JP2020152654A - Cancer prophylactic and/or therapeutic agent, cancer marker, cancer diagnostic kit, or method for measuring biological sample - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、主に大腸癌の予防及び／又は治療薬、大腸癌マーカー、大腸癌診断キット、又は生体試料の測定方法に関する物である。 The present invention mainly relates to a preventive and / or therapeutic agent for colorectal cancer, a colorectal cancer marker, a colorectal cancer diagnostic kit, or a method for measuring a biological sample.
食習慣等の生活習慣の変化に伴い、従来胃癌等が多かった日本においても、大腸癌罹患率が上昇してきており、その予防又は治療薬が望まれている。
大腸癌も他の癌と同様に、外科的手術のほか、化学療法が多く用いられており、5フルオロウラシル（5-FU：ファイブ・エフ・ユー）、ロイコボリン、イリノテカン（CPT-11：シー・ピー・ティー・イレブン）、オキサリプラチン等の低分子薬のほか、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、セツキシマブ（アービタックス（登録商標））等に代表されるような、各種の分子標的製剤等、これまで多数のものが開発されてきているが、必ずしも満足のいくものでは無かった。
With changes in lifestyle such as eating habits, the prevalence of colorectal cancer is increasing even in Japan, where gastric cancer has been common in the past, and preventive or therapeutic agents for it are desired.
Like other cancers, colorectal cancer is often used in chemotherapy as well as surgery, including 5-fluorouracil (5-FU), leucovorin, and irinotecan (CPT-11: CP-11).・ In addition to small molecule drugs such as tea eleven) and oxaliplatin, various molecular target preparations such as bevacizumab (Avastin (registered trademark)) and cetuximab (Arbitux (registered trademark)) have been used so far. Many have been developed, but not always satisfactory.
一方、大腸癌は、早期発見すれば完治し易いと言われている反面、大腸癌と診断された患者のうち、７〜８割程度が、進行癌と診断され、治療がより困難になっているという現実がある。
例えば癌が出来た箇所が肛門から遠いほど自覚症状が出にくい等の原因で発見が遅れ、血液やリンパの流れに乗る等して、他の臓器等へ転移してしまっているケースが多いからである。
従って、大腸癌に関しても、他の癌同様に早期発見が重要である。
On the other hand, colorectal cancer is said to be easy to cure if detected early, but about 70 to 80% of patients diagnosed with colorectal cancer are diagnosed with advanced cancer, making treatment more difficult. There is a reality that there is.
For example, the farther the cancer is from the anus, the less likely it is that subjective symptoms will appear. In many cases, the cancer has spread to other organs, etc. due to delay in detection due to the flow of blood or lymph. Is.
Therefore, early detection of colorectal cancer is as important as other cancers.
他方、大腸癌には、転移し易いものと転移し難いものがあることが分かってきており、癌マーカーとしては、単に大腸癌であること，あるいはその進行段階を識別するだけではなく、将来の転移の可能性の高い大腸癌であるか否かを識別しうるものが望まれている。 On the other hand, it has been found that some colorectal cancers are easy to metastasize and some are hard to metastasize, and as cancer markers, not only the colorectal cancer or its advanced stage can be identified, but also the future Those that can identify whether or not colorectal cancer has a high possibility of metastasis are desired.
これまで、種々の大腸癌マーカーが発見されており、例えばCEA、CA19-9、p53抗体等が実用化されているが（特許文献１）、それらは、単に大腸癌であることを識別するに留まり、転移し易さの指標として用いうるものではなかった。 So far, various colorectal cancer markers have been discovered, and for example, CEA, CA19-9, p53 antibody and the like have been put into practical use (Patent Document 1), but they are simply used to identify colorectal cancer. It could not be used as an index of the ease of staying and metastasis.
一方、KLHL5という蛋白質のmRNAが、癌マーカーとして使用されている例があるが（特許文献２）、これは、前立腺癌マーカーとして使用されるものであり、大腸癌や、大腸癌由来の転移癌又は浸潤癌（肝臓癌、肺癌、骨腫瘍、又は脳腫瘍等）を識別するものでは無かった。 On the other hand, there is an example in which mRNA of a protein called KLHL5 is used as a cancer marker (Patent Document 2), but this is used as a prostate cancer marker, and is used for colorectal cancer and metastatic cancer derived from colorectal cancer. Or, it did not identify invasive cancer (liver cancer, lung cancer, bone tumor, brain tumor, etc.).
更に、「KLHL5ほか16種類の蛋白質の遺伝子を含む遺伝子群から選択される複数の遺伝子の発現量に基づいて、大腸癌の再発リスクを判定する、大腸癌の再発リスクの診断方法（特許文献３）」等も提案されているが、16種類の発現量の内訳に関するデータは一切示されておらず、KLHL5単独でマーカーとして使用できることを示すものでは無かった。 Further, "A method for diagnosing the recurrence risk of colorectal cancer, which determines the recurrence risk of colorectal cancer based on the expression level of a plurality of genes selected from a gene group containing genes of KLHL5 and 16 other proteins (Patent Document 3). ) ”, Etc., but no data on the breakdown of the expression levels of 16 types were shown, and it did not indicate that KLHL5 alone could be used as a marker.
本発明者等は、大腸癌細胞において、KLHL5を初めとする各種のKLHL蛋白質グループの発現量が多く、それらの阻害剤が大腸癌の増殖を抑制し得ること、更にはそれらの中でもKLHL5の発現量と、大腸癌の進行度・転移度又は浸潤度に相関性があることを見いだし、本発明に到達したものであって、その目的とするところは、大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌の予防及び／又は治療薬、或いは大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌を識別するための癌マーカー、更にはこれらの癌の診断キット、又は生体試料の測定方法等を提供するにある。 The present inventors have a high expression level of various KLHL protein groups including KLHL5 in colorectal cancer cells, and their inhibitors can suppress the growth of colorectal cancer, and among them, the expression of KLHL5. It was found that there is a correlation between the amount and the degree of progression / metastasis or invasion of colorectal cancer, and the present invention has been reached, and the object thereof is colorectal cancer or metastatic cancer derived from colorectal cancer. Provided are a preventive and / or therapeutic agent for invasive cancer, a cancer marker for identifying colorectal cancer or metastatic cancer derived from colorectal cancer or invasive cancer, a diagnostic kit for these cancers, a method for measuring a biological sample, and the like. It is in.
上述の目的は、下記第一の発明から第十二の発明によって、達成される。 The above-mentioned object is achieved by the following first to twelfth inventions.
＜第一の発明＞
下記（Ｘ）を阻害する物質を含むことを特徴とする、下記（Ｙ）の癌細胞の増殖及び／又は転移抑制剤。
（Ｘ）KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36からなる群から選択される蛋白質又はその遺伝子
（Ｙ）大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌から選択される少なくとも１種以上の癌
<First invention>
The following (Y) cancer cell growth and / or metastasis inhibitor, which comprises a substance that inhibits the following (X).
(X) Protein selected from the group consisting of KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 or its gene (Y) At least one or more cancers selected from colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer
＜第二の発明＞
下記（Ｘ）を阻害する物質を含むことを特徴とする、下記（Ｙ）の予防及び／又は治療薬。
（Ｘ）KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36からなる群から選択される蛋白質又はその遺伝子
（Ｙ）大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌から選択される少なくとも１種以上の癌
<Second invention>
The prophylactic and / or therapeutic agent of (Y) below, which comprises a substance that inhibits (X) below.
(X) Protein selected from the group consisting of KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 or its gene (Y) At least one or more cancers selected from colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer
＜第三の発明＞
（Ｘ）を阻害する物質が、投与対象における、当該蛋白質又はその遺伝子の、量又は機能を抑制又は阻害する物質であることを特徴とする、第二の発明に記載の予防及び／又は治療薬。
<Third invention>
The prophylactic and / or therapeutic agent according to the second invention, wherein the substance that inhibits (X) is a substance that suppresses or inhibits the amount or function of the protein or its gene in the administration subject. ..
＜第四の発明＞
（Ｘ）を阻害する物質が、下記のｉ）乃至ｉｉｉ）のいずれかから選択される少なくとも１種以上であることを特徴とする、第三の発明に記載の予防及び／又は治療薬。
ｉ）（Ｘ）の発現量を、抑制する物質
ｉｉ）（Ｘ）を分解する物質
ｉｉｉ）（Ｘ）の機能を阻害する物質
<Fourth invention>
The prophylactic and / or therapeutic agent according to the third invention, wherein the substance that inhibits (X) is at least one selected from any of the following i) to iii).
i) Substances that suppress the expression level of (X) ii) Substances that decompose (X) iii) Substances that inhibit the function of (X)
＜第五の発明＞
（Ｘ）を阻害する物質が、（Ｘ）の遺伝子に対するsiRNA遺伝子、shRNA遺伝子、miRNA遺伝子、アンチセンスRNA、核酸アプタマー、又はリボザイム、或いは（Ｘ）の蛋白質に対する抗体、ペプチドアプタマー、サイクリックマクロペプチド、又はプロテアーゼから選択された少なくとも1種以上のものであることを特徴とする、第三の発明に記載の予防及び／又は治療薬。
<Fifth invention>
The substance that inhibits (X) is a siRNA gene, a shRNA gene, a miRNA gene, an antisense RNA, a nucleic acid aptamer, or a ribozyme against the gene (X), or an antibody, a peptide aptamer, or a cyclic macropeptide against the protein (X). , Or the prophylactic and / or therapeutic agent according to the third invention, which is at least one selected from proteases.
＜第六の発明＞
下記（Ｘ）を含むことを特徴とする、下記（Ｙ）を識別するための癌マーカー。
（Ｘ）KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36からなる群から選択される蛋白質又はその遺伝子
（Ｙ）大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌から選択される少なくとも１種以上の癌
<Sixth invention>
A cancer marker for identifying the following (Y), which comprises the following (X).
(X) Protein selected from the group consisting of KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 or its gene (Y) At least one or more cancers selected from colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer
＜第七の発明＞
下記（Ｘ）を検出可能な物質を含むことを特徴とする、下記（Ｙ）の診断キット。
（Ｘ）KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36からなる群から選択される蛋白質又はその遺伝子
（Ｙ）大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌から選択される少なくとも１種以上の癌
<Seventh invention>
The diagnostic kit of the following (Y), which comprises a substance capable of detecting the following (X).
(X) Protein selected from the group consisting of KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 or its gene (Y) At least one or more cancers selected from colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer
＜第八の発明＞
（Ｘ）を検出可能な物質が、（Ｘ）の蛋白質に対して特異的に結合する物質、（Ｘ）の遺伝子を増幅可能なプライマーセット、又は（Ｘ）の遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブから選択される少なくとも１種であることを特徴とする、第七の発明に記載の診断キット。
<Eighth invention>
A substance that can detect (X) specifically hybridizes to a substance that specifically binds to the protein of (X), a primer set capable of amplifying the gene of (X), or the mRNA of the gene of (X). The diagnostic kit according to a seventh aspect of the invention, which comprises at least one selected from a probe to be hybridized.
＜第九の発明＞
下記（１）及び（２）の工程を含むことを特徴とする、生体試料の測定方法。
（１）生体試料中の、下記（Ｘ）蛋白質の存在量又は下記（Ｘ）遺伝子の発現量を測定する工程
（２）（１）で測定された（Ｘ）蛋白質の存在量又は（Ｘ）遺伝子の発現量が、当該生体試料と同種の正常組織由来の対照試料中の（Ｘ）蛋白質の存在量又は（Ｘ）遺伝子の発現量と比較して多い場合に、前記生体試料が下記（Ｙ）の癌患者由来のものであると判定する工程
（Ｘ）KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36からなる群から選択される蛋白質又はその遺伝子
（Ｙ）大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌から選択される少なくとも１種以上の癌
<Ninth invention>
A method for measuring a biological sample, which comprises the following steps (1) and (2).
(1) Steps for measuring the abundance of the following (X) protein or the expression level of the following (X) gene in a biological sample (2) The abundance of the (X) protein measured in (1) or (X) When the expression level of the gene is higher than the abundance of the (X) protein or the expression level of the (X) gene in the control sample derived from a normal tissue of the same type as the biological sample, the biological sample is described below (Y). ) Steps to determine that the protein is derived from a cancer patient (X) A protein selected from the group consisting of KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 or its gene (Y) Colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer At least one or more cancers selected from
＜第十の発明＞
下記（Ａ）及び／又は（Ｂ）の工程を指標とする、大腸癌の進行度合い又は他の臓器や組織への転移又は浸潤の可能性の判定方法。
（Ａ）生体試料中の、下記（Ｘ）蛋白質の存在量又は下記（Ｘ）遺伝子の発現量を測定する工程
（Ｂ）（Ｘ）蛋白質の存在位置又は（Ｘ）遺伝子の発現位置を測定する工程
（Ｘ）KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36からなる群から選択される蛋白質又はその遺伝子
<10th invention>
A method for determining the degree of progression of colorectal cancer or the possibility of metastasis or infiltration to other organs or tissues, using the following steps (A) and / or (B) as indicators.
(A) Step of measuring the abundance of the following (X) protein or the expression level of the following (X) gene in a biological sample (B) Measuring the abundance position of the (X) protein or the expression position of the (X) gene Step (X) A protein or gene thereof selected from the group consisting of KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36.
＜第十一の発明＞
下記（Ｘ）の蛋白質又はその遺伝子を含むことを特徴とする、下記（Ｙ）の予防及び／又は治療薬のスクリーニング用キット。
（Ｘ）KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36からなる群から選択される蛋白質又はその遺伝子
（Ｙ）大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌から選択される少なくとも１種以上の癌
<Eleventh invention>
A kit for screening a prophylactic and / or therapeutic agent according to (Y) below, which comprises the protein (X) below or a gene thereof.
(X) Protein selected from the group consisting of KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 or its gene (Y) At least one or more cancers selected from colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer
＜第十二の発明＞
第十一の発明に記載のスクリーニング用キットを用いることを特徴とする、下記（Ｙ）の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法。
（Ｙ）大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌から選択される少なくとも１種以上の癌
<Twelfth invention>
The method for screening a prophylactic and / or therapeutic agent according to (Y) below, which comprises using the screening kit according to the eleventh invention.
(Y) At least one type of cancer selected from colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer
本発明のマーカーを利用して、癌の発生、進行状況、転移状況等を早期に発見することで、癌、特に大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌の、より有効な予防又は治療が可能となる。また本発明の予防／又は治療薬によって、大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌の予防／又は治療を行うことが可能となる。 By using the markers of the present invention to detect the development, progression, metastasis, etc. of cancer at an early stage, more effective prevention or treatment of cancer, especially colorectal cancer or metastatic cancer or infiltrating cancer derived from colorectal cancer. Is possible. Further, the preventive / or therapeutic agent of the present invention makes it possible to prevent / or treat colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
［本発明の癌細胞の増殖及び／又は転移抑制剤］
本発明の「（Ｙ）の癌細胞の増殖及び／又は転移抑制剤」は、（Ｘ）を阻害する物質を含むことを特徴とするものである。
[Inhibitor of cancer cell proliferation and / or metastasis of the present invention]
The "(Y) cancer cell growth and / or metastasis inhibitor" of the present invention is characterized by containing a substance that inhibits (X).
