JP2020156443A - Cell culture substrate, and differentiation control method of mesenchymal stem cell - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞培養用基板、特に間葉系幹細胞、組織幹細胞および前駆細胞からなる群より選択される幹細胞を培養するための細胞培養用基板に関する。本発明はまた、当該細胞培養用基板上で間葉系幹細胞、組織幹細胞および前駆細胞からなる群より選択される幹細胞を培養することを含む、当該幹細胞の分化制御方法、特に当該幹細胞の分化を抑制する方法、に関する。 The present invention relates to a cell culture substrate, particularly a cell culture substrate for culturing stem cells selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, tissue stem cells and progenitor cells. The present invention also comprises culturing stem cells selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, tissue stem cells and progenitor cells on the cell culture substrate, a method for controlling the differentiation of the stem cells, particularly the differentiation of the stem cells. Regarding the method of suppressing.
増殖能と分化能を有する間葉系幹細胞は、再生医療やがん治療における細胞ソースとして期待されている。間葉系幹細胞は、接触している足場材料の弾性率に対して機械的シグナル伝達経路を介して敏感に応答する（非特許文献１、２）。間葉系幹細胞の増殖・維持のために従来から使われている培養用のポリスチレンディッシュ、及び、細胞特性の評価観察のために使われるガラスは、いずれも骨芽細胞への分化が自発的に進んでしまう弾性率（＞１００ｋＰａ）である。そのため、現在の間葉系幹細胞の増殖培養条件は骨芽細胞への意図しない分化が誘導されて細胞の質の低下を引き起こしている可能性が危惧され、培養中の細胞の未分化性（品質）の維持に課題がある。間葉系幹細胞の増殖・維持培養中の自発的な骨芽細胞への分化を抑制するためには、細胞における機械的シグナル伝達を骨芽細胞抑制的な状態に保つ足場材料が求められる。 Mesenchymal stem cells, which have proliferative and differentiating abilities, are expected as a cell source in regenerative medicine and cancer treatment. Mesenchymal stem cells respond sensitively to the elastic modulus of the scaffold material in contact via a mechanical signal transduction pathway (Non-Patent Documents 1 and 2). Polystyrene dishes for culture, which have been conventionally used for the proliferation and maintenance of mesenchymal stem cells, and glass, which is used for evaluation and observation of cell characteristics, both spontaneously differentiate into osteoblasts. The elastic modulus (> 100 kPa) that advances. Therefore, it is feared that the current conditions for proliferation and culture of mesenchymal stem cells may induce unintended differentiation into osteoblasts and cause deterioration of cell quality, and the undifferentiated (quality) of the cells in culture. ) Is a problem to maintain. In order to suppress the spontaneous differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts during proliferation and maintenance culture, a scaffold material that maintains the mechanical signal transduction in the cells in an osteoblast-suppressing state is required.
機械的シグナル伝達を骨芽細胞抑制的な状態に保つために、以下の方法の有効性が報告されている。非特許文献１及び２は、（１）細胞をシリコーンやハイドロゲルなどの低弾性率（１０ｋＰａ程度）の足場材料で培養する方法を報告している。上記（１）の方法の課題として、ハイドロゲルの弾性率の不安定性が挙げられる。ハイドロゲルの弾性率は、温度、ｐＨ、イオン強度などにより容易に変化するために、運搬、保管、培養中の弾性率の維持が困難であるという課題がある。非特許文献３および４は、（２）マイクロコンタクトプリンティング法により固くて（＞１００ｋＰａ）平たい足場材料上に形成した狭小な細胞接着領域内部に細胞を閉じ込め、低弾性率表面に類似の骨芽細胞抑制的なシグナル伝達を誘起する方法を報告している。上記（２）の方法の課題として、細胞接着物質のパターニング表面は、細胞が分泌する細胞外マトリックスにより容易にパターンが崩れてしまうという課題が報告されている（非特許文献５）。また、非特許文献６は、固い樹脂であるポリカプロラクトンに１２０ｎｍ微細孔パターンを付与することで間葉系幹細胞の未分化性を維持できることを示している。 The following methods have been reported to be effective in keeping mechanical signal transduction in an osteoblast-suppressed state. Non-Patent Documents 1 and 2 report (1) a method of culturing cells in a scaffold material having a low elastic modulus (about 10 kPa) such as silicone or hydrogel. The problem of the method (1) above is the instability of the elastic modulus of the hydrogel. Since the elastic modulus of a hydrogel easily changes depending on temperature, pH, ionic strength, etc., there is a problem that it is difficult to maintain the elastic modulus during transportation, storage, and culturing. Non-Patent Documents 3 and 4 describe (2) osteoblasts that confine cells inside a narrow cell adhesion region formed on a flat scaffold material (> 100 kPa) formed by a microcontact printing method and resemble a low modulus surface. We report a method for inducing suppressive signal transduction. As a problem of the above method (2), it has been reported that the patterning surface of the cell adhesion substance is easily disintegrated by the extracellular matrix secreted by the cells (Non-Patent Document 5). Further, Non-Patent Document 6 shows that the undifferentiated state of mesenchymal stem cells can be maintained by imparting a 120 nm micropore pattern to polycaprolactone, which is a hard resin.
間葉系幹細胞の培養中の細胞の質を維持する観点から、間葉系幹細胞の増殖・維持培養中の自発的な骨芽細胞への分化を抑制するための方法や、間葉系幹細胞における機械的シグナル伝達を骨芽細胞抑制的な状態に保つための足場材料が求められている。 From the viewpoint of maintaining the quality of mesenchymal stem cells during culture, methods for suppressing the spontaneous differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts during proliferation and maintenance culture, and in mesenchymal stem cells There is a need for scaffolding materials to keep mechanical signal transduction in an osteoblast-suppressed state.
本発明は、細胞培養用基板を提供する。本発明は特に、細胞培養用基板、特に間葉系幹細胞、組織幹細胞および前駆細胞からなる群より選択される幹細胞を培養するための細胞培養用基板を提供する。本発明はまた、当該細胞培養用基板上で間葉系幹細胞、組織幹細胞および前駆細胞からなる群より選択される幹細胞を培養することを含む、当該幹細胞の分化制御方法、特に当該幹細胞の分化を抑制する方法、を提供する。 The present invention provides a substrate for cell culture. The present invention particularly provides a cell culture substrate, particularly a cell culture substrate for culturing stem cells selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, tissue stem cells and progenitor cells. The present invention also comprises culturing stem cells selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, tissue stem cells and progenitor cells on the cell culture substrate, a method for controlling the differentiation of the stem cells, particularly the differentiation of the stem cells. A method of suppressing is provided.
以上に鑑み、本件の発明者は、細胞培養用基板の微細構造の効果に注目し、研究を開始した。鋭意検討の結果、ドットパターンを有する細胞培養用基板上で間葉系幹細胞の培養を行った場合に、骨芽細胞への分化を抑制できることを見出し、さらに、間葉系幹細胞の分化を抑制することが可能なドットパターンのサイズを見出した。当該知見に基づいて、本発明は完成された。 In view of the above, the inventor of this case focused on the effect of the fine structure of the cell culture substrate and started the research. As a result of diligent studies, it was found that when mesenchymal stem cells were cultured on a cell culture substrate having a dot pattern, differentiation into osteoblasts could be suppressed, and further, differentiation of mesenchymal stem cells was suppressed. We have found the size of the dot pattern that is possible. Based on this finding, the present invention has been completed.
すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。
［１］ 間葉系幹細胞、組織幹細胞および前駆細胞からなる群より選択される幹細胞を培養するための細胞培養用基板であって、ドットパターンを有し、当該ドットパターンにおける各ドットの直径が５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であり、各ドットの配置間隔が５０ｎｍ以上４００ｎｍ以下である、前記細胞培養用基板。
That is, in one aspect, the present invention may be as follows.
[1] A cell culture substrate for culturing stem cells selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, tissue stem cells, and progenitor cells, which has a dot pattern, and the diameter of each dot in the dot pattern is 50 nm. The cell culture substrate, which is 200 nm or less and the arrangement interval of each dot is 50 nm or more and 400 nm or less.
［２］ ドットパターンにおける各ドットの高さが、５０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である、上記［１］に記載の細胞培養用基板。
［３］ 基板および／またはドットパターンの材質が、石英；ガラス；チタン、シリコン、金および白金からなる群より選択される金属、もしくはこれらいずれかの金属を含む合金；コバルト−クロム合金もしくはステンレス鋼；または、ポリスチレン、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリグリコール酸、ポリカーボネート、およびシクロオレフィンポリマーからなる群より選択されるプラスチック；である、上記［１］または［２］に記載の細胞培養用基板。
[2] The cell culture substrate according to the above [1], wherein the height of each dot in the dot pattern is 50 nm or more and 1000 nm or less.
[3] The material of the substrate and / or dot pattern is quartz; glass; a metal selected from the group consisting of titanium, silicon, gold and platinum, or an alloy containing any of these metals; cobalt-chromium alloy or stainless steel. The cell culture substrate according to the above [1] or [2], which is a plastic selected from the group consisting of polystyrene, polylactic acid, polycaprolactone, polyglycolic acid, polycarbonate, and cycloolefin polymer.
［４］ 細胞培養用基板であって、ドットパターンを有し、
（１）当該ドットパターンにおける各ドットの直径が５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であり、各ドットの配置間隔が５０ｎｍ以上４００ｎｍ以下であり、そして各ドットの高さが５０ｎｍ以上３００ｎｍ未満である；または
（２）当該ドットパターンにおける各ドットの直径が５０ｎｍ以上２００ｎｍ未満であり、そして各ドットの配置間隔が５０ｎｍ以上２００ｎｍ未満である；
前記細胞培養用基板。
[4] A substrate for cell culture, which has a dot pattern and has a dot pattern.
(1) The diameter of each dot in the dot pattern is 50 nm or more and 200 nm or less, the arrangement interval of each dot is 50 nm or more and 400 nm or less, and the height of each dot is 50 nm or more and less than 300 nm; or (2). The diameter of each dot in the dot pattern is 50 nm or more and less than 200 nm, and the spacing between the dots is 50 nm or more and less than 200 nm;
The cell culture substrate.
［５］ 間葉系幹細胞、組織幹細胞および前駆細胞からなる群より選択される幹細胞の分化を抑制する方法であって、ドットパターンを有する細胞培養用基板上で当該幹細胞を培養することを含み、当該ドットパターンにおける各ドットの直径が５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下、各ドットの配置間隔が５０ｎｍ以上４００ｎｍ以下である、前記方法。 [5] A method for suppressing the differentiation of stem cells selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, tissue stem cells and progenitor cells, which comprises culturing the stem cells on a cell culture substrate having a dot pattern. The method described above, wherein the diameter of each dot in the dot pattern is 50 nm or more and 200 nm or less, and the arrangement interval of each dot is 50 nm or more and 400 nm or less.
［６］ 細胞培養用基板上のドットパターンにおける各ドットの高さが、５０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である、上記［５］に記載の方法。
［７］ 基板および／またはドットパターンの材質が、石英；ガラス；チタン、シリコン、金および白金からなる群より選択される金属、もしくはこれらいずれかの金属を含む合金；コバルト−クロム合金もしくはステンレス鋼；または、ポリスチレン、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリグリコール酸、ポリカーボネート、およびシクロオレフィンポリマーからなる群より選択されるプラスチック；である、上記［５］または［６］に記載の方法。
[6] The method according to [5] above, wherein the height of each dot in the dot pattern on the cell culture substrate is 50 nm or more and 1000 nm or less.
[7] The material of the substrate and / or dot pattern is quartz; glass; a metal selected from the group consisting of titanium, silicon, gold and platinum, or an alloy containing any of these metals; cobalt-chromium alloy or stainless steel. The method according to [5] or [6] above, wherein the plastic is selected from the group consisting of polystyrene, polylactic acid, polycaprolactone, polyglycolic acid, polycarbonate, and cycloolefin polymer.
［８］ 幹細胞が間葉系幹細胞である、上記［５］〜［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］ 培養中の幹細胞の核上部アクチンの発達が抑制される、上記［５］〜［８］のいずれか一項に記載の方法。
[8] The method according to any one of the above [5] to [7], wherein the stem cell is a mesenchymal stem cell.
[9] The method according to any one of the above [5] to [8], wherein the development of upper nucleus actin of stem cells in culture is suppressed.
本発明は、間葉系幹細胞等の幹細胞の未分化性を維持しつつ当該幹細胞を培養可能な方法およびそのための細胞培養用基板を提供する点で有用である。 The present invention is useful in providing a method capable of culturing the stem cells while maintaining the undifferentiated state of the stem cells such as mesenchymal stem cells, and a cell culture substrate for that method.
以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
The present invention will be specifically described below, but the present invention is not limited thereto.
Unless otherwise defined herein, scientific and technical terms used in the context of the present invention shall have meanings commonly understood by those skilled in the art.
本明細書において、数値範囲を「下限値ｎ〜上限値ｙ」という表現で記載する場合、当該数値範囲は下限値ｎおよび上限値ｙを含む範囲である。すなわち、「下限値ｎ〜上限値ｙ」という記載は、下限値ｎ以上、上限値ｙ以下の数値範囲を表すものとする。 In the present specification, when the numerical range is described by the expression "lower limit value n to upper limit value y", the numerical value range is a range including the lower limit value n and the upper limit value y. That is, the description "lower limit value n to upper limit value y" represents a numerical range of the lower limit value n or more and the upper limit value y or less.
細胞培養用基板
一態様において本発明は、細胞培養用基板であって、ドットパターンを有し、当該ドットパターンにおける各ドットの直径が５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であり、各ドットの配置間隔が５０ｎｍ以上４００ｎｍ以下である、前記細胞培養用基板に関する。
In one aspect of the cell culture substrate , the present invention is a cell culture substrate, which has a dot pattern, the diameter of each dot in the dot pattern is 50 nm or more and 200 nm or less, and the arrangement interval of each dot is 50 nm or more and 400 nm. The following relates to the cell culture substrate.
別の態様において本発明は、細胞培養用基板であって、ドットパターンを有し、
（１）当該ドットパターンにおける各ドットの直径が５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であり、各ドットの配置間隔が５０ｎｍ以上４００ｎｍ以下であり、そして各ドットの高さが５０ｎｍ以上３００ｎｍ未満である；または
（２）当該ドットパターンにおける各ドットの直径が５０ｎｍ以上２００ｎｍ未満であり、そして各ドットの配置間隔が５０ｎｍ以上２００ｎｍ未満である；
前記細胞培養用基板に関する。
In another embodiment, the present invention is a cell culture substrate having a dot pattern.
