JP2020180834A - Tomato yellow leaf curl virus (tylcv) immunology diagnosis method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法に関する。より詳細には、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法に用いるイムノクロマトグラフィー用抗体混合物、検体からトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を抽出するための抽出液等に関するものである。 The present invention relates to a method for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). More specifically, it relates to an antibody mixture for immunochromatography used in the tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) detection method, an extract for extracting the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) from a sample, and the like. is there.
植物病原体は、昆虫、接触、土壌あるいは接ぎ木などを介して広く植物間に伝搬し増殖する。トマト黄化葉巻病は、ウイルスが原因の病気で、トマトなどによく発生する。
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染した植物を吸汁したタバココナジラミは、体内にウイルスを取り込み、他の株を吸汁した際にウイルスを次々に感染させる。トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染すると株の上部の成長点付近の新葉が端部から黄淡色に変色し、やがて葉がカールしたように巻いた状態になる。
黄化葉巻病は、ウイルス病であり、感染すると薬剤による治療が出来ない病気である。黄化葉巻病を放置しておくと、発病した部分から先の成長が悪くなって実がならなくなるとともに、伝染源として本病を周囲に広げる恐れがある。黄化葉巻病に発病してからだと防除する方法がないため、感染しないように早期に予防対策を行なうことが重要である。
植物病原体を高感度に検出する方法としては、植物試料から、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）やＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）等のキットを用いて遺伝子を抽出し、抽出した核酸濃度を測定し、適量を用いて遺伝子検査法（ＰＣＲ）で判定することが行われている。
例えば特許文献１には、トマト黄化葉巻病の早期診断のために、その病原ウイルスであるトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）を高感度に検出させる方法として、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の塩基配列から設計された任意の塩基配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅法を開示しており、核酸増幅に検出によりトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）感染の有無を検討できること検出のためのキットなどが開示されている。しかしながら核酸増幅法を用いた検査方法、ＥＬＩＳＡ法による検査方法は、抽出操作や測定操作に機器が必要であり、測定機器を設置する施設が必要である。
植物病原体のより簡便な検出方法として、抗体を用いた免疫学的検出方法が考えられるが、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）が分類されるジェミニウイルスに対するポリクローナル抗体は一般に力価、特異性共に低いとされ、免疫学的検出方法による高感度な検出は難しいとされてきた。非特許文献１には、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の血清学的手法による検出技術を確立するために、大腸菌内で組換え発現させたウイルスのコートタンパク質（ＣＰ）を抗原としてウサギを免疫し作製した抗血清から精製した抗ＴＹＬＣＶ−ＣＰ抗体を用いてＥＬＩＳＡ法で検討したところ、純化ウイルス及びＴＹＬＣＶ罹病トマト葉磨砕液に対し特異的な陽性反応が認められたことが開示されている。
しかしながら、ＥＬＩＳＡ法による検査方法についても測定操作に機器が必要であり、測定機器を設置する施設が必要である。
よって従前の方法では植物を生産している現場（農場等）で検査することは難しく、植物を生産している現場での検査を簡便に行なうことが可能な方法としてイムノクロマトグラフィーによる検出方法が求められていた。このような検出方法として非特許文献２には迅速免疫濾紙検定法（ｒａｐｉｄ ｉｍｍｕｎｏｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ ａｓｓａｙ、以下ＲＩＰＡと称する）によるトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）感染の診断が開示されている。ＲＩＰＡの試験デバイスはガラスファイバーに抗体が固定されている単純な構造であり製造が容易ではあるものの、測定試料中の夾雑物等がそのまま展開し非特異的反応が起こりやすくなる、また夾雑物による目詰まりが発生しやすいという問題があった。また目詰まりを防ぐために測定試料を希釈する必要があること、また測定試料に標識抗体を添加してから展開するために測定試料が希釈されてしまうことなどから測定試料中のウイルス濃度が低いと測定できないという問題があった。
Plant pathogens propagate widely between plants through insects, contacts, soil or grafts and propagate. Tomato yellow leaf curl disease is a disease caused by a virus and often occurs in tomatoes.
Bemisia tabaci, which sucks plants infected with tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), takes up the virus in the body and infects the virus one after another when sucking other strains. When infected with tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), the new leaves near the growth point at the top of the plant turn yellowish from the end, and eventually the leaves become curled.
Yellow leaf curl disease is a viral disease that cannot be treated with drugs once infected. If yellow cigar disease is left untreated, the growth of the diseased part will deteriorate and the fruit will not grow, and the disease may spread to the surroundings as a source of transmission. Since there is no way to control yellow cigar disease after it develops, it is important to take preventive measures at an early stage to prevent infection.
As a method for detecting a phytopathogen with high sensitivity, a gene is extracted from a plant sample using a kit such as RNeasy Plant Mini Kit (manufactured by Qiagen) or DNeasy Plant Mini Kit (manufactured by Qiagen), and the extracted nucleic acid concentration is obtained. Is measured, and an appropriate amount is used for determination by a genetic test method (PCR).
For example, Patent Document 1 describes tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) as a method for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), which is a pathogenic virus, with high sensitivity for early diagnosis of tomato yellow leaf curl disease. We have disclosed a nucleic acid amplification method using an oligonucleotide primer that specifically hybridizes with an arbitrary base sequence designed from the base sequence, and examined the presence or absence of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) infection by detecting nucleic acid amplification. A kit for detecting what can be done is disclosed. However, the inspection method using the nucleic acid amplification method and the inspection method by the ELISA method require equipment for the extraction operation and the measurement operation, and a facility for installing the measurement equipment is required.
An immunological detection method using an antibody can be considered as a simpler detection method for phytopathogens, but polyclonal antibodies against geminivirus in which tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) is classified generally have low titer and specificity. It has been said that highly sensitive detection by immunological detection methods is difficult. In Non-Patent Document 1, rabbits are immunized using the coat protein (CP) of the virus recombinantly expressed in Escherichia coli as an antigen in order to establish a detection technique for tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) by a serological method. It is disclosed that a specific positive reaction was observed for the purified virus and the TYLCV-affected tomato yellow leaf curl solution when examined by the ELISA method using the anti-TYLCV-CP antibody purified from the anti-sera prepared.
However, the inspection method by the ELISA method also requires equipment for the measurement operation, and a facility for installing the measurement equipment is required.
Therefore, it is difficult to inspect at the site where plants are produced (farm, etc.) by the conventional method, and a detection method by immunochromatography is required as a method that can easily perform the inspection at the site where plants are produced. Was being done. As such a detection method, Non-Patent Document 2 discloses a diagnosis of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) infection by a rapid immunofilter paper assay (hereinafter referred to as RIPA). Although the RIPA test device has a simple structure in which an antibody is immobilized on a glass fiber and is easy to manufacture, impurities in the measurement sample develop as they are and non-specific reactions are likely to occur, and it depends on the impurities. There was a problem that clogging was likely to occur. In addition, if the virus concentration in the measurement sample is low, it is necessary to dilute the measurement sample to prevent clogging, and the measurement sample is diluted to develop after adding the labeled antibody to the measurement sample. There was a problem that it could not be measured.
植物を生産している現場で簡便にトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）を検査する方法を提供する。また本発明は、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に対する抗体を用いて免疫反応を行うイムノクロマトグラフィーを用いた検出方法において、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）を高感度に検出する方法を提供することを課題とする。 Provided is a method for easily inspecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) at a plant-producing site. Further, the present invention detects tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) with high sensitivity in a detection method using immunochromatography in which an immune reaction is carried out using an antibody against the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). The challenge is to provide a way to do this.
本発明者らは、検体から、クエン酸ナトリウム緩衝液中に界面活性剤を含む抽出液を使用して抽出したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物を用いたイムノクロマトグラフィーで検出することを特徴とする、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法であって、前記界面活性剤が、エステルエーテル型非イオン界面活性剤及び硫酸エステル塩のアニオン界面活性剤からなる群から選択される、前記トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法によって、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）を高感度に検出することが出来ることを見いだし、本発明を完成するに至った。 The present inventors used a tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) coat protein (CP) extracted from a sample using an extract containing a surfactant in a sodium citrate buffer to obtain tomato yellow leaf curl virus. A method for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), which comprises detecting by immunochromatography using an antibody mixture that binds to a coat protein (CP) of (TYLCV), wherein the surfactant is an ester ether. Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) is detected with high sensitivity by the tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) detection method selected from the group consisting of type nonionic surfactants and anionic surfactants of sulfate ester salts. We found that we could do it, and completed the present invention.
