般名はニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）であり、使用コードはＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６である）は、全ヒト由来ＰＤ−１モノクローナル抗体（ＩｇＧ４−κ型）であり、米国Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ／Ｍｅｄａｒｅｘ社と日本の小野製薬会社によって共同で開発され、２０１４年７月に先に日本で末期メラノーマの治療用として市販を許可され、世界で初めて市販を許可されたＰＤ−１阻害剤薬物になった。その後、オプジーボ（ニボルマブ）は２０１４年１２月１２日に初めて他の薬物に反応しない、手術で摘出不可能または転移性メラノーマの患者の第一選択治療として市販を許可された。

２）抗−ＰＤ１モノクローナル抗体薬物キイトルーダ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）（一般名はペンブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）であり、使用コードはＭＫ３４７５、ｌａｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂである）は、ヒト化ＰＤ−１モノクローナル抗体（ＩｇＧ４−κ型）であり、米国Ｍｅｒｃｋ社によって開発され、２０１４年９月４日に初めて米国ＦＤＡの加速承認審査によって末期メラノーマ患者への、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ、抗ヒトＣＴＬＡ４モノクローナル抗体）による治療後、またはＢＲＡＦ遺伝子の突然変異を有することでＢＲＡＦ阻害剤による治療後の使用を許可された。キイトルーダは米国で市販を許可された最初の抗ＰＤ−１薬物になった。

３）テセントリク（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）（一般名はアテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）であり、使用コードはＭＰＤＬ３２８０Ａである）は、ヒト化ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（ＩｇＧ１−κ型）であり、米国Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ社によって開発され、２０１６年５月１９日に初めて米国ＦＤＡによって末期膀胱癌を治療するための第二選択治療薬として市販を許可された。

欧州連合では、オプジーボ（ニボルマブ）およびキイトルーダ（ペンブロリズマブ）は、それぞれ２０１５年６月および２０１５年７月に相次いで市販を許可された。
中国では、現在、まだ市販が許可されたＰＤ−１モノクローナル抗体薬物またはＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体薬物はない。

米国／欧州連合／日本などの国と地域で市販を許可された上記２つのＰＤ−１モノクローナル抗体薬物および１つのＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体薬物は、それぞれの早期臨床試験（Ｉ期）においてすでに腫瘍成長の抑制、さらに腫瘍の完全な消滅と拒絶および患者の生存期間の顕著な延長という客観的な治療効果が現れ、またその長期間使用の安全性も許容されている（Ｂｒａｈｍｅｒ ＪＲら，ＪＣＯ ２０１０；２８：３１６７−３１７５；Ｔｏｐａｌｉａｎ Ｓら，ＮＥＪＭ ２０１２；３６６：２４４３−２４５４；Ｂｒａｈｍｅｒ ＪＲら，ＮＥＪＭ ２０１２；３６６：２４５５−２４６５；Ｈａｍｉｄ Ｏら，ＮＥＪＭ ２０１３；３６９：１３４−１４４）。中でも、最も早く報告されて最も衝撃的な効果のあった大規模の型臨床試験の結果はＴｏｐａｌｉａｎらによって２０１２年６月に世界的に有名な医学雑誌Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄに発表された（Ｔｏｐａｌｉａｎ Ｓら：Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１２，３６６：２４４３−２４５４）。当該論文では、２９６例の末期悪性腫瘍患者が参加したＩ期臨床研究において、患者は２週間おきに米国ＢＭＳ社のＰＤ−１モノクローナル抗体薬物ニボルマブ（別名ＢＭＳ−９３６５５）を静脈注射された結果、２８％のメラノーマ患者、２７％の腎細胞癌患者および予想外に高い１８％の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者は、その腫瘍に抑制または縮小が現れ、ニボルマブは臨床で腫瘍を治療する効果において長続きする特徴を示し、例えば、１年以上追跡した３１名の患者のうち、２０名（６４．５％）は臨床において依然として有効であることが報告された。

その後、研究により、ニボルマブは臨床で末期悪性腫瘍を治療する効果が化学療法の薬物よりも優れていることがさらに実証された。例えば、Ｒｏｂｅｒｔらによって２０１５年１月に雑誌Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄに発表された論文（Ｒｏｂｅｒｔ Ｃら：Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２０１５；３７２：３２０−３０）では、ＢＭＳ社によって開始・支援されたＣｈｅｃｋＭａｔｅ０６６という臨床研究において、４１８例の未治療の、ＢＲＡＦ遺伝子の突然変異を伴わない転移性メラノーマの末期患者がランダムにグループ分けされ、それぞれニボルマブ（２週間に１回）または化学治療薬であるダカルバジン（Ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）により治療を受けた結果、治療開始から１年後、ダカルバジン治療群と比較して、ニボルマブ治療群の患者の合計生存期間および無増悪生存期間はいずれも顕著に改善されたことが報告された。その中で、ニボルマブ群では、合計生存率は７２．９％に達したが、ダカルバジン群では、合計生存率は４２．１％で（Ｐ＜０．００１）、ニボルマブ群では、増悪行生存期間の中央値は５．１か月で、ダカルバジン群では、２．２か月で（Ｐ＜０．００１）、ニボルマブ群では、客観緩和率は４０．０％で、ダカルバジン群では、１３．９％であった（Ｐ＜０．００１）。

ニボルマブの多くの臨床研究結果と同じように、ペンブロリズマブの臨床研究結果も素晴らしくて期待されている。例えば、Ｈａｍｉｄらによって２０１３年７月に雑誌Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄに発表された論文（Ｈａｍｉｄ Ｏら，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１３，３６９：１３４−１４４）では、国際共同Ｉ期試験において、前に少なくとも２回以上のイピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）による治療後、病状が進行した末期メラノーマの患者がランダムに割り付けされ、疾患が進行するか、耐えられない毒性が生じるか、患者が中止に同意するまで、それぞれ３週間おきに投与量２ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのペンブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）の静脈内投与を受けたことが報告された。研究結果を分析したところ、ペンブロリズマブによる治療後、３８％の患者は腫瘍に抑制または縮小が現れ、追跡時間の中央値が１１ヶ月の５２名の腫瘍患者のうち、４２名（８１％）はまだ有効であり、引き続きペンブロリズマブによる治療を受けている。

Ｒｏｂｅｒｔ Ｃらによって２０１４年９月に国際雑誌Ｌａｎｃｅｔに発表された論文（Ｒｏｂｅｒｔ Ｃら：Ｌａｎｃｅｔ． ２０１４ Ｓｅｐｔ．２０；３８４：１１０９−１７）では、前にイピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）による治療を受けたが効果がなかった末期メラノーマの１７３名の患者がランダムに登録され、疾患が進行するか、耐えられない毒性が生じるか、患者が中止に同意するまで、それぞれ３週間おきに投与量２ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８９）または１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８４）のペンブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）の静脈内投与を受けたことが報告された。その結果、追跡時間の中央値は８ヶ月で、ペンブロリズマブモノクローナル抗体の２つの投与量群の合計生存率（ＯＲＲ）は２６％であり、その中で、２ｍｇ／ｋｇ投与量群では、８１名の患者のうち、２１名が生存し、１０ｍｇ／ｋｇ群では、７６名の患者のうち、２０名が生存したことが示された。

オプジーボ（ニボルマブ）およびキイトルーダ（ペンブロリズマブ）のモノクローナル抗体薬物は、腫瘍治療分野に革命的な変化をもたらした（ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｉｚｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）が、臨床において依然として欠陥と欠点があり、これらの欠陥と欠点は少なくとも以下の態様を含む。

１）オプジーボ（ニボルマブ）およびキイトルーダ（ペンブロリズマブ）のモノクローナル抗体薬物は、現在、臨床において末期メラノーマ、腎臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、膀胱癌などの少数の癌種にのみ使用が許可され、他の一般的な悪性腫瘍の臨床治療における安全性および有効性はまだ研究と確証が必要である。
２）許可された腫瘍に対しても、オプジーボ（ニボルマブ）およびキイトルーダ（ペンブロリズマブ）のモノクローナル抗体薬物は、治療有効率が通常１５〜５０％の間で、患者のＰＦＳの中央値も数ヶ月しかない。これは、多くの腫瘍患者にとって、既存のＰＤ−１モノクローナル抗体薬物を受けても、効果があるか、生存時間が顕著に延びることが保証されるわけではないことを意味する。

３）オプジーボ（ニボルマブ）およびキイトルーダ（ペンブロリズマブ）薬物の長期間使用は患者に、例えば、免疫介在性肺炎（Ｉｍｍｕｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｎｅｕｍｏｎｉｔｉｓ）などの免疫に関連する有害事象（ｉｍｍｕｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔ）を生じさせ、これらの免疫に関連する有害事象はさらに皮膚、胃腸管、肝臓、内分泌などの他の多くの組織・器官に関わる（Ｎａｉｄｏｏ Ｊら：Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ． ２０１５；２６：２３７５−９１）。

これらの欠陥と欠点を克服するために、既存のオプジーボ（ニボルマブ）およびキイトルーダ（ペンブロリズマブ）薬物の具体的な標的部位（ｅｐｉｔｏｐｅ）、作用機序、薬物の有害反応が生じる原因などに対するさらなる基礎と臨床の研究を強化するとともに、臨床における使用には、独特な抗原結合領域／結合部位（ｅｐｉｔｏｐｅ）を有し、かつ体内外の生物活性／抗腫瘍治療効果が既存のオプジーボ（ニボルマブ）およびキイトルーダ（ペンブロリズマブ）よりも優れた、新規な抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体薬物を作り出すことによって、国内外の多くの腫瘍患者の薬に対する切望に応える必要がある。

ＰＤ−１とその受容体（ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２）の結合は、結合領域が幅広く、結合に関与するアミノ酸の部位数が数十箇所以上に達するなどの特徴があり、同時にヒトＰＤ−１タンパク質とマウスＰＤ−１タンパク質はアミノ酸配列における相同性が６０％程度しかないことを考慮すると、理論的には、従来の抗原タンパク質によるマウスの免疫およびハイブリドーマ技術を使用することによって、異なる結合領域または結合部位に対する様々な新規な抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の製造または開発が可能である。これらの新しい、独特な抗原結合領域／結合部位（ｅｐｉｔｏｐｅ）を有するモノクローナル抗体は、現在市販されているＰＤ−１モノクローナル抗体であるオプジーボ（ニボルマブ）またはキイトルーダ（ペンブロリズマブ）よりも強い体内外の生物活性を有するか、より安全でより優れた治療効果が期待されている。これらの新規なモノクローナル抗体は薬物成分として、生体の免疫機能および抗腫瘍の治療効果をさらに増強させる作用を実現するために、現在市販されているＰＤ−１モノクローナル抗体薬物またはＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体薬物と併用しても連続使用してもよい。一方、単独で使用される新規な免疫機能増強剤または抗腫瘍薬物製剤を独自に開発することも期待されている。

本発明が解決しようとする技術的課題の一つ目は、抗原結合領域／結合部位（ｅｐｉｔｏｐｅ）が既存のオプジーボ（ニボルマブ）またはキイトルーダ（ペンブロリズマブ）と異なる、新規な抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体またはその誘導体、例えば、抗体Ｆａｂ断片、一本鎖抗体などを提供することである。当該モノクローナル抗体またはその誘導体はＰＤ−１抗原とそのリガンド（ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２）の結合を拮抗・阻害することができる。

