JP2020186172A - ANTI-TGF-β1 ANTIBODIES - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、活性型トランスフォーミング増殖因子−β1（TGF-β1）に特異的に結合するが潜在型TGF-β1やオフターゲットタンパク質には結合しないモノクローナル抗体と、latency-associated peptide（LAP）及び潜在型TGF-β1に特異的に結合するが、活性型TGF-β1及びオフターゲットタンパク質には結合しないモノクローナル抗体に関する。 The present invention includes monoclonal antibodies that specifically bind to active transforming growth factor-β1 (TGF-β1) but not latent TGF-β1 or off-target proteins, as well as latency-associated peptide (LAP) and latent. It relates to a monoclonal antibody that specifically binds to type TGF-β1 but does not bind to active TGF-β1 and off-target proteins.
トランスフォーミング増殖因子−β（TGF-β）は、5種のアイソフォーム（TGF-β1〜β5）及び白血球細胞系譜により産生される他の多くのシグナル伝達タンパク質を含むトランスフォーミング増殖因子スパーファミリーに属する多機能性のサイトカインである。活性化したTGF-βは、他の因子とともに、1型及び2型の受容体サブユニットからなるTGF-β受容体に結合するセリン／スレオニンキナーゼ複合体を形成する。TGF-βが結合すると、2型受容体キナーゼが1型受容体キナーゼをリン酸化して活性化し、それによってシグナル伝達カスケードが活性化され、分化、遊走、増殖、免疫細胞の活性化などに機能する種々の標的遺伝子の転写を含む、下流因子の活性化が引き起こされる。そのため、がん、自己免疫疾患、感染症などの分野で高度に研究されているサイトカインの1つである。 Transforming Growth Factor-β (TGF-β) belongs to the transforming growth factor spar family, which includes five isoforms (TGF-β1 to β5) and many other signaling proteins produced by the leukocyte cell lineage. It is a multifunctional cytokine. Activated TGF-β, along with other factors, forms a serine / threonine kinase complex that binds to the TGF-β receptor, which consists of type 1 and type 2 receptor subunits. When TGF-β binds, type 2 receptor kinase phosphorylates and activates type 1 receptor kinase, which activates the signaling cascade and functions in differentiation, migration, proliferation, activation of immune cells, etc. Causes activation of downstream factors, including transcription of various target genes. Therefore, it is one of the cytokines that are highly studied in fields such as cancer, autoimmune diseases, and infectious diseases.
TGF-βアイソフォームのペプチド構造は非常に類似している（70〜80%の相同性）。それらはいずれも大きな前駆体タンパク質としてコードされており、TGF-β1は392アミノ酸、TGF-β2及びTGF-β3は412アミノ酸からなる。それらは、N末端の20〜30アミノ酸からなるシグナルペプチド、LAPと呼ばれるプロ領域、並びにプロテアーゼ切断によりプロ領域から遊離し成熟TGF-β分子となる112〜114アミノ酸からなるC末端領域を有する。TGF-βホモダイマーはLAPと相互作用してSmall Latent Complex（SLC）と呼ばれる複合体を形成する。この複合体は潜在型TGF-β結合タンパク質（LTBP）と呼ばれる別のタンパク質が結合するまで細胞内にとどまり、Large Latent Complex（LLC）と呼ばれるより大きな複合体を形成し、細胞外マトリクス（ECM）に分泌する。たいていの場合、LLCが分泌する前に、TGF-β前駆体はプロペプチドから切断されるが、非共有結合によりプロペプチドと結合したままである。分泌後、LLCは、LTBPとLAPの両方を含む不活性な複合体としてECMにとどまる。TGF-βとLTBPとの結合はジスルフィド結合であり、それにより受容体への結合を阻止し不活性な状態にとどめる。 The peptide structures of the TGF-β isoforms are very similar (70-80% homology). Both of them are encoded as large precursor proteins, consisting of 392 amino acids for TGF-β1 and 412 amino acids for TGF-β2 and TGF-β3. They have a signal peptide consisting of 20 to 30 amino acids at the N-terminal, a pro region called LAP, and a C-terminal region consisting of 112 to 114 amino acids released from the pro region by protease cleavage to become a mature TGF-β molecule. The TGF-β homodimer interacts with LAP to form a complex called the Small Latent Complex (SLC). This complex remains intracellular until another protein called latent TGF-β binding protein (LTBP) binds, forming a larger complex called the Large Latent Complex (LLC), which forms the extracellular matrix (ECM). Secrete to. In most cases, the TGF-β precursor is cleaved from the propeptide before it is secreted by LLC, but remains bound to the propeptide by non-covalent binding. After secretion, LLC remains in ECM as an inactive complex containing both LTBP and LAP. The bond between TGF-β and LTBP is a disulfide bond, which blocks the bond to the receptor and keeps it inactive.
ところで、TGF-β1は、肺線維症などの線維症やがんを含む種々の疾患の病理に関与していることが知られている。TGF-β1が関与する疾患に対する効能を評価するために、活性型TGF-β1分子を特異い的に認識する抗TGF-β1抗体が強く望まれている。しかしながら、既知の抗TGF-β1抗体は、ほぼすべて活性型TGF-β1だけでなく、潜在型TGF-β1及び／又はやTGF-β2、TGF-β3等のオフターゲットタンパク質をも認識してしまう。 By the way, TGF-β1 is known to be involved in the pathology of various diseases including fibrosis such as pulmonary fibrosis and cancer. In order to evaluate the efficacy against diseases in which TGF-β1 is involved, an anti-TGF-β1 antibody that specifically recognizes an active TGF-β1 molecule is strongly desired. However, almost all known anti-TGF-β1 antibodies recognize not only active TGF-β1 but also latent TGF-β1 and / or off-target proteins such as TGF-β2 and TGF-β3.
本発明の目的は、活性型TGF-β1に特異的に結合するが潜在型TGF-β1やオフターゲットタンパク質には結合しない新規モノクローナル抗体を提供することである。本発明の目的は、LAP及び潜在型TGF-β1に特異的に結合するが、活性型TGF-β1及びオフターゲットタンパク質には結合しない新規モノクローナル抗体を提供することである。 An object of the present invention is to provide a novel monoclonal antibody that specifically binds to active TGF-β1 but does not bind to latent TGF-β1 or off-target protein. An object of the present invention is to provide a novel monoclonal antibody that specifically binds to LAP and latent TGF-β1, but does not bind to active TGF-β1 and off-target proteins.
（発明の要約）
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ね、LAPと成熟TGF-β1領域内に、進化上保存されたユニークなアミノ酸配列をin silicoで予測した。ヒトTGF-β1由来の該アミノ酸配列を有するペプチドでマウスを免疫し、高力価を有するマウスから得られた抗体産生細胞をミエローマと融合してハイブリドーマを作製し、ELISA及びウェスタンブロットを用いたポジティブ選択と、オフターゲットタンパク質との非交差反応性を確認するためのネガティブ選択とにより、活性型TGF-β1又は潜在型TGF-β1/LAPに特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマクローンを選択した。
本発明者らは、さらに研究を重ねた結果、活性型TGF-β1（「2H4」、「4D10」、「6F12」及び「7F10」と命名した）又は潜在型TGF-β1/LAP（「2F10」と命名した）に対してきわめて高い特異性を有するモノクローナル抗体クローンを得ることに成功し、本発明を完成するに至った。
(Summary of invention)
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and in silico predicted unique amino acid sequences that are evolutionarily conserved within the LAP and mature TGF-β1 regions. Mice are immunized with a peptide having the amino acid sequence derived from human TGF-β1, antibody-producing cells obtained from mice having high titers are fused with myeloma to prepare hybridomas, and positive using ELISA and Western blot. Hybridoma clones that produce antibodies that specifically bind to active TGF-β1 or latent TGF-β1 / LAP were selected by selection and negative selection to confirm non-cross-reactivity with off-target proteins. ..
As a result of further research, the present inventors have named active TGF-β1 (named "2H4", "4D10", "6F12" and "7F10") or latent TGF-β1 / LAP ("2F10"). We have succeeded in obtaining a monoclonal antibody clone having extremely high specificity to (named), and have completed the present invention.
即ち、本発明は以下の通りである。
[1] 活性型TGF-β1に結合するが、潜在型TGF-β1には結合しない第1のモノクローナル抗体であって、
(a) 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c) 配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d) 配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e) 配列番号５で表されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f) 配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むCDR
を含む、抗体。
[2] 重鎖可変領域に含まれるCDRが上記(a)、(b)及び(c)であり、軽鎖可変領域に含まれるCDRが上記(d)、(e)及び(f)である、[1]の抗体。
[3] 重鎖可変領域に含まれるCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ上記(a)、(b)及び(c)であり、軽鎖可変領域に含まれるCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ上記(d)、(e)及び(f)である、[1]の抗体。
[4] (1) 配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
(2) 配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、[1]の抗体。
[5] [1]〜[4]のいずれかの抗体と競合的に活性型TGF-β1に結合し、かつ潜在型TGF-β1には結合しない、モノクローナル抗体。
[6] [1] 潜在型TGF-β1又はLAPに結合するが、活性型TGF-β1には結合しない第1のモノクローナル抗体であって、
(a) 配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b) 配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c) 配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d) 配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e) 配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f) 配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むCDR
を含む、抗体。
[7] 重鎖可変領域に含まれるCDRが上記(a)、(b)及び(c)であり、軽鎖可変領域に含まれるCDRが上記(d)、(e)及び(f)である、[6]の抗体。
[8] 重鎖可変領域に含まれるCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ上記(a)、(b)及び(c)であり、軽鎖可変領域に含まれるCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ上記(d)、(e)及び(f)である、[6]の抗体。
[9] (1) 配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
(2) 配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、[6]の抗体。
[10] [6]〜[9]のいずれかの抗体と競合的に潜在型TGF-β1又はLAPに結合し、かつ活性型TGF-β1には結合しない、モノクローナル抗体。
That is, the present invention is as follows.
[1] The first monoclonal antibody that binds to active TGF-β1 but not latent TGF-β1.
(a) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(b) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
(c) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
(d) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4,
(e) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 and
(f) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6
Including antibodies.
[2] The CDRs contained in the heavy chain variable region are the above (a), (b) and (c), and the CDRs contained in the light chain variable region are the above (d), (e) and (f). , [1] antibody.
[3] CDR1, CDR2 and CDR3 contained in the heavy chain variable region are the above (a), (b) and (c), respectively, and CDR1, CDR2 and CDR3 contained in the light chain variable region are described above (d), respectively. , (E) and (f), the antibody of [1].
[4] (1) A heavy chain variable region containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and
(2) The antibody of [1], which comprises a light chain variable region containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8.
[5] A monoclonal antibody that competitively binds to active TGF-β1 with any of the antibodies [1] to [4] and does not bind to latent TGF-β1.
[6] [1] A first monoclonal antibody that binds to latent TGF-β1 or LAP but not active TGF-β1.
(a) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
(b) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
(c) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11
(d) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12
(e) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 and
(f) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14.
Including antibodies.
[7] The CDRs contained in the heavy chain variable region are the above (a), (b) and (c), and the CDRs contained in the light chain variable region are the above (d), (e) and (f). , [6] antibody.
[8] CDR1, CDR2 and CDR3 contained in the heavy chain variable region are the above (a), (b) and (c), respectively, and CDR1, CDR2 and CDR3 contained in the light chain variable region are described above (d), respectively. , (E) and (f), the antibody of [6].
[9] (1) A heavy chain variable region containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 and
(2) The antibody of [6], which comprises a light chain variable region containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16.
[10] A monoclonal antibody that competitively binds to latent TGF-β1 or LAP with any of the antibodies [6] to [9] and does not bind to active TGF-β1.
本発明の抗TGF-β1抗体は活性型TGF-β1又は潜在型TGF-β1/LAPに対して高度に特異的であるので、組織標本や体液等の生物学的サンプル中のその標的分子を選択的に検出することができる。 Since the anti-TGF-β1 antibody of the present invention is highly specific for active TGF-β1 or latent TGF-β1 / LAP, its target molecule in biological samples such as tissue specimens and body fluids is selected. Can be detected.
