JP2020171317A - Cell culture method and microfiber - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、細胞培養方法及びマイクロファイバに関するものである。 The present disclosure relates to cell culture methods and microfibers.
従来、ヒトｉＰＳ細胞等のｉＰＳ細胞は、無限の増殖能と、すべての体細胞に分化し得る能力を有するので、再生医療等に使用される細胞ソースとして期待されているが、再生医療等に使用するためにはｉＰＳ細胞が大量に必要となり、そのためには三次元培養系が向いていると言われている。そこで、細胞の三次元培養方法が提案されている（例えば、特許文献１及び２並びに非特許文献１参照。）。 Conventionally, iPS cells such as human iPS cells have infinite proliferative ability and ability to differentiate into all somatic cells, and are therefore expected as a cell source used in regenerative medicine, etc. A large amount of iPS cells are required for use, and it is said that a three-dimensional culture system is suitable for that purpose. Therefore, a three-dimensional cell culture method has been proposed (see, for example, Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Document 1).
しかしながら、前記従来の細胞培養方法では、ヒトｉＰＳ細胞等のプライム型多能性幹細胞を安定的に効率よく増殖させることは、困難であった。 However, it has been difficult to stably and efficiently proliferate prime-type pluripotent stem cells such as human iPS cells by the conventional cell culture method.
ここでは、前記従来の細胞培養方法の問題点を解決して、マイクロファイバ内でプライム型多能性幹細胞を培養することによって、プライム型多能性幹細胞を安定的かつ大量に増殖させることができる細胞培養方法及びマイクロファイバを提供することを目的とする。 Here, by solving the problem of the conventional cell culture method and culturing the prime-type pluripotent stem cells in the microfiber, the prime-type pluripotent stem cells can be stably and mass-proliferated. It is an object of the present invention to provide a cell culture method and microfibers.
そのために、細胞培養方法においては、細胞培養方法であって、プライム型多能性幹細胞を内部に含む管状のマイクロファイバを製造する第１工程と、前記プライム型多能性幹細胞を前記マイクロファイバの内部で培養し、分化多能性を維持した状態で前記プライム型多能性幹細胞の断面形状及び外径が前記マイクロファイバによって制御された細胞塊になるまで増殖させ、凝集させる第２工程と、を含む。 Therefore, in the cell culture method, in the cell culture method, the first step of producing a tubular microfiber containing prime-type pluripotent stem cells inside, and the prime-type pluripotent stem cell of the microfiber The second step of culturing inward and proliferating and aggregating the prime-type pluripotent stem cells until they become cell clusters controlled by the microfibers while maintaining pluripotency. including.
他の細胞培養方法においては、さらに、前記第２工程において、前記プライム型多能性幹細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤を添加した培地中で培養することを含む。 Another cell culture method further comprises culturing the prime-type pluripotent stem cells in a medium supplemented with a ROCK inhibitor in the second step.
更に他の細胞培養方法においては、さらに、前記プライム型多能性幹細胞は、ヒトｉＰＳ細胞であり、培養開始時の前記ヒトｉＰＳ細胞の密度は、１×１０7 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕以上である。 In still other cell culture methods, the prime-type pluripotent stem cells are human iPS cells, and the density of the human iPS cells at the start of culture is 1 × 10 7 [cells / mL] or more. ..
更に他の細胞培養方法においては、さらに、前記マイクロファイバを溶融し、前記プライム型多能性幹細胞を回収する工程を更に含む。 Yet another cell culture method further comprises the step of melting the microfibers and recovering the prime-type pluripotent stem cells.
更に他の細胞培養方法においては、さらに、回収された前記プライム型多能性幹細胞を内部に含むマイクロファイバを製造することによって、前記プライム型多能性幹細胞を内部に含むマイクロファイバを継代する工程を更に含む。 In still another cell culture method, the microfiber containing the prime-type pluripotent stem cell is subcultured by producing a microfiber containing the recovered prime-type pluripotent stem cell inside. Further includes steps.
更に他の細胞培養方法においては、さらに、前記プライム型多能性幹細胞を内部に含むマイクロファイバを凍結して、前記プライム型多能性幹細胞をマイクロファイバ内で保存する工程を更に含む。 In yet another cell culture method, the step of freezing the microfiber containing the prime-type pluripotent stem cell inside and storing the prime-type pluripotent stem cell in the microfiber is further included.
更に他の細胞培養方法においては、さらに、前記プライム型多能性幹細胞を内部に含むマイクロファイバを分化誘導培地内で培養することによって、前記プライム型多能性幹細胞をマイクロファイバ内で分化誘導する工程を更に含む。 In yet another cell culture method, the prime-type pluripotent stem cells are further induced to differentiate in the microfibers by culturing the microfibers containing the prime-type pluripotent stem cells in a differentiation-inducing medium. Further includes steps.
マイクロファイバにおいては、プライム型多能性幹細胞を内部に含む管状のマイクロファイバであって、前記プライム型多能性幹細胞は、分化多能性が維持された状態で、前記プライム型多能性幹細胞の断面形状及び外径が前記マイクロファイバによって制御された細胞塊を形成している。 The microfiber is a tubular microfiber containing prime-type pluripotent stem cells inside, and the prime-type pluripotent stem cells are the prime-type pluripotent stem cells in a state in which differentiation pluripotency is maintained. The cross-sectional shape and outer diameter of the cell mass are controlled by the microfiber.
本開示によれば、プライム型多能性幹細胞を安定的に効率よく増殖させることができる。 According to the present disclosure, prime-type pluripotent stem cells can be proliferated stably and efficiently.
以下、実施の形態について図面を参照しながら詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments will be described in detail with reference to the drawings.
図１は本実施の形態における製造直後の中空マイクロファイバを示す写真である。 FIG. 1 is a photograph showing a hollow microfiber immediately after production in the present embodiment.
本実施の形態において、中空マイクロファイバは、コア部分と該コア部分を被覆する鞘状のシェル（被覆）部分とを備え、前記コア部分が中空なものであるが、該コア部分に流体、ゲル等が充填されたものをも含むものである。具体的には、特許文献１に記載されたマイクロファイバと同様のものであって、高強度ハイドロゲルで被覆されたマイクロゲルファイバを含むものである。該マイクロゲルファイバは、典型的には、アルギン酸ゲル、マトリゲル、コラーゲンゲル等のゲルであるコア部分と、高強度ハイドロゲルを含むシェル部分とを含むコア・シェル構造を有している。 In the present embodiment, the hollow microfiber includes a core portion and a sheath-shaped shell (coating) portion that covers the core portion, and the core portion is hollow, but the core portion contains a fluid or gel. Etc. are also included. Specifically, it is the same as the microfiber described in Patent Document 1, and includes a microgel fiber coated with a high-strength hydrogel. The microgel fiber typically has a core-shell structure that includes a core portion that is a gel such as alginate gel, matrigel, or collagen gel, and a shell portion that contains a high-strength hydrogel.
