JP2020201243A - センシングシステム、及びセンシング方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ナノ粒子と検知面との相互作用を促進し、広い範囲にわたって個々の粒子を追跡することのできるセンシング技術を提供することを目的とする。【解決手段】センシングシステムは、所定の検知エリアを有する基板と、前記基板上に供給される粒子を前記基板と水平な方向に駆動する第１駆動手段と、前記検知エリアでの前記粒子の動きを追跡するトラッキング手段と、を有する。【選択図】図１

Description

本発明は、微細な粒子を用いたセンシングシステムと、センシング方法に関する。

ナノ粒子は、医療診断用の標識（ラベル）として有用であり、様々な研究がなされている。ナノ粒子は、ＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immunosorbent Assay：酵素結合免疫吸着アッセイ）、免疫クロマトグラフィー（ラテラルフローアッセイ）などの商業的な医療診断システムで、高い選択性をもつ生物学的標識として用いられている。

生物材料を用いたバイオセンシングやバイオアッセイで、ナノ粒子は重要な役割を果たす。ナノ粒子に特定の物質または分子と結合しやすいリガントを付着しておくことで、その物質または分子を検出することができる。

バイオアッセイには主として、ヘテロジニアスアッセイと、ホモジニアスアッセイの２つのタイプがある。ヘテロジニアスアッセイは、溶液中のナノ粒子が、相補的な分子で表面が官能基化された固体の検知面と相互作用する。ホモジニアスアッセイは、均質な液体媒質中で相補的な抗体と抗原の相互作用が起きる。へトロジニアスアッセイでは、限られた検知エリアで分子間の相互作用が起きるのに対し、ホモジニアスアッセイでは分子間の相互作用はバルク中で起きる。

基板表面を撮影して得られる画像データから基板上の粒子の分布を計算する手法が提案されている（たとえば、特許文献１参照）。また、磁性粒子を用いたバイオセンシングが提案されている（たとえば、特許文献２参照）。

特開２０１７−１４６１４８号公報 特開２０１７−１４６１４９号公報

ナノ粒子と検知面との間の相互作用は、一般的に粒子のブラウン運動によって生じ、相互作用はランダムに起きる。ホモジニアスアッセイで高い信号対雑音比でロバストな検出を行うには、長いインキュベーション（定温放置）期間が必要である。

ＥＬＩＳＡのような光電子倍増管による蛍光検出や、磁気センサでは、広い範囲にわたって個々の粒子を追跡することが困難である。

本発明は、ナノ粒子と他の物質との相互作用、あるいはナノ粒子同士の相互作用を促進し、広い範囲にわたって個々の粒子を追跡することのできるセンシング技術を提供することを目的とする。

本発明の一態様では、センシングシステムは、
所定の検知エリアを有する基板と、
前記基板上に供給される粒子を、前記基板と水平な方向に駆動する第１駆動手段と、
前記検知エリアでの前記粒子の動きを追跡するトラッキング手段と、
を有する。

一つの構成例では、前記検知エリアは、前記基板上で第１の方向に延びる第１の電極対と、前記第１の方向と直交する第２の方向に延びる第２の電極対とによって区画され、所望の広さの検知エリアを設けることができる。
別の構成例として、前記粒子を前記基板と垂直な方向の所定の空間範囲に維持する第２駆動手段を設けてもよい。この場合、第１駆動手段と第２駆動手段で、粒子の動きを３次元的に制御することができる。

ナノ粒子と検知面との相互作用が促進され、広い範囲にわたって個々の粒子を追跡することができる。このセンシング技術は、バイオセンシング、医療診断技術、ポイントオブケア診断などに有効に適用することができる。

実施形態のセンシングシステムの模式図である。 基板上の電極パターンと検知エリアの顕微画像である。 電流の流れ方向の違いによる電気ポテンシャルエネルギー分布図である。 ヘテロジニアスなセンシングシステムの模式図である。 図４のシステムで用いられる磁性粒子の図である。 検知エリア内に分布する磁性ビーズの顕微画像である。 電界の印加による粒子の動きを示す図である。 図７の領域での粒子の軌道を示す図である。 個々の粒子の位置追跡を示す図である。 個々の粒子の振動周波数を示す図である。 個々の粒子の追跡結果を示す図である。 電極パターンの変形例を示す図である。 図１２の電極パターンを有するセンシングシステムで測定したカリブレーションカーブ（標準曲線）である。 ホモジニアスなセンシングシステムの模式図である。 ホモジニアス・バイオセンシングによる粒子挙動の観察結果を示す図である。 ホモジニアス・バイオセンシングによる粒子挙動の観察結果を示す図である。 ＮＨ２ビーズ濃度を変化させたときの磁性粒子の振幅分布を示す図である。 実施形態の粒子トラッキングのためのトレーニングデータの生成と、学習済みのニューラルネットワークによる粒子トラッキングのフローチャートである。 ニューラルネットワークの一例を示す図である。 学習用の合成フレームと、対応する確率マップの図である。 ニューラルネットワークへの入力画像と、出力された確率マップを示す図である。

図１は、実施形態のセンシングシステム１の模式図である。センシングシステム１は、粒子の制御と、粒子の反応または振舞いの解析とを行う。センシングシステム１は、所定の検知エリア４０が形成された基板２１と、基板２１上に供給される粒子の動きを制御する駆動機構と、顕微鏡２５と、情報処理装置１０を有する。

基板２１には、電極パターン２１１ａ、及び２１１ｂが形成されており、電極パターン２１１ａ及び２１１ｂの内側が検知エリア４０となっている。この構成例では、電極パターン２１１ａ及び２１１ｂと、電極パターン２１１ａ及び２１１ｂに接続される電流源２３で、駆動機構が構成される。

情報処理装置１０は、プロセッサ１１、メモリ１２、ディスプレイ１３、通信インタフェース（Ｉ／Ｆ）１４、及びカメラ１５を有し、これらはバス１６によって相互接続されている。情報処理装置１０は、スマートフォン、タブレット端末、パーソナルコンピュータ等である。