(1) The diameter of each dot in the dot pattern is 50 nm or more and 200 nm or less, the arrangement interval of each dot is 50 nm or more and 400 nm or less, and the height of each dot is 50 nm or more and less than 300 nm; or (2). The diameter of each dot in the dot pattern is 50 nm or more and less than 200 nm, and the spacing between the dots is 50 nm or more and less than 200 nm;
The present invention relates to the cell culture substrate.
本明細書において、細胞培養用基板とは、細胞を培養可能な表面を有する基板を意味する。細胞を培養可能な表面は、平面であってもよく、曲面であってもよい。細胞培養用基板の形態は、細胞の培養が可能な形態であれば特に限定されないが、例えば、シャーレ、ディッシュ、マルチプレート、細胞培養フラスコ、細胞培養チューブ、などであってもよい。 As used herein, the cell culture substrate means a substrate having a surface on which cells can be cultured. The surface on which cells can be cultured may be a flat surface or a curved surface. The form of the cell culture substrate is not particularly limited as long as the cells can be cultured, but may be, for example, a petri dish, a dish, a multi-plate, a cell culture flask, a cell culture tube, or the like.
細胞培養用基板の材質は、細胞が増殖可能な基板の材質であれば特に限定されないが、例えば、当該技術分野において通常用いられる材質であってもよい。より具体的には、本発明の細胞培養用基板の材質は、石英；ガラス；チタン、シリコン（Si）、金および白金からなる群より選択される金属、もしくはこれらいずれかの金属を含む合金；コバルト−クロム合金もしくはステンレス鋼（鉄を主成分とし、クロムを10.5%以上含む合金鋼）または、ポリスチレン、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリグリコール酸、ポリカーボネート、およびシクロオレフィンポリマーからなる群より選択されるプラスチック；からなる群より選択することができる。 The material of the cell culture substrate is not particularly limited as long as it is the material of the substrate on which cells can proliferate, but may be, for example, a material usually used in the art. More specifically, the material of the cell culture substrate of the present invention is quartz; glass; a metal selected from the group consisting of titanium, silicon (Si), gold and platinum, or an alloy containing any of these metals; It is selected from the group consisting of cobalt-chromium alloy or stainless steel (alloy steel containing iron as a main component and containing 10.5% or more of chromium) or polystyrene, polylactic acid, polycaprolactone, polyglycolic acid, polycarbonate, and cycloolefin polymer. It can be selected from the group consisting of plastics.
本発明の細胞培養用基板は、ドットパターンを有する。ドットパターンは、一定の大きさを有する柱状構造が一定の配置間隔で規則的に多数配置された、柱状構造集合体を意味する。この柱状構造を本明細書においてドットと表記する。本発明の細胞培養用基板において、各ドットは、基板上に凸部として形成される。ドットは、柱状構造を有する構造体であればその形状は特に限定されず、円柱状、楕円柱状または多角柱状、好ましくは円柱状、であることができる。 The cell culture substrate of the present invention has a dot pattern. The dot pattern means an aggregate of columnar structures in which a large number of columnar structures having a certain size are regularly arranged at regular arrangement intervals. This columnar structure is referred to as a dot in the present specification. In the cell culture substrate of the present invention, each dot is formed as a convex portion on the substrate. The shape of the dots is not particularly limited as long as it is a structure having a columnar structure, and the dots may be columnar, elliptical or polygonal, preferably columnar.
細胞培養用基板上にドットパターンとして付与されるドットの材質は、細胞培養用基板の材質として上記したものであることができる。細胞培養用基板の材質とその上に付与されるドットの材質は、同じであってもよく、異なっていてもよい。好ましい態様において、細胞培養用基板の材質とその上に付与されるドットの材質は、同じである。 The material of the dots imparted as a dot pattern on the cell culture substrate can be the above-mentioned material as the material of the cell culture substrate. The material of the cell culture substrate and the material of the dots imparted on the substrate may be the same or different. In a preferred embodiment, the material of the cell culture substrate and the material of the dots imparted thereto are the same.
基板にドットパターンを付与する方法は、特に限定されず、基板およびドットパターンの材質に応じて、当該技術分野において公知の手法を用いて行うことができる。例えば、石英基板上に、石英のドットパターンを付与する場合、電子線リソグラフィ法及びドライエッチング法を用いてドットパターンを付与することができる。 The method of imparting the dot pattern to the substrate is not particularly limited, and can be performed by using a method known in the art depending on the material of the substrate and the dot pattern. For example, when a quartz dot pattern is applied on a quartz substrate, the dot pattern can be applied by using an electron beam lithography method and a dry etching method.
本明細書において、ドットの直径（ＤＦ）とは、ドットが円柱状の構造である場合は当該円柱の上面の円の直径を意味し、ドットが楕円柱状である場合は当該楕円柱の上面の楕円の長軸の長さを意味し、ドットが多角柱状である場合は当該多角柱の上面の多角形の対角線のうち最大のものの長さ（但し、多角柱が三角柱である場合は、三角柱の上面の三角形の三辺のうちの最大のものの長さ）を意味する。本明細書において、ドットの配置間隔（ＤＩ）とは、ある柱状構造の端から隣接する柱状構造の端までの長さを意味する。ドットパターンがハニカム構造（すなわち、ドットパターンの繰り返し構造が六角形であり、六角形の中心及び各頂点にドットが存在する構造）である場合、ハニカム構造を構成する六角形の一辺（当該六角形が正六角形ではない場合は、当該六角形の最も短い辺）の頂点部分の２つの柱状構造の端から端までの長さがＤＩとなる。ドットパターンがグリッド構造（すなわち、ドットパターンの繰り返し構造が四角形であり、四角形の各頂点にドットが存在する構造）である場合、グリッド構造を構成する四角形の一辺（当該四角形が長方形または平行四辺形の場合は短辺）の頂点部分の２つの柱状構造の端から端までの長さがＤＩとなる。ドットパターンがランダムドットパターンである場合、ＤＩは柱状構造の端から隣接する柱状構造の端までの間隔の平均値である。本明細書において、ドットの高さ（ＤＨ）とは、柱状構造の高さ方向の長さを意味する。 In the present specification, the dot diameter (DF) means the diameter of the circle on the upper surface of the column when the dot has a columnar structure, and when the dot has an elliptical columnar structure, the diameter of the circle on the upper surface of the elliptical column. It means the length of the long axis of the ellipse, and when the dot is a polygonal prism, the length of the largest diagonal of the polygon on the upper surface of the polygonal prism (however, when the polygonal prism is a triangular prism, the length of the triangular prism The length of the largest of the three sides of the top triangle). As used herein, the dot placement interval (DI) means the length from the end of a columnar structure to the end of an adjacent columnar structure. When the dot pattern has a honeycomb structure (that is, the repeating structure of the dot pattern is a hexagon, and dots are present at the center and each vertex of the hexagon), one side of the hexagon constituting the honeycomb structure (the hexagon). If is not a regular hexagon, the length from end to end of the two columnar structures at the apex of the hexagon) is DI. When the dot pattern has a grid structure (that is, the repeating structure of the dot pattern is a quadrangle and dots exist at each vertex of the quadrangle), one side of the quadrangle constituting the grid structure (that quadrangle is a rectangle or a parallelogram). In the case of, the length from one end to the other of the two columnar structures at the apex of the short side) is DI. When the dot pattern is a random dot pattern, DI is the average value of the intervals from the end of the columnar structure to the end of the adjacent columnar structure. As used herein, the dot height (DH) means the length of the columnar structure in the height direction.
