JP2020508973A - 核酸ライブラリーの調製方法ならびにその方法を行うための組成物及びキット - Google Patents

核酸ライブラリーの調製方法ならびにその方法を行うための組成物及びキット Download PDF

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Abstract

核酸ライブラリーの調製方法を提供する。その方法の態様は、ＲＮＡ試料を伴うテンプレートスイッチング反応を通じて作製した二本鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）から、例えば発現ライブラリー及び／または免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーを含む１つ以上のライブラリーを作製することを含む。いくつかの態様では、この方法は、単一細胞からライブラリーを調製したり、及び／または単一細胞レベルでインデックスを付加したライブラリーを調製したりすることを含む。この方法を行う際に用いる組成物及びキットも提供する。

Description

次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術の開発によって、有益なゲノム情報及びトランスクリプトーム情報を、作製した核酸ライブラリーから迅速に抽出可能になっている。ハイスループットなＮＧＳ技術（ｌｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シークエンシング、Ｒｏｃｈｅ ４５４シークエンシング、Ｉｏｎ ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｐｒｏｔｏｎ／ＰＧＭシークエンシング）及びＳＯＬｉＤシークエンシングなど）によって、それまで使われてきたサンガーシークエンシングよりも迅速かつ安価に核酸分子をシークエンシング可能になるので、これらの技術は、バイオテクノロジーと生物医学的な研究とに大変革をもたらしている。
これらの強力なシークエンシング技術では、ライブラリーの調製が特に重視される。様々な目的で、ＮＧＳ技術を用いて、良好に調製した逆転写相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーを解析できる。例えば、ライブラリーの調製手法に応じて、トランスクリプトームデータを利用して、特定の状況でアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる遺伝子を特定するための発現差解析を行うことができる。
ｃＤＮＡライブラリーは、ＮＧＳによるＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）プロファイリングにも用いることができる。ＴＣＲは、Ｔ細胞のセレクション、機能及び活性化を制御するとともに、そのＴ細胞が、どの抗原ペプチド−主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の複合体に応答するかを判断する。
各細胞においては、ＴＣＲ遺伝子の可変部セグメント、多様性セグメント及び結合セグメント（Ｖ（Ｄ）Ｊ）の体細胞組み換えから、ＴＣＲのα鎖遺伝子とβ鎖遺伝子とが導き出されるので、個体のＴＣＲレパートリーは、非常に多様性が高い。ＴＣＲのこの多様性をプロファイリングすると、免疫レパートリーダイナミクスに対する理解が促進され、免疫応答の性質と免疫障害の病態との知識が深まる。上記のような知見により、急速に進歩しているイムノオンコロジー分野を含む様々な療法が進化する。
核酸ライブラリーの調製方法を提供する。この方法の態様は、ＲＮＡ試料を伴うテンプレートスイッチング反応を通じて作製した二本鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）から、例えば発現ライブラリー及び／または免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーを含む１つ以上のライブラリーを作製することを含む。いくつかの態様では、この方法は、単一細胞からライブラリーを調製したり、及び／または単一細胞レベルでインデックスを付加したライブラリーを調製したりすることを含む。この方法を行う際に用いる組成物及びキットも提供する。
本開示の実施形態に従って、単一のＲＮＡ試料から２つの核酸ライブラリーを調製する方法の概略図を示している。 本開示の実施形態に従って、単一のＲＮＡ試料から発現ライブラリーと免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーとを調製する方法の概略図を示している。 テンプレートスイッチング反応を用いて、産物二本鎖核酸を作製する概略図を示している。 ライブラリーの調製法でタグメンテーションを使用する例であって、本開示の方法での使用に適合できる例を示している。 本開示の実施形態に従って、遺伝子発現差解析とＴＣＲプロファイリングとを複合する際に用いるライブラリーを作製する際に用いるプロセス全体を示す全体概略図を示している。 本明細書に示されている関連実施例で説明されているように、単一Ｔ細胞からＴＣＲプロファイリング用ライブラリーを調製する際に用いるプロセス全体を示す全体概略図を示している。 図６に示されている実施例に関連するように、９６ウェルプレートにおけるインデックス付与オリゴの分布と試料のプールとを図示している。 免疫細胞プロファイリングワークフローの性能を試験したデータを示しており、単一のＪｕｒｋａｔ細胞または単一細胞当量のＪｕｒｋａｔ ＲＮＡのいずれかから作製したシークエンシングリードのうち、ＴＣＲ−α ＣＲＤ３領域またはＴＣＲ−β ＣＤＲ３領域にマッピングされたシークエンシングリードの割合（％）を示している。 免疫細胞プロファイリングワークフローの性能を試験したさらなるデータを示しており、予想されるＪｕｒｋａｔクロノタイプにマッピングされたシークエンシングリードの割合（％）を示している。 マルチサンプルナノディスペンサー（ＭＳＮＤ）形態で試験した単一細胞ＴＣＲプロファイリングワークフローの全体概略図を示している。 単一のＪｕｒｋａｔ細胞由来のシークエンシングリードであって、ＴＣＲ−αまたはＴＣＲ−βのＣＤＲ３領域にマッピングされたシークエンシングリードのアラインメント解析の結果を示している。 本発明の実施形態に従って、マルチサンプルナノディスペンサー（ＭＳＮＤ）形態で試験した単一細胞ＴＣＲプロファイリングワークフローの全体的な詳細を示している。 本発明の実施形態に従って、マルチサンプルナノディスペンサー（ＭＳＮＤ）形態で試験した単一細胞ＴＣＲプロファイリングワークフローの全体的な詳細を示している。 本発明の実施形態に従って、マルチサンプルナノディスペンサー（ＭＳＮＤ）形態で試験した単一細胞ＴＣＲプロファイリングワークフローの全体的な詳細を示している。 本発明の実施形態に従って、マルチサンプルナノディスペンサー（ＭＳＮＤ）形態で試験した単一細胞ＴＣＲプロファイリングワークフローの全体的な詳細を示している。 下記の実験部分に説明されているように、図１２Ａ〜１２Ｄのプロトコールを用いて作製した免疫細胞レセプターシークエンシングライブラリー由来のαレセプターリードカウントとβレセプターリードカウントとを示している。 下記の実験部分に説明されているように、図１２Ａ〜１２Ｄのプロトコールを用いて作製した分割ＷＴＡライブラリー由来の例示的なデータを示している。遺伝子本体のカバレッジデータを示しており、Ｘ軸は、全遺伝子にわたる正規化カバレッジであり、Ｙ軸は、マッピングされた全エキソンリードである。図には、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の一例が示されている。 下記の実験部分に説明されているように、図１２Ａ〜１２Ｄのプロトコールを用いて作製した分割ＷＴＡライブラリー由来の例示的なデータを示している。主要成分解析を示しており、図１３に示されているように、ＴＡＬＬ、ＣＣＲＦ及び処理（ＰＭＡ）ＣＣＲＦ細胞由来の５’ＤＥライブラリーからマッピングされたリードである（矢印は、別々の群を示している）。
本明細書で使用する場合、「ハイブリダイゼーション条件」という用語は、プライマーまたはその他のポリヌクレオチドが、標的核酸の領域のうち、そのプライマーまたはその他のポリヌクレオチドとある程度の相補性を有する領域に特異的にハイブリダイズする条件を意味する。プライマーが標的核酸に特異的にハイブリダイズするか否かは、そのポリマーと標的核酸との相補性の程度、ハイブリダイゼーションが行われる温度（そのプライマーの融解温度（ＴＭ）によって明らかにできる）などの因子によって決まる。融解温度とは、プライマーと標的核酸との二本鎖の半数がハイブリダイズしたままであり、その二本鎖の半数が一本鎖に解離する温度を指す。二本鎖のＴｍは、実験によって求めても、Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃ含量）−（６０／Ｎ）という式（式中、Ｎは鎖長であり、［Ｎａ＋］は１Ｍ未満である）を用いて予測してもよい。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎ．Ｙ．，Ｃｈ．１０）を参照されたい。様々なパラメーターに左右される、さらに進化した他のモデルを用いて、様々なハイブリダイゼーション条件に応じた、プライマー／標的二本鎖のＴｍを予測してもよい。特異的核酸ハイブリダイゼーションを行うためのアプローチは、例えばＴｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，ｐａｒｔ Ｉ，ｃｈａｐｔｅｒ ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ，”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９９３）に見ることができる。
「相補的な」及び「相補性」という用語は、本明細書で使用する場合、標的核酸の全体または領域（例えば、産物核酸の領域）への非共有結合によって塩基対形成するヌクレオチド配列を指す。カノニカルなワトソン・クリック塩基対形成では、ＤＮＡにおいて、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と塩基対を形成し、グアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と塩基対を形成する。ＲＮＡでは、チミンは、ウラシル（Ｕ）に置き換えられる。したがって、Ａは、Ｔと相補的であり、Ｇは、Ｃと相補的である。ＲＮＡでは、Ａは、Ｕと相補的であり、Ｕは、Ａと相補的である。典型的には、「相補的な」とは、少なくとも部分的に相補的であるヌクレオチド配列を指す。「相補的」という用語には、一方の鎖のすべてのヌクレオチドが、対応する位置において、もう一方の鎖のすべてのヌクレオチドと相補的であるように、完全に相補的である二本鎖も含まれる。特定のケースでは、ヌクレオチド配列は、標的と部分的に相補的であってよく、この場合、すべてのヌクレオチドが、すべての対応する位置において、標的核酸のすべてのヌクレオチドと相補的であるわけではない。例えば、プライマーは、標的核酸と完全に（すなわち１００％）相補的であってもよく、あるいは、プライマーと標的核酸は、完全ではない、ある程度の相補性（例えば、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９９％）を有してよい。
２つのヌクレオチド配列の同一性（％）は、最適に比較する目的でそれらの配列をアラインメントすることによって求めることができる（例えば、最適なアラインメントのために、第１の配列の配列にギャップを導入することができる）。そして、対応する位置のヌクレオチドを比較するのだが、２つの配列の同一性（％）は、それらの配列が共有している同一の位置の数から導き出す（すなわち、同一性（％）＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。一方の配列のある位置が、もう一方の配列における対応する位置と同じヌクレオチドによって占められているときには、その分子は、その位置において同一である。このような数学的なアルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５８７７（１９９３）に記載されている。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３８９−３４０２（１９９７）に記載されているように、ＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴのプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴとのプログラムを用いるときには、各プログラム（例えばＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。一態様では、配列比較のためのパラメーターは、スコア＝１００、ワード長＝１２に設定することができ、あるいは、変更することができる（例えば、ワード長＝５またはワード長＝２０）。
ドメインとは、複数のヌクレオチドで構成されている、核酸の伸長部分または長さ部分であって、明確な機能をその核酸に付与する伸長部分または長さ部分を指す。ドメインの例としては、バーコード付きユニークモレキュラーアイデンティファイアー（ＢＵＭＩ）ドメイン、プライマー結合ドメイン、ハイブリダイゼーションドメイン、バーコードドメイン（ソースバーコードドメインなど）、ユニークモレキュラーアイデンティファイアー（ＵＭＩ）ドメイン、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）アダプタードメイン、ＮＧＳインデックス付与ドメインなどが挙げられる。いくつかのケースでは、「ドメイン」及び「領域」という用語は、同義的に用いられている場合があり、例えば、免疫レセプター鎖のドメイン／領域（例えば、免疫レセプター定常ドメイン／定常領域など）を説明している場合が挙げられる。ある所定のドメインの長さは、様々であってよいが、いくつかのケースでは、その長さは、２〜１００ｎｔ（５〜５０ｎｔなど）、例えば５〜３０ｎｔの範囲である。
核酸ライブラリーの調製方法を提供する。この方法の態様は、ＲＮＡ試料を伴うテンプレートスイッチング反応を通じて作製した二本鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）から、例えば発現ライブラリー及び／または免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーを含む１つ以上のライブラリーを作製することを含む。いくつかの態様では、この方法は、単一細胞からライブラリーを調製したり、及び／または単一細胞レベルでインデックスを付加したライブラリーを調製したりすることを含む。この方法を行う際に使用する組成物及びキットも提供する。
本開示の方法をさらに詳細に説明する前に、本開示の方法は、記載されている特定的な実施形態に限定せず、すなわち、当然ながら変化し得ることを理解されたい。本開示の方法の範囲は、添付の請求項によってのみ限定されることになるので、本明細書で使用されている専門用語は、特定的な実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定するようには意図されていないことも理解されたい。
値の範囲が示されている場合、文脈上明らかに別に解される場合を除き、その範囲の下限の１／１０の単位まで、その範囲の上限及び下限の間の各値と、その示されている範囲におけるいずれかのその他の示されている値または間にある値とが、本開示の方法に含まれることが分かる。これらのさらに狭い範囲の上限及び下限は独立して、その狭い範囲に含めてよく、また、これらは、示されている範囲内のいずれかの具体的に除外された制限に従うことを条件として、本開示の方法に含まれる。示されている範囲に、１つまたは両方の極限値が含まれる場合、それらの含まれる極限値のいずれかまたは両方を除外した範囲も、本開示の方法に含まれる。
本明細書では、特定の範囲は、「約」という用語が付された数値で示されている。「約」という用語は、本明細書では、その用語が付された正確な数と、その用語が付された値に近いかまたはその数と近似である数とを文字通り網羅する目的で用いられている。数が、具体的に示されている数に近いか、または近似であるかを判断する際には、示されていない数のうち、近いか、または近似である数は、その数が示されている文脈において、具体的に示されている数と実質的に均等なものが得られる数であってよい。
別段の定めがない限り、本明細書で用いられている技術用語及び科学用語はいずれも、本開示の方法が属する分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本開示の方法を実施または試験する際には、本明細書に記載されている方法と類似または同等のいずれの方法も用いることができるが、以下では、代表的な実例となる方法と材料とを記載する。
本明細書に引用されている公報及び特許はいずれも、参照により、個々の公報または特許がそれぞれ、参照により援用されることが具体的かつ個別に示されているかのように本明細書に援用されるとともに、参照により、その公報が引用されていることと関連する方法及び／または材料を開示及び説明する目的で、本明細書に援用される。いずれの公報の引用も、出願日前のその開示内容に対するものであり、本発明の方法が、先行発明によるそのような公報に先行する権利を与えられないことを認めるものと解釈すべきではない。さらに、示されている公開日は、実際の公開日と異なることがあり、実際の公開日は、独立して確認する必要がある場合もある。
本明細書と、添付の請求項で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、文脈上明らかに別に解される場合を除き、複数の言及物が含まれることに留意する。さらに、請求項は、いずれかの任意の要素を除外して書かれていることがあることに留意する。したがって、この記述は、クレーム要素の列挙に関連して、「もっぱら」、「〜のみ」などのような排他的な用語を使用したり、または「否定的な」制限を使用したりする際、基礎となる先行詞としての役割を果たすように意図されている。
本開示の方法の特定の特徴のうち、明確にするために、別々の実施形態との関連で説明されている特徴を、１つの実施形態において組み合わせてもたらしてもよいことは明らかである。逆に、本開示の方法の特徴のうち、簡潔にするために、１つの実施形態との関連で説明されている様々な特徴を、別々にまたはいずれかの好適なサブコンビネーションでもたらしてもよい。実施形態を組み合わせたものはいずれも、本発明に明確に含まれ、すべての組み合わせが、個別かつ明示的に開示されているかのように、そのような組み合わせに、実施可能なプロセス及び／または器具／システム／キットが含まれる範囲において、本明細書に開示されている。加えて、実施形態に列挙されているサブコンビネーションであって、その変動要素を説明しているすべてのサブコンビネーションも、本発明の方法に明確に含まれ、このようなあらゆるサブコンビネーションが本明細書に個別かつ明示的に開示されているかのように、本明細書に開示されている。
本開示を読めば、当業者には明らかになるように、本明細書に記載及び例示されている個々の実施形態にはそれぞれ、別個の成分と特徴とがあり、これらは、本発明の方法の範囲または趣旨から逸脱しなければ、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特徴から容易に切り離したり、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特徴と組み合わせたりできる。示されているいずれの方法も、示されている事象の順序、または論理的に可能であるいずれかの他の順序で行うことができる。
方法
上記で概説したように、１つ以上の核酸ライブラリーの調製方法を提供する。１つのライブラリーまたは複数のライブラリーを単一のＲＮＡ試料から調製してよい。例えば、いくつかのケースでは、１つの免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーをＲＮＡ試料から調製してよい。いくつかのケースでは、発現ライブラリーと免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーとを単一のＲＮＡ試料から調製する。
本開示の方法が、複数のライブラリーを単一の試料から調製することを含む場合には、その複数のライブラリーは、順次または同時に調製してよい。例えば、いくつかのケースでは、本開示の方法は、発現ライブラリーと免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーとを同時に調製することを含んでよい。「同時に調製する」とは、２つ以上のライブラリーを調製する際に行う１つ以上のライブラリー調製工程（例えば、増幅、末端捕捉など）を同時に行うか、または時間的に少なくとも部分的に重複して行うことを意味する。いくつかのケースでは、本開示の方法は、発現ライブラリーと免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーとを順次に調製することを含んでもよい（例えば、免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーの前に、発現ライブラリーを調製する場合、または発現ライブラリーの前に、免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーを調製する場合を含む）。「順次に調製する」とは、２つのライブラリーの調製が時間的に重ならないこと、例えば、２つのライブラリーを調製する際に行う１つ以上のライブラリー調製工程を同時に行わないことを意味する。いくつかのケースでは、ライブラリーの順次的な調製は、第１のライブラリーを完成させてから、次のライブラリーの調製を開始することを含んでよい。したがって、いくつかのケースでは、ライブラリーの同時調製は、第１のライブラリーの調製が完了する前に、第２のライブラリーを調製することを含んでよい。
順次または同時に調製するとき、複数のライブラリーを単一のＲＮＡ試料から調製する場合には、本開示の方法は、産物二本鎖ｃＤＮＡをＲＮＡ試料から作製し、その後、作製した産物二本鎖ｃＤＮＡを第１の反応混合物と第２の反応混合物とに分割することを含んでよい。例えば、図１に概説されているように、ＲＮＡ試料（１００）をテンプレートスイッチング反応で用いて、二本鎖ｃＤＮＡ（１０１）をそのＲＮＡ試料から作製してよい。続いて、図示されているように、作製した二本鎖ｃＤＮＡ（所望に応じて、増幅されていてもされていなくてもよい）を例えば２つの反応物に分割し、その後、第１のライブラリー（１０２）と第２のライブラリー（１０３）とを作製することに用いてよい。いくつかの実施形態では、図２に示されているように、分割した二本鎖ｃＤＮＡを含む複数の反応混合物を用いて、発現ライブラリー（２００）と免疫細胞レセプターレパートリーライブラリー（２０１）とを作製してよい。したがって、所望に応じて、このような分割反応混合物を別々に用いて、複数のライブラリーを作製してよい（例えば、第１の反応混合物を用いて、発現ライブラリーを作製し、第２の反応混合物を用いて、免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーを作製する場合を含む）。
作製した産物二本鎖ｃＤＮＡの分割は、均等または不均等に行って、第１の反応混合物と第２の反応混合物とに、作製した産物二本鎖ｃＤＮＡが均等量または不均等量入るようにしてよい。例えば、いくつかのケースでは、発現ライブラリーの作製に用いる反応混合物には、免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーの作製に用いる反応混合物に入れる分割産物二本鎖ｃＤＮＡの量よりも多い分割産物二本鎖ｃＤＮＡを入れてよい。いくつかのケースでは、発現ライブラリーの作製に用いる反応混合物には、免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーの作製に用いる反応混合物に入れる分割産物二本鎖ｃＤＮＡの量よりも少ない分割産物二本鎖ｃＤＮＡを入れてよい。いくつかのケースでは、発現ライブラリーの作製に用いる反応混合物には、免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーの作製に用いる反応混合物に入れる分割産物二本鎖ｃＤＮＡの量と同じ量の分割産物二本鎖ｃＤＮＡを入れてよい。
産物二本鎖ｃＤＮＡは、上記のように、２つの反応混合物に分割してよいが、産物二本鎖ｃＤＮＡの分割は必ずしも、２つの反応混合物に分割することに限らず、いくつかのケースでは、産物二本鎖ｃＤＮＡは、２つ超の反応混合物に分割してよい。例えば、いくつかのケースでは、産物二本鎖ｃＤＮＡは、３つ以上の反応混合物に分割してよい。産物二本鎖ｃＤＮＡを２つ超の反応混合物に分割することは、様々な目的で用いてよい（例えば、３つ以上のライブラリーを産物二本鎖ｃＤＮＡ（単一のＲＮＡ試料から作製した産物二本鎖ｃＤＮＡを含む）から作製してよい場合が挙げられるが、これに限らない）。
本発明の方法では、作製した産物二本鎖ｃＤＮＡを異なる反応混合物に分割するいずれかの利便的な方法を用いてよい。例えば、いくつかのケースでは、産物二本鎖ｃＤＮＡは、手作業で、例えば、産物二本鎖ｃＤＮＡのアリコートを反応混合物に手作業でピペッティングすることによって、反応混合物に分割してよい。いくつかのケースでは、産物二本鎖ｃＤＮＡは、自動的に、例えば、産物二本鎖ｃＤＮＡのアリコートを反応混合物に分注するようにプログラムした液体処理ロボットまたは他の自動装置を用いることを通じて、反応混合物に分割してよい。いくつかのケースでは、本開示の方法は、個々のライブラリーの作製に用いる反応混合物に分割する前に、例えばプレ増幅ＰＣＲ工程を通じて、産物二本鎖ｃＤＮＡをプレ増幅することを含んでよい。
いくつかのケースでは、個別に調製した反応混合物は、さらなる処理の前にプールしてよく、したがって、その実施方法は、プール工程を含んでよい。例えば、いくつかのケースでは、個別に調製した産物二本鎖ｃＤＮＡは、１つ以上のライブラリーの調製前にプールしてもよい。いくつかのケースでは、調製した産物二本鎖ｃＤＮＡは、例えば、上記のように、２つ以上のライブラリーを調製するために、産物二本鎖ｃＤＮＡを別々の反応物に分割する前にプールしてよい。別々の単一のＲＮＡ試料（例えば、複数の細胞から調製した単一のＲＮＡ試料、または単一細胞から調製した単一のＲＮＡ試料を含む）から個別に調製した反応物をプールしてもよい。いずれかの利便的なプール方法を用いてよい（例えば、反応物の全体積を合わせてプールする場合、または反応物の一部の体積を合わせてプールする場合を含む）。いくつかのケースでは、個別の反応は、個別の容器またはウェル（例えば、マルチウェルプレートのウェル）で行ってよく、容器のウェルの反応混合物は、１つの容器またはウェルにプールしてよい。
いくつかのケースでは、個別の反応で作製してからプールした核酸は、プール後に個別の核酸反応源を遡って同定可能にする同定用核酸配列を含むか、またはその同定用核酸配列を含むように改変してよい。有用な同定用核酸配列としては例えば、以下にさらに詳細に説明されているようなバーコード核酸配列とインデックス付与配列とが挙げられる。
上述のように、産物二本鎖ｃＤＮＡをＲＮＡ試料から作製した後に、１つ以上のライブラリーを作製してよい。ＲＮＡ試料は、以下にさらに詳細に説明されているように、１つ以上の種類のテンプレートＲＮＡを含む試料である。ＲＮＡ試料は、細胞試料（単一細胞、または例えば２つ以上の細胞を含む細胞集団を含む細胞試料を含む）に由来するものであってよい。細胞試料は、様々な供給源に由来するものであってよく、例えば、細胞組織、生検標本、血液試料、細胞培養液などが挙げられるが、これらに限らない。加えて、細胞試料は、特定の器官、組織、腫瘍、新生物などに由来するものであってよい。さらに、原核生物または真核単細胞生物（細菌もしくは酵母を含む）の集団のようないずれかの集団から得た細胞が、本開示の方法で用いる細胞試料の供給源であることができる。しかしながら、本開示の方法が、免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーを調製することを含む場合には、概ね、真核細胞（哺乳類動物細胞を含む）をＲＮＡ試料の供給源として用いることになる。
したがって、いくつかのケースでは、本開示の方法で用いるＲＮＡ試料の供給源は、齧歯類動物（例えば、マウスまたはラット）細胞試料、ヒト以外の霊長類動物細胞試料、ヒト細胞試料などのような哺乳類動物細胞試料であってよい。いくつかのケースでは、哺乳類動物細胞試料は、哺乳類動物血液試料であってよく、例えば、齧歯類動物（例えば、マウスまたはラット）血液試料、ヒト以外の霊長類動物血液試料、ヒト血液試料などが挙げられるが、これらに限らない。
いくつかの実施形態では、有用な細胞試料としては、１つ以上の免疫細胞種を含む試料を挙げてよい。本明細書で使用する場合、「免疫細胞」という用語には概して、骨髄で産生される造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する白血球細胞（白血球）が含まれる。「免疫細胞」としては、例えば、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）と、骨髄由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）が挙げられる。「Ｔ細胞」には、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及びγδＴ細胞を含むＣＤ３発現免疫細胞のあらゆる種類が含まれる。「細胞傷害性細胞」には、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び好中球が含まれ、これらの細胞は、細胞傷害応答を媒介できる。
いくつかのケースでは、本明細書に記載されている方法で用いるＲＮＡ試料は、免疫細胞の集団に由来することになり、例えば、免疫細胞の混合集団、Ｔ細胞の集団、Ｂ細胞の集団などが挙げられるが、これらに限らない。いくつかのケースでは、本明細書に記載されている方法で用いるＲＮＡ試料は、単一の免疫細胞に由来することになり、例えば、単一のＴ細胞、単一のＢ細胞などが挙げられるが、これらに限らない。
ライブラリー
上述のように、本開示の方法で作製するライブラリーは、作製した産物二本鎖ｃＤＮＡから作製してよい。「産物二本鎖ｃＤＮＡ」とは概して、逆転写反応から作製した、テンプレート核酸の相補体を含む二本鎖ＤＮＡを意味する。産物二本鎖ｃＤＮＡは、逆転写反応を用いて、テンプレートＲＮＡから作製してよく、この場合、例えばｍＲＮＡテンプレートを含むいずれかのＲＮＡテンプレートを用いてよい。したがって、提供する方法は、逆転写反応（以下にさらに詳細に説明されているテンプレートスイッチング逆転写反応など）の使用を通じて、ＲＮＡ試料に存在するテンプレートＲＮＡから産物二本鎖ｃＤＮＡを作製することを含んでよい。
いくつかのケースでは、本開示の方法は、複数のライブラリー、例えば複数の発現ライブラリー、複数の免疫細胞レセプターレパートリーライブラリー、これらを組み合わせたものなどを複数の単一細胞から調製することを含む。例えば、いくつかのケースでは、複数の個別のＲＮＡ試料はそれぞれ、単一細胞（例えば個別の免疫細胞を含む）に由来するものであってよく、その個別のＲＮＡ試料を産物二本鎖ｃＤＮＡの調製に用いて、その後、複数のライブラリーの作製に用いてよい。複数のライブラリーを作製する場合、ライブラリーの調製の際に用いる成分（例えば産物二本鎖ｃＤＮＡ）またはライブラリー自体は、プールしてもしなくてもよい。上述されているとともに、以下にさらに詳細に説明されているように、ライブラリーまたはライブラリーの調製成分をプールする場合には、それらの核酸は、特定のライブラリー成分またはその配列の供給源を遡って同定する際に使用できる同定用ノンテンプレート核酸配列を含んでよい。このような遡及的同定は、例えばデマルチプレックスを通じて行ってよい。
いくつかの実施形態では、本開示の方法の態様は、発現ライブラリーを調製することを含む。「発現ライブラリー」とは、細胞試料（例えば、単一細胞試料、または細胞の集団を含む試料を含む）の核酸発現を評価する際に有用な核酸ライブラリーを意味する。発現ライブラリーの調製は、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）用の発現ライブラリーを調製することを含んでよい（ＮＧＳ発現ライブラリーをＲＮＡ試料から調製する場合を含む）。