[I] 定義
本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、IUPAC-IUBの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、及び当該分野における慣用記号に従う。
本明細書において「遺伝子」又は「DNA」とは、2本鎖DNAのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各1本鎖DNAを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書において遺伝子（DNA）とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムDNAを含む2本鎖DNA、cDNAを含む1本鎖DNA（正鎖）及び該正鎖と相補的な配列を有する1本鎖DNA（相補鎖）、並びにこれらの断片のいずれもが含まれる。
本明細書において「TGF-β1遺伝子」とは、そのcDNA配列がGenBankにaccession No. NM_000660として登録されているヒトTGF-β1遺伝子（DNA）、その天然の変異体又は多型バリアントを意味する。そのような変異体又は多型バリアントとしては、例えば、NCBIから入手可能なSNPデータベースに登録されたものが挙げられる。
本明細書において「TGF-β1タンパク質」又は単に「TGF-β1」といった用語は、そのアミノ酸配列がGenBankにaccession No. NP_000651として登録されているヒトTGF-β1タンパク質（該配列中、1-29位がシグナルペプチド、30-278位がLAP及び279-390位が成熟TGF-β1である）、又は上記した天然の変異体又は多型バリアントDNAによりコードされるタンパク質を意味する。
本明細書において「潜在型TGF-β1」とは、成熟TGF-β1のホモダイマー及び非共有結合によりそれと結合したLAPのホモダイマー、任意でさらにLTBPからなる不活性型のTGF-β1を意味する。「活性型TGF-β1」とは潜在型TGF-β1から遊離した成熟TGF-β1のホモダイマーを意味する。
本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、又はFabフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
本明細書においてエピトープとは、抗体が結合する抗原の領域である。ある種の実施形態では、免疫グロブリンに特異的に結合し得る抗原の任意の部位を含む。抗原決定基は、分子の化学的に活性な表面群、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基又はスルホニル基を含み、ある種の実施形態では、特異的な三次元構造特徴及び／又は特異的な荷電特徴を有してよい。ある種の実施形態では、抗体は、タンパク質及び／又は巨大分子の複雑な混合物において、この抗体が標的抗原を優先的に認識する場合、抗原に特異的に結合するということができる。
[I] Definitions In the present specification, abbreviations such as amino acids, (poly) peptides, and (poly) nucleotides are referred to as IUPAC-IUB regulations [IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)], "Guidelines for preparing specifications containing base sequences or amino acid sequences" (edited by the Japan Patent Office), and common symbols in the field.
As used herein, the term "gene" or "DNA" is used to include not only double-stranded DNA but also single-stranded DNA such as a sense strand and an antisense strand constituting the double-stranded DNA. Further, the length is not particularly limited. Therefore, unless otherwise specified, a gene (DNA) in the present specification has a double-stranded DNA containing human genomic DNA, a single-stranded DNA containing cDNA (normal strand), and a sequence complementary to the positive strand1. Includes main-strand DNA (complementary strand) and any of these fragments.
As used herein, the term "TGF-β1 gene" means a human TGF-β1 gene (DNA) whose cDNA sequence is registered in GenBank as accession No. NM_000660, and a natural variant or polymorphic variant thereof. Such variants or polymorphic variants include, for example, those registered in the SNP database available from NCBI.
As used herein, the term "TGF-β1 protein" or simply "TGF-β1" is a human TGF-β1 protein whose amino acid sequence is registered as accession No. NP_000651 in GenBank (positions 1-29 of the sequence). Is a signal peptide, positions 30-278 are LAP and positions 279-390 are mature TGF-β1), or a protein encoded by the above-mentioned natural variant or polymorphic variant DNA.
As used herein, the term "latent TGF-β1" means a homodimer of mature TGF-β1, a homodimer of LAP bound to it by a non-covalent bond, and optionally an inactive TGF-β1 consisting of LTBP. "Active TGF-β1" means a homodimer of mature TGF-β1 released from latent TGF-β1.
The term "antibody" as used herein includes a part of the above-mentioned antibody having antigen-binding property, such as a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a chimeric antibody, a single chain antibody, or a Fab fragment.
As used herein, an epitope is a region of an antigen to which an antibody binds. In certain embodiments, it comprises any site of an antigen that can specifically bind to an immunoglobulin. The antigenic determinants include chemically active surface groups of the molecule, such as amino acids, sugar side chains, phosphoryl or sulfonyl groups, and in certain embodiments, specific three-dimensional structural features and / or specific. It may have a charging feature. In certain embodiments, an antibody can be said to specifically bind to an antigen if it preferentially recognizes the target antigen in a complex mixture of proteins and / or macromolecules.
抗体の構造
抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量5-7万の重鎖と2-3万の軽鎖から構成される(免疫学イラストレイテッド (I. Roitt, J. Brostoff, D. Male編))。重鎖は、通常約440個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、IgG、IgM、IgA、IgD、IgEに対応してγ、μ、α、δ、ε鎖とよばれる。さらにIgGには、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4が存在し、それぞれγ1、γ2、γ3、γ4とよばれている。軽鎖は、通常約220個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、L型とK型の2種が知られており、それぞれλ、κ鎖とよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な2本の重鎖及び2本の軽鎖が、ジスルフィド結合（S-S結合）及び非共有結合によって結合され、分子量15-19万である。2種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖2本と同一の重鎖2本からできている。
Antibody structure The basic structure of antibody molecules is common to all classes and consists of a heavy chain with a molecular weight of 50,000 to 70,000 and a light chain with a molecular weight of 20,000 to 30,000 (I. Roitt, J. Brostoff, D. Male edition)). The heavy chain usually consists of a polypeptide chain containing about 440 amino acids, has a characteristic structure for each class, and corresponds to IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, γ, μ, α, δ, ε. It is called a chain. Further, IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 are present in IgG, and they are called γ1, γ2, γ3, and γ4, respectively. The light chain usually consists of a polypeptide chain containing about 220 amino acids, and two types, L-type and K-type, are known, which are called λ and κ chains, respectively. The peptide composition of the basic structure of an antibody molecule is that two homologous heavy chains and two light chains are bound by disulfide bonds (SS bonds) and non-covalent bonds, respectively, and have a molecular weight of 150,000 to 190,000. The two light chains can be paired with any heavy chain. Each antibody molecule is always made up of two identical light chains and two identical heavy chains.
鎖内S-S結合は、重鎖に4つ（μ、ε鎖には5つ）、軽鎖には2つあって、アミノ酸100-110残基ごとに1つのループを形成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位あるいはドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにN末端に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域（V領域）とよばれている（重鎖可変領域ドメインはVH、軽鎖可変領域ドメインはVLと表される）。これよりC末端側のアミノ酸配列は、各クラスあるいはサブクラスごとにほぼ一定で定常領域（C領域）とよばれている（各ドメインは、それぞれ、CH1、CH2、CH3あるいはCLと表される）。 There are four intrachain SS bonds (five on the μ and ε chains) on the heavy chain and two on the light chain, forming one loop for each amino acid 100-110 residue, and this three-dimensional structure is It is similar between each loop and is called a structural unit or domain. The domain located at the N-terminal of both the heavy chain and the light chain is called a variable region (V region) because its amino acid sequence is not constant even if it is a sample from the same class (subclass) of the same species. (The heavy chain variable region domain is represented as VH and the light chain variable region domain is represented as VL). From this, the amino acid sequence on the C-terminal side is almost constant for each class or subclass and is called a constant region (C region) (each domain is represented as CH1, CH2, CH3 or CL, respectively).
抗体の抗原決定部位はVH及びVLによって構成され、結合の特異性はこの部位のアミノ酸配列によっている。一方、補体や各種細胞との結合といった生物学的活性は各クラスIgのC領域の構造の差を反映している。軽鎖と重鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する3つの小さな超可変領域にほぼ限られることが分かっており、これらの領域を相補性決定領域（CDR）と呼んでいる。可変領域のうち、CDRを除く部分はフレームワーク領域（FR）とよばれ、比較的一定である。フレームワーク領域は、βシートコンフォメーションを採用しており、CDRはβシート構造を接続するループを形成することができる。各鎖におけるCDRは、フレームワーク領域によりそれらの三次元構造が保持され、他の鎖からのCDRと共に抗原結合部位を形成する。 The antigenic determination site of an antibody is composed of VH and VL, and the specificity of binding depends on the amino acid sequence of this site. On the other hand, biological activities such as complement and binding to various cells reflect the difference in the structure of the C region of each class Ig. The variability of the variable regions of the light and heavy chains has been found to be largely limited to the three small hypervariable regions present in both chains, which are called complementarity determining regions (CDRs). There are. The part of the variable area excluding CDR is called the framework area (FR) and is relatively constant. The framework region employs a β-sheet conformation, and the CDRs can form a loop connecting the β-sheet structures. The CDRs in each strand retain their three-dimensional structure by the framework region and form an antigen-binding site together with the CDRs from the other strands.
CDRを同定するためのいくつかのナンバリングシステムが一般に使用されている。Kabat定義は、配列変化性に基づき、Chothia定義は、構造ループ領域の位置に基づく。AbM定義は、Kabat及びChothiaアプローチの間の折衷である。軽鎖・重鎖の可変領域のCDRは、Kabat、Chothia又はAbMアルゴリズムにしたがって、境界を示される （Martin et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9268-9272; Martin et al. (1991) Methods Enzymol. 203: 121-153; Pedersen et al. (1992) Immunomethods 1: 126; 及びRees et al. (1996) In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, pp. 141-172）。 Several numbering systems are commonly used to identify CDRs. The Kabat definition is based on sequence variability, and the Chothia definition is based on the position of the structural loop region. The AbM definition is a compromise between the Kabat and Chothia approaches. The CDRs of the light and heavy chain variable regions are bounded according to the Kabat, Chothia or AbM algorithms (Martin et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9268-9272; Martin et al. (1991) Methods Enzymol. 203: 121-153; Pedersen et al. (1992) Immunomethods 1: 126; and Rees et al. (1996) In Sternberg MJE (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, pp. 141-172).
本発明の抗体のCDRは、該抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域（VH及びVL）のヌクレオチド配列を、公共のCDR決定ソフトウェア（http://www.abysis.org及びhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/igblast.cgi）を用いて解析することにより同定されるCDRであると定義づけられる。
2H4抗体の場合、重鎖可変領域のCDRは、配列番号７で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号26〜32（CDR1-H）、52〜57（CDR2-H）及び99〜109（CDR3-H）であり、軽鎖可変領域のCDRは、配列番号８で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号24〜40（CDR1-L）、52〜57（CDR2-L）及び99〜102（CDR3-L）である。2F10モノクローナル抗体の場合、重鎖可変領域のCDRは、配列番号１５で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号26〜32（CDR1-H）、52〜57（CDR2-H）及び99〜103（CDR3-H）であり、軽鎖可変領域のCDRは、配列番号１６で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号24〜34（CDR1-L）、50〜56（CDR2-L）及び89〜97（CDR3-L）である。
The CDRs of the antibodies of the invention determine the nucleotide sequences of the heavy and light chain variable regions (VH and VL) of the antibody in public CDR determination software (http://www.abysis.org and http://www). It is defined as a CDR identified by analysis using .ncbi.nlm.nih.gov/igblast/igblast.cgi).
In the case of 2H4 antibody, the CDRs of the heavy chain variable region are amino acid numbers 26 to 32 (CDR1-H), 52 to 57 (CDR2-H) and 99 to 109 (CDR3-H) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7. ), And the CDRs of the light chain variable region are amino acids 24 to 40 (CDR1-L), 52 to 57 (CDR2-L) and 99 to 102 (CDR3-L) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8. Is. In the case of 2F10 monoclonal antibody, the CDRs of the heavy chain variable region are amino acid numbers 26 to 32 (CDR1-H), 52 to 57 (CDR2-H) and 99 to 103 (CDR3-) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15. H), the CDRs of the light chain variable region are amino acids 24-34 (CDR1-L), 50-56 (CDR2-L) and 89-97 (CDR3-L) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16. ).
