JP2020189811A - Gel composition and gel dried product - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ゲル組成物及びゲル乾燥物に関する。 The present invention relates to gel compositions and dried gels.
フェリチンは原核生物、古細菌、植物、高等真核生物など生物界に広く存在する鉄貯蔵タンパク質である。フェリチンは１本のポリペプチド鎖から形成されるサブユニットが２４個自己集合した球状タンパク質である（図１）。フェリチンの分子量は４５０ｋＤａであり、その直径は約１２ｎｍである。フェリチンのサブユニットは、４本のαヘリックスを束ねた４ヘリックスバンドル構造を形成している（図１）。 Ferritin is an iron storage protein that is widely present in the living world such as prokaryotes, archaea, plants, and higher eukaryotes. Ferritin is a globular protein in which 24 subunits formed from a single polypeptide chain are self-assembled (Fig. 1). Ferritin has a molecular weight of 450 kDa and its diameter is about 12 nm. The ferritin subunit forms a 4-helix bundle structure in which four α-helices are bundled (Fig. 1).
フェリチンは球殻状であり、通常のタンパク質に比べ高い熱安定性及びｐＨ安定性を示す。そのため、フェリチンはドラッグデリバリーシステムの研究に利用されている。また、フェリチンは鉄以外にもクロム又はコバルトを酸化物として球殻内に取り込むことが可能である（Ｒ．Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｉｗａｈｏｒｉ，Ｍ．Ｍｕｒａｏｋａ，Ｉ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，２００５，７８，２０７５−２０８１（非特許文献１））。また、半導体の材料である硫化カドミウム又は硫化亜鉛をフェリチンの球殻内に合成した例が報告されている（Ｋ．Ｉｗａｈｏｒｉ，Ｉ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，１９，４９５６０１（非特許文献２）、Ｉ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｋ．Ｉｗａｈｏｒｉ，Ｓ．Ｋｕｍａｇａｉ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２０１０，１８００，８４６−８５７（非特許文献３））。上述のような特性からフェリチンは量子ドット又は内部メモリーへの応用も期待されている。 Ferritin has a spherical shell shape and exhibits higher thermal stability and pH stability than ordinary proteins. Therefore, ferritin is used in the study of drug delivery systems. In addition to iron, ferritin can also incorporate chromium or cobalt as an oxide into the sphere shell (R. Tsukamoto, K. Iwahori, M. Muraoka, I. Yamashita, Bull. Chem. Soc. Jpn. , 2005, 78, 2075-2081 (Non-Patent Document 1)). Further, an example in which cadmium sulfide or zinc sulfide, which is a semiconductor material, is synthesized in a ferritin spherical shell has been reported (K. Iwaori, I. Yamashita, Nanotechnology, 2008, 19, 495601 (Non-Patent Document 2)). I. Yamashita, K. Iwaori, S. Kumagai, Biochim. Biophyss. Acta, 2010, 1800, 846-857 (Non-Patent Document 3). Ferritin is also expected to be applied to quantum dots or internal memory due to the above-mentioned characteristics.
以上のようにフェリチンは機能性材料として様々な研究が進んでいるタンパク質の１つである。しかし、その多くはフェリチン２４量体（２４個のサブユニットからなるフェリチン）である。フェリチンのゲルを作製することでフェリチンの研究発展及び産業への応用が進行することが期待される。 As described above, ferritin is one of the proteins for which various studies are progressing as a functional material. However, most of them are ferritin dimers (ferritin consisting of 24 subunits). It is expected that the research and development of ferritin and its application to industry will be promoted by producing a ferritin gel.
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、フェリチン様サブユニットに由来するポリペプチドを主成分とするゲル組成物及びゲル乾燥物を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a gel composition and a gel dried product containing a polypeptide derived from a ferritin-like subunit as a main component.
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、所定の濃度のフェリチンのサブユニットを含む溶液を酸性状態にして再び元のｐＨに戻すことによって、ゲル組成物が得られることを見いだし、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の通りである。 As a result of diligent research, the present inventors have found that a gel composition can be obtained by acidifying a solution containing a predetermined concentration of ferritin subunit and returning it to the original pH. Was completed. That is, the present invention is as follows.
［１］フェリチン様サブユニットのアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び、液体物質を含むゲル組成物。
［２］上記フェリチン様サブユニットのアミノ酸配列は、
（Ａ）配列表の配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列、
（Ｂ）配列表の配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列、及び
（Ｃ）配列表の配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、［１］に記載のゲル組成物。
［３］Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｄ又はＰｔに対する金属捕捉能を有する、［１］又は［２］に記載のゲル組成物。
［４］上記液体物質は、水、又はアルコールである、［１］〜［３］のいずれかに記載のゲル組成物。
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載のゲル組成物から上記液体物質が除去されている、ゲル乾燥物。
[1] A gel composition containing a polypeptide having an amino acid sequence of a ferritin-like subunit and a liquid substance.
[2] The amino acid sequence of the ferritin-like subunit is
(A) The amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing,
(B) An amino acid sequence in which at least one amino acid is substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing, and SEQ ID NOs: 1 to (C) in the sequence listing An amino acid sequence having 90% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence according to any one of 4.
The gel composition according to [1], which comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of.
[3] The gel composition according to [1] or [2], which has a metal trapping ability for Fe, Co, Ni, Cu, Pd or Pt.
[4] The gel composition according to any one of [1] to [3], wherein the liquid substance is water or alcohol.
[5] A gel dried product in which the liquid substance is removed from the gel composition according to any one of [1] to [4].
本発明によれば、フェリチン様サブユニットに由来するポリペプチドを主成分とするゲル組成物及びゲル乾燥物を提供することが可能になる。 According to the present invention, it is possible to provide a gel composition and a gel dried product containing a polypeptide derived from a ferritin-like subunit as a main component.
以下、本発明の実施形態を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。ここで、本明細書において「Ａ〜Ｂ」という形式の表記は、範囲の上限下限（すなわちＡ以上Ｂ以下）を意味し、Ａにおいて単位の記載がなく、Ｂにおいてのみ単位が記載されている場合、Ａの単位とＢの単位とは同じである。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described, but the present invention is not limited thereto. Here, in the present specification, the notation in the form of "A to B" means the upper and lower limits of the range (that is, A or more and B or less), and the unit is not described in A and the unit is described only in B. In the case, the unit of A and the unit of B are the same.
≪ゲル組成物≫
本実施形態に係るゲル組成物は、フェリチン様サブユニットのアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、「フェリチン様ポリペプチド」と記載する場合がある。）、及び、液体物質を含む。上記ゲル組成物は、フェリチン様ポリペプチドを含むためＦｅ等に対する金属捕捉能を有する。「金属捕捉能」については後述する。
本実施形態において「ゲル組成物」とは、液体分散媒中に固体分散質が分散しているコロイドであって、流動性を失って固化したものをいう。
本実施形態において「フェリチン」は、公知のあらゆる生物種由来のフェリチンを意味する。このようなフェリチンとしては、例えば、ウマ由来フェリチン（配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するサブユニットから構成されるフェリチン）、ヒト由来フェリチン（配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するサブユニットから構成されるフェリチン）、マウス由来フェリチン（配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するサブユニットから構成されるフェリチン）等が挙げられる。
≪Gel composition≫
The gel composition according to the present embodiment contains a polypeptide having an amino acid sequence of a ferritin-like subunit (hereinafter, may be referred to as "ferritin-like polypeptide") and a liquid substance. Since the gel composition contains a ferritin-like polypeptide, it has a metal trapping ability for Fe and the like. The "metal trapping ability" will be described later.