本明細書に記載されているようにして作製するＮＧＳライブラリーは、その核酸メンバーの末端に、該当するシークエンシングプラットフォームを用いるシークエンシングに有用な部分的または完全なシークエンシングプラットフォームアダプター配列が含まれているライブラリーである。該当するシークエンシングプラットフォームとしては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）のＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）及びＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）シークエンシングシステム、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）のＩｏｎ ＰＧＭ（商標）及びＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）シークエンシングシステム、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＰＡＣＢＩＯ ＲＳ ＩＩ Ｓｅｑｕｅｌシステム、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）のＳＯＬｉＤシークエンシングシステム、Ｒｏｃｈｅの４５４ ＧＳ ＦＬＸ＋及びＧＳ Ｊｕｎｉｏｒシークエンシングシステム、Ｏｘｆｏｒｄ ＮａｎｏｐｏｒｅのＭｉｎＩＯＮ（商標）システム、または該当するいずれかの他のシークエンシングプラットフォームが挙げられるが、これらに限らない。
上記のように、本開示の方法は、産物二本鎖ｃＤＮＡをＲＮＡ試料から作製することを含み、作製したその産物二本鎖ｃＤＮＡは、２つ以上の反応混合物に分割してよく、その１つを用いて、発現ライブラリーを調製してよい。調製した発現ライブラリーは、完全長発現ライブラリーまたは非完全長発現ライブラリーであってよい。「完全長発現ライブラリー」とは、そのライブラリーの核酸メンバーが、逆転写してそのｃＤＮＡを作る際のテンプレートとした完全長ＲＮＡメンバーに対応する完全長ｃＤＮＡ配列を含むことを意味する。例えば、個別のライブラリーメンバーが、ｍＲＮＡの完全長ｃＤＮＡである場合、その完全長ｃＤＮＡは、そのｍＲＮＡのコード配列の全体、例えば、スプライシングｍＲＮＡコード配列の全体、すなわち、ｍＲＮＡの５’キャップとポリ（Ａ）テールとの間のｍＲＮＡコード配列の全体を含むことになる。完全長ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡの１つ以上の非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えば、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲに対応する配列を含んでも含まなくてもよい。
調製した発現ライブラリーは、いくつかのケースでは、対象とするＲＮＡ分子の末端を捕捉するように特異的に調製したライブラリーであってよい。このようなライブラリーは、本明細書では、「末端捕捉型」ライブラリーと称することもあり、あるいは、そのメンバーは、末端捕捉型核酸と称することもある。末端捕捉型ライブラリーは、別々に３’末端捕捉法または５’末端捕捉法が行われる核酸を含み、それらの核酸に対しては、３’末端捕捉法と５’末端捕捉法の両方を行う。末端捕捉法では、末端増幅プライマーを利用してよい。本明細書で使用する場合、「末端増幅プライマー」という用語は概して、増幅対象の二本鎖ＤＮＡに導入した末端から増幅するために、ＰＣＲ反応で使用する核酸プライマーを指す。末端増幅プライマーが結合する二本鎖ＤＮＡに導入する末端は概して、その二本鎖ＤＮＡの元々の末端ではなく（例えば、元々の５’末端（例えば、逆転写したＲＮＡの元々の５’末端に対応する元々の５’末端）ではないか、または元々の３’末端（例えば、逆転写したＲＮＡの元々の３’末端に対応する元々の３’末端）ではなく）、新たに導入した末端、例えば、断片化及び／またはライゲーション反応の生成物として作製した末端であってよい。
したがって、特定の実施形態では、発現ライブラリーの調製方法は、末端捕捉法である。末端捕捉法は、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ転写産物）のシークエンシング及び／または定量、例えば発現差解析に用いてよい。末端捕捉法では、タグメンテーション反応を利用してよく、その反応では、対象となる二本鎖ＤＮＡを断片化し、合成配列（例えば、本明細書に記載されているノンテンプレート配列のうちの１つ以上など）を含む所望のオリゴヌクレオチドに、作製した断片をライゲーションする。タグメンテーションは、この断片化とライゲーションとを媒介するトランスポザーゼを用いることを通じて行ってよい。
特定の実施形態では、末端捕捉法では、ＲＮＡの３’末端を捕捉し、例えば、末端捕捉は、第１鎖ｃＤＮＡプライマーにおける増幅プライマー結合部位と、タグメンテーションによって導入した５’タグメンテーション後ＰＣＲプライマー結合部位の存在によって促す。別の実施形態にあって、末端捕捉法では、ＲＮＡの５’末端を捕捉し、例えば、末端捕捉は、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドにおける増幅プライマー結合部位と、タグメンテーションによって導入した３’タグメンテーション後ＰＣＲプライマー結合部位との存在によって促す。
末端捕捉発現ライブラリーの調製方法の例が、図４に模式的に示されている。この方法は、テンプレートｍＲＮＡと、第１鎖ｃＤＮＡの隣接領域にそれぞれハイブリダイズしたテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドとを含む二本鎖の産物核酸（図示なし）を生成するために十分な条件下で、ＲＮＡ試料と、ＰＣＲプライマー結合ドメインを含む第１鎖ｃＤＮＡプライマーと、３’ハイブリダイゼーションドメイン及び５’の第２のＰＣＲプライマー結合ドメインを含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドと、逆転写酵素（図示なし）と、ｄＮＴＰ（図示なし）とを反応混合物において混ぜ合わせることを含む。この例では、ＲＮＡ試料は、ｍＲＮＡ（ポリＡ＋）テンプレートを含み、第１鎖ｃＤＮＡプライマーは、オリゴｄＴ３’ハイブリダイゼーションドメインと、バーコードと、シークエンシングアダプタードメイン（この例では、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｒｅａｄ Ｐｒｉｍｅｒ２配列）と、第１のＰＣＲプライマー結合ドメイン（この例では、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標）Ｐｒｉｍｅｒ ＩＩＡと結合するドメイン）と、ブロッキング修飾部（黒星）とを含む。第１鎖合成の際、逆転写酵素は、テンプレートｍＲＮＡから、ＬＮＡを含む３’ハイブリダイゼーションドメインと５’ドメイン（第２のＰＣＲプライマー結合ドメインを含む）とを含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド（この例では、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ ｖ４テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド）にテンプレートスイッチする。この例では、第２のＰＣＲプライマー結合ドメイン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標）Ｐｒｉｍｅｒ ＩＩＡと結合するドメイン）は、第１のＰＣＲプライマー結合ドメインと同じである。第１鎖合成後、ブロックされているＣｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標）Ｐｒｉｍｅｒ ＩＩＡを用いて、そのｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅して、産物二本鎖ｃＤＮＡ（図４における標識「二本鎖ｃＤＮＡ」）を作製する。
図４に示されている例では、産物二本鎖ｃＤＮＡの作製は、参照のために、ダウンストリームの増幅及びシークエンシングで用いるプライマー結合ドメインとバーコード配列を特定しやすいように図示されている。以下にさらに詳細に説明されているように、提供する方法で用いるタグメンテーションでは、図４に示されているものとは、各種要素（例えばノンテンプレート配列）の有無と位置とが異なる場合がある。例えば、図４の概略図では、３’末端捕捉が示されているが、本開示の方法の様々な工程の成分は、５’末端捕捉用に、容易に再編成できる。加えて、上記のように、提供する方法は概して、産物二本鎖ｃＤＮＡを作製してから、タグメンテーションの前に、作製した二本鎖ｃＤＮＡを反応混合物に分割することを含んでもよい。タグメンテーション反応を伴う、ライブラリーの作製についてのさらなる説明は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５１９８９号に示されており、この出願の開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
作製する発現ライブラリーは、所望の複雑度（例えば、高い複雑度）を示してよい。発現ライブラリーの「複雑度」は、ライブラリーのシークエンシングによって得られるリダンダントなシークエンシングリード（例えば、同一の開始部位を共有しているリード）の割合に関するものである。複雑度は、リダンダントなシークエンシングリードの割合と逆相関する。複雑度が低いライブラリーでは、特定の標的配列は過剰に示されるが、他の標的（例えば、低レベルで発現するｍＲＮＡ）は、カバレッジが低いかまたは０になる難点がある。複雑度が高いライブラリーでは、シークエンシングリードは、出発核酸試料における標的核酸の既知の分布とかなり近似し、例えば、出発試料に比較的低レベルで存在することが知られている標的（例えば、低レベルで発現するｍＲＮＡ）のカバレッジが得られることになる。特定の実施形態によると、提供する方法に従って作製される発現ライブラリーの複雑度は、出発核酸試料（例えばＲＮＡ試料）における異なる種の標的核酸（例えば、異なる種のｍＲＮＡ）の７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上について、シークエンシングリードが作製されるようになるものである。ライブラリーの複雑度は、そのシークエンシングリードを参照ゲノムまたはトランスクリプトーム（例えば、特定の細胞種）にマッピングすることによって求めてよい。Ｄａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０（４）：３２５−３２７に記載されているアプローチを含め、シークエンシングライブラリーの複雑度を求めるための具体的なアプローチが開発されている。
特定の実施形態では、提供する方法はさらに、調製した発現ライブラリーに対して、ＮＧＳプロトコールを行うことを含む。このプロトコールは、いずれかの好適なＮＧＳシークエンシングプラットフォームで行ってよい。該当するＮＧＳシークエンシングプラットフォームとしては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）から供給されているシークエンシングプラットフォーム（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）及び／またはＮｅｘｔＳｅｑ（商標）シークエンシングシステム）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）から供給されているシークエンシングプラットフォーム（例えば、Ｉｏｎ ＰＧＭ（商標）及び／またはＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）シークエンシングシステム）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから供給されているシークエンシングプラットフォーム（例えば、ＰＡＣＢＩＯ ＲＳ ＩＩ Ｓｅｑｕｅｌシークエンシングシステム）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）から供給されているシークエンシングプラットフォーム（例えばＳＯＬｉＤシークエンシングシステム）、Ｒｏｃｈｅから供給されているシークエンシングプラットフォーム（例えば、４５４ ＧＳ ＦＬＸ＋及び／またはＧＳ Ｊｕｎｉｏｒシークエンシングシステム）、あるいは該当するいずれかの他のシークエンシングプラットフォームが挙げられるが、これらに限らない。ＮＧＳプロトコールは、用いる特定のＮＧＳシークエンシングシステムに応じて変化することになる。ＮＧＳライブラリーをシークエンシングするための詳細なプロトコール（例えば、さらなる増幅（例えば、固相増幅）と、そのアンプリコンをシークエンシングすることと、シークエンシングデータを解析することとを含んでよい）は、用いるＮＧＳシークエンシングシステムのメーカーから入手可能である。
特定の実施形態では、本開示の方法を用いて、該当するシークエンシングプラットフォーム（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）、Ｒｏｃｈｅなどから供給されているシークエンシングプラットフォーム）でのダウンストリームのシークエンシング用に、ｍＲＮＡに対応する発現ライブラリーを作製してよい。特定の実施形態によると、本開示の方法を用いて、該当するシークエンシングプラットフォームでのダウンストリームのシークエンシング用に、ポリアデニル化されていないＲＮＡに対応するＮＧＳライブラリーを作製してよい。例えば、本明細書の別の箇所に記載されているように、マイクロＲＮＡをポリアデニル化してから、テンプレートスイッチポリマー化反応におけるテンプレートとして用いてもよい。研究者の目的に応じて、ランダムなプライミングまたは遺伝子特異的なプライミングを用いてもよい。このライブラリーは、コントロールライブラリー（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）のＰｈｉＸコントロールライブラリー）と５０：５０で混合して、シークエンシングプラットフォーム（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シークエンシングシステム）でシークエンシングしてよい。コントロールライブラリー配列を除去して、残った配列を、ｍＲＮＡの供給源（例えば、ヒト、マウスまたはいずれかの他のｍＲＮＡ供給源）のトランスクリプトームにマッピングしてよい。
調製した発現ライブラリーは、様々なダウンストリーム解析で用いてよく、いくつかのケースでは、ライブラリーの調製は、所望の種類のダウンストリーム解析用に特別に再構成してよい。例えば、いくつかのケースでは、調製した発現ライブラリーに対して、ｍＲＮＡの解析と、ノンコーディングＲＮＡ（例えばｓｎＲＮＡ及びｓｎｏＲＮＡ）のような、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡ種の解析とを含む全トランスクリプトーム解析（ＷＴＡ）を行ってよい。したがって、いくつかのケースでは、ライブラリーの調製は、トランスクリプトームにおけるｍＲＮＡ以外のＲＮＡを解析できるように、例えば、ポリ（Ａ）テールへのハイブリダイゼーションに依存しないプライマー（例えばランダムプライマー）を用いることによって、またはテーリング反応を加えることによって、例えば、産物二本鎖ｃＤＮＡの作製前に、天然においてポリアデニル化されないＲＮＡ種にポリ（Ａ）テールを付加することによって、特別に構成してよい。
いくつかのケースでは、ライブラリー、例えばＷＴＡ用のライブラリーの調製は、試料及び／またはライブラリー中のリボソームＲＮＡの量を低減する工程を含んでよい。選択的除去のために、無用なリボソームＲＮＡを低減及び／または除去するいずれかの利便的な方法を用いてよく、例えば、アフィニティー精製の利用、夾雑核酸の分解（例えば、ＲｉｂｏＧｏｎｅ（商標）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）と、米国特許第９，４２８，７９４号及び米国特許出願公開第２０１５／０２２５７７３Ａ１号（これらの開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）に記載されている方法の利用）と、これらを組み合わせたものなどが挙げられる。
特定の実施形態では、調製した発現ライブラリーは、１つ以上の遺伝子の発現差解析（例えば、相対的な発現量（すなわち、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）を求める場合を含む）で用いてよい。発現差は、定性的に求めても、定量的に求めてもよく、このような解析は、トランスクリプトームワイドであっても、ターゲット解析であってもよい。したがって、本開示の発現差解析で評価する発現転写産物の数は、変動することになる。いくつかのケースでは、発現差解析では、対象ゲノムにおける発現転写産物の５０％以上（例えば、対象ゲノムの発現転写産物の６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上または本質的にすべてが挙げられるが、これらに限らない）を評価してよい。ターゲット発現差解析としては、転写産物のサブセットまたは特定のカテゴリーのみの解析を挙げてよい。ターゲット発現解析の限定的な対象としてよい転写産物カテゴリーは、変動することになり、そのカテゴリーとしては、例えば、免疫遺伝子転写産物を挙げてよいが、これに限らない。
免疫遺伝子の有用なカテゴリー及びサブカテゴリーには概して、免疫系の機能と、病原体に対する有効な防御とを担う遺伝子群が含まれ、例えば、免疫系プロセスと関連がある遺伝子（遺伝子オントロジー（ＧＯ）アクセッション番号ＧＯ：０００２３７６によって特定される遺伝子（ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇにおいてオンライで入手可能））が挙げられるが、これらに限らず、このような遺伝子としては例えば、Ｂ細胞媒介免疫、Ｂ細胞セレクション、Ｔ細胞媒介免疫、Ｔ細胞セレクション、免疫応答の活性化、抗原の処理と提示、粘膜関連リンパ組織における抗原サンプリング、好塩基球媒介免疫、好酸球媒介免疫、血球分化、血球増殖、免疫エフェクタープロセス、免疫応答、免疫系の惹起、免疫記憶プロセス、白血球活性化、白血球ホメオスタシス、白血球媒介免疫、白血球遊走、リンパ球共刺激、リンパ球媒介免疫、マスト細胞媒介免疫、骨髄系細胞ホメオスタシス、骨髄性白血球媒介免疫、ナチュラルキラー細胞媒介免疫、免疫系プロセスの負の調節、好中球媒介免疫、免疫系プロセスの正の調節、免疫応答のメディエーター分子の産生、免疫系プロセスの調節、免疫レセプターの体細胞レベルでの多様化、寛容性誘導などと関連のある遺伝子が挙げられるが、これらに限らない。該当する具体的な遺伝子としては、サイトカイン、インターロイキン、インターロイキンレセプター、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＰＤ−１などが挙げられるが、これらに限らない。
上記で概説したように、いくつかの実施形態では、本開示の方法は、免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーをＲＮＡ試料から調製することを含む。本開示の方法の態様は、ＲＮＡ試料から作製した産物二本鎖ｃＤＮＡから、免疫細胞特異的ｃＤＮＡを増幅して、免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーを作製することを含む。「免疫細胞レセプターレパートリーライブラリー」とは概して、細胞または細胞集団の１種類以上の免疫レセプターの完全長配列または部分配列を含む核酸ライブラリーを意味する。例えば、免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーは、単一細胞において、または単一細胞試料、単一の対象もしくは細胞試料集団（例えば、２人以上の対象に由来する試料集団を含む）に由来する細胞集団において作製してよい。いくつかのケースでは、本開示のライブラリーは、個別の単一細胞から作製してよく、同定用核酸配列を付加した後、プールしてよい。
上述のように、免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーのメンバーは、長さが様々であってよく、完全長であっても、完全長未満であってもよい。いくつかのケースでは、本開示のライブラリーのメンバーは優先的には、免疫細胞レセプターの５’末端を含むことになる。該当する免疫細胞レセプターとしては例えば、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）とＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）とが挙げられるが、これらに限らない。
いくつかのケースでは、免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーとして、ＴＣＲレパートリーライブラリーを挙げてよい。ＴＣＲ複合体は、ジスルフィド結合による膜アンカー型ヘテロダイマータンパク質であって、通常、Ｔ細胞の表面に発現し、ＣＤ３鎖分子との複合体の一部として発現する可変性が高いアルファ（α）鎖及びベータ（β）鎖からなるタンパク質である。ヘテロダイマーαβ型またはヘテロダイマーγδ型に、多くのネイティブＴＣＲが存在する。ヘテロダイマーαβ型における完全内因性ＴＣＲ複合体は、８本の鎖、すなわち、アルファ鎖（本明細書では、ＴＣＲαまたはＴＣＲアルファという）、ベータ鎖（本明細書では、ＴＣＲβまたはＴＣＲベータという）、デルタ鎖、ガンマ鎖、２本のエプシロン鎖及び２本のゼータ鎖を含む。アルファＴＣＲ鎖とベータＴＣＲ鎖とは、可変（Ｖ）領域及び定常（Ｃ）領域を含む。ＴＣＲの多様性は、遺伝子組み換え（アルファ鎖のＶＪ組み換えと、ベータ鎖のＶＤＪ組み換え）に起因し、この組み換えによって、抗原（すなわちペプチド／ＭＨＣ）認識にとって重要である交差部区域が生じる。
いくつかのケースでは、ＴＣＲレパートリーライブラリーは、ＴＣＲ−α鎖配列、ＴＣＲ−β鎖配列またはＴＣＲ−α鎖配列及びＴＣＲ−β鎖配列の両方を含んでよい。本開示のＴＣＲレパートリーライブラリーのＴＣＲ鎖配列は、完全長ＴＣＲ鎖配列（例えば、完全長ＴＣＲアルファ鎖配列、完全長ＴＣＲベータ鎖配列）または部分ＴＣＲ鎖配列（例えば、部分長ＴＣＲアルファ鎖配列、部分長ＴＣＲベータ鎖配列）を含んでよい。
本開示のＴＣＲレパートリーライブラリーメンバーが、部分ＴＣＲ鎖配列を含む場合、その部分ＴＣＲ鎖配列は、ＴＣＲ鎖可変領域（例えば、ＴＣＲアルファ鎖可変領域、ＴＣＲベータ鎖可変領域）の全体または本質的に全体を含んでよい。いくつかのケースでは、得られるライブラリーメンバーは、ＴＣＲ可変領域と、ＴＣＲ定常領域の少なくとも一部とを含む。いくつかのケースでは、得られるライブラリーメンバーは、ＴＣＲアルファ及び／またはベータ鎖５’ｍＲＮＡ末端に対応する配列を含む。いくつかのケースでは、得られるライブラリーメンバーは、対応する鎖定常領域の少なくとも一部に対するＴＣＲアルファまたはベータ鎖５’末端に由来する配列を含む。
特定の実施形態では、免疫細胞特異的ライブラリーの調製は、ＴＣＲ特異的増幅を含んでよい。このようなＴＣＲ特異的増幅では、ＴＣＲ特異的プライマーを用いてよい。「ＴＣＲ特異的プライマー」とは、ＴＣＲ鎖（例えば、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖）の核酸配列またはその相補体の領域に特異的にハイブリダイズするプライマーを意味する。いくつかのケースでは、ＴＣＲ特異的プライマーは、１種類のＴＣＲ鎖のみ、例えば、ＴＣＲアルファ鎖のみ、またはＴＣＲベータ鎖のみにハイブリダイズしてよい。いくつかのケースでは、ＴＣＲ特異的プライマーは、２種類以上のＴＣＲ鎖にハイブリダイズするように構成されていてよく、例えば、ＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖との両方にハイブリダイズするように構成されていてよい。
ＴＣＲ特異的プライマーは、ＴＣＲアルファ鎖定常領域またはその相補体に特異的にハイブリダイズするように設計されていてよい。例えば、いくつかのケースでは、ＴＣＲ特異的プライマーは、哺乳類動物ＴＣＲアルファ鎖定常領域またはその相補体（例えば、ヒトＴＣＲアルファ鎖定常領域、マウスＴＣＲアルファ鎖定常領域などを含む）にハイブリダイズしてよい。
例示的なヒトＴＣＲアルファ鎖定常領域は、
ＰＮＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳＣＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴＤＴＮＬＮＦＱＮＬＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ（配列番号０１）
というアミノ酸配列を有し、この配列は、
ＣＣＡＡＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＡＣＴＣＴＡＡＡＴＣＣＡＧＴＧＡＣＡＡＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＡＴＴＣＡＣＣＧＡＴＴＴＴＧＡＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＡＡＴＧＴＧＴＣＡＣＡＡＡＧＴＡＡＧＧＡＴＴＣＴＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＴＣＡＣＡＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＴＧＡＧＧＴＣＴＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＣＴＴＴＧＣＡＴＧＴＧＣＡＡＡＣＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＴＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＡＡＧＴＴＣＣＴＧＴＧＡＴＧＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＣＧＡＡＣＣＴＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＧＴＧＡＴＴＧＧＧＴＴＣＣＧＡＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＧＣＣＧＧＧＴＴＴＡＡＴＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＡ（配列番号０２、Ｔ細胞レセプターアルファ鎖Ｃ領域、ヒト、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ２４７８３４．１、ＡＡＯ７２２５８．１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１８４８）
という核酸配列によってコードされる。
例示的なマウスＴＣＲアルファ鎖定常領域は、
ＰＹＩＱＮＰＥＰＡＶＹＱＬＫＤＰＲＳＱＤＳＴＬＣＬＦＴＤＦＤＳＱＩＮＶＰＫＴＭＥＳＧＴＦＩＴＤＫＴＶＬＤＭＫＡＭＤＳＫＳＮＧＡＩＡＷＳＮＱＴＳＦＴＣＱＤＩＦＫＥＴＮＡＴＹＰＳＳＤＶＰＣＤＡＴＬＴＥＫＳＦＥＴＤＭＮＬＮＦＱＮＬＳＶＭＧＬＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ（配列番号０３、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１８４９）または
ＰＮＩＱＮＰＥＰＡＶＹＱＬＫＤＰＲＳＱＤＳＴＬＣＬＦＴＤＦＤＳＱＩＮＶＰＫＴＭＥＳＧＴＦＩＴＤＫＴＶＬＤＭＫＡＭＤＳＫＳＮＧＡＩＡＷＳＮＱＴＳＦＴＣＱＤＩＦＫＥＴＮＡＴＹＰＳＳＤＶＰＣＤＡＴＬＴＥＫＳＦＥＴＤＭＮＬＮＦＱＮＬＳＶＭＧＬＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ（配列番号０４、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５３２２６．１）
というアミノ酸配列を有し、これらの配列はそれぞれ、
ＣＣＡＴＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＴＣＧＧＴＣＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＣＴＣＴＧＣＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＧＡＣＴＣＣＣＡＡＡＴＣＡＡＴＧＴＧＣＣＧＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＧＴＴＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡＧＣＴＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＣＣＡＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＣＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＴＧＡＣＣＧＡＧＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＧＡＡＣＣＴＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＧＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＣＣＧＡＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＧＴＡＧＣＧＧＧＡＴＴＴＡＡＣＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＴ（配列番号０５）、
ＣＣＡＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＴＣＧＧＴＣＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＣＴＣＴＧＣＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＧＡＣＴＣＣＣＡＡＡＴＣＡＡＴＧＴＧＣＣＧＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＧＴＴＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡＧＣＴＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＣＣＡＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＣＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＴＧＡＣＣＧＡＧＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＧＡＡＣＣＴＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＧＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＣＣＧＡＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＧＴＡＧＣＧＧＧＡＴＴＴＡＡＣＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＴ（配列番号０６、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ０７６６２．１）
という核酸配列によってコードされる。
ＴＣＲ特異的プライマーは、ＴＣＲベータ鎖定常領域（例えば、ＴＣＲベータ１鎖定常領域もしくはＴＣＲベータ２鎖定常領域）またはその相補体に特異的にハイブリダイズするように設計されていてよい。例えば、いくつかのケースでは、ＴＣＲ特異的プライマーは、哺乳類動物ＴＣＲベータ鎖定常領域またはその相補体（例えば、ヒトＴＣＲベータ鎖定常領域、マウスＴＣＲベータ鎖定常領域などを含む）にハイブリダイズしてよい。
例示的なヒトＴＣＲベータ鎖１定常領域は、
ＥＤＬＮＫＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＦＴＳＶＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬＭＡＭＶＫＲＫＤＦ（配列番号０７、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１８５０、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ２５１３４．１）
というアミノ酸配列を有し、この配列は、
ＧＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＧＴＧＴＴＣＣＣＡＣＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＴＧＴＧＴＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＴＧＣＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＡＧＡＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＴＣＧＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣＧＣＴＧＴＣＡＡＧＴＣＣＡＧＴＴＣＴＡＣＧＧＧＣＴＣＴＣＧＧＡＧＡＡＴＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＴＡＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＣＧＴＣＡＣＣＣＡＧＡＴＣＧＴＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＴＡＣＣＴＣＧＧＴＧＴＣＣＴＡＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＡＧＧＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＧＣＧＣＣＣＴＴＧＴＧＴＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡＴＴＴＣ（配列番号０８、ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＦ１０１７７８．１、Ｘ００４３７．１）
という核酸配列によってコードされる。
例示的なヒトＴＣＲベータ鎖２定常領域は、
ＤＬＫＮＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＹＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＦＴＳＥＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬＭＡＭＶＫＲＫＤＳＲＧ（配列番号０９、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ５Ｂ９、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ６０６６２．１）
というアミノ酸配列を有し、この配列は、
ＧＡＣＣＴＧＡＡＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＣＣＡＣＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＴＧＴＧＴＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＡＴＧＣＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＡＧＡＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＴＣＧＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣＧＣＴＧＴＣＡＡＧＴＣＣＡＧＴＴＣＴＡＣＧＧＧＣＴＣＴＣＧＧＡＧＡＡＴＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＴＡＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＣＧＴＣＡＣＣＣＡＧＡＴＣＧＴＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＴＴＡＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＴＴＧＣＴＡＧＧＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＴＴＧＴＡＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＧＴＧＣＣＣＴＣＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡＴＴＣＣＡＧＡＧＧＣＴＡＧ（配列番号１０、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ３４７４０．１）
という核酸配列によってコードされる。
例示的なマウスＴＣＲベータ鎖１定常領域は、
ＥＤＬＲＮＶＴＰＰＫＶＳＬＦＥＰＳＫＡＥＩＡＮＫＱＫＡＴＬＶＣＬＡＲＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＡＹＫＥＳＮＹＳＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＨＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＨＧＬＳＥＥＤＫＷＰＥＧＳＰＫＰＶＴＱＮＩＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＩＴＳＡＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＴＬＶＶＭＡＭＶＫＲＫＮＳ（配列番号１１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１８５２）
というアミノ酸配列を有し、この配列は、
ＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＧＡＡＡＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＴＧＴＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＡＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＴＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＧＧＣＴＡＣＣＣＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＧＧＡＣＣＣＴＣＡＧＧＣＣＴＡＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＴＡＴＡＧＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＣＡＡＴＣＣＴＣＧＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣＧＣＴＧＣＣＡＡＧＴＧＣＡＧＴＴＣＣＡＴＧＧＧＣＴＴＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＧＴＧＧＣＣＡＧＡＧＧＧＣＴＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＣＡＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＧＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＧＡＴＴＡＣＣＴＣＡＧＣＡＴＣＣＴＡＴＣＡＡＣＡＡＧＧＧＧＴＣＴＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＴＣＡＧＴＡＣＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＣＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡ（配列番号１２、ＧｅｎＢａｎｋ：ＦＪ１８８４０８．１）
という核酸配列によってコードされる。
例示的なマウスＴＣＲベータ鎖２定常領域は、
ＥＤＬＲＮＶＴＰＰＫＶＳＬＦＥＰＳＫＡＥＩＡＮＫＱＫＡＴＬＶＣＬＡＲＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＡＹＫＥＳＮＹＳＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＨＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＨＧＬＳＥＥＤＫＷＰＥＧＳＰＫＰＶＴＱＮＩＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＩＴＳＡＳＹＨＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＧＬＶＬＭＡＭＶＫＫＫＮＳ（配列番号１３、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１８５１）
というアミノ酸配列を有し、この配列は、
ＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＧＡＡＡＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＴＧＴＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＡＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＴＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＧＧＣＴＡＣＣＣＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＧＧＡＣＣＣＴＣＡＧＧＣＣＴＡＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＴＡＴＡＧＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＣＡＡＴＣＣＴＣＧＡＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣＧＣＴＧＣＣＡＡＧＴＧＣＡＧＴＴＣＣＡＴＧＧＧＣＴＴＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＧＴＧＧＣＣＡＧＡＧＧＧＣＴＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＣＡＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＧＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＡＴＣＡＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＣＴＡＴＣＡＴＣＡＧＧＧＧＧＴＴＣＴＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＣＴＡＣＴＧＧＧＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＡＴＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＣＣＴＧＡ（配列番号１４、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ４６８４１．１）
という核酸配列によってコードされる。
いくつかのケースでは、免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーとしては、ＢＣＲレパートリーライブラリーを挙げてよい。ＢＣＲ複合体は、Ｂ細胞の表面に見られ、膜結合免疫グロブリン（すなわち抗体）結合部分を含み、この部分は、重鎖と軽鎖とを含み、これらの鎖はそれぞれ、定常（Ｃ）領域及び可変（Ｖ）領域を含む。ＢＣＲの免疫グロブリン鎖は、ジスルフィド架橋によって、シグナル伝達ＣＤ７９Ａ／Ｂ鎖に結合している。ＢＣＲの免疫グロブリン鎖は、様々なアイソタイプ（ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＥを含む）のものである。ＴＣＲと同様に、ＢＣＲの免疫グロブリン部分では、Ｖ（Ｄ）Ｊ組み換えが行われて、集団内において非常に高い多様性をもたらす。
いくつかのケースでは、免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーとしては、ＢＣＲレパートリーライブラリーを挙げてよく、この場合、例えば、そのＢＣＲレパートリーライブラリーは、ＢＣＲ免疫グロブリン鎖配列（例えば、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＥ鎖配列）を含んでよい。本開示のＢＣＲレパートリーライブラリーの免疫グロブリン鎖配列としては、完全長免疫グロブリン鎖配列（例えば、完全長重鎖配列、完全長軽鎖配列）または部分免疫グロブリン配列（例えば、部分重鎖配列、部分軽鎖配列）を挙げてよい。
本開示のＢＣＲレパートリーライブラリーメンバーが、部分免疫グロブリン鎖配列を含む場合、その部分免疫グロブリン鎖配列は、免疫グロブリン可変領域（例えば、免疫グロブリン軽鎖可変領域（複数可）、免疫グロブリン重鎖可変領域（複数可））の全体または本質的に全体を含んでよい。いくつかのケースでは、得られるライブラリーメンバーは、免疫グロブリン可変領域（複数可）と、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部とを含んでよい。いくつかのケースでは、得られるライブラリーメンバーは、免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖５’ｍＲＮＡ末端に対応する配列を含む。いくつかのケースでは、得られるライブラリーメンバーは、対応する免疫グロブリン鎖定常領域の少なくとも一部に対する免疫グロブリン重鎖または軽鎖５’末端に由来する配列を含む。
特定の実施形態では、免疫細胞特異的ライブラリーの調製は、ＢＣＲ特異的増幅（例えば、免疫グロブリン鎖特異的増幅を含む）を含んでよい。このような免疫グロブリン特異的増幅では、免疫グロブリン特異的プライマーを用いてよい。「免疫グロブリン特異的プライマー」とは、免疫グロブリン鎖（例えば、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖）核酸配列またはその相補体の領域に特異的にハイブリダイズするプライマーを意味する。いくつかのケースでは、免疫グロブリン特異的プライマーは、１種類の免疫グロブリン鎖のみ、例えば、免疫グロブリン重鎖のみ、免疫グロブリン軽鎖のみ、ＩｇＤ鎖のみ、ＩｇＭ鎖のみ、ＩｇＡ鎖のみ、ＩｇＧ鎖のみ、ＩｇＥ鎖のみなどにハイブリダイズしてよい。
免疫グロブリン特異的プライマーは、免疫グロブリン重鎖定常領域またはその相補体に特異的にハイブリダイズするように設計されていてよい。例えば、いくつかのケースでは、免疫グロブリン特異的プライマーは、哺乳類動物免疫グロブリン重鎖定常領域またはその相補体（例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域などを含む）にハイブリダイズしてよい。
免疫グロブリン特異的プライマーは、免疫グロブリン軽鎖定常領域またはその相補体に特異的にハイブリダイズするように設計されていてよい。例えば、いくつかのケースでは、免疫グロブリン特異的プライマーは、哺乳類動物免疫グロブリン軽鎖定常領域またはその相補体（例えば、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域などを含む）にハイブリダイズしてよい。
ライブラリーの調製の際に行う増幅（例えば、免疫レセプター特異的増幅を含む）は、１ラウンドで行ってよく、あるいは、複数ラウンドの増幅を用いてもよい。例えば、いくつかのケースでは、第１ラウンドの増幅後、その第１ラウンドで用いなかった１つ以上の増幅プライマーを反応混合物に加えて、第１ラウンドの増幅の産物を核酸テンプレートとして用いて第２ラウンドの増幅を促してもよい。いくつかのケースでは、第２ラウンドまたは第３ラウンド以降（複数可）の増幅は、ネステッド増幅を伴ってもよく、すなわち、第２ラウンドまたは第３ラウンド以降（複数可）の増幅で用いるプライマー結合部位は、第１ラウンドの増幅で作製した産物の内側（すなわち、３’末端または５’末端から１つ分以上のヌクレオチド）に位置する。ネステッド増幅を用いる場合、ネスティングの程度は、所望に応じて変動することになり、例えば、第２ラウンドまたは第３ラウンド以降のプライマー結合部位が、第１ラウンドの増幅で作製したアンプリコンの３’末端または５’末端から１個分以上（２個分以上、３個分以上、４個分以上、５個分以上、６個分以上、７個分以上、８個分以上、９個分以上、１０個分以上、１５個分以上、２０個分以上など）のヌクレオチドである場合が挙げられる。
いくつかのケースでは、第２ラウンドまたは第３ラウンド以降（複数可）の増幅は、ネスティングせず、第２ラウンドの増幅において、第１ラウンドの増幅で用いた１つ以上のプライマー結合部位、または第１ラウンドの増幅の際に付加したプライマー結合部位（例えば、ノンテンプレート配列の一部として付加したプライマー結合部位）を用いる場合が挙げられる。いくつかのケースでは、第２ラウンドまたは第３ラウンド以降の増幅において、一方の末端ではネステッドプライマー増幅部位を、他方の末端では非ネステッドプライマー増幅部位（例えば、その前に用いたプライマー結合部位または付加したプライマー結合部位）を用いてよく、そのネステッド部位が、アンプリコンの３’末端またはアンプリコンの５’末端にある場合が挙げられる。
所定のライブラリー増幅工程の後、調製したライブラリーは、シークエンシングできる状態になっているとみなしてよい。特定の実施形態では、提供する方法はさらに、調製した免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーに対してＮＧＳプロトコールを行うことを含んでよい。このプロトコールは、いずれかの好適なＮＧＳシークエンシングプラットフォームで行ってよい。該当するＮＧＳシークエンシングプラットフォームとしては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）から供給されているシークエンシングプラットフォーム（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）及び／またはＮｅｘｔＳｅｑ（商標）シークエンシングシステム）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）から供給されているシークエンシングプラットフォーム（例えば、Ｉｏｎ ＰＧＭ（商標）及び／またはＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）シークエンシングシステム）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから供給されているシークエンシングプラットフォーム（例えば、ＰＡＣＢＩＯ ＲＳ ＩＩ Ｓｅｑｕｅｌシークエンシングシステム）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）から供給されているシークエンシングプラットフォーム（例えば、ＳＯＬｉＤシークエンシングシステム）、Ｒｏｃｈｅから供給されているシークエンシングプラットフォーム（例えば４５４ ＧＳ ＦＬＸ＋及び／またはＧＳ Ｊｕｎｉｏｒシークエンシングシステム）、あるいは該当するいずれかの他のシークエンシングプラットフォームが挙げられるが、これらに限らない。ＮＧＳプロトコールは、用いる特定のＮＧＳシークエンシングシステムに応じて変化することになる。ＮＧＳライブラリーをシークエンシングするための詳細なプロトコール（例えば、さらなる増幅（例えば固相増幅）、アンプリコンのシークエンシング及びシークエンシングデータの解析を含んでよい）は、用いるＮＧＳシークエンシングシステムのメーカーから入手可能である。
単一細胞、反応容器及びドロップレット
上記で概説したように、いくつかのケースでは、本明細書に記載されているように、ＲＮＡ試料を単一細胞から抽出して、１つ以上のライブラリーを作製してよい。そして、このような「単一細胞ライブラリー」は、さらなるダウンストリームアプリケーション（シークエンシングアプリケーションなど）で用いてよい。本明細書で使用する場合、「単一細胞」とは、１つの細胞を指す。テンプレートＲＮＡの供給源として有用な、及び／または単一細胞ライブラリー（発現ライブラリー及び／または免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーなど）の作製に有用な単一細胞は、該当する組織、または生検標本、血液試料もしくは細胞培養液から採取することができる。加えて、特定の器官、組織、腫瘍、新生物などに由来する細胞を採取して、本明細書に記載されている方法で用いることができる。
上記のような方法で用いる単一細胞は、いずれかの利便的な方法によって採取してよい。例えば、いくつかのケースでは、単一細胞は、細胞試料の限界希釈を通じて採取してよい。いくつかのケースでは、本開示の方法は、単一細胞を採取する工程を含んでよい。単一細胞懸濁液は、当該技術分野において知られている標準的な方法を用いて得ることができ、その方法としては、例えば、トリプシンまたはパパインを酵素的に用いて、組織試料中の細胞を結合させているタンパク質を消化するもの、培養液中で接着細胞を剥離するもの、または試料中の細胞を機械的に分離させるものが挙げられる。単一細胞は、いずれかの好適な反応容器に入れることができ、その容器内で、単一細胞を個別に処理できる。例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、またはいずれかの数（２０００個、４０００個、６０００個もしくは１００００個以上など）のウェルを有するプレートである。マルチウェルプレートは、チップ及び／または器具の一部であることができる。本開示は、マルチウェルプレートにおけるウェルの数によって限定されない。様々な実施形態では、プレートのウェルの総数は、１００〜２００，０００個または５０００〜１０，０００個である。別の実施形態では、プレートは、さらに小さいチップを含み、そのチップはそれぞれ、５，０００〜２０，０００個のウェルを含む。例えば、正方形チップは、直径０．１ｍｍのナノウェルを１７２×７２個含んでよい。
いくつかのケースでは、単一細胞は、セルソーター装置を用いて細胞試料をソーティングすることによって得てよい。「セルソーター」とは、本明細書で使用する場合、ダウンストリームプロセス（本明細書に記載されているようなライブラリー調製プロセスなど）のために、個々の細胞を適切な容器にソーティング可能にするいずれかの装置を意味する。
有用なセルソーターとしては、フローサイトメーター（蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）で用いられている装置など）が挙げられる。フローサイトメトリーは、流体培地において、異なる粒子（例えば細胞）種、すなわち、標識（波長、強度）、サイズなどが互いに異なる粒子を同定または区別するために、マルチパラメーターデータを用いる周知の手法である。試料をフローサイトメトリー解析する際には、まず、試料のアリコートをフローサイトメーターの流路に入れる。流路内で、試料中の細胞が、１つ以上の感知領域を実質的に１度に１つずつ通過すると、各細胞は、単一波長の光源（またはいくつかのケースでは、２つ以上の別々の光源）に１つずつ別々に暴露され、細胞ごとに、所望に応じて散乱及び／または蛍光パラメーターの測定値を別々に記録する。細胞ごとに記録したデータは、所望に応じて、リアルタイムで解析するか、または後で解析する際に備えて、データストレージ及び解析手段（コンピューターなど）に格納する。
フローサイトメーターを用いてソーティングする細胞は、一般的な容器（すなわち、シングルチューブ）にソーティングしてよく、あるいは、個別の容器に別々にソーティングしてもよい。例えば、いくつかのケースでは、細胞は、下記のように、マルチウェルプレートの個別のウェルにソーティングしてよい。
特定の実施形態によると、セルソーティングは、細胞の解析及び／または同定のアップストリームプロセス（表現型解析という場合もある）を含んでよい。例えば、いくつかのケースでは、細胞試料の細胞は、ＦＡＣＳソーティングによって、特定の表現型の特徴（表面マーカーの発現、生存能、形態、遺伝子の発現、サイトカインの発現など）を有するものとして特定して、その特徴に基づき、さらなる処理に備えて選択してよい。例えば、いくつかのケースでは、細胞試料の細胞は、１つ以上の免疫細胞マーカー（例えば、Ｔ細胞マーカー、Ｂ細胞マーカーなどが挙げられる）の発現に基づきソーティングして、さらなるダウンストリームプロセス用に回収してよい。一例では、Ｔ細胞は、１つ以上のＴ細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８など）の発現に基づき選択してよく、それらのＴ細胞は、さらなる処理のために回収してよい。いくつかのケースでは、（例えば、ＦＡＣＳソーティングを通じて）回収した細胞は、さらなる処理（本明細書に記載されているような、ライブラリーの調製が挙げられる）の前に、単一細胞試料に再配分してよい。
有用なセルソーターとしては、フローサイトメトリーを用いないマルチウェルベースのシステムも挙げられる。このようなマルチウェルベースのシステムとしては、いずれかの利便的な手段によって、マルチウェル容器の個別のウェルに細胞を入れることができる本質的にあらゆるシステムが挙げられる（例えば、ポアソン分布（すなわち限界希釈）統計（例えばマルチサンプルナノディスペンス（ＭＳＮＤ）システム）を用いることを通じて、（例えば、手作業で細胞を取り出すか、またはロボットアームまたはピペッターを用いて分注することを通じて）細胞を個別に入れることを含む）。いくつかのケースでは、有用なマルチウェルシステムとしては、マルチウェルウエハーまたはチップが挙げられ、この場合、細胞をウェルまたはウエハー／チップに入れて、顕微鏡解析システムによって個別に同定する。いくつかのケースでは、自動顕微鏡解析システムをマルチウェルウエハー／チップと併せて用いて、ダウンストリーム解析（本明細書に記載されているような、ライブラリーの調製を含む）を行う個別の細胞を自動的に同定してよい。
いくつかのケースでは、１つ以上の細胞を適切な反応容器にソーティングするか、または別段の形で、適切な反応容器に移してよく、このような容器としては、本明細書に記載されているようなライブラリー調製の態様の１つ以上を行うために十分な容器が挙げられる。反応成分を反応容器に加えてよく、例えば、ＲＮＡ試料を調製するための成分、産物二本鎖ｃＤＮＡを作製するための成分、１つ以上のライブラリー調製反応のための成分などが挙げられる。反応混合物とその成分とを入れることができるとともに、本開示の方法の反応を行うことができる反応容器は、様々なものがある。有用な反応容器としては、例えば、チューブ（例えば、シングルチューブ、マルチチューブストリップなど）、ウェル（例えば、マルチウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、またはいずれかの数（２０００個、４０００個、６０００個もしくは１００００個以上など）のウェルがあるプレート）のウェル）が挙げられるが、これらに限らない。マルチウェルプレートは、独立していても、チップ及び／または器具の一部であってもよい。
いくつかのケースでは、反応混合物とその成分とは、例えば、以下にさらに詳細に説明されているように、液体ドロップレット（例えば、水中油型エマルジョンドロップレット）に加えてよく、本開示の方法の反応は、液体ドロップレット（例えば、油中水型エマルジョンドロップレット）で行ってよい。ドロップレットは、個別反応容器の目的を果たすことができるが、ドロップレット（またはドロップレットを含むエマルジョン）は概して、好適な容器（例えば、チューブ、ウェルまたはマイクロ流体チャネルなど）に入れることになる。ドロップレットで行った増幅反応物は、例えば、蛍光（例えば、核酸検出試薬または標識プローブからの蛍光）に基づき、蛍光ベースのドロップレットソーターを用いてソーティングしてよい。有用な蛍光ベースのドロップレットソーターは、様々なものがあり、例えば、フローサイトメーター、マイクロ流体ベースのドロップレットソーターなどを挙げてよい。
上記のように、プール工程を含むプロトコールでは、そのプール工程は、例えば、単一細胞、ドロップレット、ウェルなどから、産物二本鎖ｃＤＮＡを作製後に行うことができる。したがって、本明細書に記載されている方法の特定の実施形態では、細胞を該当する組織（例えば血液）から得て、単一細胞懸濁液を得る。単一細胞をマルチウェルプレートのウェルの１つまたはその他の好適な容器（マイクロ流体チャンバーまたはチューブなど）に入れる。細胞を溶解し、反応成分をその溶解液に直接加える。単一細胞試料のプーリングを用いるか否かにかかわらず、作製したライブラリーをシークエンシングして、リードを作製してよい。これにより、各単一細胞で発現している遺伝子を同定可能にできる。
本明細書に記載されている方法の特定の実施形態では、ドロップレットを得て、単一ドロップレットをマルチウェルプレートのウェルの１つまたはその他の好適な容器（マイクロ流体チャンバーまたはチューブなど）にソーティングする。反応混合物をそのドロップレットに、例えば、さらなる精製を行わずに直接加えてよい。
いくつかのケースでは、本開示の方法は、単一ドロップレットを得る工程を含んでよい。ドロップレット細胞を得る作業は、いずれかの利便的なプロトコールに従って行ってよく、そのプロトコールとしては、（例えば、蛍光ベースのソーター（例えば、フローサイトメーターまたはマイクロ流体ベースのソーター）を用いて）例えばドロップレットを機械的にソーティングすることが挙げられる。単一ドロップレットを個別に処理できるいずれかの好適な反応容器に、単一ドロップレットを入れることができる。例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、またはいずれかの数（２０００個、４０００個、６０００個もしくは１００００個以上など）のウェルを持つプレートである。マルチウェルプレートは、チップ及び／または器具の一部であることができる。本開示は、マルチウェルプレートのウェルの数によって限定されない。様々な実施形態では、プレートのウェルの総数は、１００〜２００，０００個または５０００〜１０，０００個である。別の実施形態では、プレートは、さらに小さいチップを含み、そのチップはそれぞれ、５，０００〜２０，０００個のウェルを含む。例えば、正方形チップは、直径０．１ｍｍのナノウェルを７２×７２個または１２５×１２５個含んでよい。
マルチウェルプレートのウェル（例えばナノウェル）は、いずれかの利便的なサイズ、形または容積で作られていてよい。ウェルは、長さ１００μｍ〜１ｍｍ、幅１００μｍ〜１ｍｍ、深さ１００μｍ〜１ｍｍであってよい。様々な実施形態では、各ナノウェルは、アスペクト比（幅に対する深さの比）が１〜４である。一実施形態では、各ナノウェルは、アスペクト比が２である。横断面は、円形、楕円形、卵形、円錐形、長方形、三角形、多面体またはいずれかの他の形であってよい。ウェルのいずれかの所定の深さにおける横断面は、大きさと形とが様々であってもよい。
特定の実施形態では、ウェルは、容積が０．１ｎｌ〜１μｌである。ナノウェルは、容積が、１μｌ以下（５００ｎｌ以下など）であってよい。容積は、２００ｎｌ以下（１００ｎｌ以下など）であってよい。実施形態では、ナノウェルの容積は１００ｎｌである。所望の場合、ナノウェルは、容積に対する表面積の比を増大させるように作製でき、それによって、そのユニットを介した熱伝導を促して、それにより、熱サイクルのランプ時間を短縮できる。各ウェル（例えばナノウェル）の穴は、様々な形状を取っていてよい。例えば、ウェルの穴は、別々の隣接する区画を形成するように、直線または曲線状の壁によって隔てられていても、内側の環状区画と外側の環状区画とを形成するように、環状の壁で隔てられていてもよい。