本発明の細胞培養用基板上のドットパターンにおけるドットの直径の下限は、５０ｎｍ以上、７５ｎｍ以上、または１００ｎｍ以上であることができる。ドットの直径の上限は、２００ｎｍ以下、２００ｎｍ未満、１７５ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、または１２５ｎｍ以下であることができる。ドットの直径の好ましい範囲は、例えば、５０〜２００ｎｍ、５０ｎｍ以上２００ｎｍ未満、５０〜１７５ｎｍ、７５〜１７５ｎｍ、７５〜１５０ｎｍ、または７５〜１２５ｎｍであってもよい。 The lower limit of the dot diameter in the dot pattern on the cell culture substrate of the present invention can be 50 nm or more, 75 nm or more, or 100 nm or more. The upper limit of the dot diameter can be 200 nm or less, less than 200 nm, 175 nm or less, 150 nm or less, or 125 nm or less. The preferred range of dot diameters may be, for example, 50-200 nm, 50 nm or more and less than 200 nm, 50-175 nm, 75-175 nm, 75-150 nm, or 75-125 nm.
本発明の細胞培養用基板上のドットパターンにおけるドットの配置間隔の下限は、５０ｎｍ以上、７５ｎｍ以上、または１００ｎｍ以上であることができる。ドットの配置間隔の上限は、４００ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、２５０ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、２００ｎｍ未満、または１７５ｎｍ以下であることができる。ドットの配置間隔の好ましい範囲は、例えば、５０〜４００ｎｍ、５０〜３００ｎｍ、５０〜２５０ｎｍ、５０〜２００ｎｍ、５０ｎｍ以上２００ｎｍ未満、５０〜１７５ｎｍ、７５〜１７５ｎｍ、７５〜１５０ｎｍ、または７５〜１２５ｎｍであってもよい。 The lower limit of the dot arrangement interval in the dot pattern on the cell culture substrate of the present invention can be 50 nm or more, 75 nm or more, or 100 nm or more. The upper limit of the dot arrangement interval can be 400 nm or less, 300 nm or less, 250 nm or less, 200 nm or less, less than 200 nm, or 175 nm or less. The preferred range of dot placement intervals is, for example, 50-400 nm, 50-300 nm, 50-250 nm, 50-200 nm, 50 nm or more and less than 200 nm, 50-175 nm, 75-175 nm, 75-150 nm, or 75-125 nm. You may.
本発明の細胞培養用基板上のドットパターンにおけるドットの高さの下限は、５０ｎｍ以上、７５ｎｍ以上、１００ｎｍ以上、１２５ｎｍ以上、または１５０ｎｍ以上、であることができる。ドットの高さの上限は、１０００ｎｍ以下、８００ｎｍ以下、７００ｎｍ以下、６００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、３００ｎｍ未満、２５０ｎｍ以下、または２００ｎｍ以下、であることができる。ドットの高さの好ましい範囲は、例えば、５０〜１０００ｎｍ、５０〜８００ｎｍ、５０〜７００ｎｍ、５０〜６００ｎｍ、５０〜４００ｎｍ、５０〜３００ｎｍ、５０ｎｍ以上３００ｎｍ未満、７５〜２５０ｎｍ、または１００〜２００ｎｍであってもよい。ドットの高さはまた、ドットの直径との比で決定してもよい。ドットの高さをドットの直径との比で決定する場合、ドットの高さ（ＤＨ）／ドットの直径（ＤＦ）は、例えば０．５〜５．０、０．５〜４．０、０．５〜３．０、０．７〜３．０、０．７〜２．０であってもよい。 The lower limit of the dot height in the dot pattern on the cell culture substrate of the present invention can be 50 nm or more, 75 nm or more, 100 nm or more, 125 nm or more, or 150 nm or more. The upper limit of the dot height can be 1000 nm or less, 800 nm or less, 700 nm or less, 600 nm or less, 500 nm or less, 400 nm or less, 300 nm or less, less than 300 nm, 250 nm or less, or 200 nm or less. The preferred range of dot height is, for example, 50-1000 nm, 50-800 nm, 50-700 nm, 50-600 nm, 50-400 nm, 50-300 nm, 50 nm or more and less than 300 nm, 75-250 nm, or 100-200 nm. You may. The height of the dots may also be determined by the ratio to the diameter of the dots. When the dot height is determined by the ratio to the dot diameter, the dot height (DH) / dot diameter (DF) is, for example, 0.5 to 5.0, 0.5 to 4.0, 0. .5-3.0, 0.7-3.0, 0.7-2.0 may be used.
本発明の細胞培養用基板は、間葉系幹細胞等の幹細胞を、分化を抑制した状態で培養できる点で有用である。したがって、本発明の細胞培養用基板は、間葉系幹細胞、組織幹細胞および前駆細胞からなる群より選択される幹細胞を培養するための細胞培養用基板であってもよい。好ましくは本発明の細胞培養用基板は、間葉系幹細胞を培養するための細胞培養用基板であってもよい。 The cell culture substrate of the present invention is useful in that stem cells such as mesenchymal stem cells can be cultured in a state in which differentiation is suppressed. Therefore, the cell culture substrate of the present invention may be a cell culture substrate for culturing stem cells selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, tissue stem cells and progenitor cells. Preferably, the cell culture substrate of the present invention may be a cell culture substrate for culturing mesenchymal stem cells.
間葉系幹細胞等の分化抑制方法
一態様において、本発明は、幹細胞の分化を抑制する方法であって、ドットパターンを有する細胞培養用基板上で当該幹細胞を培養することを含み、当該ドットパターンにおける各ドットの直径が５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下、各ドットの配置間隔が５０ｎｍ以上４００ｎｍ以下である、前記方法に関する。好ましくは、本発明の方法を適用する幹細胞は間葉系幹細胞、組織幹細胞および前駆細胞からなる群より選択される幹細胞（以下、本明細書において、「間葉系幹細胞等の幹細胞」または「間葉系幹細胞等」と表記する場合がある）であり、さらに好ましくは間葉系幹細胞である。
Method for Inhibiting Differentiation of Mesenchymal Stem Cells and the like In one embodiment, the present invention is a method for suppressing differentiation of stem cells, which comprises culturing the stem cells on a cell culture substrate having a dot pattern. The present invention relates to the above method, wherein the diameter of each dot is 50 nm or more and 200 nm or less, and the arrangement interval of each dot is 50 nm or more and 400 nm or less. Preferably, the stem cell to which the method of the present invention is applied is a stem cell selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, tissue stem cells and progenitor cells (hereinafter, "stem cells such as mesenchymal stem cells" or "mesenchymal stem cells" in the present specification. It may be referred to as "leaf stem cells, etc."), and more preferably mesenchymal stem cells.
本項目の方法に使用するドットパターンを有する細胞培養用基板は、上記「細胞培養用基板」の項目において記載した細胞培養用基板を用いることができる。細胞培養用基板およびドットパターンの材質、並びにドットパターンにおける各ドットの直径、配置間隔および高さ等の構成についても、上記「細胞培養用基板」の項目において記載したとおりである。 As the cell culture substrate having the dot pattern used in the method of this item, the cell culture substrate described in the above item "Cell culture substrate" can be used. The material of the cell culture substrate and the dot pattern, and the composition of the diameter, arrangement interval, height, etc. of each dot in the dot pattern are also as described in the above-mentioned "Cell culture substrate" item.