In the present embodiment, the "gel composition" is a colloid in which a solid dispersoid is dispersed in a liquid dispersion medium, and is solidified by losing fluidity.
In the present embodiment, "ferritin" means ferritin derived from any known species. Examples of such ferritin include horse-derived ferritin (ferritin composed of the subunit having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) and human-derived ferritin (composed of the subunit having the subunit sequence shown in SEQ ID NO: 3). Ferritin), mouse-derived ferritin (ferritin composed of subunits having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4) and the like.
＜フェリチン様サブユニットのアミノ酸配列を有するポリペプチド＞
本実施形態において「フェリチン様サブユニット」は、フェリチンを構成するサブユニット及びその変異体を含む。言い換えると本実施形態において「フェリチン様サブユニット」は、野生型のフェリチンのサブユニット、及び変異型のフェリチンのサブユニットの両方が含まれる。野生型のフェリチンのサブユニットとしては、配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するサブユニットが挙げられる。変異型のフェリチンのサブユニットとしては、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するサブユニットが挙げられる。
<Peptide having an amino acid sequence of ferritin-like subunit>
In the present embodiment, the "ferritin-like subunit" includes subunits constituting ferritin and variants thereof. In other words, in the present embodiment, the "ferritin-like subunit" includes both a wild-type ferritin subunit and a mutant ferritin subunit. Examples of the subunit of wild-type ferritin include subunits having the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 2 to 4. Examples of the subunit of the mutant ferritin include the subunit having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
本実施形態において「ポリペプチド」とは、２以上のアミノ酸がペプチド結合することによって形成される分子を意味する。本実施形態において上記フェリチン様ポリペプチドは、１６０〜１９０アミノ酸残基のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことが好ましく、１６５〜１８５アミノ酸残基のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことがより好ましく、１６８〜１８３アミノ酸残基のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことが更に好ましい。 In the present embodiment, the "polypeptide" means a molecule formed by peptide bonding of two or more amino acids. In the present embodiment, the ferritin-like polypeptide preferably contains a polypeptide consisting of an amino acid sequence of 160 to 190 amino acid residues, and more preferably contains a polypeptide consisting of an amino acid sequence of 165 to 185 amino acid residues. It is more preferred to include a polypeptide consisting of an amino acid sequence of 168-183 amino acid residues.
上記フェリチン様サブユニットのアミノ酸配列は、
（Ａ）配列表の配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列、
（Ｂ）配列表の配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列、及び
（Ｃ）配列表の配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなることが好ましい。
The amino acid sequence of the ferritin-like subunit is
(A) The amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing,
(B) An amino acid sequence in which at least one amino acid is substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing, and SEQ ID NOs: 1 to (C) in the sequence listing An amino acid sequence having 90% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence according to any one of 4.
It is preferably composed of an amino acid sequence selected from the group consisting of.
上記（Ｂ）のアミノ酸配列について、配列表の配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列における置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸残基（変異されたアミノ酸残基）の数は、少なくとも１個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個である。変異されたアミノ酸配列は、天然に存在するアミノ酸配列、すなわち、自然発生による変異を有するアミノ酸配列であってもよく、人為的に所望の部位に変異を行ったアミノ酸配列であってもよい。人為的に所望の部位に変異を行う場合、自然発生による変異を有するアミノ酸配列に準じて人為的に変異を行ってもよい。 Regarding the amino acid sequence of (B) above, the number of amino acid residues (mutated amino acid residues) substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing is , At least 1, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 5. The mutated amino acid sequence may be a naturally occurring amino acid sequence, that is, an amino acid sequence having a naturally occurring mutation, or an amino acid sequence artificially mutated at a desired site. When artificially mutating to a desired site, the mutation may be artificially performed according to an amino acid sequence having a spontaneous mutation.
上記（Ｃ）のアミノ酸配列において、配列同一性は、参照配列（例えば、配列表の配列番号１〜４に記載のアミノ酸配列）に対して、クエリー配列（評価対象のアミノ酸配列）を、適切にアラインメントし、算出された値である。具体的には、配列同一性は、ＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムで算出することができる。 In the amino acid sequence of (C) above, the sequence identity appropriately sets the query sequence (amino acid sequence to be evaluated) to the reference sequence (for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing). It is a value calculated by aligning. Specifically, sequence identity can be calculated by the Clustal algorithm.
本実施形態においては、配列同一性は、高いほど好ましく、具体的には、９０％以上、９５％以上又は９８％以上である。配列同一性の上限は特に制限されないが、例えば、１００％未満である。 In the present embodiment, the higher the sequence identity is, the more preferable it is, and specifically, 90% or more, 95% or more, or 98% or more. The upper limit of sequence identity is not particularly limited, but is, for example, less than 100%.
上記フェリチン様ポリペプチドは、その含有割合が上記ゲル組成物全体に対して、１０質量％以上１００質量％未満であってもよいし、２０質量％以上１００質量％未満であってもよいし、２０質量％以上５０質量％以下であってもよい。 The content ratio of the ferritin-like polypeptide may be 10% by mass or more and less than 100% by mass, or 20% by mass or more and less than 100% by mass, based on the total content of the gel composition. It may be 20% by mass or more and 50% by mass or less.
また、上記フェリチン様ポリペプチドは、入手方法、製造方法は特に制限されないが、例えば、野生型のフェリチンに由来するポリペプチド、リコンビナントポリペプチド又は合成されたポリペプチドであってもよい。 The method for obtaining and producing the ferritin-like polypeptide is not particularly limited, and may be, for example, a polypeptide derived from wild-type ferritin, a recombinant polypeptide, or a synthesized polypeptide.
「野生型のフェリチン」としては、例えば、上述のウマ由来フェリチン、ヒト由来フェリチン、マウス由来フェリチン等が挙げられる。これらは、上記哺乳動物の血液等から得ることができる。具体的には、上記血液から血漿成分を採取し、採取された血漿成分から公知の方法によってフェリチンを精製すればよい。 Examples of the "wild-type ferritin" include the above-mentioned horse-derived ferritin, human-derived ferritin, and mouse-derived ferritin. These can be obtained from the above-mentioned mammalian blood and the like. Specifically, a plasma component may be collected from the blood, and ferritin may be purified from the collected plasma component by a known method.