１つのウェルに単一細胞または単一ドロップレットが入るように、ウェルを設計できる。個々の細胞またはドロップレットは、いずれかの他の好適な容器、例えば、マイクロ流体チャンバー、ドロップレット、ナノウェル、チューブなどで分離してよい。単一細胞またはドロップレットを操作するいずれかの利便的な方法を用いてよく、そのような方法としては、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、ロボット装置インジェクション、自然流下またはマイクロ操作、及び半自動セルピッカー（例えば、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ Ｃｏ．のＱｕｉｘｅｌｌ（商標）細胞移動システム）などの使用が挙げられる。いくつかのケースでは、ポアソン統計に従って（例えば、ウェルの約１０％、２０％、３０％または４０％以上が、単一細胞またはドロップレットを含むように（この値は、容器に分注する流体の所定の単位体積における細胞またはドロップレットの数を調整することによって定義できる））、単一細胞またはドロップレットをプレートのウェルに入れることができる。いくつかのケースでは、好適な反応容器は、ドロップレット（例えばマイクロドロップレット）を含む。個別の細胞またはドロップレットは、例えば、顕微鏡による観察によって検出可能な特徴（位置、形態、レポーター遺伝子の存在（例えば発現）、結合抗体（例えば、抗体標識）の存在、ＦＩＳＨ、ＲＮＡ（例えば、細胞内ＲＮＡ標識）の存在など）またはｑＰＣＲに基づき、個別に選択できる。
例えば、上記のように、所望の細胞集団または単一細胞を得た後、細胞を溶解することによって、核酸を細胞から放出させることができる。溶解は、例えば、細胞を加熱もしくは凍結融解することによって、界面活性剤もしくはその他の化学的方法を用いることによって、またはこれらを組み合わせることによって行うことができる。しかしながら、いずれかの好適な溶解方法を用いることができる。いくつかのケースでは、有益なことには、温和な溶解手順を用いて、核クロマチンの放出を防ぐことによって、ｃＤＮＡライブラリーのゲノムコンタミネーションを回避するとともに、ｍＲＮＡの分解を最小限にできる。例えば、細胞を溶解するには、細胞を７２℃で２分間、Ｔｗｅｅｎ−２０の存在下で加熱すれば十分であるとともに、核クロマチンからの検出可能なゲノムコンタミネーションが見られない。あるいは、細胞は、６５℃まで１０分間、水において（Ｅｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ６０（４）：４３９−５１（２００８））、または７０℃で９０秒間、０．５％のＮＰ−４０を添加したＰＣＲバッファーＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において（Ｋｕｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ３４（５）：ｅ４２（２００６））加熱でき、あるいは、溶解は、プロテアーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋなど）によって、またはカオトロピック塩（グアニジンイソチオシアネートなど）を用いることによって行うことができる（米国特許出願公開第２００７／０２８１３１３号）。
所望に応じて、所定の単一細胞またはドロップレットワークフローは、プール工程を含んでよく、この工程では、例えば産物二本鎖ｃＤＮＡで構成された核酸産物組成物を、１つ以上の追加の細胞またはドロップレットから得た核酸産物組成物とともに混ぜ合わせたり、またはプールしたりする。異なる細胞またはドロップレットから作製した異なる核酸産物組成物であって、このような実施形態において、混ぜ合わせたりまたはプールしたりする核酸産物組成物の数は、様々であってよく、その数は、いくつかのケースでは、２〜５０個（３〜２５個（４〜２０個を含む）、または１０，０００個以上など）の範囲である。
いくつかの実施形態では、例えばアドレス可能なナノウェルアレイの形状のマルチウェルプレートとサンプルディスペンサーとを含むマルチサンプルナノディスペンサー（ＭＳＮＤ）システムを用いる。このようなＭＳＮＤシステムの例は、ＩＣＥＬＬ８（登録商標）Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ ＭＳＮＤ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｆｅｒｇｅｎ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａ）である。ＩＣＥＬＬ８（登録商標） ＭＳＮＤシステムの詳細は、米国特許第７，８３３，７０９号及び同第８，２５２，５８１号、ならびに米国特許出願公開第２０１５／０３６２４２０号及び同第２０１６／０２４５８１３号（これらの開示内容は、参照により、本明細書に援用される）でさらに見られる。
タグメンテーション
上記で概説したように、いくつかのケースでは、提供する方法は、作製した産物二本鎖ｃＤＮＡの１つ以上の末端を末端捕捉することを含んでよい。特定の実施形態では、このような末端捕捉では、タグメンテーション反応を利用してよく、この反応では、１つ以上のタグメンテーション反応成分を用いてよい。用いるタグメンテーションプロセスは、様々なものであり、例えば、タグメンテーション反応による５’末端捕捉、タグメンテーション反応による３’末端捕捉、またはこれらを組み合わせたものを挙げてよい。
提供する方法にタグメンテーションが存在する場合、タグメンテーションで用いるトランスポソームは、トランスポザーゼとトランスポゾン核酸（トランスポゾン末端ドメイン及びタグメンテーション後ＰＣＲプライマー結合ドメインを含む）とを含んでよい。これらのドメインは機能的に定義されているので、研究者のニーズに応じて、同じ配列内のドメインであっても、異なる配列であってもよい。これらのドメインは重複していてもよく、タグメンテーション後ＰＣＲプライマー結合ドメインの一部が、トランスポゾン末端ドメインに存在するようになっていてもよい。
「トランスポザーゼ」とは、トランスポゾン末端ドメイン含有組成物（例えば、トランスポゾン、トランスポゾン末端、トランスポゾン末端組成物）と機能的複合体を形成できるとともに、インビトロ転位反応で、共にインキュベートする二本鎖標的ＤＮＡに、トランスポゾン末端含有組成物を挿入または転位をすることを触媒できる酵素を意味する。提供する方法を実施する際に有用であるトランスポザーゼとしては、Ｔｎ５トランスポザーゼ、Ｔｎ７トランスポザーゼ及びＭｕトランスポザーゼが挙げられるが、これらに限らない。トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼであってよい。別の態様では、トランスポザーゼは、そのトランスポザーゼの特性を向上させるため、例えば、そのトランスポザーゼの活性を高めるための１つ以上の改変（例えばアミノ酸置換）を含む。例えば、Ｔｎ５タンパク質に置換変異（例えば、Ｅ５４Ｋ、Ｍ５６Ａ及びＬ３７２Ｐ）を有する、Ｔｎ５トランスポザーゼの機能亢進変異体が開発されており、例えばＰｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：２０３３−２０４０に記載されている。
「トランスポゾン末端ドメイン」という用語は、トランスポザーゼまたはインビトロ転位反応における機能性を持つインテグラーゼ酵素との複合体の形成に必要であるヌクレオチド配列（「トランスポゾン末端配列」）のみからなる二本鎖ＤＮＡを意味する。トランスポゾン末端ドメインは、そのトランスポゾン末端ドメインを認識して、そのドメインに結合するトランスポザーゼまたはインテグラーゼと「複合体」、「シナプス複合体」、「トランスポソーム複合体」または「トランスポソーム組成物」を形成し、その複合体は、インビトロ転位反応においてその複合体とインキュベートする標的ＤＮＡに、そのトランスポゾン末端ドメインを挿入または転位できる。トランスポゾン末端ドメインは、「移入トランスポゾン末端配列」または「移入鎖」と、「非移入トランスポゾン末端配列」または「非移入鎖」とからなる２つの相補配列を呈する。例えば、インビトロ転位反応で活性を有する機能亢進Ｔｎ５トランスポザーゼ（例えばＥＺ−Ｔｎ５トランスポザーゼ、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡ）と複合体を形成するトランスポゾン末端ドメインの１つは、５’ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ３’（配列番号１５）という「移入トランスポゾン末端配列」を呈する移入鎖と、５’ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ３’（配列番号１６）という「非移入トランスポゾン末端配列」を呈する非移入鎖とを含む。インビトロ転位反応においては、移入鎖の３’末端が、標的ＤＮＡに接合または移入される。移入トランスポゾン末端配列と相補的であるトランスポゾン末端配列を呈する非移入鎖は、インビトロ転位反応において、標的ＤＮＡに接合または移入されない。提供する方法を実施するときに用いる特定のトランスポゾン末端ドメインの配列は、用いる特定のトランスポザーゼに応じて変化することになる。例えば、Ｔｎ５トランスポザーゼと併せて用いるときには、Ｔｎ５トランスポゾン末端ドメインをトランスポゾン核酸に含めてよい。本発明のトランスポソームで用いてよいトランスポザーゼとトランスポゾン末端ドメインに関するさらなる詳細としては、米国特許第９，０４０，２５６号、同第９，０８０，２１１号、同第９，０８０，２１１号及び同第９，１１５，３９６号（これらの開示内容は、参照により、本明細書に援用される）に記載されているものが挙げられるが、これらに限らない。
トランスポゾン末端ドメインに加えて、トランスポゾン核酸は、タグメンテーション後プライマー結合ドメインも含んでよい。いくつかのケースでは、タグメンテーション後プライマー結合ドメインは後で、（例えば、タグメンテーション後プライマー結合ドメインとハイブリダイズするとともに、シークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトドメインが結合しているプライマーを用いることを通じて）シークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトドメインを付加する増幅反応で用いてよい。いくつかのケースでは、タグメンテーション後プライマー結合ドメインは、シークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトドメインを含んでよい。
タグメンテーションまたは増幅（タグメンテーションの後に行うとともに、タグメンテーションに依存する）の際に付加するシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトドメインは、変動することになる。このようなシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトは、表面付着シークエンシングプラットフォームオリゴヌクレオチド（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シークエンシングシステムのフローセルの表面に付着しているＰ５またはＰ７オリゴヌクレオチド）に特異的に結合するドメイン（例えば「捕捉部位」または「捕捉配列」）、シークエンシングプライマー結合ドメイン（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）プラットフォームのＲｅａｄ１またはＲｅａｄ２プライマーが結合できるドメイン）、バーコードドメイン（例えば、所定の試料由来のすべての分子を特異的バーコードまたは「タグ」でマーキングすることによって、試料のマルチプレックスを可能にするように、シークエンシングしている核酸の試料供給源を一意的に同定するドメイン）、バーコードシークエンシングプライマー結合ドメイン（バーコードのシークエンシングで用いるプライマーが結合するドメイン）、分子特定ドメイン、またはこのようなドメインをいずれかに組み合わせたものから選択した核酸ドメインであってよい。
図４に示されているように、トランスポザーゼと、トランスポゾン核酸（トランスポゾン末端ドメインと第２のタグメンテーション後ＰＣＲプライマー結合ドメインとを含む）とを含むトランスポソームを用いて、産物二本鎖ｃＤＮＡに対してタグメンテーションを行う。この例では、Ｔｎ５トランスポザーゼとＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）ＴｎＲＰ１またはＴｎＲＰ２配列とを含むトランスポソームを用いる（図４）。
図４に示されている、タグメンテーションを介した例示的な末端捕捉法の様々な変形形態が可能であることが分かる。ＲＮＡの３’末端を捕捉する代わりに、例えば、この方法を用いて、ＲＮＡの５’末端を捕捉してもよい。５’末端捕捉は、例えば、タグメンテーション後ＰＣＲプライマー結合ドメイン（例えば、ＲＰ２配列）を第１鎖ｃＤＮＡプライマーに導入するのではなく、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドに導入することによって行うことができる。この変形形態に従うと、例えば、タグメンテーション工程の際に付加したＴｎＲＰ１配列またはＴｎＲＰ２配列に結合する増幅プライマーと併せて、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドに元々存在するタグメンテーション後ＰＣＲプライマー結合ドメインに結合する増幅プライマーを用いて、タグメンテーション後増幅を行うことができる。
別の変形形態では、２種類のトランスポソーム（上記の例で用いるＴｎＲＰ１トランスポソームまたはＴｎＲＰ２トランスポソームなど）を用いるのではなく、１種類のトランスポソーム（１種類のタグメンテーション後ＰＣＲプライマー結合ドメインを有するトランスポソーム）を用いることができる。所望のタグメンテーション産物の増幅は、前の工程（例えば、二本鎖の産物核酸の第１鎖合成または増幅など）で付加したタグメンテーション後ＰＣＲプライマー結合ドメインに結合するプライマーと併せて、トランスポソームによって供給される１種類のタグメンテーション後ＰＣＲプライマー結合ドメインに結合するプライマーを用いて行うことができる。
非限定的な例として、産物二本鎖ｃＤＮＡを２つの反応物に分割してから、産物二本鎖ｃＤＮＡに対してタグメンテーションを行ってよく、その結果、産物二本鎖ｃＤＮＡのタグメンテーション済み５’末端にＴｎＲＰ１配列を導入される。この例の実施形態は、図５に示されており、図５については、以下でさらに詳細に説明する。図５に示されているように、タグメンテーションによって、トランスポゾン配列（例えば「ＴｎＲＰ１」）が、捕捉済み５’産物二本鎖ｃＤＮＡの３’末端に付加される。その後の工程では、捕捉済み５’産物二本鎖ｃＤＮＡの増幅の際に、付加したトランスポゾン配列をプライマー結合部位として使用する。具体的には、図示されている例では、テンプレートスイッチング反応で付加した配列とハイブリダイズする第１のプライマー（「５’末端捕捉プライマー１」）と、「Ｔｎ Ｒｅａｄ１」配列と結合する第２のプライマー（「５’末端捕捉プライマー２」）とを用いて、捕捉済み５’産物二本鎖ｃＤＮＡを増幅する一方で、ＮＧＳ用のライブラリーの調製に必要なシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトドメインを同時に付加する。
いくつかのケースでは、例えばトランスポザーゼのヌクレアーゼ活性に起因して新たに作られた二本鎖核酸末端において、導入したトランスポゾン配列に結合するプライマーは、末端増幅プライマーという場合もある。この関連においては、このような末端増幅プライマーを用いて、タグメンテーションによって作製した末端から、例えば、該当するＲＮＡの元々の末端に向かって増幅してよい。例えば、いくつかのケースでは、増幅反応では、末端増幅プライマーと、二本鎖ｃＤＮＡの５’末端（すなわち、そのＲＮＡの元々の５’末端に対応する末端）から増幅する第２のプライマーを用いてよい。いくつかのケースでは、増幅反応では、末端増幅プライマーと、二本鎖ｃＤＮＡの３’末端（すなわち、そのＲＮＡの元々の３’末端に対応する末端）から増幅する第２のプライマーとを用いてよい。
他の変形形態としては、例えば、各種プライマー／オリゴヌクレオチド内のＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）特異的シークエンシングドメインを、例えばＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）のシークエンシングシステム（例えば、Ｉｏｎ ＰＧＭ（商標）及びＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）シークエンシングシステム）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのシークエンシングシステム（例えばＰＡＣＢＩＯ ＲＳ ＩＩシークエンシングシステム）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）のシークエンシングシステム（例えばＳＯＬｉＤシークエンシングシステム）、Ｒｏｃｈｅのシークエンシングシステム（例えば、４５４ ＧＳ ＦＬＸ＋及びＧＳ Ｊｕｎｉｏｒシークエンシングシステム）、または該当するいずれかの他のシークエンシングプラットフォームに必要なシークエンシングドメインに置き換えたものが挙げられる。
さらなる変形形態では、タグメンテーションには、１種類または２種類のトランスポソーム（上記の例で用いられているＴｎＲＰ１トランスポソームまたはＴｎＲＰ２トランスポソームなど）を用いるのではなく、３種類以上のトランスポソームを用いてよい。例えば、異なるタグメンテーション後ＰＣＲプライマー結合ドメインを有する３種類以上、４種類以上、５種類以上、６種類以上、７種類以上、８種類以上、９種類以上、１０種類以上、２０種類以上、５０種類以上または１００種類以上のトランスポソームを用いることができる。このようなタグメンテーション済み試料における目的のタグメンテーション産物は、前の工程（例えば、二本鎖の産物核酸の第１鎖の合成または増幅など）で付加したタグメンテーション後ＰＣＲプライマー結合ドメインに結合するプライマーと併せて、特定の種類のトランスポソームのタグメンテーション後ＰＣＲプライマー結合ドメインに結合するプライマーを用いて増幅してよい。
タグメンテーション工程用のトランスポソームを調製することが望ましい場合には、いずれかの好適なトランスポソーム調製アプローチを用いてよく、そのようなアプローチは、例えば、用いる具体的なトランスポザーゼとトランスポゾン核酸とに応じて変動し得る。例えば、トランスポゾン核酸及びトランスポザーゼは、好適なバッファーにおいて、好適なモル比（例えば、２：１のモル比、１：１のモル比、１：２のモル比など）で一緒にインキュベートしてよい。一実施形態によれば、トランスポザーゼがＴｎ５トランスポザーゼであるときには、トランスポソームの調製は、２×Ｔｎ５透析バッファーにおいて、トランスポザーゼとトランスポゾン核酸を１：１のモル比で十分な期間（１時間など）インキュベートすることを含んでよい。
産物二本鎖ｃＤＮＡのタグメンテーションは、タグメンテーション条件で、二本鎖ｃＤＮＡをトランスポソームと接触させることを含む。このような条件は、用いる特定のトランスポザーゼに応じて変動し得る。典型的には、その条件には、トランスポソームとタグ付き伸長産物とを緩衝化反応混合物内（例えば、トリスアセテートで緩衝化した反応混合物など）において、ｐＨ７〜８（ｐＨ７．５など）でインキュベートすることが含まれることになる。トランスポソームは、タグ付き伸長産物と比べて約等モル量または過剰なモル量のトランスポゾンで存在するように供給してよい。好適な温度としては、３２℃〜４２℃（３７℃など）が挙げられる。反応は、十分な期間（５分〜３時間など）進行させる。反応は、ＳＤＳ及び／または反応を停止させるために適するその他のトランスポザーゼ反応停止試薬を、ある量含んでよい溶液（例えば「停止」溶液）を加えることによって停止させてよい。トランスポソームを用いて核酸を断片化するためのプロトコールと材料は、入手可能であり、例えば、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡ）から入手可能なＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポソームキットで供給されているものが挙げられる。
続いて、タグメンテーション反応の際に付加した１つ以上のタグメンテーション後プライマー結合部位にハイブリダイズする１つ以上のタグメンテーション後ＰＣＲプライマーを用いて、得られたタグメンテーション済み試料をＰＣＲ増幅条件に供してよい。タグメンテーション後プライマーは、シークエンシングプラットフォームアダプタードメインを含んでよい。シークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクト（複数可）は、本明細書の他の箇所に記載されている核酸ドメイン（例えば、表面付着シークエンシングプラットフォームオリゴヌクレオチドに特異的に結合するドメイン、シークエンシングプライマー結合ドメイン、バーコードドメイン、バーコードシークエンシングプライマー結合ドメイン、分子特定ドメインまたはこれらをいずれかに組み合わせたもの）のいずれかを含んでよい。このような実施形態は、例えば、タグメンテーション済み試料の核酸が、該当するシークエンシングプラットフォームでのシークエンシングに有用または必要なアダプタードメインのすべてを含むわけではなく、タグメンテーション済み試料の核酸の増幅に用いるプライマーによって、残りのアダプタードメインを供給する場合に有用である。
テンプレートスイッチング逆転写
上記で概説したように、本開示の方法の態様は、テンプレートスイッチング逆転写反応の使用を伴ってよい。例えば、いくつかのケースでは、本開示の方法は、テンプレートスイッチング逆転写反応を用いて、産物二本鎖ｃＤＮＡを核酸試料から作製することを含んでよい。したがって、いくつかのケースでは、テンプレートスイッチング逆転写反応を用いて、二本鎖ｃＤＮＡをテンプレート核酸から作製してから、１つ以上のライブラリー（発現ライブラリー及び／または免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーなど）を調製するために別々に用いることができる別々の反応混合物に、その二本鎖ｃＤＮＡを分割してよい。
テンプレートスイッチング逆転写反応には概して、産物二本鎖ｃＤＮＡの作製元であるテンプレート核酸を伴うことになる。テンプレート核酸を作製する供給源及び／または方法は様々なものがある。テンプレート核酸は、テンプレート核酸組成物（例えば、規定の組成物）、あるいは生体試料（例えば、生物及び／または生細胞から採取したか、生物及び／または生細胞を含む試料）に存在してよい。テンプレート核酸を含む生体試料は、いずれかの利便的な手段によって調製して、その試料の核酸を、本明細書に記載されている方法の成分（例えば、プライマー、オリゴヌクレオチドなど）が利用できるようにしてよい。
テンプレート核酸を含む生体試料の調製方法は、様々なものがある。有用なプロセスとしては、例えば、試料をホモジナイズすること、試料の１つ以上の細胞種を溶解すること、試料の所望の核酸を濃縮すること、試料に存在する１つ以上の成分（例えば、タンパク質、脂質、夾雑核酸）を除去すること、核酸の単離を行って、テンプレート核酸を単離することなどを挙げてよいが、これらに限らない。いくつかのケースでは、生体試料の細胞は、試料の細胞を溶解することによって調製してよい。細胞を溶解するために有用なプロセスとしては、例えば、化学的溶解、酵素的溶解、機械的溶解、凍結／融解による溶解などが挙げられるが、これらに限らない。いくつかのケースでは、試料の細胞は、本明細書に記載されているような方法で、試料の複数の細胞または１つの細胞から得たテンプレート核酸を使用する前に、固定しなくてもよい。いくつかのケースでは、試料の細胞は、本明細書に記載されているような方法で、試料の複数の細胞または１つの細胞から得たテンプレート核酸を使用する前に、固定してよい。
本開示のテンプレート核酸は、配列が異なる別個のテンプレート核酸を複数含んでよい。テンプレート核酸（例えば、テンプレートＲＮＡ、テンプレートＤＮＡなど）は、いずれかの長さのポリマーであってよい。そのポリマーの長さは、様々であってよいが、いくつかのケースでは、このポリマーは、１０ｎｔ以上、２０ｎｔ以上、５０ｎｔ以上、１００ｎｔ以上、５００ｎｔ以上、１０００ｎｔ以上、２０００ｎｔ以上、３０００ｎｔ以上、４０００ｎｔ以上、５０００ｎｔ以上またはこれを超えるｎｔ数である。特定の態様では、テンプレート核酸はポリマーであり、そのポリマーの塩基数は様々であってよく、いくつかのケースでは、１０ｎｔ以下、２０ｎｔ以下、５０ｎｔ以下、１００ｎｔ以下、５００ｎｔ以下、１０００ｎｔ以下、２０００ｎｔ以下、３０００ｎｔ以下、４０００ｎｔ以下、５０００ｎｔ以下、１０，０００ｎｔ以下、２５，０００ｎｔ以下、５０，０００ｎｔ以下、７５，０００ｎｔ以下、１００，０００ｎｔ以下である。
特定の実施形態によると、テンプレート核酸は、テンプレートリボ核酸（テンプレートＲＮＡ）である。テンプレートＲＮＡは、いずれかのタイプのＲＮＡ（またはそのサブタイプ）であってよく、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランス作用性低分子干渉ＲＮＡ（ｔａ−ｓｉＲＮＡ）、天然低分子干渉ＲＮＡ（ｎａｔ−ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、ロングノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、トランスファー−メッセンジャーＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）、前駆メッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）、Ｃａｊａｌボディ特異的低分子ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、エンドリボヌクレアーゼ調製ｓｉＲＮＡ（ｅｓｉＲＮＡ）、一過性低分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、シグナル認識ＲＮＡ、テロメアＲＮＡ、リボザイム、またはこれらの種類のＲＮＡもしくはこれらのサブタイプをいずれかに組み合わせたものが挙げられるが、これらに限らない。
所定のテンプレート核酸組成物中の、配列の異なる別個のテンプレート核酸の数は様々であってよい。所定のテンプレート核酸組成物中の、別個のテンプレート核酸の数は様々であってよいが、いくつかのケースでは、所定のテンプレート核酸組成物中の、別個のテンプレート核酸の数は、１〜１０8 個（１〜１０7 個など（１〜１０5 個を含む））の範囲である。
上記のような方法で用いるテンプレート核酸組成物は、いずれかの好適な核酸試料であってよい。テンプレート核酸を含む核酸試料は、産物核酸を生成させるために十分な量で、反応混合物に混ぜ合わせてよい。一実施形態によれば、核酸試料は、反応混合物における核酸最終濃度が、１ｆｇ／μＬ〜１０μｇ／μＬ（１ｐｇ／μＬ〜５μｇ／μＬ、０．００１μｇ／μＬ〜２．５μｇ／μＬ、０．００５μｇ／μＬ〜１μｇ／μＬ、０．０１μｇ／μＬ〜０．５μｇ／μＬなど（０．１μｇ／μＬ〜０．２５μｇ／μＬを含む））となるように、反応混合物に混ぜ合わせる。特定の態様では、テンプレート核酸を含む核酸試料は、例えば、以下にさらに詳細に説明されているように、単一細胞から単離する。別の態様では、テンプレート核酸を含む核酸試料は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上または５００個以上の細胞から単離する。特定の実施形態によれば、テンプレート核酸を含む核酸試料は、５００個以下、１００個以下、５０個以下、２０個以下、１０個以下、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個または２個の細胞から単離する。
テンプレート核酸は、いずれかの目的核酸試料に存在してよく、その試料としては、単一細胞、複数の細胞（例えば培養細胞）、組織、器官、または生物（例えば、マウス、ラットなど）から単離した核酸試料が挙げられるが、これらに限らない。特定の態様では、核酸試料は、哺乳類動物（例えば、ヒト、齧歯類動物（例えばマウス）、またはいずれかの他の目的哺乳類動物）の細胞（複数可）、組織、器官及び／または類似のものから単離する。別の態様では、核酸試料は、哺乳類動物以外の供給源（両生類動物（例えばカエル（例えばクセノプス））、魚（ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ））または哺乳類動物以外のいずれかの他の核酸試料源など）から単離する。
このような供給源から核酸を単離するためのアプローチ、試薬及びキットは、当該技術分野において知られている。例えば、目的の供給源から核酸を単離するためのキット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）、ＮｕｃｌｅｏＭａｇ（登録商標）及びＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）というゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ単離キットなど）は、市販されている。特定の態様では、核酸は、固定生体試料、例えば、ホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から単離する。ＦＦＰＥ組織の核酸は、市販のキット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＦＦＰＥ ＤＮＡまたはＲＮＡ単離キットなど）を用いて単離してよい。
テンプレートスイッチング反応の一般的な描写が図３に示されている。示されている例では、単一産物核酸プライマー（３００）は、その単一産物核酸プライマーとテンプレートとが共有する相補的配列（「ＸＸＸＸ」によって示されている）を通じて、テンプレート核酸（３０１）にハイブリダイズする。単一産物核酸プライマーは、テンプレートと相補的でない付加配列（３０２）の領域（例えば、ノンテンプレート領域）を含んでよいが、必須ではない。単一産物核酸プライマーをテンプレートにアニーリングした後、逆転写酵素の使用によって、逆転写（３０３）が進行し、テンプレートと相補的である単一産物核酸鎖（３０４）を生成させる。ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素は、生成された単一産物核酸に、ノンテンプレートヌクレオチド（「ＹＹＹ」によって示されている）を転移し、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド（３０５）が、そのテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドに存在する相補的ヌクレオチドの配列（これも、「ＹＹＹ」によって示されており、本明細書では、３’ハイブリダイゼーションドメインともいう）によって、単一産物核酸のノンテンプレートヌクレオチドにハイブリダイズする。このテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、ノンテンプレートヌクレオチドにハイブリダイズしない付加配列（３０６）を含む。テンプレートスイッチングが行われ（３０７）、逆転写酵素がテンプレートからスイッチして、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを第２のテンプレートとして使用し、付加配列（３０６）を転写して、その相補体（３０８）を生成する。このようにして完全に生成された単一産物核酸鎖（３０９）は、テンプレートにハイブリダイズしなかったいずれかの付加配列（３０２）が存在する場合、その付加配列（３０２）を含む単一産物核酸プライマーの完全配列と、テンプレートの相補的配列と、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの相補的配列とを含む。テンプレートスイッチングに関連する方法及び試薬は、米国特許第９，４１０，１７３号にも記載されており、その開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド
テンプレートスイッチング逆転写反応では、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドを用いてよい。「テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド」とは、核酸ポリマー化反応の際に、ポリメラーゼが初期テンプレート（例えば、テンプレート核酸（例えばＲＮＡテンプレート））からスイッチする対象であるオリゴヌクレオチドテンプレートを意味する。この意味から、テンプレートは、「ドナーテンプレート」と称してよく、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、「アクセプターテンプレート」と称してよい。本明細書で使用する場合、「オリゴヌクレオチド」は、２〜５００ヌクレオチド、例えば２〜２００ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドマルチマーである。オリゴヌクレオチドは、合成したものであっても、酵素によって作製したものであってもよく、いくつかの実施形態では、１０〜５０ヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドモノマーを含んでも（すなわち、オリゴリボヌクレオチドまたは「ＲＮＡオリゴヌクレオチド」であっても）、デオキシリボヌクレオチドモノマーを含んでもよい（すなわち、オリゴデオキシリボヌクレオチドまたは「ＤＮＡオリゴヌクレオチド」であってもよい）。オリゴヌクレオチドは、例えば、１０〜２０ヌクレオチド、２１〜３０ヌクレオチド、３１〜４０ヌクレオチド、４１〜５０ヌクレオチド、５１〜６０ヌクレオチド、６１〜７０ヌクレオチド、７１〜８０ヌクレオチド、８０〜１００ヌクレオチド、１００〜１５０ヌクレオチドまたは１５０〜２００ヌクレオチド、最長で５００ヌクレオチド以上の長さであってよい。
テンプレートスイッチング逆転写反応では、好適な反応混合物を用いてよい。テンプレートスイッチング逆転写反応に適する反応混合物は、テンプレートからテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドへのポリメラーゼのテンプレートスイッチングを容易に可能にするとともに、さらに、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの付加配列が存在する場合には、そのあらゆる付加配列をテンプレートとするような、ポリメラーゼによる伸長を容易に可能にするために十分な濃度で、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドを含んでよい。例えば、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、０．０１〜１００μＭの最終濃度（０．１〜１０μＭなど、例えば０．５〜５μＭなど（１〜２μＭを含む）（例えば１．２μＭ））で反応混合物に加えてよい。
テンプレートスイッチング逆転写反応では、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、改変されているか、または別段の形で非天然のものである１つ以上のヌクレオチド（またはそのアナログ）を含んでも含まなくてもよい。例えば、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチドアナログ（例えば、ＬＮＡ、ＦＡＮＡ、２’−Ｏ−Ｍｅ ＲＮＡ、２’−フルオロＲＮＡなど）、結合改変体（例えば、ホスホロチオエート、３’−３’逆結合体、５’−５’逆結合体）、５’及び／または３’末端改変体（例えば、５’及び／または３’アミノ、ビオチン、ＤＩＧ、ホスフェート、チオール、色素、クエンチャーなど）、１つ以上の蛍光標識ヌクレオチド、あるいはテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドに所望の機能をもたらすいずれかの他の特徴を含んでよい。
特定の態様では、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、３’ハイブリダイゼーションドメインを含む。３’ハイブリダイゼーションドメインは、長さが様々であってよく、いくつかのケースでは、２〜１０ｎｔの長さ（３〜７ｎｔの長さなど）の範囲である。テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの３’ハイブリダイゼーションドメインは、テンプレートスイッチング反応の単一産物核酸（例えばｃＤＮＡ）に付加されるノンテンプレート配列と相補的である配列を含んでよい。ノンテンプレート配列とは、以下にさらに詳細に説明されているが、概して、テンプレート、例えばＲＮＡテンプレートまたはＤＮＡテンプレートに対応していないとともに、テンプレートを鋳型としていない配列を指す。ノンテンプレート配列は、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの３’ハイブリダイゼーションドメインに存在する場合、３’ハイブリダイゼーションドメイン全体またはその一部を網羅してよい。いくつかのケースでは、ノンテンプレート配列は、ヘテロポリヌクレオチドを含むか、またはヘテロポリヌクレオチドからなってもよく、このようなヘテロポリヌクレオチドは、長さが、２ｎｔから１０ｎｔまで様々であってよい（３〜７ｎｔの長さなど（３ｎｔを含む））。いくつかのケースでは、ノンテンプレート配列は、ホモポリヌクレオチドを含むか、またはホモポリヌクレオチドからなってよく、このようなホモポリヌクレオチドは、長さが、２ｎｔから１０ｎｔまで様々であってよい（３〜７ｎｔの長さなど（３ｎｔを含む））。
テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、溶液中に遊離していることも、固体支持体（例えばビーズ）に結合されていることもできる。いくつかのケースでは、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、容器（例えば、マルチウェルアレイチップ）内で乾燥している。乾燥テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、その容器に共有結合または非共有結合していることができる。
テール配列及びテーリング
いくつかのケースでは、本開示の方法は、二本鎖産物ｃＤＮＡを作製すること、及び／またはテール配列を有するテンプレート核酸のテール配列と相補的である配列を有するプライマーを用いて、そのテンプレート核酸を増幅することを含んでよい。「テール配列」という用語は、本明細書で使用する場合、概して、テンプレート核酸の３’末端に存在するポリヌクレオチド領域であって、１種類のヌクレオチド種（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔなど）で構成されている領域を指す。いくつかのケースでは、第１鎖相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）プライマーは、全体または一部において、テール配列と相補的であってよい。例えば、ｍＲＮＡテンプレートのポリ（Ａ）テールは、テール配列の非限定的な例の１つである。したがって、第１鎖ｃＤＮＡプライマーは、いくつかのケースでは、ｍＲＮＡテンプレートのポリ（Ａ）テールと相補的であるポリ（Ｔ）配列を含むか、またはそのポリ（Ｔ）配列からなってよい。
テール配列は、本開示のテンプレート核酸に天然に存在するものであっても、合成的に付加してもよい。したがって、本発明のテンプレート核酸に存在し得るテール配列の例としては、例えば、ポリ（Ａ）テール、ポリ（Ｃ）テール、ポリ（Ｇ）テール、ポリ（Ｔ）テールなどが挙げられるが、これらに限らない。テール配列は、サイズが、１０ｎｔ未満〜３００ｎｔ以上の範囲であってよく、例えば、１０〜３００ｎｔ、１０〜２００ｎｔ、１０〜１５０ｎｔ、１０〜１００ｎｔ、１０〜９０ｎｔ、１０〜８０ｎｔ、１０〜７０ｎｔ、１０〜６０ｎｔ、１０〜５０ｎｔ、１０〜４０ｎｔ、１０〜３０ｎｔ、１０〜２０ｎｔ、２０〜３００ｎｔ、２０〜２００ｎｔ、２０〜１５０ｎｔ、２０〜１００ｎｔ、２０〜９０ｎｔ、２０〜８０ｎｔ、２０〜７０ｎｔ、２０〜６０ｎｔ、２０〜５０ｎｔ、２０〜４０ｎｔ、２０〜３０ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１８ｎｔ、２０ｎｔなどが挙げられるが、これらに限らない。テンプレート核酸がテール配列を含む場合、二本鎖産物ｃＤＮＡの作製で用いるプライマー、例えば第１鎖ｃＤＮＡプライマーは、テール配列と相補的である配列を含んでよく、そのテール配列に、プライマーがハイブリダイズし、第１鎖ｃＤＮＡの伸長をプライミングする。テール配列と相補的である有用な配列は、様々なものがあり、例えば、ポリ（ｄＡ）配列、ポリ（ｄＣ）配列、ポリ（ｄＧ）配列、ポリ（ｄＴ）配列などを挙げてよいが、これらに限らない。
上述のように、テンプレート核酸に存在するテール配列は、天然のもの（例えば、ｍＲＮＡテンプレートのポリ（Ａ）テールの場合）であっても、人工的または合成的に作製してもよい。例えば、いくつかのケースでは、テール配列をテーリング反応で核酸テンプレートに付加してよい。テーリング反応は様々であり、その反応としては、例えば、酵素的プロセスを通じて、テール配列をテンプレートに付加する場合を挙げてよい。本開示の核酸テンプレートにテールを付加するために有用な酵素としては、例えば、ターミナルトランスフェラーゼ（例えば、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＲＮＡ特異的ヌクレオチジルトランスフェラーゼなど）が挙げられるが、これらに限らない。テーリング配列のヌクレオチド種は、例えば、ターミナルトランスフェラーゼを用いるテーリング反応において、所望の種類のｄＮＴＰのみ（例えば、ｄＡＴＰのみ、ｄＣＴＰのみ、ｄＧＴＰのみ、またはｄＴＴＰのみ）を利用可能にすることによって、所望に応じて制御してよい。いくつかのケースでは、「ｄＮＴＰテーリングミックス」をテーリング反応で使用し、このようなミックスは、１種類のみのｄＮＴＰ（例えばＡＴＰ）を含む。いくつかのケースでは、核酸テンプレートは、テーリング反応に備えて、例えば、核酸テンプレートに存在する３’ホスフェートを除去（脱リン酸化）することによって調製してよい。このような目的では、いずれかの利便的かつ適切なホスファターゼを用いてよく、例えば、アルカリホスファターゼ（例えば、エビ由来アルカリホスファターゼ及びその誘導体）などが挙げられるが、これらに限らない。
いくつかのケースでは、本開示の方法は、例えば、ｄＮＴＰ種の存在下、テール配列を有するテンプレート（すなわち、テール付きテンプレート）を作製するために十分な条件下で、テンプレート核酸をターミナルトランスフェラーゼと接触させることによって、テーリング反応を行って、テーリング配列をテンプレート核酸に付加することを含んでよい。ｄＮＴＰ付加率、すなわち、テール配列の長さは、３’末端とｄＮＴＰ濃度との比率と、どのｄＮＴＰを用いるかとによって導き出される。ターミナルトランスフェラーゼ反応は、ターミナルトランスフェラーゼが活性となる温度（３０℃〜５０℃など（３７℃を含む））で行う。ターミナルトランスフェラーゼ反応におけるｄＮＴＰは、０．０１ｍＭ〜１ｍＭの最終濃度（０．０５ｍＭ〜０．５ｍｍなど（０．１ｍＭを含む））で存在してよい。テンプレート核酸は、ターミナルトランスフェラーゼ反応において、０．０５〜５００ｐｍｏｌの濃度（０．５〜５０ｐｍｏｌ（１〜２５ｐｍｏｌを含む）、例えば５ｐｍｏｌなど）で存在してよい。ターミナルトランスフェラーゼバッファー溶液と、いずれかの他の有用な成分（例えば、Ｃｏのような金属補因子など）とは、また、例えば、別の溶液（例えばバッファー）として、または「ｄＮＴＰテーリングミックス」の一部として、ターミナルトランスフェラーゼ反応物に含めてよい。ターミナルトランスフェラーゼ反応により、核酸テンプレートの３’末端にヌクレオチドが付加され、その結果得られるテール付きテンプレート核酸は、その後、本開示の方法による反応のさらなる工程で用いてよい。
いくつかのケースでは、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドには、そのテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの５’末端（例えば、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの５’アダプター配列）の相補体を合成後、ポリメラーゼが、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドから、異なるテンプレート核酸にスイッチすることを防ぐ改変が含まれている。有用な改変としては、脱塩基損傷（例えば、テトラヒドロフラン誘導体）、ヌクレオチド付加物及びイソヌクレオチド塩基（例えば、イソシトシン、イソグアニン及び／または類似物）、ならびにこれらをいずれかに組み合わせたものが挙げられるが、これらに限らない。
いくつかのケースでは、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、５’アダプター配列（例えば、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの３’ハイブリダイゼーションドメインの５’の規定ヌクレオチド配列）を含んでよく、その５’アダプター配列は、ダウンストリームアプリケーションで、様々な目的を果たしてよい。いくつかのケースでは、５’アダプター配列は、増幅ｄｓＤＮＡのさらなる増幅、または例えば、ネステッド増幅もしくはサプレッション増幅のためのプライマー結合部位としての役割を果たしてよい。
プライマー
単一産物核酸プライマー（単一産物核酸合成プライマー（例えば、第１鎖ｃＤＮＡプライマー）または第１鎖プライマーともいう）は、テンプレート結合ドメインを含む。例えば、その核酸は、テンプレート核酸、例えば、ｍＲＮＡなどにハイブリダイズするように構成されている第１の（例えば３’）ドメインを含んでよく、テンプレート核酸にハイブリダイズしない第２の（例えば５’）ドメインとみなしてよい１つ以上の追加のドメイン、例えば、以下にさらに詳細に説明されているようなノンテンプレート配列ドメインを含んでも含まなくてもよい。このテンプレート結合ドメインの配列は独立して、規定のものであっても、任意のものであってもよい。特定の態様では、テンプレート結合ドメインは、規定配列、例えば、ポリｄＴまたは遺伝子特異的配列を有する。別の態様では、テンプレート結合ドメインは、任意の配列（例えば、ランダムヘキサマー配列のようなランダム配列）を有する。テンプレート結合ドメインの長さは、様々であってよいが、いくつかのケースでは、このドメインの長さは、５〜５０ｎｔ（６〜２５ｎｔなど、例えば、６〜２０ｎｔ）の範囲である。
単一産物核酸プライマーは、改変されているか、または別段の形で非天然のものである１つ以上のヌクレオチド（またはそのアナログ）を含んでも含まなくてもよい。例えば、単一産物核酸プライマーは、１つ以上のヌクレオチドアナログ（例えば、ＬＮＡ、ＦＡＮＡ、２’−Ｏ−Ｍｅ ＲＮＡ、２’−フルオロＲＮＡなど）、結合改変体（例えば、ホスホロチオエート、３’−３’逆結合体及び５’−５’逆結合体）、５’及び／または３’末端改変体（例えば、５’及び／または３’アミノ、ビオチン、ＤＩＧ、ホスフェート、チオール、色素、クエンチャーなど）、１つ以上の蛍光標識ヌクレオチド、あるいは所望の機能を単一産物核酸プライマーにもたらすいずれかの他の特徴を含んでよい。
いくつかのケースでは、単一産物核酸プライマーは、５’アダプター配列（例えば、単一産物核酸プライマーの３’ハイブリダイゼーションドメインの５’の規定ヌクレオチド配列）を含んでよく、その５’アダプター配列は、ダウンストリームアプリケーションで、様々な目的を果たしてよい。いくつかのケースでは、５’アダプター配列は、さらなる増幅、または例えば、ネステッド増幅もしくはサプレッション増幅のためのプライマー結合部位として機能してよい。
いくつかのケースでは、用いるプライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、単一産物核酸プライマー、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドなどを含む）のうちの１つ以上は、２つ以上のドメインを含んでよい。例えば、このプライマーまたはオリゴヌクレオチドは、テンプレートにハイブリダイズする第１の（例えば３’）ドメインと、テンプレートにハイブリダイズしない第２の（例えば５’）ドメインとを含んでよい。第１のドメインと第２のドメインとの配列は独立して、規定のものであっても、任意のものであってもよい。特定の態様では、第１のドメインは、規定配列を有し、第２のドメインの配列は、規定のものであるかまたは任意のものである。別の態様では、第１のドメインは、任意の配列（例えば、ランダムヘキサマー配列のようなランダム配列）を有し、第２のドメインの配列は、規定のものであるかまたは任意のものである。いくつかのケースでは、両方のドメインの配列が規定のものである。本開示の方法で用いるプライマー（例えば、単一産物核酸プライマー、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドなどを含む）は、２つ以上のドメインを含むが、そのドメインの１つ以上は、以下に説明されているようなノンテンプレート配列を含んでよい。
ポリメラーゼ
いくつかのケースでは、テンプレートスイッチング逆転写反応混合物に混ぜ合わせるポリメラーゼは、テンプレートスイッチングすることができ、そのポリメラーゼは、ポリマー化のためのテンプレートとして第１核酸鎖を用いた後、第２のテンプレート核酸鎖の３’末端にスイッチして、同じポリマー化反応を継続する。いくつかのケースでは、テンプレートスイッチングできるポリメラーゼは、逆転写酵素である。テンプレートスイッチングできる逆転写酵素であって、本開示の方法を実施するために有用である逆転写酵素としては、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、レトロプラスミド逆転写酵素、レトロン逆転写酵素、細菌逆転写酵素、グループＩＩイントロン由来逆転写酵素、ならびにこれらの変異体、バリアント、誘導体もしくは機能的断片、例えば、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型酵素またはＲＮａｓｅ Ｈ低減型酵素が挙げられるが、これらに限らない。例えば、逆転写酵素は、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴ）またはＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ逆転写酵素（例えば、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉＲ２非ＬＴＲエレメント逆転写酵素）であってよい。テンプレートスイッチングできるポリメラーゼであって、本開示の方法を実施するために有用なポリメラーゼは、市販されており、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から入手可能なＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ（商標）という逆転写酵素及びＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）という逆転写酵素が挙げられる。
本開示の方法のテンプレートスイッチング逆転写反応は、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有するポリメラーゼの使用を含んでよい。例えば、反応混合物に混ぜ合わせたポリメラーゼ（例えば、ＭＭＬＶ ＲＴのような逆転写酵素）は、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有して、新生鎖の３’末端にホモヌクレオチド領域（例えば、Ｃ−Ｃ−Ｃのようなホモトリヌクレオチド）を付加できるようになっており、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの３’ハイブリダイゼーションドメインは、新生鎖の３’末端のこの領域と相補的であるホモヌクレオチド領域（例えば、Ｇ−Ｇ−Ｇのようなホモトリヌクレオチド）を含む。別の態様では、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有するポリメラーゼが、新生鎖の３’末端にヌクレオチド領域（例えばトリヌクレオチド領域）を付加するときには、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの３’ハイブリダイゼーションドメインは、シトシンを含むヌクレオチドと、グアニンを含むヌクレオチドとを含むヘテロトリヌクレオチド（例えば、ｒ（Ｃ／Ｇ）３オリゴヌクレオチド）を含み、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドのそのヘテロトリヌクレオチド領域は、新生鎖の３’末端と相補的である。３’ハイブリダイゼーションドメインとテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドとの例は、米国特許第５，９６２，２７２号にさらに記載されており、その開示内容は、参照により、本明細書に援用される。
ターミナルトランスフェラーゼ活性を有するポリメラーゼは、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子の３’ヒドロキシル末端へのデオキシリボヌクレオチドの付加を触媒できる。特定の態様では、ポリメラーゼがテンプレートの５’末端に達すると、そのポリメラーゼは、新生鎖の３’末端に、テンプレートによってコードされない１つ以上の追加のヌクレオチドを導入できる。例えば、ポリメラーゼがターミナルトランスフェラーゼ活性を有するときには、そのポリメラーゼは、新生鎖の３’末端に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを超える数の追加のヌクレオチドを導入できてよい。そのヌクレオチドは、すべて同じであってもよく（例えば、新生鎖の３’末端に、ホモヌクレオチド領域を作製する）、またはそのヌクレオチドの１つ以上は、他のヌクレオチド（複数可）と異なっていてもよい（例えば、新生鎖の３’末端に、ヘテロヌクレオチド領域を作製する）。特定の態様では、ポリメラーゼのターミナルトランスフェラーゼ活性により、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを超える数の同じヌクレオチド（例えば、すべてｄＣＴＰ、すべてｄＧＴＰ、すべてｄＡＴＰまたはすべてｄＴＴＰ）のホモヌクレオチド領域が付加される。例えば、一実施形態によれば、ポリメラーゼは、ＭＭＬＶ逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴ）である。ＭＭＬＶ ＲＴは、新生鎖の３’末端に、追加のヌクレオチド（主にｄＣＴＰ、例えば、３つのｄＣＴＰ）を導入する。本明細書の別の箇所でさらに詳細に説明されているように、これらの追加のヌクレオチドは、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの３’ハイブリダイゼーションドメインと、新生鎖の３’末端とをハイブリダイゼーションさせて、例えば、そのポリメラーゼがテンプレートからテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドにテンプレートスイッチングすることを促すために有用であってよい。
本開示の方法で用いる逆転写酵素は、いくつかのケースでは、熱感受性ポリメラーゼ、すなわち、耐熱性ではないポリメラーゼであってよい。このような熱感受性ポリメラーゼは、その活性温度範囲を上回る温度で不活性になってよい。例えば、いくつかのケースでは、熱感受性ポリメラーゼは、７５°以上、８０°以上、８５°以上、９０°以上または９５°以上の温度に暴露後、不活性になったり、または活性を著しく低下させたりしてよい。
逆転写酵素を用いる場合、逆転写酵素は、ＲＴ反応産物を所望の量、例えば、単一産物核酸を所望の量で生成させるために十分な最終濃度となるように、反応混合物に混ぜ合わせてよい。特定の態様では、逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ ＲＴ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉＲＴなど）は、反応混合物に、０．１〜２００ユニット／μＬ（Ｕ／μＬ）（０．５〜１００Ｕ／μＬ、例えば１〜５０Ｕ／μＬなど（５〜２５Ｕ／μＬ、例えば２０Ｕ／μＬを含む））の最終濃度で存在する。
ノンテンプレート（ｎｏｎ−ｔｅｍｐｌａｔｅｄ）配列及びノンテンプレート（ｎｏｎ−ｔｅｍｐｌａｔｅ）配列
記載されている方法の態様は、いくつかのケースでは、ノンテンプレート配列の使用を含んでよい。「ノンテンプレート（ｎｏｎ−ｔｅｍｐｌａｔｅｄ）配列」と「ノンテンプレート（ｎｏｎ−ｔｅｍｐｌａｔｅ）配列」という用語は概して、本開示の方法に関与する配列のうち、テンプレートに対応しない配列（例えば、テンプレートに存在しないか、テンプレートにおける相補的配列を有さないか、テンプレートに存在したり、テンプレートにおける相補的配列を有したりする可能性が低い配列）を指す。ノンテンプレート配列は、テンプレート、例えばＲＮＡまたはＤＮＡテンプレートを鋳型としない配列であるので、例えば、延伸反応の際、対応するテンプレートの非存在下で付加でき、例えば、テンプレート指向性ではないターミナルトランスフェラーゼ活性を有するポリメラーゼによって付加されるヌクレオチドである。核酸へのノンテンプレート配列の付加は必ずしも、延伸反応に限定する必要はない。例えば、いくつかのケースでは、ノンテンプレート配列は、そのノンテンプレート配列を核酸にライゲーションすることを通じて付加してよい。いくつかのケースでは、ノンテンプレート配列は、トランスポザーゼ介在性反応を通じて、例えば、該当する核酸にノンテンプレート配列を付加するタグメンテーション反応を通じて付加してよい。したがって、ノンテンプレート配列は、様々なものであってよく、様々な手段を通じて、テンプレート配列に付加してよい。
ノンテンプレート（ｎｏｎ−ｔｅｍｐｌａｔｅ）配列とノンテンプレート（ｎｏｎ−ｔｅｍｐｌａｔｅｄ）配列とは、プライマー、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドまたはトランスポゾンに存在する配列のうち、核酸テンプレートにハイブリダイズしない配列（このような配列は、いくつかのケースでは、ノンハイブリダイズ配列と称することがある）を指してよいが、これらに限らない。ノンテンプレート配列は、サイズと組成の両方とも様々となる。いくつかのケースでは、ノンテンプレート配列、例えば、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドまたはプライマーに存在するノンテンプレート配列は、１０ｎｔ〜１０００ｎｔ以上の範囲であってよく、例えば、１０ｎｔ〜９００ｎｔ、１０ｎｔ〜８００ｎｔ、１０ｎｔ〜７００ｎｔ、１０ｎｔ〜６００ｎｔ、１０ｎｔ〜５００ｎｔ、１０ｎｔ〜４００ｎｔ、１０ｎｔ〜３００ｎｔ、１０ｎｔ〜２００ｎｔ、１０ｎｔ〜１００ｎｔ、１０ｎｔ〜９０ｎｔ、１０ｎｔ〜８０ｎｔ、１０ｎｔ〜７０ｎｔ、１０ｎｔ〜６０ｎｔ、１０ｎｔ〜５０ｎｔ、１０ｎｔ〜４０ｎｔ、１０ｎｔ〜３０ｎｔ、１０ｎｔ〜２０ｎｔなどが挙げられるが、これらに限らない。
いくつかのケースでは、ノンテンプレート配列は、上述のように、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの３’ハイブリダイゼーションドメインに含まれていてよい。ノンテンプレート配列は、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの３’ハイブリダイゼーションドメインに存在するときには、ヘテロポリヌクレオチドを含んだり、またはヘテロポリヌクレオチドからなったりしてもよく、このようなヘテロポリヌクレオチドは、長さが２ｎｔから１０ｎｔまで様々であってよい（３〜７ｎｔの長さなど（３ｎｔを含む））。いくつかのケースでは、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの３’ハイブリダイゼーションドメインに存在するノンテンプレート配列は、ホモポリヌクレオチドを含んだり、ホモポリヌクレオチドからなったりしてもよく、このようなホモポリヌクレオチドは、長さが２ｎｔから１０ｎｔまで様々であってよい（３〜７ｎｔの長さなど（３ｎｔを含む））。
オリゴヌクレオチドまたはプライマーに存在するノンテンプレート配列は、オリゴヌクレオチドまたはプライマーの５’末端に存在してもよく、このようなケースでは、この配列は、５’ノンテンプレート配列と称してよい。いくつかのケースでは、本開示の反応において、１つのオリゴヌクレオチドまたはプライマーのみが、ノンテンプレート配列（例えば５’ノンテンプレート配列）を含んでよい。いくつかのケースでは、本開示の反応で用いる２つ以上のオリゴヌクレオチド及び／またはプライマーが、ノンテンプレート配列（例えば５’ノンテンプレート配列）を含んでよい。２つ以上のオリゴヌクレオチド及び／またはプライマーがノンテンプレート配列を含むときには、異なるノンテンプレート配列を用いてよい。いくつかのケースでは、２つ以上のオリゴヌクレオチド及び／またはプライマーが５’ノンテンプレート配列を有する場合、そのような配列は、同じ５’ノンテンプレート配列を有してもよい。
いくつかのケースでは、ノンテンプレート配列（例えば、５’ノンテンプレート配列を含む）は、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでよい。いくつかのケースでは、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を該当する核酸に導入して、例えば、導入した制限エンドヌクレアーゼ認識部位の１つ以上で、該当する核酸を切断することによって、その産生核酸を操作可能にしてよい。
いくつかのケースでは、ノンテンプレート配列（例えば、５’ノンテンプレート配列を含む）は、１つ以上のプライマー結合部位を含んでよい。いくつかのケースでは、１つ以上のプライマー結合部位を該当する核酸に導入して、その産生核酸をさらに増幅可能にしてよい（例えば、１つ以上のプライマー結合部位を用いて、その核酸の全部または一部を増幅することを含む）。
有用なプライマー結合部位は、そのプライマー結合部位と、対応するプライマーとの所望の複雑度によって大きく異なる。いくつかのケースでは、有用なプライマー結合部位は、ＩＩ Ａプライマー（例えば、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から入手可能なようなもの）と相補性があるプライマー結合部位を含む。一実施形態によれば、産物二本鎖ｃＤＮＡの作製で用いるオリゴヌクレオチドまたはプライマーが、ＩＩ Ａプライマー結合部位を含むノンテンプレート配列を含む。一実施形態によれば、末端捕捉反応で用いる核酸が、ＩＩ Ａプライマー結合部位を含むノンテンプレート配列を含む。
いくつかのケースでは、ノンテンプレート配列（例えば、５’ノンテンプレート配列を含む）は、１つ以上のバーコード配列を含んでよく、いくつかのケースでは、このようなバーコード配列は、ユニークモレキュラーアイデンティファイアー（ＵＭＩ）ドメイン及び／またはバーコード付きユニークモレキュラーアイデンティファイアー（ＢＵＭＩ）ドメインであっても含んでもよい。ＵＭＩ及びＢＵＭＩ核酸と、各種アプリケーションでのそれらの利用とは、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５００７２３４４号にさらに説明されており、この出願公開の開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
いくつかのケースでは、例えば、バーコードをシークエンシングするシークエンシング反応の後に、ノンテンプレート配列の１つ以上のバーコード配列によって、作製した核酸の供給源を遡って特定してよい。例えば、いくつかのケースでは、テンプレートの供給源（例えば、試料、ウェル、細胞など）に特異的なバーコードを含むノンテンプレート配列を反応の際に導入する。供給源を特定するこのようなバーコードは、本明細書では、「ソースバーコード配列」と称することがあり、このような配列は様々であってよく、そのバーコードが特定する供給源に基づいて用語を割り当ててよい。ソースバーコードとしては、例えば、シークエンシングした核酸の作製元である試料を遡って特定する試料バーコード配列、シークエンシングした核酸の作製元であるウェル（例えばマルチウェルプレートのウェル）を遡って特定するウェルバーコード配列、シークエンシングした核酸の作製元であるドロップレットを遡って特定するドロップレットバーコード配列、シークエンシングした核酸の作製元である細胞（例えば、多細胞試料の細胞）を遡って特定する細胞バーコード配列などを挙げてよい。バーコードは、例えば、バーコーディング後に、例えば、シークエンシングの前に、核酸をプールする場合を含む様々な手順で使用できる。