すなわち本発明は以下の通りである。
［１］検体から、クエン酸ナトリウム緩衝液中に界面活性剤を含む抽出液を使用して抽出したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物を用いたイムノクロマトグラフィーで検出することを特徴とする、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法であって、前記界面活性剤が、エステルエーテル型非イオン界面活性剤及び硫酸エステル塩のアニオン界面活性剤からなる群から選択される、前記トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法。
［２］前記［１］に記載のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法に用いるイムノクロマトグラフィー用である、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物。
［３］配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号４に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号５に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体及び配列番号６に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体からなる群から選択される１種以上の抗体を含む、前記［２］に記載の抗体混合物。
［４］配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号４に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号５に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体又は配列番号６に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体を含む、前記［２］又は［３］に記載の抗体混合物。
［５］検体から少なくともトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を含む成分を抽出するための抽出液であって、クエン酸ナトリウム緩衝液中に界面活性剤を含み、前記界面活性剤が、エステルエーテル型非イオン界面活性剤及び硫酸エステル塩のアニオン界面活性剤からなる群から選択される、前記抽出液。
［６］前記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＣＡＳ登録番号９００５−６４−５：Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）からなる群から選択される、前記［５］に記載の抽出液。
［７］前記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＣＡＳ登録番号９００５−６４−５：Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））であり、その濃度が０．０１５〜１．５（ｗ／ｖ）％である、前記［６］に記載の抽出液。
［８］前記界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり、その濃度が０．００２〜０．１５（ｗ／ｖ）％である、前記［５］に記載の抽出液。
［９］クエン酸ナトリウムの濃度が７.５〜１５０ｍＭである、前記［５］〜［８］のいずれか１項に記載の抽出液。
［１０］前記［５］〜［９］のいずれか１項に記載の抽出液を使用することを特徴とする、検体から少なくともトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を含む成分を抽出する方法。
［１１］前記［２］〜［４］のいずれか１項に記載のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物と前記［５］〜［９］のいずれか１項に記載の抽出液とを含むことを特徴とする、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用キット。
［１２］トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する第１抗体混合物、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する第２抗体混合物、及び膜担体を備え、
前記第１抗体混合物が前記膜担体に固定化されて検出部を構成し、
前記第２抗体混合物は標識物質で標識されており、且つ前記検出部から離れた位置に保持されている、イムノクロマトグラフィー試験デバイス。
［１３］前記第１抗体混合物及び第２抗体混合物が、配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号４に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号５に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体及び配列番号６に記載のアミノ酸配列及びその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体からなる群から選択される１種以上の抗体を含む、前記［１２］に記載のイムノクロマトグラフィー試験デバイス。
［１４］前記第１抗体混合物及び前記第２抗体混合物が、配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号４に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、配列番号５に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体及び配列番号６に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体からなるポリペプチドに結合する抗体を含む、前記［１２］に記載のイムノクロマトグラフィー試験デバイス。
［１５］前記標識物質が金属コロイド粒子である、前記［１２］に記載のイムノクロマトグラフィー試験デバイス。
［１６］前記金属コロイド粒子が金コロイド粒子である、前記［１５］に記載のイムノクロマトグラフィー試験デバイス。
That is, the present invention is as follows.
[1] The coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) extracted from a sample using an extract containing a surfactant in a sodium citrate buffer was added to tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). A method for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), which comprises detecting by immunochromatography using an antibody mixture that binds to the coat protein (CP) of the above, wherein the surfactant is an ester ether type nonionic. The tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) detection method selected from the group consisting of surfactants and anionic surfactants of sulfate ester salts.
[2] An antibody mixture that binds to a coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) for immunochromatography used in the method for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) according to the above [1].
[3] An antibody that binds to a polypeptide consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, and 95% or more with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or a sequence thereof. An antibody that binds to a polypeptide consisting of an amino acid sequence having the same identity, an antibody that binds to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or an antibody consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the sequence, and SEQ ID NO: 5. From an antibody that binds to a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the described amino acid sequence or its sequence and an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or its sequence. The antibody mixture according to the above [2], which comprises one or more kinds of amino acids selected from the group consisting of amino acids that bind to an amino acid.
[4] An antibody that binds to a polypeptide consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, and 95% or more with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or a sequence thereof. An antibody that binds to a polypeptide consisting of an amino acid sequence having the same identity, an antibody that binds to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or an antibody consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the sequence, and SEQ ID NO: 5. From an antibody that binds to a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the described amino acid sequence or its sequence, or from an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or its sequence. The antibody mixture according to [2] or [3] above, which comprises an amino acid that binds to the polypeptide.
[5] An extract for extracting at least a component containing a coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) from a sample, wherein a surfactant is contained in a sodium citrate buffer, and the surfactant is said. The extract, wherein the agent is selected from the group consisting of ester ether type nonionic surfactants and sulfate ester salt anionic surfactants.
[6] The surfactant is selected from the group consisting of polyoxyethylene sorbitan monolaurate (CAS Registry Number 9005-64-5: Tween 20®) and sodium dodecyl sulfate (SDS), said [5]. The extract according to.
[7] The surfactant is polyoxyethylene sorbitan monolaurate (CAS Registry Number 9005-64-5: Tween 20 (registered trademark)), and its concentration is 0.015 to 1.5 (w / v)%. The extract according to the above [6].
[8] The extract according to the above [5], wherein the surfactant is sodium dodecyl sulfate (SDS) and the concentration thereof is 0.002 to 0.15 (w / v)%.
[9] The extract according to any one of [5] to [8] above, wherein the concentration of sodium citrate is 7.5 to 150 mM.
[10] A component containing at least a coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) from a sample, which comprises using the extract according to any one of the above [5] to [9]. How to extract.
[11] The antibody mixture that binds to the coat protein (CP) of the tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) according to any one of the above [2] to [4] and any of the above [5] to [9]. A kit for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), which comprises the extract according to item 1.
[12] A first antibody mixture that binds to the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), a second antibody mixture that binds to the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), and a membrane carrier. With
The first antibody mixture is immobilized on the membrane carrier to form a detection unit.
An immunochromatography test device in which the second antibody mixture is labeled with a labeling substance and is held at a position away from the detection unit.
[13] In SEQ ID NO: 3, the first antibody mixture and the second antibody mixture bind to an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence thereof. From an antibody that binds to a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence described or its sequence, or from an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or its sequence. The antibody that binds to the polypeptide, the amino acid sequence that binds to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, or the amino acid sequence that binds to the polypeptide consisting of an amino acid sequence that has 95% or more identity with the sequence thereof, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and its sequence. The immunochromatography test device according to the above [12], which comprises one or more antibodies selected from the group consisting of antibodies that bind to a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity.
[14] An antibody in which the first antibody mixture and the second antibody mixture bind to an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence thereof, SEQ ID NO: 3. An amino acid sequence that binds to a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence shown in the above, or an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or the sequence thereof. An antibody that binds to a polypeptide consisting of, an amino acid sequence that binds to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, or an amino acid sequence that binds to a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the sequence thereof, and an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or the amino acid sequence thereof. The immunochromatographic test device according to the above [12], which comprises an antibody that binds to a polypeptide consisting of an antibody that binds to a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the sequence.
[15] The immunochromatographic test device according to the above [12], wherein the labeling substance is a metal colloidal particle.
[16] The immunochromatographic test device according to the above [15], wherein the metal colloidal particles are gold colloidal particles.
本発明の方法により、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）を高感度に検出する方法及びイムノクロマトキットを提供することができる。
また本発明の抽出液によれば抽出液によりトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の高感度抽出が可能である。
According to the method of the present invention, it is possible to provide a method for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) with high sensitivity and an immunochromatographic kit.
Further, according to the extract of the present invention, highly sensitive extraction of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) is possible with the extract.
本発明は、検体からクエン酸ナトリウム緩衝液中に界面活性剤を含む抽出液を使用して抽出したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物を用いたイムノクロマトグラフィーで検出することを特徴とする、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法であって、前記界面活性剤が、エステルエーテル型非イオン界面活性剤及び硫酸エステル塩のアニオン界面活性剤からなる群から選択される、前記トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法に関する。 In the present invention, the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) extracted from a sample using an extract containing a surfactant in a sodium citrate buffer is used as a tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). A method for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), which comprises detecting by immunochromatography using an antibody mixture that binds to the coat protein (CP) of the above, wherein the surfactant is an ester ether type nonionic. The present invention relates to the method for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), which is selected from the group consisting of surfactants and anionic surfactants of sulfate ester salts.
[トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）]
植物ウイルスは、基本的に遺伝子本体である核酸成分と、その周りを取り囲んで核酸を保護するタンパク質のみから構成されている。植物ウイルスに含まれる核酸成分は、ウイルス種によって決まっており、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）はＤＮＡを持つウイルスで、ベゴモウイルス属ジェミニウイルス科に属する。このウイルスの形は、双子のように２個結合した球形ウイルスである。
植物ウイルスは、自らが増殖できる植物に感染すると、ウイルス核酸を自分のタンパク質合成のための鋳型にさせ、植物に優先的にウイルスに必要なウイルスタンパク質、特にコートタンパク質（ＣＰ）を大量に合成させる。一方で、植物に合成させたウイルス複製酵素によってウイルス核酸を次々と作らせる。こうして感染植物体内で複製されたウイルス核酸とコートタンパク質（ＣＰ）が、植物細胞内で集合してウイルス粒子が形成される。
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）は分子量３０ｋＤａの外被タンパク質である。このコートタンパク質（ＣＰ）遺伝子の働きは、内部の特に複製酵素遺伝子核酸を外界から守るばかりでなく、種々の機能を担っており、病徴決定機能、遠距離以降機能、非伝播機能などをあわせ持っている。また、植物ウイルスの大きな特徴としてコートタンパク質（ＣＰ）は１種類だけである。
[Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) coat protein (CP)]
A plant virus is basically composed only of a nucleic acid component, which is the main body of a gene, and a protein that surrounds and protects the nucleic acid. The nucleic acid component contained in the plant virus is determined by the virus species, and tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) is a virus having DNA and belongs to the genus Begomovirus, Geminiviridae. The form of this virus is a spherical virus in which two are bound like twins.
When a plant virus infects a plant in which it can grow, it uses the viral nucleic acid as a template for its own protein synthesis, causing the plant to preferentially synthesize a large amount of viral protein, especially coat protein (CP), which is necessary for the virus. .. On the other hand, viral nucleic acids are produced one after another by a viral replication enzyme synthesized in a plant. In this way, the viral nucleic acid and the coat protein (CP) replicated in the infected plant aggregate in the plant cell to form virus particles.
The coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) is a coat protein having a molecular weight of 30 kDa. The function of this coat protein (CP) gene not only protects the internal replication enzyme gene nucleic acid from the outside world, but also has various functions, including a symptom determination function, a long-distance post-distance function, and a non-propagation function. have. Moreover, as a major feature of plant viruses, there is only one type of coat protein (CP).
[トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物]
本発明のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物は、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体を含む抗体混合物であり、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出法に用いるイムノクロマトグラフィー用である。
[Antibody mixture that binds to the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV)]
The antibody mixture that binds to the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) of the present invention is an antibody mixture containing an antibody that binds to the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), and is a tomato. It is for immunochromatography used in the method for detecting yellow leaf curl virus (TYLCV).
本発明のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物は、好ましくは、（i）配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、(ii)配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、(iii)配列番号４に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、(iv)配列番号５に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体及び(v)配列番号６に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体からなる群から選択される１種以上の抗体を含む。 The antibody mixture that binds to the coat protein (CP) of the tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) of the present invention preferably has 95% or more identity with the amino acid sequence shown in (i) SEQ ID NO: 2 or a sequence thereof. An antibody that binds to a polypeptide consisting of an amino acid sequence, (ii) an antibody that binds to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence thereof, (iii) SEQ ID NO: An antibody that binds to a polypeptide consisting of an amino acid sequence set forth in 4 or an amino acid sequence having 95% or more identity with that sequence, and (iv) 95% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or its sequence. From the group consisting of an antibody that binds to a polypeptide consisting of an amino acid sequence having (v) an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or an antibody that binds to a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence thereof. Contains one or more selected antibodies.
本発明の抗体混合物は、より好ましくは、上記（i）〜（v）のうち４種を含み、さらに好ましくは（i）配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、(ii)配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、(iv)配列番号５に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体及び(v)配列番号６に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体を含むか又は、(i)配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、(ii)配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、(iii)配列番号４に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体及び(iv)配列番号５に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体を含む。 The antibody mixture of the present invention more preferably contains 4 of the above (i) to (v), and more preferably (i) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 95% or more identity with the amino acid sequence thereof. An antibody that binds to a polypeptide consisting of an amino acid sequence having (ii) an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or an antibody that binds to a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence thereof, (iv). An antibody that binds to a polypeptide consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and (v) 95% or more of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or a sequence thereof. It contains an antibody that binds to a polypeptide consisting of an amino acid sequence having the same identity, or (i) binds to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence thereof. An antibody that binds to a polypeptide consisting of (ii) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence thereof, (iii) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or the amino acid sequence thereof. An antibody that binds to a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the sequence and (iv) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or an amino acid sequence having 95% or more identity with the sequence. Contains an antibody that binds to.
本発明の抗体混合物は、なお好ましくは、上記（i）〜（v）のすべてを含む、すなわち、（i）配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、(ii)配列番号３に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、(iii)配列番号４に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、(iv)配列番号５に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体及び(v)配列番号６に記載のアミノ酸配列又はその配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体を含む。 The antibody mixture of the present invention still preferably contains all of the above (i) to (v), that is, (i) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or an amino acid having 95% or more identity with the amino acid sequence thereof. An antibody that binds to a polypeptide consisting of a sequence, (ii) an antibody that binds to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence thereof, (iii) SEQ ID NO: 4 An antibody that binds to a polypeptide consisting of an amino acid sequence or an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence shown in (iv) 95% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or its sequence. Includes an antibody that binds to a polypeptide consisting of an amino acid sequence having, and (v) an antibody that binds to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence thereof.
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、例えば、トマト黄化葉巻ウイルス体から抽出したコートタンパク質（ＣＰ）、またはクローニングされたコートタンパク質（ＣＰ）の遺伝子を大腸菌などの宿主で遺伝子工学的に発現させて抽出精製した組換えコートタンパク質（ＣＰ）、又はコートタンパク質（ＣＰ）の一部を構成するペプチドを免疫用抗原として、常法に従って得ることができる。
ポリクローナル抗体の場合は、前記免疫用抗原でウサギやマウスなどの動物を免疫した抗血清から得ることができる。モノクローナル抗体の場合は、マウスなどに免疫した後、この免疫された動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合して得られた融合細胞をＨＡＴ含有培地で選択した後に増殖させて、コートタンパク質（ＣＰ）を利用して、例えば、抗コートタンパク質（ＣＰ）抗体産生株をスクリーニングすることにより得ることができる。
The antibody that binds to the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, for example, a coat protein (CP) extracted from the tomato yellow leaf roll virus body, or cloned. A recombinant coat protein (CP) extracted and purified by genetically engineering expression of the coat protein (CP) gene in a host such as Escherichia coli, or a peptide constituting a part of the coat protein (CP) is used as an immunogen. , Can be obtained according to the conventional method.
In the case of a polyclonal antibody, it can be obtained from an antiserum that immunizes an animal such as a rabbit or a mouse with the immunogen. In the case of a monoclonal antibody, after immunizing a mouse or the like, fusion cells obtained by cell fusion of the spleen cells and myeloma cells of the immunized animal are selected in a HAT-containing medium and then proliferated to obtain a coat protein (coat protein). It can be obtained, for example, by screening an anti-coated protein (CP) antibody-producing strain using CP).
本発明の抗体混合物は、１種以上のモノクローナル抗体及び/又は１種以上のポリクローナル抗体の混合物として調製することもできる。 The antibody mixture of the present invention can also be prepared as a mixture of one or more monoclonal antibodies and / or one or more polyclonal antibodies.
本発明のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体には、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体フラグメントおよび改変抗体も含まれる。抗体フラグメントとしてはＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ｓｃＦｖフラグメントなどが挙げられる。 The antibody that binds to the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) of the present invention also includes an antibody fragment and a modified antibody that bind to the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). Examples of the antibody fragment include Fab fragment, F (ab') 2 fragment, Fab'fragment, scFv fragment and the like.
本発明の抗体混合物は、必要に応じて標識化される。標識化は常法により行うことができる。標識化に利用する標識物質としては金属コロイド粒子（金、銀、銅、鉄、白金、パラジウム、これらの混合物（例えば、金と白金の混合物、金と銀の混合物、パラジウムと白金の混合物）のコロイド粒子）等の有色粒子が挙げられる。金属コロイド粒子の中でも、利用し易い等の理由から、金コロイド粒子が好ましい。 The antibody mixture of the present invention is labeled as needed. Labeling can be performed by a conventional method. Labeling substances used for labeling include metal colloidal particles (gold, silver, copper, iron, platinum, palladium, and mixtures thereof (for example, a mixture of gold and platinum, a mixture of gold and silver, and a mixture of palladium and platinum). Colored particles such as colloidal particles) can be mentioned. Among the metal colloidal particles, gold colloidal particles are preferable because they are easy to use.
[検体]
本発明において「検体」とは、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の感染が疑われる植物体の一部、例えば葉、葉柄、茎、花、花弁等から採取した検体であって、被検出対象である別の植物病原体を含む植物体、或いは、植物病原体を含まない植物体を含む可能性がある検体をいう。
[Sample]
In the present invention, the "specimen" is a sample collected from a part of a plant suspected of being infected with tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), for example, leaves, petioles, stems, flowers, petals, etc., and is to be detected. Refers to a sample containing a plant containing another phytopathogen, or a plant containing no phytopathogen.