本発明が解決しようとする技術的課題の二つ目は、上記抗体をコードするＤＮＡ分子または遺伝子を提供することである。

本発明が解決しようとする技術的課題の三つ目は、上記抗体を含有する薬物または薬物組成物を提供することである。

本発明が解決しようとする技術的課題の四つ目は、腫瘍の治療における上記抗体を含有する薬物または薬物組成物の使用を提供することである。

本発明が解決しようとする技術的課題の五つ目は、上記抗体を製造する方法を提供することである。

上記技術的課題を解決するために、本発明の技術方案は、以下のものを使用する。

本発明の第一の態様では、抗原結合領域／結合部位（ｅｐｉｔｏｐｅ）が既存のオプジーボ（ニボルマブ）またはキイトルーダ（ペンブロリズマブ）と異なる、新規な抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体またはその誘導体を提供する。前記抗体またはその誘導体は、第一可変領域および第二可変領域を含み、前記第一可変領域は抗体軽鎖可変領域であり、その抗原相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３、配列番号４および配列番号５で示されるアミノ酸配列であり、前記第二の可変領域は抗体重鎖可変領域であり、その抗原相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号８、配列番号９および配列番号１０で示されるアミノ酸配列である。
前記抗体はヒト化モノクローナル抗体を含み、前記誘導体は抗体のＦａｂ断片、一本鎖抗体、二重特異性（ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体などを含む。

本発明の好適な技術方案として、前記第一可変領域は抗体軽鎖可変領域であり、配列番号１１で示されるアミノ酸配列であり、前記第二可変領域は抗体重鎖可変領域であり、配列番号１２で示されるアミノ酸配列である。

本発明の好適な技術方案として、前記抗体軽鎖可変領域およびヒト抗体軽鎖定常領域を含み、かつ前記抗体重鎖可変領域およびヒト抗体重鎖定常領域のヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。

本発明の好適な技術方案として、前記ヒト抗体軽鎖定常領域は、ヒト抗体κ鎖または抗体λ鎖由来のものであり、前記ヒト抗体重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４などのサブタイプ由来のものであり、中でも、ＩｇＧ４サブタイプが好ましい。

本発明の第二の態様では、上記抗体またはその誘導体をコードするＤＮＡ分子または遺伝子ヌクレオチド配列であって、その抗体軽鎖可変領域の遺伝子ヌクレオチド配列は配列番号１３で示され、その抗体重鎖可変領域の遺伝子ヌクレオチド配列は配列番号１４で示されるものを提供する。

本発明の第三の態様では、上記抗体またはその誘導体をコードするＤＮＡ分子／遺伝子ヌクレチオド配列および当該配列と作用可能に連結した発現調節配列を含有する発現ベクターを提供する。

本発明の第四の態様では、上記発現ベクターから形質転換された組み換え宿主細胞を提供する。当該組み換え宿主細胞またはその後代細胞は上記抗体またはその誘導体を発現する。当該抗体はヒト化モノクローナル抗体を含み、誘導体は抗体のＦａｂ断片、一本鎖抗体、二重特異性（ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体などを含む。
本発明の第五の態様では、薬学的有効量の上記抗体またはその誘導体と、薬学的に許容される担体とを含む薬物または薬物組成物を提供する。

本発明の第六の態様では、腫瘍を治療する薬物の製造における上記抗体の薬物または薬物組成物の使用を提供する。前記腫瘍は結腸癌が好ましい。本発明の具体的な実施の実例において、本発明は体内での結腸癌の成長に対する抑制における当該ヒト化抗体の使用を記載する。

本発明の第七の態様では、上記抗体またはその誘導体を製造する方法であって、
ａ） 上記ＤＮＡ配列および当該配列と作用可能に連結した発現調節配列を含有する発現ベクターを提供する工程、
ｂ） 工程ａ）に記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
ｃ） 前記抗体の発現に適切な条件で、工程ｂ）で得られた宿主細胞を培養する工程、ならびに
ｄ） 当該宿主細胞の培養液から前記抗体を単離・精製する工程、
を含む方法を提供する。

本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」とは一つの純粋細胞から得られる免疫グロブリンであって、同様の構造および化学的特徴を有し、単一の抗原決定基に対して特異性を有するものである。モノクローナル抗体は通常のポリクローナル抗体製剤（通常は異なる抗原決定基に対する異なる抗体である）と違い、各モノクローナル抗体は、抗原における単一の抗原決定基に対するものである。それらの特異性以外、モノクローナル抗体の利点は、ハイブリドーマまたは組み換えエンジニアリング細胞の培養によって得られ、他の免疫グロブリンが混在することがない。修飾語の「モノクローナル」は、抗体の特性を表し、均一な抗体コロニーから得られることで、何らかの特殊な方法で抗体を生産する必要があると理解されるべきではない。

本明細書で用いられる用語「ヒト化モノクローナル抗体」とはマウス由来モノクローナル抗体のアミノ酸配列に対して、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）を残す以外、他の配列（可変領域におけるフレームワーク領域の配列を含む）の全部または大半をヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列に変えることで、遺伝子工学の手段によってマウス由来モノクローナル抗体の免疫原性を最大限に低下させたものである。

本明細書で用いられる用語「抗体」と「免疫グロブリン」は同様の構造特徴を有し、約１５００００ダルトンのヘテロテトラマーの糖タンパク質であり、２つの同じ軽鎖（Ｌ）と２つの同じ重鎖（Ｈ）からなるものである。各軽鎖は、重鎖に１つの共有ジスルフィド結合によって結合しているが、重鎖間のジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのアイソタイプによって異なる。各重鎖および軽鎖も、それぞれ一定の間隔の鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は１つの末端に可変領域（Ｖ_Ｈ）を有する。その先は複数の定常領域である。各軽鎖は、一方の末端に可変領域（Ｖ_Ｌ）を有し、他方の末端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の一つ目の定常領域と、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と対向している。特殊なアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変領域の間に界面を形成している。

本明細書で用いられる用語「可変」とは、抗体において可変領域のある部分が配列で異なっており、これによって各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性が構成されることを指す。しかし、可変性は、均一に抗体の可変領域全体に分布しているわけではない。軽鎖と重鎖の可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つの断片に集中している。可変領域において、比較的保存的な部分は、フレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）と呼ばれる。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域に、それぞれ、基本的にβシート構造となっており、連結ループを形成する３つのＣＤＲで連結され、場合によって部分βシート構造となる４つのＦＲ領域が含まれる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域で密接に関わり、かつ他方の鎖のＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ． Ｎｏ． ９１−３２４２，Ｖｏｌ．１，６４７−６６９頁（１９９１）を参照のこと）を形成している。定常領域は、抗体と抗原との結合には直接関与しないが、例えば、抗体の抗体依存性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ｃｏｍｐｌｅｍｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）に関与するように、異なるエフェクター機能を示す。

本発明の抗体は以下の方法によって製造することができる。

まず、本発明の抗体をコードする遺伝子を適切な発現調節配列を含有する発現ベクターに挿入する。

本明細書で用いられる用語「発現調節配列」とは、通常、遺伝子発現の制御に関与する配列を指す。発現調節配列は、目的遺伝子と作用可能に連結したプロモーターおよび終結シグナルを含む。本発明の抗体をコードする遺伝子（ＤＮＡ）配列は、当業者に熟知の通常の手段によって得られ、例えば、本発明で公開されたタンパク質配列から人工合成されるかＰＣＲ法によって増幅することによって得られる。その後、本分野で周知の様々な方法によって合成またはＰＣＲ増幅で得られたＤＮＡ断片を適切な発現ベクターに挿入する。本発明で用いられる発現ベクターは、当業者に既知の市販の発現ベクター、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＣＤＮＡ３．１発現ベクターでもよい。

発現ベクターの形質転換を受ける適切な宿主細胞は、一般的に原核細胞と真核細胞を含む。常用の原核宿主細胞の例として、大腸菌、枯草菌などを含む。常用の真核宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞などを含む。本発明において、好適な宿主細胞は哺乳動物の細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。

発現ベクターで形質転換された宿主細胞を適切な条件で（例えば、無血清培地で細胞培養フラスコまたはバイオリアクターにおいて付着または懸濁培養）培養した後、培養上清液を収集し、さらにプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過除菌などを含む当業者に周知の通常の単離工程または手段によって精製して本発明の抗体を得る。

精製して得られる本発明の抗体は適切な溶媒、例えば、無菌生理食塩水に溶解させてもよく、溶解度は０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌの間でもよいが、理想の最終溶解度は１〜２０ｍｇ／ｍｌの間でもよい。

ＰＤ−１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ−１）とそのリガンドの結合を拮抗・阻害するマウス由来モノクローナル抗体およびそれを分泌するハイブリドーマ細胞系を得るために、本発明では、哺乳動物によって発現される組み換えヒトＰＤ−１細胞外タンパク質を免疫抗原とし、低投与量のマウス皮下免疫を数回繰り返すことによって、抗ＰＤ−１タンパク質のポリクローナル抗体を分泌するマウスを得、さらにその中から高力価の抗体を含有するマウスを選択し、その脾臓細胞を取り、体外でマウス骨髄腫細胞と融合させ、さらに薬物スクリーニングおよびサブクローニングなどの工程を行うことによって、抗ヒトＰＤ−１タンパク質の抗体を安定して分泌する複数のハイブリドーマモノクローナル細胞を構築した。その中で、コードがＡｂ２１のマウスハイブリドーマ細胞株は、ＥＬＩＳＡ、イムノブロット、免疫組織化学などの複数の方法によって検証され、それによって分泌されるモノクローナル抗体はヒトＰＤ−１タンパク質と特異的に結合するだけでなく、ＰＤ−１タンパク質とそのリガンド（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２）の結合を遮断・阻害することができることが実証された。

本発明は遺伝子工学などの手段によって当該マウス由来抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子断片を得、これに基づいて当該抗体に対してヒト化変換およびその発現ベクター（ｐＣＤＮＡ３．１−ｈＡＢ２１）の構築を行った。当該発現ベクターをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に形質移入によって導入し、安定的かつ効率的に当該ヒト化抗体を分泌する組み換えエンジニアリング細胞を得、そして組み換えエンジニアリング細胞の培養液から生物活性を有するヒト化ｈＡｂ２１抗体タンパク質を単離・精製して得た。

競合ＥＬＩＳＡ分析により、当該ヒト化ｈＡｂ２１抗体のＰＤ−１と結合する部位（ｅｐｉｔｏｐｅ）はニボルマブモノクローナル抗体の結合部位と明らかに異なり、ペンブロリズマブ（ＭＫ３４７５モノクローナル抗体）の結合部位とも異なることが示された。ヒト化ｈＡｂ２１抗体を体内に投与すると、腫瘍の成長に顕著な阻害作用を示し、治療効果は、すでに市販されているペンブロリズマブ（ＭＫ３４７５モノクローナル抗体）よりも遥かに優れている。