可変領域のうち、CDRを除く部分はフレームワーク領域（FR）とよばれ、比較的一定である。フレームワーク領域は、βシートコンフォメーションを採用しており、CDRはβシート構造を接続するループを形成することができる。各鎖におけるCDRは、フレームワーク領域によりそれらの三次元構造が保持され、他の鎖からのCDRと共に抗原結合部位を形成する。 The part of the variable area excluding CDR is called the framework area (FR) and is relatively constant. The framework region employs a β-sheet conformation, and the CDRs can form a loop connecting the β-sheet structures. The CDRs in each strand retain their three-dimensional structure by the framework region and form an antigen-binding site together with the CDRs from the other strands.
抗体の結合アッセイ
抗体結合性の確認は任意の周知のアッセイ方法、例えば、直接及び間接サンドイッチアッセイ、フローサイトメトリー及び免疫沈降アッセイ等で行うことができる（Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, (CRC Press, Inc. 1987) pp. 147-158）。本発明において、抗TGF-β1抗体の活性型TGF-β1又は潜在型TGF-β1／LAPポリペプチドとの結合は、例えば、以下の方法に従って測定することができる。
Antibody Binding Assays Confirmation of antibody binding can be performed by any well-known assay method, such as direct and indirect sandwich assay, flow cytometry and immunoprecipitation assay (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques,). CRC Press, Inc. 1987) pp. 147-158). In the present invention, the binding of the anti-TGF-β1 antibody to the active TGF-β1 or the latent TGF-β1 / LAP polypeptide can be measured, for example, according to the following method.
典型的な方法として、ヒトTGF-β1／LAPポリペプチド（抗原）を固相に吸着させ、抗原抗体反応や酵素反応に関与しないタンパク質（スキムミルク、アルブミン等）でブロッキングした後、抗TGF-β1モノクローナル抗体（被検抗体）を固相に接触させてインキュベートし、B/F分離により未反応の抗体を除いた後、被検抗体と特異的に反応する標識化二次抗体（抗マウスIgG等）を作用させて、固相上の標識量を測定する方法が挙げられる。固相としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、プラスチック、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂（チューブ、マイクロプレート等）、あるいはガラス（ビーズ、チューブ等）などを用いることができる。標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレセインイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。 As a typical method, a human TGF-β1 / LAP polypeptide (antigen) is adsorbed on a solid phase, blocked with a protein (skim milk, albumin, etc.) that is not involved in an antigen-antibody reaction or an enzyme reaction, and then an anti-TGF-β1 monoclonal method is used. A labeled secondary antibody (anti-mouse IgG, etc.) that specifically reacts with the test antibody after incubating the antibody (test antibody) in contact with the solid phase and removing the unreacted antibody by B / F separation. There is a method of measuring the labeled amount on the solid phase by causing the above. As the solid phase, for example, insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as plastic, polystyrene, polyacrylamide, and silicon (tubes, microplates, etc.), glass (beads, tubes, etc.), and the like are used. Can be done. As the labeling agent, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. As the radioisotope, for example, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] and the like are used. The enzyme is preferably stable and has a large specific activity, and for example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, a luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
競合アッセイ
本発明の抗TGF-β1抗体の結合定数（Ka）の測定や、既に得られた本発明の抗体と競合的に活性型又は潜在型TGF-β1に結合する本発明の他の抗体の同定には、競合ELISAなどの競合アッセイを用いることができる。競合アッセイは、上記の抗原固定化固相を用いる結合アッセイにおいて、固相と被検抗体との反応系に遊離の抗原もしくは既知抗体を共存させることにより実施される。例えば、既知濃度の被検抗体液、並びに種々の濃度の抗原を該被検抗体液に加えた混合液を抗原固定化固相に接触させてインキュベートし、固相上の標識量をそれぞれ測定する。各遊離抗原濃度における測定値からスキャッチャード解析を行い、グラフの傾きを結合定数として算出することができる。一方、抗原固定化固相に対して、標識した既知抗体（本発明の抗体）と、種々の濃度の被検抗体とを反応させ、固相上の標識量を濃度依存的に減少させた被検抗体を選択することにより、本発明の抗体と競合的に活性型又は潜在型TGF-β1に結合する抗体を同定することができる。
Competitive Assay Measurement of the binding constant (Ka) of the anti-TGF-β1 antibody of the present invention, or of other antibodies of the present invention that competitively bind to the active or latent TGF-β1 of the antibody of the present invention already obtained. Competitive assays such as competitive ELISA can be used for identification. The competitive assay is carried out by coexisting a free antigen or a known antibody in the reaction system between the solid phase and the test antibody in the above-mentioned binding assay using the antigen-immobilized solid phase. For example, a test antibody solution having a known concentration and a mixed solution in which antigens of various concentrations are added to the test antibody solution are brought into contact with the antigen-immobilized solid phase and incubated, and the labeled amount on the solid phase is measured. .. Scatchard analysis can be performed from the measured values at each free antigen concentration, and the slope of the graph can be calculated as the binding constant. On the other hand, the labeled known antibody (antibody of the present invention) was reacted with the antigen-immobilized solid phase with various concentrations of the test antibody, and the labeled amount on the solid phase was reduced in a concentration-dependent manner. By selecting a test antibody, an antibody that competitively binds to the active or latent TGF-β1 with the antibody of the present invention can be identified.
[II] 本発明の抗体
本発明は、活性型TGF-β1に結合するが、潜在型TGF-β1には結合しないモノクローナル抗体（以下、「本発明の抗活性型TGF-β1抗体」又は単に「本発明の抗体(1)」ともいう）を提供する。本発明はまた、潜在型TGF-β1もしくはLAPに結合するが、活性型TGF-β1には結合しないモノクローナル抗体（以下、「本発明の抗潜在型TGF-β1/LAP抗体」又は単に「本発明の抗体(2)」ともいう）を提供する。本発明の抗体(1)と本発明の抗体(2)とを包括して「本発明の抗TGF-β1抗体」又は単に「本発明の抗体」という。本発明の抗体はさらに、該抗体により認識されるエピトープから予測されるいかなるオフターゲットタンパク質をも認識しないことにより特徴づけられる。
[II] Antibody of the present invention The present invention is a monoclonal antibody that binds to active TGF-β1 but not latent TGF-β1 (hereinafter, "anti-active TGF-β1 antibody of the present invention" or simply ". The antibody of the present invention (1) ”) is provided. The present invention also binds to latent TGF-β1 or LAP, but does not bind to active TGF-β1 (hereinafter, "anti-latent TGF-β1 / LAP antibody of the present invention" or simply "the present invention". (Also referred to as "antibody (2)"). The antibody (1) of the present invention and the antibody (2) of the present invention are collectively referred to as "anti-TGF-β1 antibody of the present invention" or simply "antibody of the present invention". The antibodies of the invention are further characterized by not recognizing any off-target protein predicted from the epitope recognized by the antibody.
好ましい一実施態様において、本発明の抗体(1)は、モノクローナル抗体（MAb）クローン2H4又は該モノクローナル抗体の相補性決定領域（CDR）と同じCDRを有する抗体である。
別の好ましい実施態様において、本発明の抗体(1)は、Mab 2H4と競合的に活性型TGF-β1に結合し、かつ潜在型TGF-β1には結合しない抗体である。
好ましい一実施態様において、本発明の抗体(2)は、モノクローナル抗体（MAb）クローン2F10又は該モノクローナル抗体の相補性決定領域（CDR）と同じCDRを有する抗体である。
別の好ましい実施態様において、本発明の抗体(2)は、Mab 2F10と競合的に潜在型TGF-β1もしくはLAPに結合し、かつ活性型TGF-β1には結合しない抗体である。
In a preferred embodiment, the antibody (1) of the invention is a monoclonal antibody (MAb) clone 2H4 or an antibody having the same CDRs as the complementarity determining regions (CDRs) of the monoclonal antibody.
In another preferred embodiment, the antibody (1) of the present invention is an antibody that competitively binds to active TGF-β1 with Mab 2H4 and does not bind to latent TGF-β1.
In a preferred embodiment, the antibody (2) of the invention is a monoclonal antibody (MAb) clone 2F10 or an antibody having the same CDRs as the complementarity determining regions (CDRs) of the monoclonal antibody.
In another preferred embodiment, the antibody (2) of the present invention is an antibody that competitively binds to latent TGF-β1 or LAP to Mab 2F10 and does not bind to active TGF-β1.
好ましい一実施態様において、本発明の抗体(1)は、
(1) (a) Gly Tyr ThrPhe Ser Asn Tyrで表されるアミノ酸配列（配列番号１）を含むCDR、
(b) Tyr Pro Gly AsnSer Aspで表されるアミノ酸配列（配列番号２）を含むCDR、
(c) Tyr Ser Asn Tyr Glu Ala Gly Ala Met Asp Tyrで表されるアミノ酸配列（配列番号３）を含むCDR、
(d) Lys Ser Ser GlnSer Leu Leu Asn Ser Arg Thr ArgLys Asn Tyr Leu Alaで表されるアミノ酸配列（配列番号４）を含むCDR、
(e) Trp Ala Ser The ArgGlu Serで表されるアミノ酸配列（配列番号５）を含むCDR、及び
(f) Gln Gln Ser Tyr His Leu Pro Thrで表されるアミノ酸配列（配列番号６）を含むCDR
を含む抗体であるか、あるいは
(2) 上記(a)〜(f)のCDRを含むが、配列番号１〜６から選択される1以上（例、1、2、3、4、5又は6）のアミノ酸配列は、各配列において1又は2アミノ酸残基が置換及び／又は欠失及び／又は付加及び／又は挿入されており、かつ活性型TGF-β1を特異的に認識するが、潜在型TGF-β1は認識しない抗体である。
抗体の結合特性は、上記の種々の結合アッセイにより決定することができる。
In one preferred embodiment, the antibody (1) of the present invention is:
(1) (a) CDR containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) represented by Gly Tyr ThrPhe Ser Asn Tyr,
(b) CDR containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) represented by Tyr Pro Gly AsnSer Asp,
(c) CDR containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) represented by Tyr Ser Asn Tyr Glu Ala Gly Ala Met Asp Tyr,
(d) A CDR containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) represented by Lys Ser Ser GlnSer Leu Leu Asn Ser Arg Thr ArgLys Asn Tyr Leu Ala,
(e) CDR containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) represented by Trp Ala Ser The ArgGlu Ser, and
(f) CDR containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) represented by Gln Gln Ser Tyr His Leu Pro Thr
Is an antibody containing or
(2) The amino acid sequences of 1 or more (eg, 1, 2, 3, 4, 5 or 6) selected from SEQ ID NOs: 1 to 6 include the CDRs of (a) to (f) above, and each sequence 1 or 2 amino acid residues are substituted and / or deleted and / or added and / or inserted in, and the active TGF-β1 is specifically recognized, but the latent TGF-β1 is not recognized. is there.
The binding properties of the antibody can be determined by the various binding assays described above.
より好ましくは、
(1) 上記(a)〜(c)のCDRを含む重鎖可変領域と、上記(d)〜(f)のCDRを含む軽鎖可変領域とを含む抗体、あるいは
(2) 上記(1)の重鎖及び軽鎖可変領域を含むが、配列番号１〜６から選択される1以上（例、1、2、3、4、5又は6）のアミノ酸配列は、各配列において1又は2アミノ酸残基が置換及び／又は欠失及び／又は付加及び／又は挿入されており、かつ活性型TGF-β1を特異的に認識するが、潜在型TGF-β1は認識しない抗体である。
More preferably
(1) An antibody containing a heavy chain variable region containing the CDRs (a) to (c) above and a light chain variable region containing the CDRs (d) to (f) above, or
(2) The amino acid sequence of one or more (eg, 1, 2, 3, 4, 5 or 6) selected from SEQ ID NOs: 1 to 6 including the heavy chain and light chain variable regions of (1) above is One or two amino acid residues are substituted and / or deleted and / or added and / or inserted in each sequence, and the active TGF-β1 is specifically recognized, but the latent TGF-β1 is not recognized. It is an antibody.