[抽出液]
本発明は、検体からトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を抽出するための抽出液であって、クエン酸ナトリウム緩衝液中に界面活性剤を含み、前記界面活性剤が、エステルエーテル型非イオン界面活性剤及び硫酸エステル塩のアニオン界面活性剤からなる群から選択される、前記抽出液に関する。
本発明において、抽出液とは、検体から植物病原体あるいは少なくともその一部を抽出する溶液をいう。本発明において「少なくともトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を含む成分を抽出する」とはコートタンパク質（ＣＰ）それ自体のみならずコートタンパク質（ＣＰ）を含むトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）あるいはコートタンパク質を含むトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の少なくともその一部を抽出することも含む。
本発明において、エステルエーテル型非イオン界面活性剤の例としてはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＣＡＳ登録番号９００５−６４−５：Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミタート（ＣＡＳ登録番号９００５−６６−７：Ｔｗｅｅｎ４０（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラート（ＣＡＳ登録番号９００５−６７−８：Ｔｗｅｅｎ６０（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ＣＡＳ登録番号９００５−６５−６：Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート（ＣＡＳ登録番号９００５−７０−３：Ｔｗｅｅｎ８５（登録商標））等が挙げられる。
本発明において、硫酸エステル塩のアニオン界面活性剤としてはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ヘキサデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、デシル硫酸ナトリウム等が挙げられる。
本発明の抽出液は好ましくはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＣＡＳ登録番号９００５−６４−５：Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）からなる群から選択される界面活性剤を含む。
本発明の抽出液は好ましくは界面活性剤として、０．０１５〜１．５（ｗ／ｖ）％、さらに好ましくは０．１５〜０．４（ｗ／ｖ）％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＣＡＳ登録番号９００５−６４−５：Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））を含む。また本発明の抽出液は界面活性剤として、０．００２〜０．１５（ｗ／ｖ）％、さらに好ましくは０．００７〜０．０１５（ｗ／ｖ）％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む。
なお本発明において界面活性剤は水に難溶性のタンパク質を可溶化し、検体から効率的に抽出するために抽出液に添加される。
また本発明の抽出液は好ましくは７.５〜１５０ｍＭ、さらに好ましくは１０〜１００ｍＭ、より好ましくは１０〜５０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。
本発明の抽出液には、その他の成分として塩類が含まれていても良く、そのような塩類としては、塩化ナトリウムなどのようにイオン強度の調整のために含まれるもののほか、水酸化ナトリウムなどのｐＨを調整する目的で添加するものも含まれる。
本発明の抽出液のｐＨは、ｐＨ６．５からｐＨ７．５が好ましく、ｐＨ７．０からｐＨ７．２がより好ましい。
[Extract]
The present invention is an extract for extracting the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) from a sample, wherein a surfactant is contained in a sodium citrate buffer, and the surfactant is used. The present invention relates to the extract selected from the group consisting of an ester ether type nonionic surfactant and an anionic surfactant of a sulfate ester salt.
In the present invention, the extract refers to a solution for extracting a plant pathogen or at least a part thereof from a sample. In the present invention, "extracting at least a component containing a coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV)" means tomato yellow leaf curl virus containing not only the coat protein (CP) itself but also the coat protein (CP). It also includes extracting at least a portion of (TYLCV) or tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) containing a coat protein.
In the present invention, examples of the ester ether type nonionic surfactant include polyoxyethylene sorbitan monolaurate (CAS registration number 9005-64-5: Tween 20 (registered trademark)) and polyoxyethylene sorbitan monopalmitate (CAS registration). Number 9005-66-7: Tween 40®, Polyoxyethylene sorbitan monosteert alert (CAS registration number 9005-67-8: Tween 60®), Polyoxyethylene sorbitan monooleate (CAS registration number 9005) -65-6: Tween 80 (registered trademark)), polyoxyethylene sorbitan trioleate (CAS registration number 9005-70-3: Tween 85 (registered trademark)) and the like.
In the present invention, examples of the anionic surfactant of the sulfate ester salt include sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium hexadecyl sulfate, lithium dodecyl sulfate, sodium decyl sulfate and the like.
The extract of the present invention preferably contains a surfactant selected from the group consisting of polyoxyethylene sorbitan monolaurate (CAS Registry Number 9005-64-5: Tween 20®) and sodium dodecyl sulfate (SDS). ..
The extract of the present invention preferably contains 0.015 to 1.5 (w / v)%, more preferably 0.15 to 0.4 (w / v)% of polyoxyethylene sorbitan monolaur as a surfactant. Includes rate (CAS Registry Number 9005-64-5: Ethylene20®). The extract of the present invention contains 0.002 to 0.15 (w / v)%, more preferably 0.007 to 0.015 (w / v)% of sodium dodecyl sulfate (SDS) as a surfactant. Including.
In the present invention, the surfactant is added to the extract in order to solubilize a poorly soluble protein in water and efficiently extract it from the sample.
The extract of the present invention preferably contains 7.5 to 150 mM, more preferably 10 to 100 mM, and more preferably 10 to 50 mM sodium citrate.
The extract of the present invention may contain salts as other components, and such salts include those contained for adjusting the ionic strength such as sodium chloride, sodium hydroxide and the like. Also included are those added for the purpose of adjusting the pH of.
The pH of the extract of the present invention is preferably pH 6.5 to pH 7.5, and more preferably pH 7.0 to pH 7.2.
[トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）抽出方法]
本発明は、前述の抽出液を使用することを特徴とする、検体からトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を抽出する方法を提供する。本発明において「少なくともトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を含む成分を抽出する」とはコートタンパク質（ＣＰ）それ自体のみならずコートタンパク質（ＣＰ）を含むトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）あるいはコートタンパク質を含むトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の少なくともその一部を抽出することも含む。
本発明の検体からトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を抽出する方法は、上記抽出液を使用することを特徴とする。本発明の検体からトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）を抽出する方法は、上記抽出液を使用すること以外は常法に従って行うことが出来、従来用いられている磨砕、粉砕、乳化、攪拌、振とう、又は煮沸法など適宜の方法を単独又は組み合わせて用いることができる。
例えば検体であるトマトの数枚の葉を凍結乾燥させ、粉末状にしたものに対して抽出液を添加し、磨砕することにより行うことが出来る。一般に植物サンプルの磨砕作業は、乳鉢が広く用いられてきたが、チューブとセットになったディスポーザブルホモジナイザー、ソフトチューブ内にスリット加工されている簡易磨砕容器、ナイロンメッシュを含むポリエチレン製袋等の容器に、抽出液を添加して砕くことによっても行うことができる。
[Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) extraction method]
The present invention provides a method for extracting a coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) from a sample, which comprises using the above-mentioned extract. In the present invention, "extracting at least a component containing a coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV)" means tomato yellow leaf curl virus containing not only the coat protein (CP) itself but also the coat protein (CP). It also includes extracting at least a portion of (TYLCV) or tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) containing a coat protein.
The method for extracting the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) from the sample of the present invention is characterized by using the above extract. The method for extracting the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) from the sample of the present invention can be carried out according to a conventional method except that the above extract is used. Appropriate methods such as pulverization, emulsification, stirring, shaking, or boiling can be used alone or in combination.
For example, it can be carried out by freeze-drying several leaves of a tomato sample, adding an extract to the powdered tomato, and grinding the leaves. In general, mortars have been widely used for grinding plant samples, but disposable homogenizers that come with tubes, simple grinding containers that have slits inside soft tubes, polyethylene bags containing nylon mesh, etc. This can also be done by adding an extract to the container and crushing it.
[トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用キット]
本発明はトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物と前述の抽出液とを含むことを特徴とする、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用キットに関する。
本発明のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用キットは、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物と上記抽出液を含むことを特徴とする。トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用キットに含まれる抗体混合物は１種又は複数であっても良い。本発明のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用キットにおいて抗体混合物は、支持体である固相に固定化された第１抗体混合物と標識物質で標識された第２抗体混合物として含まれることが好ましい。本発明の食物アレルゲン検出用キットにはその他、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）の標準品、検出用試薬、希釈用緩衝液などを含むことができる。
[Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) detection kit]
The present invention relates to a kit for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), which comprises an antibody mixture that binds to a coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) and the above-mentioned extract.
The kit for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) of the present invention is characterized by containing an antibody mixture that binds to a coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) and the above extract. The antibody mixture contained in the tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) detection kit may be one or more. In the kit for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) of the present invention, the antibody mixture may be contained as a first antibody mixture immobilized on a solid phase which is a support and a second antibody mixture labeled with a labeling substance. preferable. In addition, the food allergen detection kit of the present invention can include a standard product of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) coat protein (CP), a detection reagent, a dilution buffer, and the like.