本発明の実施例１におけるヒトＰＤ−１とマウスＰＤ−１タンパク質のアミノ酸配列のアライメント解析の概略図である。 本発明の実施例１におけるＥＬＩＳＡ法によってマウスハイブリドーマ細胞培養上清液サンプルと９６ウェルプレートにコーティングされた組み換えヒトＰＤ−１細胞外タンパク質の結合を検出した結果の概略図である。ここで、ｍＡｂ２１およびｍＡｂ１１は２株の異なるハイブリドーマの上清液サンプルであり、陰性対照サンプルは未融合のＳＰ２／０骨髄腫細胞培養上清液サンプルである。 本発明の実施例２におけるフローサイトメーターによってマウス抗体サンプルにおける抗体とヒトＰＤ−１遺伝子で安定して形質移入されたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＰＤ−１）の結合を検出・分析した結果の概略図である。ここで、図３Ａは対照−ＩｇＧを示し、陰性対照サンプルであり、図３ＢはヒトＰＤＬ２−Ｆｃ融合タンパク質を示し、陽性対照サンプルで、図３ＣはハイブリドーマｍＡｂ７細胞上清液サンプルを示し、図３ＤはハイブリドーマｍＡｂ２１細胞上清液サンプルを示す。 本発明の実施例３における免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＩＨＣ）の方法によってｍＡｂ２１モノクローナル抗体サンプルと組織切片の特異的結合を検出した結果の概略図である。図４Ａはカニクイザルの脾臓組織の切片を、図４Ｂはカニクイザルのリンパ節組織の切片を示す。 本発明の実施例４における体外競合ＥＬＩＳＡ法によってｍＡｂ２１モノクローナル抗体サンプルまたはＭＫ３４７５モノクローナル抗体サンプルによるビオチンで標識されたヒトＰＤＬ２−Ｆｃタンパク質（ビオチン−ＰＤＬ２）と９６ウェルプレートにコーティングされたヒトＰＤ−１タンパク質の結合に対する拮抗・遮断を検出・分析した結果の概略図である。ここで、ｈＰＶ１９は無関係のモノクローナル抗体サンプルで、陰性対照である。 本発明の実施例５における体外競合ＥＬＩＳＡ法によってｍＡｂ２１モノクローナル抗体サンプルまたはＭＫ３４７５モノクローナル抗体サンプルによるビオチンで標識されたＭＫ３４７５モノクローナル抗体（ビオチン−ＭＫ３４７５）と９６ウェルプレートにコーティングされたヒトＰＤ−１タンパク質の結合に対する拮抗・遮断を検出・分析した結果の概略図である。ここで、ｈＰＶ１９は無関係のモノクローナル抗体サンプルで、陰性対照である。 本発明の実施例８におけるヒト化ｈＡｂ２１モノクローナル抗体の軽鎖可変領域とニボルマブモノクローナル抗体の軽鎖可変領域およびＭＫ３４７５モノクローナル抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列のアライメント解析の概略図である。ここで、枠で示されるのはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列である。 本発明の実施例８におけるヒト化ｈＡｂ２１モノクローナル抗体の重鎖可変領域とニボルマブモノクローナル抗体（Ｎｉｖｏ）の重鎖可変領域およびＭＫ３４７５モノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列のアライメント解析の概略図である。ここで、枠で示されるのはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列である。 本発明の実施例１０におけるＥＬＩＳＡ法によって３種類のＩｇＧ４型モノクローナル抗体（ｈＡｂ２１モノクローナル抗体、ニボルマブおよびＭＫ３４７５のモノクローナル抗体）および３種類のＩｇＧ１型モノクローナル抗体（アバスチン、ｈＰＶ１９およびエルビタックス）と９６ウェルプレートにコーティングされた組み換えヒトＦｃＲタンパク質（ＣＤ６４タンパク質）の結合を検出して比較・分析した結果の概略図である。 本発明の実施例１１におけるＥＬＩＳＡ法によって、ヒト化ｈＡｂ２１モノクローナル抗体、ニボルマブモノクローナル抗体（Ｎｉｖｏ）およびＭＫ３４７５モノクローナル抗体とヒトＰＤ−１−Ｆｃおよび他のいくつかの免疫関連タンパク質−Ｆｃ融合タンパク質の結合を検出して比較・分析した結果の概略図である。ここで、ｈＰＶ１９は無関係のモノクローナル抗体サンプルで、陰性対照である。 本発明の実施例１２における競合ＥＬＩＳＡ法によって体外でヒト化ｈＡｂ２１モノクローナル抗体、ニボルマブモノクローナル抗体（Ｎｉｖｏ）およびＭＫ３４７５モノクローナル抗体によるビオチンで標識されたＭＫ３４７５モノクローナル抗体（ビオチン−ＭＫ３４７５）と９６ウェルプレートにコーティングされたヒトＰＤ−１タンパク質の結合に対する拮抗・遮断を検出・分析した結果の概略図である。ここで、ｈＰＶ１９は無関係のモノクローナル抗体サンプルで、陰性対照である。 本発明の実施例１２における競合ＥＬＩＳＡ法によって体外でヒト化ｈＡｂ２１モノクローナル抗体、ニボルマブモノクローナル抗体（Ｎｉｖｏ）およびＭＫ３４７５モノクローナル抗体のサンプルによるビオチンで標識されたニボルマブモノクローナル抗体（ビオチン−ニボルマブ）と９６ウェルプレートにコーティングされたヒトＰＤ−１タンパク質の結合に対する拮抗・遮断を検出・分析した結果の概略図である。ここで、ｈＰＶ１９は無関係のモノクローナル抗体サンプルで、陰性対照である。 本発明の実施例１２における体外競合ＥＬＩＳＡ法によってヒト化ｈＡｂ２１モノクローナル抗体、ニボルマブモノクローナル抗体（Ｎｉｖｏ）、ＭＫ３４７５モノクローナル抗体、ニボルマブモノクローナル抗体とＭＫ３４７５モノクローナル抗体の混合物（ＭＫ３４７５＋Ｎｉｖｏ）のサンプルによるビオチンで標識されたｈＡｂ２１モノクローナル抗体（ビオチン−ｈＡｂ２１）と９６ウェルプレートにコーティングされたヒトＰＤ−１タンパク質の結合に対する拮抗・遮断を検出・分析した結果の概略図である。ここで、ｈＰＶ１９は無関係のモノクローナル抗体サンプルで、陰性対照である。 本発明の実施例１３におけるフローサイトメーターによって異なる溶解度のニボルマブとヒトＰＤ−１遺伝子で安定して形質移入されたＣＨＯ細胞の結合（ＣＨＯ／ＰＤ−１）を検出・分析した結果の概略図である。ここで、ドットヒストグラムは陰性対照のＩｇＧの結果である。 本発明の実施例１３におけるフローサイトメーターによって異なる溶解度のｈＡｂ２１モノクローナル抗体サンプルとヒトＰＤ−１遺伝子で安定して形質移入されたＣＨＯ細胞の結合（ＣＨＯ／ＰＤ−１）を検出・分析した結果の概略図である。ここで、ドットヒストグラムは陰性対照のＩｇＧの結果である。 本発明の実施例１３におけるフローサイトメーターによる検出・分析の結果から作成された平均蛍光強度（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＭＦＩ）とｈＡｂ２１モノクローナル抗体またはニボルマブモノクローナル抗体の溶解度グラフである。 本発明の実施例１４におけるフローサイトメーターによって異なる溶解度のニボルマブ（Ｎｉｖｏ、左）またはｈＡｂ２１モノクローナル抗体サンプル（ｈＡｂ２１、右）とＰＨＡによって活性化されたヒトＪｕｒｋａｔＴ細胞の結合を検出・分析した結果の概略図である。ここで、ドットヒストグラムは陰性対照のＩｇＧの結果である。 本発明の実施例１５におけるフローサイトメーターによって異なる溶解度のｈＡｂ２１モノクローナル抗体サンプル（ｈＡｂ２１、右）、または異なる溶解度のニボルマブ（左）とＰＨＡによって活性化されたヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）の結合を検出・分析した結果の概略図である。ここで、ドットヒストグラムは陰性対照のＩｇＧの結果である。 本発明の実施例１６におけるｈＰＤ−１ヒト化マウスにマウス由来ＭＣ３８結腸癌細胞を皮下移植した腫瘍モデルの第１段階の研究において、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体またはＭＫ３４７５モノクローナル抗体（ペンブロリズマブ）を投与した後の腫瘍増殖のグラフである。 本発明の実施例１６におけるｈＰＤ−１ヒト化マウスにマウス由来ＭＣ３８結腸癌細胞を皮下移植した腫瘍モデルの第１段階の研究において、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体またはＭＫ３４７５モノクローナル抗体（ペンブロリズマブ）を投与した後のマウスの体重増加のグラフである。 本発明の実施例１６におけるｈＰＤ−１ヒト化マウスにマウス由来ＭＣ３８結腸癌細胞を皮下移植した腫瘍モデルの第１段階の研究において、生理食塩水の陰性対照群（Ａ群）の各動物個体の体内の腫瘍体積の増加の傾向である。 本発明の実施例１６におけるｈＰＤ−１ヒト化マウスにマウス由来ＭＣ３８結腸癌細胞を皮下移植した腫瘍モデルの第１段階の研究において、ペンブロリズマブ（ＭＫ３４７５）モノクローナル抗体治療群（Ｂ群）の各動物個体の体内の腫瘍体積の増加の傾向である。 本発明の実施例１６におけるｈＰＤ−１ヒト化マウスにマウス由来ＭＣ３８結腸癌細胞を皮下移植した腫瘍モデルの第１段階の研究において、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体治療群（Ｃ）（Ａ群）の各動物個体の体内の腫瘍体積の増加の傾向である。 本発明の実施例１６におけるｈＰＤ−１ヒト化マウスにマウス由来ＭＣ３８結腸癌細胞を皮下移植した腫瘍モデルの第２段階の研究において、再移植の腫瘍増殖のグラフ、およびそれと野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下移植した場合の腫瘍増殖のグラフの比較である。 本発明の実施例１７における通常のＣ５７ＢＬ／６マウスにマウス由来ＭＣ３８結腸癌細胞を皮下移植したモデルの研究において、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体治療群および生理食塩水対照群の動物体内の腫瘍体積の増加の傾向である。 本発明の実施例１８におけるカニクイザルにｈＡｂ２１モノクローナル抗体を単回静脈内投与した後の薬物溶解度−時間グラフである。

以下、実施例を参照して本発明をさらに説明するが、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明を制限するものではない。

実施例１：抗ＰＤ−１抗体を分泌するマウスハイブリドーマ細胞系の構築と選別・同定
１）ヒトＰＤ−１タンパク質のアミノ酸配列とマウスＰＤ−１タンパク質のアミノ酸配列のアライメント解析
ヒトＰＤ−１タンパク質のアミノ酸配列とマウスＰＤ−１タンパク質のアミノ酸配列のアライメント解析を図１に示す。その中の枠と斜体で示されたアミノ酸配列は、ＰＤ−１の細胞外分泌・発現を誘導するシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）であり、枠と太字で示されたアミノ酸配列はＰＤ−１タンパク質の膜貫通領域ＴＭである。図１に示すように、アミノ酸配列において、ヒトＰＤ−１とマウスＰＤ−１タンパク質は全体の相同性は６０％しかなく、またその中の直接そのリガンド（ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２）の認識および結合に関与する細胞外領域（ＩｇＶ領域を含む）のアミノ酸の異なる部位数もヒトとマウスで３０を超える。そのため、従来の抗原タンパク質によるマウスに対する免疫およびハイブリドーマの製造技術を使用すれば、異なる結合領域またはアミノ酸結合部位に対するマウス抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体を製造することができると推測される。これらの抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体は、その抗原結合領域／結合部位（ｅｐｉｔｏｐｅ）が既存のＰＤ−１モノクローナル抗体、例えば、オプジーボ（ニボルマブ）またはキイトルーダ（ペンブロリズマブ）と異なるため、その体内外の生物活性および治療効果がオプジーボ（ニボルマブ）またはキイトルーダ（ペンブロリズマブ）と異なるか、さらにそれ以上であることが期待されている。これらの新規な部位を認識する、新規なＰＤ−１モノクローナル抗体は薬物成分として、生体の免疫機能および抗腫瘍の治療効果をさらに増強させる作用を実現するために、現在市販されているＰＤ−１モノクローナル抗体薬物またはＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体薬物と併用しても連続使用してもよい。一方、当該新規な抗体も単独で使用される新規な免疫機能増強剤または抗腫瘍薬物製剤を独自に開発することが期待されている。
そのため、本発明では、これらの新規なＰＤ−１モノクローナル抗体の研究・開発と製造が行われ、その具体的な製造工程は以下の通りである。