（Ｘ）KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36からなる群から選択される蛋白質又はその遺伝子
（Ｙ）大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌から選択される少なくとも１種以上の癌
(X) Protein selected from the group consisting of KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 or its gene (Y) At least one or more cancers selected from colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer
「（Ｘ）を阻害する物質」とは、具体的には、「投与対象（生体や細胞や実験試料等）における、（Ｘ）の蛋白質又はその遺伝子の、量又は機能を抑制又は阻害する物質」である。 Specifically, the "substance that inhibits (X)" is a "substance that suppresses or inhibits the amount or function of the protein (X) or its gene in the administration target (living body, cell, experimental sample, etc.)". ".
「（Ｘ）の蛋白質又はその遺伝子の、量又は機能を抑制又は阻害する物質」としては、
「（Ｘ）の蛋白質又はその遺伝子の発現量を、抑制する物質」
「（Ｘ）の蛋白質又はその遺伝子を分解する物質」
「（Ｘ）の蛋白質又はその遺伝子の機能を阻害する物質」
等が挙げられる。
As "a substance that suppresses or inhibits the amount or function of the protein (X) or its gene",
"A substance that suppresses the expression level of the protein (X) or its gene"
"A substance that degrades the protein (X) or its gene"
"A substance that inhibits the function of the protein (X) or its gene"
And so on.
具体的には、下記のようなものが挙げられるが、必ずしもこれらに限られるものでは無い。 Specific examples include, but are not necessarily limited to, the following.
（ｉ）（Ｘ）の遺伝子に対するsiRNA遺伝子、shRNA遺伝子、miRNA遺伝子、アンチセンスRNA、核酸アプタマー、又はリボザイム等を含む、遺伝子発現制御等に用いられる各種の核酸物質、各種の核酸分解酵素、及び各種の低分子性化合物等。
（ｉｉ）（Ｘ）の蛋白質に対する抗体、ペプチドアプタマー、サイクリックマクロペプチド、又は各種のプロテアーゼ等を含む、蛋白質を制御するのに用いられる各種のペプチド或いは蛋白質類、及び各種の低分子性化合物等。
(I) Various nucleic acid substances used for gene expression control and the like, various nucleic acid degrading enzymes, including siRNA gene, shRNA gene, miRNA gene, antisense RNA, nucleic acid aptamer, ribozyme, etc. for the gene of (X), and Various low molecular weight compounds, etc.
(Ii) Various peptides or proteins used for controlling the protein, including antibodies against the protein of (X), peptide aptamers, cyclic macropeptides, various proteases, etc., and various low molecular weight compounds, etc. ..
（ｉ）の（Ｘ）の遺伝子に対するsiRNA遺伝子、shRNA遺伝子、miRNA遺伝子、アンチセンスRNA、核酸アプタマー、リボザイム等は、公知の知見に基づいて適宜設計することが可能であるが、siRNA遺伝子としては、例えば後述する表１に記載したようなものを購入することができるほか、Sigma社等に設計依頼することも可能である。
尚、核酸アプタマーは、ランダム配列からなる公知の巨大ライブラリー等からのスクリーニングによって得ることが一般的である。
The siRNA gene, shRNA gene, miRNA gene, antisense RNA, nucleic acid aptamer, ribozyme, etc. for the gene (X) of (i) can be appropriately designed based on known findings, but as the siRNA gene, For example, it is possible to purchase the ones shown in Table 1 described later, or to request the design from Sigma or the like.
Nucleic acid aptamers are generally obtained by screening from a known large library consisting of random sequences or the like.
（ｉｉ）の（Ｘ）の蛋白質に対する抗体は、公知の方法に従い、KLHL蛋白質を抗原として、適当な宿主に免疫することや、常法に従った人工的な合成等によって作製することができるが、公知の抗体として表２記載のようなものを購入することもできる。 The antibody against the protein (X) of (ii) can be produced by immunizing an appropriate host with the KLHL protein as an antigen or by artificial synthesis according to a conventional method according to a known method. , Known antibodies as shown in Table 2 can also be purchased.
本発明において抗体とは、モノクローナル抗体（mAb）、ポリクローナル抗体（pAb）、もしくはキメラ抗体やヒト化抗体のいずれであっても良く、ファージ抗体であっても良い。 In the present invention, the antibody may be either a monoclonal antibody (mAb), a polyclonal antibody (pAb), a chimeric antibody or a humanized antibody, or may be a phage antibody.
本発明において、抗体を「抑制剤」や後述する「予防又は治療剤」に用いる場合には、抑制ターゲットが明確なため、モノクローナル抗体が好ましい。
但し、後述する「本発明の診断キット」の「（Ｘ）の蛋白質に対して特異的に結合する物質」として使用する際には、ポリクローナル抗体でも良い。
In the present invention, when an antibody is used as an "inhibitor" or a "preventive or therapeutic agent" described later, a monoclonal antibody is preferable because the inhibitory target is clear.
However, when used as a "substance that specifically binds to the protein (X)" of the "diagnostic kit of the present invention" described later, a polyclonal antibody may be used.
尚、ペプチドアプタマーも、上述の核酸アプタマー同様、公知の巨大ライブラリー等からのスクリーニングによって得ることが一般的である。 The peptide aptamer is also generally obtained by screening from a known large library or the like, like the above-mentioned nucleic acid aptamer.
（Ｙ）の「大腸癌」とは、直腸癌、盲腸癌、結腸癌、肛門管癌等の、大腸組織に発生した悪性腫瘍を意味する。また、（Ｙ）の「大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌」とは、大腸癌を原発とし、リンパ行性転移、血行性転移、又は腹膜播種等によって他の臓器又は組織に転移又は浸潤した癌を言い、具体的には例えば肝臓癌、肺癌、骨腫瘍、又は脳腫瘍等が挙げられる。 The “colorectal cancer” in (Y) means a malignant tumor that develops in the large intestine tissue, such as rectal cancer, cecal cancer, colon cancer, and anal canal cancer. In addition, (Y) "metastasis cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer" is originated from colorectal cancer and has metastasized or infiltrated into other organs or tissues by lymphatic metastasis, hematogenous metastasis, peritoneal dissemination, or the like. It refers to cancer, and specific examples thereof include liver cancer, lung cancer, bone tumor, and brain tumor.
本発明の「癌細胞の増殖又は転移抑制剤」は、後述する本発明の「癌の予防又は治療薬」の有効成分として用いられるほか、実験室内における実験・研究試薬として、例えば癌の予防及び／又は治療薬のスクリーニング実験等に用いる試薬の一部としても、非常に利用価値の高いものである。 The "cancer cell growth or metastasis inhibitor" of the present invention is used as an active ingredient of the "cancer preventive or therapeutic agent" of the present invention described later, and is also used as an experimental / research reagent in a laboratory, for example, cancer prevention and cancer prevention. / Or, it is very useful as a part of a reagent used for a screening experiment of a therapeutic drug.
尚、実験・研究試薬としては、上記の成分の他、一般に実験・研究試薬に用いられている溶媒その他の各種添加剤等を含有させることができる。 In addition to the above-mentioned components, the experimental / research reagent may contain a solvent and other various additives generally used for the experimental / research reagent.
［本発明の癌の予防及び／又は治療薬］
本発明の「下記（Ｙ）の癌の予防及び／又は治療薬」は、「下記（Ｘ）を阻害する物質」を含むことを特徴とするものである。
[Preventive and / or therapeutic agent for cancer of the present invention]
The "preventive and / or therapeutic agent for the following (Y) cancer" of the present invention is characterized by containing "a substance that inhibits the following (X)".
（Ｘ）KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36からなる群から選択される蛋白質又はその遺伝子
（Ｙ）大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌から選択される少なくとも１種以上の癌
(X) Protein selected from the group consisting of KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 or its gene (Y) At least one or more cancers selected from colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer
「下記（Ｘ）を阻害する物質」としては、上述の「本発明の癌細胞の増殖及び／又は転移抑制剤」の説明で記載したようなものが挙げられる。 Examples of the "substance that inhibits (X) below" include those described in the above-mentioned description of the "cancer cell growth and / or metastasis inhibitor of the present invention".
［本発明の癌マーカー］
本発明の「癌マーカー」は、（Ｙ）を識別するための癌マーカーであって、（Ｘ）を含むことを特徴とするものである。
[Cancer marker of the present invention]
The "cancer marker" of the present invention is a cancer marker for identifying (Y), and is characterized by containing (X).
（Ｘ）KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36からなる群から選択される蛋白質又はその遺伝子
（Ｙ）大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌から選択される少なくとも１種以上の癌
(X) Protein selected from the group consisting of KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 or its gene (Y) At least one or more cancers selected from colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer
≪マーカーの構成（１）≫
本発明のマーカーに用いられる、KLHL蛋白質は、kelch-like ，又はkelch like family memberなどと呼ばれるKLHL蛋白質ファミリーのうち、KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36である。
<< Marker configuration (1) >>
The KLHL protein used for the marker of the present invention is KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 among the KLHL protein families called kelch-like or kelch like family member.
これらは、各々約７５５個，約６１５個，約５８４個，又は約６１６個のアミノ酸からなる公知の蛋白質であり、その詳細は、各々下記にも示されている。
但し、KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36は、いずれもそれぞれにバリアントが複数あり、上記のアミノ酸数は、あくまでも各々の代表例である。
These are known proteins consisting of about 755, about 615, about 584, or about 616 amino acids, respectively, the details of which are also shown below.
However, KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 each have a plurality of variants, and the above amino acid number is just a representative example of each.
また、本発明のマーカーに用いられるKLHL蛋白質は、上記蛋白質の単量体のほか、多量体、又は当該蛋白質の一部のポリペプチドであっても良く、また、本発明のマーカーに用いられる遺伝子は、その配列の全部又は一部であっても良い。 The KLHL protein used in the marker of the present invention may be a multimer or a part of the polypeptide of the protein in addition to the monomer of the above protein, and the gene used in the marker of the present invention. May be all or part of the sequence.
KLHL5：https://www.uniprot.org/uniprot/Q96PQ7 KLHL5: https://www.uniprot.org/uniprot/Q96PQ7
KLHL26：https://www.uniprot.org/uniprot/Q53HC5 KLHL26: https://www.uniprot.org/uniprot/Q53HC5
KLHL27：https://www.uniprot.org/uniprot/Q9Y573 KLHL27: https://www.uniprot.org/uniprot/Q9Y573
KLHL36：https://www.uniprot.org/uniprot/Q8N4N3 KLHL36: https://www.uniprot.org/uniprot/Q8N4N3
≪マーカーの構成（２）≫
本発明のマーカーに用いられる、KLHL蛋白質遺伝子とは、上述した公知KLHL蛋白質の遺伝子であり、その詳細は、下記にも示されるものである。
<< Marker configuration (2) >>
The KLHL protein gene used in the marker of the present invention is the above-mentioned known KLHL protein gene, and the details thereof are also shown below.
KLHL5：https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=KLHL5&keywords=KLHL5 KLHL5: https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=KLHL5&keywords=KLHL5
KLHL26：https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=KLHL26&keywords=KLHL26 KLHL26: https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=KLHL26&keywords=KLHL26
KLHL27： https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=IPP&keywords=KLHL27 KLHL27: https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=IPP&keywords=KLHL27
KLHL36：https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=KLHL36&keywords=KLHL36 KLHL36: https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=KLHL36&keywords=KLHL36
≪マーカーの由来≫
本発明のマーカーを構成するKLHL蛋白質は、ヒト又はその他生物の生体に由来するものであるが、具体的には生体由来の試料（以下「生体試料」と記載する。）」中に存在するものを検出することにより、マーカーとしての役割を発揮するものである。
≪Origin of marker≫
The KLHL protein constituting the marker of the present invention is derived from the living body of a human or other living body, and specifically, is present in a living body-derived sample (hereinafter referred to as "biological sample"). By detecting the above, it exerts a role as a marker.
上記の「生体試料」としては、癌の疑いのある、或いは癌と診断された生物個体由来の試料が主に用いられるが、健常と思われる生物個体由来の試料であっても良く、それらの個体の、臓器又は組織等に由来する試料等が用いられる。 As the above-mentioned "biological sample", a sample derived from an individual organism suspected of having cancer or diagnosed as cancer is mainly used, but a sample derived from an individual organism that seems to be healthy may also be used. A sample or the like derived from an organ or tissue of an individual is used.
≪生体試料≫
具体的な生体試料としては、生体から偶然あるいは人為的に抽出された臓器又は組織の一部、生体由来細胞、又はその培養細胞、又は体液等が挙げられるが、細胞としては、培養細胞よりも採取直後の細胞の方が、より正確な情報が得られるため好ましい。
≪Biological sample≫
Specific examples of biological samples include parts of organs or tissues accidentally or artificially extracted from the living body, living body-derived cells, or cultured cells thereof, body fluids, and the like, but the cells are more than cultured cells. Immediately after collection, cells are preferable because more accurate information can be obtained.
但し、直接免疫不全マウスに移植するPDX (Patients-derived xenografts)や、３次元オルガノイド培養システム等を用いて、採取したがん細胞の形質や発現している遺伝子を保持したまま培養する方法を用いれば、培養細胞であっても、本発明における生体試料として用いることは、十分に可能である。 However, using PDX (Patients-derived xenografts) that is directly transplanted to immunodeficient mice, a three-dimensional organoid culture system, etc., a method of culturing while retaining the traits and expressed genes of the collected cancer cells is used. For example, even cultured cells can be sufficiently used as a biological sample in the present invention.
尚、体液としては、例えば下記のようなものが挙げられる。
末梢血、血清、又は血漿を含む血液、リンパ液、組織液（組織間液、細胞間液、間質液）、体腔液、漿膜腔液、胸水、腹水、心嚢液、脳脊髄液（髄液）、関節液（滑液）、眼房水（房水）等のいわゆる狭義の体液のほか、消化液、唾液、胃液、胆汁、膵液、腸液、汗、涙、鼻水、尿、精液、膣液、羊水又は母乳等の広義の体液。
Examples of body fluids include the following.
Peripheral blood, serum, or blood containing plasma, lymph, tissue fluid (interstitial fluid, interstitial fluid, interstitial fluid), body fluid, serum cavity fluid, pleural fluid, ascites, cardiac sac fluid, cerebrospinal fluid (cerebrospinal fluid), In addition to so-called body fluids such as joint fluid (interstitial fluid) and aqueous humor (aqueous humor), digestive fluid, saliva, gastric fluid, bile, pancreatic fluid, intestinal fluid, sweat, tears, nasal fluid, urine, semen, vaginal fluid, and sheep's fluid. Or body fluid in a broad sense such as breast milk.
≪マーカー利用よる効果≫
本発明のマーカーは、これを指標とした診断を行うことで、大腸癌や大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌について、その発生、進行状況、転移状況等を早期に発見することできるため、これらの癌についての、より有効な予防又は治療が可能となる。
≪Effect of using markers≫
Since the marker of the present invention can detect the onset, progress, metastasis, etc. of colorectal cancer, metastatic cancer derived from colorectal cancer, or infiltrating cancer at an early stage by performing diagnosis using this as an index. More effective prevention or treatment of cancer is possible.