なお、本実施の形態における中空マイクロファイバの場合、コア部分は、必ずしもゲルである必要はなく、液体培地等の粘性の低い流体であってもよい。また、前記シェル部分は、高強度ハイドロゲルやコート剤による被覆が多層に形成されている多層被覆であってもよい。例えば、２種類以上の異なる強度を有する高強度ハイドロゲルで２層以上の被覆が形成されていてもよい。 In the case of the hollow microfiber in the present embodiment, the core portion does not necessarily have to be a gel, and may be a fluid having a low viscosity such as a liquid medium. Further, the shell portion may be a multi-layer coating in which a coating with a high-strength hydrogel or a coating agent is formed in multiple layers. For example, two or more layers of high-strength hydrogels having two or more different strengths may be formed.
さらに、前記中空マイクロファイバの内径、すなわち、シェル部分の内径は、例えば、１００〔ｎｍ〕〜１０００〔μｍ〕程度であるが、かかる数値範囲に限定されるものではない。また、前記中空マイクロファイバの断面形状は、円形が望ましいが、楕円形でもよいし、四角形や五角形等の多角形であってもよい。さらに、前記中空マイクロファイバの長さは、例えば、数〔ｍｍ〕〜数十〔ｍ〕程度であるが、かかる数値範囲に限定されるものではない。さらに、前記中空マイクロファイバの外径、すなわち、シェル部分の外径は、例えば、２００〔ｎｍ〕〜２０００〔μｍ〕程度であるが、かかる数値範囲に限定されるものではない。 Further, the inner diameter of the hollow microfiber, that is, the inner diameter of the shell portion is, for example, about 100 [nm] to 1000 [μm], but is not limited to such a numerical range. The cross-sectional shape of the hollow microfiber is preferably circular, but may be elliptical or polygonal such as a quadrangle or a pentagon. Further, the length of the hollow microfiber is, for example, about several [mm] to several tens [m], but is not limited to such a numerical range. Further, the outer diameter of the hollow microfiber, that is, the outer diameter of the shell portion is, for example, about 200 [nm] to 2000 [μm], but is not limited to such a numerical range.
また、本実施の形態において、前記中空マイクロファイバ内で培養される細胞は、プライム型多能性幹細胞である。該プライム型多能性幹細胞には、例えば、ウシｉＰＳ細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞等、マウス、ラットなどのげっ歯類を除く全てのｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞が含まれるが、図に示される実験例において使用されたプライム型多能性幹細胞は、ヒトｉＰＳ細胞であり、より具体的には、４０９Ｂ２：エピソーマルベクターによる樹立細胞、４５４Ｅ２：センダイウイルスベクターによる樹立細胞、及び、ＴｋＤＮ３−４：ウイルスベクターによる樹立細胞の３種類のヒトｉＰＳ細胞である。 Further, in the present embodiment, the cells cultured in the hollow microfiber are prime pluripotent stem cells. The prime-type pluripotent stem cells include, for example, bovine iPS cells, human ES cells, human iPS cells, and all iPS cells and ES cells except rodents such as mice and rats, which are shown in the figure. The prime-type pluripotent stem cells used in these experimental examples are human iPS cells, and more specifically, 409B2: established cells by episomal vector, 454E2: established cells by Sendai virus vector, and TkDN3-4. : Three types of human iPS cells established by viral vectors.
本実施の形態における実験例では、まず、ヒトｉＰＳ細胞を内部に含む中空マイクロファイバが製造された。該中空マイクロファイバの製造方法は、特許文献１に記載されたマイクロファイバの製造方法に従っている。具体的には、特許文献１の「発明の詳細な説明」において段落「００３７」以降に示された「実施例」中で段落「００４１」に記載されている例３の製造方法に従っているが、以下の（ａ）〜（ｃ）の点で異なっている。
（ａ）Ｑcoreを２５〔μＬ／ｍｉｎ〕とし、Ｑshell を７５〔μＬ／ｍｉｎ〕とした点
（ｂ）コア部分の流体に含まれる細胞をヒトｉＰＳ細胞とし、その密度を１×１０6 〜１×１０8 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕とした点
（ｃ）コア部分の流体として、コラーゲンゲル（細胞外マトリクス（ＥＣＭ））、アルギン酸ゲル（細胞外マトリクスを含まない）、マトリゲル（人工基底膜マトリックス）、及び、液体培地（ゲルを含まない）を使用した点
このような製造方法に従って製造された直後の中空マイクロファイバであって、ヒトｉＰＳ細胞が内部（コア部分）に含まれる中空マイクロファイバ、すなわち、ヒトｉＰＳ細胞ファイバの写真が図１に示されている。
In the experimental example in the present embodiment, first, a hollow microfiber containing human iPS cells was produced. The method for producing the hollow microfiber follows the method for producing a microfiber described in Patent Document 1. Specifically, it follows the manufacturing method of Example 3 described in paragraph "0041" in "Examples" shown after paragraph "0037" in "Detailed Description of the Invention" of Patent Document 1. It differs in the following points (a) to (c).
(A) Q core is 25 [μL / min] and Q shell is 75 [μL / min]. (B) Cells contained in the fluid of the core are human iPS cells, and their density is 1 × 10 6 ~ 1 × 10 8 [cells / mL] points (c) As the fluid of the core part, collagen gel (extracellular matrix (ECM)), alginate gel (excluding extracellular matrix), matrigel (artificial basal matrix matrix) ) And a point using a liquid medium (without gel) A hollow microfiber immediately after being manufactured according to such a manufacturing method, in which human iPS cells are contained inside (core part). That is, a photograph of the human iPS cell fiber is shown in FIG.