本項目の方法において、間葉系幹細胞等の幹細胞の培養は、培養基板または培養容器として本発明の細胞培養用基板を用いることを除いては、当業者に公知の間葉系幹細胞等の培養条件により培養することができる。 In the method of this item, the culture of stem cells such as mesenchymal stem cells is carried out by culturing mesenchymal stem cells or the like known to those skilled in the art, except that the cell culture substrate of the present invention is used as a culture substrate or a culture vessel. It can be cultured depending on the conditions.
好ましい態様において、本項目の方法に使用するドットパターンを有する細胞培養用基板は、細胞外マトリックスまたは細胞外マトリックスを構成するタンパク質またはペプチドでコートされていてもよい。細胞培養用基板のコーティングに用いられるタンパク質は、例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン等が含まれるが、これらに限定されない。 In a preferred embodiment, the cell culture substrate having the dot pattern used in the method of this item may be coated with an extracellular matrix or a protein or peptide constituting the extracellular matrix. Proteins used for coating the cell culture substrate include, but are not limited to, for example, fibronectin, collagen, laminin, vitronectin and the like.
本項目の方法において間葉系幹細胞等の培養は、特に限定されないが、例えば、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ハムＦ−１２培地、ＭＥＭ（イーグル最小必須培地）、もしくはライボビッツＬ−１５培地等の培地、またはこれらを含む混合培地を用いて行うことができる。本発明の方法における間葉系幹細胞等の培養温度は、特に限定されないが、室温〜４０℃、好ましくは３５〜４０℃の範囲で行われる。間葉系幹細胞等の培養に適した温度は、細胞の由来に応じて変化しうる。例えば、哺乳類由来（例えば、ヒト、ウシ、マウス等）の間葉系幹細胞等を培養する際の温度は、３５〜４０℃であることが好ましい。本発明の方法における間葉系幹細胞等の培養期間は、特に限定されないが、１２時間〜４０日、好ましくは３〜１４日の範囲で行われる。 In the method of this item, the culture of mesenchymal stem cells and the like is not particularly limited, but for example, DMEM (Dalbeco modified Eagle medium), Ham F-12 medium, MEM (Eagle's minimum essential medium), Leibovitz L-15 medium and the like. It can be carried out using the medium of the above, or a mixed medium containing these. The culture temperature of mesenchymal stem cells and the like in the method of the present invention is not particularly limited, but is in the range of room temperature to 40 ° C., preferably 35 to 40 ° C. The temperature suitable for culturing mesenchymal stem cells and the like can change depending on the origin of the cells. For example, the temperature for culturing mesenchymal stem cells derived from mammals (for example, human, bovine, mouse, etc.) is preferably 35 to 40 ° C. The culture period of the mesenchymal stem cells and the like in the method of the present invention is not particularly limited, but is in the range of 12 hours to 40 days, preferably 3 to 14 days.
本項目の方法により、間葉系幹細胞等の幹細胞の分化を抑制しながら当該細胞を培養することができる。好ましい態様において、本項目の方法により、間葉系幹細胞等の骨分化、より具体的には骨芽細胞分化を抑制することができる。骨芽細胞分化の評価は、当業者に公知の手法により行うことができる。例えば、転写因子RUNX2の核内移行の割合は、骨芽細胞分化初期の指標として知られており、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性は、骨芽細胞分化中期の指標として知られている。骨芽細胞分化の評価は、これらの指標を利用して行うことができる。すなわち、ドットパターンを有する細胞培養用基板上で間葉系幹細胞等の幹細胞を培養した場合に、ドットパターンを有しない平滑な表面を有する同材質の基板上で当該幹細胞を培養した場合と比較して、上記の指標の低減効果がある場合に、ドットパターンを有する細胞培養用基板の使用により間葉系幹細胞等の幹細胞の分化が抑制されたと判断することができる。 By the method of this item, the cells can be cultured while suppressing the differentiation of stem cells such as mesenchymal stem cells. In a preferred embodiment, the method of this item can suppress bone differentiation of mesenchymal stem cells and the like, more specifically, osteoblast differentiation. Evaluation of osteoblast differentiation can be performed by a method known to those skilled in the art. For example, the rate of nuclear translocation of the transcription factor RUNX2 is known as an indicator of early osteoblast differentiation, and alkaline phosphatase (ALP) activity is known as an indicator of metaphase osteoblast differentiation. Evaluation of osteoblast differentiation can be performed using these indicators. That is, when stem cells such as mesenchymal stem cells are cultured on a cell culture substrate having a dot pattern, the stem cells are compared with the case where the stem cells are cultured on a substrate of the same material having a smooth surface without a dot pattern. Therefore, when there is an effect of reducing the above-mentioned index, it can be determined that the differentiation of stem cells such as mesenchymal stem cells is suppressed by using a cell culture substrate having a dot pattern.
また、ドットパターンを有する細胞培養用基板上で培養した間葉系幹細胞についてアクチン細胞骨格の三次元形態および細胞形態を観察した（後述の実施例２及び３）。その結果、ドットパターンを有する細胞培養用基板を培養に用いることにより、細胞内部張力の発生源であるアクチン細胞骨格の三次元形態が変化し、かつ細胞の伸展面積が抑制されている様子が観察された。このことから、ドットパターンを有する細胞培養用基板の使用により、機械的シグナル伝達を骨芽細胞抑制的な状態に誘導されるというメカニズムが推測された。 In addition, the three-dimensional morphology and cell morphology of the actin cytoskeleton were observed for mesenchymal stem cells cultured on a cell culture substrate having a dot pattern (Examples 2 and 3 described later). As a result, it was observed that by using a cell culture substrate having a dot pattern for culturing, the three-dimensional morphology of the actin cytoskeleton, which is the source of cell internal tension, was changed and the cell extension area was suppressed. Was done. From this, it was speculated that the use of a cell culture substrate having a dot pattern induces mechanical signal transduction to an osteoblast-suppressing state.
ドットパターンを有する細胞培養用基板の使用により、特に、培養中の間葉系幹細胞の核上部アクチンの発達が抑制される様子が観察されたことから、本項目の方法による効果の一つとして、培養中の間葉系幹細胞等の核上部アクチンの発達が抑制されるということが挙げられる。 Since it was observed that the use of a cell culture substrate having a dot pattern suppressed the development of upper nucleus actin of mesenchymal stem cells during culture, one of the effects of the method of this item was during culture. The development of upper nuclear actin such as foliar stem cells is suppressed.
間葉系幹細胞等の核上部アクチンの発達を抑制する方法
一態様において、本発明は、間葉系幹細胞等の幹細胞の核上部アクチンの発達を抑制する方法であって、ドットパターンを有する細胞培養用基板上で当該幹細胞を培養することを含み、当該ドットパターンにおける各ドットの直径が５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下、各ドットの配置間隔が５０ｎｍ以上４００ｎｍ以下である、前記方法に関する。
Method of Suppressing Development of Upper Nuclear Actin of Mesenchymal Stem Cell or the like In one embodiment, the present invention is a method of suppressing the development of upper nuclear actin of stem cell such as mesenchymal stem cell, and cell culture having a dot pattern. The present invention relates to the above method, which comprises culturing the stem cells on a substrate, wherein the diameter of each dot in the dot pattern is 50 nm or more and 200 nm or less, and the arrangement interval of each dot is 50 nm or more and 400 nm or less.
