JP2020132592A - Method for protecting dopamine neurocyte in living body - Google Patents

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義基 中島
Yoshiki Nakashima
義基 中島
健史 大政
Takeshi Omasa
健史 大政
洋文 野口
Hirofumi Noguchi
洋文 野口
知佳 潮平
Chika Shimohira
知佳 潮平
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Abstract

To provide a technique for protecting dopamine nerve in a living body.SOLUTION: There are provided polypeptide or protein containing any one of MFG-E8 (Milk fat globule-EGF factor 8), MFG-E8 fragment, and MFG-E8 or MFG-E8 fragment, a composition for protecting dopamine neurocyte which has any one or two more types thereof as an active ingredient, or a cell producing the composition. Further, by fabricating a cell of regenerative medical products which produces MFG-E8, continuous protection of dopamine nerve is promoted in a living body, and pathological reduction of dopamine nerve in a brain tissue in the progress of pathologic condition of Parkinson's disease is suppressed. Further, in the case where a cell for treatment is a stem cell, a cell producing a composition, whose differentiation was induced after that, can be also used for treatment and prevention of Parkinson's disease.SELECTED DRAWING: Figure 1

Description

本発明は、パーキンソン病の治療薬等に関する。より詳しくは、中脳黒質のドパミン神経細胞、治療用ドパミン神経細胞を保護するための薬剤及び治療用細胞等に関する。 The present invention relates to a therapeutic agent for Parkinson's disease and the like. More specifically, the present invention relates to dopaminergic neurons in the substantia nigra of the midbrain, drugs for protecting therapeutic dopaminergic neurons, therapeutic cells, and the like.

パーキンソン病(Parkinson's disease)は、1817年James Parkinsonによって初めて報告された疾患である(非特許文献1)。
パーキンソン病は、50〜60歳代に多く発症し、脳や末梢自律神経系などの神経細胞が変性する神経変性疾患である。パーキンソン病の症状として、運動緩慢、振戦、筋強剛、姿勢保持障害などの運動症状並びに嗅覚障害、自律神経症状、精神症状、認知機能障害、睡眠障害などのさまざまな非運動症状がみられる。パーキンソン病の原因は未だ完全には解明されていないが、パーキンソン病では、神経細胞体や神経線維にα-synucleinというタンパク質が凝集・蓄積しており、これが凝集する過程において神経細胞が障害を受けるのではないかと考えられている。なお、α-synucleinが蓄積して球状になった構造物は、レビー小体と呼ばれている。
Parkinson's disease is the first disease reported by James Parkinson in 1817 (Non-Patent Document 1).
Parkinson's disease is a neurodegenerative disease that often develops in the 50s and 60s and degenerates nerve cells such as the brain and peripheral autonomic nervous system. Symptoms of Parkinson's disease include bradykinesia, tremor, muscle rigidity, posture retention disorders, and various non-motor symptoms such as olfactory dysfunction, autonomic symptom, psychiatric symptom, cognitive dysfunction, and sleep disorder. .. The cause of Parkinson's disease has not yet been completely elucidated, but in Parkinson's disease, a protein called α-synuclein is aggregated and accumulated in nerve cell bodies and nerve fibers, and nerve cells are damaged in the process of aggregation. It is believed that this is the case. The structure in which α-synuclein is accumulated and becomes spherical is called a Lewy body.

パーキンソン病は、加齢とともに患者数も増え、我が国の患者数は、人口10万人あたり150人程度とされている。パーキンソン病では黒質ドパミン神経細胞の変性脱落に伴う線条体ドパミン神経終末の減少、線条体のドパミン量の減少により運動症状が生じる。運動症状には、黒質ドパミン神経細胞が50%程度に減少し、ドパミン神経終末のドパミン量が20%以下に低下すると出現するとされている(非特許文献2)。 The number of patients with Parkinson's disease increases with aging, and the number of patients in Japan is said to be about 150 per 100,000 population. In Parkinson's disease, motor symptoms occur due to a decrease in striatal dopaminergic nerve endings and a decrease in the amount of dopamine in the striatum associated with degenerative loss of substantia nigra dopamine neurons. It is said that motor symptoms appear when the substantia nigra dopaminergic neurons decrease to about 50% and the amount of dopamine at the dopaminergic nerve endings decreases to 20% or less (Non-Patent Document 2).

パーキンソン病治療の主体は薬物療法である。それ以外には、脳深部刺激療法などの脳の手術療法や、リハビリテーションであり、細胞移植治療などの報告もある。また、治療用ドパミン神経細胞の例としては、京都大学の高橋淳教授らのグループによりサルを用いた基礎研究に続き、2018年からヒトinduced pluripotent stem cells(iPS細胞)を用い作製された治療用ドパミン神経細胞を使ったヒトを対象とした治験が開始されている(https://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/pressrelease/news/180730-170000.html)。
代表的な薬物治療は、ドパミンの前駆物質であるレボドパを投与するドパミン補充療法である。その他に、ドパミンと同様の作用を有するドパミンアゴニスト、ドパミンの放出を促す薬(アマンタジン)、ドパミンの分解をおこす物質の阻害剤(セレギリン、エンタカポン)、非ドパミン系のゾニサミド、アデノシン受容体のアンタゴニストであるイストラデフィリン、またアセチルコリンを減少させる薬(抗コリン剤)などが用いられる。
The main treatment for Parkinson's disease is drug therapy. Other than that, there are reports of brain surgery such as deep brain stimulation, rehabilitation, and cell transplantation therapy. In addition, as an example of therapeutic dopamine neurons, following basic research using monkeys by a group of Professor Atsushi Takahashi of Kyoto University, etc., therapeutic use produced using human induced pluripotent stem cells (iPS cells) from 2018 A clinical trial using dopamine neurons in humans has been started (https://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/pressrelease/news/180730-170000.html).
A typical drug treatment is dopamine replacement therapy in which levodopa, a precursor of dopamine, is administered. In addition, dopamine agonists that have the same action as dopamine, drugs that promote the release of dopamine (amantadine), inhibitors of substances that decompose dopamine (selegiline, entacapone), non-dopamine-based zonisamide, and antagonists of adenosine receptors. Some istradefylins and drugs that reduce acetylcholine (anticholinergic agents) are used.