情報処理装置１０のカメラ１５は、顕微鏡２５の接眼レンズと光学的に接続される。顕微鏡２５は、一般的な光学顕微鏡であり、カメラ１５と顕微鏡２５の接眼レンズの間に、ミラー等の光学系が挿入されていてもよい。あるいは、情報処理装置１０のカメラ１５を直接、接眼レンズの上に配置してもよい。カメラ１５は、ビデオカメラ機能を有していることが望ましい。たとえば、スマートフォンのカメラ用の開口部を、直接顕微鏡２５の接眼レンズの上に置いてもよい。

電極パターン２１１ａ及び２１１ｂによって、検知エリア４０内の粒子３０に、基板２１と水平な方向に力が働くと（点線の双方向矢印）、粒子３０は、基板２１の表面近傍で水平方向に移動する。この例では、電圧を印加して電流を流し、基板と水平方向の電界を発生させている。カメラ１５は、粒子３０を撮影し、撮影データを取得する。

撮影データは、情報処理装置１０内のプロセッサ１１によって処理され、解析されてもよいし、通信インタフェース１４を介して、外部の解析装置に送信されてもよい。撮影データの処理及び解析には、粒子３０のトラッキングが含まれる。粒子３０は、電流源２３を含む駆動機構によって、基板２１上の比較的広い検知エリア４０内を移動する。検知エリア４０内で粒子３０に反応が起きたとき、あるいは粒子３０が別の物質と結合したときに、粒子３０の動きが止まる。粒子３０の動きを追跡することで、反応または結合の有無を解析することができる。

図１の例では、顕微鏡２５とカメラ１５、及びプロセッサ１１によってトラッキング手段が構成されるが、粒子３０のサイズによっては、顕微鏡２５を用いずに、直接、カメラ１５によって粒子３０の動画像を取得してもよい。情報処理装置１０は、４Ｋ解像度の映像出力に対応しているのが好ましいが、この要件は必須ではない。実施形態では、ビデオ画像のひとつの画素の解像度を１００ｎｍ程度とする。

粒子３０が所定の質量を有するときは、重力によって、基板２１の表面近傍に位置することができる。電極パターン２１１ａ及び２１１ｂを介して交流電界が印加されているときも、粒子３０は、基板２１から一定の高さ範囲で、面内方向に移動する。

粒子３０を自重によって基板２１の表面近傍に維持することが難しい場合は、基板２１の表面から一定の高さ範囲内に粒子３０を維持するために、粒子３０に対して基板２１と垂直な方向の力（図中の実線の矢印）を作用させる第２の駆動手段を用いてもよい。図１の例では、第２の駆動手段として、マグネット２２が基板２１の裏面に配置されている。マグネット２２により、基板２１と垂直な方向に磁力が働く。粒子３０が磁性を帯びる場合は、磁力によって基板２１と垂直な方向で粒子３０の位置が制御される。

電流源２３に接続された電極パターン２１１ａ及び２１１ｂによって、水平方向に交流電界が生成され、マグネット２２によって垂直方向の磁力が働く。検知エリア４０内に非線形または不均一な電磁場が生成され、粒子３０に電気双極子モーメントが誘起されて、誘電泳動する。粒子３０は、基板２１上の検知エリア４０内で、基板２１の表面から一定の高さ範囲を保ったまま、面内方向に移動する。

粒子３０を基板２１の近傍に維持する第２の駆動手段は、マグネット２２に限定されない。斜め下方に向かう電界を印加してもよいし、真空吸着力、電気泳動力、誘電泳動力等の外力を印加してもよい。

図２は、基板２１に形成される検知エリア４０の顕微画像である。基板２１の表面に、互いに９０°の角度で配置される電極パターン２１１ａ、２１１ｂ、２１１ｃ、及び２１１ｄが形成されている。電極パターン２１１ａ〜２１１ｄの内側の領域が、検知エリア４０である。検知エリア４０は５００μｍ×５００μｍ以上であり、従来の検知エリアと比較して格段に広い。

基板２１は、たとえばＳｉ／ＳｉＯ_２基板である。電極パターン２１１ａ〜２１１ｄは、ＳｉＯ_２膜上に形成された金（Ａｕ）等の導体膜である。電極パターン２１１ａ〜２１１ｄは、真空蒸着とエッチング、電子ビームリソグラフィを用いたリフトオフ法など、任意の方法で形成することができる。図２の例で、検知エリア４０のサイズは５７５μｍ×５７５μｍである。図２の電極パターンの形状、材料等は一例であって、互いに９０°の角度で配置される２組の電極によって検知エリア４０が規定されるかぎり、より簡単な電極パターンが形成されてもよい。他の電極パターンについては、後述する。

検知エリア４０に供給されるナノサイズの粒子３０に誘電泳動力を生じさせて、検知エリア４０全体にわたって移動させるには、電極パターン２１１ａと２１１ｂのペアと、電極パターン２１１ｃと２１１ｄのペアに、振幅が２０ｍＡ程度の交流電流を印加すればよい。このとき、電極パターン２１１ａと２１１ｂに流れる電流と、電極パターン２１１ｃと２１１ｄに流れる電流の位相が、互いにπ／２ずれるようにする。互いに直交する向きに配置される２組の電極パターン２１１ａと２１１ｂ、及び２１１ｃと２１１ｄを用いることで、粒子３０は楕円形の軌道を描きながら、検知エリア４０の中を移動する。

粒子３０が抗原で修飾されているときは、基板２１の表面を、プローブとしての抗体で官能基化（修飾）してもよい。電界の印加の下で、粒子３０が検知エリア４０内を移動することで、特異的な相互作用の確率が高まって検出効率が向上するとともに、非特異的な相互作用は抑制される。

図３は、一対の電極パターンの電流の流れ方向の違いによる電気ポテンシャルエネルギー分布図である。図３の（ａ）は、電極パターン２１１ｄにｙ軸に沿って正の電流を流した場合（すなわち、電極パターン２１１ｄに＋ｙ軸方向に電流を流した場合であり、その際、電極パターン２１１ｃは−ｙ軸方向に電流が流れる）、図３の（ｂ）は電極パターン２１１ｄにｙ軸に沿って負の電流を流した場合（すなわち、電極パターン２１１ｄに−ｙ軸方向に電流を流した場合であり、その際、電極パターン２１１ｃは＋ｙ軸方向に電流が流れる）に、発生したポテンシャルエネルギー分布図である。対向する一対の電極パターン２１１ｃ及び２１１ｄに、一端側の電位を固定し、他端で電位が正弦波的に変化するように、ｙ軸方向に沿って電流を印加し、ラプラス方程式を解くことで検知エリア４０のポテンシャルエネルギー分布が計算されている。