図１において、第１行（上段）は、ヒトｉＰＳ細胞の密度が１×１０7 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕であるものを示し、第２行（下段）は、ヒトｉＰＳ細胞の密度が１×１０8 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕であるものを示している。また、左側から順に、第１列は内部に、ヒトｉＰＳ細胞とともに、アルギン酸ゲルが収容されたものを示し、第２列は内部に、ヒトｉＰＳ細胞とともに、液体培地が収容されたものを示し、第３列は内部に、ヒトｉＰＳ細胞とともに、マトリゲルが収容されたものを示し、第４列は内部に、ヒトｉＰＳ細胞とともに、コラーゲンゲルが収容されたものを示している。なお、本実施の形態において示される例において、コラーゲンは、株式会社高研が販売するＡｔｅｌｏＣｅｌｌ（Ｒ）の細胞培養用コラーゲン酸性溶液Ｉ−ＰＣ（ウシＩ型コラーゲン）５〔ｍｇ／ｍＬ〕を使用した（使用時には、中性化するために４〔ｍｇ／ｍＬ〕にし、更に培地で希釈することで１〜４〔ｍｇ／ｍＬ〕にする。）。 In FIG. 1, the first row (upper row) shows that the density of human iPS cells is 1 × 10 7 [cells / mL], and the second row (lower row) shows that the density of human iPS cells is 1 × 10 8 [cells / mL] is shown. Further, in order from the left side, the first column shows the one in which the alginate gel was contained together with the human iPS cells, and the second column shows the one in which the liquid medium was contained together with the human iPS cells. The third column shows the cells containing human iPS cells and Matrigel inside, and the fourth column shows the cells containing human iPS cells and collagen gel inside. In the example shown in this embodiment, the collagen used is AteloCell (R) collagen acidic solution I-PC (bovine type I collagen) 5 [mg / mL] for cell culture sold by Koken Co., Ltd. (At the time of use, it is adjusted to 4 [mg / mL] for neutralization, and further diluted with a medium to 1 to 4 [mg / mL]).
続いて、実験例では、ヒトｉＰＳ細胞の培養が行われた。 Subsequently, in the experimental example, human iPS cells were cultured.
図２は本実施の形態におけるＲＯＣＫ阻害剤の添加の有無による結果を示す写真、図３は本実施の形態におけるＤａｙ４の中空マイクロファイバとその生存率を示す写真、図４は本実施の形態における３種類のヒトｉＰＳ細胞を示す写真、図５は本実施の形態における低細胞密度の中空マイクロファイバを示す写真である。 FIG. 2 is a photograph showing the results depending on the presence or absence of the addition of the ROCK inhibitor in the present embodiment, FIG. 3 is a photograph showing the hollow microfiber of Day 4 in the present embodiment and its survival rate, and FIG. 4 is a photograph showing the survival rate in the present embodiment. A photograph showing three types of human iPS cells, FIG. 5 is a photograph showing a hollow microfiber having a low cell density in the present embodiment.
ヒトｉＰＳ細胞が内部に収容された中空マイクロファイバは、プラスチック等の皿状の容器に収容された培地に浸され、これにより、ヒトｉＰＳ細胞の培養が行われた。 The hollow microfiber containing the human iPS cells was immersed in a medium contained in a dish-shaped container such as plastic, whereby the human iPS cells were cultured.
培養において使用された培地には、その作成直後に、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２）が添加された。図２には、ＲＯＣＫ阻害剤が添加された場合（左側）、及び、ＲＯＣＫ阻害剤が添加されなかった場合（右側）の、ヒトｉＰＳ細胞ファイバの写真が示されている。ＲＯＣＫ阻害剤が添加された場合には、中空マイクロファイバ内でヒトｉＰＳ細胞が増殖して凝集したことが示されている。一方、ＲＯＣＫ阻害剤が添加されなかった場合には、細胞死が高頻度で発生し、ヒトｉＰＳ細胞は増殖しなかった。 A ROCK inhibitor (Y-27632) was added to the medium used in the culture immediately after its preparation. FIG. 2 shows photographs of human iPS cell fibers when the ROCK inhibitor was added (left side) and when the ROCK inhibitor was not added (right side). It has been shown that human iPS cells proliferated and aggregated in hollow microfibers when the ROCK inhibitor was added. On the other hand, when the ROCK inhibitor was not added, cell death occurred frequently and human iPS cells did not proliferate.
培養の結果、中空マイクロファイバ内でヒトｉＰＳ細胞同士が凝集して接着し、俵型の細胞塊や、紐状の細胞塊が形成された。このように、ヒトｉＰＳ細胞同士が凝集して形成された細胞塊の断面形状及び直径乃至外径は、中空マイクロファイバの内部の断面形状及び内径によって規定される。すなわち、前記細胞塊の断面形状及び直径は、中空マイクロファイバによって制御される。そして、前記細胞塊に対し、中空マイクロファイバ内に収容された状態のままで、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイ（生細胞を緑に染色し、死細胞を赤に染色するアッセイ）が行われた。これにより、すべてのヒトｉＰＳ細胞ファイバにおいて、高い割合でヒトｉＰＳ細胞が生存していることが確認された。したがって、過剰な凝集に起因する細胞死を避けつつ、ヒトｉＰＳ細胞を高い増殖率で増殖させることができた、と言える。 As a result of the culture, human iPS cells aggregated and adhered to each other in the hollow microfiber, and a bale-shaped cell mass and a string-shaped cell mass were formed. As described above, the cross-sectional shape and diameter to outer diameter of the cell mass formed by aggregating human iPS cells are defined by the cross-sectional shape and inner diameter inside the hollow microfiber. That is, the cross-sectional shape and diameter of the cell mass are controlled by hollow microfibers. Then, a Live / Dead assay (an assay in which live cells were stained green and dead cells were stained red) was performed on the cell mass while being housed in the hollow microfiber. This confirmed that a high proportion of human iPS cells survived in all human iPS cell fibers. Therefore, it can be said that human iPS cells could be proliferated at a high proliferation rate while avoiding cell death due to excessive aggregation.
図３には、培養開始から４日後（Ｄａｙ４）のヒトｉＰＳ細胞ファイバの写真が示されている。図３において、図１と同様に、第１行は、培養開始時のヒトｉＰＳ細胞の密度が１×１０7 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕であるものを示し、第２行は、培養開始時のヒトｉＰＳ細胞の密度が１×１０8 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕であるものを示している。また、左側から順に、第１列は内部に、ヒトｉＰＳ細胞とともに、アルギン酸ゲルが収容されたものを示し、第２列は内部に、ヒトｉＰＳ細胞とともに、液体培地が収容されたものを示し、第３列は内部に、ヒトｉＰＳ細胞とともに、マトリゲルが収容されたものを示し、第４列は内部に、ヒトｉＰＳ細胞とともに、コラーゲンゲルが収容されたものを示している。 FIG. 3 shows a photograph of human iPS cell fibers 4 days after the start of culture (Day 4). In FIG. 3, as in FIG. 1, the first row shows that the density of human iPS cells at the start of culture is 1 × 10 7 [cells / mL], and the second row shows humans at the start of culture. density of iPS cells exhibit what is 1 × 10 8 [cells / mL]. Further, in order from the left side, the first column shows the one in which the alginate gel was contained together with the human iPS cells, and the second column shows the one in which the liquid medium was contained together with the human iPS cells. The third column shows the cells containing human iPS cells and Matrigel, and the fourth column shows the cells containing human iPS cells and collagen gel inside.