より好ましくは、上記の抗体において、上記(a)、(b)及び(c)のCDRは、重鎖のN末端側からこの順で配置されている。即ち、(a)、(b)及び(c)のCDRは、それぞれ重鎖のCDR1、CDR2及びCDR3に相当する。同様に、上記(d)、(e)及び(f1のCDRは、軽鎖のN末端側からこの順で配置されている。即ち、(d)、(e)及び(f)のCDRは、それぞれ軽鎖のCDR1、CDR2及びCDR3に相当する。 More preferably, in the above antibody, the CDRs of (a), (b) and (c) are arranged in this order from the N-terminal side of the heavy chain. That is, the CDRs of (a), (b) and (c) correspond to the heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3, respectively. Similarly, the CDRs of (d), (e) and (f1) above are arranged in this order from the N-terminal side of the light chain. That is, the CDRs of (d), (e) and (f) are arranged in this order. They correspond to CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain, respectively.
いっそう好ましくは、本発明の抗体(1)は、
(1) 配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、あるいは
(2) 上記(1)の重鎖及び軽鎖可変領域を含み（但し、配列番号７及び８のいずれか一方もしくは両方において、1個以上、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜数個（例、1、2、3、4又は5個）のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失及び／又は付加及び／又は挿入されている）、かつ活性型TGF-β1を特異的に認識するが、潜在型TGF-β1は認識しない抗体である。
More preferably, the antibody (1) of the present invention
(1) An antibody containing a heavy chain variable region containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and a light chain variable region containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or an antibody.
(2) Containing the heavy chain and light chain variable regions of (1) above (however, in any one or both of SEQ ID NOs: 7 and 8, one or more, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10). One, more preferably one to several (eg, 1, 2, 3, 4 or 5) amino acid residues substituted and / or deleted and / or added and / or inserted) and active form. It is an antibody that specifically recognizes TGF-β1 but does not recognize latent TGF-β1.
別の実施態様においては、本発明の抗体(1)は、上記のいずれかの抗活性型TGF-β1抗体と競合的に活性型TGF-β1に結合し、かつ潜在型TGF-β1には結合しない抗体であり得る。
抗体の競合的結合は、上記の競合アッセイにより測定することができる。
In another embodiment, the antibody (1) of the invention binds to active TGF-β1 competitively with any of the above anti-active TGF-β1 antibodies and to latent TGF-β1. Can be an antibody that does not.
Competitive binding of antibodies can be measured by the competitive assay described above.
好ましい一実施態様において、本発明の抗体(2)は、
(1) (a) Gly Tyr ThrPhe Thr Asp Tyrで表されるアミノ酸配列（配列番号９）を含むCDR、
(b) Ile Pro Asn Ser GlyGlyで表されるアミノ酸配列（配列番号１０）を含むCDR、
(c) Glu Ala Met Asp Tyrで表されるアミノ酸配列（配列番号１１）を含むCDR、
(d) Arg Ala Ser GlnSer Ile Arg Asn Lys Leu Hisで表されるアミノ酸配列（配列番号１２）を含むCDR、
(e) Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Serで表されるアミノ酸配列（配列番号１３）を含むCDR、及び
(f) Leu Gln Ser AsnSer Trp Pro Leu Thrで表されるアミノ酸配列（配列番号１４）を含むCDR
を含む抗体であるか、あるいは
(2) 上記(a)〜(f)のCDRを含むが、配列番号９〜１４から選択される1以上（例、1、2、3、4、5又は6）のアミノ酸配列は、各配列において1又は2アミノ酸残基が置換及び／又は欠失及び／又は付加及び／又は挿入されており、かつ潜在型TGF-β1又はLAPを特異的に認識するが、活性型TGF-β1は認識しない抗体である。
抗体の結合特性は、上記の種々の結合アッセイにより決定することができる。
In one preferred embodiment, the antibody (2) of the present invention is:
(1) (a) CDR containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 9) represented by Gly Tyr ThrPhe Thr Asp Tyr,
(b) CDR containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) represented by Ile Pro Asn Ser Gly Gly,
(c) CDR containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 11) represented by Glu Ala Met Asp Tyr,
(d) CDR containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 12) represented by Arg Ala Ser GlnSer Ile Arg Asn Lys Leu His,
(e) CDR containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 13) represented by Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser, and
(f) CDR containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 14) represented by Leu Gln Ser AsnSer Trp Pro Leu Thr
Is an antibody containing or
(2) The amino acid sequences of one or more (eg, 1, 2, 3, 4, 5 or 6) selected from SEQ ID NOs: 9 to 14, including the CDRs of (a) to (f) above, are each sequence. 1 or 2 amino acid residues are substituted and / or deleted and / or added and / or inserted in, and the latent TGF-β1 or LAP is specifically recognized, but the active TGF-β1 is not recognized. It is an antibody.
The binding properties of the antibody can be determined by the various binding assays described above.
より好ましくは、
(1) 上記(a)〜(c)のCDRを含む重鎖可変領域と、上記(d)〜(f)のCDRを含む軽鎖可変領域とを含む抗体、あるいは
(2) 上記(1)の重鎖及び軽鎖可変領域を含むが、配列番号９〜１４から選択される1以上（例、1、2、3、4、5又は6）のアミノ酸配列は、各配列において1又は2アミノ酸残基が置換及び／又は欠失及び／又は付加及び／又は挿入されており、かつ潜在型TGF-β1又はLAPを特異的に認識するが、活性型TGF-β1は認識しない抗体である。
More preferably
(1) An antibody containing a heavy chain variable region containing the CDRs (a) to (c) above and a light chain variable region containing the CDRs (d) to (f) above, or
(2) The amino acid sequence of one or more (eg, 1, 2, 3, 4, 5 or 6) selected from SEQ ID NOs: 9 to 14, including the heavy chain and light chain variable regions of (1) above, is One or two amino acid residues are substituted and / or deleted and / or added and / or inserted in each sequence, and the latent TGF-β1 or LAP is specifically recognized, but the active TGF-β1 is It is an unrecognized antibody.
より好ましくは、上記の抗体において、上記(a)、(b)及び(c)のCDRは、重鎖のN末端側からこの順で配置されている。即ち、(a)、(b)及び(c)のCDRは、それぞれ重鎖のCDR1、CDR2及びCDR3に相当する。同様に、上記(d)、(e)及び(f1のCDRは、軽鎖のN末端側からこの順で配置されている。即ち、(d)、(e)及び(f)のCDRは、それぞれ軽鎖のCDR1、CDR2及びCDR3に相当する。 More preferably, in the above antibody, the CDRs of (a), (b) and (c) are arranged in this order from the N-terminal side of the heavy chain. That is, the CDRs of (a), (b) and (c) correspond to the heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3, respectively. Similarly, the CDRs of (d), (e) and (f1) above are arranged in this order from the N-terminal side of the light chain. That is, the CDRs of (d), (e) and (f) are arranged in this order. They correspond to CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain, respectively.
いっそう好ましくは、本発明の抗体(2)は、
(1) 配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、あるいは
(2) 上記(1)の重鎖及び軽鎖可変領域を含み（但し、配列番号１５及び１６のいずれか一方もしくは両方において、1個以上、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜数個（例、1、2、3、4又は5個）のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失及び／又は付加及び／又は挿入されている）、かつ潜在型TGF-β1又はLAPを特異的に認識するが、活性型TGF-β1は認識しない抗体である。
More preferably, the antibody (2) of the present invention
(1) An antibody containing a heavy chain variable region containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 and a light chain variable region containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 or an antibody.
(2) Containing the heavy chain and light chain variable regions of (1) above (however, in any one or both of SEQ ID NOs: 15 and 16, one or more, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10). One, more preferably one to several (eg, 1, 2, 3, 4 or 5) amino acid residues substituted and / or deleted and / or added and / or inserted) and latent. It is an antibody that specifically recognizes TGF-β1 or LAP, but does not recognize active TGF-β1.
別の実施態様においては、本発明の抗体(2)は、上記のいずれかの抗潜在型TGF-β1/LAP抗体と競合的に潜在型TGF-β1又はLAPに結合し、かつ活性型TGF-β1には結合しない抗体であり得る。抗体の競合的結合は、上記の競合アッセイにより測定することができる。そのような抗体の例として、後述の実施例に記載されるマウス抗ヒト活性型TGF-β1抗体クローン4D10、6F12及び7F10が挙げられる。
抗体の競合的結合は、上記の競合アッセイにより測定することができる。
In another embodiment, the antibody (2) of the invention binds to latent TGF-β1 or LAP competitively with any of the above anti-latent TGF-β1 / LAP antibodies and is active TGF-. It can be an antibody that does not bind to β1. Competitive binding of antibodies can be measured by the competitive assay described above. Examples of such antibodies include mouse anti-human active TGF-β1 antibody clones 4D10, 6F12 and 7F10 described in Examples below.
Competitive binding of antibodies can be measured by the competitive assay described above.
抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。
本発明の抗体は、抗原決定基（エピトープ）を特異的に認識し、結合するための相補性決定領域 (CDR) を少なくとも有するものであれば、分子の形態に特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’)2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール (PEG) 等のタンパク質安定化作用を有する分子などで修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。
The isotype of the antibody is not particularly limited, but IgG, IgM or IgA is preferable, and IgG is particularly preferable.
The antibody of the present invention is not particularly limited in the form of the molecule as long as it has at least a complementarity determining region (CDR) for specifically recognizing and binding an antigenic determinant (epitogen), and is a complete antibody molecule. In addition, for example, fragments such as Fab, Fab', F (ab') 2, scFv, scFv-Fc, minibodies, diabodies and other genetically engineered conjugate molecules, or polyethylene glycol (PEG), etc. It may be a derivative thereof modified with a molecule having a protein stabilizing action of the above.
[III] 本発明の抗体の作製
本発明の抗体は自体公知の抗体製造法によって作製することができる。以下に、本発明の抗体作製のための免疫原の調製方法、並びに該抗体の製造方法について説明する。
[III] Preparation of the antibody of the present invention The antibody of the present invention can be prepared by an antibody production method known per se. The method for preparing an immunogen for producing the antibody of the present invention and the method for producing the antibody will be described below.
(1) 免疫原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、潜在型もしくは成熟TGF-β1全体又はLAPポリペプチド全体、あるいはその部分ペプチド、あるいはそれと同一の抗原決定基を1種以上有する（合成）ペプチドなどを使用することができる。一実施態様において、6〜15アミノ酸からなる成熟TGF-β1又はLAPポリペプチドの部分ペプチドが免疫原として使用される。より好ましくは、成熟TGF-β1及びLAPの各領域内の進化的に保存されたユニークなアミノ酸配列を、免疫原として用いることができる。そのような進化的に保存されたユニークなアミノ酸配列は、商業的に利用可能なエピトープ予測ソフトウェアを用いて、in silicoで予測することができる。
(1) Preparation of immunogen As an antigen used for preparing the antibody of the present invention, a latent or mature TGF-β1 whole or a whole LAP polypeptide, a partial peptide thereof, or the same antigenic determinant is used. A (synthetic) peptide having one or more kinds can be used. In one embodiment, a mature TGF-β1 consisting of 6-15 amino acids or a partial peptide of a LAP polypeptide is used as an immunogen. More preferably, evolutionarily conserved unique amino acid sequences within each region of mature TGF-β1 and LAP can be used as immunogens. Such evolutionarily conserved unique amino acid sequences can be predicted in silico using commercially available epitope prediction software.
潜在型もしくは成熟TGF-β1全体又はLAPポリペプチド全体、あるいはその部分ペプチドは、例えば、（a）ヒトの組織又は細胞から公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、（b）ペプチド・シンセサイザー等を使用する公知のペプチド合成法で化学的に合成、（c）潜在型もしくは成熟TGF-β1全体又はLAPポリペプチド全体、あるいはその部分ペプチドをコードするDNAを含む形質転換体を培養、あるいは（d）潜在型もしくは成熟TGF-β1全体又はLAPポリペプチド全体、あるいはその部分ペプチドをコードする核酸を鋳型として、無細胞転写／翻訳系を用いて生化学的に合成することによって調製される。 The entire latent or mature TGF-β1 or the entire LAP polypeptide, or a partial peptide thereof, is prepared, for example, from (a) a method known from human tissues or cells or a method similar thereto, (b) a peptide synthesizer, etc. Chemically synthesized by a known peptide synthesis method using the above, (c) culturing a transformant containing DNA encoding the entire latent or mature TGF-β1 or the entire LAP polypeptide, or a partial peptide thereof, or (d). ) It is prepared by biochemical synthesis using a cell-free transcription / translation system using a nucleic acid encoding a latent or mature TGF-β1 whole or LAP polypeptide as a whole or a partial peptide thereof as a template.