いくつかのケースでは、例えば、オリゴヌクレオチド及び／または核酸プライマーに存在するノンテンプレート配列は、シークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む。「シークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクト」とは、該当するシークエンシングプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）によって供給されているシークエンシングプラットフォーム（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）及び／またはＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）シークエンシングシステム）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）によって供給されているシークエンシングプラットフォーム（例えば、Ｉｏｎ ＰＧＭ（商標）及び／またはＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）シークエンシングシステム）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって供給されているシークエンシングプラットフォーム（例えば、ＰＡＣＢＩＯ ＲＳ ＩＩシークエンシングシステム）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ（商標）によって供給されているシークエンシングプラットフォーム（例えば、ＳＯＬｉＤシークエンシングシステム）、Ｒｏｃｈｅによって供給されているシークエンシングプラットフォーム（例えば、４５４ ＧＳ ＦＬＸ＋及び／またはＧＳ Ｊｕｎｉｏｒシークエンシングシステム）、あるいは該当するいずれかの他のシークエンシングプラットフォームなど）で用いられる核酸ドメイン（例えば、シークエンシングプラットフォームアダプター核酸配列）またはその相補体の少なくとも一部を含む核酸コンストラクトを意味する。
特定の態様では、ノンテンプレート配列は、表面付着シークエンシングプラットフォームオリゴヌクレオチド（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シークエンシングシステムのフローセルの表面に付着しているＰ５またはＰ７オリゴヌクレオチド）に特異的に結合するドメイン（例えば、「捕捉部位」または「捕捉配列」）である核酸ドメインと、シークエンシングプライマー結合ドメイン（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）プラットフォームのＲｅａｄ１またはＲｅａｄ２プライマーが結合できるドメイン）とを含むシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む。そのシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトは、該当するシークエンシングプラットフォームに適するいずれかの長さ及び配列の核酸ドメイン（例えば、「シークエンシングアダプター」）を含んでよい。特定の態様では、この核酸ドメインは、４〜２００ｎｔの長さであってよい。例えば、この核酸ドメインは、４〜１００ｎｔの長さ（６〜７５ｎｔ、８〜５０ｎｔまたは１０〜４０ｎｔの長さなど）であってよい。特定の実施形態によれば、シークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトは、２〜８ｎｔの長さ（９〜１５ｎｔ、１６〜２２ｎｔ、２３〜２９ｎｔまたは３０〜３６ｎｔの長さなど）である核酸ドメインを含む。
その核酸ドメインは、例えば、その核酸ドメインに隣接するｃＤＮＡインサートの固相増幅及び／または合成によるシークエンシングの際に、該当するシークエンシングプラットフォームで用いられるポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）が、その核酸ドメインに特異的に結合できるようにする長さ及び配列を有してよい。核酸ドメインの例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ベースのシークエンシングプラットフォームで用いられるＰ５（５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ−３’）（配列番号１７）、Ｐ７（５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ−３’）（配列番号１８）、Ｒｅａｄ１プライマー（５’−ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ−３’）（配列番号１９）及びＲｅａｄ２プライマー（５’−ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ−３’）（配列番号２０）ドメインが挙げられる。核酸ドメインの他の例としては、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）ベースのシークエンシングプラットフォームで用いられるＡアダプター（５’−ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧ−３’）（配列番号２１）及びＰ１アダプター（５’−ＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＡＴ−３’）（配列番号２２）ドメインが挙げられる。
該当するシークエンシングプラットフォームでのシークエンシングに有用なノンテンプレート配列ドメインのヌクレオチド配列は様々であってよく、及び／または時間の経過とともに変化してよい。アダプター配列は典型的には、シークエンシングプラットフォームのメーカーによって供給されている（例えば、シークエンシングシステムとともに供給される技術文書に掲載されていたり、及び／またはメーカーのウェブサイトで入手可能であったりする）。このような情報に基づき、ノンテンプレート配列（例えば、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド及び／または単一産物核酸プライマー及び／または類似のもの）のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトの配列は、該当するプラットフォームで、核酸インサート（テンプレート核酸に対応しているインサート）をシークエンシング可能にする構成で、１つ以上の核酸ドメインの全部または一部を含むように設計してよい。ノンテンプレート配列に含めてよいシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトと、本明細書に記載されている他の核酸試薬とは、ＵＳ２０１５−０１１１７８９Ａ１として公開された米国特許出願第１４／４７８，９７８号にさらに説明されており、その開示内容は、参照により、本明細書に援用される。
ノンテンプレート配列は、該当する核酸、例えば、オリゴヌクレオチド、核酸プライマー、作製したｄｓＤＮＡなどに、様々な手段によって付加してよい。例えば、上述のように、ノンテンプレート配列は、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有するポリメラーゼの作用を通じて付加してよい。例えば、プライマーまたはオリゴヌクレオチドに存在するノンテンプレート配列は、増幅反応の際に、産物核酸に導入してよい。いくつかのケースでは、ノンテンプレート核酸配列は、核酸に（例えば、増幅の前に、プライマーまたはオリゴヌクレオチドに、核酸増幅産物になど）直接結合してよい。ノンテンプレート配列を核酸に直接結合する方法は、様々なものがあり、例えば、ライゲーション、化学的な合成／連結、酵素によるヌクレオチドの付加（例えば、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有するポリメラーゼによる付加）などを挙げてよいが、これらに限らない。
いくつかのケースでは、本開示の方法は、シークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを核酸の末端に結合することを含んでよい。例えば、いくつかのケースでは、本開示の方法で用いるオリゴヌクレオチド及び／またはプライマーは、シークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含まなくてもよく、すなわち、該当する核酸の作製後に、所望のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを結合してもよい。該当する核酸またはその誘導体の末端に結合するアダプターコンストラクトは、ダウンストリームシークエンシングアプリケーションで有用ないずれかの配列エレメントを含んでよく、そのエレメントとしては、本明細書に記載の方法のオリゴヌクレオチド及び／またはプライマーの任意のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトに関して上記したエレメントのいずれかが挙げられる。例えば、該当する核酸またはその誘導体の末端に結合するアダプターコンストラクトは、表面付着シークエンシングプラットフォームオリゴヌクレオチドに特異的に結合するドメイン、シークエンシングプライマー結合ドメイン、バーコードドメイン、バーコードシークエンシングプライマー結合ドメイン、分子特定ドメイン及びこれらを組み合わせたものからなる群から選択した核酸ドメインまたはその相補体を含んでよい。
シークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトの結合は、いずれかの好適なアプローチを用いて行ってよい。特定の態様では、アダプターコンストラクトは、「シームレス」クローニング法と同じまたは類似のアプローチを用いて、産物核酸またはその誘導体の末端に結合する。シームレス法は、制限酵素解析及び消化、ＤＮＡ末端修復、脱リン酸化、ライゲーション、酵素の不活化及びクリーンアップ、ならびに核酸物質の対応する喪失を１ラウンド以上排除する。該当するシームレス結合法としては、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から入手可能なＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）クローニングシステム、Ｌｉ ＆ Ｅｌｌｅｄｇｅ（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５１−２５６に記載されているようなＳＬＩＣ（配列及びリガーゼ非依存性クローニング）、Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６：３４３−３４５に記載されているようなギブソンアセンブリー、Ｑｕａｎ ＆ Ｔｉａｎ（２００９）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ４（７）：ｅ６４４１に記載されているようなＣＰＥＣ（環状ポリメラーゼ伸長クローニング）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４０（８）：ｅ５５に記載されているようなＳＬｉＣＥ（シームレスライゲーションクローニング抽出物法）、及びＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によるＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）シームレスクローニング技術が挙げられる。
該当するシークエンシングプラットフォームに有用もしくは必要なシークエンシングドメインの一部しか有さない、該当する核酸またはその誘導体に、追加の核酸シークエンシングドメインを付与するために、いずれかの好適なアプローチを用いてよい。例えば、その５’末端（例えば、該当する核酸またはその誘導体と相補的であるプライマー領域の５’）にアダプター配列を有するＰＣＲプライマーを用いて、該当する核酸またはその誘導体を増幅して、アンプリコンが、いずれかの所望の構成で、元の産物核酸におけるアダプター配列と、プライマーにおけるアダプター配列とを含むようにできる。シームレスクローニング法、制限消化／ライゲーションなどに基づくアプローチを含む他のアプローチを用いてもよい。
追加の方法パラメーター
上記で概説したように、本明細書に記載の方法は、例えばテンプレートスイッチング逆転写反応、核酸増幅反応、末端捕捉反応、タグメンテーション反応などを含む特定の核酸反応を含んでよい。このような反応における反応混合物成分は、その反応の生成物を生成するために十分な条件下で混ぜ合わせる。例えば、いくつかのケースでは、産物二本鎖ｃＤＮＡを生成するために十分な条件下でテンプレートスイッチング逆転写反応の反応成分を混ぜ合わせる。いくつかのケースでは、核酸増幅反応の反応成分は、増幅産物核酸を生成するために十分な条件下で混ぜ合わせる。いくつかのケースでは、末端捕捉反応の反応成分は、末端捕捉核酸を生成するために十分な条件下で混ぜ合わせる。いくつかのケースでは、タグメンテーション反応の反応成分は、タグメンテーション済み核酸を生成するために十分な条件下で混ぜ合わせる。
本開示の核酸を「生成するために十分な条件」とは、その反応における関連する核酸及び／または他の反応成分が、所望の形で、互いと相互作用できるようにする反応条件を意味する。例えば、いくつかのケースでは、この条件は、反応混合物の核酸がハイブリダイズするために十分なものであってよい。いくつかのケースでは、この条件は、反応混合物の酵素が化学的プロセス（例えば、ポリマー化、加水分解など）を触媒するために十分なものであってよい。好適な反応条件もたらすこととしては、反応混合物成分、その濃度及び反応温度を選択して、関連するプロセスが進行する環境（例えば、関連する核酸が互いに配列特異的にハイブリダイズする環境、関連するポリメラーゼがポリマー化を行うことによって、核酸を延伸させる環境などが挙げられる）を作ることを挙げてよい。反応の特異的核酸（例えばテンプレート核酸、オリゴヌクレオチド、プライマーなど）に加えて、反応混合物は、適切なｐＨ、塩濃度（例えばＫＣｌ濃度）などを構築するバッファー成分を含んでよい。二本鎖核酸複合体を生成するために十分な条件としては、ハイブリダイゼーションに適切な条件（「ハイブリダイゼーション条件」ともいう）を挙げてよい。
好適な反応条件の実現には、反応混合物成分、その濃度及び反応温度を選択して、１つ以上のポリメラーゼが活性になり、及び／または反応物における関連核酸が、所望の形で、互いに相互作用（例えばハイブリダイズ）する環境を作ることを含めてよい。好適な反応条件では、反応混合物は、反応成分に加えて、伸長反応（複数可）及び／またはテンプレートスイッチングを行うための適切なｐＨ、塩濃度（例えばＫＣｌ濃度）、金属補因子濃度（例えば、Ｍｇ2+またはＭｎ2+濃度）などを構築するバッファー成分を含んでよい。１つ以上のヌクレアーゼインヒビター（例えば、ＲＮａｓｅインヒビター及び／またはＤＮａｓｅインヒビター）、ＧＣリッチ配列の増幅／複製を促す１つ以上の添加剤（例えば、ＧＣ−Ｍｅｌｔ（商標）試薬（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ））、ベタイン、ＤＭＳＯ、エチレングリコール、１，２−プロパンジオールもしくはこれらを組み合わせたもの）、１つ以上の分子クラウディング剤（例えば、ポリエチレングリコールなど）、１つ以上の酵素安定化成分（例えば、１〜１０ｍＭ（例えば５ｍＭ）の範囲の最終濃度で存在するＤＴＴ）及び／またはポリメラーゼの媒介による伸長反応及び／またはテンプレートスイッチングを促すために有用ないずれかの他の反応混合物成分のようなその他の成分を含めてよい。
１つ以上の反応混合物は、プライマー伸長反応及び／またはテンプレートスイッチングに適するｐＨであってよい。特定の実施形態では、反応混合物のｐＨは、５〜９（７〜９など（８〜９を含む）、例えば８〜８．５）の範囲である。いくつかのケースでは、反応混合物は、ｐＨ調整剤を含む。該当するｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、塩酸、リン酸バッファー溶液、クエン酸バッファー溶液などが挙げられるが、これらに限らない。例えば、ｐＨ調整剤を適切な量で加えることによって、反応混合物のｐＨを所望の範囲に調整することができる。
プライマー伸長反応に適する温度範囲は、用いる具体的なポリメラーゼ、用いるいずれかのプライマーの融解温度などのような要因によって変動し得る。いくつかのケースでは、逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ逆転写酵素）を用いてよく、ハイブリダイズされるプライマーを逆転写酵素の媒介によって伸長するために十分な反応混合物条件としては、反応混合物を４℃〜７２℃（１６℃〜７０℃、例えば３７℃〜５０℃、４０℃〜４５℃など（４２℃を含む））の範囲の温度にすることが挙げられる。
いくつかのケースでは、本明細書に記載されている方法は、例えば、テンプレートの二次構造を変性させるために十分な温度に、テンプレートを含む反応混合物を曝すことによって、テンプレートを変性させることを含んでよい。状況に応じて、変性は、１つ以上の反応成分を反応混合物に加える前または加えた後に行ってよく、いくつかのケースでは、単一産物核酸を作製するための転写、例えば逆転写の開始前に行う。有用な変性温度は、様々な温度があり、５０℃未満〜１００℃超の範囲であってよく、例えば、５０℃以上、５５℃以上、６５℃以上、７０℃以上、７２℃以上、７５℃以上、８０℃以上、８５℃以上、９０℃以上、９５℃以上などが挙げられるがこれらに限らない。
いくつかのケースでは、提供する方法は、最終核酸産物（例えば核酸ライブラリー）及び／または中間核酸産物（例えば二本鎖産物ｃＤＮＡ）を単離及び／または精製することを含んでよい。いずれかの利便的な精製方法を用いてよく、例えば、核酸沈殿（すなわち、アルコール沈殿）、ゲル精製などが挙げられるが、これらに限らない。
いくつかのケースでは、提供する方法は、例えば、作製した二本鎖ｃＤＮＡ、作製した核酸ライブラリーなどを増幅する際に用いるものとして、増幅ポリメラーゼを用いることを含んでよい。いずれかの利便的な増幅ポリメラーゼを用いてよく、耐熱性ポリメラーゼを含むＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これに限らない。有用な増幅ポリメラーゼとしては、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、これらの誘導体などが挙げられる。いくつかのケースでは、増幅ポリメラーゼは、ホットスタートポリメラーゼであってよく、例えば、ホットスタートＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ホットスタートＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられるが、これらに限らない。
増幅ポリメラーゼは、反応混合物に混ぜ合わせて、その増幅ポリメラーゼの最終濃度が、産物核酸を所望の量で生成させるために、例えば、増幅産物二本鎖ｃＤＮＡを所望の量、ライブラリー核酸を所望の量などで生成させるために十分な濃度となるようにしてよい。特定の態様では、増幅ポリメラーゼ（例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼなど）は、反応混合物に、０．１〜２００ユニット／μＬ（Ｕ／μＬ）（０．５〜１００Ｕ／μＬ、例えば１〜５０Ｕ／μＬなど（５〜２５Ｕ／μＬを含む）、例えば２０Ｕ／μＬ）の最終濃度で存在する。
本開示の方法の核酸反応、例えば増幅反応は、ｄＮＴＰを反応混合物に混ぜ合わせることを含んでよい。特定の態様では、４つの天然のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）をそれぞれ、反応混合物に加える。例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰは、各ｄＮＴＰの最終濃度が、０．０１〜１００ｍＭ（０．１〜１０ｍＭなど（０．５〜５ｍＭを含む）、（例えば１ｍＭ））になるように、反応混合物に加えてよい。いくつかのケースでは、反応混合物に加える１種類以上のヌクレオチドは、非天然のヌクレオチド、例えば、そのヌクレオチドに結合された結合部分もしくは他の部分（例えば、蛍光部分）を有する改変ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、または本開示の方法もしくは該当するダウンストリームアプリケーションで有用ないずれかの他のタイプの非天然ヌクレオチドであってよい。
反応混合物は、様々な温度に暴露して、反応の様々な局面を駆動してよく、その局面としては、例えば、核酸の変性／融解、核酸のハイブリダイゼーション／アニーリング、ポリメラーゼの媒介による延伸／伸長などが挙げられるが、これらに限らない。様々なプロセスを行う温度は、行うプロセスに従って呼称してよく、例えば、融解温度、アニーリング温度、延伸温度などが挙げられる。このようなプロセスの最適温度は、例えば、用いるポリメラーゼ、核酸の特徴などに応じて変動することになる。特定のポリメラーゼ（逆転写酵素及び増幅ポリメラーゼが挙げられる）の最適温度は、参考文献の文から容易に得ることができる。核酸に関する最適温度、例えば、アニーリング温度及び融解温度は、該当する核酸の既知の特徴（例えば、全長、ハイブリダイゼーション長、Ｇ／Ｃ含有率、二次構造予測などが挙げられる）に基づき、容易に算出できる。
特定の実施形態によると、本開示の方法は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を単離、増幅及び／または解析（例えばシークエンシング）することを含んでよい。本開示の方法が、ＤＮＡを単離、増幅及び／または解析することを含む場合、用いるＤＮＡは、ＤＮＡテンプレートと称してよい（または場合によっては、テンプレートＤＮＡと称する）。テンプレートＤＮＡは、いずれかのタイプのＤＮＡ（またはそのサブタイプ）であってよく、ゲノムＤＮＡ（例えば、動物ゲノムＤＮＡ（例えば、哺乳類動物ゲノムＤＮＡ（例えば、ヒトゲノムＤＮＡ、齧歯類動物ゲノムＤＮＡ（例えば、マウス、ラットなど）など）、ミトコンドリアＤＮＡ、またはそれらのタイプのＤＮＡまたはそれらのサブタイプをいずれかに組み合わせたものが挙げられるが、これらに限らない。
特定の実施形態では、所望に応じて、解析のために、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離及び／または処理してよい。例えば、いくつかのケースでは、提供する方法は、ＲＮＡを含む試料から、１つ以上のライブラリーを調製することを含むとともに、その試料からｇＤＮＡを単離、処理及び／または解析することをさらに含んでよい。したがって、いくつかのケースでは、試料としては、例えば、複数の細胞から単離した核酸試料、単一細胞から単離した試料を含め、ＲＮＡとＤＮＡ（例えばｇＤＮＡ）との両方を含む試料を挙げてよい。例えば、いくつかのケースでは、本開示の方法は、単一細胞からＲＮＡとＤＮＡとを単離、処理及び／または解析することを含んでよく、例えば、ＲＮＡの処理に、ＲＮＡ試料から２つ以上ライブラリー（例えば、発現ライブラリーと免疫細胞レセプターレパートリーライブラリー）を調製することが含まれる場合が挙げられる。
ｇＤＮＡの単離、処理及び／または解析は、様々な目的で行ってよい。例えば、いくつかのケースでは、試料のｇＤＮＡをシークエンシングして、ゲノム配列情報を得てよい。該当する試料のｇＤＮＡのこのようなシークエンシングは、いくつかのケースでは、１つの免疫座または１つ以上の免疫座をシークエンシングすることを含んでよい。「免疫座」とは概して、免疫系プロセスと関連する遺伝子（遺伝子オントロジー（ＧＯ）アクセッション番号ＧＯ：０００２３７６（オンラインでｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇで入手可能）によって同定される遺伝子など）を含め、いずれかの免疫関連遺伝子の遺伝子座を意味し、例えば、Ｂ細胞媒介免疫、Ｂ細胞セレクション、Ｔ細胞媒介免疫、Ｔ細胞セレクション、免疫応答の活性化、抗原の処理と提示、粘膜関連リンパ組織における抗原サンプリング、好塩基球媒介免疫、好酸球媒介免疫、血球分化、血球増殖、免疫エフェクタープロセス、免疫応答、免疫系の惹起、免疫記憶プロセス、白血球活性化、白血球ホメオスタシス、白血球媒介免疫、白血球遊走、リンパ球共刺激、リンパ球媒介免疫、マスト細胞媒介免疫、骨髄系細胞ホメオスタシス、骨髄性白血球媒介免疫、ナチュラルキラー細胞媒介免疫、負の免疫系プロセス調節、好中球媒介免疫、正の免疫系プロセス調節、免疫応答のメディエーター分子の産生、免疫系プロセスの調節、免疫レセプターの体細胞レベルでの多様化、寛容性誘導などと関連する遺伝子が挙げられるが、これらに限らない。
いくつかのケースでは、本開示の方法においてシークエンシングしたり及び／または別段で解析したりしてよい免疫座は、ＴＣＲ座であってよい。いくつかのケースでは、本開示の方法においてシークエンシングしたり及び／または別段で解析したりしてよい免疫座は、ＢＣＲ座であってよい。いくつかのケースでは、免疫座のｇＤＮＡのシークエンシングによって、例えば発現ライブラリー及び／または免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーを含め、本発明で作製したライブラリーの１つ以上のＮＧＳ解析との協調解析を可能にできる。いくつかのケースでは、提供する方法で行うｇＤＮＡ解析は、全ゲノムシークエンシングを含んでよい。
組成物及びキット
本開示の態様は、組成物及びキットも含む。本開示の組成物及びキットは、例えば、本開示の方法に関して上記で説明した反応混合物成分のいずれかのうちの１つ以上を含んでよい。例えば、本開示の組成物及びキットは、核酸試料（例えば、ＲＮＡ試料、ＲＮＡとＤＮＡが組み合わさった試料など）、増幅ポリメラーゼ（例えば耐熱性ポリメラーゼなど）、逆転写酵素（例えば、テンプレートスイッチングできる逆転写酵素など）、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド、末端捕捉プライマー、免疫レセプター特異的プライマー、タグメンテーション反応の１つ以上の成分、ｄＮＴＰ、塩、金属補因子、１つ以上のヌクレアーゼインヒビター（例えば、ＲＮａｓｅインヒビター及び／またはＤＮａｓｅインヒビター）、１つ以上の分子クラウディング剤（例えばポリエチレングリコールなど）、１つ以上の酵素安定化成分（例えばＤＴＴ）、あるいはいずれかの他の所望のキット成分（複数可）を含んでよい。
いくつかのケースでは、本開示の組成物及び／またはキットの成分は、「カクテル」として提供してもよく、カクテルとは、本明細書で使用する場合、異なるものであるが、類似のものである成分を２つ以上、１つの容器で集めたりまたは組み合わせたりしたものを指す。本開示のキットにおける有用なカクテルとしては、例えば、「プライマーカクテル」が挙げられるが、これに限らず、このようなカクテルの組成は様々であってよく、例えば、２つ以上のプライマー（例えば、末端増幅プライマーと免疫レセプター特異的プライマーとを含む）のカクテルなどを挙げてよい。本開示のキットにおける有用なカクテルとしては、例えば、「タグメンテーションカクテル」も挙げてよいが、これに限らず、このようなカクテルの組成は様々であってよく、例えば、タグメンテーション反応の２つ以上の成分（例えば、トランスポゾンとトランスポザーゼとを含む）のカクテルを挙げてよい。
特定の実施形態では、本開示のキットは、該当する核酸供給源から核酸を単離するための試薬を含む。この試薬は、単一細胞、培養細胞、組織、器官または生物を含め、様々なＤＮＡ供給源またはＲＮＡ供給源から核酸試料を単離するために適していてよい。本開示のキットは、固定した細胞、組織または器官、例えば、ホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から核酸試料を単離するための試薬を含んでよい。このようなキットは、１つ以上の脱パラフィン剤、核酸を脱架橋するために適する１つ以上の薬剤及び／または類似のものを含んでよい。
本開示のキットの成分は、別々の容器に入っていてよく、あるいは、複数の成分が、１つの容器に入っていてもよい。例えば、テンプレートスイッチング反応を行うための成分と、ライブラリーを調製するための成分（例えば、作製した二本鎖ｃＤＮＡを分割後に用いる成分）とは、異なるチューブに入っていてもよい。いくつかのケースでは、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドと第１鎖ｃＤＮＡプライマーとは、同じチューブに入っていても、異なるチューブに入っていてもよい。いくつかのケースでは、１つ以上の免疫レセプター特異的プライマーと１つ以上の末端（例えば５’末端）プライマーとは、同じチューブに入っていても、異なるチューブに入っていてもよい。いくつかのケースでは、１つ以上の末端（例えば、５’末端または３’末端）プライマーと、１つ以上のタグメンテーション後プライマーとは、同じチューブに入っていても、異なるチューブに入っていてもよい。いくつかのケースでは、デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）は、逆転写酵素、増幅ポリメラーゼまたは１つ以上のプライマーもしくはオリゴヌクレオチドと同じチューブに入っていてもよい。
特定の実施形態では、提供するキットは、５’増幅プライマー、免疫細胞レセプター特異的増幅プライマー（すなわち免疫レセプター特異的プライマー）及び末端増幅プライマーをいずれかに組み合わせたものを含んでもよい。例えば、キットは、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドによって付加されるプライマー結合部位に結合する５’増幅プライマーと、１つ以上の免疫細胞レセプターポリペプチド（例えば、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、免疫グロブリン鎖）の領域（例えば定常領域）に特異的に結合する免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーと、末端捕捉で用いる末端増幅プライマー（例えば、末端捕捉プロセス（例えばタグメンテーション反応など）で付加するプライマー結合部位に結合する末端増幅プライマー）とを組み合わせたものを含んでよい。
特定のケースでは、提供するキットは、テンプレートスイッチング逆転写反応を行うための１つ以上の成分を含んでよい。このような成分としては、例えば、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド、プライマー、逆転写酵素などを含め、本明細書に記載されている成分が挙げられるが、これらに限らない。このような成分、例えば、オリゴヌクレオチド及びプライマーは、いくつかのケースでは、アダプター配列を含んでよい。例えば、いくつかのケースでは、提供するテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドは、５’アダプター配列を含んでよい。
特定のケースでは、提供するキットは、タグメンテーション反応を行うための１つ以上の成分を含んでよい。例えば、このようなキットは、タグメンテーション後増幅プライマー結合ドメインを含むトランスポゾン核酸、タグメンテーション後増幅プライマー結合ドメインにハイブリダイズするタグメンテーション後増幅プライマー、トランスポザーゼ（例えばＴｎ５トランスポザーゼ）のうちの１つの試薬もしくはこれらをいくつか組み合わせたもの、またはいくつかの他のものを組み合わせたもの（本明細書に記載されている１つ以上の追加の成分を含むことができる）、これらを組み合わせたものを含んでよい。