[イムノクロマトグラフィー]
本発明のトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する抗体混合物を用い、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用の試験器具（イムノクロマトグラフィー試験デバイス）を構築することができる。即ち、本発明は、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する第１抗体混合物、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に結合する第２抗体混合物、及び膜担体を備え、前記第１抗体混合物が前記膜担体に固定化されて検出部を構成し、前記第２抗体混合物は標識物質で標識されており、且つ前記検出部から離れた位置に保持されている、イムノクロマトグラフィー試験デバイスに関する。
[Immunochromatography]
Using the antibody mixture that binds to the coat protein (CP) of the tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) of the present invention, a test device (immunochromatography test device) for detecting the tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) can be constructed. .. That is, the present invention relates to a first antibody mixture that binds to the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), and a second antibody mixture that binds to the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). And a membrane carrier, the first antibody mixture is immobilized on the membrane carrier to form a detection unit, the second antibody mixture is labeled with a labeling substance, and is held at a position away from the detection unit. Regarding immunochromatography test devices that have been used.
本発明のイムノクロマトグラフィー試験デバイスにおいて、「固定」とは、抗体が移動しないように膜等の担体に配置されることを意味する。「保持」とは、担体の中又は表面を移動可能に配置されることを意味する。以下、一例として図２及び図３（具体例であるテストストリップ）を参照して、試験デバイスの構成を説明する。第１抗体混合物は捕捉抗体であり、担体（Ｂ）に固定されて検出部（Ｂ１）を構成する。「検出部」とは、抗原抗体反応によって形成される、検体中の抗原と第２抗体混合物の複合体を捕捉し、抗原の存在を検出する部位をいう。 In the immunochromatographic test device of the present invention, "fixation" means that the antibody is placed on a carrier such as a membrane so as not to move. "Retention" means being movably disposed within or on the surface of a carrier. Hereinafter, the configuration of the test device will be described with reference to FIGS. 2 and 3 (a test strip as a specific example) as an example. The first antibody mixture is a capture antibody and is immobilized on the carrier (B) to form a detection unit (B1). The “detection unit” refers to a site formed by an antigen-antibody reaction that captures a complex of an antigen and a second antibody mixture in a sample and detects the presence of the antigen.
担体には、タンパク質を結合でき、且つ検体中の成分、抗原−第２抗体混合物の複合体などを展開できる材質のものが用いられる。好ましくは、担体は膜状（膜担体）である。膜担体の材質としてポリエチレン、ナイロン類、セルロース類を挙げることができる。より好ましくはニトロセルロース膜を使用する。担体上には、検出部に加えて、検体が適切に展開されたことを確認するための対照部（Ｂ２）を備えることが好ましい。対照部には、第２抗体混合物に結合可能な物質が固定されている。好ましくは、検出部と対照部は、担体上に、展開方向を横断する方向で線状に設置されることができる（それぞれ「テストライン」及び「コントロールライン」とも称される）。担体上の検出部及び対照部の位置関係は特に限定されないが、一般には、検出部よりも下流側に対照部が形成される。 As the carrier, a material that can bind a protein and develop a component in a sample, a complex of an antigen-second antibody mixture, or the like is used. Preferably, the carrier is membranous (membrane carrier). Examples of the material of the membrane carrier include polyethylene, nylons, and celluloses. More preferably, a nitrocellulose membrane is used. It is preferable that the carrier is provided with a control unit (B2) for confirming that the sample has been properly developed, in addition to the detection unit. A substance capable of binding to the second antibody mixture is immobilized on the control portion. Preferably, the detection section and the control section can be linearly placed on the carrier in a direction transverse to the deployment direction (also referred to as "test line" and "control line", respectively). The positional relationship between the detection part and the control part on the carrier is not particularly limited, but in general, the control part is formed on the downstream side of the detection part.
第１抗体混合物及び第２抗体混合物に結合可能な物質の固定方法は、担体の種類に応じて、常法に従って行うことができる。例えば、適切に希釈した抗体溶液を、抗体塗布機を用いて塗布し、乾燥することで固定することができる。検出部に固定される捕捉抗体の量は、好ましくはテストストリップ１枚当たり０．４〜３μgであり、より好ましくは１〜２μgである。 The method for fixing the substance that can bind to the first antibody mixture and the second antibody mixture can be carried out according to a conventional method depending on the type of carrier. For example, an appropriately diluted antibody solution can be applied by using an antibody coating machine and dried to fix the antibody solution. The amount of the capture antibody immobilized on the detection unit is preferably 0.4 to 3 μg, more preferably 1 to 2 μg per test strip.
第２抗体混合物は、標識物質で標識された抗体、即ち「標識抗体」であり、検出部とは離れた位置において担体に保持されている。典型的には、標識抗体を保持する担体は、捕捉抗体を固定化する担体とは別の部材である。第２抗体混合物（標識抗体）を保持している標識抗体保持部材（Ｃ）は、検出部よりも上流側に配置される。標識抗体保持部材は、乾燥状態で標識抗体を保持し、液体で浸潤すると標識抗体を放出する。標識抗体保持部材の材質としては、グラスファイバー、セルロースファイバー、ポリエステルなどが挙げられる。標識抗体保持部材に標識抗体を保持させる方法は常法に従って行うことができることができる。例えば適量の標識抗体を含む緩衝液に標識抗体保持部材を含浸させ、又は適量の標識抗体を含む緩衝液を標識抗体保持部材に滴下した後、乾燥させることにより行うことができる。保持させる標識抗体の量は好ましくはテストストリップ１枚当たり抗体量として５〜２０ｎgであり、より好ましくは５〜１０ｎgである。 The second antibody mixture is an antibody labeled with a labeling substance, that is, a "labeled antibody", and is held on a carrier at a position distant from the detection unit. Typically, the carrier carrying the labeled antibody is a separate member from the carrier that immobilizes the capture antibody. The labeled antibody holding member (C) holding the second antibody mixture (labeled antibody) is arranged on the upstream side of the detection unit. The labeled antibody retaining member retains the labeled antibody in a dry state and releases the labeled antibody when infiltrated with a liquid. Examples of the material of the labeled antibody holding member include glass fiber, cellulose fiber, polyester and the like. The method of causing the labeled antibody holding member to hold the labeled antibody can be carried out according to a conventional method. For example, the buffer solution containing an appropriate amount of the labeled antibody is impregnated with the labeled antibody holding member, or the buffer solution containing the appropriate amount of the labeled antibody is dropped onto the labeled antibody holding member and then dried. The amount of labeled antibody to be retained is preferably 5 to 20 ng, more preferably 5 to 10 ng as the amount of antibody per test strip.
検体添加部材は、標識抗体保持部材の上流側に配置され、好ましくは、検体添加部材中の少なくとも下流側領域の下面が、標識抗体保持部材中の上流側の領域の上面と接触している。標識抗体保持部材の一部が、検体添加部材の下面と担体の上流側の領域の上面との間に挟み込まれていることが好ましい。好ましくは、担体の下流に配置される吸収部材（Ｅ）が備えられる。吸収部材は、その上流側領域の下面が、担体の検出部よりも下流側に存在する領域の上面と接触するよう配置される。 The sample addition member is arranged on the upstream side of the labeled antibody holding member, and preferably, the lower surface of at least the downstream side region in the sample addition member is in contact with the upper surface of the upstream side region in the labeled antibody holding member. It is preferable that a part of the labeled antibody holding member is sandwiched between the lower surface of the sample addition member and the upper surface of the region on the upstream side of the carrier. Preferably, an absorbing member (E) arranged downstream of the carrier is provided. The absorption member is arranged so that the lower surface of the upstream region thereof contacts the upper surface of the region existing downstream of the detection portion of the carrier.
本発明の試験デバイスでは、必要に応じて前処理した液体状の検体を検体添加部材（Ｄ）に滴下すると、標識抗体保持部材に浸潤し、検体と標識抗体との混合物が担体に移動し、担体中で検出部に向けて展開する。検体にトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）（抗原）が含まれる場合、当該抗原と標識抗体とが免疫複合体を形成する。そして、検出部において抗原抗体反応によって、当該複合体が捕捉抗体に捕捉され、集積して発色する。従って、検出部における呈色の度合いを目視で観察し、検体中の抗原の有無を判定することが可能となる。担体が対照部を備える場合には、検体中の抗原と複合体を形成せずに残留する標識抗体が検出部を素通りし、下流の対照部に固定された、標識抗体に結合可能な物質に捕捉され、集積して発色する。 In the test device of the present invention, when a pretreated liquid sample is dropped onto the sample addition member (D) as needed, it infiltrates the labeled antibody holding member, and the mixture of the sample and the labeled antibody moves to the carrier. Deploy toward the detector in the carrier. When the sample contains a coat protein (CP) (antigen) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), the antigen and the labeled antibody form an immune complex. Then, the complex is captured by the capture antibody by the antigen-antibody reaction in the detection unit, and accumulates to develop color. Therefore, it is possible to visually observe the degree of coloration in the detection unit and determine the presence or absence of an antigen in the sample. When the carrier has a control part, the labeled antibody remaining without forming a complex with the antigen in the sample passes through the detection part and becomes a substance immobilized on the downstream control part and capable of binding to the labeled antibody. Captured, accumulated and colored.