オリゴヌクレオチドを免疫原として使用する場合、該オリゴペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）等の適切なキャリアタンパク質に連結して免疫原性を付与することができる。 When an oligonucleotide is used as an immunogen, the oligopeptide can be linked to a suitable carrier protein such as keyhole limpet hemocyanin (KLH) to confer immunogenicity.
(2) モノクローナル抗体の作製
(a) モノクローナル抗体産生細胞の作製
上記のようにして調製された免疫原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静脈注入、皮下注射、皮内注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独であるいは担体、希釈剤と共に投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常1〜6週毎に１回ずつ、計2〜10回程度行われる。温血動物としては、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、サル、イヌ、モルモット、ヒツジ、ロバ、ニワトリ等が用いられるが、マウス、ラット及びウサギが好ましい。
(2) Preparation of monoclonal antibody
(a) Preparation of monoclonal antibody-producing cells The immunogen prepared as described above produces antibodies to warm-blooded animals by administration methods such as intraperitoneal injection, intravenous injection, subcutaneous injection, and intradermal injection. It is administered to the site where it is possible, either alone or with a carrier or diluent. A complete Freund's adjuvant or an incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability at the time of administration. The administration is usually performed once every 1 to 6 weeks, for a total of 2 to 10 times. As the warm-blooded animal, for example, mice, rats, rabbits, goats, monkeys, dogs, guinea pigs, sheep, donkeys, chickens and the like are used, but mice, rats and rabbits are preferable.
あるいは、免疫原を体外免疫法に供することもできる。体外免疫法に用いられる動物細胞としては、ヒトおよび上記した温血動物（好ましくはマウス、ラット）の末梢血、脾臓、リンパ節などから単離されるリンパ球、好ましくはＢリンパ球等が挙げられる。例えば、マウスやラット細胞の場合、4〜12週齢程度の動物から脾臓を摘出・脾細胞を分離し、適当な培地（例：ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、ハムF12培地等）で洗浄した後、抗原を含む胎仔ウシ血清（FCS；5〜20%程度）添加培地に浮遊させて4〜10日間程度CO2インキュベーターなどを用いて培養する。抗原濃度としては、例えば0.05〜5μgが挙げられるがこれに限定されない。同一系統の動物（1〜2週齢程度が好ましい）の胸腺細胞培養上清を常法に従って調製し、培地に添加することが好ましい。 Alternatively, the immunogen can be used for in vitro immunization. Examples of animal cells used in the in vitro immunization method include lymphocytes isolated from the peripheral blood, spleen, lymph nodes and the like of humans and the above-mentioned warm-blooded animals (preferably mice and rats), preferably B lymphocytes and the like. .. For example, in the case of mouse or rat cells, the spleen is removed from an animal about 4 to 12 weeks old, the spleen cells are separated, and an appropriate medium (eg, Dalveco modified Eagle's medium (DMEM), RPMI1640 medium, ham F12 medium, etc.) After washing with, the cells are suspended in a medium containing fetal bovine serum (FCS; about 5 to 20%) containing an antigen and cultured in a CO 2 incubator for about 4 to 10 days. Examples of the antigen concentration include, but are not limited to, 0.05 to 5 μg. It is preferable to prepare thymocyte culture supernatants of animals of the same strain (preferably about 1 to 2 weeks old) according to a conventional method and add them to the medium.
ヒト細胞の体外免疫では、胸腺細胞培養上清を得ることは困難なので、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6等数種のサイトカインおよび必要に応じてアジュバント物質（例：ムラミルジペプチド等）を抗原とともに培地に添加して免疫感作を行うことが好ましい。 Since it is difficult to obtain thymocyte culture supernatant by in vitro immunization of human cells, several cytokines such as IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 and adjuvant substances as needed (eg, unevenness) It is preferable to add (mildipeptide, etc.) to the medium together with the antigen to perform immunosensitization.
モノクローナル抗体の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物（例：マウス、ラット）もしくは動物細胞（例：ヒト、マウス、ラット）から抗体価の上昇が認められた個体もしくは細胞集団を選択し、最終免疫の2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取もしくは体外免疫後4〜10日間培養した後に細胞を回収して抗体産生細胞を単離し、これと骨髄腫細胞とを融合させることにより抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。血清中の抗体価の測定は、例えば標識化抗原と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。 When producing a monoclonal antibody, an individual or cell population in which an increase in antibody titer was observed was selected from warm-blooded animals (eg, mice, rats) or animal cells (eg, humans, mice, rats) immunized with the antigen. Antibodies are obtained by collecting spleen or lymph nodes 2 to 5 days after final immunization or culturing for 4 to 10 days after in vitro immunization, then collecting cells to isolate antibody-producing cells, and fusing them with myeloma cells. Produced hybridomas can be prepared. The antibody titer in serum can be measured, for example, by reacting the labeled antigen with the antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
骨髄腫細胞は多量の抗体を分泌するハイブリドーマを産生し得るものであれば特に制限はないが、自身は抗体を産生もしくは分泌しないものが好ましく、また、細胞融合効率が高いものがより好ましい。また、ハイブリドーマの選択を容易にするために、HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）感受性の株を用いることが好ましい。例えばマウス骨髄腫細胞としてはNS-1、P3U1、SP2/0、AP-1等が、ラット骨髄腫細胞としてはR210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3等が、ヒト骨髄腫細胞としてはSKO-007、GM 1500-6TG-2、LICR-LON-HMy2、UC729-6等が挙げられる。 The myeloma cells are not particularly limited as long as they can produce hybridomas that secrete a large amount of antibodies, but those that produce or do not secrete antibodies by themselves are preferable, and those with high cell fusion efficiency are more preferable. Moreover, in order to facilitate the selection of hybridoma, it is preferable to use a strain sensitive to HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). For example, NS-1, P3U1, SP2 / 0, AP-1, etc. as mouse myeloma cells, R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, etc. as rat myeloma cells, SKO- as human myeloma cells. 007, GM 1500-6TG-2, LICH-LON-HMy2, UC729-6, etc. can be mentioned.
融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法［ネイチャー（Nature）、256巻、495頁(1975年)］に従って実施することができる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（PEG）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはPEGなどが用いられる。PEGの分子量は特に制限はないが、低毒性で且つ粘性が比較的低いPEG1000〜PEG6000が好ましい。PEG濃度としては例えば10〜80%程度、好ましくは30〜50%程度が例示される。PEGの希釈用溶液としては無血清培地（例：RPMI1640）、5〜20%程度の血清を含む完全培地、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、トリス緩衝液等の各種緩衝液を用いることができる。所望によりDMSO（例：10〜20％程度）を添加することもできる。融合液のpHとしては、例えば4〜10程度、好ましくは6〜8程度が挙げられる。 The fusion operation can be performed according to known methods, such as Koehler and Milstein's method [Nature, Vol. 256, p. 495 (1975)]. Examples of the fusion accelerator include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG and the like are preferably used. The molecular weight of PEG is not particularly limited, but PEG1000 to PEG6000, which have low toxicity and relatively low viscosity, are preferable. The PEG concentration is, for example, about 10 to 80%, preferably about 30 to 50%. As a solution for diluting PEG, various buffers such as serum-free medium (eg RPMI1640), complete medium containing about 5 to 20% serum, phosphate buffered saline (PBS), and Tris buffer can be used. it can. If desired, DMSO (eg, about 10 to 20%) can be added. The pH of the fusion solution is, for example, about 4 to 10, preferably about 6 to 8.
抗体産生細胞（脾細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は、通常1:1〜20:1程度であり、通常20〜40℃、好ましくは30〜37℃で通常1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。 The preferred ratio of the number of antibody-producing cells (spleen cells) to the number of myeloma cells is usually about 1: 1 to 20: 1, and is usually incubated at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for usually 1 to 10 minutes. By doing so, cell fusion can be carried out efficiently.
抗体産生細胞株はまた、リンパ球をトランスフォームし得るウイルスに抗体産生細胞を感染させて該細胞を不死化することによっても得ることができる。そのようなウイルスとしては、例えばエプスタイン−バー（EB）ウイルス等が挙げられる。大多数の人は伝染性単核球症の無症状感染としてこのウイルスに感染した経験があるので免疫を有しているが、通常のEBウイルスを用いた場合にはウイルス粒子も産生されるので、適切な精製を行うべきである。ウイルス混入の可能性のないEBシステムとして、Ｂリンパ球を不死化する能力を保持するがウイルス粒子の複製能力を欠損した組換えEBウイルス（例えば、潜伏感染状態から溶解感染状態への移行のスイッチ遺伝子における欠損など）を用いることもまた好ましい。 Antibody-producing cell lines can also be obtained by infecting antibody-producing cells with a virus capable of transforming lymphocytes to immortalize the cells. Examples of such a virus include Epstein-Barr (EB) virus and the like. The majority of people are immune because they have been infected with this virus as an asymptomatic infection of infectious mononucleosis, but when using the normal EB virus, virus particles are also produced. , Should be properly purified. As an EB system with no potential for virus contamination, a recombinant EB virus that retains the ability to immortalize B lymphocytes but lacks the ability to replicate virus particles (eg, a switch to transition from a latently infected state to a dissolved infected state). It is also preferable to use (such as a defect in a gene).
マーモセット由来のB95-8細胞はEBウイルスを分泌しているので、その培養上清を用いれば容易にＢリンパ球をトランスフォームすることができる。この細胞を例えば血清及びペニシリン／ストレプトマイシン（P/S）添加培地（例：RPMI1640）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で培養した後、濾過もしくは遠心分離等により培養上清を分離し、これに抗体産生Ｂリンパ球を適当な濃度（例：約107細胞/mL）で浮遊させて、通常20〜40℃、好ましくは30〜37℃で通常0.5〜2時間程度インキュベートすることにより抗体産生Ｂ細胞株を得ることができる。ヒトの抗体産生細胞が混合リンパ球として提供される場合、大部分の人はEBウイルス感染細胞に対して傷害性を示すＴリンパ球を有しているので、トランスフォーメーション頻度を高めるためには、例えばヒツジ赤血球等とＥロゼットを形成させることによってＴリンパ球を予め除去しておくことが好ましい。また、可溶性抗原を結合したヒツジ赤血球を抗体産生Ｂリンパ球と混合し、パーコール等の密度勾配を用いてロゼットを分離することにより標的抗原に特異的なリンパ球を選別することができる。さらに、大過剰の抗原を添加することにより抗原特異的なＢリンパ球はキャップされて表面にIgGを提示しなくなるので、抗IgG抗体を結合したヒツジ赤血球と混合すると抗原非特異的なＢリンパ球のみがロゼットを形成する。従って、この混合物からパーコール等の密度勾配を用いてロゼット非形成層を採取することにより、抗原特異的Ｂリンパ球を選別することができる。 Since B95-8 cells derived from marmosets secrete EB virus, B lymphocytes can be easily transformed by using the culture supernatant. After culturing these cells in, for example, serum and a medium supplemented with penicillin / streptomycin (P / S) (eg, RPMI1640) or a serum-free medium supplemented with a cell growth factor, the culture supernatant is separated by filtration or centrifugation. suitable concentration (e.g. about 107 cells / mL) of antibody-producing B lymphocytes resuspended in typically 20 to 40 ° C., preferably antibody production by incubation of usually about 0.5 to 2 hours at 30 to 37 ° C. A B cell line can be obtained. When human antibody-producing cells are provided as mixed lymphocytes, most people have T lymphocytes that are damaging to EB virus-infected cells, so in order to increase the frequency of transformation, For example, it is preferable to remove T lymphocytes in advance by forming an E rosette with sheep erythrocytes and the like. In addition, lymphocytes specific to the target antigen can be selected by mixing sheep erythrocytes bound with a soluble antigen with antibody-producing B lymphocytes and separating the rosette using a density gradient such as percor. Furthermore, by adding a large excess of antigen, antigen-specific B lymphocytes are capped and do not present IgG on the surface. Therefore, when mixed with sheep erythrocytes bound to anti-IgG antibody, antigen-specific B lymphocytes are not present. Only form a rosette. Therefore, antigen-specific B lymphocytes can be selected by collecting the rosette cambium from this mixture using a density gradient such as Percoll.