具体的には、試料中の検出量が多い程、その組織又は臓器等における癌の進行度（ステージ）が高く、また他の臓器や組織への転移や浸潤等の可能性が高いと判断できる。 Specifically, it can be judged that the larger the amount detected in the sample, the higher the degree of cancer progression (stage) in the tissue or organ, and the higher the possibility of metastasis or infiltration to other organs or tissues. ..
≪マーカーの用途≫
本発明のマーカーは、後述する本発明の「診断キット」等を用いた癌診断の、診断指標となり得るほか、本発明の「癌の予防及び／又は治療薬のスクリーニング用キット」を用いた本発明の「癌の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法」に用いることができる。
≪Use of marker≫
The marker of the present invention can be a diagnostic index for cancer diagnosis using the "diagnostic kit" of the present invention described later, and the present invention using the "kit for screening for cancer prevention and / or therapeutic agent" of the present invention. It can be used in the "method for screening a drug for preventing and / or treating cancer" of the present invention.
今回、本発明者等によって、上記（Ｘ）で挙げたKLHL蛋白質、中でも特にKLHL5が、大腸癌において、進行度の高い病態、更には大腸癌に由来すると考えられる肝臓癌や肺癌において、健常な生体よりも過剰に発現していることを見出した。そのため、（Ｘ）のKLHL蛋白質、中でも特にKLHL5が、大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌の診断マーカーとして、非常に有用である。 This time, the KLHL protein mentioned in (X) above, especially KLHL5, is healthy in colorectal cancer in highly advanced pathological conditions, and in liver cancer and lung cancer which are considered to be derived from colorectal cancer. It was found that it was overexpressed than in the living body. Therefore, the KLHL protein (X), especially KLHL5, is very useful as a diagnostic marker for colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer.
［本発明の癌診断キット］
本発明の（Ｙ）の診断キットは、（Ｘ）を検出可能な物質を含むことを特徴とするものである。
（Ｘ）KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36からなる群から選択される蛋白質又はその遺伝子
（Ｙ）大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌から選択される少なくとも１種以上の癌
[Cancer Diagnostic Kit of the Present Invention]
The diagnostic kit of (Y) of the present invention is characterized by containing a substance capable of detecting (X).
(X) Protein selected from the group consisting of KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 or its gene (Y) At least one or more cancers selected from colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer
「（Ｘ）を検出可能な物質」としては、以下のようなものが挙げられる。 Examples of the "substance that can detect (X)" include the following.
１）（Ｘ）の各蛋白質に対して特異的に結合する物質
２）（Ｘ）の各遺伝子を増幅可能なプライマーセット
３）（Ｘ）の各遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ
1) A substance that specifically binds to each protein of (X) 2) A primer set capable of amplifying each gene of (X) 3) A probe that specifically hybridizes to the mRNA of each gene of (X)
１）の「（Ｘ）の各蛋白質に対して特異的に結合する物質」としては、（Ｘ）の各蛋白質に対する抗体のほか、ペプチドアプタマー、サイクリックマクロペプチド等が挙げられる。 Examples of the "substance that specifically binds to each protein of (X)" in 1) include antibodies to each protein of (X), peptide aptamers, cyclic macropeptides, and the like.
抗体としては、上述の本発明の「本発明の癌細胞の増殖及び／又は転移抑制剤」や「本発明の癌の予防及び／又は治療薬」で記載したようなものが挙げられるが、「癌診断キット」に用いる場合には、ポリクローナル抗体も、好ましい抗体として使用できる。 Examples of the antibody include those described in the above-mentioned "cancer cell growth and / or metastasis inhibitor of the present invention" and "preventive and / or therapeutic agent for cancer of the present invention" of the present invention. When used in a "cancer diagnostic kit", a polyclonal antibody can also be used as a preferred antibody.
２）のプライマーセットや、３）のプローブは、（Ｘ）の各遺伝子の配列を元に、PCRの技術分野において通常用いられている技術を用いることによって、作成することが可能である。 The primer set of 2) and the probe of 3) can be prepared based on the sequence of each gene of (X) by using a technique usually used in the technical field of PCR.
本発明の診断キットには、上記の他、通常診断キットに用いられているような他の成分を包含させることができる。 In addition to the above, the diagnostic kit of the present invention can include other components as are usually used in diagnostic kits.
尚、本発明の（Ｘ）で言う「蛋白質」には、一般的なKLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36の他、多量体、又は当該蛋白質の一部のみが切り離されたポリペプチド等も含まれる。 The "protein" referred to in (X) of the present invention includes general KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36, as well as a multimer or a polypeptide in which only a part of the protein is cleaved. ..
また、これら蛋白質の配列には、個体差があるため、一概に規定できるものではない。
そのため、上述した「（Ｘ）を検出可能な物質」にも、一般的なKLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36蛋白質の配列の個体差に応じた、各種のバリエーションがあり得る。
Moreover, since there are individual differences in the sequences of these proteins, it cannot be unconditionally defined.
Therefore, the above-mentioned "substance that can detect (X)" may have various variations depending on individual differences in the sequences of general KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 proteins.
また、本発明の（Ｘ）で言う「遺伝子」とは、アデニン（A）、グアニン（G）等のプリン塩基や、チミン（T）、ウラシル（U）、シトシン（C）等のピリミジン塩基やそれらの修飾塩基を構成要素として含むポリヌクレオチドであり、生体内に存在している、KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36の、一本鎖又は二本鎖のDNA、一本鎖又は二本鎖のRNA等が含まれる。 Further, the "gene" referred to in (X) of the present invention includes purine bases such as adenine (A) and guanine (G), pyrimidine bases such as thymine (T), uracil (U) and cytosine (C), and the like. Single- or double-stranded DNA, single-stranded or double-stranded DNA of KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36, which is a polynucleotide containing these modified bases as a component and is present in the living body. Includes RNA and the like.
尚、本発明の（Ｘ）で言う「遺伝子」には、各遺伝子の一部の断片等も含まれる。各遺伝子に特徴的な配列部分であれば、一部の遺伝子断片であっても、診断に用いることが可能だからである。 The "gene" referred to in (X) of the present invention also includes a part of each gene. This is because any gene fragment can be used for diagnosis as long as it is a sequence portion characteristic of each gene.
また、KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36遺伝子の配列にも、一塩基多型その他の個体差があるため、一概に規定できるものではない。
そのため、上述した「（Ｘ）を検出可能な物質」にも、一般的なKLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36遺伝子の配列の個体差に応じた、各種のバリエーションがあり得る。
In addition, the sequences of the KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 genes cannot be unequivocally defined because they have single nucleotide polymorphisms and other individual differences.
Therefore, the above-mentioned "substance that can detect (X)" may have various variations depending on individual differences in the sequences of general KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 genes.
［本発明の生体試料の測定方法］
本発明の「生体試料の測定方法」は、下記（１）及び（２）の工程を含むことを特徴とするものである。
[Method for measuring biological sample of the present invention]
The "method for measuring a biological sample" of the present invention is characterized by including the following steps (1) and (2).
（１）生体試料中の、（Ｘ）蛋白質の存在量又は（Ｘ）遺伝子の発現量を測定する工程
（２）（１）で測定された（Ｘ）蛋白質の存在量又は（Ｘ）遺伝子の発現量が、当該生体試料と同種の正常組織由来の対照試料中の（Ｘ）蛋白質の存在量又は（Ｘ）遺伝子の発現量と比較して多い場合に、前記生体試料が（Ｙ）の癌患者由来のものであると判定する工程
(1) Steps for measuring the abundance of (X) protein or the expression level of (X) gene in a biological sample (2) The abundance of (X) protein or the (X) gene measured in (1) When the expression level is higher than the abundance of (X) protein or the expression level of (X) gene in a control sample derived from a normal tissue of the same type as the biological sample, the biological sample is cancer of (Y). Step to determine that it is of patient origin
（Ｘ）KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36からなる群から選択される蛋白質又はその遺伝子
（Ｙ）大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌から選択される少なくとも１種以上の癌
尚、本発明の測定対象である（Ｘ）蛋白質の存在量は、上記（Ｘ）蛋白質の単量体のほか、多量体、又は当該蛋白質の一部のポリペプチド等の量から推定される量であっても良く、また、本発明の測定対象である（Ｘ）遺伝子の発現量も、その配列の一部からなる断片の量等から推定される量であっても良い。
(X) Protein selected from the group consisting of KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 or its gene (Y) At least one type of cancer selected from colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer. The abundance of the protein (X) to be measured in the present invention is an amount estimated from the amount of the monomer of the protein (X), a multimer, or a part of the polypeptide of the protein. Further, the expression level of the gene (X) to be measured in the present invention may be an amount estimated from the amount of a fragment consisting of a part of the sequence or the like.
「生体試料」とは、上述した「本発明の癌マーカー」の説明において記載した「生体試料」を言う。 The "biological sample" refers to the "biological sample" described in the above description of the "cancer marker of the present invention".
［本発明の大腸癌の進行度合い又は他の臓器や組織への転移又は浸潤の可能性を判定する方法］
本発明の「大腸癌の進行度合い又は他の臓器や組織への転移又は浸潤の可能性を判定する方法」は、下記（Ａ）及び／又は（Ｂ）の工程を含むことを特徴とするものである。
[Method for determining the degree of progression of colorectal cancer of the present invention or the possibility of metastasis or infiltration to other organs or tissues]
The "method for determining the degree of progression of colorectal cancer or the possibility of metastasis or infiltration to other organs or tissues" of the present invention is characterized by including the following steps (A) and / or (B). Is.
（Ａ）生体試料中の、（Ｘ）蛋白質の存在量又は（Ｘ）遺伝子の発現量を測定する工程
（Ｂ）（Ｘ）蛋白質の存在位置又は（Ｘ）遺伝子の発現位置を測定する工程
(A) Step of measuring the abundance of (X) protein or the expression level of (X) gene in a biological sample (B) Step of measuring the abundance position of (X) protein or the expression position of (X) gene
（Ｘ）KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36からなる群から選択される蛋白質又はその遺伝子
また、（Ａ）の（Ｘ）蛋白質の存在量は、上記（Ｘ）蛋白質の単量体のほか、多量体、又は当該蛋白質の一部のポリペプチド等の量から推測される量であっても良く、また（Ｘ）遺伝子の発現量も、その配列の一部からなる断片の量等から推測される量であっても良い。
(X) A protein selected from the group consisting of KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 or a gene thereof. The abundance of the (X) protein in (A) is large in addition to the above-mentioned (X) protein monomer. The amount may be estimated from the amount of the body or a part of the protein such as a polypeptide, and the expression level of the gene (X) is also estimated from the amount of a fragment consisting of a part of the sequence. It may be a quantity.
「存在位置」又は「発現位置」とは、（Ｘ）蛋白質又は遺伝子が存在又は発現している、生体中の位置（臓器その他の組織及び／又は当該組織中の位置）を意味する。 The "location" or "expression position" means a position in a living body (organ or other tissue and / or a position in the tissue) in which the (X) protein or gene is present or expressed.
例えば大腸は、その断面において内側より、粘膜（ｍ：粘膜上皮、粘膜固有層、陰窩（腸腺）、粘膜筋板）、粘膜下層（sm）、筋層（mp：輪筋層、筋層間神経叢、縦筋層）、漿膜（se）等に分類されるが、これらの「どこに」、「どの程度」、KLHL蛋白質が発現しているかによって、大腸癌の進行度や転移可能性が判断できる。
大腸癌は、大腸の最も内側の粘膜表面（粘膜上皮細胞）より発生し、大腸の壁に深く侵入（浸潤）するにつれて進行し、リンパ管や血管への癌細胞の侵入、あるいは癌細胞が大腸の壁を突き破って腹腔内に拡がる腹膜播種等によって、他の組織に転移すること等を通じて、全身に広がっていくことが知られているからである。
For example, in the cross section of the large intestine, the mucosa (m: mucosal epithelium, lamina propria, crypt (intestinal gland), mucosal muscularis), submucosal layer (sm), muscle layer (mp: muscular layer, muscle layer) It is classified into the muscularis membrane, muscularis propria), serous membrane (se), etc., and the degree of progression and metastasis of colon cancer are judged by the "where", "how much", and the expression of the KLHL protein. it can.
Colorectal cancer develops from the innermost mucosal surface (mucosal epithelial cells) of the large intestine and progresses as it invades (invades) the wall of the large intestine. Invasion of cancer cells into lymph vessels and blood vessels, or cancer cells in the large intestine. This is because it is known that the peritoneal dissemination that breaks through the wall of the large intestine and spreads into the large intestine spreads to other tissues and spreads to the whole body.
KLHL蛋白質の発現が、粘膜や粘膜下層中に留まっている場合には、早期癌（粘膜内癌（m癌）、粘膜下層癌（sm癌）等）と診断でき、筋層や漿膜等にまで発現が見られる場合には、進行癌（mp癌、se癌）と診断でき、既に転移している或いは将来転移する可能性が高くなる。
また、上記分類中、同じ層中であっても、大腸の内側から外側（下層）に向かって大腸壁の深い位置での発現である程、進行度や転移可能性が高くなると判断される。
If the expression of KLHL protein remains in the mucous membrane or submucosa, it can be diagnosed as early stage cancer (intramucosal cancer (m cancer), submucosal cancer (sm cancer), etc.), and even in the muscle layer and serosa. If it is expressed, it can be diagnosed as advanced cancer (mp cancer, se cancer), and there is a high possibility that it has already metastasized or will metastasize in the future.
In addition, in the above classification, it is judged that the degree of progression and the possibility of metastasis increase as the expression is deeper in the large intestine wall from the inside to the outside (lower layer) of the large intestine even in the same layer.
今回、本発明者等によって、上記（Ｘ）で挙げたKLHL蛋白質、中でも特にKLHL5が、大腸癌において、進行度の高い病態、更には大腸癌に由来すると考えられる肝臓癌や肺癌において、健常な生体よりも過剰に発現していることが見出された。そのため、（Ｘ）のKLHL蛋白質、中でもKLHL5が、大腸癌の進行度合い又は他臓器への転移の可能性を判定するために、特に有用であることも同時に明らかとなった。 This time, the KLHL protein mentioned in (X) above, especially KLHL5, is healthy in colorectal cancer in highly advanced pathological conditions, and in liver cancer and lung cancer which are considered to be derived from colorectal cancer. It was found that it was overexpressed than in the living body. Therefore, it was also revealed that the KLHL protein (X), especially KLHL5, is particularly useful for determining the degree of progression of colorectal cancer or the possibility of metastasis to other organs.
［本発明の癌の予防及び／又は治療薬のスクリーニング用キット］
本発明の「（Ｙ）の予防及び／又は治療薬のスクリーニング用キット」は、（Ｘ）蛋白質又はその遺伝子を含むことを特徴とするものである。
[Kit for screening for preventive and / or therapeutic agents for cancer of the present invention]
The "kit for screening a preventive and / or therapeutic agent for (Y)" of the present invention is characterized by containing (X) protein or a gene thereof.