「リコンビナントポリペプチド」とは、大腸菌、酵母、培養細胞等を宿主として、遺伝子組換え技術を用いて人工的に作製したポリペプチドを意味する。リコンビナントポリペプチドの製造方法としては、従来から知られている方法を用いればよい。具体的には、例えば以下の方法が挙げられる。まず、目的のポリペプチドをコードする塩基配列を有するベクターを宿主である大腸菌に導入し、形質転換を行う。形質転換した大腸菌を所定の培地で培養することによって、当該大腸菌に目的のポリペプチドを合成させる。 The "recombinant polypeptide" means a polypeptide artificially produced by using gene recombination technology using Escherichia coli, yeast, cultured cells, or the like as a host. As a method for producing the recombinant polypeptide, a conventionally known method may be used. Specifically, for example, the following method can be mentioned. First, a vector having a base sequence encoding the target polypeptide is introduced into Escherichia coli as a host and transformed. By culturing the transformed Escherichia coli in a predetermined medium, the Escherichia coli is allowed to synthesize the target polypeptide.
「合成されたポリペプチド」とは、原料であるアミノ酸を逐次結合させていくことによって生成されるポリペプチドを意味する。アミノ酸からの合成方法としては、例えば、固相合成法と液相合成法が挙げられる。固相合成法としては、例えば、Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法等が挙げられる。本実施形態に係るポリペプチドは、いずれの方法で合成してもよい。 The "synthesized polypeptide" means a polypeptide produced by sequentially binding amino acids as raw materials. Examples of the synthetic method from amino acids include a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method. Examples of the solid-phase synthesis method include the Fmoc method and the Boc method. The polypeptide according to this embodiment may be synthesized by any method.
例えば、上記ポリペプチドは、プロリンを担体ポリスチレンに固定し、アミノ基の保護としてｆｌｕｏｒｅｎｙｌ−ｍｅｔｈｏｘｙ−ｃａｒｂｏｎｙｌ基（Ｆｍｏｃ基）又はｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ Ｏｘｙ Ｃａｒｂｏｎｙｌ基（Ｂｏｃ基）を使用する公知の固相合成法により合成することができる。 For example, the above-mentioned polypeptide is a known solid-phase synthesis method in which proline is immobilized on a carrier polystyrene and a fluoroneur-methoxy-carbonyl group (Fmoc group) or a tert-Butyl Oxy Carbonyl group (Boc group) is used as protection of an amino group. Can be synthesized by.
＜液体物質＞
本実施形態において「液体物質」は、上記ゲル組成物が安定に存在できる限り、特に制限は無い。上記液体物質は、水又はアルコールであることが好ましい。上記アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール及びブタノール等が挙げられる。生体適合性の観点から、上記液体物質は水であることが好ましい。
<Liquid substance>
In the present embodiment, the "liquid substance" is not particularly limited as long as the gel composition can be stably present. The liquid substance is preferably water or alcohol. Examples of the alcohol include methanol, ethanol, propanol and butanol. From the viewpoint of biocompatibility, the liquid substance is preferably water.
上記液体物質は、その含有割合が上記ゲル組成物全体に対して、０質量％を超えて、９０質量％以下であってもよいし、０質量％を超えて、８０質量％以下であってもよいし、５０質量％以上８０質量％以下であってもよい。 The content ratio of the liquid substance may be more than 0% by mass and 90% by mass or less, or more than 0% by mass and 80% by mass or less with respect to the entire gel composition. It may be 50% by mass or more and 80% by mass or less.
＜その他の成分＞
本実施形態におけるゲル組成物は、上記ゲル組成物が安定に存在できる限り、その他の成分を含んでいてもよい。その他の成分としては、例えば、緩衝剤、ｐＨ調整剤、無機塩等が挙げられる。
<Other ingredients>
The gel composition in the present embodiment may contain other components as long as the gel composition can be stably present. Examples of other components include buffering agents, pH adjusters, inorganic salts and the like.
≪ゲル組成物の物性≫
＜金属捕捉能＞
本実施形態に係るゲル組成物は、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｄ又はＰｔに対する金属捕捉能を有することが好ましい。ここで、「金属捕捉能」とは、金属原子又は金属イオンを上記ゲル組成物中にとどめておき、上記ゲル組成物の外へ拡散することを抑制する能力を意味する。上記ゲル組成物は、フェリチン様ポリペプチドを含むため、Ｆｅ、Ｃｏを捕捉することに特に優れている。このように上記ゲル組成物は、所定の金属に対する金属捕捉能を有することから、例えば、工業廃水から毒性のある金属を除去する際に用いることができる。
≪Physical properties of gel composition≫
<Metal capture capacity>
The gel composition according to this embodiment preferably has a metal trapping ability for Fe, Co, Ni, Cu, Pd or Pt. Here, the "metal trapping ability" means the ability to retain a metal atom or a metal ion in the gel composition and suppress its diffusion to the outside of the gel composition. Since the gel composition contains a ferritin-like polypeptide, it is particularly excellent in capturing Fe and Co. As described above, since the gel composition has a metal trapping ability for a predetermined metal, it can be used, for example, when removing a toxic metal from industrial wastewater.
＜熱安定性＞
本実施形態にかかるゲル組成物は、２５〜６０℃において安定であることが好ましい。ここで、「２５〜６０℃において安定である」とは、２５〜６０℃において、上記ゲル組成物が分解、変性等を起こすことなく、ゲルの状態を維持していることを意味する。
<Thermal stability>
The gel composition according to this embodiment is preferably stable at 25 to 60 ° C. Here, "stable at 25 to 60 ° C." means that the gel composition maintains the gel state at 25 to 60 ° C. without causing decomposition, denaturation, or the like.
≪ゲル乾燥物及びその物性≫
本実施形態に係るゲル乾燥物は、上記ゲル組成物から上記液体物質が除去されている。本実施形態の一側面において、上記ゲル乾燥物は、上記液体物質に対する吸収能を有することが好ましい。すなわち、上記ゲル乾燥物は、例えば吸水材として好適に用いることが可能である。
≪Dried gel and its physical properties≫
In the gel dried product according to the present embodiment, the liquid substance is removed from the gel composition. In one aspect of the present embodiment, the dried gel product preferably has an ability to absorb the liquid substance. That is, the dried gel product can be suitably used as, for example, a water absorbing material.
≪ゲル組成物の製造方法≫
本実施形態に係るゲル組成物の製造方法は、
フェリチン様サブユニットのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むフェリチン溶液を準備する工程（以下、「第一工程」という場合がある。）と、
上記フェリチン溶液のｐＨを下げる工程（以下、「第二工程」という場合がある。）と、
上記フェリチン溶液のｐＨを上げる工程（以下、「第三工程」という場合がある。）と、を含む。以下各工程について説明する。
<< Manufacturing method of gel composition >>
The method for producing the gel composition according to the present embodiment is
A step of preparing a ferritin solution containing a polypeptide having an amino acid sequence of a ferritin-like subunit (hereinafter, may be referred to as "first step") and
The step of lowering the pH of the ferritin solution (hereinafter, may be referred to as "second step") and
It includes a step of raising the pH of the ferritin solution (hereinafter, may be referred to as a “third step”). Each step will be described below.