図３の（ａ）では、ｘ＝０、ｙ＝２でポテンシャルエネルギーが最も大きくなり、＋ｘ方向に力が働く。図３の（ｂ）でｙ軸に沿って負の電流を印加すると、−ｘ方向に力が働く。この正弦波の場により、粒子３０はｘ方向に沿って振動する。電極パターン２１１ａ及び２１１ｂとともに、電極パターン２１１ｃ及び２１１ｄを用いて、ｘ軸方向とｙ軸方向に同時に、かつπ／２の位相差を与えて電流を印加すると、検知エリア４０で粒子３０は楕円形の軌道を描いて移動する。

粒子３０に作用する誘電泳動力Ｆdepは外部電界に比例し、式（１）で表される。

ここで、ｒ_０は粒子の半径、ＣＭは角周波数ωの関数としてのクラウジウス-モソッティの関係であり、ε_ｍは溶媒の誘電率、ε_ｐは粒子の誘電率である。

このような粒子の誘電泳動を利用したバイオセンシングの具体的な構成を、以下で説明する。

＜ヘテロジニアス・バイオセンシング＞
図４は、ヘテロジニアスなセンシングシステム１Ａの模式図である。センシングシステム１Ａは、情報処理装置１０としてスマートフォン１０Ａを用いる。基板２１の表面は、抗原２０１で修飾されている。互いに対向する電極２１ａと２１ｂ、及び２１ｃと２１ｄ（図２参照）で区画される領域が検知エリア４０となる。

基板２１Ａ上に、支持フレーム２８によって反応チャンバーが形成され、反応チャンバー内に磁性粒子３０Ａを含む溶液が充填されている。支持フレーム２８は、プラスチックで形成されていてもよいし、基板２１Ａと同じ材料で形成されていてもよい。支持フレーム２８で区画される反応チャンバーは、ガラスプレート２９が覆われている。スマートフォン１０Ａのカメラ機能を利用して、拡大レンズ２５Ａを介して磁性粒子３０Ａの動きを記録する。

図５は、磁性粒子３０Ａの一例を示す。図５の（ａ）は模式図、図５の（ｂ）はＴＥＭ像である。磁性粒子３０Ａは、磁性粉末３０１が分散されたポリマー３０２で形成されており、表面がリガンド３０３で修飾されている。図４の例では、基板２１Ａの表面を抗原２０１で修飾し、磁性粒子３０Ａの表面を抗体で修飾するが、基板表面を抗体で修飾して磁性粒子３０Ａの表面を抗原で修飾してもよい。

磁性粒子３０Ａの直径は、用途に応じて、サブミクロン〜数ミクロンに設定されてもよい。実際に作製されたＴＥＭ像の磁性粒子３０Ａの平均直径は２．８μｍである。磁性粒子３０Ａは、電場、または電磁場によって操作可能であり、表面の修飾が自在である。

図４のように、磁性粒子３０Ａのリガンド（抗体）の一部は、溶液中の自由抗原２０２と反応し得るが、自由抗原２０２の割合が少ない場合は、電磁界に沿って磁性粒子３０Ａが移動する過程で、基板２１Ａ上の抗原２０１と高い確率で相互作用する。このような磁性粒子３０Ａの挙動は、拡大レンズ２５Ａを介してスマートフォン１０Ａで観察され、記録される。

図６は、検知エリア４０内に分布する磁性粒子３０Ａの顕微写真である。図４のセンシングシステム１Ａでは、基板２１Ａと垂直方向への駆動手段としてマグネット２２を用いている。電界の印加前は、磁性粒子３０Ａの動きは非常に少ないか、ランダムに動くだけであり、基板２１Ａの表面に設けられた物質（たとえば抗原２０１）と相互作用する機会が限定的である。

図７は、電界の印加による磁性粒子３０Ａの動きを示す図である。図７の（ａ）は電界印加前の基板２１Ａ上の磁性粒子３０Ａの顕微画像、図７の（ｂ）は電界印加の０．５秒後の顕微画像、図７の（ｃ）は、（ａ）と（ｂ）の合成画像である。図７の（ｃ）で、濃い点が初期位置であり、薄い点が移動後の位置である。電界の印加により、多数の磁性粒子３０Ａがほぼ同じ方向に移動していることがわかる。

上述のように、電極パターン２１１ａと２１１ｂの組と、電極パターン２１１ａ及び２１１ｂの組は、その長軸が互いに直交する方向に延びるように配置されている。互いに直交する方向に所定の位相差で交流電流を流すことで、磁性粒子３０Ａは正弦波的に振動しながら検知エリア４０内を移動する。

図７の（ｃ）に示されるように、電界印加の０．５秒には、ほとんどの磁性粒子３０Ａが、紙面の水平方向から４５°の方向（右上の方向）に移動している。スマートフォン１０Ａのカメラ機能で撮影された動画像を取り込み、所定の画像処理プログラムを実行することで、個々の磁性粒子３０Ａの識別とトラッキングが可能である。あらかじめスマートフォン１０Ａに画像処理プログラムをインストールして、スマートフォン１０Ａでプログラムを実行してもよいし、スマートフォン１０ＡからＰＣ等に画像データを転送して、ＰＣで画像処理プログラムを実行してもよい。

たとえば、正規化相互相関法またはテンプレートマッチング法を使用して、ビデオフレームごとに各磁性粒子３０Ａを識別することができる。テンプレートマッチング等で得られた特徴マップにしきい値処理を施し、残りの一致部分について、「non-maximum suppression」処理によりフィルタリングを行う。「non-maximum suppression」は、重複して認識された粒子について、最大値を除く値をすべてゼロにして、検出の信頼度を高める処理である。これにより、現在のフレーム内で粒子が存在する場所を多数検出することができる。

フレーム間の磁性粒子３０Ａの時間的な関連付けは、カルマンフィルタに基づいて各粒子の運動モデルを展開することで行われる。カルマンフィルタは、粒子の速度と加速度に基づいて粒子の次の位置を予測する。特徴マップから得られた磁性粒子３０Ａの位置は、追跡対象の各磁性粒子３０Ａの運動モデルでなされた予測結果と比較される。時間的関連付けは、予測された位置から観測された位置への最近傍探索によって行われる。カルマンフィルタは、予測値と観測値の差に基づいて更新される。