２）抗ＰＤ−１抗体を分泌するマウスハイブリドーマ細胞系の構築と選別・同定
工程１．組み換えヒトＰＤ−１タンパク質（免疫抗原）の由来と動物の免疫
本発明の実施例において、免疫に使用した抗原は哺乳動物によって発現される組み換えヒトＰＤ−１細胞外タンパク質である（北京義翹神州公司製）。当該組み換えヒトＰＤ−１タンパク質を完全フロイントアジュバント（米国Ｓｉｇｍａ社製）と混合した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮下の数箇所に注射した（１００μｌ／匹、１０μｇＰＤ−１タンパク質／回）。最初の免疫から２−３週間後、さらにマウスの皮下の数箇所に、ヒトＰＤ−１タンパク質と不完全フロイントアジュバント（米国Ｓｉｇｍａ社製）を含有する混合物を注射し、３−４回強化免疫した後、少量のマウスの血清を取り、組み換えヒトＰＤ−１タンパク質がコーティングされた９６ウェルプレートに対してＥＬＩＳＡ法によってマウス血清における抗ＰＤ−１抗体の力価を検出し、高力価のマウスの脾臓細胞を取って次の工程の細胞融合に使用した。

工程２．細胞融合
最後の免疫から３−４日後、無菌でマウス脾臓細胞懸濁液を調製し、マウスＳＰ２／０骨髄腫細胞（中国科学院上海生命科学院細胞寄託センターから購入）と、５：１または１０：１の比率で５０％のＰＥＧ−１０００（米国Ｓｉｇｍａ社製）の作用下で融合させた。融合は通常の方法（Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ：Ｎａｔｕｒｅ １９７５；２５６：４９５−４９７）に従い、ＰＥＧ使用量は１ｍｌで、６０秒でゆっくり添加を終えた。９０秒反応させた後、無血清のＲＰＭＩ−１６４０培地で反応を停止させ、１０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清液を除去し、さらに遠心沈殿した細胞を１０％ＨＡＴ（Ｈ：ヒポキサンチン、Ａ：アミノプテリン、Ｔ：チミジン、米国Ｓｉｇｍａ社製）を含有するＲＰＭＩ １６４０−１０％ＦＣＳ培地で細胞濃度が１×１０^６／ｍｌになるように調整し、９６ウェル平底細胞培養プレート（２００μｌ／ウェル）に入れ、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター（米国Ｔｈｅｒｍｏ社製）で２−３週間培養した。

工程３．酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）による抗体分泌陽性のマウスハイブリドーマ細胞の選別
同様に、組み換えヒトＰＤ−１タンパク質（２μｇ／ｍｌ、ｐＨ９．６、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ_３液）で９６ウェルマイクロプレートをコーティングし、３７℃で２時間コーティングした後、さらに２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を入れて４℃で一晩ブロッキングした。翌日、コーティングプレートをＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０液で洗浄した後、被験ハイブリドーマ細胞培養上清液（未融合のＳＰ２／０骨髄腫細胞培養上清は陰性対照である）を３７℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０液で洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼＨＲＰで標識されたヒツジ抗マウスＩｇＧ（米国Ｓｉｇｍａ会社製品）を入れ、３７℃で１時間インキュベートし、さらにＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０液で十分に洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）−０．１％Ｈ_２Ｏ_２基質液を入れて１０〜１５ｍｉｎ呈色させた後、さらに０．１Ｍ ＨＣｌを入れて反応を停止させた。その後、ＭＫ３−Ｍｕｌｔｉｓｋａｎマイクロプレートリーダー（米国Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）によって、４９２ｎｍにおけるＯＤ値を読み取った。測定されたＯＤ４９２値が陰性対照値よりも５〜１０倍高いハイブリドーマ細胞を再クローン化し、増幅して凍結保存した。

工程４．陽性ハイブリドーマ細胞のサブクローニング−限界希釈法
一次的に選別された陽性ハイブリドーマ細胞をＲＰＭＩ−１６４０−１０％ＦＣＳ培地で１〜１０個細胞／ウェルになるように希釈し、９６ウェル細胞培養プレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで２−３週間培養した。クローンができたら、上清液を取ってＥＬＩＳＡでさらに抗ＰＤ−１抗体を検出・同定した。図２はＥＬＩＳＡ法によってハイブリドーマのサブクローン上清液と組み換えヒトＰＤ−１タンパク質の結合を検出した結果の概略図であり、コードがｍＡｂ２１のハイブリドーマ細胞株の上清液は高力価の抗ＰＤ−１抗体を含有する。

実施例２ フローサイトメーターによるマウス由来モノクローナル抗体ｍＡＢ２１とヒトＰＤ−１遺伝子を形質移入して発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＰＤ−１）の結合の検出・分析
本実施例において、マウス由来ｍＡＢ２１モノクローナル抗体上清液、または既知のヒトＰＤ−１タンパク質と結合するマウス由来ｍＡＢ７モノクローナル抗体上清液（中国特許出願公開書類ＣＮ１０４５５８１７７Ａを参照のこと）を一次抗体とし、ＦＩＴＣ蛍光標識のヒツジ抗マウスＩｇＧを二次抗体とし、フローサイトメーターによってｍＡＢ２１モノクローナル抗体サンプルとヒトＰＤ−１遺伝子を安定して発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＰＤ−１）の結合を検出・分析した。そのため、ＣＨＯ−ＰＤ−１細胞を、それぞれマウスＩｇＧ（陰性対照、Ａ）、ヒトＰＤＬ２−Ｆｃ融合タンパク質（Ｂ）、マウス抗ＰＤ−１陽性サンプルｍＡＢ７上清液（Ｃ、１：５希釈）またはマウスｍＡＢ２１上清液（Ｄ、１：５希釈）と、４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ−０．１％ＦＣＳ液で洗浄した後、ＦＩＴＣ標識のヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社製）を入れ（ヒトＰＤＬ２−Ｆｃ融合タンパク質サンプルに対して、ＦＩＴＣ標識のヒツジ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃを入れた）、４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ−０．１％ＦＣＳ液で洗浄した後、サンプルをＣｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００ ＭＣＬフローサイトメーター（米国Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）にセットして検出した。

図３は当該フローサイトメーターによって検出された代表的な結果の概略図である。図３に示すように、マウスＩｇＧ陰性対照サンプル（図３Ａを参照）と比較して、ヒトＰＤＬ２−Ｆｃ融合タンパク質サンプル（図３Ｂを参照）、陽性サンプルのマウスモノクローナル抗体のｍＡＢ７モノクローナル抗体上清液（図３Ｃを参照）および被験サンプルのｍＡＢ２１モノクローナル抗体上清液（図３Ｄを参照）はいずれもＣＨＯ／ＰＤ−１細胞と特異的に結合することができ、ｍＡＢ２１モノクローナル抗体サンプルの結合強度はｍＡＢ７モノクローナル抗体よりも高い。

実施例３ 免疫組織化学（ＩＨＣ）の方法によるマウス由来ｍＡＢ２１モノクローナル抗体とカニクイザル組織細胞の結合の検出
本実施例において、免疫組織化学（ＩＨＣ）の方法によってｍＡｂ２１モノクローナル抗体サンプルと正常なカニクイザル由来の組織切片（昭衍（蘇州）新薬研究中心有限公司によって提供された）の結合を検出・分析したが、その検出工程は以下の通りである。

カニクイザル（脾臓およびリンパ節組織）のパラフィン切片に対して、再水和および抗原回復処理を行った後、ｍＡｂ２１モノクローナル抗体の上清液を一次抗体として添加し、常温で１時間インキュベートして洗浄した後、さらに希釈されたＨＲＰで標識されたヒツジ抗マウスＩｇＧ（二次抗体）を入れ、常温で１時間インキュベートして洗浄した後、基質であるＤＡＢを入れて呈色させ、ヘマトキシリンで二次染色し、封止し、撮影した。当該免疫組織化学の代表的な結果は図４に示すように、ｍＡｂ２１モノクローナル抗体サンプルは、サルの脾臓組織（図４Ａを参照）およびリンパ節組織（図４Ｂを参照）と特異的に結合することができることが示された。

実施例４ 競合ＥＬＩＳＡ法によるｍＡｂ２１モノクローナル抗体のＰＤ−１タンパク質とその受容体の結合に対する拮抗・遮断の生物活性の検出
体外でｍＡｂ２１モノクローナル抗体の生物活性を検出する方法の一つは、競合ＥＬＩＳＡ法によってそのＰＤ−１タンパク質とその受容体（ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２）の結合に対する拮抗・遮断を検出する方法である。

当該競合ＥＬＩＳＡ法の基本原理と過程は、まず異なる溶解度のｍＡｂ２１モノクローナル抗体サンプルまたは陽性対照サンプル、例えば、ＭＫ３４７５モノクローナル抗体を固定溶解度のビオチンで標識されたヒトＰＤ−１受容体タンパク質（例えば、ＰＤＬ１−ＦｃまたはＰＤＬ２−Ｆｃ融合タンパク質）と混合した後、さらに混合物を予めＰＤ−１タンパク質がコーティングされた９６ウェルプレートに移し、インキュベートして溶離した後、酵素で標識されたアビジン（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたアビジン）を入れ、さらにインキュベートして溶離した後、基質を入れて呈色させてＯＤ値を測定した。

ここで、競合ＥＬＩＳＡ法による検出の具体的な工程は以下の通りである。

１）組み換えヒトＰＤ−１細胞外タンパク質（北京義翹神州公司製）で９６ウェルプレートをコーティングし（コーティング溶解度：２μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）、４℃で一晩置いた。

２）ＰＢＳ液で洗浄して２％ＢＳＡ（ＰＢＳ−０．１％ｔｗｅｅｎ２０液に希釈した）で室温でブロッキングした後、それぞれ固定溶解度のビオチンで標識されたＰＤＬ１−Ｆｃタンパク質またはＰＤＬ２−Ｆｃタンパク質（ＰＤＬ１−Ｆｃタンパク質およびＰＤＬ２−Ｆｃタンパク質はいずれも北京義翹神州公司製）と異なる溶解度のＡＢ７抗体、または無関係のマウス抗体（マウスＩｇＧ）を入れ、３７℃で２ｈインキュベートした。

３）ＰＢＳ−Ｔで溶離した後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたアビジン（１：５０００）を入れ、３７℃で１ｈインキュベートした。

４）ＰＢＳ−Ｔで溶離した後、呈色液（ｏ−フェニレンジアミン）−３％過酸化水素水を入れ、室温で１０ｍｉｎ呈色させた。

５）ＨＣＬを入れて反応を停止させ、酵素結合免疫測定装置によって波長４９２ ｎｍにおける各ウェルの吸光値を測定した。

図５Ａは、被験サンプルのｍＡｂ２１モノクローナル抗体および陽性サンプルのＭＫ３４７５モノクローナル抗体が体外でビオチンで標識されたＰＤＬ２−Ｆｃタンパク質（ビオチン−ＰＤＬ２Ｆｃ）と競合してＰＤ−１タンパク質と結合した代表的な結果である。図５Ａに示すように、異なる溶解度のｍＡｂ２１モノクローナル抗体またはＭＫ３４７５モノクローナル抗体と固定溶解度のビオチンで標識されたＰＤＬ２−Ｆｃタンパク質のサンプルでは、各ウェルの呈色反応のＯＤ値は入れた抗体タンパク質量に反比例する。すなわち、入れたｍＡｂ２１モノクローナル抗体またはＭＫ３４７５モノクローナル抗体の量が多いほど、その呈色ＯＤ値が低下する。また、無関係のモノクローナル抗体サンプルｈＰＶ１９の添加量は、各ウェルのＯＤ値に対する影響が大きくない。この結果から、ＭＫ３４７５モノクローナル抗体と同様に、ｍＡｂ２１モノクローナル抗体は体外で競合してＰＤ−１とその受容体の結合を遮断する生物活性を有することが示された。