過去6年間(2011年1月から2017年1月)における我が国での新薬の承認は、次の薬剤である。
・ドパミンアゴニスト(ミラペックスLA [日本ベーリンガーインゲルハイム株式会社]、レキップCR [グラクソ・スミスクライン株式会社]、アポカイン [協和発酵キリン株式会社]、ニュープロ(貼付剤[大塚製薬株式会社])
・非ドパミン系に働く新しい機序を有するアデノシンA2A 受容体阻害剤(ノウリアスト [協和発酵キリン株式会社])
・空腸投与用レボドパ・カルビドパ水和物配合剤(デュオドーパ [アッヴィ])
・COMT 阻害剤のエンタカポンとレボドパ・カルビドパ配合剤との合剤(スタレボ [ノバルティスファーマ])
The approval of new drugs in Japan over the past 6 years (January 2011 to January 2017) is as follows.
・ Dopamine agonist (Mirapex LA [Nihon Boehringer Ingelheim Co., Ltd.], Requip CR [GlaxoSmithKline Co., Ltd.], Apokine [Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.], New Pro (patch [Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.])
・ Adenosine A2A receptor inhibitor with a new mechanism of action on non-dopamines (Nouriast [Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.])
・ Levodopa / carbidopa hydrate combination drug for jejunal administration (Duodopa [AbbVie])
・ A combination of the COMT inhibitor entacapone and a combination of levodopa and carbidopa (Starevo [Novartis Pharma])

ところで、Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8)は、ヒトにおけるラクトアドヘリンホモログであり、母乳及び乳房上皮細胞で見つかった膜結合型糖タンパク質である(非特許文献3参照)。
非特許文献4には、敗血症や虚血再灌流障害の治療にMFG-E8の投与が有効となり得ることが記載されている。
非特許文献5には、活性化マクロファージから分泌されるMFG-E8が、アポトーシスした細胞に結合し、ファゴサイトによる貪食を誘導することが記載されている。
特許文献1には、MFG-E8を用いた細胞の培養方法が記載されており、ヒトiPS細胞が足場材料を用いずに培養可能な技術が示されている。
このようにMFG-E8について様々な報告がなされているが、これまでに、パーキンソン病の治療薬としてMFG-E8を投与することや、MFG-E8産生細胞を治療用細胞として用いたパーキンソン病の治療法は報告されていない。
By the way, Milk fat globule-EGF factor 8 (MFG-E8) is a lactoadherin homologue in humans and is a membrane-bound glycoprotein found in breast milk and breast epithelial cells (see Non-Patent Document 3).
Non-Patent Document 4 describes that administration of MFG-E8 can be effective for the treatment of sepsis and ischemia-reperfusion injury.
Non-Patent Document 5 describes that MFG-E8 secreted from activated macrophages binds to apoptotic cells and induces phagocytosis by fagosite.
Patent Document 1 describes a method for culturing cells using MFG-E8, and shows a technique for culturing human iPS cells without using a scaffold material.
In this way, various reports have been made on MFG-E8, but so far, MFG-E8 has been administered as a therapeutic agent for Parkinson's disease, and MFG-E8-producing cells have been used as therapeutic cells for Parkinson's disease. No cure has been reported.

WO2015-182140WO2015-182140

J Neuropsychiatry Clin Neurosci. 2002 Spring;14(2):223-236J Neuropsychiatry Clin Neurosci. 2002 Spring; 14 (2): 223-236 織茂智之、パーキンソン病の診断と治療の新たな展開、臨床神経 2017;57:259-273Tomoyuki Orishige, New Developments in Diagnosis and Treatment of Parkinson's Disease, Clinical Neurology 2017; 57: 259-273 Pediatric Research. 1996 April 39:66.Pediatric Research. 1996 April 39:66. Mol Med. 2011 Jan-Feb;17(1-2):126-133.Mol Med. 2011 Jan-Feb; 17 (1-2): 126-133. Nature. 2002 May 9;417(6885):182-187.Nature. 2002 May 9; 417 (6885): 182-187. Brain Sci. 2018 Aug 31;8(9).Brain Sci. 2018 Aug 31; 8 (9).

本発明は、中脳黒質のドパミン神経細胞、治療用ドパミン神経細胞を保護可能な技術を提供することを主な目的とする。 An object of the present invention is to provide a technique capable of protecting dopaminergic neurons in the substantia nigra of the midbrain and therapeutic dopaminergic neurons.

本発明者らは、MFG-E8の断片が、生体内においてドパミン神経細胞の保護を促進することを見出し、これを有効成分とするドパミン神経細胞を保護するための組成物等の発明を完成させた。 The present inventors have found that a fragment of MFG-E8 promotes the protection of dopaminergic neurons in vivo, and have completed the invention of a composition for protecting dopaminergic neurons containing this as an active ingredient. It was.