以下本発明を具体的に説明する為に実施例を示すが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。 Hereinafter, examples will be shown for the purpose of specifically explaining the present invention, but the present invention is not limited to the following examples.
＜製造例（イムノクロマトグラフィーの作製）＞
１. 組換えタンパク質（トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ））の作製
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）：ＴＹＬＣＶ−ＣＰ（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ: ＮＰ６５８９９２．１）のアミノ酸配列全長（（ｆ）：１−２５８ａａ、配列番号１）及び全長を５分割（（ａ）：１−６０ａａ、配列番号２、（ｂ）：５１−１１０ａａ、配列番号３、（ｃ）：１０１−１６０ａａ、配列番号４、（ｄ）：１５１−２１０ａａ、配列番号５、（ｅ）：２０１−２５８ａａ、配列番号６）し、Ｈｉｓタグ融合タンパク質として発現させるため、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥヘルスケア社）に挿入した。これらのプラスミドを大腸菌ＢＬ２１−ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に形質転換させて導入し、コロニーを単離させた。この大腸菌をＩＰＴＧで発現誘導させて、大量発現しタグ精製した。
組換えコートタンパク質（ＣＰ）の領域範囲を図１に示した。
<Production example (preparation of immunochromatography)>
1. Preparation of recombinant protein (coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV)) Coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV): TYLCV-CP (NCBI Reference Sequence: NP658992.1.) Amino acid sequence full length ((f): 1-258aa, SEQ ID NO: 1) and total length divided into 5 ((a): 1-60aa, SEQ ID NO: 2, (b): 51-110aa, SEQ ID NO: 3, (c) : 101-160aa, SEQ ID NO: 4, (d): 151-210aa, SEQ ID NO: 5, (e): 201-258aa, SEQ ID NO: 6) to express as a His tag fusion protein, pGEX-6P-1 ( It was inserted into GE Healthcare). These plasmids were transformed into Escherichia coli BL21-DE3 (Novagen) and introduced to isolate colonies. The expression of this Escherichia coli was induced by IPTG, expressed in large quantities, and tagged.
The region range of the recombinant coated protein (CP) is shown in FIG.
２．トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に対する抗体の作製
得られた組換えコートタンパク質全長（ｆ）を免疫抗原とし、３匹のウサギを４回免疫した。抗血清の力価が上昇したことを確認し、各ウサギの血液を回収した。血液から分離した血清から、ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（ＧＥヘルスケア社）を用い抗体を精製し、３種のポリクローナル抗体Ａ〜Ｃを得た。
2. Preparation of antibody against tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) coat protein (CP) Three rabbits were immunized four times using the obtained recombinant coat protein full length (f) as an immune antigen. After confirming that the antiserum titer had increased, blood was collected from each rabbit. Antibodies were purified from the serum separated from blood using a HiTrap Protein A column (GE Healthcare) to obtain three types of polyclonal antibodies A to C.
３.トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に対する抗体混合物のコートタンパク質（ＣＰ）上の結合領域の確認
（１）（ａ）から（ｆ）の組換えタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｗａｋｏ社）でアガロースゲル電気泳動し、ウエスタンブロッド機（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）でニトロセルロースメンブレン（ミリポア社）に転写させた。
（２）トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）の全長（組換えタンパク質（ｆ））で免疫した動物から得た３種のポリクローナル抗体Ａ〜Ｃを（ａ）〜（ｆ）の組換えタンパク質に反応させ、ＥＣＬ試薬（ＧＥヘルスケア社）とケミドック（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を使用し、抗原抗体反応で確認を行なった。
ウエスタンブロットの結果を表１に示した。なお表中、陽性（＋）判定は抗原抗体反応が確認できたもの、陰性（−）判定は抗原抗体反応が確認できなかったものを示す。
3. Confirmation of the binding region on the coat protein (CP) of the antibody mixture against the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) (1) Confirmation of the binding region of the recombinant proteins of (a) to (f) by SDS-PAGE ( Agarose gel electrophoresis was performed on Wako) and transferred to a nitrocellulose membrane (Millipore) on a Western Brod machine (BIO-RAD).
(2) Three types of polyclonal antibodies A to C obtained from animals immunized with the full length (recombinant protein (f)) of the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) (a) to (f). ECL reagent (GE Healthcare) and Chemidock (BIO-RAD) were used to react with the recombinant protein of the above, and confirmation was performed by antigen-antibody reaction.
The results of Western blotting are shown in Table 1. In the table, the positive (+) determination indicates that the antigen-antibody reaction was confirmed, and the negative (-) determination indicates that the antigen-antibody reaction could not be confirmed.
４.トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に対する抗体混合物の検出限界の検討
（ｆ）の組換えタンパク質をＥＬＩＳＡプレート（ヌンク社）に固相化し、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）の全長（組換えタンパク質（ｆ））に対する３種のポリクローナル抗体Ａ〜Ｃを反応させ、マイクロプレートリーダー（日立社）で抗体限界値の測定確認を行なった。
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）の組換え抗原によるコートタンパク質（ＣＰ）抗体混合物の検出限界値を表２に示した。なお、陽性（＋）判定は０．０５０以上、陰性（−）判定は０〜０．０５０未満とした。
4. Examination of detection limit of antibody mixture against tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) coat protein (CP) The recombinant protein of (f) was immobilized on an ELISA plate (Nunk), and tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) was immobilized. ), The full length of the coated protein (CP) (recombinant protein (f)) was reacted with three types of polyclonal antibodies A to C, and the measurement and confirmation of the antibody limit value was confirmed with a microplate reader (Hitachi).
Table 2 shows the detection limits of the coat protein (CP) antibody mixture by the recombinant antigen of the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). The positive (+) judgment was 0.050 or more, and the negative (-) judgment was 0 to less than 0.050.
５．トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトの試験デバイスの作製
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に対するポリクローナル抗体Ａを使用したイムノクロマトグラフィー用テストストリップを含む試験デバイスを製造した。本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの模式構成図を図２に示した。
（１）プラスチック製粘着シート（Ａ）に不溶性メンブレン（Ｂ）を貼り、次いで、コンジュゲートパッド（Ｃ）、サンプルパッド（Ｄ）の順に貼り合わせて配置装着し、反対側の端には吸収パッド（Ｅ）を貼り合わせて配置装着した。
（２）コンジュゲートパッドには、金コロイドにトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に対するポリクローナル抗体Ａを感作したコンジュゲート（標識抗体）が含浸されており、不溶性メンブレンには、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に対するポリクローナル抗体Ａ（固定抗体）を（塗布濃度３．５ｍｇ／ｍＬ、塗布量５０μｌ／分、１０ｍｍ／秒）、およびコントロール試薬（塗布濃度０．７５ｍｇ／ｍＬ、塗布量５０μｌ／分、１０ｍｍ／秒）を流れ方向に対して垂直になるように、ライン上に固定化した。
（３）各パッドは、上下のパッドとその一部が接するように積層して配置した。
（４）イムノクロマトグラフィー用テストストリップの塗布ラインの位置は、図３に示した通りであり、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）に対するポリクローナル抗体からなるラインをテストライン（Ｂ１）、コントロール試薬からなるラインをコントロールライン（Ｂ２）とした。
（５）更に、５ｍｍ幅に、イムノクロマトカッター（ニップンエンジニアリング社）で切断しイムノクロマトグラフィー用テストストリップを得た。
5. Preparation of test device for immunochromatography for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) A test device containing a test strip for immunochromatography using polyclonal antibody A against the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) was manufactured. A schematic configuration diagram of the test strip for immunochromatography of the present invention is shown in FIG.
(1) An insoluble membrane (B) is attached to a plastic adhesive sheet (A), and then a conjugate pad (C) and a sample pad (D) are attached in this order for placement and attachment, and an absorption pad is attached to the opposite end. (E) was pasted together and placed and attached.