図８は、検知エリア４０のうち図７に示す領域での磁性粒子３０Ａの軌道を示す図である。シミュレーションから予測され、かつ実験で観察された各磁性粒子３０Ａの楕円形の軌跡は、粒子トラッキングメカニズムによってうまく識別されている。これらの軌跡から、位置、速度、加速度などのパラメータが取得され、目的の磁性粒子３０Ａがいつ、どこで基板２１Ａの表面に捕捉されたかを明らかにすることができる。

図８からわかるように、任意の粒子の軌跡はスマートフォンで得られた高解像度ビデオ画像から確実に復元される。磁性粒子３０Ａ等の粒子が生物学的相互作用によって基板２１Ａの表面に付着し、または捕捉されると、その粒子は移動を停止するので、補捉された粒子を識別することができる。

このトラッキング方法によると、まったく運動がない状態から粒子のブラウン運動を識別することができる。検知エリア４０に電界を印加して粒子を面内方向に駆動する実施形態の構成と手法は、広い領域にわたって生物学的相互作用を促進する。また、トラッキングによって、基板２１Ａのセンシング面に付着した粒子の数を特定することができる。各粒子は個別に追跡されるので、広い面積にわたって単一の粒子でさえも検出することができる。この検出感度は、従来の磁性粒子センサと比較して、格段に高い。

図９は、個々の粒子の位置トラッキングを示す図である。横軸は時間（秒）、縦軸はｘ方向の位置（μｍ）である。電界の印加により、粒子＃１〜＃４のそれぞれが、ｘ方向に振動しながら移動している。この振動は、正弦波の交流電界の印加によるものであり、粒子間で運動の振幅は同じである。図９では、粒子＃１〜＃４は、まだ基板２１Ａの表面に捕捉されていない。

図１０は、粒子＃１〜＃４の振動周波数を示す図である。横軸は周波数（Ｈｚ）、縦軸は振幅の正規化対数である。全ての粒子が、０．５Ｈｚの前後で大きく振れている。この周波数の逆数が、印加された電界の周期である。

図１１は、粒子＃５〜＃７のトラッキング結果を示す図である。横軸は時間（秒）、縦軸はｘ方向の位置（μｍ）である。基板２１と平行な方向への電界の印加により、各粒子は基板２１上の溶媒中を移動するが、基板２１の表面に存在する物質と結合した場合、その粒子の運動は止まる。

粒子＃５は、電界の印加が開始される時点で、すでに基板２１の表面に付着または結合し、電界が印加されても、その動作は停止している。粒子＃６は、電界印加開始から約４０秒は、基板２１上を移動しているが、４０秒以降は動作が停止している。ここから、粒子＃６が基板２１の表面と相互作用した時間と、位置がわかる。

粒子＃７は、電界印加から約２０秒後に一度、動きが停止するが、相互作用が弱い等の理由により、約３２秒後に、再度、動き始める。その後、約４６秒後に基板２１上の別の位置で捕捉され、動きが止まる。

このように、個々の粒子について反応または相互作用の有無と、反応位置を高精度に検出することができる。相互作用が起きるまで、粒子は検知エリア４０の面内方向に駆動されて一か所にとどまらないので、相互作用の確率が増大し、反応効率が高い。電極パターン２１１ａ〜２１１ｄが形成された基板２１と電流／電圧源、小型の顕微鏡、及びスマートフォン等の携帯端末があれば、微粒子、分子、抗体の存在、動き、反応等を検知またはテストすることができる。

＜電極パターンの変形例＞
図４のセンシングシステム１Ａでは、図６に示すように円形の突起が形成された電極パターンを用いたが、より簡単な電極構成を採用してもよい。

図１２は、電極パターンの変形例を示す。基板２１Ａの表面に、電極パターン２１２ａ〜２１２ｄが形成されている。基板２１Ａは、たとえば、窒化ケイ素（Ｓｉ_３Ｎ_４）でコーティングされたシリコン基板である。Ｓｉ_３Ｎ_４コートの上に、厚さ１００ｎｍのチタン（Ｔｉ）の薄膜と、厚さ１００ｎｍのＡｕの薄膜を蒸着で形成し、フォトリソグラフィでパターニングすることで、電極パターン２１２ａ〜２１２ｄが形成される。

電極パターン２１２ａ〜２１２ｄで規定される検知エリア４０のサイズは、５６０μｍ×５６０μｍである。検知エリア４０の紙面の左側に多く分布する黒い点は、直径１μｍの磁性粒子である。図１２の状態で、電界は印可されていない。

電極パターン２１２ａと２１１ｂのペア、及び、電極パターン２１１ｃと２１１ｄのペアに、位相をπ／２ずらして交流電流を印加することで、検知エリア４０内で磁性粒子をらせん状に振動させながら、一定方向へ誘電泳動させることができる。

Ａ点とＤ点を結ぶ対角線での断面、あるいは、Ｐ点とＳ点を結ぶ対角線での断面が、図４の断面構成に相当する。図１２の電極パターン２１２ａ〜２１２ｄは、図１及び図６の電極パターン２１１ａ〜２１１ｄと比較して、形状がシンプルで作製が容易であり、バイオセンシング用のチップの小型化と低コスト化に適している。

図１３は、図１２の電極パターンを用いて測定された磁性粒子のカリブレーションカーブである。縦軸は、磁性粒子が基板２１Ａに捕捉される割合（％）、横軸は時間（分）である。基板２１Ａの表面はビオチンで修飾され、磁性粒子３０Ａの表面はストレプトアビジンで修飾されている。ビオチン濃度の異なる４種類の溶液中に磁性粒子３０Ａを一定濃度で分散させた溶液のそれぞれで、１分ごとに基板２１Ａへの磁性粒子の捕捉割合を計測する。

まず、脱イオン水中に体積濃度で２％の磁性粒子を分散させた磁性粒子の溶液を準備する。一方で、ビオチン濃度が２０マイクロモル（μＭ）、２００ナノモル（ｎＭ）、２ｎＭ、及び、０ｎＭの４通りのビオチン溶液を準備する。５００μＬの各ビオチン溶液に、５００μＬの磁性粒子の溶液を混合して、４種類の溶液を生成する。いずれの溶液にも、１％の磁性粒子（ストレプトアビジンでコーティングされている）が含まれている。ビオチン濃度が０ｎＭの溶液が、基準サンプルとなる。