すなわち、上記課題解決のため、本発明は、以下の[1]〜[17]を提供する。
[1]MFG-E8(Milk fat globule-EGF factor 8)、MFG-E8断片、ならびにMFG-E8又はMFG-E8断片のいずれかを含むポリペプチドやタンパク質、これらいずれか又は二種以上を有効成分とするドパミン神経細胞保護のための組成物。
[2]前記ポリペプチドやタンパク質が、以下の(A)から(E)のいずれかで示される[1]に記載のドパミン神経細胞保護のための組成物。
(A) 配列番号1又は2のアミノ酸配列で示されるタンパク質。
(B) 配列番号3から16で示されるアミノ酸配列のいずれか又は二種以上を含んでなるポリペプチドやタンパク質。
(C) (A)又は(B)で示されるポリペプチドやタンパク質において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含む、ポリペプチドやタンパク質。
(D) (A)から(C)で示されるポリペプチドやタンパク質において、配列番号1における下記と同等の修飾ないし官能部位を備えるポリペプチドやタンパク質。
[Disulfide bond部位]
配列番号1において、27-38番目、32-55番目、57-66番目、70-225番目、212-216番目、230-387番目の組み合わせで示されるアミノ酸。
[糖鎖修飾部位]
配列番号1において、228番目、238番目、325番目、329番目、350番目のアミノ酸。
[Phosphoserin修飾部位]
配列番号1において、42番目のアミノ酸。
(E) (A)から(D)に記載のいずれかのアミノ酸配列が二量体化されたポリペプチドやタンパク質。
[3]前記ポリペプチドやタンパク質が、10から387残基のアミノ酸配列を含む[1]又は[2]に記載のドパミン神経細胞保護のための組成物。
[4]MFG-E8、MFG-E8断片、ならびにMFG-E8又はMFG-E8断片のいずれかを含むポリペプチドやタンパク質、これらのいずれか又は二種以上が、細胞により産生される[1]から[3]のいずれかに記載のドパミン神経細胞保護のための組成物。
[5]前記細胞が、医薬品の産生細胞、又は再生医療等製品の細胞である[4]に記載のドパミン神経細胞保護のための組成物。
[6]前記細胞が、ヒト医薬品産生用細胞、又はヒト細胞である[5]に記載のドパミン神経細胞保護のための組成物。
[7]前記細胞が、MFG-E8、MFG-E8断片、ならびにMFG-E8又はMFG-E8断片のいずれかを含むポリペプチドやタンパク質を発現するヒト医薬品の産生細胞、又はヒト再生医療等製品の細胞である[4]から[6]に記載のドパミン神経細胞保護のための組成物。
[8]前記細胞、またはその細胞の産生物が、ヒトを対象とした医薬品、又は再生医療等製品である[4]から[7]のいずれかに記載のドパミン神経細胞保護のための組成物。
[9]前記ドパミン神経細胞が、ヒトドパミン神経細胞である[1]から[8]のいずれかに記載のドパミン神経細胞保護のための組成物。
[10]前記ドパミン神経細胞が、生体内ドパミン神経細胞、又は治療用ドパミン神経細胞である[1]から[9]のいずれかに記載のドパミン神経細胞保護のための組成物。
[11]効果部位が生体内である、[1]から[10]のいずれかに記載のドパミン神経細胞保護のための組成物。
[12]前記効果部位が神経組織である[11]に記載のドパミン神経細胞保護のための組成物。
[13][4]から[12]に記載のドパミン神経細胞保護のための組成物、又は組成物を産生する細胞。
[14][13]に記載の細胞の製造方法であって、
(a)MFG-E8、MFG-E8断片、ならびにMFG-E8又はMFG-E8断片のいずれかを含むポリペプチドやタンパク質、これらいずれか又は二種以上を発現するベクターを設計又は作製する工程と、
(b)細胞が前記ベクターを取り込む工程と、
(c)MFG-E8、MFG-E8断片、ならびにMFG-E8又はMFG-E8断片のいずれかを含むポリペプチドやタンパク質を産生する細胞を選別し培養する工程と、
(d)細胞を保存、もしくは細胞が産生したMFG-E8、MFG-E8断片、ならびにMFG-E8又はMFG-E8断片のいずれかを含むポリペプチドやタンパク質を濃縮、抽出、または精製する工程と、
を含むドパミン神経細胞保護のための細胞、及び細胞由来の組成物の製造方法。
[15]前記ベクターが発現ベクターである、[14]に記載のパーキンソン病治療のための組成物、又は組成物を産生する細胞の製造方法。
[16][14]、[15] 記載の組成物と同等のMFG-E8、MFG-E8断片、ならびにMFG-E8又はMFG-E8断片のいずれかを含むポリペプチドやタンパク質を内在性で発現する治療用細胞のドパミン神経細胞保護のための利用。
[17]以下の(A)から(E)のいずれかで示されるドパミン神経細胞を保護する組成物。
(A) 配列番号1又は2のアミノ酸配列で示されるタンパク質。
(B) 配列番号3から16で示されるアミノ酸配列のいずれか又は二種以上を含んでなるポリペプチドやタンパク質。
(C) (A)又は(B)で示されるポリペプチドやタンパク質において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含む、ポリペプチドやタンパク質。
(D) (A)から(C)で示されるポリペプチドやタンパク質において、配列番号1における下記と同等の修飾ないし官能部位を備えるポリペプチドやタンパク質。
[Disulfide bond部位]
配列番号1において、27-38番目、32-55番目、57-66番目、70-225番目、212-216番目、230-387番目の組み合わせで示されるアミノ酸。
[糖鎖修飾部位]
配列番号1において、228番目、238番目、325番目、329番目、350番目のアミノ酸。
[Phosphoserin修飾部位]
配列番号1において、42番目のアミノ酸。
(E) (A)から(D)に記載のいずれかのアミノ酸配列が二量体化されたポリペプチドやタンパク質。
That is, in order to solve the above problems, the present invention provides the following [1] to [17].
[1] MFG-E8 (Milk fat globule-EGF factor 8), MFG-E8 fragment, and polypeptide or protein containing either MFG-E8 or MFG-E8 fragment, one or more of these as active ingredients A composition for protecting dopamine neurons.
[2] The composition for protecting dopamine neurons according to [1], wherein the polypeptide or protein is represented by any of the following (A) to (E).
(A) The protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2.
(B) A polypeptide or protein comprising any or two or more of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 16.
(C) A polypeptide or protein containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the polypeptide or protein represented by (A) or (B).
(D) In the polypeptides and proteins shown in (A) to (C), the polypeptides and proteins having the same modification or functional site as the following in SEQ ID NO: 1.
[Disulfide bond site]
The amino acids shown in the combinations of positions 27-38, 32-55, 57-66, 70-225, 212-216, and 230-387 in SEQ ID NO: 1.
[Sugar chain modification site]
In SEQ ID NO: 1, the 228th, 238th, 325th, 329th and 350th amino acids.
[Phosphoserin modification site]
The 42nd amino acid in SEQ ID NO: 1.
(E) A polypeptide or protein in which any of the amino acid sequences described in (A) to (D) is dimerized.