(2) The conjugate pad is impregnated with a gold colloid impregnated with a conjugate (labeled antibody) sensitized with polyclonal antibody A against the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), and the insoluble membrane is impregnated. , Polyclonal antibody A (fixed antibody) against tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) coat protein (CP) (coating concentration 3.5 mg / mL, coating amount 50 μl / min, 10 mm / sec), and control reagent (coating concentration). 0.75 mg / mL, coating amount 50 μl / min, 10 mm / sec) were immobilized on the line so as to be perpendicular to the flow direction.
(3) Each pad was laminated and arranged so that the upper and lower pads and a part thereof were in contact with each other.
(4) The position of the application line of the test strip for immunochromatography is as shown in FIG. 3, and the line consisting of the polyclonal antibody against the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) is used as the test line (B1). , The line composed of the control reagent was designated as the control line (B2).
(5) Further, a test strip for immunochromatography was obtained by cutting into a width of 5 mm with an immunochromatographic cutter (Nippon Engineering Co., Ltd.).
＜試験例１（従来の植物ウイルス検出用抽出液の検討）＞
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の感染葉（ＴＹＬＣＶ感染葉）と、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染していない健全葉を、表４に示す各緩衝液で抽出させ、製造例で作製したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトで比較した。なお検体は条件をそろえるためにトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）感染葉、及び健全葉を採取後にそれぞれ凍結乾燥させ数枚を混ぜたものを使用した。
（１）各抽出液１ｍＬに、５０ｍｇずつを秤量したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）感染葉、及び、健全葉の乾燥葉を添加し、磨砕しサンプル液とした。
（２）このサンプル液１００μＬをトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトのサンプルパッドに滴下させ、２５分後テストラインの発色強度をイムノクロマトリーダーで測定し、表３の判定基準に従って評価した。
結果を表４に示す。
<Test Example 1 (Examination of conventional extract for plant virus detection)>
Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) infected leaves (TYLCV infected leaves) and healthy leaves not infected with tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) were extracted with each buffer solution shown in Table 4 and prepared in a production example. The comparison was made by immunochromatography for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). In order to meet the conditions, tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) infected leaves and healthy leaves were collected, freeze-dried, and mixed with several leaves.
(1) Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) infected leaves and healthy leaves were added to 1 mL of each extract and weighed 50 mg each, and ground to prepare a sample solution.
(2) 100 μL of this sample solution was dropped onto a sample pad of immunochromatography for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), and after 25 minutes, the color development intensity of the test line was measured with an immunochromatographic reader and evaluated according to the criteria shown in Table 3.
The results are shown in Table 4.
本結果によれば、カンキツ類における植物ウイルスの一種である温州萎縮ウイルス（ＳＤＶ）を検出するイムノクロマト植物診断キットについての文献に記載された抽出液を用いた比較例１ではトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染していない健全葉で偽陽性となった。
植物ウイルスの一種であるキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）を検出するイムノクロマト植物診断キットについての文献に記載された抽出液を用いた比較例２では、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の感染の有無で差は見られたものの、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染していない健全葉で、偽陽性反応が見られた。
カンキツ類における植物ウイルスの一種である温州萎縮ウイルス（ＳＤＶ）を検出するイムノクロマト植物診断キットについての文献に記載された抽出液を用いた比較例３ではトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の感染の有無で差は見られたものの、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染した感染葉での反応が弱かった。
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の抗血清を使用したＥＬＩＳＡによるウイルス診断についての文献に記載された抽出液を用いた参考例１ではトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の感染の有無で差が見られなかった。
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用の市販のＥＬＩＳＡキットの抽出液を用いた参考例２では、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の感染の有無で差は見られたものの、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染した感染葉での反応が弱かった。
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用ｒａｐｉｄ ｉｍｍｕｎｏｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ ａｓｓａｙが開示されている文献に記載された抽出液を用いた参考例３ではトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染していない健全葉で、偽陽性反応が見られた。
According to this result, in Comparative Example 1 using the extract described in the literature on an immunochromatographic plant diagnostic kit for detecting Wenzhou atrophy virus (SDV), which is a kind of plant virus in citrus fruits, tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). ) Was false positive in healthy leaves that were not infected.
In Comparative Example 2 using the extract described in the literature for an immunochromatographic plant diagnostic kit that detects cucumber mosaic virus (CMV), which is a type of plant virus, there is a difference depending on the presence or absence of infection with tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). However, a false positive reaction was observed in healthy leaves not infected with tomato yellow leaf curl virus (TYLCV).
In Comparative Example 3 using the extract described in the literature for an immunochromatographic plant diagnostic kit for detecting Wenzhou atrophy virus (SDV), which is a type of plant virus in citrus fruits, the presence or absence of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) infection was used. Although there was a difference, the reaction was weak in the infected leaves infected with tomato yellow leaf curl virus (TYLCV).
In Reference Example 1 using the extract described in the literature on virus diagnosis by ELISA using the antiserum of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), there is a difference depending on the presence or absence of infection with tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). I couldn't.
In Reference Example 2 using an extract of a commercially available ELISA kit for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), although there was a difference depending on the presence or absence of infection with tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), tomato yellow leaf curl The reaction on infected leaves infected with the virus (TYLCV) was weak.
In Reference Example 3 using the extract described in the literature in which the rapid immunofilter paper assembly for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) is disclosed, healthy leaves not infected with tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) are used. A false positive reaction was seen.
＜試験例２（抽出液における緩衝液の種類の検討）＞
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の感染葉（ＴＹＬＣＶ感染葉）と、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染していない健全葉を、各緩衝液で抽出させ、製造例で作製したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトで比較した。なお検体は条件をそろえるためにトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）感染葉、及び健全葉を採取後にそれぞれ凍結乾燥させ数枚を混ぜたものを使用した。
（１）界面活性剤（０．２％（ｗ/ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０）を含む各緩衝液１ｍＬに、５０ｍｇずつを秤量したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）感染葉、及び、健全葉の乾燥葉を添加し、磨砕しサンプル液とした。
（２）このサンプル液１００μＬをトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトのサンプルパッドに滴下させ、２５分後テストラインの発色強度をイムノクロマトリーダーで測定し、上記表３の判定基準に従って評価した。
結果を表５に示す。また、表６に高感度に検出することができたクエン酸ナトリウムについての使用濃度による結果を示した。
<Test Example 2 (Examination of type of buffer solution in extract)>
Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) infected leaves (TYLCV infected leaves) and healthy leaves not infected with tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) were extracted with each buffer solution, and tomato yellowing produced in the production example. Comparison was performed by immunochromatography for detecting yellow leaf curl virus (TYLCV). In order to meet the conditions, tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) infected leaves and healthy leaves were collected, freeze-dried, and mixed with several leaves.
(1) Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) infected leaves and dried leaves of healthy leaves were weighed 50 mg each in 1 mL of each buffer solution containing a surfactant (0.2% (w / v) Tween 20). It was added and ground to prepare a sample solution.
(2) 100 μL of this sample solution was dropped onto a sample pad of immunochromatography for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), and after 25 minutes, the color development intensity of the test line was measured with an immunochromatographic reader and evaluated according to the criteria shown in Table 3 above. ..
The results are shown in Table 5. In addition, Table 6 shows the results based on the concentration used for sodium citrate, which could be detected with high sensitivity.
また、トリス系緩衝液は反応せず、反応した場合は偽陽性発色であった。
In addition, the Tris-based buffer did not react, and when it did, it gave a false positive color.
さらにクエン酸ナトリウムの濃度を１ｍＭ〜１０００ｍＭの範囲で変化させた以外は試験例２の方法に従って同様の検討を行った。結果を表６に示す。
またクエン酸ナトリウムの濃度が５００ｍＭ、１０００ｍＭである場合には測定不能であったが、これは高濃度のナトリウムを含有する緩衝液により金コロイド標識抗体が凝集反応を起こし、展開の途中で目詰まりしたためと考えられる。
Further, the same examination was carried out according to the method of Test Example 2 except that the concentration of sodium citrate was changed in the range of 1 mM to 1000 mM. The results are shown in Table 6.
In addition, it was not possible to measure when the concentration of sodium citrate was 500 mM or 1000 mM, but this was because the gold colloid-labeled antibody caused an agglutination reaction due to the buffer solution containing a high concentration of sodium, and clogged during the development. It is probable that it was done.