（Ｘ）KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36からなる群から選択される蛋白質又はその遺伝子
（Ｙ）大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌から選択される少なくとも１種以上の癌
(X) Protein selected from the group consisting of KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 or its gene (Y) At least one or more cancers selected from colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer
本発明の「スクリーニング用キット」は、後述する本発明の「大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法」に用いることができる。 The "screening kit" of the present invention can be used in the "screening method for a preventive and / or therapeutic agent for colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer" of the present invention described later.
≪構成成分≫ ≪Components≫
（Ｘ）に挙げたKLHL蛋白質は、例えばセルフリーサイエンス社（http://www.cfsciences.com）受託で合成をオーダーし、購入することが可能である。 The KLHL protein listed in (X) can be ordered and purchased for synthesis by, for example, Self-Free Science Co., Ltd. (http://www.cfsciences.com).
（Ｘ）に挙げたKLHL蛋白質遺伝子は、例えば下記に示したように（公財）かずさDNA研究所等を通じて、市場から入手可能である。 The KLHL protein gene listed in (X) can be obtained from the market through, for example, the Kazusa DNA Research Institute (public interest incorporated foundation) as shown below.
http://www.biosupport.kazusa.or.jp/sub_center1/clone.html#human_clone http://www.biosupport.kazusa.or.jp/sub_center1/clone.html#human_clone
尚、本発明に用いられるKLHL蛋白質は、上記蛋白質の単量体のほか、多量体、又は当該蛋白質の一部のポリペプチドであっても良く、また、本発明に用いられる遺伝子は、その配列の全部又は一部であっても良い。
また本発明で言う、KLHL遺伝子には、これまで報告されているような一塩基多型その他の変異体等も含まれる。
The KLHL protein used in the present invention may be a multimer or a partial polypeptide of the protein in addition to the monomer of the above protein, and the gene used in the present invention is a sequence thereof. May be all or part of.
The KLHL gene referred to in the present invention also includes single nucleotide polymorphisms and other mutants as previously reported.
［本発明のスクリーニング方法］
本発明の「（Ｙ）の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法」は、上記本発明の「（Ｙ）の予防及び／又は治療薬のスクリーニング用キット」を用いることを特徴とするものである。
[Screening method of the present invention]
The "method for screening a preventive and / or therapeutic agent for (Y)" of the present invention is characterized by using the "kit for screening a preventive and / or therapeutic agent for (Y)" of the present invention. ..
具体的には、投与対象（生体や細胞や実験試料等）に、被験物質を投与した前後での、「（Ｘ）の蛋白質又は遺伝子」の量や機能を測定し、（Ｘ）の発現量の増加が抑制又は発現量が減少している場合、或いは（Ｘ）の機能が低下している場合に、（Ｙ）の癌の予防及び／又は治療薬の候補物質として選択することによって、実施することができる。 Specifically, the amount and function of "protein or gene of (X)" before and after administration of the test substance to the administration target (living body, cells, experimental sample, etc.) are measured, and the expression level of (X) is measured. When the increase in (Y) is suppressed or the expression level is decreased, or when the function of (X) is decreased, it is carried out by selecting it as a candidate substance for the preventive and / or therapeutic agent for the cancer of (Y). can do.
［実施例１〜１０，比較例１〜１１：大腸癌細胞の増殖抑制剤］
各種KLHL蛋白質（KLHL2、3、4、5、6、9、12、19、26、27、36、37、39）遺伝子に対する「siRNA」、又は「抗KLHL5抗体」からなる、大腸癌細胞の増殖抑制剤を製造した。
各siRNA配列は、後述する表１及び配列表に、抗体の詳細については表２に示した通りである。
[Examples 1 to 10, Comparative Examples 1 to 11: Colorectal cancer cell growth inhibitor]
Proliferation of colorectal cancer cells consisting of "siRNA" or "anti-KLHL5 antibody" against various KLHL protein (KLHL2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 19, 26, 27, 36, 37, 39) genes An inhibitor was produced.
Each siRNA sequence is shown in Table 1 and the sequence listing described later, and the details of the antibody are shown in Table 2.
尚、KLHL蛋白質（KLHL5、26、27、又は36）の遺伝子に対する「siRNA」を［実施例１〜９］（表１）
「抗KLHL5抗体」(product number ; HPA013958, SIGMA社)を、［実施例１０］（表２）
KLHL蛋白質（KLHL2、3、4、6、9、12、19、37、又は39）の遺伝子に対する「siRNA」を［比較例１〜９］（表１）
とした。
また、CUL3蛋白質の遺伝子に対する「siRNA」を［比較例１０］（表１）とした。
In addition, "siRNA" for the gene of KLHL protein (KLHL5, 26, 27, or 36) was used in [Examples 1 to 9] (Table 1).
"Anti-KLHL5 antibody" (product number; HPA013958, SIGMA), [Example 10] (Table 2)
"SiRNA" for the gene of KLHL protein (KLHL2, 3, 4, 6, 9, 12, 19, 37, or 39) [Comparative Examples 1-9] (Table 1)
And said.
In addition, "siRNA" for the gene of CUL3 protein was designated as [Comparative Example 10] (Table 1).
また、表１に記載の、siControlをSigma社より購入し、対照例１とした。 In addition, siControl shown in Table 1 was purchased from Sigma and used as Control Example 1.
［試験例］
以下の試験例によって、本発明の各種の抑制剤等の効果を確認した。
尚、各試験例において用いたsiRNA、蛋白質の分離・検出方法、検出用抗体等は下記の通りである。
[Test example]
The effects of various inhibitors of the present invention were confirmed by the following test examples.
The siRNA, protein separation / detection method, detection antibody, etc. used in each test example are as follows.
≪材料及び方法：Material and method≫
（siRNA試薬）
各試験例で使用したsiRNA試薬の配列は、表１及び配列表に示した通りである。
≪Material and method≫
(SiRNA reagent)
The sequences of the siRNA reagents used in each test example are as shown in Table 1 and the sequence listing.
（KLHL蛋白質抗体）
各試験例で使用したKLHL蛋白質抗体は、表２に示したものを使用した。
(KLHL protein antibody)
The KLHL protein antibody used in each test example was as shown in Table 2.
［試験例１：大腸癌細胞の増殖抑制試験］
下記のプロトコルに従って、実施例1、６、７、８、比較例１〜１０及び対照例１の「細胞増殖抑制剤」を用いて、大腸癌細胞HCT116の増殖抑制試験を実施した。
[Test Example 1: Colorectal cancer cell growth suppression test]
A growth inhibition test of colorectal cancer cell HCT116 was carried out using the "cell growth inhibitors" of Examples 1, 6, 7, 8 and Comparative Examples 1 to 10 and Control Example 1 according to the following protocol.
（プロトコル）
上記した実施例、比較例、対照例の各増殖抑制剤（siRNA）を用い、大腸癌細胞株HCT116（ヒト結腸腺癌）のノックダウンを行った。siRNAの導入に際し、ThermoFisher scientific社製のリポフェクション試薬を使用した。
siRNA処理した細胞を培養皿（96well）に播種し（1.0x104/well/100μL）、72時間培養した。
尚、培地としては、［McCoy’s 5A培地＋FBS10％］を用いた。
ナカライテスク株式会社製の、試験例３で詳述するMTTアッセイ試薬を添加し、30分後にマルチプレートリーダーを用い吸光度(450nm)を測定し、各増殖抑制剤（siRNA）による細胞増殖抑制効果を評価した。
(protocol)
The colon cancer cell line HCT116 (human colon adenocarcinoma) was knocked down using each of the growth inhibitors (siRNAs) of the above-mentioned Examples, Comparative Examples, and Control Examples. A lipofection reagent manufactured by Thermo Fisher scientific was used for the introduction of siRNA.
The siRNA-treated cells were seeded in a culture dish (96 well) (1.0x10 4 / well / 100 μL) and cultured for 72 hours.
As the medium, [McCoy's 5A medium + FBS 10%] was used.
The MTT assay reagent manufactured by Nacalai Tesque, Inc., which will be described in detail in Test Example 3, was added, and after 30 minutes, the absorbance (450 nm) was measured using a multi-plate reader to determine the cell growth inhibitory effect of each growth inhibitor (siRNA). evaluated.
（結果）
図１に示すように、対照例や比較例１〜１０の「細胞増殖抑制剤」（siRNA）には、大腸癌細胞株HCT116細胞の増殖抑制効果は、殆ど無かったのに対し、下記の（Ｘ）のKLHL蛋白質遺伝子を阻害する実施例１（siKLHL5＃１）、６（siKLH26）、７（siKLHL27）、８（siKLHL36）の各種「細胞増殖抑制剤」（siRNA）（枠で囲った写真のもの）は、大腸癌細胞株HCT116細胞の増殖を、いずれも顕著に抑制した。
(result)
As shown in FIG. 1, the "cell growth inhibitor" (siRNA) of Control Examples and Comparative Examples 1 to 10 had almost no growth inhibitory effect on the colon cancer cell line HCT116 cells, whereas the following ( Various "cell growth inhibitors" (siRNA) of Example 1 (siKLHL5 # 1), 6 (siKLH26), 7 (siKLHL27), 8 (siKLHL36) that inhibit the KLHL protein gene of X) (framed photo) ) Remarkably suppressed the proliferation of colon cancer cell line HCT116 cells.
（考察）
従って、siKLHL5、siKLHL26、siKLHL27、又はsiKLHL36を主成分とする大腸癌細胞の「細胞増殖抑制剤」が、大腸癌を初めとする、下記（Ｙ）の各種癌の、予防及び／又は治療薬としても使用可能であることは明らかである。
(Discussion)
Therefore, the "cell growth inhibitor" of colorectal cancer cells containing siKLHL5, siKLHL26, siKLHL27, or siKLHL36 as the main component can be used as a preventive and / or therapeutic agent for various cancers (Y) below, including colorectal cancer. It is clear that can also be used.
（Ｙ）大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌から選択される少なくとも１種以上の癌 (Y) At least one type of cancer selected from colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer
［試験例２：大腸癌細胞の遊走抑制試験］
下記のプロトコルに従って、実施例1及び対照例１の「細胞増殖抑制剤」を用いて、大腸癌細胞HCT116の遊走抑制試験を実施した。
[Test Example 2: Colorectal cancer cell migration suppression test]
A migration inhibition test of colorectal cancer cell HCT116 was carried out using the "cell growth inhibitor" of Example 1 and Control Example 1 according to the following protocol.
（プロトコル）
試験例１と同様の手法で、siRNAを用い、大腸癌細胞株HCT116中のKLHL5のノックダウンを行った。
ノックダウン処理したHCT116用いトランスウェル（Transwell（登録商標）システムにより、遊走能に与える影響を評価した。
トランスウェルシステムとは、培養皿が2重になったもので、受け皿となるマルチプレートと細胞が通過できる小孔（8 μm pore size）を持つトランウェルインサートからなる、コーニングインターナショナル社のシステムである。トランスウェルシステムのより詳細なプロトコルは、例えば下記のURL等に掲載されている。
https://www.corning.com/jp/jp/products/life-sciences/products/permeable-supports/transwell-guidelines.html
受け皿となるマルチプレート(24 well)の各wellに、細胞遊走活性化作用を有するFBSを下記の通常培地（10％）より高濃度（20%）に調整した培地［McCoy’s 5A培地＋FBS20％］を加え、次にトランウェルインサートを、マルチプレートの各wellに、トランウェルインサートの各コンパートメントが対応するように嵌め込んだ。
各々のコンパートメント内に、上述のノックダウン処理したHCT116を通常培地［McCoy’s 5A培地＋FBS10％］とともに加えた(3.5x105/well/mL)。
48時間培養後、トランウェルインサートの上層側の細胞を綿棒で拭き取った後に、トランウェルインサートの下層側に付着している細胞を100％のメタノール用いて固定した。さらに２％のクリスタルバイオレットで染色を行い、トランウェルインサートを通過した細胞数を計測した。
(protocol)
Knockdown of KLHL5 in colorectal cancer cell line HCT116 was performed using siRNA in the same manner as in Test Example 1.
The effect on migratory performance was evaluated by the Transwell (registered trademark) system using the knockdown-treated HCT116.
The Transwell system is a system of Corning International, which consists of a double culture dish, a multi-plate serving as a saucer, and a transwell insert with a small pore size (8 μm pore size) through which cells can pass. .. A more detailed protocol for the transwell system is posted, for example, at the following URL.
https://www.corning.com/jp/jp/products/life-sciences/products/permeable-supports/transwell-guidelines.html
In each well of the multi-plate (24 well) serving as a saucer, a medium [McCoy's 5A medium + FBS 20%] prepared by adjusting the concentration (20%) of FBS having a cell migration activating effect to a higher concentration (20%) than the following normal medium (10%). In addition, the Tranwell inserts were then fitted into each well of the multiplate so that each compartment of the Tranwell inserts corresponded.
In each compartment, the knockdown-treated HCT116 described above was added with normal medium [McCoy's 5A medium + FBS 10%] (3.5x10 5 / well / mL).
After culturing for 48 hours, the cells on the upper layer side of the Tranwell insert were wiped off with a cotton swab, and then the cells adhering to the lower layer side of the Tranwell insert were fixed with 100% methanol. Further staining was performed with 2% crystal violet, and the number of cells that passed through the Tranwell insert was counted.
（結果）
図２に示すように、対照例と比較して、実施例１の「細胞増殖抑制剤」（siKLHL5＃１）によって、大腸癌細胞株HCT116細胞の遊走を、顕著に抑制していることが分かった。
(result)
As shown in FIG. 2, it was found that the migration of colon cancer cell line HCT116 cells was significantly suppressed by the “cell growth inhibitor” (siKLHL5 # 1) of Example 1 as compared with the control example. It was.
（考察）
上述の結果から、KLHL5の遺伝子を阻害する物質は、大腸癌細胞の増殖及び／又は転移抑制剤，あるいは大腸癌の予防及び／又は治療薬となり得ることが分かった。
(Discussion)
From the above results, it was found that a substance that inhibits the KLHL5 gene can be a growth and / or metastasis inhibitor for colorectal cancer cells, or a preventive and / or therapeutic agent for colorectal cancer.
［試験例３：大腸癌細胞の増殖抑制試験（MTTアッセイ法による定量）］
下記のプロトコルに従って、実施例1、６、７比較例１０及び対照例１の「細胞増殖抑制剤」を用いて、大腸癌細胞HCT116の増殖抑制試験を実施した。
[Test Example 3: Colorectal cancer cell growth suppression test (quantitative by MTT assay)]
A growth inhibition test of colorectal cancer cell HCT116 was carried out using the "cell growth inhibitor" of Examples 1, 6 and 7 Comparative Example 10 and Control Example 1 according to the following protocol.