[3] The composition for protecting dopamine neurons according to [1] or [2], wherein the polypeptide or protein contains an amino acid sequence of 10 to 387 residues.
[4] Polypeptides and proteins containing MFG-E8, MFG-E8 fragments, and either MFG-E8 or MFG-E8 fragments, any or two or more of these, from [1] The composition for protecting dopamine neurons according to any one of [3].
[5] The composition for protecting dopamine neurons according to [4], wherein the cell is a cell producing a pharmaceutical product or a cell of a product such as regenerative medicine.
[6] The composition for protecting dopamine neurons according to [5], wherein the cell is a human drug-producing cell or a human cell.
[7] A cell producing a human drug or a product such as human regenerative medicine in which the cell expresses a polypeptide or protein containing either the MFG-E8, the MFG-E8 fragment, or the MFG-E8 or the MFG-E8 fragment. The composition for protecting dopamine neurons according to [4] to [6], which are cells.
[8] The composition for protecting dopamine neurons according to any one of [4] to [7], wherein the cell or a product of the cell is a drug for humans or a product such as regenerative medicine. ..
[9] The composition for protecting dopamine neurons according to any one of [1] to [8], wherein the dopamine neurons are human dopamine neurons.
[10] The composition for protecting dopamine neurons according to any one of [1] to [9], wherein the dopamine neurons are in vivo dopamine neurons or therapeutic dopamine neurons.
[11] The composition for protecting dopamine neurons according to any one of [1] to [10], wherein the site of effect is in vivo.
[12] The composition for protecting dopamine neurons according to [11], wherein the effect site is nerve tissue.
[13] The composition for protecting dopamine neurons according to [4] to [12], or a cell that produces the composition.
[14] The method for producing cells according to [13].
(A) A step of designing or preparing a polypeptide or protein containing MFG-E8, MFG-E8 fragment, and either MFG-E8 or MFG-E8 fragment, or a vector expressing any one or more of them.
(B) The step of the cells taking up the vector and
(C) A step of selecting and culturing cells producing a polypeptide or protein containing MFG-E8, MFG-E8 fragment, and either MFG-E8 or MFG-E8 fragment.
(D) A step of conserving cells or concentrating, extracting, or purifying polypeptides or proteins containing either MFG-E8, MFG-E8 fragments, and MFG-E8 or MFG-E8 fragments produced by cells.
A method for producing a cell for protecting dopamine neurons, and a composition derived from the cell.
[15] The composition for treating Parkinson's disease according to [14], wherein the vector is an expression vector, or a method for producing a cell producing the composition.
[16] Endocrine expression of polypeptides and proteins containing MFG-E8, MFG-E8 fragments equivalent to the compositions described in [14], [15], and either MFG-E8 or MFG-E8 fragments. Use of therapeutic cells for dopaminergic neuronal protection.
[17] A composition that protects dopaminergic neurons represented by any of the following (A) to (E).
(A) The protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2.
(B) A polypeptide or protein comprising any or two or more of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 16.
(C) A polypeptide or protein containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the polypeptide or protein represented by (A) or (B).
(D) In the polypeptides and proteins shown in (A) to (C), the polypeptides and proteins having the same modification or functional site as the following in SEQ ID NO: 1.
[Disulfide bond site]
The amino acids shown in the combinations of positions 27-38, 32-55, 57-66, 70-225, 212-216, and 230-387 in SEQ ID NO: 1.
[Sugar chain modification site]
In SEQ ID NO: 1, the 228th, 238th, 325th, 329th and 350th amino acids.
[Phosphoserin modification site]
The 42nd amino acid in SEQ ID NO: 1.
(E) A polypeptide or protein in which any of the amino acid sequences described in (A) to (D) is dimerized.