＜試験例３（抽出液における界面活性剤の検討）＞
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の感染葉（ＴＹＬＣＶ感染葉）から、更に高感度にウイルスを抽出させるため、クエン酸ナトリウム緩衝液に各界面活性剤を添加し、製造例で作製したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトで比較した。なお検体は条件をそろえるためにトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）感染葉、及び健全葉を採取後にそれぞれ凍結乾燥させ数枚を混ぜたものを使用した。
（１）各界面活性剤を添加した５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液１ｍＬに、５０ｍｇずつを秤量したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）感染葉、及び、健全葉の乾燥葉を添加し、磨砕しサンプル液とした。
（２）このサンプル液１００μＬをトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトのサンプルパッドに滴下させ、２５分後テストラインの発色強度をイムノクロマトリーダーで測定し、表３の判定基準に従って評価した。 結果を表７に示す。 また、表８に高感度に検出することができた界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０、ＳＤＳ）についての使用濃度による結果を示した。
<Test Example 3 (Examination of surfactant in extract)>
Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) infected leaves (TYLCV infected leaves), in order to extract the virus with higher sensitivity, each surfactant was added to sodium citrate buffer, and tomato yellowing produced in the production example. Comparison was performed by immunochromatography for detecting yellow leaf curl virus (TYLCV). In order to meet the conditions, tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) infected leaves and healthy leaves were collected, freeze-dried, and mixed with several leaves.
(1) Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) infected leaves and dried leaves of healthy leaves, weighed 50 mg each, were added to 1 mL of 50 mM sodium citrate buffer containing each surfactant, and ground and sampled. It was made into a liquid.
(2) 100 μL of this sample solution was dropped onto a sample pad of immunochromatography for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), and after 25 minutes, the color development intensity of the test line was measured with an immunochromatographic reader and evaluated according to the criteria shown in Table 3. The results are shown in Table 7. In addition, Table 8 shows the results based on the concentrations used for the surfactants (Tween 20, SDS) that could be detected with high sensitivity.
また、ＳＤＳの濃度が２％（ｗ／ｖ），５％（ｗ／ｖ），１０％（ｗ／ｖ）である場合において測定不能であったが、これは溶液の粘性が強くなり、目詰まりを起こし、展開出来なくなったためと考えられる。
In addition, it was not possible to measure when the SDS concentration was 2% (w / v), 5% (w / v), and 10% (w / v), but this caused the solution to become more viscous and the eyes became more viscous. It is probable that it was clogged and could not be deployed.
＜試験例４（抗体混合物の検討）＞
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の感染葉（ＴＹＬＣＶ感染葉）から、更に高感度にウイルスを検出するため、使用する抗体混合物をトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトで比較した。トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトは、標識抗体、固定抗体として使用する抗体混合物が異なる以外は製造例に従って作製した。なお検体は条件をそろえるためにトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）感染葉、及び健全葉を採取後にそれぞれ凍結乾燥させ数枚を混ぜたものを使用した。
（１）界面活性剤（０．２％（ｗ/ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０）を含む５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液１ｍＬに、５０ｍｇずつを秤量したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）感染葉の乾燥葉、及び、健全葉の乾燥葉を添加し、磨砕しサンプル液とした。
（２）このサンプル液１００μＬを複合体の抗体を用いて作製したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトのサンプルパッドに滴下させ、２５分後テストラインの発色強度をイムノクロマトリーダーで測定し、表３の判定基準に従って評価した。
<Test Example 4 (Examination of antibody mixture)>
In order to detect the virus from the tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) infected leaves (TYLCV infected leaves) with higher sensitivity, the antibody mixture used was compared by immunochromatography for tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) detection. The immunochromatography for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) was prepared according to the production example except that the antibody mixture used as the labeled antibody and the fixed antibody was different. In order to meet the conditions, tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) infected leaves and healthy leaves were collected, freeze-dried, and mixed with several leaves.
(1) Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) -infected leaves and dried leaves weighing 50 mg each in 1 mL of 50 mM sodium citrate buffer containing a surfactant (0.2% (w / v) Tween 20), and Dried leaves of healthy leaves were added and ground to prepare a sample solution.
(2) 100 μL of this sample solution was dropped onto a sample pad for immunochromatography for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) prepared using an antibody of the complex, and 25 minutes later, the color development intensity of the test line was measured with an immunochromatographic reader. Evaluation was made according to the criteria in Table 3.
結果を表９に示す。なお使用した各ポリクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡ法でトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）の組換えコートタンパク質を用いて抗体活性を比較した場合、差は見られなかった。 The results are shown in Table 9. No difference was observed between the polyclonal antibodies used when the antibody activities were compared using the recombinant coated protein of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) by the ELISA method.
本結果によれば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）の５つの結合領域にそれぞれに結合する抗体を含むポリクローナル抗体Ａを使用した場合、高感度に検出が可能であった。また、（ｃ）に結合する抗体を含まないポリクローナル抗体Ｂと（ｅ）に結合する抗体を含まないポリクローナル抗体Ｃを合わせると、結合領域を補うことで検出感度を上げることが可能であった。 According to this result, when polyclonal antibody A containing an antibody that binds to each of the five binding regions of (a), (b), (c), (d), and (e) is used, it is detected with high sensitivity. Was possible. Further, by combining the polyclonal antibody B that does not contain the antibody that binds to (c) and the polyclonal antibody C that does not contain the antibody that binds to (e), it was possible to increase the detection sensitivity by supplementing the binding region.
＜試験例５（検体の部位および交差反応の検討）＞
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染した植物体（葉、茎、花等）を検体とし、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトで比較した。また、トマト退緑ウイルス（ＴｏＣＶ）に感染している植物体に対する反応を検討した。
トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトは、製造例に従って作製した。なお検体は植物体（葉、茎、花）を採取し、そのままの状態で使用した。
（１）界面活性剤（０．２％（ｗ/ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０）を含む５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液１ｍＬに、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染した植物体（葉、茎、花）、及び、トマト退緑ウイルス（ＴｏＣＶ）に感染した植物体（葉、茎）、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）とトマト退緑ウイルス（ＴｏＣＶ）の両方に感染した植物体（葉、茎）、ウイルスに感染していない植物体（葉、茎）を採取したままの状態で、滅菌バサミで切断し５０ｍｇずつを秤量したものを添加し磨砕してサンプル液とした。
（２）このサンプル液１００μＬを複合体の抗体を用いて作製したトマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）検出用イムノクロマトのサンプルパッドに滴下させ、２５分後イムノクロマトリーダーで測定し、表３の判定基準に従って評価した。結果を表１０に示す。
<Test Example 5 (Examination of sample site and cross-reactivity)>
Plants (leaves, stems, flowers, etc.) infected with tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) were used as samples and compared by immunochromatography for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). In addition, the reaction to plants infected with tomato chlorotic virus (ToCV) was examined.
An immunochromatography for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) was prepared according to a production example. As a sample, plants (leaves, stems, flowers) were collected and used as they were.
(1) Plants (leaves, stems, flowers) infected with tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) in 1 mL of 50 mM sodium citrate buffer containing a surfactant (0.2% (w / v) Tween 20). And plants infected with tomato chlorotic virus (ToCV) (leaves, stems), plants infected with both tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) and tomato chlorotic virus (ToCV), viruses. In the state where the plants (leaves, stems) that were not infected with yellow leaf curl were collected, they were cut with a sterile scissors, weighed 50 mg each, and ground to obtain a sample solution.
(2) 100 μL of this sample solution was dropped onto a sample pad for immunochromatography for detecting tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) prepared using the antibody of the complex, and after 25 minutes, it was measured with an immunochromatographic reader, and according to the criteria shown in Table 3. evaluated. The results are shown in Table 10.
本結果によれば、トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）に感染した植物体（葉、茎、花）であれば検出が可能であり、別のウイルスに同時感染した植物体であっても検出が可能であった。
また、ウイルス感染のない植物体との偽陽性反応や、別のウイルスに感染した植物体の誤判定の反応は見られなかった。
According to this result, it is possible to detect plants (leaves, stems, flowers) infected with tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), and even plants infected with another virus. It was possible.
In addition, no false positive reaction with plants without virus infection or false positive reaction with plants infected with another virus was observed.
（Ａ）プラスチック製粘着シート
（Ｂ）不溶性メンブレン（担体）
（Ｃ）コンジュゲートパッド（標識抗体保持部材）
（Ｄ）サンプルパッド（検体添加部材）
（Ｅ）吸収パッド（吸収部材）
（Ｂ１）テストライン（検出部）
（Ｂ２）コントロールライン（対照部）
(A) Plastic adhesive sheet (B) Insoluble membrane (carrier)
(C) Conjugate pad (labeled antibody holding member)
(D) Sample pad (sample addition member)
(E) Absorption pad (absorbent member)
(B1) Test line (detector)
(B2) Control line (control part)
Claims (16)
前記第１抗体混合物が前記膜担体に固定化されて検出部を構成し、
前記第２抗体混合物は標識物質で標識されており、且つ前記検出部から離れた位置に保持されている、イムノクロマトグラフィー試験デバイス。 It comprises a first antibody mixture that binds to the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), a second antibody mixture that binds to the coat protein (CP) of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), and a membrane carrier.
The first antibody mixture is immobilized on the membrane carrier to form a detection unit.
An immunochromatography test device in which the second antibody mixture is labeled with a labeling substance and is held at a position away from the detection unit.
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