トランスフォーメーションによって無限増殖能を獲得したヒト抗体分泌細胞は、抗体分泌能を安定に持続させるためにマウスもしくはヒトの骨髄腫細胞と戻し融合させることができる。骨髄腫細胞としては上記と同様のものが用いられ得る。 Human antibody-secreting cells that have acquired infinite proliferation ability by transformation can be re-fused with mouse or human myeloma cells in order to stably maintain the antibody-secreting ability. As the myeloma cells, the same cells as described above can be used.
ハイブリドーマのスクリーニング、育種は通常HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、5〜20% FCSを含む動物細胞用培地（例：RPMI1640）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で行われる。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンの濃度としては、例えばそれぞれ約0.1mM、約0.4μMおよび約0.016mM等が挙げられる。ヒト−マウスハイブリドーマの選択にはウワバイン耐性を用いることができる。ヒト細胞株はマウス細胞株に比べてウワバインに対する感受性が高いので、10-7〜10-3M程度で培地に添加することにより未融合のヒト細胞を排除することができる。 Hybridoma screening and breeding is usually performed in animal cell medium containing 5-20% FCS (eg RPMI1640) with the addition of HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) or serum-free medium supplemented with cell growth factors. Will be. Concentrations of hypoxanthine, aminopterin and thymidine include, for example, about 0.1 mM, about 0.4 μM and about 0.016 mM, respectively. Ouabain resistance can be used to select human-mouse hybridomas. Since human cell lines are more sensitive to ouabain than mouse cell lines, unfused human cells can be eliminated by adding them to the medium at about 10 -7 to 10 -3 M.
ハイブリドーマの選択にはフィーダー細胞やある種の細胞培養上清を用いることが好ましい。フィーダー細胞としては、ハイブリドーマの出現を助けて自身は死滅するように生存期間が限られた異系の細胞種、ハイブリドーマの出現に有用な増殖因子を大量に産生し得る細胞を放射線照射等して増殖力を低減させたもの等が用いられる。例えば、マウスのフィーダー細胞としては、脾細胞、マクロファージ、血液、胸腺細胞等が、ヒトのフィーダー細胞としては、末梢血単核細胞等が挙げられる。細胞培養上清としては、例えば上記の各種細胞の初代培養上清や種々の株化細胞の培養上清が挙げられる。 For selection of hybridomas, it is preferable to use feeder cells or certain cell culture supernatants. Feeder cells include allogeneic cell types with a limited survival period that help the emergence of hybridomas and kill themselves, and cells that can produce large amounts of growth factors useful for the emergence of hybridomas are irradiated. Those with reduced proliferative power are used. For example, mouse feeder cells include splenocytes, macrophages, blood, thymocytes and the like, and human feeder cells include peripheral blood mononuclear cells and the like. Examples of the cell culture supernatant include the above-mentioned primary culture supernatants of various cells and culture supernatants of various established cells.
また、ハイブリドーマは、抗原を蛍光標識して融合細胞と反応させた後、蛍光活性化セルソータ（FACS）を用いて抗原と結合する細胞を分離することによっても選択することができる。この場合、標的抗原に対する抗体を産生するハイブリドーマを直接選択することができるので、クローニングの労力を大いに軽減することが可能である。 Hybridomas can also be selected by fluorescently labeling the antigen, reacting it with the fused cells, and then separating the cells that bind to the antigen using a fluorescence activated cell sorter (FACS). In this case, since the hybridoma that produces the antibody against the target antigen can be directly selected, the labor of cloning can be greatly reduced.
標的抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローニングには種々の方法が使用できる。 Various methods can be used for cloning hybridomas that produce monoclonal antibodies against the target antigen.
アミノプテリンは多くの細胞機能を阻害するので、できるだけ早く培地から除去することが好ましい。マウスやラットの場合、ほとんどの骨髄腫細胞は10〜14日以内に死滅するので、融合2週間後からはアミノプテリンを除去することができる。但し、ヒトハイブリドーマについては通常融合後4〜6週間程度はアミノプテリン添加培地で維持される。ヒポキサンチン、チミジンはアミノプテリン除去後1週間以上後に除去するのが望ましい。即ち、マウス細胞の場合、例えば融合7〜10日後にヒポキサンチンおよびチミジン（HT）添加完全培地（例：10% FCS添加RPMI1640）の添加または交換を行う。融合後8〜14日程度で目視可能なクローンが出現する。クローンの直径が1mm程度になれば培養上清中の抗体量の測定が可能となる。 Since aminopterin inhibits many cell functions, it is preferable to remove it from the medium as soon as possible. In mice and rats, most myeloma cells die within 10-14 days, so aminopterin can be removed 2 weeks after fusion. However, human hybridomas are usually maintained in an aminopterin-added medium for about 4 to 6 weeks after fusion. Hypoxanthine and thymidine should be removed at least 1 week after the removal of aminopterin. That is, in the case of mouse cells, for example, 7 to 10 days after fusion, addition or replacement of hypoxanthine and thymidine (HT) -added complete medium (eg, 10% FCS-added RPMI1640) is performed. Visible clones appear about 8 to 14 days after fusion. When the diameter of the clone is about 1 mm, the amount of antibody in the culture supernatant can be measured.
抗体量の測定は、例えば標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチド（抗原決定基として用いた部分アミノ酸配列を含む）を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例：マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質（例：125I、131I、3H、14C）、酵素（例：β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン）などで標識した抗免疫グロブリン（IgG）抗体（もとの抗体産生細胞が由来する動物と同一種の動物由来のIgGに対する抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した標的抗原（抗原決定基）に対する抗体を検出する方法、抗IgG抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、上記と同様の標識剤で標識した標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチドを加え、固相に結合した標的抗原（抗原決定基）に対する抗体を検出する方法などによって行うことができる。 The amount of antibody can be measured, for example, by adsorbing a target antigen or a derivative thereof or a partial peptide thereof (including a partial amino acid sequence used as an antigenic determinant) directly or with a carrier on a solid phase (eg, microplate) of a hybridoma culture supernatant. , Then radioactive substances (eg 125 I, 131 I, 3 H, 14 C), enzymes (eg β-galactosidase, β-glucosidase, alkali phosphatase, peroxidase, malic acid dehydrogenase), fluorescence Anti-immunoglobulin (IgG) antibody (animal from which the original antibody-producing cell is derived) labeled with a substance (eg, fluorescamine, fluoressen isothiocyanate), luminescent substance (eg, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin), etc. (An antibody against IgG derived from the same species as the same species is used) or protein A is added to detect an antibody against a target antigen (antibody determinant) bound to the solid phase, an anti-IgG antibody or a solid to which protein A is adsorbed. A method of adding a hybridoma culture supernatant to a phase, adding a target antigen labeled with a labeling agent similar to the above, a derivative thereof, or a partial peptide thereof, and detecting an antibody against the target antigen (antibody determinant) bound to the solid phase, etc. Can be done by.
クローニング方法としては限界希釈法が通常用いられるが、軟寒天を用いたクローニングやFACSを用いたクローニング（上述）も可能である。限界希釈法によるクローニングは、例えば以下の手順で行うことができるがこれに限定されない。 The limiting dilution method is usually used as the cloning method, but cloning using soft agar and cloning using FACS (described above) are also possible. Cloning by the limiting dilution method can be performed, for example, by the following procedure, but is not limited thereto.
上記のようにして抗体量を測定して陽性ウェルを選択する。適当なフィーダー細胞を選択して96ウェルプレートに添加しておく。抗体陽性ウェルから細胞を吸い出し、完全培地（例：10% FCSおよびP/S添加RMPI1640）中に30細胞/mLの密度となるように浮遊させ、フィーダー細胞を添加したウェルプレートに0.1mL（3細胞/ウェル）加え、残りの細胞懸濁液を10細胞/mLに希釈して別のウェルに同様にまき（1細胞/ウェル）、さらに残りの細胞懸濁液を3細胞/mLに希釈して別のウェルにまく（0.3細胞/ウェル）。目視可能なクローンが出現するまで2〜3週間程度培養し、抗体量を測定・陽性ウェルを選択し、再度クローニングする。ヒト細胞の場合はクローニングが比較的困難なので、10細胞/ウェルのプレートも調製しておく。通常2回のサブクローニングでモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができるが、その安定性を確認するためにさらに数ヶ月間定期的に再クローニングを行うことが望ましい。 The amount of antibody is measured as described above and a positive well is selected. Suitable feeder cells are selected and added to the 96-well plate. Cells were aspirated from antibody-positive wells, suspended in complete medium (eg, RMPI1640 with 10% FCS and P / S) to a density of 30 cells / mL, and 0.1 mL (3) on well plates supplemented with feeder cells. Add cells / well), dilute the remaining cell suspension to 10 cells / mL and sprinkle in another well in the same manner (1 cell / well), and further dilute the remaining cell suspension to 3 cells / mL. Sprinkle in another well (0.3 cells / well). Incubate for about 2 to 3 weeks until a visible clone appears, measure the amount of antibody, select a positive well, and clone again. Since cloning is relatively difficult for human cells, a 10-cell / well plate should also be prepared. Monoclonal antibody-producing hybridomas can usually be obtained by two subclonings, but it is desirable to perform periodic recloning for several months to confirm their stability.
(b) ディファレンシャル・スクリーニング
上記のようにして得られた活性型TGF-β1に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、次いで2次スクリーニングに供される。2次スクリーニングでは、免疫原として使用された活性型TGF-β1及び／又はその部分ペプチドだけでなく、潜在型TGF-β1もプローブとして使用される。上記のようにして得られた潜在型TGF-β1／LAPに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマもまた、次いで2次スクリーニングに供される。2次スクリーニングでは、免疫原として使用された潜在型TGF-β1及び／又はLAPの部分ペプチドだけでなく、活性型TGF-β1もプローブとして使用される。2次スクリーニングの結果、活性型TGF-β1及び／又はその部分ペプチドとは反応するが、潜在型TGF-β1とは反応しなかったモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、本発明の抗活性型TGF-β1抗体を産生するハイブリドーマとして選択することができる。同様に、2次スクリーニングの結果、潜在型TGF-β1及び／又はLAPの部分ペプチドとは反応するが、活性型TGF-β1とは反応しなかったモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、本発明の抗潜在型TGF-β1／LAP抗体を産生するハイブリドーマとして選択することができる。
(b) Differential screening The hybridoma that produces the monoclonal antibody against the active TGF-β1 obtained as described above is then subjected to the secondary screening. In the secondary screening, not only the active TGF-β1 and / or a partial peptide thereof used as an immunogen, but also the latent TGF-β1 is used as a probe. Hybridomas that produce monoclonal antibodies to the latent TGF-β1 / LAP obtained as described above are also then subjected to secondary screening. In the secondary screening, not only the latent TGF-β1 and / or partial peptide of LAP used as an immunogen, but also the active TGF-β1 is used as a probe. As a result of the secondary screening, a hybridoma that produces a monoclonal antibody that reacts with the active TGF-β1 and / or its partial peptide but does not react with the latent TGF-β1 is a hybridoma of the present invention. It can be selected as a hybridoma that produces β1 antibody. Similarly, as a result of the secondary screening, a hybridoma producing a monoclonal antibody that reacts with a partial peptide of latent TGF-β1 and / or LAP but does not react with active TGF-β1 is used as an anti-antibody of the present invention. It can be selected as a hybridoma that produces latent TGF-β1 / LAP antibody.
(e) ネガティブ選択
好ましい一実施態様において、本発明の抗体は、それが認識するエピトープのアミノ酸配列から予測される、TGF-β2、TGF-β3等を含むいかなるオフターゲットタンパク質とも交差反応しない。従って、上記のようにして得られた活性型TGF-β1又は潜在型TGF-β1／LAPのいずれか一方のみを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをネガティブ選択にかけ、それらがオフターゲットタンパク質と交差反応しないことを確認することができる。
(e) Negative Selection In a preferred embodiment, the antibody of the invention does not cross-react with any off-target protein, including TGF-β2, TGF-β3, etc., as predicted from the amino acid sequence of the epitope it recognizes. Therefore, hybridomas that produce monoclonal antibodies that recognize only one of the active TGF-β1 or latent TGF-β1 / LAP obtained as described above are subjected to negative selection and cross-react with off-target proteins. You can be sure not to.
