JP2020511543A - 選択性tnfr1拮抗ペプチドsn10及び炎症性腸疾患におけるその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
選択性TNFR1拮抗ペプチドHydrostatin−SN10の合成及び検出
ポリペプチド固相合成技術によりHydrostatin−SN10を合成し、HPLC(図1)及びMS(図2)によりその純度及び分子量を分析した結果、純度>97%、分子量1250.29g/molであった。
BIAcoreによるHydrostatin−SN10とTNFR1との結合能の分析
1、ベースラインレベルに達するまで、泳動用緩衝液を10μl/minの流速でCM−5センシングチップに設けられたチャンネルに通過させた。
2、機器推奨緩衝液によりチップの各チャンネルの表面反応基を活性化した。
3、EP緩衝液でTNFR1及びTNFR2の凍結乾燥粉末を溶解し、チップの表面に包まれるように一定の濃度で試料を注入し、さらに、1mol/Lのエタノールアミンでチップをブロックした。なお、適切な再生条件を選択するために、動力学曲線を測定する前に再生条件をテストする必要がある。
4、ベースラインが安定した後、一連の濃度のポリペプチドを注入し、中間濃度のポリペプチドを1回注射し、各濃度の応答値を記録した。
MSTによるHydrostatin−SN10とTNFR1との結合能の分析
1、Hydrostatin−SN10とTNF−α、TNFR1、TNFR2との相互作用
1:1の希釈比率で一連のグラジエント濃度のHydrostatin−SN10を調製し、蛍光マーカーTNF−α/TNFR1/TNFR2 200nMとHydrostatin−SN10とを等体積で均一に混合した後、暗所で30分間インキュベートし、次いで、毛細管で適量のサンプルを取って検出し、相対蛍光値の時間軌跡及び熱泳動(Thermophoresis)の用量反応曲線を観察し、ソフトウェアNTAffinityAnalysis v2.0.2によりシミュレートして親和性KD値を計算し、特異的結合の傾向があるか否かを判断した。
1:1の希釈比率で一連のグラジエント濃度のTNF−αを調製し、蛍光マーカーTNFR1/TNFR2(200nM)とTNF−αとを等体積で均一に混合した後、暗所で30分間インキュベートし、次いで、毛細管で適量のサンプルを取って検出し、ソフトウェアによりシミュレートして陽性対照TNFR1/TNFR2及びTNF−αのKD値を求め、400nMのTNFR1と400μMのHydrostatin−SN10を等体積で混合した後、さらに一連の濃度のTNF−αと等体積で混合し、30分間インキュベートした後、毛細管で適量のサンプルを取って検出し、ソフトウェアによりシミュレートしてKD値を求めた。Hydrostatin−SN10添加前後のTNF−α飽和濃度、応答値振幅及び親和性定数KD値の変化を比較した。
図4に示すように、MST実験の結果から分かるように、Hydrostatin−SN10は、標的特異的であり、TNFR1と直接相互作用することができ、TNFR1との結合能が約2.8μMであり、TNF−α、TNFR2に結合せず、TNFR1のみに結合し、選択性を有し、TNFR1とTNF−αとの相互作用を競合的に阻害することができる。
SDラット体内のHydrostatin−SN10及びPEG−SN10の血漿半減期の検出。
Genzyme社から購入したELISAキットを用いて、製品説明書に従って測定した。ヘパリンで処理した50μL毛細管により後眼窩から血清サンプルを採取し、処理後の1min、2min、3min、5min、10min、15min、20min、30min、45min、1h、2h、4h、6h、8hに血液サンプルを収集した。2時間静置した後、サンプルを遠心分離し、得られた上澄みを検出のために−20℃で貯蔵した。
デキストラン硫酸ナトリウム誘発マウス急性結腸炎に対するHydrostatin−SN10及びPEG−SN10の作用
6−8週齢のBalb/cマウスを10匹/群でランダムに8群に分けた。正常群(normal)に処理をしなかった。モデル群(model)について、マウスの飲水に2.5%(w/v)のDSS(市販、MP社から購入、MW:36,000−50,000)を加え、結腸炎を誘発するためにモデルを7日間構築した。残りの群について、モデルを構築すると同時に、Hydrostatin−SN10ペプチド及びPEG−SN10ペプチド(400μg/kg/d)を腹腔内注射した(陰性対照群:ランダムペプチド群(400μg/kg/d));陽性対照群:スルファサラジン(SASP、400mg/kg/d)及びインフリキシマブ(IFX、5mg/kg/d))。各群マウスの体重変化を毎日記録した(図5)。Hydrostatin−SN10及びPEG−SN10は、結腸炎による体重減少を効果的に抑制できることが分かった。表2に従って疾患活動性指数(DAI)の採点を行い、結果を図6に示す。Hydrostatin−SN10及びPEG−SN10は、結腸炎マウスの下痢、便血症状を効果的に抑制することができる。モデル構築の7日後、マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、マウスの完全な結腸及び脾臓を取り出したところ、Hydrostatin−SN10及びPEG−SN10はマウスの結腸長さを顕著に改善できることを発見した(図7)。