本項目の方法に使用するドットパターンを有する細胞培養用基板は、上記「細胞培養用基板」の項目において記載した細胞培養用基板を用いることができる。細胞培養用基板およびドットパターンの材質、並びにドットパターンにおける各ドットの直径、配置間隔および高さ等の構成についても、上記「細胞培養用基板」の項目において記載したとおりである。 As the cell culture substrate having the dot pattern used in the method of this item, the cell culture substrate described in the above item "Cell culture substrate" can be used. The material of the cell culture substrate and the dot pattern, and the composition of the diameter, arrangement interval, height, etc. of each dot in the dot pattern are also as described in the above-mentioned "Cell culture substrate" item.
本項目の方法において、間葉系幹細胞等の幹細胞の培養は、上記「幹細胞の分化抑制方法」の項目において記載した条件で行うことができる。
アクチンの発達度は、当業者に公知の手法により評価することができ、例えば、細胞のアクチンを蛍光標識したファロイジンで染色し、蛍光顕微鏡により比較観察することにより評価することができる。核上部アクチンは、当業者に公知の手法により評価することができ、例えば、細胞のアクチンを染色した上で、共焦点レーザー顕微鏡等の焦点深度を核の上部に合わせることにより観察することができる。したがって、ドットパターンを有する細胞培養用基板上で間葉系幹細胞等の幹細胞を培養した場合に、ドットパターンを有しない平滑な表面を有する同材質の基板上で当該幹細胞を培養した場合と比較して、核上部アクチンの発達が抑制されている様子が観察された場合に、ドットパターンを有する細胞培養用基板の使用により核上部アクチンの発達が抑制されたと判断することができる。
In the method of this item, the culture of stem cells such as mesenchymal stem cells can be performed under the conditions described in the item of "Method for suppressing differentiation of stem cells".
The degree of actin development can be evaluated by a method known to those skilled in the art. For example, cell actin can be evaluated by staining with fluorescently labeled phalloidin and comparatively observing with a fluorescence microscope. The upper nuclear actin can be evaluated by a method known to those skilled in the art, and can be observed, for example, by staining the actin of cells and then adjusting the depth of focus with a confocal laser scanning microscope or the like to the upper part of the nucleus. .. Therefore, when stem cells such as mesenchymal stem cells are cultured on a cell culture substrate having a dot pattern, the stem cells are compared with the case where the stem cells are cultured on a substrate of the same material having a smooth surface without a dot pattern. Therefore, when it is observed that the development of upper nuclear actin is suppressed, it can be determined that the development of upper nuclear actin is suppressed by the use of the cell culture substrate having a dot pattern.
以下、本発明について実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら制限されるものではない。
実施例１：間葉系幹細胞の分化抑制に関するナノドットパターンの影響
ドットパターンを有する石英基板を準備した。具体的には、ドットパターンの各ドットの直径（ＤＦ）として１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍまたは５００ｎｍの５種、及び各ドットの配置間隔（ＤＩ）として１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍまたは５００ｎｍの５種、のそれぞれを組み合わせた２５種類のドットパターンを有する石英基板を準備した。各ドットの高さは１５０ｎｍであった。また、対照として、ドットパターンのない平面を有する石英基板を用いた。これらの石英基板を用いて、間葉系幹細胞の培養中のドットパターンの影響を評価した。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
Example 1: Effect of nanodot pattern on suppression of differentiation of mesenchymal stem cells A quartz substrate having a dot pattern was prepared. Specifically, the diameter (DF) of each dot of the dot pattern is 100 nm, 150 nm, 200 nm, 250 nm or 500 nm, and the arrangement interval (DI) of each dot is 100 nm, 150 nm, 200 nm, 250 nm or 500 nm. A quartz substrate having 25 kinds of dot patterns in which each of the seeds was combined was prepared. The height of each dot was 150 nm. As a control, a quartz substrate having a flat surface without a dot pattern was used. Using these quartz substrates, the effect of dot patterns during culturing of mesenchymal stem cells was evaluated.
基板をポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製の穴あきマスクで覆い（図１）、培養期間中、細胞播種から培養終了まで特定のドットパターンのみに細胞が接触するようにした。基板表面は化学物質（フィブロネクチン（20 mg/ml））でコートした。評価には間葉系幹細胞増殖培地中（Lonza）で増殖させた骨髄由来のヒト間葉系幹細胞（ATCC）を用い、継代数は５以内とした。細胞を基板上に播種して間葉系幹細胞増殖培地（Lonza）中で接着させた。いくつかの例では細胞をマイトマイシンＣ（１０μｇ／ｍｌ、２時間）処理し増殖を阻害した。播種から１日経過後にＭＥＭα（10% FBS、１００ユニット ペニシリン、0.1 mg/ml ストレプトマイシン）に置換し、３日に１回培地交換をした。骨芽細胞分化はアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性を指標として評価した。ＡＬＰ活性の評価にはBCIP-NBT溶液キット（ナカライテスク）を用いた。 The substrate was covered with a perforated mask made of polydimethylsiloxane (PDMS) (FIG. 1) so that the cells only contacted a specific dot pattern during the culture period from cell seeding to the end of the culture. The surface of the substrate was coated with a chemical substance (fibronectin (20 mg / ml)). Bone marrow-derived human mesenchymal stem cells (ATCC) grown in mesenchymal stem cell growth medium (Lonza) were used for evaluation, and the number of passages was set to 5 or less. The cells were seeded on a substrate and adhered in mesenchymal stem cell proliferation medium (Lonza). In some examples, cells were treated with mitomycin C (10 μg / ml, 2 hours) to inhibit growth. One day after sowing, the cells were replaced with MEMα (10% FBS, 100 units penicillin, 0.1 mg / ml streptomycin), and the medium was changed once every three days. Osteoblast differentiation was evaluated using alkaline phosphatase (ALP) activity as an index. A BCIP-NBT solution kit (Nacalai Tesque) was used to evaluate ALP activity.
結果を図２に示す。図２は、各ドットパターン上での培養期間１４日経過後の細胞のＡＬＰ活性を評価したグラフであり、４試行の平均値を示したものである。ドットパターン上での間葉系幹細胞の培養に関し、以下の３つの特徴的な傾向が認められた：
（１）評価に用いたすべてのパターン（直径１００ｎｍ〜５００ｎｍ、配置間隔１００ｎｍ〜５００ｎｍ、高さ１５０ｎｍ、の範囲内のドットパターン）における間葉系幹細胞の培養において、ドットパターンのない平面を有する石英基板と比較して骨芽細胞への分化を抑制する傾向が観察された；
（２）直径１００ｎｍ、配置間隔１００ｎｍ、高さ１５０ｎｍ、のドットパターンにおける間葉系幹細胞の培養では、培養日数に関わらず、骨芽細胞分化の抑制効果が高いことが見出された；
（３）直径１００ｎｍのドット構造上での培養により、間葉系幹細胞が分化して生ずる骨芽細胞の割合は、より大きな配置間隔を有するドットパターン上での培養で増加傾向にあった。すなわち、直径１００ｎｍのドット構造において、ドットの配置間隔の増大に伴い、間葉系幹細胞の骨芽細胞分化を抑制効果が低下する傾向が観察された。
The results are shown in FIG. FIG. 2 is a graph for evaluating the ALP activity of cells after a lapse of 14 days in the culture period on each dot pattern, and shows the average value of 4 trials. Regarding the culture of mesenchymal stem cells on the dot pattern, the following three characteristic tendencies were observed:
(1) Quartz having a flat surface without a dot pattern in culturing mesenchymal stem cells in all patterns used for evaluation (dot patterns within the range of diameter 100 nm to 500 nm, arrangement interval 100 nm to 500 nm, height 150 nm). A tendency to suppress differentiation into osteoblasts was observed compared to the substrate;
(2) In culturing mesenchymal stem cells in a dot pattern having a diameter of 100 nm, an arrangement interval of 100 nm, and a height of 150 nm, it was found that the effect of suppressing osteoblast differentiation was high regardless of the number of culture days;
(3) The proportion of osteoblasts produced by differentiating mesenchymal stem cells by culturing on a dot structure having a diameter of 100 nm tended to increase in culturing on a dot pattern having a larger arrangement interval. That is, in a dot structure having a diameter of 100 nm, it was observed that the effect of suppressing osteoblast differentiation of mesenchymal stem cells decreased as the dot arrangement interval increased.