（プロトコル）
試験例１と同様の方法で、実施例、比較例、対照例の各「細胞増殖抑制剤」（siRNA）をHCT116細胞に導入後、下記のMTTアッセイ法による癌細胞の生細胞数測定を行い、各siRNAの癌細胞増殖抑制効果を確認した。
(protocol)
After introducing each "cell growth inhibitor" (siRNA) of Examples, Comparative Examples, and Control Examples into HCT116 cells by the same method as in Test Example 1, the number of viable cancer cells was measured by the following MTT assay method. , The cancer cell growth inhibitory effect of each siRNA was confirmed.
（MTTアッセイ法）
3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド (MTTアッセイ試薬)が、生細胞のミトコンドリアで開裂し、暗青色のホルマザンを生成することを利用し、生細胞を測定した。
(MTT assay method)
Utilizing the fact that 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT assay reagent) cleaves in the mitochondria of living cells to produce dark blue formazan, living cells Was measured.
具体的には、該当する細胞を96well培養皿に播種し（1.0x104/well/100μL）、72時間培養後に培養液を吸引した。100μLのPBSを各wellに添加し、さらにナカライテスク株式会社製のMTTアッセイ試薬を10μL添加した。30分後にマルチプレートリーダーを用いて吸光度（450nm）を測定し、生細胞数を反映する細胞活性を測定した。
尚、培地としては、［McCoy’s 5A培地＋FBS10％］を用いた。
また、KLHL蛋白質発現と大腸癌との因果関係調査の一環として、KLHL5蛋白質の、ユビキチンリガーゼ（E3）アダプターとしての可能性を探るため、E3のプラットフォームであるCUL3蛋白質についても、比較例１０のsiCUL3を用いて、発現抑制試験を行った。
Specifically, the corresponding cells were seeded in a 96-well culture dish (1.0x10 4 / well / 100 μL), and the culture solution was aspirated after culturing for 72 hours. 100 μL of PBS was added to each well, and 10 μL of MTT assay reagent manufactured by Nacalai Tesque, Inc. was further added. After 30 minutes, the absorbance (450 nm) was measured using a multi-plate reader, and the cell activity reflecting the number of viable cells was measured.
As the medium, [McCoy's 5A medium + FBS 10%] was used.
In addition, as part of the investigation of the causal relationship between KLHL protein expression and colorectal cancer, in order to explore the possibility of KLHL5 protein as a ubiquitin ligase (E3) adapter, the CUL3 protein, which is the platform of E3, was also used as siCUL3 in Comparative Example 10. Was used to perform an expression suppression test.
（結果）
図３に示すように、比較例や対照例と比較して、実施例1（siKLHL5＃１）、実施例６（siKLHL26）、実施例７（siKLHL27）の「細胞増殖抑制剤」によって、大腸癌細胞株HCT116細胞の生細胞数が、顕著に減少していることが分かった。
(result)
As shown in FIG. 3, as compared with Comparative Examples and Control Examples, colorectal cancer was caused by the "cell growth inhibitor" of Example 1 (siKLHL5 # 1), Example 6 (siKLHL26), and Example 7 (siKLHL27). It was found that the viable cell number of the cell line HCT116 cells was significantly reduced.
（考察）
上述の結果から、KLHL5、26、27の遺伝子を阻害する物質は、大腸癌細胞の増殖及び／又は転移抑制剤，あるいは大腸癌の予防及び／又は治療薬となり得ることが分かった。
(Discussion)
From the above results, it was found that a substance that inhibits the genes of KLHL5, 26, 27 can be a growth and / or metastasis inhibitor of colorectal cancer cells, or a preventive and / or therapeutic agent for colorectal cancer.
尚、比較例１０のsiCUL3によって、むしろ大腸癌細胞の生細胞が増加しているのは、CUL3は、ユビキチンリガーゼ（E3）のプラットフォームとして、183種の「基質受容体」と相互作用し、またそれぞれの基質受容体が複数の「基質」をユビキチン化の標的とすることから、CUL3ノックダウンの効果が極めて多岐に及び、かつ大きいためと考えられる。 It should be noted that siCUL3 in Comparative Example 10 rather increases the number of viable colon cancer cells because CUL3 interacts with 183 kinds of "substrate receptors" as a platform for ubiquitin ligase (E3). It is considered that the effect of CUL3 knockdown is extremely diverse and large because each substrate receptor targets a plurality of "substrates" for ubiquitination.
［試験例４：癌細胞の特性（足場非依存性）の残存確認試験（１）］
下記のプロトコルに従って、実施例1、７及び対照例１の「細胞増殖抑制剤」を用いて、細胞接着阻止剤（poly HEMA：ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリラレート)）を使用した培養皿での培養における、大腸癌細胞HCT116の特性（足場非依存性）の残存確認試験を実施した。
[Test Example 4: Residual confirmation test of cancer cell characteristics (scaffold-independent) (1)]
In culture dishes with cell adhesion inhibitors (poly HEMA: poly (2-hydroxyethyl methacrylate)) using the "cell growth inhibitors" of Examples 1 and 7 and Control Example 1 according to the protocol below. A residual confirmation test of the characteristics (scaffold-independent) of colon cancer cell HCT116 was carried out in the culture of.
（プロトコル）
試験例１と同様の手法で、siRNA処理により、大腸癌細胞株、HCT116のKLHL5 ノックダウンを行った。
細胞接着阻止剤（poly HEMA）の塗布された培養皿（24well）にKLHL5 ノックダウン HCT116を播種（5x104/well/mL）した。
尚、培地としては、［McCoy’s 5A培地＋FBS10％］を用いた。
48時間培養後に細胞を培養皿から回収し、遠心分離（2,000rpm，3分）後、上澄を除去した。
遠心チューブ内にトリプシン100μLを添加して、チューブ内に付着した細胞を剥離し、細胞懸濁液を調整した。
細胞懸濁液10μLに対しトリパンブルー10μLを加え、細胞の染色を行った。生存している細胞数を計測し、KLHL5の足場非依存性への影響を評価した。
(protocol)
KLHL5 knockdown of colon cancer cell line, HCT116, was performed by siRNA treatment in the same manner as in Test Example 1.
KLHL5 knockdown HCT116 was seeded (5x10 4 / well / mL) in culture dishes (24 wells) coated with a cell adhesion inhibitor (poly HEMA).
As the medium, [McCoy's 5A medium + FBS 10%] was used.
After culturing for 48 hours, the cells were collected from the culture dish, centrifuged (2,000 rpm, 3 minutes), and the supernatant was removed.
100 μL of trypsin was added into the centrifuge tube to exfoliate the cells adhering to the tube to prepare a cell suspension.
Trypan blue 10 μL was added to 10 μL of the cell suspension, and the cells were stained. The number of surviving cells was counted and the effect of KLHL5 on scaffold independence was evaluated.
（結果）
通常のがん細胞は足場非依存性増殖を示すためpoly HEMA処理培養ディッシュ上でも増殖するが、図４に示すように、実施例１（siKLHL5＃１）、７（siKLHL27）の「細胞増殖抑制剤」の添加によって、HCT116細胞の増殖が抑制されていることが分かった。
これは、KLHL5又はKLHL27に対するsiRNA処理によって、大腸癌細胞HCT116が、その特性である足場非依存性増殖能を失っていた（細胞−マトリクス間の接着喪失により誘導されるアポトーシス（細胞自死）つまりアノイキス（anoikis）を起こした）ことを意味している。
(result)
Since normal cancer cells show scaffold-independent growth, they also grow on poly HEMA-treated culture dishes, but as shown in FIG. 4, "cell growth suppression" in Examples 1 (siKLHL5 # 1) and 7 (siKLHL27) It was found that the addition of the "drug" suppressed the proliferation of HCT116 cells.
This is because colorectal cancer cell HCT116 lost its characteristic scaffold-independent proliferative capacity by siRNA treatment for KLHL5 or KLHL27 (apoptosis induced by loss of cell-matrix adhesion (cell self-death)). It means that it caused anoikis).
（考察）
上述の結果から、KLHL5又はKLHL27の遺伝子を阻害する物質は、大腸癌細胞の増殖及び／又は転移抑制剤，あるいは大腸癌の予防及び／又は治療薬となり得ることが分かった。
(Discussion)
From the above results, it was found that a substance that inhibits the KLHL5 or KLHL27 gene can be a growth and / or metastasis inhibitor for colorectal cancer cells, or a preventive and / or therapeutic agent for colorectal cancer.
［試験例５：癌細胞の特性（足場非依存性）の残存確認試験（２）］
下記のプロトコルに従って、実施例1、７及び対照例１の「細胞増殖抑制剤」を用いて、軟寒天培地での培養における大腸癌細胞HCT116の特性（足場非依存性）の残存確認試験を実施した。
[Test Example 5: Residual confirmation test of cancer cell characteristics (scaffold-independent) (2)]
A residual confirmation test of the characteristics (scaffold-independent) of colorectal cancer cell HCT116 in culture on soft agar was carried out using the "cell growth inhibitors" of Examples 1 and 7 and Control Example 1 according to the following protocol. did.
（プロトコル）
試験例１と同様の手法で、siRNAを用い大腸癌細胞株、HCT116のKLHL5のノックダウンを行った。軟寒天培地（6well）にKLHL5 ノックダウン HCT116を播種し（1.0x104/well）、4週間培養した。100μm以上の大きさのコロニー数を測定し、KLHL5の足場非依存性増殖能への影響を評価した。
(protocol)
Knockdown of KLHL5 of colon cancer cell line, HCT116, was performed using siRNA by the same method as in Test Example 1. KLHL5 knockdown HCT116 was seeded on soft agar medium (6 well) (1.0x10 4 / well) and cultured for 4 weeks. The number of colonies with a size of 100 μm or more was measured, and the effect of KLHL5 on the scaffold-independent growth ability was evaluated.
（結果）
野生型HCT116細胞は足場非依存性増殖を示すため軟寒天培地でも増殖するが、図５に示すように、実施例１又は７の「細胞増殖抑制剤」（KLHL5又はKLHL27に対するsiRNA処理）の使用によって、HCT116細胞の増殖が抑制されており、癌細胞の特性である足場非依存性増殖能を失ったと言える。
(result)
Wild-type HCT116 cells also grow on soft agar because they exhibit scaffold-independent growth, but as shown in FIG. 5, use of the "cell growth inhibitor" (siRNA treatment for KLHL5 or KLHL27) of Example 1 or 7. It can be said that the proliferation of HCT116 cells was suppressed and the scaffold-independent proliferation ability, which is a characteristic of cancer cells, was lost.
（考察）
上述の結果から、KLHL5又はKLHL27の遺伝子を阻害する物質は、大腸癌細胞の増殖及び／又は転移抑制剤，あるいは大腸癌の予防及び／又は治療薬となり得ることが分かった。
(Discussion)
From the above results, it was found that a substance that inhibits the KLHL5 or KLHL27 gene can be a growth and / or metastasis inhibitor for colorectal cancer cells, or a preventive and / or therapeutic agent for colorectal cancer.
［試験例６：各種siKLHL5による大腸癌細胞のKLHL5の発現量確認試験］
実施例１〜５の、複数種類の「細胞増殖抑制剤」（siKLHL5）を用いて、大腸癌細胞HCT116中における、KLHL5の発現量の抑制効果を比較した。コントロールとして、対照例１のsiControlを用いた。
[Test Example 6: Confirmation test of KLHL5 expression level in colorectal cancer cells by various siKLHL5]
Using a plurality of types of "cell growth inhibitors" (siKLHL5) of Examples 1 to 5, the effect of suppressing the expression level of KLHL5 in colorectal cancer cell HCT116 was compared. As a control, siControl of Control Example 1 was used.
図６から分かる通り、実施例１〜５の各「細胞増殖抑制剤」（siKLHL5）には、いずれも非常に高いKLHL5の発現抑制効果が見られた。
尚、図には示していないが、Silencer Select社製のsiKLHL5（#4427037 Silencer(R) Select Pre-designed siRNA, inventoried, std purity,1 nmol siRNA ID: s27397）によっても、実施例１〜５程では無いものの、明確なKLHL5の発現抑制効果が見られた。
As can be seen from FIG. 6, each of the "cell growth inhibitors" (siKLHL5) of Examples 1 to 5 showed a very high KLHL5 expression inhibitory effect.
Although not shown in the figure, Examples 1 to 5 can also be used with siKLHL5 (# 4427037 Silencer (R) Select Pre-designed siRNA, inventoried, std purity, 1 nmol siRNA ID: s27397) manufactured by Silencer Select. Although not, a clear inhibitory effect on the expression of KLHL5 was observed.
（考察）
このことは、実施例１〜５のsiKLHL5が、大腸癌細胞の増殖及び／又は転移抑制剤，あるいは大腸癌の予防及び／又は治療薬として有用であることを示している。
(Discussion)
This indicates that siKLHL5 of Examples 1 to 5 is useful as an agent for suppressing the proliferation and / or metastasis of colorectal cancer cells, or as a preventive and / or therapeutic agent for colorectal cancer.
［試験例７：siKLHL5によるKLHL5ノックダウン特異性の確認試験］
下記のプロトコルに従って、本発明の「細胞増殖抑制剤」（siRNA）により、大腸癌細胞HCT116において、KLHL5蛋白質の発現が特異的に抑制されていることを確認した。
[Test Example 7: Confirmation test of KLHL5 knockdown specificity by siKLHL5]
According to the protocol below, it was confirmed that the expression of KLHL5 protein was specifically suppressed in colorectal cancer cell HCT116 by the "cell growth inhibitor" (siRNA) of the present invention.
（プロトコル）
（i）融合遺伝子の作成
野生型のKLHL5遺伝子（ＷＴ）、及び実施例１又は２各々のsiKLHL5に対して抵抗性を持つようにsiRNA標的領域に変異を導入したKLHL5遺伝子（Mut1，Mut2）の、合計３種のKLHL5遺伝子を、それぞれFLAG遺伝子に結合し、３種類のFLAG標識KLHL5融合遺伝子（FLAG−KLHL5遺伝子）を作成した。
(protocol)
(I) Preparation of fusion gene The wild-type KLHL5 gene (WT) and the KLHL5 gene (Mut1, Mut2) in which a mutation was introduced into the siRNA target region so as to have resistance to each siKLHL5 of Example 1 or 2 , A total of 3 types of KLHL5 genes were bound to each FLAG gene to prepare 3 types of FLAG-labeled KLHL5 fusion genes (FLAG-KLHL5 genes).
（ii）遺伝子導入
(ii-1)HCT116細胞に対照例１，実施例１，又は実施例２のsiRNA（siKLHL5 ＃１，＃２）を、各々リポフェクション試薬「Lipofectamine RNAi max」(Invitrogen社製)を用いてトランスフェクションし、２４時間培養した。
(ii-2)(ii-1)の3種のHCT116細胞各々に、（i）で作成した３種類のFLAG−KLHL5融合遺伝子を、リポフェクション試薬「GeneJuice」(Millipore社製)を用いてトランスフェクションし、通常の培養条件（McCoy’s 5A培地+FBS(10％) 、５％CO2）下で４８時間、細胞培養することによって、それぞれのFLAG−KLHL5蛋白質を強制発現させた。
(Ii) Gene transfer
(ii-1) Transfection of HCT116 cells with siRNAs of Control Example 1, Example 1 or Example 2 (siKLHL5 # 1, # 2) using the lipofection reagent "Lipofectamine RNAi max" (manufactured by Invitrogen). And cultured for 24 hours.