この測定法は、競合的結合原理に基づく測定（アッセイ）である。溶液中のフリービオチンの量が多くなるほど、ストレプトアビジンで標識された磁性粒子と基板２１Ａとの相互作用が減少する。

１分経過の時点で、図中の縦棒で示される信頼区間は４つの溶液間で比較的近いが、２分以降は離れていく。２分の時点での横方向の破線は、３σ検出限界（ＬＯＤ：Limit of Detection）を示す。３σ検出限界は、基準サンプル（自由ビオチン濃度が０ｎＭ）よりも低い。図１２の結果から、図４のセンシングシステム１Ａでの検出限界は、非標識物質（フリービオチン）の濃度１ｎＭである。

非標識物質の濃度が１ｎＭ以下のときに、実施形態のセンシングシステム１Ａにより、効率的、かつ高い信頼性でヘテロジニアス・バイオセンシングを行うことができる。

＜ホモジニアス・バイオセンシング＞
本発明のバイオセンシングは、基板表面を修飾しないホモジニアス・バイオセンシングにも適用可能である。

図１４は、ホモジニアスなセンシングシステム１Ｂの模式図である。ヘテロジニアスなセンシングシステム１Ａと同様に、基板２１上に電極パターンが形成されて、電極パターンの間に検知エリア４０が形成されている。電極パターンは、図２の電極パターン２１１ａ〜２１１ｄを用いてもよいし、図１２の電極パターン２１２ａ〜２１２ｄを用いてもよい。

基板２１は修飾されていない。溶液（バルク）中に、標的物質で修飾された粒子３１０と、リガンド３０３Ｂで修飾された粒子３０−１〜３０−３が存在する。この例で、リガンド３０３Ｂはカルボキシ基（ＣＯＯＨ）である。ＣＯＯＨで修飾された粒子３０−１〜３０−３を、便宜上、ＣＯＯＨビーズと呼ぶ。ＣＯＯＨビーズの平均直径は約１μｍである。

粒子３１０は、アミノ基（ＮＨ２）で修飾されている。ＮＨ２で修飾された粒子３１０を、便宜上、ＮＨ２ビーズと呼ぶ。ＮＨ２ビーズの平均直径は、２００ｎｍである。

図１４の（ａ）で、検知エリア４０に電場が印加されることで、粒子３０−１〜３０−３は調和振動、すなわち正弦波形で表される周期運動をしながら、一定方向に移動する。 図１４の（ｂ）のように、粒子３０−２が、標的物質（ＮＨ２）で修飾された粒子３１０と結合すると、調和振動の振幅が小さくなる。

各粒子３０の挙動を追跡し、粒子の振幅の変化を検出することで、物質間の相互作用の有無、割合、タイミング等を検出することができる。

図１５は、ＣＯＯＨビーズのみの溶液（ａ）と、ＣＯＯＨビーズとＮＨ２ビーズを混合した溶液（ｂ）の、粒子挙動の観察結果である。図１５の（ａ）で観察される円形の軌跡は、電場印可下でのＣＯＯＨビーズの挙動である。図中の数字は、各ビーズの識別番号である。ＣＯＯＨビーズだけの方が、粒子の動きが大きいことがわかる。

図１６は、ＣＯＯＨビーズ単体の動きと、ＣＯＯＨにＮＨ２が結合した粒子の動きを比較する図である。縦軸は位置（μｍ）、横軸は時間（秒）である。ＣＯＯＨビーズは、大きな振幅で正弦波の周期運動をしている。一方、ＣＯＯＨにＮＨ２が結合した粒子の振幅は非常に小さいか、ほとんど振動していない。

この観察結果を利用して、各粒子の動きを追跡し、振動の停止、または所定の閾値以下への振幅の低減を検出することで、生体反応を検出することができる。ホモジニアス・バイオセンシングでは、基板２１の表面を修飾する必要がない。また、粒子３０を基板２１の表面近傍に維持するための磁場の印可が不要である。電場中の粒子のトラッキングのみで、効率的に相互作用の有無等を検出できる。

図１７は、ＮＨ２ビーズ濃度を変化させたときの粒子３０の振幅分布を示す。縦軸は確率、横軸は振幅（ピクセル数）である。ＮＨ２ビーズの濃度は、２００μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌ、１２０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、０μｇ／ｍｌの６種類である。

ＮＨ２ビーズの濃度が小さいときは、ＣＯＯＨビーズは９ピクセルにわたって大きく振動している。アミノ基の濃度が増えるほど、ＣＯＯＨに結合するＮＨ２が増え、ＣＯＯＨビーズの振幅が減少する。

実施形態のホモジニアス・バイオセンシングは、簡易なシステム構成で電場印加下の各粒子を追跡することで、効率よく生体反応の有無や進行状況を検出することができる。たとえば、抗原で修飾された微小な粒子を含むの溶液中に、抗体で修飾された粒子３０を導入して挙動を観察し、またはカウントすることで、反応位置や反応速度を推定することができる。、
＜ＡＩベースのトラッキングアルゴリズム＞
上述したヘテロジニアスまたはホモジニアスなバイオセンシングにおいて、粒子のトラッキングにニューラルネットワークを適用してもよい。実施形態のトラッキングアルゴリズムの特徴として、人工的に生成された画像データをトレーニングデータとして、ニューラルネットワークを訓練する。

図１８は、粒子トラッキングのためのトレーニングデータの生成と、学習済みのニューラルネットワークによる粒子トラッキングのフローチャートである。ステップＳ１１で、粒子が撮影された画像を取得する。すでに撮影されて保存されている画像であってもよいし、新たに撮影した画像であってもよい。後述するように、トレーニングデータの生成に多大な量の画像データは不要なので、ある程度変化のある画像が得られればよい。