また、４０９Ｂ２：エピソーマルベクターによる樹立細胞、４５４Ｅ２：センダイウイルスベクターによる樹立細胞、及び、ＴｋＤＮ３−４：ウイルスベクターによる樹立細胞の３種類のヒトｉＰＳ細胞のすべてについて、培養されたことが確認された。図４には、培養された３種類のヒトｉＰＳ細胞ファイバの写真（左側から順に、４０９Ｂ２、４５４Ｅ２及びＴｋＤＮ３−４の写真）が示されている。 In addition, it was confirmed that all three types of human iPS cells, 409B2: cells established by episomal vector, 454E2: cells established by Sendai virus vector, and TkDN3-4: cells established by viral vector, were cultured. .. FIG. 4 shows photographs of three types of cultured human iPS cell fibers (photographs of 409B2, 454E2 and TkDN3-4 in order from the left side).
なお、中空マイクロファイバ内に収容されるヒトｉＰＳ細胞の密度が低密度である場合、具体的には、培養開始時のヒトｉＰＳ細胞の密度が１×１０6 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕以下の場合には、図５に示されるように、ヒトｉＰＳ細胞は、増殖せずに死んでしまった。図５には、培養開始時のヒトｉＰＳ細胞の密度が１×１０6 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕の場合における培養開始直後（Ｄａｙ０）及び１２日後（Ｄａｙ１２）のヒトｉＰＳ細胞ファイバの写真（左側から順に、Ｄａｙ０及びＤａｙ１２の写真）が示されている。 When the density of human iPS cells housed in the hollow microfiber is low, specifically, when the density of human iPS cells at the start of culture is 1 × 10 6 [cells / mL] or less. As shown in FIG. 5, human iPS cells died without proliferating. FIG. 5 shows photographs of human iPS cell fibers immediately after the start of culture (Day 0) and 12 days after the start of culture (Day 12) when the density of human iPS cells at the start of culture is 1 × 10 6 [cells / mL] (in order from the left side). , Photographs of Day 0 and Day 12) are shown.
このように、実験例において、ヒトｉＰＳ細胞は、中空マイクロファイバ内で培養され、増殖し、凝集する。これにより、ヒトｉＰＳ細胞が凝集した俵型や紐状の細胞塊であって、断面形状及び外径が中空マイクロファイバによって制御された細胞塊を形成することができた。 Thus, in experimental examples, human iPS cells are cultured, proliferated, and aggregated in hollow microfibers. As a result, it was possible to form a bale-shaped or string-shaped cell mass in which human iPS cells aggregated, and a cell mass whose cross-sectional shape and outer diameter were controlled by hollow microfibers.
続いて、実験例では、培養されたヒトｉＰＳ細胞の回収が行われた。なお、これ以降に示される実験例においては、１種類のヒトｉＰＳ細胞、すなわち、４０９Ｂ２のみが使用されている。これは、４０９Ｂ２は、京都大学で樹立された一般的なヒトｉＰＳ細胞であって、ゲノムへの遺伝子挿入がないのでヒト受精卵から樹立されるヒトＥＳ細胞に近く、ヒト多能性幹細胞全般のモデルになるからである。 Subsequently, in the experimental example, the cultured human iPS cells were recovered. In the experimental examples shown below, only one type of human iPS cell, that is, 409B2 is used. This is because 409B2 is a general human iPS cell established at Kyoto University, and since there is no gene insertion into the genome, it is close to a human ES cell established from a fertilized human egg, and is a general human pluripotent stem cell. Because it becomes a model.
図６は本実施の形態におけるヒトｉＰＳ細胞の回収工程を示す写真、図７は本実施の形態におけるＤａｙ４のヒトｉＰＳ細胞の生存率を示すグラフ、図８は本実施の形態におけるヒトｉＰＳ細胞の増殖率を示すグラフ、図９は本実施の形態におけるＤａｙ４のヒトｉＰＳ細胞の増殖率とコラーゲンゲル濃度及び細胞密度との関係を示すグラフである。 FIG. 6 is a photograph showing the recovery process of human iPS cells in the present embodiment, FIG. 7 is a graph showing the survival rate of human iPS cells of Day 4 in the present embodiment, and FIG. 8 is a graph showing the survival rate of human iPS cells in the present embodiment. The graph showing the growth rate, FIG. 9, is a graph showing the relationship between the growth rate of human iPS cells of Day 4 and the collagen gel concentration and the cell density in the present embodiment.
中空マイクロファイバ内で培養されたヒトｉＰＳ細胞を回収する場合、図６に示されるように、アルギン酸リアーゼによって中空マイクロファイバのシェル部分を構成するアルギン酸ゲルを溶かし、ヒトｉＰＳ細胞が凝集した俵型や紐状の細胞塊を回収した。すなわち、中空マイクロファイバを溶融して細胞塊を回収した。続いて、アキュターゼによって回収した細胞塊において、細胞同士の結合を乖離させた。図６には、左側から順に、中空マイクロファイバ内で培養されたヒトｉＰＳ細胞の写真、アルギン酸リアーゼによる５〔ｍｉｎ〕の処理の後に中空マイクロファイバのシェル部分を構成するアルギン酸ゲルが溶けた状態のヒトｉＰＳ細胞の細胞塊の写真、及び、アキュターゼ（細胞乖離ならばアキュターゼでなくてもよい）による５〔ｍｉｎ〕の処理の後に細胞同士の結合が乖離したヒトｉＰＳ細胞の写真が示されている。 When recovering human iPS cells cultured in hollow microfibers, as shown in FIG. 6, alginate gel constituting the shell portion of the hollow microfibers is dissolved by alginate lyase, and human iPS cells are aggregated in a bale shape. A string-shaped cell mass was collected. That is, the hollow microfiber was melted and the cell mass was collected. Subsequently, in the cell mass recovered by Accutase, the binding between cells was dissociated. FIG. 6 shows photographs of human iPS cells cultured in hollow microfibers in order from the left side, in which the alginate gel constituting the shell portion of the hollow microfibers was melted after treatment with alginate lyase for 5 [min]. A photograph of a cell mass of human iPS cells and a photograph of human iPS cells in which cell-cell binding is dissociated after 5 [min] treatment with acutase (which does not have to be acutase if cell dissociation) are shown are shown. ..