こうして得られたハイブリドーマはin vitro又はin vivoで培養するすることができる。in vitroでの培養法としては、上記のようにして得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、細胞密度を例えば105〜106細胞/mL程度に保ちながら、また、FCS濃度を徐々に減らしながら、ウェルプレートから徐々にスケールアップしていく方法が挙げられる。in vivoでの培養法としては、例えば、腹腔内にミネラルオイルを注入して形質細胞腫（MOPC）を誘導したマウス（ハイブリドーマの親株と組織適合性のマウス）に、5〜10日後に106〜107細胞程度のハイブリドーマを腹腔内注射し、2〜5週間後に麻酔下で腹水を採取する方法が挙げられる。 The hybridoma thus obtained can be cultured in vitro or in vivo. The culture method for in vitro, monoclonal antibody-producing hybridoma obtained as described above, while the cell density, for example, about 105 to 106 cells / mL, also gradually reducing the FCS concentration, wells There is a method of gradually scaling up from the plate. In vivo culture methods include, for example, in mice in which plasmacytoma (MOPC) has been induced by injecting mineral oil into the abdominal cavity (hybridoma parent strain and tissue-compatible mice) after 5 to 10 days 10 6 An example is a method in which a hybridoma of about 10 7 cells is injected intraperitoneally, and ascites is collected under anesthesia 2 to 5 weeks later.
(c) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法［例：塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例：DEAE、QEAE）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など］に従って行うことができる。
以上のようにして、ハイブリドーマを温血動物の生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から抗体を採取することによって、モノクローナル抗体を製造することができる。
(c) Purification of monoclonal antibody Separation and purification of monoclonal antibody is a method known per se, for example, separation and purification of immunoglobulin [eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchange. Only the antibody is collected by the body (eg, DEAE, QEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase, or active adsorbent such as protein A or protein G, and the binding is dissociated to obtain the antibody. It can be carried out according to the specific purification method obtained].
As described above, a monoclonal antibody can be produced by culturing a hybridoma in vivo or in vitro of a warm-blooded animal and collecting the antibody from the body fluid or culture thereof.
上記のようにして得られる本発明の抗活性型TGF-β1抗体の例として、後述の実施例に記載されるマウス抗ヒト活性型TGF-β1抗体クローン2H4、4D10、6F12及び7F10が挙げられる。上記のようにして得られる本発明の抗潜在型TGF-β1/LAP抗体の例として、後述の実施例に記載されるマウス抗ヒト潜在型TGF-β1/LAP抗体クローン2F10が挙げられる。アミノ酸配列決定の結果、2H4抗体は、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる可変領域を含む重鎖、及び配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる可変領域を含む軽鎖を有すること、また、2F10抗体は、配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなる可変領域を含む重鎖、及び配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなる可変領域を含む軽鎖を有することが明らかとなっている。 Examples of the anti-active TGF-β1 antibody of the present invention obtained as described above include mouse anti-human active TGF-β1 antibody clones 2H4, 4D10, 6F12 and 7F10 described in Examples described later. Examples of the anti-latent TGF-β1 / LAP antibody of the present invention obtained as described above include the mouse anti-human latent TGF-β1 / LAP antibody clone 2F10 described in Examples described later. As a result of amino acid sequencing, the 2H4 antibody has a heavy chain containing a variable region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and a light chain containing a variable region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8. Further, it has been clarified that the 2F10 antibody has a heavy chain containing a variable region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 and a light chain containing a variable region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16. There is.
(d) 組換え抗体の作製
別の実施態様において、こうして得られた抗活性型TGF-β1抗体又は抗潜在型TGF-β1／LAP抗体の重鎖及び軽鎖をコードするcDNAを、該抗体を産生するハイブリドーマのcDNAライブラリーから単離し、常法に従って、目的の宿主細胞で機能的な適当な発現ベクターにクローニングすることができる。次いで、こうして得られた重鎖及び軽鎖発現ベクターを宿主細胞に導入する。有用な宿主細胞としては、動物細胞、例えば上記したマウス骨髄腫細胞の他、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、サル由来のCOS-7細胞、Vero細胞、ラット由来のGHS細胞などが挙げられる。遺伝子導入は動物細胞に適用可能ないかなる方法を用いてもよいが、好ましくはエレクトロポレーション法又はカチオン性脂質を用いた方法などが挙げられる。宿主細胞に適した培地中で一定期間培養後、培養上清を回収して抗体タンパク質を常法により精製することにより、本発明の抗体を単離することができる。あるいは、宿主細胞としてウシ、ヤギ、ニワトリ等のトランスジェニック技術が確立し、且つ家畜（家禽）として大量繁殖のノウハウが蓄積されている動物の生殖系列細胞を用い、常法によってトランスジェニック動物を作製することにより、得られる動物の乳汁もしくは卵から容易に且つ大量に本発明の抗体を得ることもできる。さらに、トウモロコシ、イネ、コムギ、ダイズ、タバコなどのトランスジェニック技術が確立し、且つ主要作物として大量に栽培されている植物細胞を宿主細胞として、プロトプラストへのマイクロインジェクションやエレクトロポレーション、無傷細胞へのパーティクルガン法やTiベクター法などを用いてトランスジェニック植物を作製し、得られる種子や葉などから大量に本発明の抗体を得ることも可能である。
(d) Preparation of recombinant antibody In another embodiment, the cDNA encoding the heavy chain and light chain of the anti-active TGF-β1 antibody or anti-latent TGF-β1 / LAP antibody thus obtained is used to obtain the antibody. It can be isolated from the cDNA library of the hybridoma produced and cloned into a suitable expression vector that is functional in the host cell of interest according to conventional methods. The heavy and light chain expression vectors thus obtained are then introduced into the host cell. Useful host cells include animal cells, such as mouse myeloma cells described above, Chinese hamster ovary (CHO) cells, monkey-derived COS-7 cells, Vero cells, rat-derived GHS cells and the like. Any method applicable to animal cells may be used for gene transfer, but an electroporation method or a method using a cationic lipid is preferable. The antibody of the present invention can be isolated by culturing in a medium suitable for a host cell for a certain period of time, collecting the culture supernatant, and purifying the antibody protein by a conventional method. Alternatively, transgenic animals are produced by a conventional method using germline cells of animals such as cattle, goats, chickens, etc. that have established transgenic technology as host cells and have accumulated know-how on mass breeding as livestock (poultry). By doing so, the antibody of the present invention can be easily and in large quantities from the obtained animal milk or egg. Furthermore, using plant cells for which transgenic technologies such as corn, rice, wheat, soybean, and tobacco have been established and are cultivated in large quantities as major crops as host cells, to microinjection to protoplasts, electroporation, and intact cells. It is also possible to prepare a transgenic plant by using the particle gun method or the Ti vector method of the above, and obtain a large amount of the antibody of the present invention from the obtained seeds and leaves.
[IV] 本発明の抗体の用途
本発明の抗体は活性型TGF-β1又は潜在型TGF-β1/LAPのいずれかを特異的に認識することができ、かついかなるオフターゲットタンパク質も認識しないので、被検細胞サンプル中の活性型TGF-β1又は潜在型TGF-β1/LAPの正確な検出及び定量に使用することができる。これらの目的のために、全抗体分子を用いてもよいし、抗体分子のF(ab’)2、Fab’又はFabフラクション等のその断片を用いてもよい。本発明の抗体を用いた測定法は特に制限されず、任意の測定法を用いることができる。
[IV] Uses of the antibody of the present invention Since the antibody of the present invention can specifically recognize either active TGF-β1 or latent TGF-β1 / LAP and does not recognize any off-target protein. It can be used for accurate detection and quantification of active TGF-β1 or latent TGF-β1 / LAP in test cell samples. For these purposes, all antibody molecules may be used, or fragments thereof, such as F (ab') 2 , Fab' or Fab fraction of the antibody molecule, may be used. The measurement method using the antibody of the present invention is not particularly limited, and any measurement method can be used.
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、[125I]、[131I]、[3H]、[14C]などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート（FITC）、フィコエリスリン（PE）などが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。 As the labeling agent used in the measurement method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. As the radioisotope, for example, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] and the like are used. The enzyme is preferably stable and has a large specific activity, and for example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE) and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, a luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
本発明の抗体を直接標識物質で標識してもよいし、間接的に標識してもよい。好ましい態様においては、本発明の抗体は非標識抗体（一次抗体）とし、本発明の抗体を作製した動物に対する抗血清や抗Ig抗体等の標識された二次抗体により、活性型又は潜在型TGF-β1を検出することができる。あるいは、ビオチン化した二次抗体を用いて、TGF-β1-本発明の抗体-二次抗体の複合体を形成させ、これを標識したストレプトアビジンを用いて可視化することもできる。 The antibody of the present invention may be directly labeled with a labeling substance or indirectly. In a preferred embodiment, the antibody of the present invention is an unlabeled antibody (primary antibody), and an active or latent TGF is produced by a labeled secondary antibody such as antiserum or anti-Ig antibody against the animal for which the antibody of the present invention is produced. -β1 can be detected. Alternatively, a biotinylated secondary antibody can be used to form a TGF-β1-antibody-secondary antibody complex of the invention, which can be visualized with labeled streptavidin.
例えば、生検組織サンプルをグルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒド等で固定・透過処理しPBS等の緩衝液で洗浄、BSA等でブロッキングした後、本発明の抗体とインキュベートする。PBS等の緩衝液で洗浄して未反応の抗体を除去した後、本発明のと反応した組織を標識した二次抗体で可視化し、顕微鏡下で目視観察したり、共焦点レーザー走査型顕微鏡や、IN Cell Analyzer（Amarsham/GE）等の自動化された生細胞画像解析装置等を用いて定量解析することができる。 For example, a biopsy tissue sample is fixed and permeated with glutaraldehyde, paraformaldehyde, etc., washed with a buffer solution such as PBS, blocked with BSA, etc., and then incubated with the antibody of the present invention. After washing with a buffer solution such as PBS to remove unreacted antibody, the tissue that reacted with the present invention is visualized with a labeled secondary antibody and visually observed under a microscope, or a confocal laser scanning microscope or , IN Cell Analyzer (Amarsham / GE) and other automated live cell image analyzers can be used for quantitative analysis.
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
1) 免疫原の調製
潜在型TGF-β1ポリペプチドのLAP及び成熟TGF-β1領域に位置する進化上保存されたユニークな配列（10アミノ酸）を、市販のエピトープ予測ソフトウェアEpitope Hunterを用いて抽出した。抽出された配列からなるペプチドを、ペプチドシーケンサーを用いて合成した。これらのペプチドをキャリアに連結して免疫原を得た。
1) Preparation of immunogens Evolutionarily conserved unique sequences (10 amino acids) located in the LAP and mature TGF-β1 regions of latent TGF-β1 polypeptides were extracted using commercially available epitope prediction software Epitope Hunter. .. A peptide consisting of the extracted sequences was synthesized using a peptide sequencer. These peptides were linked to carriers to obtain immunogens.
2) 免疫感作
こうして得られた免疫原を等容の完全フロイントアジュバント（CFA）又は不完全フロイントアジュバント（IFA）で乳化し、マウスに腹腔内注射した。その後、ブースター注射を行い、マウスを屠殺した。
2) Immunosensitization The immunogen thus obtained was emulsified with isovolumic complete Freund's adjuvant (CFA) or incomplete Freund's adjuvant (IFA) and injected intraperitoneally into mice. Then, booster injection was performed and the mice were sacrificed.