ステップＳ１２で、基板上に粒子が存在しない空の基板の画像を取得する。たとえば、図２または図１２の電極パターンが形成された基板のみの画像を取得する。

ステップＳ１３で、粒子の画像と、空の基板の画像をソフトウェアで合成して、粒子の画像が既知の合成画像を生成する。合成画像は、基板上に粒子が存在しているかのように見える画像となる。生成された合成画像ごとに、そこに含まれる粒子の位置が対応付けられる。オリジナル画像（粒子の画像と空基板の画像）の数が少なくても、ソフトウェアによって所望の数、所望の種類の合成画像を生成することができる。

ステップＳ１４で、生成した合成画像をトレーニングデータとして用いて、粒子トラッキングのためのニューラルネットワークを訓練する。ステップＳ１５で、学習済みのニューラルネットワークを用いて、バイオセンシングで観測された画像中の粒子の動きをトラッキングする。ニューラルネットワークは、座標情報が既知の合成画像で訓練されているので、観測データ中の粒子の位置を正しく判定することができる。

この方法により、情報処理装置の種類に関係なく、正しく粒子をトラッキングすることができる。

現在、スマートフォンを含めて、多種多様な情報処理端末が市場に出回っている。異なる機種、異なるバージョンのスマートフォンで磁性粒子の挙動を撮影すると、ピクセルレベルで磁性粒子の外観が異なり得る。機種やバージョンごとにカメラ機能、センサのノイズ特性、フォーカシング条件等が異なるからである。２０〜３０種類のスマートフォンがある場合、スマートフォンごとに個別にトラッキングプログラムを調整することは非現実的である。

一般に、多くのスマートフォンに内蔵されているビデオカメラのフォーカス機能は、それほど精密ではない。磁性粒子を精度よく追跡するには焦点合わせが重要であるが、フォーカス機能が劣る場合でも、トラッキングプログラムで粒子を特定できることが望ましい。

実施形態では、図１８の方法に基づいて、情報処理装置間に発生し得る特性ばらつきやフォーカス機能の相違を、自動的、またはインテリジェントに理解し、調整することが可能になる。

粒子トラッキングの用途でＡＩ（Artificial Intelligence；人口知能）プログラムを訓練するには、一般的には、撮影された画像に含まれる何千万もの磁性粒子の例をＡＩプログラムに与えて、磁性粒子の位置が正しく検出されるように学習させる。膨大な画像の例と、各画像における磁性粒子の正確な位置情報とを含む「ラベル付きデータセット」が必要であるが、磁性粒子を同定する既存のデータセットは存在しない。

実施形態では、ラベル付きデータセットをプログラムにより自動生成する。上述のように、様々な粒子の画像と、空の基板の画像を組み合わせて、ランダムな位置に粒子が存在する人工画像を生成する。このような合成画像はソフトウェアによって生成されるので、粒子の位置は既知であり、何百万もの学習用の画像を生成できる。人工的に生成された画像を使用して学習されたＡＩアルゴリズムは、スマートフォン等で撮影された実際の画像から磁性粒子を正しく識別することができる。

実際にスマートフォンで撮影された画像（または焦点の合っていない画像を含む）から粒子を検出するアルゴリズムは、セマンティックセグメンテーションのタスクを実行する畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ：Convolutional Neural Network）によって実現され得る。セマンティックセグメンテーションは、画像内のピクセルの１つひとつに対して、そのピクセルが示す意味（周辺のピクセル情報を含む）をラベル付けし、カテゴリ分類する手法である。

図１９は、実施形態の粒子トラッキング用のニューラルネットワーク５００のアーキテクチャの例である。たとえば、４Ｋビデオフレームがセマンティックセグメンテーションのアルゴリズムに入力され、ビデオフレーム内の粒子分布の確率マップが出力される。出力される確率マップの各ピクセルは「０」と「１」の間の値を持つ。「１」は、そのピクセルが粒子を含むことが１００％確実であることを表す。「０」は、そのピクセルに粒子が存在しないことが１００％確実であることを示す。

サイズ２１６０×３８４０×３の４Ｋビデオフレームは、サイズが２７０×４８０×３の６４個のパッチに分割される。分割された各パッチに、第１の軸に沿ってゼロ（またはバイアス項）が埋め込まれて、２７２×４８０×３のテンソルが生成される。このテンソルは、図１９のＣＮＮを通過するＲＧＢ画像である。

図１９の例で、ＣＮＮは、フィルタ数が徐々に増大する４つの畳み込みレイヤと、フィルタ数が徐々に減少する４つの転置畳み込み（デコンボリューションとも呼ばれる）のレイヤを有する。前半の４つの畳み込みレイヤでは、２×２のストライドで、連続して画像が縮小される。畳み込み後のテンソルのサイズは、１７×３０×２５６になる。後半の転置畳み込みでは、レイヤごとにフィルタ数が低減され、２×２のストライドでテンソルがアップスケーリングされる。
ニューラルネットワーク５００の後半のテンソルを、前半のテンソルと互換性のある形状に連結（concatenate）してもよい。換言すると、ニューラルネットワーク５００のレイヤを通過するテンソルの形状が、通過方向に対称性を持つように連結されてもよい。

最終のデコンボリューションレイヤには２つのフィルタが含まれ、２７２×４８０×２のテンソルが出力される。出力テンソルの最初のフィルタは、ピクセルが背景である確率であり、２番目のフィルタは、ピクセルに粒子が存在する確率である。各ピクセルで、２つの確率の合計は１になる。ネットワークの計算コストを削減するために、ネットワークの前半で深さ方向に分離可能な畳み込みが使用されている。

各レイヤで、各ピクセルのｘ位置とｙ位置が入力テンソルと連結されて、ピクセル位置に関するより多くの情報がネットワークに提供される。ＣＮＮの中に座標情報を取り込むこの手法は、CoordConvとして知られている。

畳み込み、及び転置畳み込みのカーネルサイズは、各レイヤで３×３である。すべてのレイヤでバッチ正規化が行われてもよい。後半の転置畳み込みのレイヤでは、バッチノルムは連結の後に適用される。

最終レイヤでの活性化関数として、ピクセル単位でsoftmax（正規化指数）関数を用いてもよい。最終レイヤ以外のレイヤでは、活性化関数としてLeaky ReLu関数（負の部分の勾配係数α＝０．３）が用いてもよい。

出力では、softmaxクロスエントロピー損失が計算される。最適化アルゴリズムとしてAdamオプティマイザを適用し、標準的な誤差逆伝播（back-propagation）アルゴリズムを用いてモデルを訓練してもよい。学習率は、最初は５×１０^−５から始め、各エポックで２倍に減衰させてオプティマイザの収束を加速してもよい。