特定のケースでは、提供するキットは、自動システム（例えば、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ製のＩＣＥＬＬ８システム）で複数の反応を行うための１つ以上の成分を含んでよい。提供するキットは、マルチウェルプレート（すなわちアレイチップ）を含むことができる。このマルチウェルアレイチップは、本開示のテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド及び／またはいずれかの他のプライマーをそのマルチウェルアレイチップのウェルに、（例えば乾燥形態で）含むことができる。
上記の成分に加えて、本開示のキットは、そのキットの成分を使用して、例えば、上記のような本開示の方法を実施するための説明をさらに含んでよい。加えて、例えば、キットのプライマー及び／またはオリゴヌクレオチドが、ＢＵＭＩドメインを含む場合には、そのキットは、例えば、コード付きＢＵＭＩドメインのデコード、ユニークな分子種の計数などを含め、結果解析のためのプログラミングをさらに含んでよい。この説明及び／または解析プログラミングは概して、好適な記録媒体に記録されている。この説明及び／またはプログラミングは、紙またはプラスチックなどの基材に印刷してもよい。したがって、説明は、キットに、添付文書、キットまたはその成分の容器のラベル（すなわち、パッケージまたはサブパッケージに付随するラベル）などとして存在してよい。別の実施形態では、説明は、好適なコンピューター可読記憶媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）などにある電子記憶データファイルとして存在してよい。さらに別の実施形態では、実際の説明は、キットには入っていないが、遠隔の供給源から、例えばインターネットを介して、説明を入手する手段が提供されている。この実施形態の例は、説明を見ることができたり、及び／または説明をダウンロードできたりするウェブアドレスを含むキットである。説明に関しては、説明を入手するこの手段は、好適な基材に記録されている。
本開示の組成物は、いずれかの好適な環境で存在してよい。一実施形態によれば、本開示の組成物は、反応チューブ（例えば、０．２ｍＬチューブ、０．６ｍＬチューブ、１．５ｍＬチューブなど）、ウェル、マイクロ流体チャンバー、ドロップレットまたはその他の好適な容器に入っている。特定の態様では、本開示の組成物は、２つ以上の（例えば複数の）反応チューブまたはウェル（例えば、９６ウェルプレート、マルチウェルプレートのようなプレート（例えば、約１０００個、５０００個もしくは１０，０００個以上のウェルを含む））に入っている。このチューブ及び／またはプレートは、いずれかの好適な材料、例えば、ポリプロピレンなど、ＰＤＭＳまたはアルミニウムで作られていてよい。この容器は、容器の壁に核酸が吸着することを低減するように処理してもよい。特定の態様では、本開示の組成物が入っているチューブ及び／またはプレートは、（例えば、ヒートブロック、ウォーターバス、サーモサイクラー及び／または類似のものに入れたときに）本開示の組成物に効率的に熱を伝導して、例えば、特定の酵素反応を起こすために必要とされるように、短期間で、組成物の温度を変化させることができるようにする。特定の実施形態によれば、本開示の組成物は、薄肉ポリプロピレンチューブ、または薄肉ポリプロピレンウェルまたは熱コンダクタンスが高い材料（アルミニウムなど）を有するプレートに入っている。いくつかのケースでは、本開示の組成物は、ドロップレットに入っていてよい。特定の実施形態では、固体表面またはビーズで反応を行うことが利便的であり、このケースでは、当該技術分野において知られている方法（ビオチン結合または共有結合など）によって、単一産物核酸プライマー及び／またはテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド、あるいは１つ以上の他のプライマーを固体支持体またはビーズに結合して、その支持体で、反応を進行させてよい。あるいは、例えば、Ｍａｃｏｓｋｏ，ＥＺ ｅｔ．ａｌ，Ｃｅｌｌ １６１，１２０２−１２１４，Ｍａｙ ２１，２０１５に記載されているように、オリゴを固体支持体上で直接合成してよい。
本開示の組成物に適する他の環境としては、例えば、マイクロ流体チップ（例えば、「ラブオンチップデバイス」、例えば、チャネルと入口を備えるマイクロ流体デバイス）が挙げられる。本開示の組成物は、その組成物を所望の温度にするように構成された器具、例えば、温度制御式ウォーターバス、ヒートブロック、ヒートブロックアダプターなどに入れてよい。組成物を所望の温度にするように構成された器具は、組成物を一連の異なる所望の温度に、それぞれ好適な期間にわたってするように構成されていてよい（例えば、この器具は、サーモサイクラーであってよい）。
有用性
本開示の方法は、免疫細胞レセプターレパートリー解析及び／または別々に調製した２つ以上のシークエンシングライブラリーの解析を用いるアプリケーション（このような解析を順次または同時に行うことのできる場合を含む）を含め、様々なアプリケーションで有用である。
上述のように、いくつかのケースでは、別々に調製した２つのライブラリーから得たデータを協調させてよい。このような協調データは、共通または関連する目的を果たし得る。例えば、いくつかのケースでは、免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーから得たデータは、発現ライブラリーから得たデータと協調させてよい。いくつかの実施形態では、免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーのシークエンシングによって、細胞、細胞集団、または対象もしくは対象集団で発現される免疫レセプターのレパートリーの同定に関する情報を得ることができ、発現ライブラリーの発現差解析によって、相対的な遺伝子発現レベルに関する情報であって、免疫レセプターレパートリーの情報と協調させてよい情報を得ることができる。例えば、いくつかのケースでは、（例えば、全トランスクリプトーム解析（ＷＴＡ）の一部として、）発現ライブラリーによって、１つ以上の細胞の全トランスクリプトームに関する発現差の情報を得ることができ、このようなトランスクリプトーム情報は、同じ１つ以上の細胞の免疫レセプターレパートリーの情報と比較したりまたは協調させたりしてよい。別の例として、いくつかのケースでは、発現ライブラリーによって、１つ以上の細胞における１つ以上の免疫関連遺伝子（例えば、サイトカイン、インターロイキン、インターロイキンレセプター、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＰＤ−１など）の発現に関する発現差情報を得ることができ、このような免疫関連遺伝子の発現情報は、同じ１つ以上の細胞の免疫レセプターレパートリーの情報と比較したりまたは協調させたりしてよい。このようなプロセスを通じて、細胞または細胞集団の免疫レセプターレパートリーと、他の遺伝子（免疫関連遺伝子と非免疫関連遺伝子を含む）の発現との関係を特定したり及び／またはさらに調べたりしてよい。
さらに、ライブラリーの並列調製で単一産物二本鎖ｃＤＮＡを使用することによって、結果の一貫性と、データセットにわたって結果を相関させる機能とを向上可能にしてよい。加えて、複数のライブラリーの調製方法で単一産物二本鎖ｃＤＮＡを用いるのは、その２つ以上のライブラリーから得たデータを後で協調させるか否かにはかかわらず、２つ以上のライブラリーを作製するために、ユーザーインプットと「ハンズオンタイム」の低減が望ましい方法において、さらに有用である。
本開示の方法の用途としては、免疫分子の同定及び／またはスクリーニングが望ましい医学用途及び研究用途が挙げられる。このような用途としては、ヒト臨床研究用途、及び、前臨床研究用途（例えば、齧歯類動物、小型哺乳類動物、大型哺乳類動物、ヒト以外の霊長類動物などのような動物モデルで行う前臨床研究用途など）が挙げられる。
本明細書に開示されている方法で作製するライブラリーであって、シークエンシングできる状態のライブラリーは、いずれかの利便的なシークエンシングプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）のＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）及びＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）シークエンシングシステム、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）のＩｏｎ ＰＧＭ（商標）及びＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）シークエンシングシステム、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＰＡＣＢＩＯ ＲＳ ＩＩシークエンシングシステム、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）のＳＯＬｉＤシークエンシングシステム、Ｒｏｃｈｅの４５４ ＧＳ ＦＬＸ＋及びＧＳ Ｊｕｎｉｏｒシークエンシングシステム、またはいずれかの他の利便的なシークエンシングプラットフォームを含む）を用いて、ライブラリーメンバーをシークエンシング可能にするアダプター配列を含む。提供する方法は、シークエンシングできる状態のライブラリーであって、該当するＲＮＡ出発物質、例えば、ｍＲＮＡ、非ポリアデニル化ＲＮＡ（例えばマイクロＲＮＡ）のいずれかの単一試料に対応するライブラリーを１つ以上作製するために有用である。加えて、本開示の方法を用いて、個別の単一細胞に由来する単一のＲＮＡ試料から、または関連細胞集団から、シークエンシングできる状態のｃＤＮＡライブラリーを単独でまたは並列で作製してよい。
下記の実施例は、例示として示されており、限定するものとして示されているものではない。
実施例１：単一細胞由来の遺伝子発現解析及びＴＣＲプロファイリングの複合
単一細胞由来の遺伝子発現差解析及びＴＣＲプロファイリングを複合する際に用いるライブラリーの作製に用いるプロセス全体を示している全体概略図が図５に示されている。
逆転写（ＲＴ）反応とプレ増幅ＰＣＲ
このプロトコールの最初の部分では、テンプレートスイッチング逆転写反応を通じて、投入単一細胞から採取したｍＲＮＡ試料から二本鎖ｃＤＮＡを作製した。単一細胞ｍＲＮＡ試料を９６ウェルプレートのウェルに分散させ、単一細胞ｍＲＮＡ試料から第１鎖を合成するために、各ウェルにおいて、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）ｄＴプライマーと逆転写酵素（ＲＴ）とを使用した。ＲＴのターミナルトランスフェラーゼ活性によって、合成された第１鎖をテーリングした。そのテール付きヌクレオチドにＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ Ｉｎｄｅｘｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅをハイブリダイズさせて、ＲＴのテンプレートスイッチングと、合成された第１鎖の伸長とを行い、ＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ Ｉｎｄｅｘｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅをテンプレートとするインデックスとプレ増幅ＰＣＲプライマー結合部位配列とを含めた。
次に、ＴＣＲ ｄＴ ＰｒｉｍｅｒとＰｒｅ−Ａｍｐ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ（プレ増幅ＰＣＲプライマー結合部位にハイブリダイズする）とを用いて、テンプレートスイッチング反応の産物を増幅させて、最終的に、産物二本鎖ｃＤＮＡを作製した。各ウェルの作製産物二本鎖ｃＤＮＡ（各単一細胞反応に特有のインデックス配列を含む）をプールし、ＰＣＲクリーンアップを行った。プーリングとクリーンアップの後、二本鎖ｃＤＮＡを２つの反応物に分割して、（１）配列差解析と（２）ＴＣＲプロファイリング用のシークエンシングライブラリーとを別々に作製した。
配列差解析用ライブラリーの調製
配列差解析用シークエンシングライブラリーの調製は、５’末端捕捉によって行った。簡潔に述べると、ＴｎＲＰ１トランスポゾン及びＴｎＰＲ２トランスポゾンとＴｎ５トランスポザーゼとを用いて、産物二本鎖ｃＤＮＡをタグメンテーションした。タグメンテーションによって、完全５’末端（すなわち、インデックスとプレ増幅ＰＣＲプライマー結合部位配列が保持されている５’末端）と、タグメンテーション後増幅プライマー結合ドメインが導入されたタグメンテーション済み３’末端とを有する産物二本鎖ｃＤＮＡ断片が得られた。２つの５’末端捕捉プライマー、すなわち、プレ増幅ＰＣＲプライマー結合部位配列にハイブリダイズする第１のプライマー（「５’末端捕捉プライマー１」）と、タグメンテーション後増幅プライマー結合ドメインにハイブリダイズする第２のプライマー（「５’末端捕捉プライマー２」）とを用いて、タグメンテーション済み５’断片を増幅し、シークエンシングアダプター配列を導入した。第１のプライマー（「５’末端捕捉プライマー１」）は、Ｐ７、ｉ７、Ｒｅａｄ２及びＳＭＡＲＴ配列を含んでいた。第２のプライマー（「５’末端捕捉プライマー２」）は、Ｐ５、ｉ５及びＴｎ Ｒｅａｄ１配列を含んでいた。増幅後、ライブラリーが完成し、シークエンシングできる状態となった。
ＴＣＲプロファイリング用ライブラリーの調製
ＴＣＲプロファイリング解析用のＴＣＲ特異的ライブラリーの調製は、チューブ内で、ＴＣＲ特異的増幅と、配列アダプターの付加とを用いて行った。ＴＣＲ特異的増幅は、ＳＭＡＲＴ Ｐｒｉｍｅｒ１（Ｒｅａｄ２配列とＳＭＡＲＴ配列を含む）と、ヒトＴＣＲアルファ／ベータ鎖定常領域に特異的なプライマー（「ＴＣＲａ／ｂ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍｅｒ１」）とを用いて行った。増幅の第１ラウンド（「ＰＣＲ １」）では、ＳＭＡＲＴ Ｐｒｉｍｅｒ１はプレ増幅ＰＣＲプライマー結合部位配列にハイブリダイズし、ＴＣＲａ／ｂ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍｅｒ１はＴＣＲアルファ／ベータ鎖定常領域にハイブリダイズした。増幅の第２ラウンド（「ＰＣＲ２」）は、ＴＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ２ Ｆｏｒｗａｒｄ ＨＴ Ｉｎｄｅｘ（Ｒｅａｄ２配列にハイブリダイズし、Ｐ７配列及びｉ７配列を導入する）と、ＴＣＲ ａ／ｂ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍｅｒ２ Ｒｅｖｅｒｓｅ ＨＴ Ｉｎｄｅｘ（増幅ＴＣＲアルファ／ベータ定常領域配列にハイブリダイズし、Ｒｅａｄ１配列、ｉ５配列及びＰ５配列を導入する）を用いて行った。増幅後、ライブラリーが完成し、シークエンシングできる状態となった。
実施例２：単一細胞Ｔ細胞レセプタープロファイリング
単一細胞を９６ウェルプレートの個々のウェル内の溶解バッファーにソーティングした。続いて、そのプレート（横列ごとにユニークインデックス付きＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑオリゴヌクレオチドを含む（Ａ〜Ｈ、図７））に、逆転写試薬を加えた。そのプレートの各ウェルで、ＲＴとプレ増幅ＰＣＲ工程を行い、縦列ごとに産物をプールし、そのｃＤＮＡ分子の由来元である個別の細胞に従ってバーコードを付与したｃＤＮＡ分子の混合物をそれぞれ含む１２個のプールを得た。その後のライブラリー構築工程は、（以下にさらに詳細に説明されているように、）１２個のプールのそれぞれに対して行い、調製する必要があるライブラリーの数を９６個から１２個に減少させた。バーコードを含めることにより、各プールにおいて、シークエンシングデータのデマルチプレックスが可能になり、それにより、ＴＣＲ−α及びＴＣＲ−βサブユニットにおいて、単一細胞の分解と、配列情報の対合とが可能になる。
単一Ｔ細胞からＴＣＲプロファイリング用ライブラリーを調製する際に用いるプロセス全体を示している全体概略図が図６に示されている。ライブラリーの調製の際に用いるプロセスは、実施例１に記載されているプロセスのＴＣＲプロファイリング用ライブラリーの調製部分と似たものであった。
簡潔に述べると、単一細胞を９６ウェルプレートにソーティングした。第１鎖ｃＤＮＡの合成をＴＣＲ ｄＴプライマーによってプライミングし、ＭＭＬＶ由来逆転写酵素（ＲＴ）によって行った。各ｍＲＮＡ分子の５’末端に達したら、このＲＴがノンテンプレートヌクレオチドを第１鎖ｃＤＮＡに付加した。ＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ（登録商標） Ｉｎｄｅｘｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅは、横列特異的インデックス配列に加えて、ＲＴによって付加したノンテンプレートヌクレオチドと相補的である配列を含んでおり、第１鎖ｃＤＮＡにハイブリダイズした。テンプレートスイッチング工程では、ＲＴは、付加配列を第１鎖ｃＤＮＡの末端に導入する際のテンプレートとして、ＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ Ｉｎｄｅｘｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅの残部を利用した。
続いて、各ウェルにおいて、プレ増幅ＰＣＲ工程を行って、ＰＣＲによる増幅とライブラリーの構築との際に出発物質として機能する二本鎖ｃＤＮＡを作製した。クリーンアップ工程後、９６ウェルプレートの各縦列のｃＤＮＡを別々のチューブにプールし（図７を参照）、オリゴヌクレオチドテンプレート配列と相補的であるプライマー（「ＳＭＡＲＴ Ｐｒｉｍｅｒ１」）と、ＴＣＲ−α及び／またはＴＣＲ−βサブユニットの定常領域（複数可）と相補的であるプライマー（「ＴＣＲａ／ｂ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍｅｒ１））とを用いて、ＴＣＲ特異的配列をＰＣＲによって増幅した。その後、ＰＣＲラウンドを行って、ＴＣＲ−α及び／またはＴＣＲ−βサブユニットの可変領域をさらに増幅して、ＴＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ２ Ｆｏｒｗａｒｄ ＨＴ ＩｎｄｅｘとＴＣＲ ａ／ｂ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍｅｒ２ Ｒｅｖｅｒｓｅ ＨＴ Ｉｎｄｅｘを用いて、アダプター配列を導入した。プライマーに含まれていたのは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シークエンシングプラットフォームと適合性があるアダプターとインデックス配列（それぞれ、ｒｅａｄ２＋ｉ７＋ Ｐ７及びｒｅａｄ１＋ｉ５＋Ｐ５）であった。精製、サイズ選別及び品質解析後、３００ｂｐのペアエンドリードを用いて、ＴＣＲ ｃＤＮＡライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームでシークエンシングした。
ワークフロー性能の試験を行うために、ＴＣＲ−α配列ライブラリーとＴＣＲ−β配列ライブラリーとを単一Ｊｕｒｋａｔ細胞または単一細胞当量のＪｕｒｋａｔ ＲＮＡ（２．５ｐｇのＲＮＡ）のいずれかから作製した。同じ種類のインプットごとに異なるＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ Ｉｎｄｅｘｅｄ Ｏｌｉｇｏを用いて、８個の細胞と８個のＲＮＡ試料とを９６ウェルプレートで個別に処理した。各ウェルにおいて、ＲＴ及びプレ増幅ＰＣＲ反応を行い、上記のように、次のＰＣＲラウンドの前に、同じ種類のインプットに由来するｃＤＮＡ産物を一緒にプールした。３００ｂｐのペアエンドリードを用いて、最終的なライブラリーをＭｉＳｅｑでシークエンシングした。シークエンシング後、ＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ Ｉｎｄｅｘｅｄ Ｏｌｉｇｏに由来するバーコード配列を用いて、シークエンシングデータをデマルチプレックスしてから、ＭｉＸＣＲを用いて、そのデータを解析した（Ｂｏｌｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２（５）：３８０−３８１）。
各細胞またはＲＮＡ試料由来のＴＣＲ−αまたはＴＣＲ−βのＣＤＲ３領域にマッピングされたシークエンシングリードの割合（％）を求めた（図８）。各ＲＮＡ試料では、リードの＞９６％が、いずれかのＴＣＲサブユニットにマッピングされた。解析した８個の細胞のうち７個で、リードの＞８９％がいずれかのＴＣＲサブユニットにマッピングされた。
各細胞またはＲＮＡ試料から、予想されるＪｕｒｋａｔクロノタイプ（ＴＲＡＶ８−４、ＴＲＡＪ３／ＴＲＢＶ１２−３、ＴＲＢＪ１−２）にマッピングされたシークエンシングリードの割合（％）も求めた（図９）。各ＲＮＡ試料では、リードの＞９２％で、正確なＪｕｒｋａｔクロノタイプが同定された。リードアラインメントデータと一致して、解析した８個の細胞のうち７個で、リードの＞８６％において、正確なＪｕｒｋａｔクロノタイプが同定された。
要約すると、９６ウェル形状のアッセイアプローチでのＪｕｒｋａｔ細胞の試験によって、平均でシークエンシングリードの９２％がＴＣＲ配列にマッピングされた一方で、リードの平均９０％で、正確なＪｕｒｋａｔクロノタイプが同定されたことが示された。
実施例３：ＩＣＥＬＬ８システムを用いた単一細胞Ｔ細胞レセプタープロファイリング
ａ．２つのプライマーの媒介によるｃＤＮＡ合成
マルチサンプルナノディスペンサー（ＭＳＮＤ）形状でも、単一細胞ＴＣＲプロファイリングを試験した。ＷａｆｅｒＧｅｎ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）ＩＣＥＬＬ８（登録商標）ＭＳＮＤシステムを用いて、細胞と試薬とをナノリットルの体積で、ＩＣＥＬＬ８（登録商標）チップのウェルに分注した。ワークフローは概して、図１０に概説されている。
オンチップ反応プロセスには、３つの分注工程を含めた。「分注＃１」（単一細胞溶液）では、ＭＳＮＤを用いて、ポアソン統計によって定められたように、単一細胞収量を最大限にするように設計した方法を用いて、ＷａｆｅｒＧｅｎ ７２×７２チップに、プレプリントしたバーコード付きＰＣＲプライマーとともに（またはこのプライマーなしに）、Ｔ細胞を分注した。ＣｅｌｌＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ソフトウェア（Ｗａｆｅｒｇｅｎ，Ｆｒｅｍｏｎｔ ＣＡ）を用いて、細胞の自動イメージングを行った。単一細胞を含むウェルをダウンセレクトして、各バーコードが１回のみ用いられるようにした。ウェル特異的アドレスをもたらす、チップ上の各バーコード（ｎ＝１，７２８）は３コピー存在した。細胞をオンチップで凍結融解によって溶解し、即座に処理した。
「分注＃２」（ＲＴミックス）では、第１鎖ｃＤＮＡ合成をＴＣＲ ｄＴプライマーによってプライミングし、細胞溶解バッファーの存在下で、ＭＭＬＶ由来逆転写酵素（ＲＴ）によって行った。各ｍＲＮＡ分子の５’末端に達したら、このＲＴがノンテンプレートヌクレオチドを第１鎖ｃＤＮＡに付加した。ＳＭＡＲＴＳｅｑｖ４ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅは、このＲＴによって付加したノンテンプレートヌクレオチドと相補的である配列を含み、第１鎖ｃＤＮＡにハイブリダイズした。テンプレートスイッチング工程では、ＲＴは、付加配列を第１鎖ｃＤＮＡの末端に導入する際のテンプレートとして、ＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ ｖ４テンプレートスイッチングオリゴの残部を利用した。
分注＃３（プレ増殖ミックス）では、１０サイクルのプレ増幅を行って、プレプリントしたＰＣＲ１−Ａ Ｐｒｉｍｅｒを導入した（ＴＣＲ ｄＴ Ｐｒｉｍｅｒと併用した）。チップの内容物は、固定具を用いて、遠心分離によって抽出してから、カラム精製する。
ＰＣＲ増幅反応をチューブで行った。オリゴヌクレオチドテンプレート配列と相補的であるインデックス付きプライマー（ＴＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ２ Ｆｏｒｗａｒｄ ＨＴ Ｉｎｄｅｘ）と、ＴＣＲ−α及び／またはＴＣＲ−βサブユニットの定常領域（複数可）と相補的であるプライマー（ＴＣＲ α／β Ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍｅｒ１）とを用いて、ＴＣＲ ｃＤＮＡの完全長可変領域をＰＣＲによって選択的に増幅した。ＴＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ２ Ｆｏｒｗａｒｄ ＨＴ ＩｎｄｅｘとＴＣＲ ａ／ｂ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍｅｒ２ Ｒｅｖｅｒｓｅ ＨＴ Ｉｎｄｅｘとを用いて、その後のＰＣＲラウンドを行って、ＴＣＲ−α及び／またはＴＣＲ−βサブユニットの可変領域をさらに増幅し、アダプター配列を導入した。プライマーに含まれていたのは、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットフォームと適合するアダプター配列とインデックス配列（それぞれＲｅａｄ２＋ｉ７＋ Ｐ７及びＲｅａｄ１＋ｉ５＋Ｐ５）とであった。精製、サイズ選別及び品質解析後、３００ ｂｐのペアエンドリードを用いて、ＴＣＲ ｃＤＮＡライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームでシークエンシングした。
オンチップワークフローでのＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）ｃＤＮＡ合成キット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）の性能を評価するために、ＩＣＥＬＬ８（登録商標）ＭＳＮＤシステムを用いて作製したシークエンシングデータを３つの独立したライブラリー調製ランについて解析した。そのプロトコールは最初、Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＲＮＡコントロール試料で行い、ライブラリーは、単一のバーコードを用いて作製した（（１）及び（２））。続いて、１，７２８個のバーコードを含むプレプリントチップで検証を行った。得られたｃＤＮＡライブラリーをシークエンシングしてから、ＭｉＸＣＲを用いて解析した（Ｂｏｌｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２（５）：３８０−３８１）。
単一のバーコードを用いた検証実験では、１，４７１個のＪｕｒｋａｔ細胞と、６個または４８個のＰＢＭＣ ＲＮＡコントロールウェルとを最終的なライブラリーに含めた。これらの実験のいずれでも、ＴＣＲ−αまたはＴＣＲ−βのＣＤＲ３領域にマッピングされたリード数は良好であった（ラン１（１）では約８４％、ラン２（２）では約６９％であった）とともに、これらのリードの大部分をクロノタイプコールに用いた。（１）では、クロノタイプコールに用いたリードの９９％超によって、正確なＪｕｒｋａｔクロノタイプ（ＴＲＡＶ８−４、ＴＲＡＪ３／ＴＲＢＶ１２−３、ＴＲＢＪ１−２）が同定された。ＰＢＭＣ ＲＮＡコントロール試料をより多く用いた（２）では、この値は、約９５％であった（残りの約５％リードでは、ＰＢＭＣ ＲＮＡコントロールに存在する別のクロノタイプが同定された）。
続いて、１，７２８個のバーコードをプレプリントしたＩＣＥＬＬ８（登録商標）ＭＳＮＤチップにおけるワークフローを試験した。この実験では、８２４個のＪｕｒｋａｔ細胞、１０個のＪｕｒｋａｔ ＲＮＡコントロール及び１０個のＰＢＭＣコントロールを最終的なライブラリーに含めた。このケースでは、リードの約６７％が、ＴＣＲ−αまたはＴＣＲ−βのＣＤＲ３領域にマッピングされた。クロノタイプコールに用いたリードの９９％超で、正確なＪｕｒｋａｔクロノタイプ（ＴＲＡＶ８−４、ＴＲＡＪ３／ＴＲＢＶ１２−３、ＴＲＢＪ１−２）が同定されたとともに、アルファ鎖及びベータ鎖のいずれも良好に示された。このデータの概要は、以下の表に示されている。
単一のＪｕｒｋａｔ細胞に由来するシークエンシングリードのアラインメントをさらに解析した。上記の実験に含めた細胞のうち、無作為に選択した２５個の細胞のシークエンシングデータを解析して、ＴＣＲ−αまたはＴＣＲ−βのＣＤＲ３領域にマッピングされたシークエンシングリードの割合（％）を求めた。この解析結果は図１１に示されており、各細胞に関して、「Ｒ」は横列の位置、「Ｃ」は縦列の位置を指している。細胞の大半（２１／２５）において、リードの＞６０％が、ＴＣＲ−α配列またはＴＣＲ−β配列にマッピングされた。いずれの細胞においても、正確なＪｕｒｋａｔクロノタイプ（ＴＲＡＶ８−４、ＴＲＡＪ３／ＴＲＢＶ１２−３、ＴＲＢＪ１−２）が同定された。コントロールウェルから得たデータでも、同様の範囲のアラインメント率が得られた。
上記結果から、ＭＳＮＤ形状における単一細胞ＴＣＲプロファイリングによって、約１，０００個の細胞のシークエンシングライブラリーを一度に作製でき、これらのライブラリーを併せてプールして、１回のラン（例えば、ＭｉＳｅｑ（登録商標）での１回のラン）できちんと解析できることが示されている。このアプローチを用いて、個別のＪｕｒｋａｔ細胞を解析したところ、大半の細胞において、リードの＞６０％がＴＣＲ配列にマッピングされたことが確認され、これらのリードの約７０〜８０％をクロノタイプの同定で使用した。
ｂ．単一プライマーの媒介による、ｃＤＮＡの合成
図１２Ａ〜１２Ｄには、上記実施例の変形形態のうち、ＩＣＥＬＬ８（登録商標）ＭＳＮＤシステムを用いてｃＤＮＡを作製する際に、単一のプライマーを使用し、さらに、そのｃＤＮＡを本発明の実施形態に従って用いる変形形態が例示されている。上記の実施例３ａにおけるように、ＷａｆｅｒＧｅｎ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）ＩＣＥＬＬ８（登録商標）ＭＳＮＤシステムを用いて、細胞と試薬とをナノリットルの体積で、ＩＣＥＬＬ８（登録商標）ＭＳＮＤチップのウェルに分注する。
図１２Ａに示されているオンチップ反応プロセスは、３つの分注工程を含む。「分注＃１」（単一細胞溶液）では、ＭＳＮＤのディスペンサーを用いて、ポアソン統計によって定められたように、単一細胞収量を最大限にするように設計した方法を用いて、プレプリントバーコード付きＴＳＯを含むＷａｆｅｒＧｅｎ ７２×７２ＳｍａｒｔＣｈｉｐチップにＴ細胞を分注する。バーコード付きＴＳＯは、１つ以上のプライマー結合部位とバーコード配列とを含むことができる。そのバーコード配列は、その７２×７２ＳｍａｒｔＣｈｉｐの同じウェルに由来することを示すウェルバーコード配列であることができる。ＣｅｌｌＳｅｌｅｃｔ（登録商標）というソフトウェアで、細胞の自動イメージングを行う。単一細胞を含むウェルをダウンセレクトして、各バーコードが１回のみ用いられるようにする。細胞をオンチップで凍結融解によって溶解し、即座に処理する。
「分注＃２」（ＲＴ−ＰＣＲミックス）では、第１鎖ｃＤＮＡの合成をオリゴｄＴプライマーによってプライミングし、細胞溶解バッファーの存在下で、ＭＭＬＶ由来逆転写酵素（ＲＴ）によって行う。各ｍＲＮＡ分子の５’末端に達したら、このＲＴがノンテンプレートヌクレオチドを第１鎖ｃＤＮＡに付加する。プレプリントＴＳＯは、ＲＴによって付加されるノンテンプレートヌクレオチドと相補的である配列を含み、第１鎖ｃＤＮＡにハイブリダイズした。テンプレートスイッチング工程では、ＲＴは、付加配列を第１鎖ｃＤＮＡの末端に導入するためのテンプレートとして、ＴＳＯの残部を用いる。
例示されているプロトコールでは、１回のプライマー増幅で二本鎖ｃＤＮＡの合成を可能にするために、ＴＳＯ及びＣＤＳの末端配列は、同じである。ＴＳＯは、１つ以上の追加のＴＳＯ特異的配列を含んでよく、この配列は、例えば、プライマー結合部位、ＵＭＩ、細胞／試料バーコードなどであることができる。チップ上に保持したままで、単一のプライマーを用いてｃＤＮＡを増幅することによって、（図１２Ｂのバイオアナライザー波形に示されているように）完全長ｃＤＮＡライブラリーを作製する。その単一のプライマーは、新たなプライマーであることも、逆転写で用いたＴＳＯ及びＣＤＳプライマーであることもできる。
図１２Ｃに示されているように、試料をチップから取り出し、プロトコールの「オフチップ」部分でプールする。続いて、２つの試料を作製するために、プールした試料を分割してよい。一方の試料は、免疫細胞レセプターレパートリーシークエンシングライブラリーの作製に用いてよい。もう一方の試料は、ＷＴＡまたはその他の遺伝子特異的増幅に用いてよい。