(ii-2) Transfection of each of the three types of HCT116 cells of (ii-1) with the three types of FLAG-KLHL5 fusion genes prepared in (i) using the lipofection reagent "Gene Juice" (manufactured by Millipore). Then, each FLAG-KLHL5 protein was forcibly expressed by culturing the cells under normal culture conditions (McCoy's 5A medium + FBS (10%), 5% CO 2 ) for 48 hours.
（iii）KLHL5蛋白質の検出
（ii）でKLHL5を過剰発現させた後、KLHL5蛋白質を、表２記載の抗FLAG抗体で検出することによって検証した。
尚、内因性コントロールとして、β−アクチンを使用した。
(Iii) Detection of KLHL5 protein After overexpressing KLHL5 in (ii), the KLHL5 protein was verified by detecting with the anti-FLAG antibody shown in Table 2.
In addition, β-actin was used as an endogenous control.
（結果）
図７から分かる通り、野生型のKLHL5を導入した細胞では、実施例１及び実施例２のいずれのsiRNA（siKLHL5 ＃１，＃２）によっても、KLHL5の発現を抑制できた。
(result)
As can be seen from FIG. 7, in the wild-type KLHL5-introduced cells, the expression of KLHL5 could be suppressed by any of the siRNAs of Example 1 and Example 2 (siKLHL5 # 1 and # 2).
一方、siRNA標的領域に変異を導入したKLHL5遺伝子（Mut1，Mut2）を導入した細胞では、導入した変異を含む部位を標的とする方のsiRNA（Mut1に対するsiKLHL5 ＃１，Mut2に対するsiKLHL5 ＃２）では、KLHL5の発現抑制効果が失われており、実施例１及び実施例２よるKLHL5の発現抑制が、siRNAによる特異的なものであることが判明した。 On the other hand, in cells into which the KLHL5 gene (Mut1, Mut2) into which a mutation has been introduced into the siRNA target region has been introduced, the siRNA targeting the site containing the introduced mutation (siKLHL5 # 1 for Mut1 and siKLHL5 # 2 for Mut2) , The expression-suppressing effect of KLHL5 was lost, and it was found that the expression-suppressing effect of KLHL5 by Example 1 and Example 2 was specific to siRNA.
（考察）
上記の結果は、実施例１，２に代表されるsiKLHL5試薬が、大腸癌細胞の増殖抑制剤となり得ることに加えて、そのKLHL5の発現抑制作用が非常に特異的ものであることから、より副作用の少ない、大腸癌の予防及び／又は治療剤となり得ることを示している。
(Discussion)
The above results are based on the fact that the siKLHL5 reagent represented by Examples 1 and 2 can be a growth inhibitor for colorectal cancer cells and that the KLHL5 expression inhibitory action is very specific. It has been shown that it can be a prophylactic and / or therapeutic agent for colorectal cancer with few side effects.
［試験例８：KLHL5遺伝子（mRNA）の大腸癌マーカーとしての利用可能性］
「大腸癌」及び「ヒト大腸腺腫」におけるKLHL5 mRNAの発現を、real-time PCRで確認した。
[Test Example 8: Possibility of KLHL5 gene (mRNA) as a marker for colorectal cancer]
The expression of KLHL5 mRNA in "colorectal cancer" and "human colorectal adenoma" was confirmed by real-time PCR.
（プロトコル）
パラフィン包埋された臨床検体(「進行大腸癌」18サンプル、「低異形度腺腫」9サンプル)より、Maxwell 16 LEV RNA FFPE kit (Promega社)を使用してmRNAを抽出した。
比較対象とするコントロールとしては、同一臨床検体の非腫瘍部位より採取し、同様に抽出したmRNAを用いた。
抽出したmRNAを、「KLHL5特異的プライマー」及び「PrimeScript 1strand cDNA synthesis kit（製品コードTKR 6110）、タカラバイオ社システム」を用いてcDNAに変換し、TaqMan Gene Expression Assay(applied biosystems社)を使用し、ABI 7500fastによりreal-time PCRを用いて増幅した。
real-time PCRの結果を示す「増幅曲線」の、ミッドポイント（S字曲線の変曲点）の値を、KLHL5 mRNAの発現量を反映したデータとして、本試験例の比較・検証に用いた。
内因性コントロールはGAPDHを使用し、結果は対コントロール比で比較検討した。
(protocol)
MRNA was extracted from paraffin-embedded clinical specimens (18 samples of "advanced colorectal cancer" and 9 samples of "low-grade adenoma") using the Maxwell 16 LEV RNA FFPE kit (Promega).
As a control to be compared, mRNA collected from a non-tumor site of the same clinical sample and similarly extracted was used.
The extracted mRNA is converted to cDNA using "KLHL5-specific primer" and "PrimeScript 1strand cDNA synthesis kit (product code TKR 6110), Takara Biosystems", and TaqMan Gene Expression Assay (applied biosystems) is used. , ABI 7500fast amplified using real-time PCR.
The midpoint (inflection point of the S-shaped curve) value of the "amplification curve" showing the results of real-time PCR was used for comparison and verification of this test example as data reflecting the expression level of KLHL5 mRNA. ..
GAPDH was used as the endogenous control, and the results were compared and examined in terms of the control ratio.
（結果）
図８から分かる通り、「進行大腸癌（図８のadenocarcinoma：腺癌）」では、「大腸腺腫（図８のadenoma：低異形度腺腫（良性腫瘍））」に比べて有意にKLHL5 mRNAが高発現していることが判明した。
(result)
As can be seen from FIG. 8, “advanced colorectal cancer (adenocarcinoma: adenocarcinoma in FIG. 8)” has significantly higher KLHL5 mRNA than “colorectal adenoma (adenoma in FIG. 8: low-grade adenoma (benign tumor))”. It turned out to be expressed.
（考察）
上述の結果から、「KLHL5遺伝子（mRNA）」が、「大腸癌のマーカー」として特に有用であることが裏付けられた。
(Discussion)
From the above results, it was confirmed that the "KLHL5 gene (mRNA)" is particularly useful as a "marker for colorectal cancer".
［試験例９：KLHL5蛋白質の大腸癌マーカーとしての利用可能性］
「ヒト大腸癌組織」におけるKLHL5蛋白質の発現を免疫染色で確認した結果を示す図である。
[Test Example 9: Possibility of KLHL5 protein as a marker for colorectal cancer]
It is a figure which shows the result of having confirmed the expression of KLHL5 protein in "human colorectal cancer tissue" by immunostaining.
（プロトコル）
パラフィン包埋された「ヒト大腸癌」切除標本を使用し、表２記載（実施例１０）の「抗KLHL5抗体」を用いた免疫染色により、KLHL5の発現を検証した。
発現の程度は視認による相対的評価で行った。「正常組織(Normal tissue)」としては、同一個体の肉眼的非癌部を使用した。
Negative controlは一次抗体を使用せず免疫染色を実施。免疫染色は下記プロトコルを使用した。
(protocol)
The expression of KLHL5 was verified by immunostaining with the "anti-KLHL5 antibody" shown in Table 2 (Example 10) using paraffin-embedded "human colorectal cancer" resected specimens.
The degree of expression was visually evaluated relative to each other. As the "normal tissue", the macroscopic non-cancerous part of the same individual was used.
Negative control is immunostaining without using primary antibody. The following protocol was used for immunostaining.
≪免疫染色プロトコル≫
(1) 脱パラフィン
(2) 前処理。加熱しておいた10mMクエン酸に入れ、10分加熱。その後、冷却。
(3) 3%H2O2で内因性ペルキシダーゼの阻害
(4) PBSで洗浄。５分ｘ3回。
(5) 正常血清でブロッキング
(6) 一次抗体添加。常温で１時間以上、更に4℃で一晩放置。
(7) PBSで洗浄。５分ｘ３回
(8) ２次抗体添加。１０分
(9) PBSで洗浄。５分ｘ３回
(10) 酵素試薬。５分
(11) PBSで洗浄。５分ｘ３回
(12) DAB溶液を作成し、４分標本に浸透。
(13) 流水水洗5分〜10分
(14) ヘマトキシリン液添加 1分静置
(15) 流水水洗 ５分
(16) 脱水、エタノール３相
(17) 透徹、キシレン４相
(18) 封入
≪Immunostaining protocol≫
(1) Deparaffinization
(2) Pretreatment. Place in heated 10 mM citric acid and heat for 10 minutes. Then cool.
(3) Inhibition of endogenous perxidase with 3% H 2 O 2
(4) Wash with PBS. 5 minutes x 3 times.
(5) Blocking with normal serum
(6) Addition of primary antibody. Leave at room temperature for 1 hour or more and then at 4 ° C overnight.
(7) Wash with PBS. 5 minutes x 3 times
(8) Addition of secondary antibody. 10 minutes
(9) Wash with PBS. 5 minutes x 3 times
(10) Enzyme reagent. 5 minutes
(11) Wash with PBS. 5 minutes x 3 times
(12) Prepare a DAB solution and infiltrate the 4-minute specimen.
(13) Rinse with running water for 5 to 10 minutes
(14) Add hematoxylin solution and let stand for 1 minute
(15) 5 minutes under running water
(16) Dehydration, ethanol 3 phase
(17) Toru, xylene 4-phase
(18) Enclosed
（結果）
図９に示す組織標本には正常組織及び癌組織が混在しているが、KLHL5は癌組織のみに特異的に発現していることが判明した。
尚、免疫染色の２次抗体による非特異的な染色の可能性を排除するため、組織標本の連続切片を用い２次抗体のみで免疫染色を行ったところ、染色は認めなかった。
(result)
Although normal tissue and cancer tissue are mixed in the tissue sample shown in FIG. 9, it was found that KLHL5 is specifically expressed only in the cancer tissue.
In order to eliminate the possibility of non-specific staining with the secondary antibody for immunostaining, immunostaining was performed using only the secondary antibody using continuous sections of tissue specimens, but no staining was observed.
（考察）
上述の結果から、「KLHL5蛋白質」も、「大腸癌のマーカー」として利用可能であることが裏付けられた。
また、２次抗体による非特異的な染色は見られなかったことから、「抗KLHL5抗体」が、本発明の［癌診断キット］の構成成分として有用であることも、確認できた。
(Discussion)
From the above results, it was confirmed that "KLHL5 protein" can also be used as a "marker for colorectal cancer".
In addition, since non-specific staining with the secondary antibody was not observed, it was confirmed that the "anti-KLHL5 antibody" is useful as a component of the [cancer diagnostic kit] of the present invention.
［試験例１０：抗KLHL5抗体のKLHL5蛋白質に対する特異性の確認試験］
予めKLHL5抗原で処理した表２記載(実施例１０)の「抗KLHL5抗体」を用いて、「大腸癌組織」の免疫染色を行うことによって、「抗KLHL5抗体」のKLHL5蛋白質への特異性を検証した。
[Test Example 10: Confirmation test of specificity of anti-KLHL5 antibody for KLHL5 protein]
By immunostaining "colorectal cancer tissue" using the "anti-KLHL5 antibody" shown in Table 2 (Example 10) previously treated with the KLHL5 antigen, the specificity of the "anti-KLHL5 antibody" for the KLHL5 protein was determined. I verified it.
（プロトコル）
表２記載（実施例１０）の「抗KLHL5抗体」のPBS希釈液に、抗体：抗原が1:20(mol)となるように下記抗原希釈液を加え、４℃で一晩転倒混和した。
この混合液を一次抗体として免疫染色を行い、上述の試験例９と同様のプロトコルに従い、「大腸癌組織」の免疫染色を行った。
(protocol)
The following antigen diluent was added to the PBS diluent of "anti-KLHL5 antibody" shown in Table 2 (Example 10) so that the antibody: antigen was 1:20 (mol), and the mixture was inverted and mixed overnight at 4 ° C.
This mixed solution was used as a primary antibody for immunostaining, and "colorectal cancer tissue" was immunostained according to the same protocol as in Test Example 9 described above.
（使用抗原）PrEST Antigen KLHL5(SIGMA社) (Antigen used) PrEST Antigen KLHL5 (SIGMA)
（結果）
図１０から分かる通り、予めKLHL5抗原で処理した「抗KLHL5抗体」では、大腸癌組織は染色されなかった。
(result)
As can be seen from FIG. 10, the colorectal cancer tissue was not stained with the "anti-KLHL5 antibody" previously treated with the KLHL5 antigen.
（考察）
これは、「抗KLHL5抗体」が、予め行った「KLHL5抗原処理」によって、もはや「大腸癌組織」に発現したKLHL5には、結合しなくなったことを意味している。
(Discussion)
This means that the "anti-KLHL5 antibody" no longer binds to KLHL5 expressed in "colorectal cancer tissue" by the "KLHL5 antigen treatment" performed in advance.
このことは、「抗KLHL5抗体」のKLHL5蛋白質に対する特異性を証明するものであり、試験例９の結果と共に、「抗KLHL5抗体」が、本発明の［癌診断キット］の構成成分として利用可能であることを示すものである。
また、抗体は生体内において抗原蛋白質の機能を阻害し得るものであることから、上記結果は、「抗KLHL5抗体」が、本発明の［癌細胞の増殖又は転移抑制剤］又は本発明の［癌の予防又は治療薬］に使用し得ることも示している。
This proves the specificity of the "anti-KLHL5 antibody" for the KLHL5 protein, and along with the results of Test Example 9, the "anti-KLHL5 antibody" can be used as a component of the [cancer diagnostic kit] of the present invention. It shows that.
In addition, since the antibody can inhibit the function of the antigen protein in vivo, the above result shows that the "anti-KLHL5 antibody" is the [cancer cell growth or metastasis inhibitor] of the present invention or the [] of the present invention. It has also been shown that it can be used as a preventive or therapeutic drug for cancer.
［試験例１１：KLHL5蛋白質の早期大腸癌マーカーとしての利用可能性］
「ヒト大腸腺腫（図１１のadenoma）」、「早期大腸癌（図１１のadenocarcinoma（粘膜内癌; m癌））」におけるKLHL5蛋白質の発現を、免疫染色で確認した。
[Test Example 11: Possibility of KLHL5 protein as a marker for early colorectal cancer]
The expression of KLHL5 protein in "human colorectal adenoma (adenoma in FIG. 11)" and "early colorectal cancer (adenocarcinoma (intramucosal cancer; m cancer) in FIG. 11)" was confirmed by immunostaining.
（プロトコル）
パラフィン包埋された「ヒト大腸腺腫（高度異型腺腫２検体）」、及び「早期大腸癌（粘膜癌(m癌)２検体））の、各切除標本を使用し、表２記載（実施例１０）の「抗KLHL5抗体」を用いた免疫染色により、KLHL5の発現を検証した。
免疫染色は上述の試験例９と同様のプロトコルを使用した。
KLHL5タンパク発現は、免疫染色結果を視認することによって相対的に評価した。図１１上段は弱拡大、下段は強拡大を示す。
(protocol)
Table 2 (Example 10) using each resected specimen of paraffin-embedded "human colorectal adenoma (2 specimens of highly atypical adenoma)" and "early colon cancer (2 specimens of mucosal cancer (m cancer))". ), The expression of KLHL5 was verified by immunostaining using "anti-KLHL5 antibody".