上述したように、粒子トラッキングのためにＡＩアルゴリズムを実現する際の最大のハードルは、ニューラルネットワーク５００を訓練するための既存のデータセット（画像及びこれに対応する確率マップの例）が存在しないことである。

実施形態では、合成データセットを生成し、これを用いてニューラルネットワーク５００を訓練する。具体的には、実験データから磁性粒子のテンプレートを抽出し、粒子がまったく存在しない空の基板のフレームに重ねる。重ね合わせはソフトウェアで行われるので、粒子の正確な位置は既知である。この位置情報に基づいて、画像に対応する確率マップを生成する。合成データ生成のプログラミング言語としてCythonを用い、Ｃコードにコンパイルして実行速度を高めてもよい。

図１８の方法により、実際に、約３７万個の合成フレームパッチと、対応する確率マップを生成し、これらのトレーニングデータを用いて、５エポックでニューラルネットワーク５００を訓練する。

図２０は、生成された合成フレーム（ａ）と、ニューラルネットワーク５００で出力された確率マップ（ｂ）である。確率マップ（ｂ）で、明るい点は、高い確率でその粒子が存在することを示している。

合成フレーム（ａ）では磁性粒子の輪郭がシャープな境界線となっており、人間の目からすると、自然に取られた画像ではないことは明らかである。合成フレームは人工的なデータであるが、このデータで訓練されたニューラルネットワーク５００は、スマートフォンで撮影された実際のビデオデータに非常に良く機能する。

図２１は、ニューラルネットワーク５００への入力画像と、出力（予測）された確率マップを示す。左側の画像（ａ）、（ｃ），（ｅ）が実際にスマートフォンで撮影され、ニューラルネットワーク５００に入力された画像である。右側の画像（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）が対応する確率マップである。

画像（ａ）では、サークルで囲まれた領域に、ポリマー汚染物質が写っている。対応する確率マップ（ｂ）では、このポリマー汚染物質はトラッキングアルゴリズムによって無視され、粒子の存在確率が非常に低い（暗い）ピクセルとして提示されている。

画像（ｃ）に対しては、確率マップ（ｄ）によって、画像内のすべての粒子がうまく検出されている。

画像（ｅ）では、粒子とともに基板上の電極パターンが写っている。ニューラルネットワーク５００は合成データによって学習済みであり、確率マップ（ｆ）で電極パターンは無視されて、電極パターン上と近傍の磁性粒子がうまく検出されている。

図２１から、ニューラルネットワーク５００により、鮮明な粒子像が確率マップとして得られることがわかる。図２０、及び図２１では、１種類の粒子についてのみニューラルネットワーク５００を適用しているが、アルゴリズムを微調整することで、異なる種類の粒子を検出し、それらを互いに異なるものとして識別することも可能である。ニューラルネットワーク５００を用いた粒子のトラッキングは、ヘテロジニアスなバイオセンシングにも、ホモジニアスなバイオセンシングにも適用可能である。

実施形態のセンシングシステムは、ナノ粒子またはミクロ粒子を用いたバイオセンシングや医療診断に有効に適用できる。特に、診療所、自宅、病院の診察室、ベッドサイド、手術室等の医療の現場で行うポイントオブケアの検査に良好に適用される。実施形態のシステムは、特に以下の利点を有する。
（ａ）検知エリア４０は、従来の磁気センサの検知エリアと比較して、はるかに大きい。
（ｂ）単一の粒子の軌跡を追跡することができる。
（ｃ）数千個の粒子を個別かつ同時に追跡可能であり、センサの感度を向上し、ダイナミクスの範囲を拡張することができる。
（ｄ）粒子を駆動する機構は、粒子の特性に応じて選択できるので、使用される粒子の性質として、磁性、非磁性、荷電、非荷電を問わない。
（ｅ）粒子を面内方向に駆動する電界は、磁気センサの磁力と比較してはるかに強く、必要な電流量は小さい。消費電力が低減されるだけでなく、大電流の磁力ベースのセンサに一般的に必要とされる冷却機構が不要になる。
（ｆ）ホモジニアスセンシングでは、基板の修飾や磁界の印可は不要であり、簡単な電極パターンのみでセンシング用の標識粒子と、標的物質との相互作用を促進することができる。
（ｇ）合成データを用いて訓練したニューラルネットワークを用いることで、正確かつ鮮明に粒子をトラッキングすることができる。

実施形態のセンシング方法は、基板上に所定の検知エリアを形成し、基板上に供給される粒子３０を基板２１と水平な方向に駆動し、検知エリア内の粒子３０の運動をトラッキング手段で追跡することで実現される。

基板２１と水平な方向への駆動手段の一例として、電界を印加するが、誘導泳動力、電気泳動力、その他の外力を利用してもよい。基板２１と垂直な方向への駆動手段として、磁界の印加に替えて、誘導泳動力、電気泳動力、吸着力などの外力を用いてもよいし、粒子自体の自重と重力を利用してもよい。垂直方向の誘導泳動力を用いる場合、粒子３０は非磁性粒子でよい。

基板２１と水平な方向と垂直な方向の駆動手段を用いることで、基板２１上で粒子３０の三次元的な動きを制御することができる。

溶媒中に分散された粒子３０を基板２１上に供給する場合は、電極パターンが形成された基板２１の全体を容器内に収容してもよい。シリコン酸化膜付きのシリコン基板を加工する際に、電極パターンの外側に一定の高さの外壁を形成しておいてもよい。外壁で囲まれた検知エリア４０に、粒子３０を含む溶媒を注入することで、試料をテストすることができる。

粒子３０が抗原で修飾（官能基化）されている場合、基板２１の表面にプローブとして設けられている相補的な抗体によって捕捉される。粒子２０が検知エリア４０内を効率的に移動するほど、抗原と抗体の相互作用の確率は高くなる。電磁力を利用して粒子３０を駆動する場合、印加する電磁力の大きさ、方向、タイミングなどの制御が容易であり、かつ精密に制御することができる。粒子３０と基板表面との生物学的相互作用の確率が向上するとともに、非特異的相互作用を抑制できる。