＜第一工程＞
第一工程では、フェリチン様サブユニットのアミノ酸配列を有するポリペプチド（フェリチン様ポリペプチド）を含むフェリチン溶液を準備する。フェリチン様ポリペプチドは、上述したように公知の方法によって製造すればよい。
<First process>
In the first step, a ferritin solution containing a polypeptide having an amino acid sequence of a ferritin-like subunit (ferritin-like polypeptide) is prepared. The ferritin-like polypeptide may be produced by a known method as described above.
上記フェリチン溶液における溶媒は、例えば、水、生理食塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、他の緩衝液、無機塩水等が挙げられる。なお、「Ｔｒｉｓ」はトリスヒドロキシメチルアミノメタンの略称である。 Examples of the solvent in the ferritin solution include water, physiological saline, Tris-HCl buffer, other buffers, and inorganic saline. In addition, "Tris" is an abbreviation for trishydroxymethylaminomethane.
上記フェリチン様ポリペプチドの濃度（サブユニット単位の濃度）は、６ｍＭを超えていることが好ましく、６ｍＭを超えて２４ｍＭ以下であることがより好ましい。フェリチン様ポリペプチドの濃度を上述の範囲にすることで、後工程においてゲル化が進行しやすい傾向がある。 The concentration of the ferritin-like polypeptide (concentration in subunit units) is preferably more than 6 mM, more preferably more than 6 mM and 24 mM or less. By setting the concentration of the ferritin-like polypeptide in the above range, gelation tends to proceed easily in the subsequent step.
上記フェリチン溶液のｐＨは、５以上であることが好ましく、７以上９以下であることがより好ましい。 The pH of the ferritin solution is preferably 5 or more, more preferably 7 or more and 9 or less.
＜第二工程＞
第二工程では、上記フェリチン溶液のｐＨを下げる。上記フェリチン溶液のｐＨを下げる方法は特に制限されないが、例えば、所定量の１Ｍ塩酸を上記フェリチン溶液に加える方法が挙げられる。ｐＨを下げることで、上記フェリチン溶液中のフェリチン様ポリペプチドが変性して白濁する（例えば、図２の（Ａ））。
<Second process>
In the second step, the pH of the ferritin solution is lowered. The method for lowering the pH of the ferritin solution is not particularly limited, and examples thereof include a method of adding a predetermined amount of 1M hydrochloric acid to the ferritin solution. By lowering the pH, the ferritin-like polypeptide in the ferritin solution is denatured and becomes cloudy (for example, (A) in FIG. 2).
第二工程において、上記フェリチン溶液のｐＨは１以下にすることが好ましく、０．５以上０．７未満にすることがより好ましく、０．５以上０．６以下にすることが更に好ましい。ｐＨを上述の範囲まで下げることで、後工程においてゲル化が進行しやすい傾向がある。 In the second step, the pH of the ferritin solution is preferably 1 or less, more preferably 0.5 or more and less than 0.7, and further preferably 0.5 or more and 0.6 or less. By lowering the pH to the above range, gelation tends to proceed easily in the subsequent step.
＜第三工程＞
第三工程では、上記フェリチン溶液のｐＨを上げる。上記フェリチン溶液のｐＨを上げる方法は特に制限されないが、例えば、所定量の１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を上記フェリチン溶液に加える方法が挙げられる。ｐＨを上げることで、上記フェリチン溶液中のフェリチン様ポリペプチドがリフォールディングして、ゲル化が進行し、ゲル組成物が得られる（例えば、図２の（Ｂ））。
<Third process>
In the third step, the pH of the ferritin solution is raised. The method for raising the pH of the ferritin solution is not particularly limited, and examples thereof include a method of adding a predetermined amount of a 1M sodium hydroxide aqueous solution to the ferritin solution. By increasing the pH, the ferritin-like polypeptide in the ferritin solution is refolded, gelation proceeds, and a gel composition is obtained (for example, (B) in FIG. 2).
第三工程において、上記フェリチン溶液のｐＨは５以上にすることが好ましく、７以上９以下にすることがより好ましい。ｐＨを上述の範囲まで上げることで、ゲル化が進行しやすい傾向がある。 In the third step, the pH of the ferritin solution is preferably 5 or more, more preferably 7 or more and 9 or less. By raising the pH to the above range, gelation tends to proceed easily.
上述のようにして得られたゲル組成物は、そのまま目的の用途に使用してもよい。また、上記ゲル組成物を目的の液体物質に浸漬して、上記フェリチン溶液の溶媒から上記液体物質に置換した後に目的の用途に使用することもできる。 The gel composition obtained as described above may be used as it is for the intended purpose. Further, the gel composition can be immersed in a target liquid substance to replace the solvent of the ferritin solution with the liquid substance, and then used for the desired purpose.
さらに、上記第三工程の後に、上記ゲル組成物を公知の方法によって乾燥させ、液体物質を除去することでゲル乾燥物を得ることができる。 Further, after the third step, the gel composition is dried by a known method to remove the liquid substance, whereby a gel-dried product can be obtained.
以下、実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。特に明記しない限り、各種操作は、モレキュラークローニング ア ラボラトリー マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）第２版（ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ）ら、１９８９年）に従って行った。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples. Unless otherwise specified, various operations were performed according to the Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition (Sambrook, J, 1989).
≪ウマ由来のフェリチン様ポリペプチドを含むゲル組成物の作製≫
＜ウマ由来フェリチン様ポリペプチドの作製＞
（ＬＢ培地の作製）
ＬＢ Ｂｒｏｔｈ（ナカライテスク株式会社製、商品名、５０ｇ）を水道水（２Ｌ）で溶解し、滅菌処理前のルリア−ベルターニ培地（ＬＢ培地）を得た。得られたＬＢ培地に対してオートクレーブ処理（１２０℃、１．２気圧、２０分間）を行うことにより滅菌処理を行った。滅菌処理後のＬＢ培地を放冷により室温まで冷ました。その後、予め滅菌フィルター（孔径０．２２μｍ、メルクミリポア社製）に通したアンピシリン溶液（Ａｍｐ、和光純薬工業株式会社製、１００μｇ／ｍＬ）を、当該ＬＢ培地１Ｌあたり１ｍＬ添加した。以上の手順により、アンピシリンを含むＬＢ培地を作製した。
<< Preparation of gel composition containing ferritin-like polypeptide derived from horse >>
<Preparation of horse-derived ferritin-like polypeptide>
(Preparation of LB medium)
LB Broth (manufactured by Nacalai Tesque, Inc., trade name, 50 g) was dissolved in tap water (2 L) to obtain Luria-Bertani medium (LB medium) before sterilization. The obtained LB medium was sterilized by performing an autoclave treatment (120 ° C., 1.2 atm, 20 minutes). The LB medium after sterilization was cooled to room temperature by allowing it to cool. Then, 1 mL of an ampicillin solution (Amp, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 100 μg / mL) that had been passed through a sterilization filter (pore diameter 0.22 μm, manufactured by Merck Millipore) was added per 1 L of the LB medium. By the above procedure, an LB medium containing ampicillin was prepared.