本発明により、中脳黒質のドパミン神経細胞、治療用ドパミン神経細胞を保護可能な技術の提供が可能となる。 The present invention makes it possible to provide a technique capable of protecting dopaminergic neurons in the substantia nigra of the midbrain and therapeutic dopaminergic neurons.

中脳黒質へグラム陰性菌細胞壁外膜の構成成分であるリポ多糖(Lipopolysaccharide(LPS))を投与した場合におけるMFG-E8断片の効果を、ラットを用いて評価した顕微鏡撮影画像を示す図である(実施例1)。ラット黒質の免疫組織切片画像中の、TH染色陽性細胞を矢印で示す(スケールバー200μm)。In the figure showing a microscopic image of the effect of the MFG-E8 fragment evaluated using rats when lipopolysaccharide (LPS), which is a component of the outer membrane of Gram-negative bacteria cells, was administered to the substantia nigra of the midbrain. There is (Example 1). TH-stained positive cells in the immune tissue section image of rat substantia nigra are indicated by arrows (scale bar 200 μm). 中脳黒質へLPSを投与した場合におけるMFG-E8断片の効果を、ラットを用いて評価した結果を示す図である(実施例1)。ラットの中脳黒質へLPSを投与し、MFG-E8存在下及び非存在下で2週間飼育を行った。摘出後の脳組織切片にTyrosine Hydroxylase(TH)抗体を用いた免疫染色を行い、顕微鏡撮影画像内の面積に対する染色陽性部位の面積比率を算出した。It is a figure which shows the result of having evaluated the effect of MFG-E8 fragment when LPS was administered to the substantia nigra of the midbrain using rats (Example 1). LPS was administered to the substantia nigra of the rat, and the rats were bred for 2 weeks in the presence and absence of MFG-E8. The brain tissue section after excision was immunostained with a Tyrosine Hydroxylase (TH) antibody, and the area ratio of the staining positive site to the area in the microscopic image was calculated. 中脳黒質へLPSを投与した場合におけるMFG-E8断片の効果を、ラットを用いて評価した結果を示す図である(実施例1)。ラットの中脳黒質へLPSを投与し、MFG-E8存在下及び非存在下で2週間飼育を行った。摘出後の脳組織切片にTyrosine Hydroxylase(TH)抗体を用いた免疫染色を行い、顕微鏡撮影画像内の面積に対する染色陽性ドパミン神経細胞数を測定した。It is a figure which shows the result of having evaluated the effect of MFG-E8 fragment in the case of administration of LPS to the substantia nigra of the midbrain using rats (Example 1). LPS was administered to the substantia nigra of the rat, and the rats were bred for 2 weeks in the presence and absence of MFG-E8. The brain tissue section after excision was immunostained with a Tyrosine Hydroxylase (TH) antibody, and the number of staining-positive dopamine neurons was measured with respect to the area in the microscopic image.

以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。 Hereinafter, suitable embodiments for carrying out the present invention will be described. It should be noted that the embodiments described below show an example of typical embodiments of the present invention, and the scope of the present invention is not narrowly interpreted by this.

<<発明の原理ならびに有効成分>>
本発明は、配列番号2に示されるヒトMFG-E8の断片が、生体内においてドパミン神経細胞の保護効果を有することから見い出されたものである。
ヒトMFG-E8は、配列番号1(GenBank Accession No.Q08431)に示される387アミノ酸残基からなるタンパク質であり、ラクトアドヘリン(lactadherin)、Breast epithelial antigen BA46、HMFG、MFGM、secreted EGF repeat and discoidin domains-containing protein 1(SED1)とも称される。
<< Principle of invention and active ingredient >>
The present invention has been found because the fragment of human MFG-E8 shown in SEQ ID NO: 2 has a protective effect on dopaminergic neurons in vivo.
Human MFG-E8 is a protein consisting of 387 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 1 (GenBank Accession No. Q08431), lactadherin, Breast epithelial antigen BA46, HMFG, MFGM, secreted EGF repeat and discoidin. Also called domains-containing protein 1 (SED1).

配列番号1において1から23番目のアミノ酸配列は分泌シグナル配列であるほか、下記配列に示すような機能的部位を有する。
[配列番号3]EGF-like Domain部位を示す(配列番号1のアミノ酸配列24-67番目)。
[配列番号4]F5/8 type C1 Domain部位を示す(配列番号1のアミノ酸配列70-225番目)。
[配列番号5]F5/8 type C2 Domain部位を示す(配列番号1のアミノ酸配列230-387番目)。
[配列番号6]Lactadherin Chain部位を示す(配列番号1のアミノ酸配列24-387番目)。
[配列番号7]Lactadherin short form Chain部位を示す(配列番号1のアミノ酸配列202-387番目)。
[配列番号8]Medin Chain部位を示す(配列番号1のアミノ酸配列268-317番目)。
[配列番号9]ヒト脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清に分泌されるMFG-E8の配列部位の一部を示す(配列番号1のアミノ酸配列70-107番目)。
[配列番号10]ヒト脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清に分泌されるMFG-E8配列の一部を示す(配列番号1のアミノ酸配列207-219番目)。
[配列番号11]臨床用培地で培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞が発現するMFG-E8配列の一部を示す(配列番号1のアミノ酸配列93-107番目)。
[配列番号12]臨床用培地で培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞が発現するMFG-E8配列の一部を示す(配列番号1のアミノ酸配列111-134番目)。
[配列番号13]研究用培地で培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞が発現するMFG-E8配列の一部を示す(配列番号1のアミノ酸配列111-135番目)。
[配列番号14]研究用培地で培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞が発現するMFG-E8配列の一部を示す(配列番号1のアミノ酸配列220-237番目)。
[配列番号15]研究用培地で培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞が発現するMFG-E8配列の一部を示す(配列番号1のアミノ酸配列254-268番目)。
[配列番号16]研究用培地で培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞が発現するMFG-E8配列の一部を示す(配列番号1のアミノ酸配列272-308番目)。
加えて、配列番号1は、下記の修飾ないし官能部位を有する。
[Disulfide bond部位]
配列番号1において、27-38番目、32-55番目、57-66番目、70-225番目、212-216番目、230-387番目の組み合わせで示されるアミノ酸。
[糖鎖修飾部位]
配列番号1において、228番目、238番目、325番目、329番目、350番目のアミノ酸。
[Phosphoserin修飾部位]
配列番号1において、42番目のアミノ酸。
The amino acid sequences 1 to 23 in SEQ ID NO: 1 are secretory signal sequences and have functional sites as shown in the following sequences.
[SEQ ID NO: 3] Indicates an EGF-like Domain site (amino acid sequence 24-67 of SEQ ID NO: 1).
[SEQ ID NO: 4] Indicates the F5 / 8 type C1 Domain site (amino acid sequence 70-225 of SEQ ID NO: 1).
[SEQ ID NO: 5] Indicates the F5 / 8 type C2 Domain site (amino acid sequence 230-387 of SEQ ID NO: 1).
[SEQ ID NO: 6] Indicates the Lactadherin Chain site (amino acid sequence 24-387 of SEQ ID NO: 1).
[SEQ ID NO: 7] Indicates the Lactadherin short form Chain site (amino acid sequence 202-387 of SEQ ID NO: 1).
[SEQ ID NO: 8] Indicates the Medin Chain site (amino acid sequence 268-317 of SEQ ID NO: 1).
[SEQ ID NO: 9] A part of the sequence site of MFG-E8 secreted into the culture supernatant of human fat-derived mesenchymal stem cells is shown (amino acid sequence 70-107 of SEQ ID NO: 1).
[SEQ ID NO: 10] A part of the MFG-E8 sequence secreted into the culture supernatant of human fat-derived mesenchymal stem cells is shown (amino acid sequence 207-219 of SEQ ID NO: 1).
[SEQ ID NO: 11] A part of the MFG-E8 sequence expressed by human fat-derived mesenchymal stem cells cultured in a clinical medium is shown (amino acid sequence 93-107 of SEQ ID NO: 1).
[SEQ ID NO: 12] Shows a part of the MFG-E8 sequence expressed by human fat-derived mesenchymal stem cells cultured in a clinical medium (amino acid sequence 111-134 of SEQ ID NO: 1).
[SEQ ID NO: 13] A part of the MFG-E8 sequence expressed by human adipose-derived mesenchymal stem cells cultured in a research medium is shown (amino acid sequence 111-135 of SEQ ID NO: 1).
[SEQ ID NO: 14] Shows a part of the MFG-E8 sequence expressed by human fat-derived mesenchymal stem cells cultured in the research medium (amino acid sequence 220-237 of SEQ ID NO: 1).
[SEQ ID NO: 15] A part of the MFG-E8 sequence expressed by human adipose-derived mesenchymal stem cells cultured in a research medium is shown (amino acid sequence 254-268 of SEQ ID NO: 1).
[SEQ ID NO: 16] A part of the MFG-E8 sequence expressed by human adipose-derived mesenchymal stem cells cultured in a research medium is shown (amino acid sequence 272-308 of SEQ ID NO: 1).
In addition, SEQ ID NO: 1 has the following modifications or functional sites:
[Disulfide bond site]
The amino acids shown in the combinations of positions 27-38, 32-55, 57-66, 70-225, 212-216, and 230-387 in SEQ ID NO: 1.
[Sugar chain modification site]
In SEQ ID NO: 1, the 228th, 238th, 325th, 329th and 350th amino acids.
[Phosphoserin modification site]
The 42nd amino acid in SEQ ID NO: 1.