実施例５ ＥＬＩＳＡ法によるｍＡｂ２１モノクローナル抗体およびＭＫ３４７５モノクローナル抗体のＰＤ−１タンパク質との競合的結合の検出・分析
実施例４と同様の競合ＥＬＩＳＡ法によって、ｍＡｂ２１モノクローナル抗体およびＭＫ３４７５モノクローナル抗体のＰＤ−１タンパク質との競合的結合を検出・分析した。その基本原理と検出の過程は、以下のとおりである。まず異なる溶解度のｍＡｂ２１モノクローナル抗体またはＭＫ３４７５モノクローナル抗体を固定溶解度のビオチンで標識されたＭＫ３４７５モノクローナル抗体（ビオチン−ＭＫ３４７５）と混合した後、さらに混合物を予めＰＤ−１タンパク質がコーティングされた９６ウェルプレートに移し、インキュベートして溶離した後、酵素で標識されたアビジン（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたアビジン）を入れ、さらにインキュベートして溶離した後、基質を入れて呈色させてＯＤ値を測定した。

図５Ｂは競合ＥＬＩＳＡ法による検出・分析の代表的な結果である。図５Ｂに示すように、異なる溶解度のｍＡｂ２１モノクローナル抗体またはＭＫ３４７５モノクローナル抗体と固定溶解度のビオチンで標識されたビオチン−ＭＫ３４７５のサンプルに入れ、各ウェルの呈色反応のＯＤ値は入れた標識されたモノクローナル抗体のサンプルの量と反比例する。すなわち、入れたｍＡｂ２１モノクローナル抗体またはＭＫ３４７５モノクローナル抗体の量が多いほど、その呈色ＯＤ値が低下する。また、無関係のモノクローナル抗体サンプルｈＰＶ１９の添加量は各ウェルのＯＤ値に対する影響が大きくない。この結果から、ｍＡｂ２１モノクローナル抗体は体外でＭＫ３４７５と競合してＰＤ−１と結合することが示された。

実施例６．マウス由来ｍＡＢ２１抗体可変領域のコード遺伝子のクローニング
ここで、まずマウスｍＡＢ２１ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出し、さらに当該ＲＮＡを鋳型とし、縮重プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒ）を使用し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＲＴ−ＰＣＲ）法（Ｗａｎｇ Ｙら：Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ｔｈｅ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｆｒｏｍ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｃＤＮＡ。 ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２００６；７ Ｓｕｐｐｌ（４）：Ｓ９）によってそれぞれクローニングして増幅してｍＡＢ２１抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のｃＤＮＡ遺伝子断片を得た。ここで、ｃＤＮＡ遺伝子のクローニング工程は以下の通りである。
工程１．キット（江蘇海門碧云天公司製）によってマウスＡＢ２１ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを抽出した。
工程２．逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）方法によってエッペンドルフ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管においてｃＤＮＡ鋳型を得た。

ここで、ｍＡＢ２１抗体の軽鎖可変領域の逆転写に使用されたＰＣＲプライマー（ＡＢ２１−Ｌ）配列は、ＴＧＴ ＣＧＴ ＴＣＡ ＣＴＧ ＣＣＡ ＴＣＡ ＡＴである。

ｍＡＢ２１抗体の重鎖可変領域の逆転写に使用されたＰＣＲプライマー（ＡＢ２１−Ｈ）配列は、ＧＣＡ ＡＧＧ ＣＴＴ ＡＣＡ ＡＣＣ ＡＣＡ ＡＴＣである。
ＰＣＲ反応系は以下の通りである。

温度４２℃で１時間反応させた後、７５℃に昇温し、１５分不活性化させて得られたｃＤＮＡを−２０℃に置き、保存して使用に備えた。

工程３．ｍＡＢ２１抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の遺伝子のＰＣＲによるクローニング・増幅

縮重プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒ）のＰＣＲ法による当該ＡＢ２１抗体の軽鎖可変領域の遺伝子のクローニング・増幅に使用された１対のプライマーは以下の通りである。
フォワードプライマー：ＧＡＣ ＡＴＴ ＧＴＧ ＡＴＧ ＷＣＭ ＣＡ
リバースプライマー：ＣＴＧ ＡＧＧ ＣＡＣ ＣＴＣ ＣＡＧ ＡＴＧ ＴＴ
ここで、Ｗ＝ＡまたはＴであり、Ｍ＝ＡまたはＣである。

また、縮重プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒ）とＰＣＲ法によるＡＢ２１抗体の重鎖可変領域の遺伝子のクローニング・増幅に使用された１対のプライマーは以下の通りである。

フォワードプライマー：ＧＴＲ ＣＡＧ ＣＴＴ ＣＡＧ ＧＡＧ ＴＣ
ここで、Ｒ＝ＡまたはＧである。

リバースプライマー：ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＧＧ ＡＣＡ ＧＴＣ ＡＣＴ
ＰＣＲ増幅によって得られたＤＮＡ産物を、１％アガロースゲルで電気泳動分析を行った。電気泳動終了後、単離されたＤＮＡバンドを切り出してそれぞれシークエンシングを行い、抗体の軽鎖および重鎖の可変領域のＤＮＡのヌクレオチド配列を得た。測定された当該抗体の軽鎖可変領域のＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号１に示し、当該ＤＮＡのヌクレオチド配列から推測された抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２に示す。当該軽鎖の抗原相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３、配列番号４および配列番号５に示す。

測定された当該抗体の重鎖可変領域のＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号６に示し、当該ＤＮＡのヌクレオチド配列から推測された抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７に示す。当該重鎖の抗原相補性決定領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号８、配列番号９および配列番号１０に示す。

実施例７ マウス由来ｍＡｂ２１抗体のヒト−マウスキメラ抗体（ｃＡＢ２１）の構築
実施例６でクローニング・増幅されたＡＢ２１抗体の軽鎖可変領域の遺伝子および重鎖可変領域の遺伝子を、それぞれヒトκ軽鎖定常領域（Ｃ−ｄｏｍａｉｎ）およびヒトＩｇＧ１−重鎖定常領域の遺伝子断片と融合させ、ヒト−マウスキメラ軽鎖の遺伝子（ｃＡＢ２１Ｌ）およびヒト−マウスキメラ重鎖の遺伝子（ｃＡＢ２１Ｈ）を得た。その後、軽鎖キメラ遺伝子と重鎖キメラ遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミドにクローニングし、大腸菌に導入して増幅し、単離して大量のヒト−マウスキメラ抗体遺伝子を含有する発現プラスミドを得た。

ヒト−マウスキメラ抗体遺伝子を含有する発現プラスミドを、さらにＦｕｇｅｎ−６リポソーム（Ｒｏｃｈｅ）と混合した後、ＣＨＯ細胞に同時形質移入した。細胞の形質移入から２〜３日後、培養上清液を取り、ヒトＰＤ−１タンパク質をコーティングした９６ウェルプレートで、ＨＲＰ酵素で標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（上海西塘生物公司から購入）を二次抗体とし、二次抗体を検出するため、ＥＬＩＳＡ法によって上清液におけるキメラ抗体（ｃＡＢ２１）とヒトＰＤ−１タンパク質の結合を検出した。当該ＥＬＩＳＡの代表的な検出結果を下記表１に示す。

表１ ＥＬＩＳＡ法によるキメラ抗体（ｃＡＢ２１）の遺伝子を一過性形質移入された細胞の培養上清液とヒトＰＤ−１タンパク質の結合の検出

表１の結果から、ヒト−マウスキメラ抗体の遺伝子ｃＡＢ２１の発現プラスミドを形質移入されたＣＨＯ細胞の培養上清液はヒトＰＤ−１タンパク質と特異的に結合することができることが示された。

上記形質移入細胞の上清液を遠心分離して０．４５μｍろ膜でろ過した後、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ｐｒｏｔｅｉｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、米国ＧＥ社製）に仕込み、単離して精製し、ヒト−マウスキメラ抗体（ｃＡＢ２１）の抗体タンパク質を得た。

実施例８ マウス由来ｍＡＢ２１抗体のヒト化の遺伝子工学的改変
ＥＬＩＳＡ法によって、ヒト−マウスキメラ抗体（ｃＡＢ２１）がヒトＰＤ１タンパク質との高親和力の結合活性を有することを予備的に証明した上で、ＰＣＲなどの一連の遺伝子工学のクローニング手段で、当該キメラ抗体の軽鎖および重鎖における抗原相補性決定領域（ＣＤＲ）の遺伝子断片を、それぞれヒトκ軽鎖およびＩｇＧ４−重鎖の可変領域に対応するフレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）に移植し、ヒト化ｈＡＢ２１抗体を得た。

１）ｍＡｂ２１抗体の軽鎖のヒト化
アミノ酸配列の分析によって、ヒトグロブリンのκ軽鎖の第一Ｖ領域の生殖系列遺伝子の発現産物（ＩｇＫＶ１−９、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ： ２８９４１）は、ｍＡＢ２１の軽鎖可変領域と最も高い相同性を有することがわかった。これに基づき、ｍＡＢ２１軽鎖のフレームワーク（ＦＲ）の代わりに、ヒトＩｇＫＶ１−９の相同配列を使用し、そして代わりの可変領域の遺伝子をヒトグロブリンＩｇＧ−κ軽鎖の定常領域のコード配列と連結し、最後にヒト化された軽鎖コード遺伝子（ｈＡＢ２１−Ｌ）を得ることに成功した。ここで、ヒト化ｈＡＢ２１抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号１１に示し、そのヌクレオチド配列を配列番号１３に示す。

図６Ａは、ヒト化ｈＡｂ２１モノクローナル抗体の軽鎖可変領域と、ニボルマブモノクローナル抗体の軽鎖可変領域およびＭＫ３４７５モノクローナル抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列のアライメント解析の結果である。ここで、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列におけるニボルマブモノクローナル抗体またはＭＫ３４７５モノクローナル抗体と異なる箇所はすべて記号「Ｘ」で表示され、各モノクローナル抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、いずれも枠で識別される。図６Ａに示すように、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体の軽鎖可変領域およびＣＤＲ配列は、ニボルマブモノクローナル抗体とも、ＭＫ３４７５モノクローナル抗体とも異なる。

２）ｍＡｂ２１抗体の重鎖のヒト化
アミノ酸配列の分析によって、ヒトグロブリンの重鎖の第三Ｖ領域の生殖系列遺伝子の発現産物（ＩｇＨＶ３−２３、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ： ２８４４２）は、ｍＡＢ２１抗体の重鎖と最も高い相同性を有することがわかった。これに基づき、ｍＡＢ２１の重鎖フレームワーク（ＦＲ）の代わりに、ヒトＩｇＨＶ３−２３の相同配列を使用し、同時にヒト化抗体と生体内におけるグロブリン−Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）の結合およびそれが介在する細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）のＰＤ−１発現陽性免疫細胞（リンパ球）に対する殺傷作用を低下させるため、ヒト化されたｍＡＢ２１抗体の重鎖可変領域の遺伝子をヒトグロブリン−ＩｇＧ４重鎖の定常領域の配列と連結し、そしてＩｇＧ４重鎖の定常領域におけるヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）おける２２８番目に位置するアミノ酸を元のセリンからプロリンに変えた（Ｓ２２８Ｐ）。この遺伝子工学の一連の改変の後、最後にヒト化重鎖コード可変領域、ヒトＩｇＧ４−重鎖定常領域（Ｓ２２８Ｐ）を含む全長ヒト化ｈＡＢ２１抗体の重鎖を得ることに成功した。ここで、ヒト化ｈＡＢ２１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を、配列番号１２に示し、そのヌクレオチド配列を配列番号１４に示す。