3) 細胞融合、クローニング及びアッセイ
血清の間接ELISAにより高力価を有していた免疫マウスの脾臓由来のリンパ球を、ポリエチレングリコールを用いてマウスミエローマ細胞と融合させた。融合細胞を96-ウェル組織培養プレートに播種し、ハイブリドーマ培地を添加することによりハイブリドーマ（64クローン）を選択した。間接ELISAテストを用いてスクリーニングを実施した。各ハイブリドーマからの培養上清を、BSAを含むブロッキング溶液で前処理した抗原ペプチドもしくはTGF-β1でコーティングしたスクリーニングプレートに添加した。ハイブリドーマの培養上清を室温にて該プレート中でインキュベートした。プレートをPBSで洗浄後、1:1500希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）をコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgGを各ウェルに添加し、インキュベートした。最後の洗浄後、発色基質（OPD system）をプレートに添加して5分間発色させ、450nmでの吸光度を測定した。64クローンすべてが抗原ペプチドでコーティングした間接ELISAに対して陽性であった。それらのうち、11クローンがTGF-β1でコーティングした間接ELISAに対して陽性であった。
次に、抗原ペプチド及びTGF-β1タンパク質陽性の抗体を産生するハイブリドーマをウェスタンブロット（WB）解析に供した。TGF-β1を過剰発現する細胞又は組織の溶解液をSDS-ポリアクリルアミドゲル上にロードし、5倍希釈したハイブリドーマ上清と反応させ、免疫反応性をHRPをコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgGを用いて可視化した。11クローン中10クローンが細胞及び組織溶解液の両方に対して陽性であった。
さらに、HepG2細胞に対する免疫蛍光（IF）アッセイを行った。10クローンのうち6クローンがHepG2のIFにおいて強い陽性シグナルを示した。それらのうち、4クローン (2H4, 4D10, 6F12及び7F10) をより詳細な解析に使用した。
モノクローナル抗体のアイソタイプをマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキットを用いて解析した。2H4, 4D10, 6F12及び7F10抗体は、IgG1アイソタイプに属した。
同様にして、抗潜在型TGF-β1/LAPモノクローナル抗体クローン（2F10）をLAPタンパク質由来の抗原ペプチドで免疫したマウスにより得た。
3) Cell fusion, cloning and assay Lymphocytes derived from the spleen of immune mice, which had high titers by indirect ELISA of serum, were fused with mouse myeloma cells using polyethylene glycol. Hybridomas (64 clones) were selected by seeding the fused cells in 96-well tissue culture plates and adding hybridoma medium. Screening was performed using an indirect ELISA test. Culture supernatants from each hybridoma were added to a screening plate coated with antigen peptide or TGF-β1 pretreated with a blocking solution containing BSA. The hybridoma culture supernatant was incubated in the plate at room temperature. After washing the plates with PBS, 1: 1500 diluted horseradish peroxidase (HRP) -conjugated goat anti-mouse IgG was added to each well and incubated. After the final wash, a color-developing substrate (OPD system) was added to the plate to develop color for 5 minutes and the absorbance at 450 nm was measured. All 64 clones were positive for indirect ELISA coated with antigenic peptide. Of these, 11 clones were positive for TGF-β1-coated indirect ELISA.
Hybridomas producing antigenic peptides and TGF-β1 protein-positive antibodies were then subjected to Western blot (WB) analysis. A cell or tissue lysate overexpressing TGF-β1 was loaded onto an SDS-polyacrylamide gel, reacted with a 5-fold diluted hybridoma supernatant, and immunoreactive using HRP-conjugated goat anti-mouse IgG. Visualized. Of the 11 clones, 10 clones were positive for both cell and tissue lysates.
In addition, an immunofluorescence (IF) assay on HepG2 cells was performed. Six of the 10 clones showed a strong positive signal in the IF of HepG2. Of them, 4 clones (2H4, 4D10, 6F12 and 7F10) were used for more detailed analysis.
Monoclonal antibody isotypes were analyzed using a mouse monoclonal antibody isotyping kit. The 2H4, 4D10, 6F12 and 7F10 antibodies belonged to the IgG1 isotype.
Similarly, anti-latent TGF-β1 / LAP monoclonal antibody clones (2F10) were obtained from mice immunized with an antigenic peptide derived from the LAP protein.
4) 免疫組織化学
がん組織アレイ（6つのHCCクローン、6つの胆管がんクローン、6つの肺腺がんクローン、6つのRCCクローン、5つの乳がんクローン、6つの卵巣がんクローン、2つの頸部がんクローン、5つの大腸がん、5つの胃がんクローン及び3つの膵がんクローンを含む）に対して、2H4, 4D10, 6F12及び7F10抗体を用いて免疫組織化学（IHC）を行った。代表的な染色像を図１〜７に示す。染色度を、各組織サンプルについての観察により定義される指標に従ってスコア化し（0、1、2又は3）、平均レベルを算出した。表１に示すとおり、4つの抗活性型TGF-β1抗体クローンすべてが、種々のがん組織に対して強いIHCシグナルを示した。
4) Immunohistochemical Cancer Tissue Array (6 HCC clones, 6 cholangiocarcinoma clones, 6 lung adenocarcinoma clones, 6 RCC clones, 5 breast cancer clones, 6 ovarian cancer clones, 2 necks Immunohistochemistry (IHC) was performed on partial cancer clones (including 5 colon cancers, 5 gastric cancer clones and 3 pancreatic cancer clones) using 2H4, 4D10, 6F12 and 7F10 antibodies. Representative stained images are shown in FIGS. 1 to 7. Staining was scored (0, 1, 2 or 3) according to the indicators defined by observation for each tissue sample and average levels were calculated. As shown in Table 1, all four anti-active TGF-β1 antibody clones showed strong IHC signals against various cancer tissues.
同様にして、2F10抗体を用いて種々のがん組織及びTGF-β1―Tgマウス肺のIHC染色を行った。結果を図８及び９に示す。抗潜在型TGF-β1/LAP抗体2F10は、種々のがん組織に対して強いIHCシグナルを示した（図８）。この抗体は、Tgマウス肺も強く染色したが、野生型マウス肺を染色しなかった（図９）。 Similarly, IHC staining of various cancer tissues and TGF-β1-Tg mouse lungs was performed using 2F10 antibody. The results are shown in FIGS. 8 and 9. The anti-latent TGF-β1 / LAP antibody 2F10 showed a strong IHC signal to various cancer tissues (Fig. 8). This antibody also strongly stained Tg mouse lungs, but did not stain wild-type mouse lungs (Fig. 9).
5. 重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列の決定
2H4及び2F10抗体を、それらを産生する各ハイブリドーマから精製し、重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を常法により決定した。その結果、これらの抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下に示すとおりであった。
[2H4重鎖可変領域]
EVKLQQSGTV LARPGTSVKM SCKASGYTFS NYWMHWVKQR PGQGLEWIGA
IYPGNSDTRF NQKFKGKAKL TAVTSASTAY MDLSSLTDED SAVYYCTGYS
NYEAGAMDYW GQGTSVTVSS (配列番号７)
[2H4軽鎖可変領域]
DIVMTQSPSS LAVSSGEKVT MSCKSSQSLL NSRTRKNYLAWYQQKPGQSP
KLLIYWASTR ESGVPDRFTG SGSGTDFTLT ISGVQAEDLA VYYCQQSYHL
PTFGGGTKLE IKR (配列番号８)
[2F10重鎖可変領域]
EVQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYTFT DYYMNWVRQS HGKSLEWIGD
IIPNSGGTSY NQKFKGKATL TVDMSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCTTEA
MDYWGQGTSV TVSS (配列番号１５)
[2F10軽鎖可変領域]
DIVLTQSPAT LSVTPGDSVS LSCRASQSIR NKLHWYQQKS HESPRLLIKY
ASQSISRIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVET EDFGMYFCLQ SNSWPLTFGS
GTKLEIKR
5. Determination of amino acid sequences for heavy and light chain variable regions
2H4 and 2F10 antibodies were purified from each hybridoma producing them and the amino acid sequences of the heavy and light chain variable regions were determined by conventional methods. As a result, the amino acid sequences of the heavy chain and light chain variable regions of these antibodies were as shown below.
[2H4 heavy chain variable region]
EVKLQQSGTV LARPGTSVKM SCKASGYTFS NYWMHWVKQR PGQGLEWIGA
IYPGNSDTRF NQKFKGKAKL TAVTSASTAY MDLSSLTDED SAVYYCTGYS
NYEAGAMDYW GQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 7)
[2H4 light chain variable region]
DIVMTQSPSS LAVSSGEKVT MSCKSSQSLL NSRTRKNYLAWYQQKPGQSP
KLLIYWASTR ESGVPDRFTG SGSGTDFTLT ISGVQAEDLA VYYCQQSYHL
PTFGGGTKLE IKR (SEQ ID NO: 8)
[2F10 heavy chain variable region]
EVQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYTFT DYYMNWVRQS HGKSLEWIGD
IIPNSGGTSY NQKFKGKATL TVDMSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCTTEA
MDYWGQGTSV TVSS (SEQ ID NO: 15)
[2F10 light chain variable region]
DIVLTQSPAT LSVTPGDSVS LSCRASQSIR NKLHWYQQKS HESPRLLIKY
ASQSISRIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVET EDFGMYFCLQ SNSWPLTFGS
GTKLEIKR
6. CDRの決定
公共で利用可能なCDR予測ソフトウェア (http://www.abysis.org/; 及びhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/igblast.cgi) を用い, ２H4 及び２F10抗体の重鎖及び軽鎖のCDRを決定した。配列番号７、８、１５及び１６の各々において、四角で囲んだ配列が、N末端からこの順でCDR1、CDR2及びCDR3である。
6. CDR determination Using publicly available CDR prediction software (http://www.abysis.org/; and https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/igblast.cgi), 2H4 And the CDRs of the heavy and light chains of the 2F10 antibody were determined. In each of SEQ ID NOs: 7, 8, 15 and 16, the sequences enclosed in squares are CDR1, CDR2 and CDR3 in this order from the N-terminus.
7. 可能性のあるオフターゲットタンパク質との交差反応性
上で得られた抗体のTGF-β1に対する抗原特異性を確認するために、これらの抗体により認識されるエピトープ配列から予測される、可能性のあるオフターゲットタンパク質と、これらの抗体との交差反応性を調べた。結合アッセイにより、これらの抗体は、試験したいずれのオフターゲットタンパク質とも結合しなかった。
7. Possibility predicted from the epitope sequences recognized by these antibodies to confirm the antigen specificity of the antibodies obtained on TGF-β1 cross-reactivity with possible off-target proteins . The cross-reactivity of certain off-target proteins with these antibodies was investigated. By binding assay, these antibodies did not bind to any of the off-target proteins tested.
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
Although the present invention has been described with emphasis on preferred embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that preferred embodiments can be modified. The present invention is intended that the invention may be practiced in ways other than those described in detail herein. Accordingly, the present invention includes all modifications contained within the spirit and scope of the appended claims.
The contents of all publications, including the patents and patent application specifications mentioned herein, are incorporated herein by reference in their entirety to the same extent as expressly stated. ..
本発明の抗体は、組織標本や体液等の生物学的サンプル中の活性型TGF-β1又は潜在型TGF-β/LAPのいずれかのみを検出するのに非常に有用である。 The antibodies of the present invention are very useful for detecting either active TGF-β1 or latent TGF-β / LAP in biological samples such as tissue specimens and body fluids.
Claims (10)
(a) 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c) 配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d) 配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e) 配列番号５で表されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f) 配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むCDR
を含む、抗体。 The first monoclonal antibody that binds to active TGF-β1 but not latent TGF-β1.
(a) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(b) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
(c) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
(d) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4,
(e) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 and
(f) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6
Including antibodies.
(2) 配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の抗体。 (1) Heavy chain variable region containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and
(2) The antibody according to claim 1, which comprises a light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8.
(a) 配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b) 配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c) 配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d) 配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e) 配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f) 配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むCDR
を含む、抗体。 The first monoclonal antibody that binds to latent TGF-β1 or LAP but not active TGF-β1.
(a) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
(b) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
(c) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11
(d) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12
(e) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 and
(f) CDR containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14.
Including antibodies.
(2) 配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項６に記載の抗体。 (1) A heavy chain variable region containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 and
(2) The antibody according to claim 6, which comprises a light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16.
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2018
- 2018-06-19 WO PCT/JP2018/023920 patent/WO2018235964A1/en active Application Filing
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| Publication number | Publication date |
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| WO2018235964A1 (en) | 2018-12-27 |
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