本発明で用いたMFG-E8断片は、ヒトMFG-E8のアミノ酸配列における24番目から387番目までのアミノ酸配列からなり、ヒトMFG-E8(387アミノ酸残基)のおよそ94%からなる断片である。
すなわちMFG-E8断片は、ヒトMFG-E8における分泌シグナル配列部分が除去されたアミノ酸配列から構成されており、分泌能を除く機能は、ヒトMFG-E8と同等である。加えて、MFG-E8断片は、前記配列番号3から16に示す各種機能的部位を含むものである。これより、MFG-E8断片の有する機能的部位のいずれか又は複数を含む、又はMFG-E8断片と機能的に同等若しくはこれを包含する機能を有すると評価しうる組成物は、同様のドパミン神経細胞保護効果が期待できるものである。
このようなドパミン神経細胞保護効果が期待できる組成物として、下記のポリペプチドもしくはたんぱく質が挙げられる。
(1) ヒトMFG-E8(GenBank Accession No.Q08431、配列番号1)。
(2) ヒトMFG-E8断片(配列番号2)。
(3) ヒトMFG-E8断片の機能的部位で示されるアミノ酸配列(配列番号3から16のいずれかで示されるアミノ酸配列)。
(4) ヒトMFG-E8断片の複数の機能的部位を含むアミノ酸配列(配列番号3から16の二種以上を含むアミノ酸配列)。
(5) 上記(1)から(4)で示されるアミノ酸配列のうち、1もしくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列。
(6) 上記(1)から(5)で示されるアミノ酸配列のうち、MFG-E8が有するDisulfide bond部位、糖修飾部位、Phosphoserin修飾部位、これらいずれか又は複数を実質的に備えるアミノ酸配列。
(7) 上記(1)から(6)で示されるアミノ酸配列が二量体化されたアミノ酸配列。
(8) ヒトMFG-E8のアイソフォーム(GenBank Accession No.Q08431-1、No.Q08431-2、No.Q08431-3など)やMFG-E8のホモログ、ならびにこれらの上記(1)から(6)に相当するアミノ酸配列。
すなわち,これらを換言すれば,ドパミン神経細胞保護効果が期待できる化合物は,下記に示されるアミノ酸配列化合物である。
(A) 配列番号1又は2のアミノ酸配列で示されるタンパク質。
(B) 配列番号3から16で示されるアミノ酸配列のいずれか又は二種以上を含んでなるポリペプチドやタンパク質。
(C) (A)又は(B)で示されるポリペプチドやタンパク質において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含む、ポリペプチドやタンパク質。
(D) (A)から(C)で示されるポリペプチドやタンパク質において、配列番号1における下記と同等の修飾ないし官能部位を備えるポリペプチドやタンパク質。
[Disulfide bond部位]
配列番号1において、27-38番目、32-55番目、57-66番目、70-225番目、212-216番目、230-387番目の組み合わせで示されるアミノ酸。
[糖鎖修飾部位]
配列番号1において、228番目、238番目、325番目、329番目、350番目のアミノ酸。
[Phosphoserin修飾部位]
配列番号1において、42番目のアミノ酸。
(E) (A)から(D)に記載のいずれかのアミノ酸配列が二量体化されたポリペプチドやタンパク質。
The MFG-E8 fragment used in the present invention consists of the 24th to 387th amino acid sequences in the amino acid sequence of human MFG-E8, and is a fragment consisting of approximately 94% of human MFG-E8 (387 amino acid residues). ..
That is, the MFG-E8 fragment is composed of an amino acid sequence in which the secretory signal sequence portion of human MFG-E8 has been removed, and its function excluding secretory ability is equivalent to that of human MFG-E8. In addition, the MFG-E8 fragment contains the various functional sites set forth in SEQ ID NOs: 3 to 16. From this, a composition that can be evaluated to contain any or more of the functional sites of the MFG-E8 fragment, or to have a function that is functionally equivalent to or includes the MFG-E8 fragment, is a similar dopaminergic nerve. It can be expected to have a cytoprotective effect.
Examples of the composition that can be expected to have such a dopaminergic neuron protective effect include the following polypeptides or proteins.
(1) Human MFG-E8 (GenBank Accession No.Q08431, SEQ ID NO: 1).
(2) Human MFG-E8 fragment (SEQ ID NO: 2).
(3) Amino acid sequence shown at the functional site of the human MFG-E8 fragment (amino acid sequence shown by any of SEQ ID NOs: 3 to 16).
(4) Amino acid sequence containing a plurality of functional sites of a human MFG-E8 fragment (amino acid sequence containing two or more of SEQ ID NOs: 3 to 16).
(5) An amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added among the amino acid sequences shown in (1) to (4) above.
(6) Among the amino acid sequences shown in (1) to (5) above, an amino acid sequence substantially comprising one or a plurality of a disulfide bond site, a sugar modification site, and a phosphoserin modification site possessed by MFG-E8.
(7) An amino acid sequence obtained by dimerizing the amino acid sequences shown in (1) to (6) above.
(8) Human MFG-E8 isoforms (GenBank Accession No.Q08431-1, No.Q08431-2, No.Q08431-3, etc.), MFG-E8 homologues, and these (1) to (6) above. Amino acid sequence corresponding to.
That is, in other words, the compounds that can be expected to have a dopaminergic neuron protective effect are the amino acid sequence compounds shown below.
(A) The protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2.
(B) A polypeptide or protein comprising any or two or more of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 16.
(C) A polypeptide or protein containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the polypeptide or protein represented by (A) or (B).
(D) In the polypeptides and proteins shown in (A) to (C), the polypeptides and proteins having the same modification or functional site as the following in SEQ ID NO: 1.
[Disulfide bond site]
The amino acids shown in the combinations of positions 27-38, 32-55, 57-66, 70-225, 212-216, and 230-387 in SEQ ID NO: 1.
[Sugar chain modification site]
In SEQ ID NO: 1, the 228th, 238th, 325th, 329th and 350th amino acids.
[Phosphoserin modification site]
The 42nd amino acid in SEQ ID NO: 1.
(E) A polypeptide or protein in which any of the amino acid sequences described in (A) to (D) is dimerized.