脾臓重量を測定し、脾臓指数を計算したところ、Hydrostatin−SN10及びPEG−SN10は、結腸炎による脾臓変化を効果的に抑制できることを発見した(図8)。マウス結腸組織のミエロペルオキシダーゼ(MPO)を検出したところ、Hydrostatin−SN10及びPEG−SN10は、マウス病変結腸組織中のMPOの活性を顕著に低下できることを発見した(図9);マウス血液を採取した後、2時間静置2し、上澄みを取って炎症性因子の検出を行なったところ、Hydrostatin−SN10及びPEG−SN10は、治療群のマウス血清中の炎症誘発因子TNF−α、IL−6、IL−1β、IFN−γの含有量を顕著に低減させ、炎症抑制因子IL−10の含有量が顕著に高くなることを発見した(図10)。結腸末端組織を取り、10%ホルマリンで固定し、組織切片をHE染色した後、結腸変化を観察したところ、Hydrostatin−SN10及びPEG−SN10は、DSSによる結腸病変を顕著に抑制できることを発見した(図11)。マウス結腸の組織切片中のTNF−α発現量を観察したところ、同様にHydrostatin−SN10及びPEG−SN10はマウス結腸組織の炎症程度を減軽できることを発見した(図12)。
オキサゾロン誘発マウス急性結腸炎に対するHydrostatin−SN10及びPEG−SN10の作用
オキサゾロン誘発マウス結腸炎動物モデルの構築
6−8週齢の雄性Balb/cマウスを10匹/群でランダムに8群に分けた。1日目に、マウスの背中皮膚(1.5cm×1.5cm)を剃毛し、正常群について皮膚に0.15mLのアセトン/オリーブオイル溶液(アセトン/オリーブオイルの体積比は4:1)を塗り、モデル群、SN10群の陰性対照薬群及び陽性対照薬群について皮膚に0.15mLの3%(w/v)オキサゾロン(アセトン/オリーブオイル溶液に溶解)を塗り、皮膚前感作を行なった。8日目に、4%の抱水クロラールを腹腔内注射することでマウスを麻酔した後、3.5Fのカテーテルをゆっくりと肛門からマウス結腸内に約4cm挿入し、正常群に0.1mLの50%エタノールを注入し、他の群に0.1mLの1%(w/v)オキサゾロン(50%のエタノールに溶解)を注入した後、カテーテルをゆっくり引き抜き、薬液が腸管腔内に十分に残るように、マウスを垂直で頭が下に向く姿勢に60秒保持した。浣腸後、正常群及びモデル群のマウスに0.1mLの生理食塩水を腹腔内注射し、Hydrostatin−SN10群、PEG−SN10群及びランダムペプチド群にそれぞれ0.1mLのHydrostatin−SN10、PEG−SN10及びランダムペプチド(生理食塩水に溶解)を腹腔内注射し、容量はいずれも400ug/kg/dであり、陽性薬群についてそれぞれ0.1mLスルファサラジン(強制経口)及びインフリキシマブ(生理食塩水に溶解)(腹腔内注射)を投与し、容量は、それぞれ400mg/kg/d及び5mg/kg/dであり、両方とも3日間連続投与した。
Claims (10)
- 炎症性腸疾患の治療薬の製造における選択性TNFR1拮抗ペプチドHydrostatin−SN10の使用であって、
前記選択性TNFR1拮抗ペプチドHydrostatin−SN10のコーディング遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号1に示され、前記選択性TNFR1拮抗ペプチドHydrostatin−SN10のアミノ酸配列は、配列番号2に示される、使用。 - 前記選択性TNFR1拮抗ペプチドHydrostatin−SN10の分子量は1250.29ダルトンである、請求項1に記載の使用。
- 前記炎症性腸疾患は、クローン病及び潰瘍性結腸炎を含み、
前記炎症性腸疾患の治療薬は、TNFR1を選択的に拮抗する、請求項1に記載の使用。 - 前記炎症性腸疾患の治療薬は、選択性TNFR1拮抗ペプチドHydrostatin−SN10を唯一の活性成分とするか、又は選択性TNFR1拮抗ペプチドHydrostatin−SN10を含む医薬組成物である、請求項1に記載の使用。
- mPEG2000によって修飾された選択性TNFR1拮抗ペプチドPEG−SN10であって、
前記mPEG2000のカルボキシル基は、Hydrostatin−SN10のペプチド鎖のN端にあるアスパラギン酸の遊離アミノ基に共有結合し、
前記Hydrostatin−SN10のアミノ酸配列は、配列番号2に示される、mPEG2000によって修飾された選択性TNFR1拮抗ペプチドPEG−SN10。 - 前記mPEG2000の平均分子量は2000ダルトンである、請求項5に記載のmPEG2000によって修飾された選択性TNFR1拮抗ペプチドPEG−SN10。
- 炎症性腸疾患の治療薬の製造における、請求項5又は6に記載のmPEG2000によって修飾された選択性TNFR1拮抗ペプチドPEG−SN10の使用。
- 前記炎症性腸疾患の治療薬は、PEG−SN10を唯一の活性成分とするか、又はPEG−SN10を含む医薬組成物である、請求項7に記載の使用。
- 前記医薬組成物及び薬剤学的に許容される添加剤を用いて医薬製剤を製造する、請求項4又は8に記載の使用。
- 前記医薬製剤は、錠剤、顆粒剤、分散剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤、滴丸剤、注射剤、粉末注射剤又はエアロゾル剤である、請求項9に記載の使用。
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