スマートフォン等の情報処理端末の高解像度ビデオ機能を用いる場合、視野内のすべての粒子３０を追跡することができ、基板２１の表面と生物学的に相互作用した粒子、あるいはバルク中で標的粒子と相互作用したセンシング粒子を識別することができる。生物学的に相互作用するセンシング粒子の数は、標的分子の濃度と強く相関する。従って、ビデオ中の粒子を追跡することで、標的生体分子の濃度の決定が容易になる。

実施形態の構成は、光源を捕捉抗体と検出抗体でサンドイッチして検出するサンドイッチアッセイと異なり、標識抗原を用いた競合的バイオアッセイに適している。

基板２１の表面を修飾せずに、センシング粒子の表面が抗体で修飾（官能基化）されている場合は、均質な溶媒中でセンシング粒子と標的となる抗原の相互作用が起きる。相互作用により形成されたクラスターをトラッキング手段で追跡し、クラスターの数を識別することができる。

粒子３０として、蛍光性の粒子を用いる場合、粒子３０からの光学的な反射信号または透過信号を用いる替わりに、蛍光信号を取得することができる。この場合、光学顕微鏡に替えて、蛍光顕微鏡を用いてもよい。

実施形態の構成と手法は、ブラウン運動する粒子を、動きを示さない粒子から追跡して識別する場合にも適用可能である。

スマートフォン等の情報処理装置で取得されたビデオ画像は、クラウドコンピューティング等を介して遠隔処理されてもよい。この手法は、特にポイントオブケアのテスティングに有用である。あるいは、情報処理装置による処理の結果を、リアルタイムで地理的に離れて位置する患者と医療専門家との間で共有することが可能である。

１、１Ａ、１Ｂ センシングシステム
１０ 情報処理装置
１０Ａ スマートフォン
１１ プロセッサ
１２ メモリ
１３ ディスプレイ
１４ 通信インタフェース
１５ カメラ
１６ バス
２１、２１Ａ 基板
２１１ａ〜２１１ｄ、２１２ａ〜２１２ｄ 電極パターン
２２ マグネット
２３ 電流源
２５ 顕微鏡
２５Ａ 拡大レンズ
３０、３０−１〜３０−３ 粒子
３０Ａ 磁性粒子
４０ 検知エリア
２０１ 抗原
３０３，３０３Ｂ リガンド
５００ ニューラルネットワーク

Claims (18)

1. 所定の検知エリアを有する基板と、
   前記基板上に供給される粒子を前記基板と水平な方向に動かす第１駆動手段と、
   前記検知エリアでの前記粒子の動きを追跡するトラッキング手段と、
   を有するセンシングシステム。
2. 前記第１駆動手段は、前記基板上で第１の方向に延びる第１の電極対と、前記第１の方向と直交する第２の方向に延びる第２の電極対とを含み、
   前記検知エリアは、前記第１の電極対と前記第２の電極対に囲まれている請求項１に記載のセンシングシステム。
3. 前記第１駆動手段は、前記第１の電極対と前記第２の電極対に、位相が互いに９０度ずれた交流電流を印可する電流源を含む請求項２に記載のセンシングシステム。
4. 前記粒子を、前記基板と垂直な方向で所定の空間範囲に維持する第２駆動手段、
   をさらに有し、
   前記第１駆動手段と前記第２駆動手段で、前記粒子の動きが３次元的に制御される、
   請求項１〜３のいずれか１項に記載のセンシングシステム。
5. 前記第２駆動手段は、前記基板と垂直な方向に外力を印加する外力印加手段であり、
   前記粒子は、前記外力によって前記所定の空間範囲に維持される請求項４に記載のセンシングシステム。
6. 前記粒子は磁性粒子であり、前記外力印加手段によって、前記基板と垂直な方向に磁力が印加される、請求項５に記載のセンシングシステム。
7. 前記粒子は非磁性粒子であり、前記外力は、誘電泳動力または吸着力である、請求項５に記載のセンシングシステム。
8. 前記粒子は、所定以上の重さを有し、
   前記粒子は、重力によって前記基板と垂直な方向で所定の空間範囲に維持される、
   請求項１または２に記載のセンシングシステム。
9. 前記粒子は蛍光粒子であり、前記トラッキング手段は前記蛍光粒子からの蛍光信号を個別にモニタする、請求項１〜８のいずれか１項に記載のセンシングシステム。
10. 前記基板の前記検知エリアに、前記粒子を捕捉する捕捉手段が設けられており、前記トラッキング手段は、前記粒子の捕捉を検出する請求項１〜９のいずれか１項に記載のセンシングシステム。
11. 前記粒子は抗原で修飾され、前記捕捉手段は、相補的な抗体で修飾された前記基板の表面である、請求項１０に記載のセンシングシステム。
12. 前記粒子は抗体で修飾され、前記捕捉手段は、相補的な抗原で修飾された前記基板の表面である、請求項１０に記載のセンシングシステム。
13. 前記粒子は標識粒子であり、
    前記標識粒子は、前記検知エリアに導入される標的物質によって捕捉される、
    請求項１〜３のいずれか１項に記載のセンシングシステム。
14. 前記標識粒子は、前記標的物質との結合により、振幅が低減し、
    前記トラッキング手段は、前記標識粒子の振幅低下を検出することで、前記標的物質の存在を検知する、請求項１３に記載のセンシングシステム。
15. 基板上に所定の検知エリアを形成し、
    前記基板上に供給される粒子を、前記検知エリア内で前記基板と水平な方向に駆動し、
    前記検知エリア内の前記粒子の運動をトラッキング手段で追跡する、
    センシング方法。
16. 人工的に生成された合成画像をトレーニングデータとして用いてニューラルネットワークを訓練し、
    学習済みの前記ニューラルネットワークを前記トラッキング手段に適用する、
    請求項１５に記載のセンシング方法。
17. 粒子が撮影された画像と、粒子が存在しない空の基板の画像をソフトウェアで合成して前記粒子の座標情報が既知の画像データを前記合成画像として生成する、
    請求項１６に記載のセンシング方法。
18. 前記検知エリア内の前記粒子を撮影し、
    撮影された画像を前記ニューラルネットワークに入力し、
    粒子の存在を示す確率マップをトラッキング結果として前記ニューラルネットワークから出力する、
    請求項１６または請求項１７に記載のセンシング方法。