MFG-E8ないしMFG-E8断片のアミノ酸配列の一部を含んで構成されるポリペプチドやタンパク質は細胞により産生される組成物でもあり、その例として、発明者らが行った液体クロマトグラフィー質量分析法(Liquid Chromatography/Mass Spectrometry: LC/MS/MS)を用いた解析結果により示される(非特許文献6)。細胞の培養条件を変えてヒト脂肪由来間葉系幹細胞が発現・分泌するMFG-E8断片のアミノ酸配列を同定し、前記配列番号11から16に示される機能的部位を明らかとした。
なお、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞(hMSC-AT-c)はPromoCell社(Heidelberg, Germany)より入手した。臨床用培地(MSCGM-CD間葉系幹細BulletKit)はLonza社(Basel, Schweiz)より入手した。研究用培地として10%FBS含有DMEMを用いた。
Polypeptides and proteins composed of a part of the amino acid sequence of MFG-E8 or MFG-E8 fragments are also compositions produced by cells, for example, liquid chromatography-mass spectrometry performed by the inventors. It is shown by the analysis result using the method (Liquid Chromatography / Mass Spectrometry: LC / MS / MS) (Non-Patent Document 6). The amino acid sequences of the MFG-E8 fragments expressed and secreted by human fat-derived mesenchymal stem cells were identified by changing the cell culture conditions, and the functional sites shown in SEQ ID NOs: 11 to 16 were clarified.
Human fat-derived mesenchymal stem cells (hMSC-AT-c) were obtained from PromoCell (Heidelberg, Germany). The clinical medium (MSCGM-CD mesenchymal stem cell Bullet Kit) was obtained from Lonza (Basel, Schweiz). DMEM containing 10% FBS was used as the research medium.

本発明で用いられるMFG-E8断片ないしMFG-E8(以下、これらをまとめて「MFG-E8等」とも称する。)について、これらの構造ないし機能を損なわない限りは、ドパミン神経保護効果を期待できることから、部分的なアミノ酸配列の短縮・伸長を行うこともできる。 The MFG-E8 fragment or MFG-E8 (hereinafter collectively referred to as "MFG-E8, etc.") used in the present invention can be expected to have a dopamine neuroprotective effect as long as these structures or functions are not impaired. Therefore, it is also possible to partially shorten or extend the amino acid sequence.

MFG-E8断片の短縮の場合、10以上のアミノ酸配列から構成され、配列番号2から16のアミノ酸配列を含む。例えば配列番号2では、少なくともMFG-E8断片の90%から99%(327-363アミノ酸残基)、好ましくは91から99%(331-363アミノ酸残基)、より好ましくは92から99%(334-363アミノ酸残基)、特に好ましくは93から99%(338-363アミノ酸残基)、最も好ましくは94から99%(342-363アミノ酸残基)が挙げられる。
また、MFG-E8断片の伸長の場合、10以上のアミノ酸配列から構成され、配列番号2から16のアミノ酸配列を含む。例えば配列番号2では、少なくともMFG-E8断片の100%から120%(365-436アミノ酸残基)、好ましくは101%から118%(365-429アミノ酸残基)、より好ましくは101%から116%(365-422アミノ酸残基)、特に好ましくは101%から114%(365-414アミノ酸残基)、最も好ましくは101%から110%(365-400アミノ酸残基)とすることができる。
In the case of shortening the MFG-E8 fragment, it is composed of 10 or more amino acid sequences and contains the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 16. For example, in SEQ ID NO: 2, at least 90% to 99% (327-363 amino acid residues), preferably 91 to 99% (331-363 amino acid residues), more preferably 92 to 99% (334) of the MFG-E8 fragment. -363 amino acid residues), particularly preferably 93 to 99% (338-363 amino acid residues), most preferably 94 to 99% (342-363 amino acid residues).
Further, in the case of extension of the MFG-E8 fragment, it is composed of 10 or more amino acid sequences and contains the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 16. For example, in SEQ ID NO: 2, at least 100% to 120% (365-436 amino acid residues), preferably 101% to 118% (365-429 amino acid residues), more preferably 101% to 116% of the MFG-E8 fragment. (365-422 amino acid residues), particularly preferably 101% to 114% (365-414 amino acid residues), most preferably 101% to 110% (365-400 amino acid residues).