（ウマ由来フェリチン様遺伝子を含む大腸菌の作製）
公知の遺伝子工学的手法により、ウマ由来のフェリチン様サブユニットのアミノ酸配列（配列番号１）をコードする遺伝子（以下、「ウマ由来フェリチン様遺伝子」という場合がある。）を、プラスミド（ｐＭＫ２）のマルチクローニングサイトに挿入して、ウマ由来フェリチン様遺伝子を有するプラスミドを構築した。その後、公知の遺伝子工学的手法により、構築したプラスミドを大腸菌（商品名：ＮｏｖａＢｌｕｅ、メルクミリポア社製）に導入した。以上の手順により、ウマ由来フェリチン様遺伝子を有するプラスミドが導入された大腸菌を作製した。当該大腸菌は、グリセロールストックとして−８０℃にて保存した。なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、ウマ由来フェリチンサブユニットのアミノ酸配列（配列番号２）におけるＮ末端の８アミノ酸残基を欠失させたアミノ酸配列である。
(Preparation of Escherichia coli containing horse-derived ferritin-like gene)
By a known genetic engineering technique, a gene encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of a horse-derived ferritin-like subunit (hereinafter, may be referred to as "horse-derived ferritin-like gene") is obtained from a plasmid (pMK2). It was inserted into a multicloning site to construct a plasmid carrying a horse-derived ferritin-like gene. Then, the constructed plasmid was introduced into Escherichia coli (trade name: NovaBlue, manufactured by Merck Millipore) by a known genetic engineering method. By the above procedure, Escherichia coli into which a plasmid having a ferritin-like gene derived from horse was introduced was prepared. The E. coli was stored as a glycerol stock at −80 ° C. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence in which the N-terminal 8 amino acid residues in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the horse-derived ferritin subunit are deleted.
（大腸菌の培養）
（１）前々培養
ウマ由来フェリチン様遺伝子を有するプラスミドが導入された大腸菌をグリセロールストックからＬＢ培地２ｍＬに植菌し、振盪培養した（３７℃、２００ｒｐｍ、１４時間）。
（２）前培養
前々培養した培養液２ｍＬをＬＢ培地３００ｍＬに添加し、振盪培養した（３７℃、１７０ｒｐｍ、５時間）。
（３）本培養
前培養した培養液５０ｍＬをＬＢ培地２Ｌに加え、振盪培養した（３７℃、１１０ｒｐｍ、２４時間）。以上の手順で、ウマ由来のフェリチン様サブユニットのアミノ酸配列を有するポリペプチド（フェリチン様ポリペプチド）を含む大腸菌を培養した。
(Culturing E. coli)
(1) Pre-culture Escherichia coli into which a plasmid having a ferritin-like gene derived from horse was introduced was inoculated from a glycerol stock into 2 mL of LB medium and cultured with shaking (37 ° C., 200 rpm, 14 hours).
(2) Pre-culture 2 mL of the pre-cultured culture solution was added to 300 mL of the LB medium and cultured with shaking (37 ° C., 170 rpm, 5 hours).
(3) Main culture 50 mL of the pre-cultured culture solution was added to 2 L of LB medium and cultured with shaking (37 ° C., 110 rpm, 24 hours). In the above procedure, Escherichia coli containing a polypeptide having an amino acid sequence of a ferritin-like subunit derived from horse (ferritin-like polypeptide) was cultured.
（ウマ由来のフェリチン様ポリペプチドの粗生成物の作製）
（１）上述の工程で得られた大腸菌を含む培養液を遠心分離（４℃、８０００ｒｐｍ、６分間）することにより、上記大腸菌を沈殿物として回収した（菌体質量：約５０ｇ）。
（２）得られた菌体を液体窒素で凍結した。その後、菌体量１ｇに対して１０ｍＬの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加して菌体を懸濁させた。菌体を含む懸濁液を、４℃で１０分間攪拌した。
（３）得られた懸濁液（１０ｍＬ、菌体１０ｇ分）を氷上で超音波破砕した（出力４０％、１秒間破砕−２秒間停止のサイクルを、合計１０分間）。
（４）超音波破砕後の懸濁液を遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、１５分間）した。その後、上清を回収した。
（５）回収した上清をインキュベートし（６０℃、２０分間）、遠心分離（４℃、１７０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、更に上清を回収した。以上の手順でフェリチン様ポリペプチドの粗生成物を得た。
(Preparation of crude product of ferritin-like polypeptide derived from horse)
(1) The culture solution containing Escherichia coli obtained in the above step was centrifuged (4 ° C., 8000 rpm, 6 minutes) to recover the Escherichia coli as a precipitate (cell mass: about 50 g).
(2) The obtained cells were frozen in liquid nitrogen. Then, 10 mL of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) was added to 1 g of the cell mass to suspend the cell. The suspension containing the cells was stirred at 4 ° C. for 10 minutes.
(3) The obtained suspension (10 mL, 10 g of bacterial cells) was ultrasonically crushed on ice (output 40%, crushed for 1 second-2 seconds stopped for a total of 10 minutes).
(4) The suspension after ultrasonic crushing was centrifuged (4 ° C., 15000 rpm, 15 minutes). Then, the supernatant was collected.
(5) The collected supernatant was incubated (60 ° C., 20 minutes), centrifuged (4 ° C., 17,000 rpm, 10 minutes), and the supernatant was further collected. A crude product of a ferritin-like polypeptide was obtained by the above procedure.
（ウマ由来のフェリチン様ポリペプチドの精製）
（１）まず、陰イオン交換カラム担体Ｑ−セファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化させた。その後、抽出したフェリチン様ポリペプチドの粗生成物を、当該陰イオン交換カラム担体に吸着させた。続いて、２００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を当該陰イオン交換カラムに流した。その後３００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を当該陰イオン交換カラムに流すことでフェリチン様ポリペプチドを溶出させた。
（２）抽出したフェリチン様ポリペプチドの溶液（以下、「フェリチン溶液」という場合がある。）を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で２倍希釈し、溶液をフィルター（孔径０．２２μｍ、メルクミリポア社製）に通した。フィルターに通したフェリチン溶液を、ＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＢｉｏＬｏｇｉｃ ＤｕｏＦｌｏｗシステム、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによって精製した。ＦＰＬＣの条件を以下に示す。
［ＦＰＬＣ条件］
カラム ：ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）
流速 ：３．０ ｍＬ／ｍｉｎ
緩衝液Ａ ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）
緩衝液Ｂ ：１．０Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）
グラジエント：０→５０％Ｂ（８０ｍＬ）
検出波長 ：２８０ｎｍ
(Purification of ferritin-like polypeptide derived from horse)
(1) First, the anion exchange column carrier Q-Sepharose (GE Healthcare) was equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5). Then, the crude product of the extracted ferritin-like polypeptide was adsorbed on the anion exchange column carrier. Subsequently, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) containing 200 mM NaCl was flowed through the anion exchange column. The ferritin-like polypeptide was then eluted by flowing 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) containing 300 mM NaCl through the anion exchange column.