図６Ｂは、ヒト化ｈＡｂ２１モノクローナル抗体の重鎖可変領域とニボルマブモノクローナル抗体の重鎖可変領域およびＭＫ３４７５モノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列のアライメント解析の結果である。ここで、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列におけるニボルマブモノクローナル抗体またはＭＫ３４７５モノクローナル抗体と異なる箇所はすべて記号「Ｘ」で表示され、各モノクローナル抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、いずれも枠で識別される。図６Ｂに示すように、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体の重鎖可変領域およびＣＤＲ配列は、ニボルマブモノクローナル抗体とも、ＭＫ３４７５モノクローナル抗体とも異なる。

実施例９ 安定的かつ効率的にヒト化ｈＡｂ２１抗体を発現・分泌するＣＨＯ細胞エンジニアリング株の構築および抗体タンパク質の単離・精製
ヒト化重鎖遺伝子（ｈＡＢ２１Ｈ）、ヒト化軽鎖遺伝子（ｈＡＢ２１Ｌ）を、段階的にｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｙｇｒｏ発現ベクターにクローニングし、大腸菌に導入した後、増幅・単離してヒト化ｈＡＢ２１発現プラスミドを得た。その後、発現キメラ抗体ｃＡＢ２１およびヒト化抗体ｈＡＢ２１の組み換えプラスミドを、それぞれＣＨＯ細胞に一過性形質移入した。形質移入から４８時間後、ウェルにおける細胞培養上清液を吸い取り、ＰＤ−１タンパク質をコーティング抗原とし、ＨＲＰ酵素で標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（上海西塘生物公司から購入）を検出二次抗体とし、ＯＰＤを呈色基質とし、直接ＥＬＩＳＡ法によって形質移入細胞の上清液における抗体とヒトＰＤ−１抗原の結合の活性を検出した。

下記表２は当該ＥＬＩＳＡの代表的な検出結果である。

表２ ＥＬＩＳＡによる一過性形質移入細胞の培養上清液とヒトＰＤ−１タンパク質の結合の分析

表２における結果のように、ヒト−マウスキメラ型ｃＡＢ２１抗体と同様に、ヒト化ｈＡＢ２１抗体（ＩｇＧ４−κ）は、ヒトＰＤ−１タンパク質と結合する活性を維持することが示された。

上記形質移入細胞をクローニング・選別して、無血清培地の懸濁培養によって順化した後、いくつかの安定的かつ効率的にヒト化ｈＡＢ２１抗体タンパク質を発現・分泌するＣＨＯ細胞エンジニアリング株を得ることに成功した（発現量は１ｇ／Ｌ以上に達した）。

その後、中から一つの細胞エンジニアリング株を選択して、さらに無血清培地で増幅培養した後、培養上清液を収集し、上清液を遠心分離して０．４５μｍろ膜でろ過した後、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ｐｒｏｔｅｉｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、米国ＧＥ社製）、イオン交換クロマトグラフィーカラム、ウイルスの除去・不活性化、およびろ過除菌（０．２２μｍろ膜によるろ過）を含む、いくつかの単離・精製工程を行った後、最後に高純度（タンパク質の純度は９９％以上に達した）のヒト化ｈＡＢ２１抗体を得た。精製されたｈＡｂ２１抗体を無菌生理食塩に再溶解させ（１−２０ｍｇ／ｍｌ）、低温（−２０℃以下）で保存した。

実施例１０ ＥＬＩＳＡ法による精製されたｈＡｂ２１モノクローナル抗体とＦｃＲ受容体タンパク質の結合の検出・分析
直接ＥＬＩＳＡ法によって精製されたｈＡｂ２１（ＩｇＧ４−κ）モノクローナル抗体と９６ウェルプレートにコーティングされた組み換えＦｃＲ受容体（例えば、ＦｃγＲI受容体、ＣＤ６４）タンパク質の結合を検出・分析し、そしてその結果を同種類のＩｇＧ４型モノクローナル抗体（ニボルマブおよびＭＫ３４７５モノクローナル抗体）および３種類のＩｇＧ１型モノクローナル抗体（アバスチン、ｈＰＶ１９およびエルビタックス）と比較した。

当該ＥＬＩＳＡ法による検出の基本の工程は以下の通りである。２倍段階希釈されたＩｇＧ４型モノクローナル抗体（ｈＡｂ２１、ニボルマブおよびＭＫ３４７５モノクローナル抗体）またはＩｇＧ１型モノクローナル抗体（アバスチン、ｈＰＶ１９およびエルビタックス）を含むサンプルを予め組み換えヒトＦｃγＲI受容体タンパク質（ＣＤ６４、北京義翹神州公司製）がコーティングされた９６ウェルプレートに入れ、３７℃で２ｈインキュベートして洗浄した後、各ウェルにさらにＨＲＰで標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を入れ、３７℃で１ｈインキュベートして洗浄した後、各ウェルにＯＰＤ基質を入れて呈色させた。

図７は当該ＥＬＩＳＡ法による検出・分析の代表的な結果である。結果から、３種類のＩｇＧ１型モノクローナル抗体（アバスチン、ｈＰＶ１９およびエルビタックス）と比較して、３種類のＩｇＧ４型モノクローナル抗体（ｈＡｂ２１、ニボルマブおよびＭＫ３４７５）とＦｃγＲI受容体（ＣＤ６４）の結合活性が顕著に低下した（９５％以上低下した）ことが示され、当該結果も予想と一致した。

実施例１１ ＥＬＩＳＡ法によるｍＡｂ２１モノクローナル抗体とＰＤ−１および他の免疫関連タンパク質の結合の検出・分析
直接ＥＬＩＳＡ法によって精製されたｈＡｂ２１モノクローナル抗体、ニボルマブおよびＭＫ３４７５モノクローナル抗体とＰＤ−１および他の関連タンパク質の結合活性を比較・分析した。当該ＥＬＩＳＡ法による検出の基本の工程は以下の通りである。２倍段階希釈されたＰＤ−モノクローナル抗体（ｈＡｂ２１、ニボルマブおよびＭＫ３４７５モノクローナル抗体）または無関連モノクローナル抗体ｈＰＶ１９のサンプルをそれぞれ予め組み換えＰＤ１−Ｆｃまたは他の免疫関連遺伝子−Ｆｃ融合タンパク質（ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＴＬＡ４、ＣＤ３、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＢＴＬＡなどを含む）がコーティングされた９６ウェルプレートに入れ、３７℃で２ｈインキュベートして洗浄した後、９６ウェルプレートの各ウェルにさらにＨＲＰで標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ抗体（米国Ｓｉｇｍａ社製）を入れ、３７℃で１ｈインキュベートして洗浄した後、各ウェルにＯＰＤ基質を入れて呈色させた。

図８は当該ＥＬＩＳＡ法による検出・分析の代表的な結果である。結果から、ニボルマブおよびＭＫ３４７５と同様に、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体はヒトＰＤ−１タンパク質だけと特異的に結合し、他の免疫関連タンパク質、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＴＬＡ４、ＣＤ３、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＢＴＬＡなどのいずれとも結合しなかったことが示された。

実施例１２ 競合ＥＬＩＳＡ法によるｍＡｂ２１モノクローナル抗体、ニボルマブおよびＭＫ３４７５モノクローナル抗体のＰＤ−１タンパク質と結合する部位の比較分析
Ａｂ２１モノクローナル抗体のＰＤ−１タンパク質と結合する部位がニボルマブの結合部位またはＭＫ３４７５モノクローナル抗体の部位と異なるか否かを検証するため、本実施例において、実施例５と同様の競合ＥＬＩＳＡ法によってｍＡｂ２１モノクローナル抗体、ニボルマブおよびＭＫ３４７５モノクローナル抗体のＰＤ−１タンパク質と結合する部位を比較分析した。

図９Ａは競合ＥＬＩＳＡ法によるｈＡｂ２１モノクローナル抗体、ニボルマブモノクローナル抗体（Ｎｉｖｏ）およびＭＫ３４７５モノクローナル抗体によるビオチンで標識されたＭＫ３４７５モノクローナル抗体（ビオチン−ＭＫ３４７５）と９６ウェルプレートにコーティングされたヒトＰＤ−１タンパク質の結合に対する拮抗・遮断に対する検出・分析の代表的な結果である。図９Ａに示すように、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体はほとんどＭＫ３４７５モノクローナル抗体と同様のビオチン−ＭＫ３４７５とＰＤ−１タンパク質の結合を拮抗・遮断する効果に達したが、ニボルマブのビオチン−ＭＫ３４７５とＰＤ−１タンパク質を拮抗・遮断する効率は５０％程度で、無関連モノクローナル抗体ｈＰＶ１９は拮抗作用がなかったことが示された。

図９Ｂは競合ＥＬＩＳＡ法によるｈＡｂ２１モノクローナル抗体、ニボルマブモノクローナル抗体（Ｎｉｖｏ）およびＭＫ３４７５モノクローナル抗体によるビオチンで標識されたニボルマブモノクローナル抗体（ビオチン−ニボルマブ）と９６ウェルプレートにコーティングされたヒトＰＤ−１タンパク質の結合に対する拮抗・遮断に対する検出・分析の代表的な結果である。図９Ｂに示すように、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体もほとんどニボルマブモノクローナル抗体と同様のビオチン−ニボルマブとＰＤ−１タンパク質の結合を拮抗・遮断する効果に達したが、ＭＫ３４７５のビオチン−ニボルマブとＰＤ−１タンパク質を拮抗・遮断する効率は７０％程度で、無関連モノクローナル抗体ｈＰＶ１９は拮抗作用がなかったことが示された。

図９Ｃは当該体外競合ＥＬＩＳＡ法によるｈＡｂ２１モノクローナル抗体、ニボルマブモノクローナル抗体（Ｎｉｖｏ）、ＭＫ３４７５モノクローナル抗体、ニボルマブモノクローナル抗体とＭＫ３４７５モノクローナル抗体の併用（ＭＫ３４７５＋Ｎｉｖｏ）によるビオチンで標識されたｈＡＢ２１モノクローナル抗体（ビオチン−ｈＡｂ２１）と９６ウェルプレートにコーティングされたヒトＰＤ−１タンパク質の結合に対する拮抗・遮断に対する検出・分析の代表的な結果である。図９Ｃに示すように、ニボルマブモノクローナル抗体またはＭＫ３４７５モノクローナル抗体はいずれも部分的にビオチン−ｈＡｂ２１とＰＤ−１タンパク質の結合を遮断した（拮抗抑制率は、ニボルマブモノクローナル抗体では２０％程度で、ＭＫ３４７５モノクローナル抗体では５０％程度である）。また、ニボルマブモノクローナル抗体とＭＫ３４７５モノクローナル抗体を併用しても、そのビオチン−ｈＡｂ２１とＰＤ−１タンパク質の結合を拮抗・阻害する効率は７０％程度だけであった。

上記競合ＥＬＩＳＡを総合的に分析した結果、本発明におけるｈＡｂ２１モノクローナル抗体は、そのヒトＰＤ−１タンパク質と結合する部位（ｅｐｉｔｏｐｅ）がニボルマブモノクローナル抗体とも、ＭＫ３４７５モノクローナル抗体とも顕著に異なることがわかる。