このようにして回収されたヒトｉＰＳ細胞の生存率は、図７に示されるように、９０〔％〕前後と高いことが確認された。図７においては、縦軸に培養開始から４日後（Ｄａｙ４）のヒトｉＰＳ細胞の生存率が示され、横軸にコア部分の種類毎のヒトｉＰＳ細胞の密度が示されている。コア部分の種類、すなわち、ヒトｉＰＳ細胞とともに中空マイクロファイバ内に収容されたものの種類は、左側から順に、アルギン酸ゲル（Ａｌｇ）、液体培地（Ｈｏｌｌｏｗ）、マトリゲル（ＭＧ）及びコラーゲンゲル（Ｃｏｌ）である。また、培養開始時のヒトｉＰＳ細胞の密度は、コア部分の各種類毎に、１×１０7 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕及び１×１０8 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕である。 As shown in FIG. 7, it was confirmed that the survival rate of the human iPS cells recovered in this way was as high as around 90 [%]. In FIG. 7, the vertical axis shows the viability of human iPS cells 4 days after the start of culture (Day 4), and the horizontal axis shows the density of human iPS cells for each type of core portion. The types of core parts, that is, those housed in hollow microfibers together with human iPS cells, are, in order from the left side, alginate gel (Alg), liquid medium (Hollow), matrigel (MG) and collagen gel (Col). is there. The density of human iPS cells at the start of culture is 1 × 10 7 [cells / mL] and 1 × 10 8 [cells / mL] for each type of core portion.
また、図８に示されるように、コア部分の種類がコラーゲンゲルである場合に、ヒトｉＰＳ細胞の増殖率が高くなることが確認された。図８においては、縦軸には、Ｄａｙ０を１とした場合の増殖倍率が示され、横軸には、図７と同様に、コア部分の種類毎のヒトｉＰＳ細胞の密度が示されている。 Further, as shown in FIG. 8, it was confirmed that the proliferation rate of human iPS cells is high when the type of the core portion is collagen gel. In FIG. 8, the vertical axis shows the proliferation ratio when Day 0 is 1, and the horizontal axis shows the density of human iPS cells for each type of core portion, as in FIG. 7. ..
そこで、図９に示されるように、中空マイクロファイバ内に収容されたコラーゲンゲルの濃度の変化に対応するヒトｉＰＳ細胞の増殖率の変化が確認された。図９においては、縦軸には、図８と同様に、Ｄａｙ０を１とした場合の増殖倍率が示され、横軸には、ヒトｉＰＳ細胞の密度毎のコラーゲンゲルの濃度が示されている。培養開始時のヒトｉＰＳ細胞の密度は、左側から順に、１×１０7 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕及び１×１０8 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕である。また、コラーゲンゲルの濃度は、ヒトｉＰＳ細胞の密度毎に、０〔ｍｇ／ｍＬ〕、１〔ｍｇ／ｍＬ〕及び４〔ｍｇ／ｍＬ〕である。なお、コラーゲンゲルの濃度が０〔ｍｇ／ｍＬ〕という状態は、コア部分の種類が液体培地（Ｈｏｌｌｏｗ）である状態と同じである。 Therefore, as shown in FIG. 9, a change in the proliferation rate of human iPS cells corresponding to a change in the concentration of collagen gel contained in the hollow microfiber was confirmed. In FIG. 9, the vertical axis shows the growth ratio when Day 0 is 1, and the horizontal axis shows the collagen gel concentration for each density of human iPS cells. .. The density of human iPS cells at the start of culture is 1 × 10 7 [cells / mL] and 1 × 10 8 [cells / mL] in order from the left side. The collagen gel concentration is 0 [mg / mL], 1 [mg / mL] and 4 [mg / mL] for each density of human iPS cells. The state where the collagen gel concentration is 0 [mg / mL] is the same as the state where the type of the core portion is a liquid medium (Hollow).
図９に示されるように、コラーゲンゲルの濃度が０〜４〔ｍｇ／ｍＬ〕の範囲において、ヒトｉＰＳ細胞の増殖が確認された。また、コラーゲンゲルの濃度が１〔ｍｇ／ｍＬ〕である場合に増殖率が最も高くなることが確認された。 As shown in FIG. 9, the proliferation of human iPS cells was confirmed in the collagen gel concentration range of 0 to 4 [mg / mL]. It was also confirmed that the growth rate was highest when the collagen gel concentration was 1 [mg / mL].
続いて、実験例では、ヒトｉＰＳ細胞ファイバからヒトｉＰＳ細胞ファイバへの継代が行われた。 Subsequently, in the experimental example, the passage from the human iPS cell fiber to the human iPS cell fiber was performed.
図１０は本実施の形態におけるヒトｉＰＳ細胞の増殖率と培養日数との関係を示すグラフ、図１１は本実施の形態におけるヒトｉＰＳ細胞の増殖率と継代のタイミングとの関係を示すグラフ、図１２は本実施の形態における４日おきに継代を繰り返して培養したヒトｉＰＳ細胞の増殖率と培養日数との関係を示すグラフ、図１３は本実施の形態における１ヶ月以上培養されたヒトｉＰＳ細胞の核型を示す写真、図１４は本実施の形態における１ヶ月以上培養されたヒトｉＰＳ細胞の未分化マーカーを示す写真である。 FIG. 10 is a graph showing the relationship between the proliferation rate of human iPS cells and the number of culture days in the present embodiment, and FIG. 11 is a graph showing the relationship between the proliferation rate of human iPS cells and the timing of passage in the present embodiment. FIG. 12 is a graph showing the relationship between the proliferation rate of human iPS cells cultured by repeating passage every 4 days and the number of days of culture in the present embodiment, and FIG. 13 is a graph showing the relationship between the number of days of culture and FIG. A photograph showing the nuclei of iPS cells, FIG. 14 is a photograph showing an undifferentiated marker of human iPS cells cultured for 1 month or longer in the present embodiment.