実施例２：間葉系幹細胞の核上部アクチン線維の発達に対するナノドットパターンの影響
まず、比較のために、間葉系幹細胞をカバーガラス上で、骨分化誘導培地（Lonza；デキサメタゾン、アスコルベート、β−グリセロホスフェート含有培地）中で培養して、間葉系幹細胞を骨芽細胞へと分化させた。間葉系幹細胞は、骨髄由来のヒト間葉系幹細胞（ATCC）を用い、継代数は５以内とした。
Example 2: Effect of nanodot pattern on the development of upper nucleus actin filaments of mesenchymal stem cells First, for comparison, mesenchymal stem cells were placed on a cover glass in an osteogenesis-inducing medium (Lonza; dexamethasone, ascorbate, β -Mesenchymal stem cells were differentiated into osteoblasts by culturing in a medium containing glycerophosphate. As the mesenchymal stem cells, human mesenchymal stem cells (ATCC) derived from bone marrow were used, and the number of passages was set to 5 or less.
ドットパターンを有する基板上で培養した間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞を直径が１００ｎｍ、配置間隔が１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍまたは５００ｎｍ、高さが１５０ｎｍのドットパターンを有する石英基板上で、実施例１と同様に培養することにより得た。 Mesenchymal stem cells cultured on a substrate having a dot pattern are obtained by culturing mesenchymal stem cells on a quartz substrate having a dot pattern having a diameter of 100 nm, an arrangement interval of 100 nm, 150 nm, 200 nm, 250 nm or 500 nm, and a height of 150 nm. , Obtained by culturing in the same manner as in Example 1.
核の染色はＤＡＰＩ（５μｇ／ｍＬ）により、アクチンの染色はＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５４６標識ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（６６ｎＭ）により行った。
結果を図３および４に示す。
Nuclei were stained with DAPI (5 μg / mL) and actin was stained with Alexafluor 546 labeled phalloidin (66 nM).
The results are shown in FIGS. 3 and 4.
図３は、間葉系幹細胞を骨分化誘導培地で培養した細胞について核及びアクチンを染色した写真である。核上部アクチン、核下部アクチンともに培養が進むにつれ、太く平行化したアクチンの発達が観察された。細胞核については、培養３日目までは発達したアクチンフィラメントの配向方向と細胞核の長軸が一致し、アクチンの発達によりその配向方向に細胞核が伸展される様子が観察された。培養７日目になると、アクチンフィラメントの配向方向と細胞核の長軸は一致しなくなった。これは細胞核がアクチンフィラメントから開放されたことを意味するものと考えられる。 FIG. 3 is a photograph of mesenchymal stem cells cultured in a bone differentiation-inducing medium and stained with nuclei and actin. As the culture of both upper-nuclear actin and lower-nuclear actin progressed, the development of thick and parallel actin was observed. Regarding the cell nucleus, the orientation direction of the developed actin filament and the long axis of the cell nucleus coincided with each other until the third day of culture, and it was observed that the cell nucleus was extended in the orientation direction by the development of actin. On the 7th day of culturing, the orientation direction of the actin filament and the long axis of the cell nucleus did not match. This is thought to mean that the cell nucleus was released from the actin filament.
図４は、ドットパターンを有する基板上で、間葉系幹細胞を培養した際の、培養１４日目の細胞核及びアクチンを染色した写真である。核下部アクチンについては若干アクチンの発達が見られるものの、核上部アクチンについてはアクチン構造が乱れている様子が観察された。これは、核上部アクチンの発達が抑制されている状況と考えられる。 FIG. 4 is a photograph of cell nuclei and actin stained on the 14th day of culture when mesenchymal stem cells were cultured on a substrate having a dot pattern. Although some actin development was observed in the lower nuclear actin, it was observed that the actin structure was disturbed in the upper nuclear actin. This is considered to be a situation in which the development of upper nuclear actin is suppressed.
上記の結果から、核上部アクチン線維の発達度が、間葉系幹細胞について骨芽細胞への分化抑制性と分化促進性に関わっていることが推測できる（図５）。また、ドットパターンを有する基板上で間葉系幹細胞を培養することが、核上部のアクチン発達を抑制している可能性がある。 From the above results, it can be inferred that the degree of development of upper nuclear actin fibers is involved in the inhibitory and promoting differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts (Fig. 5). In addition, culturing mesenchymal stem cells on a substrate having a dot pattern may suppress actin development in the upper part of the nucleus.
実施例３：間葉系幹細胞の細胞形態に対するナノドットパターンの影響
間葉系幹細胞の分化に影響を及ぼす細胞側の因子として、伸展面積およびアスペクト比に関する報告がある。そこで、ドットパターン上、またはドットパターンなしの平面上で培養した間葉系幹細胞について、細胞形態を観察し、細胞の伸展面積−アスペクト比と骨芽細胞分化との関係を分析した。
Example 3: Effect of nanodot pattern on cell morphology of mesenchymal stem cells There are reports on the extension area and aspect ratio as cell-side factors that influence the differentiation of mesenchymal stem cells. Therefore, we observed the cell morphology of mesenchymal stem cells cultured on a dot pattern or on a plane without a dot pattern, and analyzed the relationship between the cell extension area-aspect ratio and osteoblast differentiation.
間葉系幹細胞は、実施例１と同様にドットパターンを有する基板及びドットパターンのない平面を有する基板上で培養した。
ドットパターン上で培養した細胞と平面上で培養した細胞の伸展面積−アスペクト比の分布を比較した。ドットパターン上で培養下細胞の伸展面積−アスペクト比の分布は、平面上で培養した細胞とは傾向が異なった。同じ培養日数で比較すると、ドットパターン上で培養した細胞の伸展面積は、平面上で培養した細胞よりも小さい。ドットパターン上で培養した細胞は、培養３日目では伸展面積５，０００μｍ２よりも小さい領域に、培養１４日目では伸展面積が１０，０００μｍ２よりも小さい領域に分布する頻度が高かった。平面上で培養した細胞の伸展面積−アスペクト比はこれらの領域の外に分布する頻度が高かった。
The mesenchymal stem cells were cultured on a substrate having a dot pattern and a substrate having a plane without a dot pattern as in Example 1.
The distribution of the spread area-aspect ratio of the cells cultured on the dot pattern and the cells cultured on the plane was compared. The distribution of the spread area-aspect ratio of the cultured cells on the dot pattern tended to be different from that of the cells cultured on the plane. When compared for the same number of culture days, the spread area of the cells cultured on the dot pattern is smaller than that of the cells cultured on the plane. The cells cultured on the dot pattern were frequently distributed in the region having an extension area smaller than 5,000 μm 2 on the 3rd day of culture and in the region having an extension area smaller than 10,000 μm 2 on the 14th day of culture. The spread area-aspect ratio of cells cultured on a plane was frequently distributed outside these regions.