Immunostaining used the same protocol as in Test Example 9 above.
KLHL5 protein expression was relatively assessed by visual inspection of immunostaining results. The upper part of FIG. 11 shows a weak enlargement, and the lower part shows a strong enlargement.
（結果）
図１１から分かる通り、「大腸腺腫」ではKLHL5蛋白質は検出されなかったが、「早期大腸癌（粘膜内癌; m癌）」では、わずかにKLHL5蛋白質の発現を認めた。
(result)
As can be seen from FIG. 11, the KLHL5 protein was not detected in "colorectal adenoma", but the expression of KLHL5 protein was slightly observed in "early colorectal cancer (intramucosal cancer; m cancer)".
（考察）
上述の結果から、「KLHL5蛋白質」は単なる大腸癌マーカーとしてのみならず、早期大腸癌を発見し得る、優れた「大腸癌マーカー」であることが裏付けられた。
(Discussion)
From the above results, it was confirmed that "KLHL5 protein" is not only a marker for colorectal cancer but also an excellent "marker for colorectal cancer" that can detect early colorectal cancer.
［試験例１２：KLHL5蛋白質の高度大腸癌マーカーとしての利用可能性(1)］
ヒト大腸癌組織におけるKLHL5蛋白質の発現を免疫染色で確認した。
[Test Example 12: Possibility of KLHL5 protein as a marker for advanced colorectal cancer (1)]
Expression of KLHL5 protein in human colon cancer tissue was confirmed by immunostaining.
（プロトコル）
パラフィン包埋された下記1)、2)の2グループのヒト大腸癌切除標本を使用し、表２記載（実施例１０）の「抗KLHL5抗体」を用いた免疫染色によりKLHL5の発現を検証した。
1)早期大腸癌（粘膜下層浸潤癌；Adenocarcinoma(sm)）２検体
2)進行大腸癌（筋層以深浸潤癌：Adenocarcinoma(advanced)；２検体
免疫染色は上述の試験例９と同様のプロトコルを使用した。
KLHL5タンパク発現は、免疫染色結果を視認することによって相対的に評価した。
「早期大腸癌（sm）」、「進行大腸癌（advanced）」は標本サイズが大きくなるため、癌を含む大腸組織を上下で「上層」・「下層」（「upper layer」・「lower layer」）と任意部位で２分した。1)、2)の各2検体は、同グループの検体はそれぞれ同様の結果を示したため、1)、2)の各グループ中の、１検体の結果について、図１２に示した。
尚、図上段は弱拡大、下段は強拡大を示す。
(protocol)
The expression of KLHL5 was verified by immunostaining using the "anti-KLHL5 antibody" shown in Table 2 (Example 10) using paraffin-embedded human colon cancer resected specimens of the following groups 1) and 2). ..
1) Early colorectal cancer (submucosal infiltration cancer; Adenocarcinoma (sm)) 2 samples
2) Advanced colorectal cancer (deep infiltration cancer below the muscular layer: Adenocarcinoma (advanced); 2 specimen immunostaining used the same protocol as in Test Example 9 described above.
KLHL5 protein expression was relatively evaluated by visual inspection of immunostaining results.
Since the sample size of "early colorectal cancer (sm)" and "advanced colorectal cancer (advanced)" is large, the large intestine tissue containing cancer is placed up and down in the "upper layer" and "lower layer"("upperlayer" and "lower layer". ) And 2 minutes at any site. As for each of the two samples of 1) and 2), the samples of the same group showed similar results. Therefore, the results of one sample in each of the groups of 1) and 2) are shown in FIG.
The upper part of the figure shows a weak enlargement, and the lower part shows a strong enlargement.
（結果）
図１２から分かる通り、「早期大腸癌（sm）」ではKLHL5蛋白質の発現は弱く、「進行大腸癌（advanced）」ではKLHL5は腫瘍の上層では発現が認められず、下層で発現が認められた。
(result)
As can be seen from FIG. 12, the expression of KLHL5 protein was weak in "early colorectal cancer (sm)", and KLHL5 was not expressed in the upper layer of the tumor but in the lower layer in "advanced". ..
（考察）
上述の結果から、KLHL5蛋白質は、単なる大腸癌マーカーとしてのみならず、大腸癌の進行度合いをも検出可能な、優れた高度大腸癌マーカーであることが裏付けられた。
(Discussion)
From the above results, it was confirmed that the KLHL5 protein is an excellent advanced colorectal cancer marker that can detect not only the colorectal cancer marker but also the degree of progression of colorectal cancer.
［試験例１３：KLHL5蛋白質の転移性腫瘍マーカーとしての利用可能性］
「ヒト大腸癌転移組織（肺転移及び肝臓転移）」におけるKLHL5蛋白質の発現を、免疫染色で確認した。
[Test Example 13: Possibility of KLHL5 protein as a metastatic tumor marker]
The expression of KLHL5 protein in "human colorectal cancer metastatic tissue (lung metastasis and liver metastasis)" was confirmed by immunostaining.
（プロトコル）
パラフィン包埋された「ヒト大腸癌転移巣」切除標本（肺転移1検体、肝転移1検体）を使用し、表２記載（実施例１０）の「抗KLHL5抗体」を用いた免疫染色によりKLHL5の発現を検証した。
免疫染色は上述の試験例９と同様のプロトコルを使用した。
KLHL5タンパク発現は、免疫染色結果を視認することによって相対的に評価した。
サンプル転移巣組織を上下で上層・下層（「upper layer」・「lower layer」）と任意部位で２分した。図上段は弱拡大、下段は強拡大を示す。
(protocol)
Using paraffin-embedded "human colorectal cancer metastasis" excised specimens (1 lung metastasis, 1 liver metastasis), immunostaining with "anti-KLHL5 antibody" shown in Table 2 (Example 10) KLHL5 The expression of was verified.
Immunostaining used the same protocol as in Test Example 9 above.
KLHL5 protein expression was relatively evaluated by visual inspection of immunostaining results.
The sample metastatic tissue was divided into upper and lower layers (“upper layer” and “lower layer”) at arbitrary sites. The upper part of the figure shows a weak enlargement, and the lower part shows a strong enlargement.
（結果）
図１３から分かる通り、大腸癌肺転移、大腸癌肝転移ともに、わずかにKLHL5蛋白質の発現が認められた。
(result)
As can be seen from FIG. 13, slight expression of KLHL5 protein was observed in both lung metastasis of colorectal cancer and liver metastasis of colorectal cancer.
（考察）
上述の結果から、「KLHL5蛋白質」は、単なる「大腸癌マーカー」としてのみならず、肺癌、肝臓癌等の、大腸癌由来の転移癌又は浸潤癌をも検出可能な、優れた「転移性腫瘍マーカー」として利用可能であることが裏付けられた。
更には、本発明の［予防又は治療剤］が、大腸癌のみならず、肺癌、肝臓癌等の、大腸癌由来の転移癌又は浸潤癌に対する予防又は治療薬となり得ることも判明した。
(Discussion)
From the above results, "KLHL5 protein" is an excellent "metastatic tumor" that can detect not only "colorectal cancer marker" but also metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer such as lung cancer and liver cancer. It was confirmed that it can be used as a "marker".
Furthermore, it has been found that the [preventive or therapeutic agent] of the present invention can be a prophylactic or therapeutic agent not only for colorectal cancer but also for metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer such as lung cancer and liver cancer.
［試験例１４：KLHL5蛋白質の高度大腸癌マーカーとしての利用可能性(2)］
ステージ４と診断されたヒト大腸癌組織におけるKLHL5蛋白質の発現を、深度別に免疫染色で確認した。
[Test Example 14: Possibility of KLHL5 protein as a marker for advanced colorectal cancer (2)]
The expression of KLHL5 protein in human colorectal cancer tissue diagnosed as stage 4 was confirmed by immunostaining by depth.
（プロトコル）
パラフィン包埋されたヒト進行大腸癌切除標本を使用し、表２記載（実施例１０）の「抗KLHL5抗体」を用いた免疫染色により、KLHL5の発現を検証した。
免疫染色は上述の試験例９と同様のプロトコルを使用した。
KLHL5タンパク発現は、免疫染色結果を視認することによって相対的に評価した。
対象標本は大腸の内腔（lumen）に近い「粘膜側」から「漿膜（serosa）側」までを連続観察し、ほぼ３等分となるように、任意の点で「上層」・「中層」・「下層」（「upper layer」・「middle layer」・「lower layer」）に3分した。図左側は弱拡大、右側は強拡大を示す。
(protocol)
The expression of KLHL5 was verified by immunostaining using the "anti-KLHL5 antibody" shown in Table 2 (Example 10) using paraffin-embedded human advanced colorectal cancer resected specimens.
For immunostaining, the same protocol as in Test Example 9 described above was used.
KLHL5 protein expression was relatively assessed by visual inspection of immunostaining results.
The target specimen is continuously observed from the "mucosal side" near the lumen of the large intestine to the "serosa side", and is "upper layer" and "middle layer" at any point so that it is divided into three equal parts.・ Divided into "lower layer"("upperlayer","middlelayer","lowerlayer"). The left side of the figure shows a weak enlargement, and the right side shows a strong enlargement.
（結果）
図１４から分かる通り、本試験例で用いた大腸癌組織（ステージ４）においては、KLHL5蛋白質の発現量が、大腸癌組織の「上層」では弱く、「中層」から「下層」にかけて増強していることが判明した。
(result)
As can be seen from FIG. 14, in the colorectal cancer tissue (stage 4) used in this test example, the expression level of the KLHL5 protein was weak in the “upper layer” of the colorectal cancer tissue, and increased from the “middle layer” to the “lower layer”. It turned out to be.
（考察）
上記の結果、及び試験例１３の結果から、「KLHL5蛋白質」が、単なる「大腸癌マーカー」としてのみならず、大腸癌のステージの判定基準の１つとしても使用可能な、優れたマーカーとして使用可能であることが裏付けられた。
(Discussion)
From the above results and the results of Test Example 13, "KLHL5 protein" is used as an excellent marker that can be used not only as a mere "colorectal cancer marker" but also as one of the criteria for determining the stage of colorectal cancer. It was confirmed that it was possible.
［試験例１５：KLHL5蛋白質の進行性・転移性大腸癌マーカーとしての利用可能性の統計学的確認(1)］
後述する［ヒト進行大腸癌組織の上層、中層、下層の分類法及びKLHL5蛋白質発現強度の数値化の定義］に従い、KLHL5の発現を数値化し、「大腸腺腫（adenoma）」、「大腸癌（adenocarcinoma）」、「大腸癌転移巣（metastatic lesion）」におけるKLHL5の発現を統計学的に解析した。
尚、「大腸癌」については、深達度に応じ、下記3つのカテゴリーに階層化した。
「早期大腸癌」（「粘膜内癌；m癌」、「粘膜下層癌；sm癌」）
「進行癌：advanced」
[Test Example 15: Statistical confirmation of the availability of KLHL5 protein as a marker for advanced / metastatic colorectal cancer (1)]
According to [Classification of upper, middle, and lower layers of human advanced colorectal cancer tissue and definition of quantification of KLHL5 protein expression intensity], the expression of KLHL5 is quantified, and "colorectal adenoma" and "colorectal cancer (adenocarcinoma)" ) ”, And the expression of KLHL5 in“ metastatic lesions of colorectal cancer ”was statistically analyzed.
"Colorectal cancer" was hierarchized into the following three categories according to the degree of invasion.
"Early colorectal cancer"("intramucosalcancer; m cancer", "submucosal cancer; sm cancer")
"Advanced cancer: advanced"
（プロトコル）
パラフィン包埋されたヒト大腸病変切除標本(腺腫４例、m癌5例、sm癌２例、進行癌33例、転移巣9例)を使用し、表２記載（実施例１０）の「抗KLHL5抗体」を用いた免疫染色によりKLHL5の発現を検証した。
免疫染色は上述の試験例９と同様のプロトコルを使用した。
KLHL5タンパク発現は、後述する［ヒト進行大腸癌組織の上層、中層、下層の分類法及びKLHL5蛋白質発現強度の数値化の定義］に従い、KLHL5蛋白質の発現を数値化し、大腸腺腫、早期大腸癌（m癌、sm癌）、進行大腸癌、大腸癌転移巣におけるKLHL5蛋白質の発現量（各症例数における平均値＋標準誤差）を、統計学的に解析した。
(protocol)
Paraffin-embedded human colon lesion resection specimens (4 adenomas, 5 m cancers, 2 sm cancers, 33 advanced cancers, 9 metastatic lesions) were used, and the "antibodies" in Table 2 (Example 10) were used. The expression of KLHL5 was verified by immunostaining using "KLHL5 antibody".
Immunostaining used the same protocol as in Test Example 9 above.
KLHL5 protein expression is quantified according to [Classification of upper, middle, and lower layers of human advanced colorectal cancer tissue and definition of quantification of KLHL5 protein expression intensity], and colorectal adenoma, early colorectal cancer ( The expression level of KLHL5 protein (mean value + standard error in each number of cases) in m cancer, sm cancer), advanced colorectal cancer, and colorectal cancer metastatic lesions was statistically analyzed.
（結果）
図１５から分かる通り、「進行癌」では、「早期癌（m癌、sm癌）」と比較して有意にKLHL5蛋白質の発現が増強していた。また「進行癌」では「大腸腺腫」はもちろんのこと、「大腸癌転移巣」と比較しても有意にKLHL5蛋白質の発現が増強していた。
(result)
As can be seen from FIG. 15, in "advanced cancer", the expression of KLHL5 protein was significantly enhanced as compared with "early cancer (m cancer, sm cancer)". Moreover, in "advanced cancer", the expression of KLHL5 protein was significantly enhanced as compared with "colorectal cancer metastasis" as well as "colorectal adenoma".
（考察）
上記の結果から、KLHL5蛋白質が、単なる大腸癌マーカーとしてのみならず、大腸癌のステージの判定にも使用可能であることや、肺癌、肝臓癌等の、大腸癌由来の転移癌又は浸潤癌をも検出可能な、優れたマーカーとしても使用可能であることが、数値的に裏付けられた。
尚、「大腸癌転移巣」におけるKLHL5蛋白質発現量が、「進行癌」と比較して、優位に少なかったのは、転移巣に癌が転移して間もないためと考えられる。
(Discussion)
From the above results, the KLHL5 protein can be used not only as a marker for colorectal cancer but also for determining the stage of colorectal cancer, and metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer such as lung cancer and liver cancer. It was numerically supported that it can also be used as an excellent marker that can be detected.
The expression level of KLHL5 protein in "colorectal cancer metastatic lesions" was significantly lower than that in "advanced cancer", probably because the cancer had just metastasized to the metastatic lesions.