例示されているように、免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーを作製するための試料は、ＴＣＲα／β遺伝子特異的プライマーとＴＳＯ末端特異的プライマーを用いて増幅してよい。第２のネステッドＰＣＲ増幅も行ってよい。図１２Ｄのバイオアナライザー波形に示されているように、増幅によって、ＴＣＲαレセプターとβレセプターの両方を含むライブラリーを作製できる。
上記のプロトコールを実施する例では、２つのチップに、異なるＴ細胞株を分注した。チップ１は、１８８個のＴＡＬＬ−１０４細胞と、２つのポジティブコントロールウェル（Ｊｕｒｋａｔ ＲＮＡ−５ｐｇ／ウェル）と、２つのネガティブコントロールウェルとを有していた。チップ２は、９４個のＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞と、ＰＭＡで処理した９４個のＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞と、２つのポジティブコントロールウェル（Ｊｕｒｋａｔ ＲＮＡ−５ｐｇ／ウェル）と、２つのネガティブコントロールウェルとを有していた。
細胞をＩＣＥＬＬ８（登録商標）ＭＳＮＤシステムでソーティングし、上記のようなＴＣＲ増幅方法を行った。ライブラリーをシークエンシングして解析した。図１３に示されているように、実験で用いたＣＣＲＦ細胞とＴＡＬＬ細胞とのＴＣＲαレセプター及びＴＣＲβレセプターを同定できた。また、ＰＭＡで処理したＣＣＲＦ細胞では、αレセプターリード及びβレセプターリードの増加が見られたことから、この方法によって、活性化細胞におけるレセプターを検出できることが示された。図１３に示されているように、Ｅｘｃｅｌを用いて、ＭｉＸＣＲの出力データをフィルタリングして、ＴＣＲαクロノタイプとＴＣＲβクロノタイプとの両方において、１×ＰＢＳのネガティブコントロールよりも高いリード閾値が定められた（実線は、８０リードカウントを示している）。ＪＭＰソフトウェアを用いてデータを解析し、ボックスプロットにプロットし、このプロットでは、下方のバーは、２５パーセンタイルを示しており、上方のバーは、７５パーセンタイルを示している。各点は、細胞におけるＴＣＲαクロノタイプとＴＣＲβクロノタイプを示している。オンチップネガティブコントロールを用いて、試料と、ＮＴＣまたは「ジャンクな」低リードクロノタイプとを区別可能にする閾値を設定した。無刺激のＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞及びＪｕｒｋａｔ ＲＮＡ（ポジティブコントロール）と刺激したＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞及びＪｕｒｋａｔ ＲＮＡとから生成されたデータが示されている。ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞をホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）で誘導することにより、ＴＣＲα遺伝子の発現が増加する。ＰＭＡで処理したかまたは処理しなかった細胞を用いて、ＣＣＲＦ−ＣＥＭデータを生成した。ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞をＰＭＡで処理したところ、コール率が、ＴＣＲαクロノタイプとＴＣＲβクロノタイプとのデータに基づくと４倍向上した（１４％から５２％）。
図１４Ａ及び１４Ｂには、図１２Ａ〜１２Ｄのプロトコールに従って作製した最初の増幅二本鎖ｃＤＮＡ試料から分割した試料で、全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）が成功したことが示されている。増幅反応を分割することによって作製した全トランスクリプトーム増幅物（ＷＴＡ）をＮＥＸＴＥＲＡ（商標）核酸ライブラリー調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で処理して、アンプリコンを断片化し、アダプター配列を付加した。ＴＳＯ特異的配列（例えばプライマー結合部位）に特異的なプライマーと、Ｎｅｘｔｅｒａ導入アダプターに特異的なプライマーとを用いて、アンプリコンの５’末端を増幅した。５’発現差ライブラリーをシークエンシングして、遺伝子本体のカバレッジと主要な遺伝子成分とについて解析した。図１４Ａ及びＢに示されているように、この５’ＤＥライブラリー調製方法では、アンプリコンの５’末端が十分に捕捉され、同様に異なる細胞種も同定された。
添付の請求項にもかかわらず、本開示は、以下の付記によっても定義される。
１．リボ核酸（ＲＮＡ）試料から発現ライブラリーと免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーとを調製する方法であって、
（ａ）テンプレートスイッチング逆転写反応を用いて、産物二本鎖ｃＤＮＡをＲＮＡ試料から作製することと、
（ｂ）作製した産生二本鎖ｃＤＮＡを第１の反応混合物と第２の反応混合物とに分割することと、
（ｃ）産生二本鎖ｃＤＮＡを末端捕捉して、発現ライブラリーを第１の反応混合物から作製し、産物二本鎖ｃＤＮＡの免疫細胞特異的ｃＤＮＡを増幅して、免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーを第２の反応混合物から作製することと
を含む、方法。
２．末端捕捉と増幅とを同時に行う、付記１に記載の方法。
３．末端捕捉と増幅とを順次に行う、付記１に記載の方法。
４．ＲＮＡ試料を細胞試料から得る、付記１〜３のいずれかに記載の方法。
５．ＲＮＡ試料を単一細胞から得る、付記１〜３のいずれかに記載の方法。
６．単一細胞はＴ細胞である、付記５に記載の方法。
７．単一細胞はＢ細胞である、付記５に記載の方法。
８．分割の前に、複数の単一細胞ＲＮＡ試料から作製した産物二本鎖ｃＤＮＡをプールすることをさらに含む、付記５〜７のいずれかに記載の方法。
９．産物二本鎖ｃＤＮＡを作製する際に用いるプライマーまたはオリゴヌクレオチドは、産物二本鎖ｃＤＮＡの作製元である単一細胞を特定するインデックス付与配列を含む、付記５〜８のいずれかに記載の方法。
１０．プライマーまたはオリゴヌクレオチドは、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドである、付記９に記載の方法。
１１．単一細胞を生体試料から得る、付記５〜１０のいずれかに記載の方法。
１２．セルソーターを用いて、単一細胞を単離することをさらに含む、付記１１に記載の方法。
１３．セルソーターはフローサイトメーターである、付記１２に記載の方法。
１４．セルソーターはマルチウェルベースのシステムである、付記１２に記載の方法。
１５．発現ライブラリーは、５’末端ライブラリーである、付記１〜１４のいずれかに記載の方法。
１６．発現ライブラリーは、３’末端ライブラリーである、付記１〜１４のいずれかに記載の方法。
１７．発現ライブラリーと、免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーとをシークエンシングすることをさらに含む、付記１〜１６のいずれかに記載の方法。
１８．シークエンシングした発現ライブラリーの発現差解析をさらに含む、付記１７に記載の方法。
１９．発現差解析は全トランスクリプトーム解析（ＷＴＡ）を含む、付記１８に記載の方法。
２０．発現差解析はターゲット発現解析を含む、付記１８または１９に記載の方法。
２１．ターゲット発現解析は免疫遺伝子発現解析を含む、付記２０に記載の方法。
２２．免疫細胞レセプター特異的ｃＤＮＡは、免疫細胞レセプター配列の５’末端を含む、付記１〜２１のいずれかに記載の方法。
２３．免疫細胞レセプター特異的ｃＤＮＡは、完全長免疫細胞レセプター配列を含む、付記１〜２２のいずれかに記載の方法。
２４．増幅作業は、第２の反応混合物と、５’増幅プライマー及び免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーとを接触させることを含む、付記１〜２３のいずれかに記載の方法。
２５．免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーは、免疫細胞レセプターの１つ以上の鎖の定常領域に特異的にハイブリダイズする、付記２４に記載の方法。
２６．免疫細胞レセプターは、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）である、付記２５に記載の方法。
２７．１つ以上の鎖は、ＴＣＲ−α鎖、ＴＣＲ−β鎖またはこれらの両方である、付記２５または２６に記載の方法。
２８．免疫細胞レセプターは、Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）である、付記２５に記載の方法。
２９．１つ以上の鎖は、免疫グロブリン鎖である、付記２５または２８に記載の方法。
３０．免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーは、１つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、付記２４〜２９のいずれかに記載の方法。
３１．５’増幅プライマーは、インデックス付与配列を含む、付記２４〜３０のいずれかに記載の方法。
３２．５’増幅プライマーは、１つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、付記２４〜３１のいずれかに記載の方法。
３３．末端捕捉は、第１の反応混合物と末端増幅プライマーとを接触させることを含む、付記１〜３２のいずれかに記載の方法。
３４．末端捕捉は、５’末端捕捉を含む、付記３３に記載の方法。
３５．５’末端捕捉は、第１の反応混合物と５’末端増幅プライマーとを接触させることを含む、付記３４に記載の方法。
３６．５’末端増幅プライマーは、１つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、付記３５に記載の方法。
３７．末端捕捉は、３’末端捕捉を含む、付記３３に記載の方法。
３８．３’末端捕捉は、第１の反応混合物と３’末端増幅プライマーとを接触させることを含む、付記３７に記載の方法。
３９．３’末端増幅プライマーは、１つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、付記３８に記載の方法。
４０．末端捕捉は、タグメンテーションを行って、タグメンテーション後増幅プライマー結合ドメインを産物二本鎖ｃＤＮＡに付加することを含む、付記１〜３９のいずれかに記載の方法。
４１．タグメンテーションは、末端増幅プライマーと、タグメンテーション後増幅プライマー結合ドメインにハイブリダイズするタグメンテーション後増幅プライマーとを用いて、産物二本鎖ｃＤＮＡを増幅することを含む、付記４０に記載の方法。
４２．タグメンテーションは、産物二本鎖ｃＤＮＡとＴｎ５トランスポザーゼとを接触させることをさらに含む、付記４０または４１に記載の方法。
４３．産物二本鎖ｃＤＮＡを作製することは、産物二本鎖ｃＤＮＡを生成するために十分な条件下で、
ＲＮＡ試料と、
第１鎖相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）プライマーと、
３’ハイブリダイゼーションドメイン及び５’アダプター配列結合ドメインを含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドと、
逆転写酵素と、
ｄＮＴＰと
を反応混合物において混ぜ合わせることを含む、付記１〜４２のいずれかに記載の方法。
４４．単一細胞のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）をシークエンシングすることをさらに含む、付記１〜４３のいずれかに記載の方法。
４５．単一細胞のｇＤＮＡを、シークエンシングの前に単離することをさらに含む、付記４４に記載の方法。
４６．単一細胞のｇＤＮＡをシークエンシングすることは、免疫座特異的シークエンシングを含む、付記４４または４５に記載の方法。
４７．免疫座特異的シークエンシングは、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）座特異的シークエンシングを含む、付記４６に記載の方法。
４８．免疫座特異的シークエンシングは、Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）座特異的シークエンシングを含む、付記４６または４７に記載の方法。
４９．単一細胞のｇＤＮＡをシークエンシングすることは、全ゲノムシークエンシングを含む、付記４４〜４８のいずれかに記載の方法。
５０．発現ライブラリーは、完全長発現ライブラリーである、付記１〜４９のいずれかに記載の方法。
５１．５’増幅プライマーと、
免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーと、
末端増幅プライマーと
を含むキット。
５２．ポリ（ｄＴ）プライマーをさらに含む、付記５１に記載のキット。
５３．５’増幅プライマーは、インデックス付与配列を含む、付記５１または５２に記載のキット。
５４．５’増幅プライマーは、１つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、付記５１〜５３のいずれかに記載のキット。
５５．免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーは、インデックス付与配列を含む、付記５１〜５４のいずれかに記載のキット。
５６．免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーは、１つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、付記５１〜５５のいずれかに記載のキット。
５７．末端増幅プライマーは、インデックス付与配列を含む、付記５１〜５６のいずれかに記載のキット。
５８．末端増幅プライマーは、１つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、付記５１〜５７のいずれかに記載のキット。
５９．末端増幅プライマーは、５’末端増幅プライマーである、付記５１〜５８のいずれかに記載のキット。
６０．末端増幅プライマーは、３’末端増幅プライマーである、付記５１〜５８のいずれかに記載のキット。
６１．テンプレートスイッチング逆転写反応を行うための１つ以上の成分であって、５’アダプター配列を含むテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含む成分をさらに含む、付記５１〜６０のいずれかに記載のキット。
６２．５’増幅プライマーは、５’アダプター配列またはその相補体を含む、付記６１に記載のキット。
６３．末端増幅プライマーは、５’アダプター配列またはその相補体を含む、付記６１または６２に記載のキット。
６４．５’増幅プライマーの５’部分と同一の配列を含む第２の５’増幅プライマーを含む、付記５１〜６３のいずれかに記載のキット。
６５．免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーの部分と同一の配列を含む第２の免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーを含む、付記５１〜６４のいずれかに記載のキット。
６６．その部分は、免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーの５’部分である、付記６５に記載のキット。
６７．その部分は、免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーの３’部分である、付記６５に記載のキット。
６８．タグメンテーション反応を行うための１つ以上の成分をさらに含む、付記５１〜６７のいずれかに記載のキット。
６９．タグメンテーション反応を行うための１つ以上の成分は、
タグメンテーション後増幅プライマー結合ドメインを含むトランスポゾン核酸、
タグメンテーション後増幅プライマー結合ドメインにハイブリダイズするタグメンテーション後増幅プライマー、
トランスポザーゼまたは
これらを組み合わせたもの
を含む、付記６８に記載のキット。
７０．トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼである、付記６９に記載のキット。
７１．複数の単一細胞から免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）複数の各単一細胞からＲＮＡ試料を単離することと、
（ｂ）テンプレートスイッチング逆転写反応を用いて、ＲＮＡ試料からインデックス付き産物二本鎖ｃＤＮＡを作製することと、
（ｃ）作製したインデックス付き産物二本鎖ｃＤＮＡをプールすることと、
（ｄ）インデックス付き産物二本鎖ｃＤＮＡの免疫細胞特異的ｃＤＮＡを増幅して、単一細胞インデックス付き免疫細胞特異的ｃＤＮＡを含む免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーを作製することと
を含む方法。
７２．単一細胞は、Ｔ細胞である、付記７１に記載の方法。
７３．単一細胞は、Ｂ細胞である、付記７１に記載の方法。
７４．インデックス付き産物二本鎖ｃＤＮＡを作製する際に用いるプライマーまたはオリゴヌクレオチドは、単一細胞を特定するインデックス付与配列を含む、付記７１〜７３のいずれかに記載の方法。
７５．プライマーまたはオリゴヌクレオチドは、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドである、付記７４に記載の方法。
７６．プライマーまたはオリゴヌクレオチドは、テンプレートスイッチング逆転写反応で用いるテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドの５’部分と同一である配列を含む５’増幅プライマーである、付記７４に記載の方法。
７７．インデックス付き免疫細胞レセプター特異的ｃＤＮＡは、免疫細胞レセプター配列の５’末端を含む、付記７１〜７６のいずれかに記載の方法。
７８．インデックス付き免疫細胞レセプター特異的ｃＤＮＡは、完全長免疫細胞レセプター配列を含む、付記７１〜７７のいずれかに記載の方法。
７９．増幅は、プールしたインデックス付き産物二本鎖ｃＤＮＡと、５’増幅プライマー及び免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーとを接触させることを含む、付記７１〜７８のいずれかに記載の方法。
８０．免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーは、免疫細胞レセプターの１つ以上の鎖の定常領域に特異的にハイブリダイズする、付記７９に記載の方法。
８１．免疫細胞レセプターは、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）である、付記８０に記載の方法。
８２．１つ以上の鎖は、ＴＣＲ−α鎖、ＴＣＲ−β鎖またはこれらの両方である、付記８１に記載の方法。
８３．免疫細胞レセプターは、Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）である、付記８０に記載の方法。
８４．１つ以上の鎖は、免疫グロブリン鎖である、付記８３に記載の方法。
８５．免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーは、１つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、付記７９〜８４のいずれかに記載の方法。
８６．５’増幅プライマーは、インデックス付与配列を含む、付記７９〜８５のいずれかに記載の方法。
８７．５’増幅プライマーは、１つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、付記７９〜８６のいずれかに記載の方法。
８８．単一細胞を生体試料から得る、付記７９〜８７のいずれかに記載の方法。
８９．セルソーターを用いて、単一細胞を単離することをさらに含む、付記８８に記載の方法。
９０．セルソーターは、フローサイトメーターである、付記８９に記載の方法。
９１．セルソーターは、マルチウェルベースのシステムである、付記８９に記載の方法。
９２．単一細胞のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）をシークエンシングすることをさらに含む、付記７１〜９１のいずれかに記載の方法。
９３．単一細胞のｇＤＮＡを、シークエンシングの前に単離することをさらに含む、付記９２に記載の方法。
９４．単一細胞のｇＤＮＡをシークエンシングすることは、免疫座特異的シークエンシングを含む、付記９２または９３に記載の方法。
９５．免疫座特異的シークエンシングは、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）座特異的シークエンシングを含む、付記９４に記載の方法。
９６．免疫座特異的シークエンシングは、Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）座特異的シークエンシングを含む、付記９４または９５に記載の方法。
９７．単一細胞のｇＤＮＡをシークエンシングすることは、全ゲノムシークエンシングを含む、付記９２〜９６のいずれかに記載の方法。
９８．免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーをシークエンシングすることをさらに含む、付記７１〜９７のいずれかに記載の方法。
９９．５’アダプター配列を含むテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドと、
５’アダプター配列を含む５’増幅プライマーと、
免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーと
を含むキット。
１００．テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドは、インデックス付与配列を含む、付記９９に記載のキット。
１０１．５’増幅プライマーは、インデックス付与配列を含む、付記９９または１００に記載のキット。
１０２．５’増幅プライマーは、１つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、付記９９〜１０１のいずれかに記載のキット。
１０３．免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーは、インデックス付与配列を含む、付記９９〜１０２のいずれかに記載のキット。
１０４．免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーは、１つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、付記９９〜１０３のいずれかに記載のキット。
１０５．キットは、ポリ（ｄＴ）プライマーを含む、付記９９〜１０４のいずれかに記載のキット。
１０６．テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに加えて、テンプレートスイッチング逆転写反応を行うための１つ以上の成分をさらに含む、付記９９〜１０５のいずれかに記載のキット。
１０７．第２の５’増幅プライマーを含む、付記９９〜１０６のいずれかに記載のキット。
１０８．第２の５’増幅プライマーは、１つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、付記１０７に記載のキット。
１０９．第２の５’増幅プライマーは、５’増幅プライマーの５’部分と同一の配列を含む、付記１０７または１０８に記載のキット。
１１０．第３の５’増幅プライマーをさらに含む、付記１０７〜１０９のいずれかに記載のキット。
１１１．第３の５’増幅プライマーは、１つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、付記１１０に記載のキット。
１１２．第３の５’増幅プライマーは、第２の５’増幅プライマーの５’部分と同一の配列を含む、付記１１０または１１１に記載のキット。
１１３．第２の５’増幅プライマーは、５’増幅プライマーに結合された５’ノンテンプレート配列に存在するプライマー結合部位にハイブリダイズする配列を含む、付記１０７または１０８に記載のキット。
１１４．免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーの部分と同一の配列を含む第２の免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーを含む、付記９９〜１１３のいずれかに記載のキット。
１１５．その部分は、免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーの５’部分である、付記９９〜１１４のいずれかに記載のキット。
１１６．その部分は、免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーの３’部分である、付記９９〜１１４のいずれかに記載のキット。
明瞭な理解のために、上記の発明について、実例と実施例によって、ある程度詳細に説明してきたが、本発明の教示に鑑みれば、添付の請求項の趣旨または範囲から逸脱せずに、本発明に対して特定の変更と修正を行ってよいことは当業者には容易に分かる。
したがって、上記の内容は、本発明の原理を例示しているに過ぎない。本明細書に明示的には説明されたり示されたりしていないが、本発明の原理を具体化するとともに、その趣旨及び範囲に含まれる様々な構成を当業者は考案できることが分かるであろう。さらに、本明細書に示されている実施例と特定の用語とはいずれも、原則として、当該技術分野の促進に本発明者が寄与する本発明の原理及び概念を読み手が理解することを補助するように意図されており、このように具体的に示されている実施例と条件とには限定しないものとして解釈すべきである。さらに、本発明の原理、態様及び実施形態、ならびにその具体的な実施例を示している本明細書の記述はいずれも、その構造的均等物と機能的均等物との両方を含むように意図されている。加えて、このような均等物には、構造にかかわらず、現在知られている均等物と、将来開発される均等物、すなわち、開発されるいずれかの要素のうち、同じ機能を果たす要素との両方が含まれるように意図されている。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示されたり、説明されたりしている例示的な実施形態に限定するようには意図されていない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は、添付の請求項によって具体化される。
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９（ｅ）条に従い、２０１７年２月１６日に出願した米国特許仮出願第６２／４５９，８５８号の出願日に基づく優先権を主張するものであり、この仮出願の開示内容は、参照により本明細書に援用される。

Claims (15)

  1. リボ核酸（ＲＮＡ）試料から発現ライブラリーと免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーとを調製する方法であって、
    （ａ）テンプレートスイッチング逆転写反応を用いて、ＲＮＡ試料から産物二本鎖ｃＤＮＡを作製することと、
    （ｂ）作製した産物二本鎖ｃＤＮＡを第１の反応混合物と第２の反応混合物とに分割することと、
    （ｃ）前記産物二本鎖ｃＤＮＡを末端捕捉して、前記第１の反応混合物から発現ライブラリーを作製し、前記産物二本鎖ｃＤＮＡの免疫細胞特異的ｃＤＮＡを増幅して、前記第２の反応混合物から免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーを作製することと
    を含む、方法。
  2. 前記ＲＮＡ試料を細胞試料から得る、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＲＮＡ試料を単一細胞から得る、請求項２に記載の方法。
  4. 前記単一細胞は、Ｔ細胞またはＢ細胞である、請求項３に記載の方法。
  5. 複数の単一細胞ＲＮＡ試料から作製した産物二本鎖ｃＤＮＡを、前記（ｂ）での分割前にプールすることをさらに含む、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記産物二本鎖ｃＤＮＡを作製する際に用いるプライマーまたはオリゴヌクレオチドは、前記産物二本鎖ｃＤＮＡの作製元である単一細胞を特定するインデックス付与配列を含む、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記プライマーまたはオリゴヌクレオチドは、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドである、請求項６に記載の方法。
  8. 前記発現ライブラリーと前記免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーをシークエンシングすることをさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記前記（ｃ）での増幅は、前記第２の反応混合物と、５’増幅プライマー及び免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーとを接触させることを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
  10. 前記免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーは、免疫細胞レセプターの１つ以上の鎖の定常領域に特異的にハイブリダイズする、請求項９に記載の方法。
  11. 前記免疫細胞レセプターは、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記産物二本鎖ｃＤＮＡを作製することは、前記産物二本鎖ｃＤＮＡを生成するために十分な条件下で、
    前記ＲＮＡ試料と、
    第１鎖相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）プライマーと、
    ３’ハイブリダイゼーションドメイン及び５’アダプター配列結合ドメインを含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドと、
    逆転写酵素と、
    ｄＮＴＰと
    を反応混合物において混ぜ合わせることを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
  13. ５’増幅プライマーと、
    免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーと、
    末端増幅プライマーと
    を含む、キット。
  14. 複数の単一細胞から免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーを調製する方法であって、
    （ａ）前記複数の各単一細胞からＲＮＡ試料を単離することと、
    （ｂ）テンプレートスイッチング逆転写反応を用いて、前記ＲＮＡ試料からインデックス付き産物二本鎖ｃＤＮＡを作製することと、
    （ｃ）作製したインデックス付き産物二本鎖ｃＤＮＡをプールすることと、
    （ｄ）前記インデックス付き産物二本鎖ｃＤＮＡの免疫細胞特異的ｃＤＮＡを増幅して、単一細胞インデックス付き免疫細胞特異的ｃＤＮＡを含む免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーを作製することと
    を含む、方法。
  15. ５’アダプター配列を含むテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドと、
    前記５’アダプター配列を含む５’増幅プライマーと、
    免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーと
    を含む、キット。


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