ヒトｉＰＳ細胞ファイバからヒトｉＰＳ細胞ファイバへの継代は、図６に示されるような回収工程によって回収されたヒトｉＰＳ細胞を希釈し、新たな中空マイクロファイバ内に封入することにより、行われた。この場合、中空マイクロファイバ内に、ヒトｉＰＳ細胞とともに、収容されたものは、１〔ｍｇ／ｍＬ〕のコラーゲンゲルである。 The passage from the human iPS cell fiber to the human iPS cell fiber was carried out by diluting the human iPS cells recovered by the recovery step as shown in FIG. 6 and encapsulating them in a new hollow microfiber. .. In this case, what is contained in the hollow microfiber together with the human iPS cells is 1 [mg / mL] collagen gel.
図１０に示されるように、増殖されたヒトｉＰＳ細胞の細胞数は、Ｄａｙ１で一旦低下した後、Ｄａｙ２で初期細胞数にまで復帰し、Ｄａｙ４で大きく上昇し、Ｄａｙ６で最大となることが確認された。図１０においては、縦軸には、Ｄａｙ０を１とした場合の増殖倍率が示され、横軸には、増殖開始からの経過日数が示されている。 As shown in FIG. 10, it was confirmed that the number of proliferated human iPS cells decreased once on Day 1, then returned to the initial number on Day 2, increased significantly on Day 4, and reached the maximum on Day 6. Was done. In FIG. 10, the vertical axis shows the growth ratio when Day 0 is 1, and the horizontal axis shows the number of days elapsed from the start of growth.
そこで、最適な継代のタイミングが、Ｄａｙ４以降の範囲で検討された。そして、図１１に示されるように、Ｄａｙ４以降では継代後の増殖率が低下することが判明したので、最適な継代のタイミングはＤａｙ４である、と判断された。図１１においては、縦軸には、Ｄａｙ０を１とした場合の増殖倍率が示され、横軸には、継代のタイミング毎の継代前の増殖期間及び継代後の増殖期間が示されている。継代のタイミング毎の継代前の増殖期間及び継代後の増殖期間は、左側から順に、継代のタイミングがＤａｙ４の場合にＤａｙ０〜４及びＤａｙ４〜８、継代のタイミングがＤａｙ６の場合にＤａｙ０〜６及びＤａｙ６〜１２、継代のタイミングＤａｙ８の場合にＤａｙ０〜８及びＤａｙ８〜１６である。また、黒地のバーグラフは継代前の増殖率を示し、白地のバーグラフは継代後の増殖率を示している。 Therefore, the optimum timing of the passage was examined in the range after Day 4. Then, as shown in FIG. 11, since it was found that the proliferation rate after passage decreased after Day 4, it was determined that the optimum passage timing was Day 4. In FIG. 11, the vertical axis shows the growth rate when Day 0 is 1, and the horizontal axis shows the growth period before passage and the growth period after passage for each passage timing. ing. The growth period before passage and the growth period after passage for each passage timing are, in order from the left side, when the passage timing is Day 4, Day 0 to 4 and Day 4 to 8, and when the passage timing is Day 6. Days 0 to 6 and Days 6 to 12, and in the case of the timing Day 8 of the passage, Days 0 to 8 and Days 8 to 16. The black bar graph shows the growth rate before passage, and the white bar graph shows the growth rate after passage.
そして、このような継代を繰り返すことによって、図１２に示されるように、長期に亘り、具体的には、１ヶ月以上の期間に亘り、効率的にヒトｉＰＳ細胞の増殖が行われることが確認された。図１２においては、縦軸には、Ｄａｙ０を１とした場合の増殖倍率が示され、横軸には、増殖開始からの経過日数が示されている。 Then, by repeating such passages, as shown in FIG. 12, human iPS cells can be efficiently proliferated over a long period of time, specifically, over a period of one month or longer. confirmed. In FIG. 12, the vertical axis shows the growth ratio when Day 0 is 1, and the horizontal axis shows the number of days elapsed from the start of growth.
また、このような継代を繰り返し、長期に亘って、具体的には、５４日に亘って培養されたヒトｉＰＳ細胞の核型の写真が、図１３に示されている。これにより、５４日に亘って培養されたヒトｉＰＳ細胞が正常な核型を示すことが確認された。 In addition, a photograph of the karyotype of human iPS cells cultured for a long period of time, specifically for 54 days, by repeating such passages is shown in FIG. This confirmed that human iPS cells cultured for 54 days showed a normal karyotype.
さらに、図１４には、１ヶ月以上に亘って培養されたヒトｉＰＳ細胞の未分化マーカーの写真が示されている。なお、図１４において、左側の縦１列に並んだ写真は、ＲＴ−ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応））による未分化マーカーを示し、右側の縦２列に並んだ写真は、ＩＣＣ及びＡＰ（アルカリホスターゼ）染色による未分化マーカーを示している。これにより、１ヶ月以上に亘って培養されたヒトｉＰＳ細胞において、未分化マーカーの発現が維持されていることが確認された。 Further, FIG. 14 shows a photograph of an undifferentiated marker of human iPS cells cultured for 1 month or longer. In FIG. 14, the photographs arranged in the left vertical column show undifferentiated markers by RT-PCR (real-time PCR (polymerase chain reaction)), and the photographs arranged in the right vertical column show ICC and AP. It shows an undifferentiated marker by (alkali hostase) staining. From this, it was confirmed that the expression of the undifferentiated marker was maintained in the human iPS cells cultured for 1 month or longer.
続いて、実験例では、長期に亘って培養されたヒトｉＰＳ細胞の分化誘導培地での培養が行われた。 Subsequently, in the experimental example, human iPS cells cultured for a long period of time were cultured in a differentiation-inducing medium.
図１５は本実施の形態における分化誘導中の中空マイクロファイバを示す写真、図１６は本実施の形態におけるヒトｉＰＳ細胞の自発的な空洞化を示す写真、図１７は本実施の形態における１ヶ月以上培養後、分化誘導されたヒトｉＰＳ細胞が三胚葉に分化することを示す写真、図１８は本実施の形態におけるヒトｉＰＳ細胞が三次元分化誘導されることを外胚葉マーカー免疫染色で示す写真、図１９は本実施の形態における凍結保存された後に解凍されたヒトｉＰＳ細胞を示す写真、図２０は本実施の形態における凍結保存された後に解凍されたヒトｉＰＳ細胞の生存率を示すグラフ、図２１は本実施の形態における凍結保存された後に解凍されたヒトｉＰＳ細胞が増殖することを示す写真である。 FIG. 15 is a photograph showing the hollow microfiber during differentiation induction in the present embodiment, FIG. 16 is a photograph showing the spontaneous cavitation of human iPS cells in the present embodiment, and FIG. 17 is a photograph showing the spontaneous cavitation of human iPS cells in the present embodiment. Photograph showing that the differentiation-induced human iPS cells differentiate into three embryos after the above culture, FIG. 18 is a photograph showing that the human iPS cells in the present embodiment are induced to three-dimensional differentiation by ectoderm marker immunostaining. FIG. 19 is a photograph showing human iPS cells thawed after cryopreservation in the present embodiment, and FIG. 20 is a graph showing the viability of human iPS cells thawed after cryopreservation in the present embodiment. FIG. 21 is a photograph showing the proliferation of human iPS cells thawed after cryopreservation in the present embodiment.