実施例１３ フローサイトメーターによるｈＡｂ２１モノクローナル抗体およびニボルマブとヒトＰＤ−１遺伝子を発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＰＤ−１）の結合の検出・分析
本実施例において、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体またはニボルマブモノクローナル抗体を一次抗体とし、ＦＩＴＣ蛍光で標識されたヒツジ抗ヒトＩｇＧを二次抗体とし、フローサイトメーターによってｈＡｂ２１モノクローナル抗体またはニボルマブとヒトＰＤ−１遺伝子を発現するＣＨＯ細胞の結合を検出・分析した。

そのため、安定してヒトＰＤ−１遺伝子を発現するＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ／ＰＤ−１）を野生型ＣＨＯ細胞株と（１：２）の比率で混合した後、等量でそれぞれ異なる溶解度（０．００３−１０μｇ／ｍＬ）のｈＡｂ２１モノクローナル抗体またはニボルマブモノクローナル抗体の溶液に溶解させ、４℃で１時間インキュベートしてＰＢＳ−０．１％ＦＣＳ液で洗浄した後、ＦＩＴＣで標識されたヒツジ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社製、１：２００）を入れ、４℃で１時間インキュベートし、さらにＰＢＳ−０．１％ＦＣＳ液で洗浄した後、サンプルをフローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００ ＭＣＬ、米国Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）で検出した。

図１０Ａはニボルマブモノクローナル抗体のフローサイトメーターによる検出・分析の代表的な結果のグラフである。図１０Ａに示すように、溶解度の範囲が０．０３〜１０μｇ／ｍＬのニボルマブモノクローナル抗体は、いずれもＣＨＯ／ＰＤ−１細胞と結合し、結合の蛍光強度（ＭＦＩ）はニボルマブモノクローナル抗体の溶解度と正の相関がある。

図１０ＢはｈＡｂ２１モノクローナル抗体のフローサイトメーターによる検出・分析の代表的な結果のグラフである。図１０Ｂに示すように、溶解度の範囲が０．０３〜１０μｇ／ｍＬのｈＡｂ２１モノクローナル抗体もいずれも（ＣＨＯ／ＰＤ−１）細胞と結合し、結合の蛍光強度（ＭＦＩ）はｈＡｂ２１モノクローナル抗体の溶解度と正の相関がある。

図１０Ｃはフローサイトメーターによる検出・分析の結果から作成された平均蛍光強度（ＭＦＩ）とｈＡｂ２１モノクローナル抗体またはニボルマブモノクローナル抗体の溶解度グラフであり、図１０Ｃに示すように、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体群のサンプルのＣＨＯ−ＰＤ−１細胞との結合の蛍光強度は、ニボルマブモノクローナル抗体群のサンプルよりも有意に強かった。

実施例１４ フローサイトメーターによるｈＡｂ２１モノクローナル抗体およびニボルマブとＰＨＡによって活性化されたヒトＪｕｒｋａｔＴ細胞の結合の検出・分析

本実施例において、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体またはニボルマブモノクローナル抗体を一次抗体とし、ＦＩＴＣ蛍光で標識されたヒツジ抗ヒトＩｇＧを二次抗体とし、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体またはニボルマブとＰＨＡによって活性化されたヒトＪｕｒｋａｔＴ細胞の結合の検出・分析と比較に使用した。

そのため、まずヒトＪｕｒｋａｔＴ細胞株（中国科学院上海生命科学院細胞寄託センター）を濃度が３μｇ／ｍＬのリンパ球活性化因子−フィトヘマグルチニンＰＨＡ（Ｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、米国Ｓｉｇｍａ社製）を含むＲＰＭＩ−１０％ＦＣＳ培養液で培養することによって、ＪｕｒｋａｔＴ細胞を活性化してＰＤ−１タンパク質の発現を誘導した。ＰＨＡによる活性化・誘導から２４〜４８時間後、細胞を遠心分離した後、異なる溶解度（０．１〜３μｇ／ｍＬ）のｈＡｂ２１モノクローナル抗体またはニボルマブモノクローナル抗体を含むサンプル溶液に再溶解させ、同時に最終溶解度がμｇ／ｍＬのヒトＩｇＧを含む溶液を陰性対照サンプルとし、４℃で１時間インキュベートしてＰＢＳ−０．１％ＦＣＳ液で洗浄した後、ＦＩＴＣで標識されたヒツジ抗ヒトＩｇＧ（米国Ｓｉｇｍａ社製、１：２００）を入れ、４℃で１時間インキュベートし、さらにＰＢＳ−０．１％ＦＣＳ液で洗浄した後、サンプルをフローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００ ＭＣＬ、米国Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）で検出した。

図１１はｈＡｂ２１モノクローナル抗体（右）およびニボルマブ（左）のフローサイトメーターによる検出・分析の結果のグラフである。図に示すように、陰性対照ＩｇＧサンプルと比較して、溶解度１〜３μｇ／ｍＬの範囲で、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体およびニボルマブはいずれもＰＨＡによって活性化されたＪｕｒｋａｔ細胞との結合が検出されたが、より低い溶解度の範囲（０．１〜０．３μｇ／ｍＬ）でも、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体とＪｕｒｋａｔ細胞の結合が検出され、ニボルマブモノクローナル抗体とＪｕｒｋａｔ細胞の結合は顕著ではなかった。

実施例１５ フローサイトメーターによるｈＡｂ２１モノクローナル抗体およびニボルマブとＰＨＡによって活性化されたヒト末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）の結合の検出・分析

本実施例において、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体またはニボルマブモノクローナル抗体を一次抗体とし、ＦＩＴＣ蛍光で標識されたヒツジ抗ヒトＩｇＧを二次抗体とし、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体またはニボルマブとＰＨＡによって活性化されたヒト末梢血由来の単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）の結合の検出・分析と比較に使用した。

そのため、まず健康なボランティア由来の末梢血の全血を一定の体積のＦｉｃｏｌ液に入れ、常温で遠心分離した後、その中の単核細胞を単離し、さらに最終濃度が３μｇ／ｍＬのリンパ球活性化因子−フィトヘマグルチニンＰＨＡ（Ｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、米国Ｓｉｇｍａ社製）を含むＲＰＭＩ−１０％ＦＣＳ培養液で培養することによって、リンパ球を活性化してＰＤ−１タンパク質の発現を誘導した。ＰＨＡによる活性化・誘導から４８〜７２時間後、細胞を遠心分離した後、異なる溶解度（０．０１５〜４μｇ／ｍＬ）のｈＡｂ２１モノクローナル抗体またはニボルマブモノクローナル抗体を含むサンプル溶液に再溶解させ、同時に最終溶解度が１μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧを含むサンプルを陰性対照とし、４℃で１時間インキュベートしてＰＢＳ−０．１％ＦＣＳ液で洗浄した後、ＦＩＴＣで標識されたヒツジ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社製、１：２００）を入れ、４℃で１時間インキュベートし、さらにＰＢＳ−０．１％ＦＣＳ液で洗浄した後、サンプルをＣｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００ ＭＣＬフローサイトメーター（米国Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）で検出した。

図１２はｈＡｂ２１モノクローナル抗体（右）およびニボルマブモノクローナル抗体（左）のフローサイトメーターによる検出・分析の結果のグラフである。図１２に示すように、陰性対照ＩｇＧサンプルと比較して、溶解度０．２５〜４．０μｇ／ｍＬの範囲で、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体およびニボルマブはいずれもＰＨＡによって活性化されたヒトＰＢＭＣ細胞との結合が検出された。

実施例１６ ＰＤ−１ヒト化マウス体内で測定されたｈＡｂ２１の抗腫瘍治療効果

ｈＡｂ２１モノクローナル抗体はマウスＰＤ−１を認識しないため、一般のマウス体内でｈＡｂ２１モノクローナル抗体の治療効果を直接測定することができない。そのため、本実施例において、特別に遺伝子工学によって改変されたＰＤ−１ヒト化マウスを使用して体内でｈＡｂ２１モノクローナル抗体の抗腫瘍治療効果を測定する一連の研究を行った。

当該動物試験の研究は２段階に分け、その第１段階の試験モデル、投与の群分けおよび試験結果の記載は以下の通りである。

第１段階の研究：
動物試験モデルと投与の群分け：
数が１×１０^６のＣ５７ＢＬ／６マウス由来のＭＣ３８結腸癌細胞（上海南方模式生物科技股分有限公司によって提供）を同じ遺伝子背景を有するＣ５７ＢＬ／６のＰＤ−１ヒト化ホモ接合体マウスの右側の背部の皮下に接種した（当該ＰＤ−１ヒト化マウスは遺伝子相同組換えの手段によって、マウスＰＤ−１遺伝子の位置に代わりにヒトのＰＤ−１遺伝子を入れることで、マウス内因性ＰＤ−１タンパク質の代わりにヒトＰＤ−１を発現する）。接種される腫瘍の体積が約米粒の大きさ（約４０〜５０ｍｍ^３、腫瘍細胞の接種から６〜７日目前後）に達した時点で、動物をランダムに以下の３群に分けた。

Ａ：生理食塩水陰性対照群（ｎ＝６、等体積の生理食塩水）
Ｂ：ペンブロリズマブ（ＭＫ３４７５）モノクローナル治療群（ｎ＝６、投与量１０ｍｇ／ｋｇ体重）
Ｃ：ｈＡｂ２１モノクローナル治療群（ｎ＝６、投与量１０ｍｇ／ｋｇ体重）

動物の群分けの当日から（すなわち腫瘍接種から６〜７日目）、１週間に２回、腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によって投与し（３〜４日おきに）、連続して４回投与した（計２週間）。その期間中、毎日動物の一般的な臨床症状を観察し、３〜４日おきに腫瘍の長径（ｍｍ）と短径（ｍｍ）および動物体重を測定した。腫瘍体積の計算式：体積（ｍｍ^３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×０．５。測定時、腫瘍体積が４０００ｍｍ^３を超えたら、被験動物に対して安楽死を実施した（ｅｕｔｈａｎｉｚｅｄ）。

動物試験結果：
図１３Ａは各群の試験動物の腫瘍の平均体積の増加の傾向であり、図１３Ｂは各群の試験動物の平均体重の増加の傾向である。

図１４Ａ、図１４Ｂおよび図１４Ｃは、それぞれ各投与群の各動物個体の体内の腫瘍体積の増加の傾向を示す図である。

下記表３−５は各投与群における各動物の腫瘍成長の測定結果である。

表３：NS対照群で処理されたマウス（ｎ＝６）における腫瘍体積（ｍｍ^３）

括弧内の数字は最初の処理からの日数である

表４：ペンブロリズマブで処理されたマウス（ｎ＝６）における腫瘍体積（ｍｍ^３）

括弧内の数字は最初の処理からの日数である

表５：ｈＡｂ２１モノクローナル抗体で処理されたマウス（ｎ＝６）における腫瘍体積（ｍｍ^３）

括弧内の数字は最初の処理からの日数である

結果は、上記表３−５、図１３Ａ、図１４Ａ、図１４Ｂおよび図１４Ｃに示すように、生理食塩水陰性対照と比較して、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体治療群またはペンブロリズマブ治療群では、投与から５〜８日後、腫瘍の成長が抑制された。