次に、ＡＬＰ陰性・陽性の別に着目した。培養３日目には、ＡＬＰ陰性細胞のみが分布する骨芽細胞分化抑制性の領域が存在することが見出された。この培養３日目における骨芽細胞分化抑制領域は、アスペクト比が１．５よりも小さい場合には伸展面積が５，０００μｍ２よりも小さい範囲、またアスペクト比が１．５を超えると伸展面積が１，６００μｍ２よりも小さい範囲が該当する。培養１４日目には、ＡＬＰ陰性細胞の頻度が高い骨芽細胞分化抑制性の領域（図６、「分化抑制」として示された領域）に加え、ＡＬＰ陽性細胞の頻度が高い骨芽細胞分化促進性の領域（図６、「分化促進」として示された領域）も認められた。骨芽細胞分化抑制領域の伸展面積の上限は１０，０００μｍ２で、アスペクト比が大きいほど小さくなる。骨芽細胞分化促進領域は、伸展面積が３，０００μｍ２〜２０，０００μｍ２で、アスペクト比が３〜７の範囲に位置する。但し、骨芽細胞分化促進領域における伸展面積の下限は、アスペクト比が３〜５．５の場合にはアスペクト比に依存し、アスペクト比が大きいほど小さい。 Next, we focused on ALP negative and positive. On the third day of culture, it was found that there was an osteoblast differentiation inhibitory region in which only ALP-negative cells were distributed. The osteoblast differentiation inhibitory region on the third day of culture has an extension area smaller than 5,000 μm 2 when the aspect ratio is smaller than 1.5, and an extension area when the aspect ratio exceeds 1.5. Applicable in a range smaller than 1,600 μm 2 . On the 14th day of culture, in addition to the osteoblast differentiation-suppressing region (Fig. 6, indicated as "differentiation inhibition") in which ALP-negative cells are frequently used, osteoblast differentiation in which ALP-positive cells are frequently used. A facilitative region (FIG. 6, region indicated as "promoting differentiation") was also observed. The upper limit of the extension area of the osteoblast differentiation inhibitory region is 10,000 μm 2 , and the larger the aspect ratio, the smaller the extension area. The osteoblast differentiation promoting region has an extension area of 3,000 μm 2 to 20,000 μm 2 and an aspect ratio in the range of 3 to 7. However, the lower limit of the extension area in the osteoblast differentiation promoting region depends on the aspect ratio when the aspect ratio is 3 to 5.5, and the larger the aspect ratio, the smaller the lower limit.
また、培養１４日目の細胞の伸展面積−アスペクト比の分布をより詳細に検討した。直径が１００ｎｍ、配置間隔が１００ｎｍのドットパターンを用いた場合は、大部分の細胞において、細胞の伸展面積−アスペクト比は、骨芽細胞分化抑制領域内に位置した。この結果から、実施例１で（１）として記載した傾向は、細胞形態が骨芽細胞分化抑制性の細胞伸展面積−アスペクト比に誘導されたことによりもたらされた可能性がある。また、直径が１００ｎｍのドットパターンについて、配置間隔が増加すると、骨芽細胞分化抑制領域に位置する細胞が減少し、骨芽細胞分化促進領域に位置する細胞が増加した。この結果から、実施例１で（３）として記載した傾向は、配置間隔の増大により、細胞の形態が骨芽細胞分化抑制性から骨芽細胞分化促進性の細胞伸展面積−アスペクト比へと変化を誘導されたことによりもたらされた可能性がある。さらに、直径が１００〜５００ｎｍのドットパターンについて、配置間隔に関わらず、培養した細胞は、細胞伸展面積−アスペクト比が骨芽細胞分化抑制領域、あるいは、骨芽細胞分化抑制領域と骨芽細胞分化抑制領域の間の領域（以下、混合領域と記載する）に位置し、骨芽細胞分化促進領域にはほとんど存在しなかった。この結果から、実施例１で（１）として記載した傾向は、本発明のドットパターンが、間葉系幹細胞の伸展面積−アスペクト比を骨芽細胞分化抑制領域および混合領域、あるいは骨芽細胞分化抑制領域または混合領域のいずれかの形態、に誘導するためであると考えられる。 In addition, the distribution of the spread area-aspect ratio of cells on the 14th day of culture was examined in more detail. When a dot pattern having a diameter of 100 nm and an arrangement interval of 100 nm was used, in most cells, the cell extension area-aspect ratio was located within the osteoblast differentiation inhibitory region. From this result, it is possible that the tendency described as (1) in Example 1 was brought about by the fact that the cell morphology was induced to the cell extension area-aspect ratio that suppresses osteoblast differentiation. Further, for a dot pattern having a diameter of 100 nm, as the arrangement interval increased, the number of cells located in the osteoblast differentiation suppressing region decreased, and the number of cells located in the osteoblast differentiation promoting region increased. From this result, the tendency described as (3) in Example 1 is that the cell morphology changes from the osteoblast differentiation inhibitory to the osteoblast differentiation promoting cell extension area-aspect ratio due to the increase in the arrangement interval. It may have been brought about by being induced. Furthermore, for dot patterns with a diameter of 100 to 500 nm, the cultured cells have a cell extension area-aspect ratio of the osteoblast differentiation inhibitory region or the osteoblast differentiation inhibitory region and osteoblast differentiation regardless of the arrangement interval. It was located in the region between the inhibitory regions (hereinafter referred to as the mixed region) and was hardly present in the osteoblast differentiation promoting region. From this result, the tendency described as (1) in Example 1 is that the dot pattern of the present invention sets the extension area-aspect ratio of mesenchymal stem cells to the osteoblast differentiation inhibitory region and mixed region, or osteoblast differentiation. It is believed that this is to induce into either the form of the suppressive region or the mixed region.
再生医療やがん治療における細胞ソースとして期待されている間葉系幹細胞等の幹細胞について、未分化性を維持しつつ培養することは、細胞の品質を維持する上で重要である。本発明は、間葉系幹細胞等について未分化性を維持しつつ培養可能な方法およびそのための細胞培養用基板を提供する点で有用である。 It is important to culture stem cells such as mesenchymal stem cells, which are expected as cell sources in regenerative medicine and cancer treatment, while maintaining their undifferentiated state in order to maintain the quality of the cells. The present invention is useful in providing a method capable of culturing mesenchymal stem cells and the like while maintaining undifferentiated state, and a cell culture substrate for that purpose.
Claims (9)
（１）当該ドットパターンにおける各ドットの直径が５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であり、各ドットの配置間隔が５０ｎｍ以上４００ｎｍ以下であり、そして各ドットの高さが５０ｎｍ以上３００ｎｍ未満である；または
（２）当該ドットパターンにおける各ドットの直径が５０ｎｍ以上２００ｎｍ未満であり、そして各ドットの配置間隔が５０ｎｍ以上２００ｎｍ未満である；
前記細胞培養用基板。 A substrate for cell culture, which has a dot pattern and
(1) The diameter of each dot in the dot pattern is 50 nm or more and 200 nm or less, the arrangement interval of each dot is 50 nm or more and 400 nm or less, and the height of each dot is 50 nm or more and less than 300 nm; or (2). The diameter of each dot in the dot pattern is 50 nm or more and less than 200 nm, and the spacing between the dots is 50 nm or more and less than 200 nm;
The cell culture substrate.
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