前述のような継代によって１ヶ月以上に亘って培養されたヒトｉＰＳ細胞は、中空マイクロファイバ内に収容されたままで、分化誘導培地（２０〔％〕のＦＳＢ（ウシ胎児血清）を含むＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地））内で培養することによって、図１５に示されるように、中空マイクロファイバの形状のままで分化誘導することができることが確認された。また、図１６に示されるように、内部が自発的な空洞化（内皮細胞系の分化と考えられる）を行うことがあることも確認された。 Human iPS cells cultured for 1 month or longer by passage as described above are kept in hollow microfibers and contain DMEM (20%) of FSB (fetal bovine serum) in a differentiation-inducing medium. It was confirmed that differentiation can be induced in the shape of hollow microfibers as shown in FIG. 15 by culturing in Dalveco-modified Eagle's medium)). It was also confirmed that, as shown in FIG. 16, the inside may undergo spontaneous cavitation (which is considered to be differentiation of the endothelial cell line).
さらに、図１７及び１８に示されるように、分化誘導されたヒトｉＰＳ細胞が三胚葉のマーカーを示すことが確認され、当初のヒトｉＰＳ細胞と同様に生体のいずれの細胞にも分化することができる能力、すなわち、分化多能性（Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を示すことが確認された。なお、図１７には、左側から順に、外胚葉のＴｕｊ１マーカー、中胚葉のαＳＭＡマーカー及び内胚葉のＡＦＰマーカーの写真が示されている。また、図１８には、三次元的な外胚葉（神経）マーカーの写真が示されている。 Furthermore, as shown in FIGS. 17 and 18, it was confirmed that the differentiation-induced human iPS cells show markers of the three germ layers, and it is possible to differentiate into any cells in the living body in the same manner as the original human iPS cells. It was confirmed that it exhibits the ability to be capable of, that is, pluripotency. In addition, in FIG. 17, photographs of the Tuj1 marker of the ectoderm, the αSMA marker of the mesoderm, and the AFP marker of the endoderm are shown in order from the left side. In addition, FIG. 18 shows a photograph of a three-dimensional ectoderm (nerve) marker.
ところで、従来の細胞培養方法によって培養されたヒトｉＰＳ細胞は、培養皿から剥がした後に遠心処理を施してペレットにし、細胞保存液に懸濁して凍結する必要がある。これに対して、この実験例で培養されたヒトｉＰＳ細胞は、中空マイクロファイバ内に収容されたままで直接細胞保存液に浸し、凍結することによって保存することができた。図１９には、このようにして凍結して保存された中空マイクロファイバ内に収容されたままのヒトｉＰＳ細胞を融解（解凍）した状態の写真が示されている。なお、図１９に示されるのは、融解直後の状態である。 By the way, human iPS cells cultured by a conventional cell culture method need to be peeled off from a culture dish, subjected to centrifugation to be pelletized, suspended in a cell preservation solution, and frozen. On the other hand, the human iPS cells cultured in this experimental example could be preserved by directly immersing them in a cell preservation solution while being contained in hollow microfibers and freezing them. FIG. 19 shows a photograph of human iPS cells still contained in the hollow microfiber frozen and stored in this way in a thawed (thawed) state. It should be noted that what is shown in FIG. 19 is the state immediately after melting.
また、このようにして融解されたヒトｉＰＳ細胞の生存率は、図２０に示されるように、従来の細胞培養方法によって培養され、凍結され、融解されたヒトｉＰＳ細胞の生存率と同等であることが確認された。図２０において、縦軸には、凍結前を１とした場合の生存率が示され、２Ｄとして、従来の細胞培養方法によって培養され、凍結され、融解されたヒトｉＰＳ細胞の生存率が示され、３Ｄとして、この実験例で培養され、中空マイクロファイバ内に収容されたままで凍結され、融解されたヒトｉＰＳ細胞の生存率が示されている。 Further, the viability of the human iPS cells thawed in this manner is equivalent to the viability of the human iPS cells cultured, frozen and thawed by a conventional cell culture method, as shown in FIG. It was confirmed that. In FIG. 20, the vertical axis shows the survival rate when 1 is before freezing, and 2D shows the survival rate of human iPS cells cultured, frozen, and thawed by a conventional cell culture method. As 3D, the viability of human iPS cells cultured in this experimental example, frozen and thawed while housed in hollow microfibers is shown.
さらに、このようにして凍結して保存された中空マイクロファイバ内に収容されたままで融解されたヒトｉＰＳ細胞は、そのまま培養されることで増殖することが確認された。図２１には、このようにして培養されて増殖した中空マイクロファイバ内に収容されたままのヒトｉＰＳ細胞の写真が示されている。なお、図２１に示されるのは、融解から４日後の状態である。 Furthermore, it was confirmed that the human iPS cells thawed while being contained in the hollow microfiber frozen and stored in this way proliferate by being cultured as they are. FIG. 21 shows a photograph of human iPS cells still housed in hollow microfibers cultured and proliferated in this way. It should be noted that what is shown in FIG. 21 is the state 4 days after melting.
このように、本実施の形態における中空マイクロファイバを用いた細胞培養方法は、プライム型多能性幹細胞を内部に含む中空マイクロファイバを製造する工程と、プライム型多能性幹細胞を中空マイクロファイバの内部で培養し、増殖させ、凝集させる工程と、を含む方法である。 As described above, the cell culture method using the hollow microfiber in the present embodiment includes a step of producing a hollow microfiber containing prime-type pluripotent stem cells inside and a step of using the prime-type pluripotent stem cell in the hollow microfiber. It is a method including a step of culturing, growing, and aggregating internally.
これにより、プライム型多能性幹細胞を容易に、短時間で、高い増殖率で増殖させることができるとともに、過剰な凝集に起因する細胞死を避けることができる。 As a result, prime-type pluripotent stem cells can be easily proliferated at a high proliferation rate in a short time, and cell death due to excessive aggregation can be avoided.