(2) The extracted solution of ferritin-like polypeptide (hereinafter, may be referred to as "ferritin solution") is diluted 2-fold with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), and the solution is filtered (pore size 0.22 μm). , Made by Merck Millipore). The filtered ferritin solution was purified by anion exchange column chromatography using FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) (BioLogic DuoFlow system, manufactured by BIO-RAD). The conditions of FPLC are shown below.
[FPLC conditions]
Column: HiTrap Q HP (manufactured by GE Healthcare)
Flow velocity: 3.0 mL / min
Buffer A: 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5)
Buffer B: 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) containing 1.0 M NaCl.
Gradient: 0 → 50% B (80 mL)
Detection wavelength: 280 nm
（３）Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５（ＭＷＣＯ １００００、メルクミリポア社製）を用いて、精製したフェリチン溶液（約３０ｍＬ）を約１０ｍＬに濃縮した。濃縮されたフェリチン溶液を、フィルターに通して沈殿物などの不純物を除いた。その後、当該フェリチン溶液を、ＦＰＬＣ（ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより精製した。ＦＰＬＣの条件を以下に示す。
［ＦＰＬＣ条件］
カラム ：ＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ ＨＲ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）
流速 ：１．０ｍＬ／分間
緩衝液 ：１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）
検出波長：２８０ｎｍ
(3) Purified ferritin solution (about 30 mL) was concentrated to about 10 mL using Amicon Ultra-15 (MWCO 10000, manufactured by Merck Millipore). The concentrated ferritin solution was filtered to remove impurities such as precipitates. Then, the ferritin solution was purified by gel filtration column chromatography using FPLC (AKTAprime plus, GE Healthcare). The conditions of FPLC are shown below.
[FPLC conditions]
Column: HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR (manufactured by GE Healthcare)
Flow rate: 1.0 mL / min Buffer: 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) containing 150 mM NaCl.
Detection wavelength: 280 nm
（４）得られたフェリチン溶液におけるフェリチンの精製度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、９５％以上であった。
以上の手順によって、ウマ由来のフェリチン様ポリペプチドを作製した。
(4) When the degree of purification of ferritin in the obtained ferritin solution was confirmed by SDS-PAGE, it was 95% or more.
By the above procedure, a ferritin-like polypeptide derived from horse was prepared.
＜フェリチン様ポリペプチドのゲル化＞
（ウマ由来のフェリチン様ポリペプチドを含むゲル組成物の生成）
（１）精製したフェリチン溶液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５（ＭＷＣＯ １００００、メルクミリポア社製）を用いて約１２ｍＭ（サブユニット単位のモル濃度）になるまで濃縮した。
（２）濃縮した微量（約１０μＬ）のフェリチン溶液に１．０Ｍ塩酸を１０μＬ加え、フェリチン様ポリペプチドを白色に変性させた（ｐＨ０．５）（図２の（Ａ））。
（３）その後、変性したフェリチン様ポリペプチドを含む溶液に１．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を１０μＬ加え当該溶液のｐＨを８．５に上げた。以上の手順でウマ由来フェリチン様ポリペプチドを含むゲル組成物を生成した（図２の（Ｂ））。
<Gelification of ferritin-like polypeptide>
(Production of gel composition containing ferritin-like polypeptide derived from horse)
(1) The purified ferritin solution was concentrated using Amicon Ultra-15 (MWCO 10000, manufactured by Merck Millipore) to about 12 mM (molar concentration in subunit units).
(2) 10 μL of 1.0 M hydrochloric acid was added to a concentrated trace amount (about 10 μL) of ferritin solution to denature the ferritin-like polypeptide into white (pH 0.5) ((A) in FIG. 2).
(3) After that, 10 μL of 1.0 M sodium hydroxide aqueous solution was added to the solution containing the denatured ferritin-like polypeptide, and the pH of the solution was raised to 8.5. A gel composition containing a ferritin-like polypeptide derived from horse was produced by the above procedure ((B) in FIG. 2).
（ゲル化条件の検討）
（１）フェリチン溶液をそれぞれ３ｍＭ、６ｍＭ、１２ｍＭ及び２４ｍＭ（全てサブユニット単位のモル濃度）に調製した。
（２）１０μＬの各フェリチン溶液に、酸変性時のｐＨがそれぞれ０．５（１．０Ｍ塩酸１０μＬ程度）、０．６（１．０Ｍ塩酸５．５μＬ程度）、０．７（１．０Ｍ塩酸３．５μＬ程度）及び０．８（１．０Ｍ塩酸２μＬ程度）となるように塩酸を加えた。その後、加えた塩酸と同量同濃度の水酸化ナトリウム水溶液でフェリチン溶液のｐＨを上げた（ｐＨ８．５）。以上の手順で、フェリチン様ポリペプチドのモル濃度及び酸変性時のｐＨ（第二工程におけるｐＨ）が異なる各条件においてゲル化するかどうかを検証した。結果を表１に示す。表１の結果から、第一工程におけるフェリチン溶液中のフェリチン様ポリペプチドのモル濃度が１２ｍＭ以上であり、第二工程におけるｐＨが０．６以下である場合、ゲル化することがわかった。ゲル化には酸変性時の溶液のｐＨと、フェリチン様ポリペプチドのモル濃度に依存していることがわかった。
(Examination of gelation conditions)
(1) Ferritin solutions were prepared at 3 mM, 6 mM, 12 mM and 24 mM (molar concentrations of all subunits), respectively.
(2) In each 10 μL ferritin solution, the pH at the time of acid denaturation was 0.5 (about 10 μL of 1.0 M hydrochloric acid), 0.6 (about 5.5 μL of 1.0 M hydrochloric acid), and 0.7 (1.0 M), respectively. Hydrochloric acid was added so as to be about 3.5 μL of hydrochloric acid) and 0.8 (about 2 μL of 1.0 M hydrochloric acid). Then, the pH of the ferritin solution was raised with the same amount and concentration of sodium hydroxide aqueous solution as the added hydrochloric acid (pH 8.5). In the above procedure, it was verified whether or not the ferritin-like polypeptide gels under different conditions of molar concentration and pH at the time of acid denaturation (pH in the second step). The results are shown in Table 1. From the results in Table 1, it was found that gelation occurs when the molar concentration of the ferritin-like polypeptide in the ferritin solution in the first step is 12 mM or more and the pH in the second step is 0.6 or less. It was found that gelation depends on the pH of the solution during acid denaturation and the molar concentration of ferritin-like polypeptide.