意外で喜ばしいことに、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体のＭＣ３８結腸癌移植腫瘍に対する治療効果は、ペンブロリズマブよりもはるかに優れている。ｈＡｂ２１モノクローナル抗体治療群では、２回だけ投与した後（すなわち最初の投与から８日目）、すべての被験動物（６／６）の腫瘍はいずれも収縮したか完全に消失した。４回目の投与が終わった後（最後の投与でもある）、投与を停止しても、腫瘍の成長が回復しなかった（当該実験では、腫瘍接種から５０日目、すなわち最後の投与後の３２日目まで観察した）。一方、ペンブロリズマブ治療群では、１匹だけは（１／６）３回の投与後（すなわち最初の投与から１２日目）腫瘍が収縮して消失したが、他の各動物は４回の投与治療が終わった後、いずれも腫瘍がまた成長し始め（もう１匹の動物は最初の投与から１５日目に死亡した）、腫瘍接種から４３日目に、この４匹の動物はいずれも死亡したか、安楽死させられた。

図１３Ｂは各群の試験動物の平均体重の増加の傾向である。図１３Ｂに示すように、生理食塩水陰性対照群と比較して、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体またはペンブロリズマブの投与後、被験動物の体重の増加に影響がなかった。

第２段階の研究：
研究目的、動物試験モデルと群分け
当該第２段階の研究目的は、上記ｈＡＢ２１で治療に成功したＰＤ−１ヒト化マウスは、投与を継続しない場合、改めて接種されるＭＣ３８腫瘍を拒絶するか否かを評価することである（免疫記憶機能があるか、予備的に検証した）。

動物試験モデルと群分け
試験は、以下のＣとＤの２群に分けた。

Ｃ：試験群：ｈＡＢ２１モノクローナル抗体による治療を受け、そしていずれもＭＣ３８腫瘍を完全に拒絶した上記６匹のＰＤ−１ヒト化マウスは、腫瘍が拒絶されてから約２０日後（すなわちｈＡＢ２１モノクローナル抗体の最後の投与から１０日目）、マウスのもう一方の側（左側）の皮下に改めて同数量（１×１０^６）のＭＣ３８腫瘍細胞を接種した。

Ｄ：対照群：同時に５匹の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）を選択して、左側の皮下に同数量（１×１０^６）のＭＣ３８腫瘍細胞を接種した。

２群の動物は研究期間内で何らの投与または治療も受けなかった。腫瘍接種後、６日目から毎日動物の一般的な臨床症状を観察し、３〜４日おきに腫瘍の長径（ｍｍ）と短径（ｍｍ）および動物体重を測定した。腫瘍体積の計算式：体積（ｍｍ^３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×０．５

動物試験結果：
図１５は２群の試験動物の腫瘍の平均体積の増加の傾向である。
下記表６は各群における各動物の腫瘍成長の測定結果である。

表６：野生型C57BL/6マウスまたは予めｈＡｂ２１モノクローナル抗体で処理されたヒト化PD-1マウスにおけるMC38腫瘍成長の体積（ｍｍ^３）


括弧内の数字はヒト化PD-1マウスの最初のMC38腫瘍の接種からの日数である

結果は、
表６および図１５に示すように、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス群に接種されたＭＣ３８腫瘍の成長は早かったが、ｈＡｂ２１モノクローナル抗体で治療されたＰＤ−１ヒト化マウスは、改めて接種されたＭＣ３８腫瘍が観察期間中に成長せず、接種から８〜１５日目に完全に拒絶された。この結果によって、ｈＡＢ２１で治療に成功したＰＤ−１ヒト化マウスは免疫記憶を有し、投与を継続しない場合、改めて接種されるＭＣ３８腫瘍を拒絶することができることが予備的に証明された。

実施例１６ 野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス体内で測定されたｈＡｂ２１の抗腫瘍活性
研究目的：
当該研究目的は、ヒトＰＤ−１遺伝子を発現しない野生型マウスにおいて、ｈＡＢ２１モノクローナル抗体の投与後、腫瘍が拒絶されるか否かを評価することである。
動物試験モデルと群分け：
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）の右側の皮下に数量が１×１０^６のＭＣ３８腫瘍細胞を接種し、接種される腫瘍の体積が約米粒の大きさ（約４０〜５０ｍｍ^３、腫瘍細胞接種から約６日目）に達した時点で動物をランダムに以下の２群に分けた。
Ａ：生理食塩水対照群（ｎ＝６、等体積の生理食塩水）
Ｂ：ｈＡｂ２１モノクローナル治療群（ｎ＝６、投与量１０ｍｇ／ｋｇ体重）

動物の群分けの当日から（すなわち腫瘍接種から６日目）、１週間に２回、腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によって投与し（３〜４日おきに）、連続して４回投与した（計２週間）。その期間中、毎日動物の一般的な臨床症状を観察し、３〜４日おきに腫瘍の長径（ｍｍ）と短径（ｍｍ）および動物体重を測定した。腫瘍体積の計算式：体積（ｍｍ^３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×０．５

試験結果：
図１６は２群の試験動物の腫瘍の平均体積の増加の傾向である。
下記表７は各群における各動物の腫瘍成長の測定結果である。

表７：Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスにおける腫瘍体積（ｍｍ^３）



括弧内の数字は最初の処理からの日数である

結果は、上記表７および図１６に示すように、ｈＡｂ２１モノクローナル治療群のＭＣ３８腫瘍の体積の増加の傾向は生理食塩水対照群の増加の傾向と基本的に同じである。この結果から、ヒトＰＤ−１遺伝子を発現しない野生型マウスにおいて、ｈＡＢ２１モノクローナル抗体は腫瘍の成長に有意な作用がないことが示された。

実施例１８ カニクイザルの体内におけるｈＡｂ２１モノクローナルの予備的な薬物代謝および毒理／安全性の実験評価

ｍＡＢ２１モノクローナル抗体はカニクイザルのＰＤ−１を認識して結合することが知られているため（実施例３を参照）、本実施例において、正常なカニクイザルを選択してｈＡｂ２１モノクローナル抗体を静脈内投与する予備的な薬物動態学および毒理／安全性の実験評価を行った（昭衍（蘇州）新薬研究中心有限公司に依頼した）。

試験は、２匹のオスカニクイザルを使用し、投与量が１０ｍｇ／ｋｇ体重のｈＡＢ２１モノクローナル抗体を単回静脈内投与し、投与後、異なる時点で採血し、検証されたＥＬＩＳＡ法によって血清サンプルのｈＡＢ２１モノクローナル抗体注射液の含有量を検出した。実験において、２匹のカニクイザルの投与量が１０ｍｇ／ｋｇ体重のｈＡＢ２１モノクローナル抗体を単回静脈内投与した後、動物の精神状態、行動活動などのいずれにも実験結果に影響しうる異常があるとの所見は観察されなかった。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎノンコンパートメントモデルによって投与後の各動物のｈＡＢ２１モノクローナル抗体の主な代謝動態学のパラメーターを計算し、結果は下記表８および図１７に示す。

表８ カニクイザルののｈＡｂ２１モノクローナル抗体の単回静脈内投与の薬物動態学のパラメーター


＊は動物に薬剤耐性抗体が生じて血中薬物濃度の検出に影響を及ぼした可能性があることを示す

表８および図１７に示すように、２匹のカニクイザルに１０ｍｇ／ｋｇのｈＡＢ２１モノクローナル抗体を単回静脈内投与した後、Ｃｍａｘは非常に近く、それぞれ２３４．０６および２４７．２２μｇ／ｍＬであり、体内半減期（ｔ_１／２）がそれぞれ４０２．５６ｈおよび５８．８４ｈでは、２番の動物は投与から２８日目に血中薬物濃度の数値が急激に低下し、２番の動物は投与から１７日に薬剤耐性抗体が生じ、血中薬物濃度の検出およびそのパラメーター、例えば、ｔ_１／２に影響を及ぼしたという疑いがある。

ヒトグロブリンのアミノ酸配列はヒト以外の霊長類動物（例えば、カニクイザル）の抗体タンパク質と異なるため、カニクイザルは免疫原性のヒトまたはヒト化抗体薬物を投与すると、薬剤耐性抗体（抗抗体）が生じるのは意外ではない（ｖａｎＭｅｅｒ ＰＪら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍａｂｓ ｉｎ ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｎｏｎｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｆｅｔｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．ＭＡｂｓ ２０１３；５：８１０−６）。実際、ＢＭＳ社の全ヒト化ニボルマブモノクローナル抗体薬物は、ヒト以外の霊長類動物（カニクイザル）において行われた非臨床研究でも、１ｍｇ／ｋｇ投与量群では、６匹の動物のうち５匹が、１０ｍｇ／ｋｇ投与量群では、３匹の動物のうち２匹が投与から２８日目にいずれも抗ニボルマブ抗体（中和抗体陽性を含む）が検出されたが、抗抗体の出現は動物に不利な影響がなかった（Ｗａｎｇ Ｃら：Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２０１４；２：１−１１）。

Claims (12)

1. ヒトＰＤ−１抗原とそのリガンドの結合を拮抗・阻害するモノクローナル抗体またはその誘導体であって、第一可変領域および第二可変領域を含み、ここで、前記第一可変領域は抗体軽鎖可変領域であり、その抗原相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３、配列番号４および配列番号５で示されるアミノ酸配列であり、前記第二可変領域は抗体重鎖可変領域であり、その抗原相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号８、配列番号９および配列番号１０で示されるアミノ酸配列であることを特徴とする抗体またはその誘導体。
2. 前記第一可変領域は抗体軽鎖可変領域であり、配列番号１１で示されるアミノ酸配列であり、前記第二可変領域は抗体重鎖可変領域であり、配列番号１２で示されるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１に記載の抗体またはその誘導体。
3. 前記抗体軽鎖可変領域およびヒト抗体軽鎖定常領域を含み、かつ前記抗体重鎖可変領域およびヒト抗体重鎖定常領域のヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の抗体またはその誘導体。
4. 前記ヒト抗体軽鎖定常領域は、ヒト抗体κ鎖または抗体λ鎖由来のものであり、前記ヒト抗体重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のサブタイプ由来のものであることを特徴とする請求項３に記載の抗体またはその誘導体。
5. 請求項２に記載の抗体またはその誘導体をコードするＤＮＡ分子または遺伝子であって、その抗体軽鎖可変領域は配列番号１３で示されるヌクレオチド配列であり、抗体重鎖可変領域は配列番号１４で示されるヌクレオチド配列であることを特徴とするＤＮＡ分子または遺伝子。
6. 請求項５に記載のＤＮＡ分子配列および当該配列と作用可能に連結した発現調節配列を含有することを特徴とする発現ベクター。
7. 請求項６に記載の発現ベクターで形質転換されてなることを特徴とする組み換え宿主細胞。
8. 前記組み換え宿主細胞またはその後代細胞は請求項１または２に記載の抗体またはその誘導体を発現することを特徴とする請求項７に記載の組み換え宿主細胞またはその後代細胞。
9. 薬学的有効量の請求項１または２に記載の抗体またはその誘導体と、薬学的に許容される担体とを含む薬物または薬物組成物。
10. 腫瘍を治療する薬物の製造における請求項９に記載の薬物または薬物組成物の使用。
11. 前記腫瘍は結腸癌であることを特徴とする請求項１０に記載の使用。
12. 請求項１に記載の抗体またはその誘導体を製造する方法であって、
    ａ） 請求項５に記載のＤＮＡ分子配列および当該配列と作用可能に連結した発現調節配列を含有する発現ベクターを提供する工程、
    ｂ） 工程ａ）に記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
    ｃ） 前記抗体の発現に適切な条件で、工程ｂ）で得られた宿主細胞を培養する工程、ならびに
    ｄ） アフィニティークロマトグラフィーによって宿主細胞の培養液から前記抗体を単離・精製する工程、
    を含むことを特徴とする方法。