［試験例１６：KLHL5蛋白質の進行性・転移性大腸癌マーカーとしての利用可能性の統計学的確認(2)］
進行大腸癌の「上層」、「中層」、「下層」におけるKLHL5蛋白質の発現を、統計学的に解析した。
[Test Example 16: Statistical confirmation of the availability of KLHL5 protein as a marker for advanced / metastatic colorectal cancer (2)]
The expression of KLHL5 protein in the "upper", "middle", and "lower" layers of advanced colorectal cancer was statistically analyzed.
（プロトコル）
パラフィン包埋されたヒト進行大腸癌33検体を使用し、表２記載（実施例１０）の「抗KLHL5抗体」を用いた免疫染色によりKLHL5の発現を検証した。
免疫染色は上述の試験例９と同様のプロトコルを使用した。
KLHL5タンパク発現は後述する［ヒト進行大腸癌組織の「上層」、「中層」、「下層」の分類法及びKLHL5蛋白質発現強度の数値化の定義］に従い、KLHL5蛋白質の発現量（各部位における33検体の平均値＋標準誤差）を数値化し、進行大腸癌の「上層」、「中層」、「下層」におけるKLHL5蛋白質の発現を、統計学的に解析した。
(protocol)
Using 33 paraffin-embedded human advanced colorectal cancer samples, the expression of KLHL5 was verified by immunostaining using the "anti-KLHL5 antibody" shown in Table 2 (Example 10).
Immunostaining used the same protocol as in Test Example 9 above.
KLHL5 protein expression is the expression level of KLHL5 protein (33 at each site) according to [Classification of "upper layer", "middle layer", and "lower layer" of human advanced colorectal cancer tissue and definition of quantification of KLHL5 protein expression intensity]. Specimen mean value + standard error) was quantified, and the expression of KLHL5 protein in the "upper layer", "middle layer", and "lower layer" of advanced colorectal cancer was statistically analyzed.
（結果）
図１６から分かる通り、進行大腸癌では、「上層」、「中層」と比較して「下層」で有意にKLHL５の発現が高いことが示された。
(result)
As can be seen from FIG. 16, in advanced colorectal cancer, it was shown that the expression of KLHL5 was significantly higher in the "lower layer" than in the "upper layer" and "middle layer".
（考察）
上記の結果から、KLHL5蛋白質が、単なる進行大腸癌マーカーとしてのみならず、転移・浸潤可能性の判定等にも使用可能であることが、数値的に裏付けられた。
(Discussion)
From the above results, it was numerically supported that the KLHL5 protein can be used not only as a marker for advanced colorectal cancer but also for determining the possibility of metastasis / infiltration.
［試験例１７：KLHL5遺伝子（mRNA）の大腸癌マーカーとしての利用可能性の統計学的確認(1)］
公開データベース（Oncomine, https://www.oncomine.org/）の情報を用いて、「大腸癌組織」及び「大腸腺腫組織」におけるKLHL5 mRNA発現量を解析した。
[Test Example 17: Statistical confirmation of the availability of the KLHL5 gene (mRNA) as a marker for colorectal cancer (1)]
The expression level of KLHL5 mRNA in "colorectal cancer tissue" and "colorectal adenoma tissue" was analyzed using the information in the public database (Oncomine, https://www.oncomine.org/).
（プロトコル）
既知の解析方法である公開データベース（Oncomine, https://www.oncomine.org/）の情報を用いて、「大腸癌組織」及び「大腸腺腫組織」におけるKLHL5 mRNA発現量を解析し、記載数値及びP-valueを評価した。
公開データベースは、Skrzypczak（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE20916）らのデータを利用し、Oncomine 3.0 softwearを用いて統計学的な解析を行った。
(protocol)
Using information from a public database (Oncomine, https://www.oncomine.org/), which is a known analysis method, we analyzed the expression level of KLHL5 mRNA in "colorectal cancer tissue" and "colorectal adenoma tissue", and described the numerical values. And P-value were evaluated.
The public database uses data from Skrzypczak (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE20916) and others, and statistical analysis using Oncomine 3.0 softwear. Was done.
（結果）
図１７から分かる通り、既知の遺伝子情報からも、「大腸癌組織」では、「大腸腺腫組織」と比較して、有意にKLHL5 mRNAの発現が高いことが、本試験例によって確認できた。
(result)
As can be seen from FIG. 17, from the known genetic information, it was confirmed by this test example that the expression of KLHL5 mRNA was significantly higher in the "colorectal cancer tissue" than in the "colorectal adenoma tissue".
（考察）
上記の結果からも、KLHL5遺伝子が、大腸癌マーカーとして有用であることが裏付けられた。
(Discussion)
From the above results, it was confirmed that the KLHL5 gene is useful as a marker for colorectal cancer.
［試験例１８：KLHL5遺伝子（mRNA）の大腸癌マーカーとしての利用可能性の統計学的確認(2)］
公開データベース（Oncomine, https://www.oncomine.org/）の情報を用いて、「大腸癌組織」及び「正常の大腸組織」におけるKLHL5 mRNA発現量を解析した。
[Test Example 18: Statistical confirmation of the availability of the KLHL5 gene (mRNA) as a marker for colorectal cancer (2)]
The expression level of KLHL5 mRNA in "colorectal cancer tissue" and "normal colorectal tissue" was analyzed using the information in the public database (Oncomine, https://www.oncomine.org/).
（プロトコル）
試験例１７と同様の方法で、「大腸癌組織」及び「正常大腸組織」におけるKLHL5 mRNA発現量を解析し、記載数値及びP-valueを評価した。
(protocol)
The expression level of KLHL5 mRNA in "colorectal cancer tissue" and "normal large intestine tissue" was analyzed by the same method as in Test Example 17, and the described values and P-value were evaluated.
（結果）
図１８から分かる通り、既知の遺伝子情報からも、「大腸癌組織」では「正常大腸組織」と比較して、有意にKLHL5 mRNAの発現が高いことが示された。
(result)
As can be seen from FIG. 18, the known genetic information also showed that the expression of KLHL5 mRNA was significantly higher in "colorectal cancer tissue" than in "normal colorectal tissue".
（考察）
上記の結果からも、KLHL5遺伝子が、大腸癌マーカーとして有用であることが裏付けられた。
(Discussion)
From the above results, it was confirmed that the KLHL5 gene is useful as a marker for colorectal cancer.
［試験例１９：KLHL5遺伝子（mRNA）の大腸癌マーカーとしての利用可能性の統計学的確認(3)］
公開データベース（Prognoscan, https://www.prognoscan.org/）の情報を利用し、大腸癌組織におけるKLHL5 mRNA発現と無病生存率の相関をKaplan-Meier法を用い解析した。
[Test Example 19: Statistical confirmation of the availability of the KLHL5 gene (mRNA) as a marker for colorectal cancer (3)]
Using information from a public database (Prognoscan, https://www.prognoscan.org/), the correlation between KLHL5 mRNA expression and disease-free survival in colorectal cancer tissues was analyzed using the Kaplan-Meier method.
（プロトコル）
既知の解析方法である公開データベース（Prognoscan, https://www.prognoscan.org/）の情報を用い、大腸癌組織における「KLHL5 mRNA発現量」と「無病生存率」の相関をKaplan-Meier法を用い解析した。
公開データベースは、Jorissen RNら（Clin Cancer Res. 2009 Dec 15;15(24):7642-7651.）及び、Smith JJら（Gastroenterology. 2010 Mar;138(3):958-68. doi: 10.1053/j.gastro.2009.11.005. Epub 2009 Nov 13. , Gastroenterology. 2012 Mar;142(3):562-571.e2. doi: 10.1053/j.gastro.2011.11.026. Epub 2011 Nov 22.）の報告に記載のものを使用した。
(protocol)
The Kaplan-Meier method is used to correlate "KLHL5 mRNA expression level" and "disease-free survival rate" in colorectal cancer tissues using information from a public database (Prognoscan, https://www.prognoscan.org/), which is a known analysis method. Was analyzed using.
Public databases are Jorissen RN et al. (Clin Cancer Res. 2009 Dec 15; 15 (24): 7642-7651.) And Smith JJ et al. (Gastroenterology. 2010 Mar; 138 (3): 958-68. Doi: 10.1053 / j.gastro.2009.11.005. Epub 2009 Nov 13., Gastroenterology. 2012 Mar; 142 (3): 562-571.e2. doi: 10.1053 / j.gastro.2011.11.026. Epub 2011 Nov 22.) The one described in was used.
（結果）
図１９から分かる通り、KLHL5 mRNA高発現群（図中の下のライン）では、KLHL5 mRNA低発現群（図中の上のライン）と比較して統計学的に有意に「無病生存率」が低下していた。
(result)
As can be seen from FIG. 19, the KLHL5 mRNA high expression group (lower line in the figure) has a statistically significant "disease-free survival rate" as compared with the KLHL5 mRNA low expression group (upper line in the figure). It was declining.
（考察）
上記の結果からも、KLHL5遺伝子が、大腸癌マーカーとして有用であることが裏付けられた。
(Discussion)
From the above results, it was confirmed that the KLHL5 gene is useful as a marker for colorectal cancer.
［ヒト進行大腸癌組織の上層、中層、下層の分類法及びKLHL5蛋白質発現強度の数値化の定義］
図２０−１は、ヒト進行大腸癌組織の上層、中層、下層の分類法、図２０−２はKLHL5蛋白質強度の数値化の定義について示した図である。
[Definition of classification of upper, middle and lower layers of human advanced colorectal cancer tissue and quantification of KLHL5 protein expression intensity]
FIG. 20-1 is a diagram showing the classification of upper, middle, and lower layers of human advanced colorectal cancer tissue, and FIG. 20-2 is a diagram showing a definition of quantification of KLHL5 protein intensity.
図に示すように大腸癌組織の表層から最深部までの距離を計測し、３分割し、上層、中層、下層に分類した。
KLHL5蛋白の発現強度については、免疫染色を行った大腸癌組織を用い、KLHL5蛋白陽性細胞数の計測及び染色濃度の評価により数値化した。
As shown in the figure, the distance from the surface layer to the deepest part of the colorectal cancer tissue was measured, divided into three, and classified into upper layer, middle layer, and lower layer.
The expression intensity of KLHL5 protein was quantified by measuring the number of KLHL5 protein-positive cells and evaluating the staining concentration using immunostained colorectal cancer tissue.
（上記配列中、小文字はRNA、大文字はDNAを表す。） (In the above sequence, lowercase letters represent RNA and uppercase letters represent DNA.)
上記実施例の結果等から分かる通り、本発明は、癌の予防又は治療あるいは早期発見等に、非常に有用なものである。 As can be seen from the results of the above examples, the present invention is very useful for the prevention or treatment of cancer, early detection, and the like.
Claims (12)
（Ｘ）KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36からなる群から選択される蛋白質又はその遺伝子
（Ｙ）大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌から選択される少なくとも１種以上の癌 The following (Y) cancer cell growth and / or metastasis inhibitor, which comprises a substance that inhibits the following (X).
(X) Protein selected from the group consisting of KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 or its gene (Y) At least one or more cancers selected from colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer
（Ｘ）KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36からなる群から選択される蛋白質又はその遺伝子
（Ｙ）大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌から選択される少なくとも１種以上の癌 The prophylactic and / or therapeutic agent of (Y) below, which comprises a substance that inhibits (X) below.
(X) Protein selected from the group consisting of KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 or its gene (Y) At least one or more cancers selected from colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer
ｉ）（Ｘ）の発現量を、抑制する物質
ｉｉ）（Ｘ）を分解する物質
ｉｉｉ）（Ｘ）の機能を阻害する物質 The prophylactic and / or therapeutic agent according to claim 3, wherein the substance that inhibits (X) is at least one selected from any of the following i) to iii).
i) Substances that suppress the expression level of (X) ii) Substances that decompose (X) iii) Substances that inhibit the function of (X)
（Ｘ）KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36からなる群から選択される蛋白質又はその遺伝子
（Ｙ）大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌から選択される少なくとも１種以上の癌 A cancer marker for identifying the following (Y), which comprises the following (X).
(X) Protein selected from the group consisting of KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 or its gene (Y) At least one or more cancers selected from colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer
（Ｘ）KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36からなる群から選択される蛋白質又はその遺伝子
（Ｙ）大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌から選択される少なくとも１種以上の癌 The diagnostic kit of the following (Y), which comprises a substance capable of detecting the following (X).
(X) Protein selected from the group consisting of KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 or its gene (Y) At least one or more cancers selected from colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer
（１）生体試料中の、下記（Ｘ）蛋白質の存在量又は下記（Ｘ）遺伝子の発現量を測定する工程
（２）（１）で測定された（Ｘ）蛋白質の存在量又は（Ｘ）遺伝子の発現量が、当該生体試料と同種の正常組織由来の対照試料中の（Ｘ）蛋白質の存在量又は（Ｘ）遺伝子の発現量と比較して多い場合に、前記生体試料が下記（Ｙ）の癌患者由来のものであると判定する工程
（Ｘ）KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36からなる群から選択される蛋白質又はその遺伝子
（Ｙ）大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌から選択される少なくとも１種以上の癌 A method for measuring a biological sample, which comprises the following steps (1) and (2).
(1) Steps for measuring the abundance of the following (X) protein or the expression level of the following (X) gene in a biological sample (2) The abundance of the (X) protein measured in (1) or (X) When the expression level of the gene is higher than the abundance of the (X) protein or the expression level of the (X) gene in the control sample derived from a normal tissue of the same type as the biological sample, the biological sample is described below (Y). ) Steps to determine that the protein is derived from a cancer patient (X) A protein selected from the group consisting of KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 or its gene (Y) Colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer At least one or more cancers selected from
（Ａ）生体試料中の、下記（Ｘ）蛋白質の存在量又は下記（Ｘ）遺伝子の発現量を測定する工程
（Ｂ）（Ｘ）蛋白質の存在位置又は（Ｘ）遺伝子の発現位置を測定する工程
（Ｘ）KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36からなる群から選択される蛋白質又はその遺伝子 A method for determining the degree of progression of colorectal cancer or the possibility of metastasis or infiltration to other organs or tissues, using the following steps (A) and / or (B) as indicators.
(A) Step of measuring the abundance of the following (X) protein or the expression level of the following (X) gene in a biological sample (B) Measuring the abundance position of the (X) protein or the expression position of the (X) gene Step (X) A protein or gene thereof selected from the group consisting of KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36.
（Ｘ）KLHL5、KLHL26、KLHL27、又はKLHL36からなる群から選択される蛋白質又はその遺伝子
（Ｙ）大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌から選択される少なくとも１種以上の癌 A kit for screening a prophylactic and / or therapeutic agent according to (Y) below, which comprises the protein (X) below or a gene thereof.
(X) Protein selected from the group consisting of KLHL5, KLHL26, KLHL27, or KLHL36 or its gene (Y) At least one or more cancers selected from colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer
（Ｙ）大腸癌又は大腸癌由来の転移癌若しくは浸潤癌から選択される少なくとも１種以上の癌 The method for screening a prophylactic and / or therapeutic agent according to (Y) below, which comprises using the screening kit according to claim 11.
(Y) At least one type of cancer selected from colorectal cancer or metastatic cancer or invasive cancer derived from colorectal cancer
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