≪ゲル組成物の物性≫
（溶解性）
以下の手順で、作製したゲル組成物の溶解性を検証した。まず、約１ｍＬの純水、１．０Ｍ塩酸、１．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、メタノール（Ｗａｋｏ社製）、２−メルカプトエタノール（Ｗａｋｏ社製）（液体）、又は４３μＭトリプシン（シグマアルドリッチ社製）水溶液に上記ゲル組成物を浸漬して、室温で１週間静置した。その後、上記ゲル組成物が溶解するか検証した。その結果、塩酸、水酸化ナトリウム水溶液、メタノール及び２−メルカプトエタノール溶液に対してゲル組成物は不溶でありゲルの形状を維持していた。一方、トリプシン水溶液を加えると徐々にゲル組成物が分解し、最終的に溶解した。この結果より、ゲル組成物はプロテアーゼ分解性を有していること、ゲル組成物はフェリチン様ポリペプチドで形成されていることが示唆された。
≪Physical properties of gel composition≫
(Solubility)
The solubility of the prepared gel composition was verified by the following procedure. First, about 1 mL of pure water, 1.0 M hydrochloric acid, 1.0 M aqueous sodium hydroxide solution, methanol (manufactured by Wako), 2-mercaptoethanol (manufactured by Wako) (liquid), or 43 μM trypsin (manufactured by Sigma-Aldrich). The gel composition was immersed in an aqueous solution and allowed to stand at room temperature for 1 week. Then, it was verified whether the gel composition was dissolved. As a result, the gel composition was insoluble in hydrochloric acid, sodium hydroxide aqueous solution, methanol and 2-mercaptoethanol solution, and the gel shape was maintained. On the other hand, when the trypsin aqueous solution was added, the gel composition was gradually decomposed and finally dissolved. From this result, it was suggested that the gel composition has protease degradability and that the gel composition is formed of a ferritin-like polypeptide.
（熱安定性）
作製したゲル組成物の熱安定性の知見を得るため、２０℃〜１００℃の純水にゲル組成物を３０分間浸し、肉眼で形状観察を行った。その結果、８０℃ではゲル組成物は徐々に分解していき、１００℃では速やかに分解した。一方、６０℃以下でインキュベートしてもゲル組成物の形状にほとんど変化は見られず安定であった。以上の結果から、上記ゲル組成物は、野生型のフェリチンと同様の熱安定性を有していることが示唆された。
(Thermal stability)
In order to obtain knowledge of the thermal stability of the prepared gel composition, the gel composition was immersed in pure water at 20 ° C. to 100 ° C. for 30 minutes, and the shape was observed with the naked eye. As a result, the gel composition was gradually decomposed at 80 ° C. and rapidly decomposed at 100 ° C. On the other hand, the gel composition was stable with almost no change in shape even when incubated at 60 ° C. or lower. From the above results, it was suggested that the gel composition had the same thermal stability as the wild type ferritin.
（組成）
作製したゲル組成物の一部に超純水を加えボルテックスで懸濁し、懸濁液を得た。続いて、０．１％ＴＦＡ／ＭｉｌｌｉＱ（２５μＬ）と、０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ（５０μＬ）の混合溶液に、約５ｍｇのシナピン酸を飽和させてマトリックス溶液を作製した。得られた懸濁液（１μＬ）と、上記マトリックス溶液（８μＬ）とを混合して混合溶液を得た。得られた混合溶液を質量分析用のプレートの上に乗せてマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）で分析した。その結果、フェリチンのサブユニットの分子量（理論値：［フェリチンのサブユニット＋Ｈ］＋＝１９１４８Ｄａ）に対応するピークが検出された。これらの結果より、得られたゲル組成物はフェリチン様ポリペプチドで形成されていることが判明した。
(composition)
Ultrapure water was added to a part of the prepared gel composition and suspended in a vortex to obtain a suspension. Subsequently, a mixed solution of 0.1% TFA / MilliQ (25 μL) and 0.1% TFA / MeCN (50 μL) was saturated with about 5 mg of sinapic acid to prepare a matrix solution. The obtained suspension (1 μL) and the above matrix solution (8 μL) were mixed to obtain a mixed solution. The obtained mixed solution was placed on a plate for mass spectrometry and analyzed by a matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS). As a result, a peak corresponding to the molecular weight of the ferritin subunit (theoretical value: [ferritin subunit + H] + = 19148Da) was detected. From these results, it was found that the obtained gel composition was formed of a ferritin-like polypeptide.
（吸水性）
ゲル組成物を１００℃で１０分熱乾燥処理により脱水させゲル乾燥物を得た。その後得られたゲル乾燥物に超純水を加え、室温で１時間インキュベートし、再びゲル組成物とした。脱水させたゲル乾燥物（図３の（Ａ））に純水を加えた結果、ゲル組成物は長さが約３倍、質量が約５倍膨潤した（図３の（Ｂ））。この一連の操作で質量対比により含水率を計算すると平均して約８０％であることが判明した。なお、水で膨潤したゲル組成物を上記と同様の方法で熱乾燥処理したところ、再度ゲル乾燥物を得ることができた（図３の（Ｃ））。以上の結果から、ゲル乾燥物は水に対する吸収能（吸水性）を有していることが分かった。
(Water absorption)
The gel composition was dehydrated by heat drying treatment at 100 ° C. for 10 minutes to obtain a dried gel. After that, ultrapure water was added to the obtained dried gel product, and the mixture was incubated at room temperature for 1 hour to obtain a gel composition again. As a result of adding pure water to the dehydrated gel dried product ((A) in FIG. 3), the gel composition swelled about 3 times in length and about 5 times in mass ((B) in FIG. 3). When the water content was calculated by mass comparison in this series of operations, it was found to be about 80% on average. When the gel composition swollen with water was heat-dried by the same method as described above, a gel-dried product could be obtained again ((C) in FIG. 3). From the above results, it was found that the dried gel has an absorption capacity (water absorption) for water.
（鉄捕捉能）
（実験１）作製したゲル組成物に３０ｍＭの硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）（ナカライテスク社製）の水溶液を加え、室温で２４時間インキュベートした。インキュベート後のゲル組成物を観察したところ、うすい黄色から赤褐色に変色していた。インキュベート後のゲル組成物を超純水で洗浄し、観察したところ、赤褐色のままであった。ゲル組成物の質量は硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）水溶液に浸す前に比べ約３０％増加していた。
(Iron trapping ability)
(Experiment 1) A 30 mM aqueous solution of ammonium iron (II) sulfate (manufactured by Nacalai Tesque) was added to the prepared gel composition, and the mixture was incubated at room temperature for 24 hours. When the gel composition after the incubation was observed, the color changed from pale yellow to reddish brown. The gel composition after incubation was washed with ultrapure water and observed, and remained reddish brown. The mass of the gel composition was increased by about 30% as compared with that before immersion in the aqueous solution of ammonium iron (II) sulfate.
（実験２）３０ｍＭの塩化鉄（ＩＩＩ）（関東化学社製）の水溶液を用いて（実験１）と同様の操作を行った。得られたゲル組成物を観察したところ、うすい黄色（図４の（Ａ））から赤褐色に変色していた（図４の（Ｂ））。インキュベート後のゲル組成物を超純水で洗浄し、観察したところ、赤褐色のままであった。ゲル組成物の質量は塩化鉄（ＩＩＩ）水溶液に浸す前に比べ約２０％増加していた。 (Experiment 2) The same operation as in (Experiment 1) was carried out using an aqueous solution of 30 mM iron (III) chloride (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.). When the obtained gel composition was observed, the color changed from pale yellow ((A) in FIG. 4) to reddish brown ((B) in FIG. 4). The gel composition after incubation was washed with ultrapure water and observed, and remained reddish brown. The mass of the gel composition was increased by about 20% as compared with that before immersion in the iron (III) chloride aqueous solution.