また、凝集したプライム型多能性幹細胞は、断面形状及び外径が中空マイクロファイバによって制御された細胞塊となる。したがって、細胞塊の形状及び大きさを容易に制御することができ、過剰な凝集に起因する細胞死を避けつつ、プライム型多能性幹細胞を高い増殖率で増殖させることができる。 In addition, the aggregated prime-type pluripotent stem cells become a cell mass whose cross-sectional shape and outer diameter are controlled by hollow microfibers. Therefore, the shape and size of the cell mass can be easily controlled, and prime-type pluripotent stem cells can be proliferated at a high proliferation rate while avoiding cell death due to excessive aggregation.
さらに、プライム型多能性幹細胞は、コラーゲンゲルとともに、中空マイクロファイバの内部に収容される。この場合、極めて高い増殖率で、プライム型多能性幹細胞を増殖させることができる。 In addition, prime pluripotent stem cells, along with collagen gel, are housed inside hollow microfibers. In this case, prime-type pluripotent stem cells can be proliferated at an extremely high proliferation rate.
さらに、中空マイクロファイバを用いた細胞培養方法は、中空マイクロファイバを溶融し、プライム型多能性幹細胞を回収する工程を更に含む方法である。したがって、増殖させ、凝集させたプライム型多能性幹細胞を、容易に、効率的に回収することができる。 Further, the cell culture method using hollow microfiber is a method further including a step of melting the hollow microfiber and recovering prime-type pluripotent stem cells. Therefore, the proliferated and aggregated prime-type pluripotent stem cells can be easily and efficiently recovered.
さらに、プライム型多能性幹細胞は、凝集した状態で回収された後、細胞同士の結合が乖離される。したがって、回収されたプライム型多能性幹細胞を各種の用途で容易に利用することができる。 Furthermore, after the prime-type pluripotent stem cells are collected in an aggregated state, the binding between the cells is broken. Therefore, the recovered prime-type pluripotent stem cells can be easily used for various purposes.
さらに、中空マイクロファイバを用いた細胞培養方法は、回収されたプライム型多能性幹細胞を内部に含む中空マイクロファイバを製造することによって、プライム型多能性幹細胞を内部に含む中空マイクロファイバを継代する工程を更に含む方法である。これにより、プライム型多能性幹細胞を長期間に亘って効率的に増殖させることができ、大量に増殖させることができる。 Furthermore, in the cell culture method using hollow microfibers, the hollow microfibers containing the recovered prime-type pluripotent stem cells are produced, thereby succeeding the hollow microfibers containing the prime-type pluripotent stem cells inside. It is a method further including a substitute step. As a result, prime-type pluripotent stem cells can be efficiently proliferated over a long period of time, and can be proliferated in large quantities.
さらに、中空マイクロファイバを用いた細胞培養方法は、プライム型多能性幹細胞を内部に含む中空マイクロファイバを凍結して、プライム型多能性幹細胞を中空マイクロファイバ内で保存する工程を更に含む方法である。これにより、プライム型多能性幹細胞を容易に保存することができるとともに、必要なときに、容易に再利用することができる。 Further, the cell culture method using hollow microfibers further includes a step of freezing the hollow microfibers containing prime-type pluripotent stem cells inside and preserving the prime-type pluripotent stem cells in the hollow microfibers. Is. As a result, prime-type pluripotent stem cells can be easily preserved and easily reused when needed.
さらに、中空マイクロファイバを用いた細胞培養方法は、プライム型多能性幹細胞を内部に含む中空マイクロファイバを培地に浸して、プライム型多能性幹細胞を中空マイクロファイバ内で分化誘導する工程を更に含む方法である。これにより、プライム型多能性幹細胞を各種の細胞に容易に分化誘導することができる。 Further, in the cell culture method using hollow microfibers, a step of immersing the hollow microfibers containing prime-type pluripotent stem cells in a medium to induce differentiation of the prime-type pluripotent stem cells in the hollow microfibers is further performed. It is a method to include. As a result, prime-type pluripotent stem cells can be easily induced to differentiate into various cells.
なお、本明細書の開示は、好適で例示的な実施の形態に関する特徴を述べたものである。ここに添付された特許請求の範囲内及びその趣旨内における種々の他の実施の形態、修正及び変形は、当業者であれば、本明細書の開示を総覧することによって、当然に考え付くことである。 It should be noted that the disclosure herein describes features relating to preferred and exemplary embodiments. Various other embodiments, modifications and modifications within the scope and purpose of the claims attached herein can be naturally conceived by those skilled in the art by reviewing the disclosure of the present specification. is there.
本開示は、細胞培養方法及びマイクロファイバに適用することができる。 The present disclosure can be applied to cell culture methods and microfibers.
Claims (8)
（ａ）プライム型多能性幹細胞を内部に含む管状のマイクロファイバを製造する第１工程と、
（ｂ）前記プライム型多能性幹細胞を前記マイクロファイバの内部で培養し、分化多能性を維持した状態で前記プライム型多能性幹細胞の断面形状及び外径が前記マイクロファイバによって制御された細胞塊になるまで増殖させ、凝集させる第２工程と、
を含む、細胞培養方法。 It is a cell culture method
(A) The first step of producing a tubular microfiber containing prime-type pluripotent stem cells inside, and
(B) The prime-type pluripotent stem cells were cultured inside the microfibers, and the cross-sectional shape and outer diameter of the prime-type pluripotent stem cells were controlled by the microfibers while maintaining pluripotency. The second step of growing and aggregating until it becomes a cell mass,
A cell culture method, including.
培養開始時の前記ヒトｉＰＳ細胞の密度は、１×１０7 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕以上である請求項１又は２に記載の細胞培養方法。 The prime-type pluripotent stem cells are human iPS cells.
The cell culture method according to claim 1 or 2, wherein the density of the human iPS cells at the start of culture is 1 × 10 7 [cells / mL] or more.
前記プライム型多能性幹細胞は、分化多能性が維持された状態で、前記プライム型多能性幹細胞の断面形状及び外径が前記マイクロファイバによって制御された細胞塊を形成している、マイクロファイバ。 Tubular microfiber containing prime-type pluripotent stem cells inside
The prime-type pluripotent stem cells form a cell mass in which the cross-sectional shape and outer diameter of the prime-type pluripotent stem cells are controlled by the microfibers while maintaining pluripotency. fiber.
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