（実験３）作製したゲル組成物に３０ｍＭの硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）（ナカライテスク社製）の水溶液を加え、室温で１．５時間インキュベートした。インキュベート後のゲル組成物を観察したところ、うすい黄色から暗緑色に変化していた。インキュベート後のゲル組成物を超純水で洗浄し、室温で２４時間インキュベートしたところ、ゲル組成物は赤褐色に変化した。 (Experiment 3) A 30 mM aqueous solution of ammonium iron (II) sulfate (manufactured by Nacalai Tesque) was added to the prepared gel composition, and the mixture was incubated at room temperature for 1.5 hours. Observation of the gel composition after incubation revealed that it changed from light yellow to dark green. When the gel composition after incubation was washed with ultrapure water and incubated at room temperature for 24 hours, the gel composition turned reddish brown.
（実験１）〜（実験３）の結果から、上記ゲル組成物は、フェリチンと同様に鉄捕捉能を保持していることがわかった。上記ゲル組成物は、２価の鉄イオン、及び３価の鉄イオンに結合し、２価で結合した鉄イオンは３価になることがわかった。また、キレート剤をゲル組成物に加えても変化はなく、鉄イオンはゲル組成物の内部にとどまっていたことが示唆された。 From the results of (Experiment 1) to (Experiment 3), it was found that the gel composition retains the iron trapping ability like ferritin. It was found that the gel composition was bound to a divalent iron ion and a trivalent iron ion, and the divalently bound iron ion became trivalent. Moreover, there was no change even when the chelating agent was added to the gel composition, suggesting that the iron ions remained inside the gel composition.
（その他の金属捕捉能）
鉄以外の金属に対する金属捕捉能を検討するため、上述したのと同じ手順で作製したゲル組成物を準備した（図５の（Ａ）〜（Ｄ））。作製したゲル組成物に金属塩の水溶液（３０ｍＭ）を加え、室温で２時間インキュベートした。このとき用いた金属塩は塩化鉄（ＩＩＩ）、塩化銅、塩化コバルト及び塩化ニッケルであった。インキュベート後のゲル組成物を観察したところ、うすい黄色からそれぞれの金属塩に応じた色に変色していた。具体的には、塩化鉄（ＩＩＩ）の場合、ゲル組成物はうすい黄色から赤褐色に変色していた（図６の（Ａ））。塩化銅の場合、ゲル組成物はうすい黄色から緑青色に変色していた（図６の（Ｃ））。塩化コバルトの場合、ゲル組成物はうすい黄色から淡紫色に変色していた（図６の（Ｂ））。塩化ニッケルの場合、ゲル組成物はうすい黄色から淡橙色に変色していた（図６の（Ｄ））。インキュベート後のゲル組成物それぞれを超純水で洗浄し（室温で１８時間）、観察したところ、変色したままであった（図７の（Ａ）〜（Ｄ））。以上の結果から、上記ゲル組成物は、フェリチンと同様に鉄以外の金属に対しても金属捕捉能を保持していることがわかった。
(Other metal trapping ability)
In order to examine the metal trapping ability for metals other than iron, gel compositions prepared by the same procedure as described above were prepared ((A) to (D) in FIGS. 5). An aqueous solution of a metal salt (30 mM) was added to the prepared gel composition, and the mixture was incubated at room temperature for 2 hours. The metal salts used at this time were iron (III) chloride, copper chloride, cobalt chloride and nickel chloride. When the gel composition after incubation was observed, the color changed from pale yellow to a color corresponding to each metal salt. Specifically, in the case of iron (III) chloride, the gel composition was discolored from pale yellow to reddish brown ((A) in FIG. 6). In the case of copper chloride, the gel composition was discolored from pale yellow to greenish blue ((C) in FIG. 6). In the case of cobalt chloride, the gel composition was discolored from pale yellow to pale purple (FIG. 6 (B)). In the case of nickel chloride, the gel composition was discolored from pale yellow to pale orange ((D) in FIG. 6). Each of the gel compositions after incubation was washed with ultrapure water (18 hours at room temperature), and when observed, the color remained discolored ((A) to (D) in FIGS. 7). From the above results, it was found that the gel composition retains the metal trapping ability for metals other than iron as well as ferritin.
上述の実験でゲル組成物が捕捉した金属（Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ及びＣｕ）はいずれも遷移金属であること、並びに、フェリチンはＦｅ以外にも、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐｄ（パラジウム）及びＰｔ（白金）等の遷移金属を捕捉することが知られていることから、同じ遷移金属であるＰｄ及びＰｔに対しても、上記ゲル組成物は金属捕捉能を有していると本発明者らは考えている。 The metals (Fe, Ni, Co and Cu) captured by the gel composition in the above experiment are all transition metals, and ferritin is Ni, Co, Cu, Pd (palladium) and Pt in addition to Fe. Since it is known to capture transition metals such as (platinum), the present inventors have stated that the gel composition has a metal trapping ability even for the same transition metals Pd and Pt. Is thinking.
なお、超純水で洗浄した後のゲル組成物を１００ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸水溶液（ＥＤＴＡ水溶液）に浸漬して３時間インキュベートすると、鉄以外の金属では脱色し、ゲル組成物から当該金属が遊離することを確認した（図８の（Ａ）〜（Ｄ））。 When the gel composition washed with ultrapure water is immersed in a 100 mM ethylenediaminetetraacetic acid aqueous solution (EDTA aqueous solution) and incubated for 3 hours, metals other than iron are decolorized and the metal is liberated from the gel composition. This was confirmed ((A) to (D) in FIG. 8).
以上のように本発明の実施形態及び実施例について説明を行なったが、上述の各実施形態及び各実施例の構成を適宜組み合わせることも当初から予定している。 Although the embodiments and examples of the present invention have been described as described above, it is planned from the beginning that the configurations of the above-described embodiments and the embodiments are appropriately combined.
今回開示された実施の形態及び実施例はすべての点で例示であって、制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した実施の形態及び実施例ではなく特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味、及び範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。 The embodiments and examples disclosed this time should be considered as exemplary in all respects and not restrictive. The scope of the present invention is shown not by the above-described embodiments and examples but by the scope of claims, and is intended to include meaning equivalent to the scope of claims and all modifications within the scope.
Claims (5)
（Ａ）配列表の配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列、
（Ｂ）配列表の配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列、及び
（Ｃ）配列表の配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列である、請求項１に記載のゲル組成物。 The amino acid sequence of the ferritin-like subunit is
(A) The amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing,
(B) An amino acid sequence in which at least one amino acid is substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing, and SEQ ID NO: 1 to (C) in the sequence listing. An amino acid sequence having 90% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence according to any one of 4.
The gel composition according to claim 1, which is an amino acid sequence selected from the group consisting of.
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