MFG-E8の短縮の場合、配列番号1のアミノ酸配列を含む。配列番号1では、少なくともMFG-E8の90%から99%(348-386アミノ酸残基)、好ましくは91から99%(352-386アミノ酸残基)、より好ましくは92から99%(356-386アミノ酸残基)、特に好ましくは93から99%(359-386アミノ酸残基)、最も好ましくは94から99%(363-386アミノ酸残基)が挙げられる。
また、MFG-E8の伸長の場合、配列番号1のアミノ酸配列を含む。配列番号1では、少なくともMFG-E8の100%から120%(388-464アミノ酸残基)、好ましくは101%から118%(388-456アミノ酸残基)、より好ましくは101%から116%(388-448アミノ酸残基)、特に好ましくは101%から114%(388-441アミノ酸残基)、最も好ましくは101%から110%(388-425アミノ酸残基)とすることができる。
In the case of shortening of MFG-E8, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is included. In SEQ ID NO: 1, at least 90% to 99% (348-386 amino acid residues), preferably 91 to 99% (352-386 amino acid residues), more preferably 92 to 99% (356-386) of MFG-E8. Amino acid residues), particularly preferably 93 to 99% (359-386 amino acid residues), most preferably 94 to 99% (363-386 amino acid residues).
In the case of extension of MFG-E8, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is included. In SEQ ID NO: 1, at least 100% to 120% (388-464 amino acid residues) of MFG-E8, preferably 101% to 118% (388-456 amino acid residues), and more preferably 101% to 116% (388). -448 amino acid residues), particularly preferably 101% to 114% (388-441 amino acid residues), most preferably 101% to 110% (388-425 amino acid residues).

上記のとおり、本発明において有効成分として用いられるMFG-E8、MFG-E8断片、ならびにMFG-E8又はMFG-E8断片のいずれかを配列の一部として構成されるポリペプチドやたんぱく質について、これらは部分的なアミノ酸の置換・欠失・挿入や化学的修飾を行うことができる。
すなわち、これら有効成分と、構造的・機能的な同等性を保持したまま、部分的なアミノ酸の置換・欠失・挿入や化学的修飾を行った化合物については、均等な有効成分化合物に相当するものである。
As described above, for the MFG-E8, MFG-E8 fragment, and the polypeptide or protein in which either the MFG-E8 or MFG-E8 fragment is used as an active ingredient in the present invention as a part of the sequence, these are described. Partial amino acid substitution / deletion / insertion and chemical modification can be performed.
That is, a compound that has undergone partial amino acid substitution / deletion / insertion or chemical modification while maintaining structural and functional equivalence with these active ingredients corresponds to an equal active ingredient compound. It is a thing.

本発明では、組成物の一様態として、上記に挙げる有効成分そのものを組成物成分として含む様態が挙げられる。また、異なる様態として、後述する再生医療等製品などの治療用細胞により有効成分が産生される様態が挙げられる。
なお、治療用細胞における「治療」には、ドパミン神経細胞障害やパーキンソン病の根治的ないし対症的な治療法に加えて、これらの予防や遅延をも含むものとする。
In the present invention, as a uniform state of the composition, a mode in which the above-mentioned active ingredient itself is contained as a composition component can be mentioned. In addition, as a different mode, there is a mode in which the active ingredient is produced by therapeutic cells such as products such as regenerative medicine described later.
In addition, "treatment" in therapeutic cells includes not only curative or symptomatic treatment methods for dopaminergic neurocellular disorders and Parkinson's disease, but also prevention and delay of these.

<<治療用細胞や医薬品製造用細胞の製造方法>>
[MFG-E8]
本発明に係るパーキンソン病治療用細胞は、MFG-E8(Milk fat globule-EGF factor 8)、MFG-E8断片、ならびにMFG-E8又はMFG-E8断片のいずれかを含むポリペプチドやたんぱく質、これらのいずれか又は複数を産生することを特徴とする。
また,本発明のパーキンソン病治療用細胞は,下記の工程により作製することができる。
(a)MFG-E8、MFG-E8断片、ならびにMFG-E8又はMFG-E8断片のいずれかを含むポリペプチドやタンパク質、これらいずれか又は二種以上を発現するベクターを設計又は作製する工程
(b)細胞が前記ベクターを取り込む工程
(c)MFG-E8、MFG-E8断片、ならびにMFG-E8又はMFG-E8断片のいずれかを含むポリペプチドやタンパク質を産生する細胞を選別し培養する工程
これら一連の工程により作製されたパーキンソン病治療用細胞は,これを保存して治療用に用いる、もしくはパーキンソン病治療用細胞が産生したMFG-E8、MFG-E8断片、ならびにMFG-E8又はMFG-E8断片のいずれかを含むポリペプチドやタンパク質を濃縮、抽出、または精製することにより用いることができる。
<< Manufacturing method of therapeutic cells and pharmaceutical manufacturing cells >>
[MFG-E8]
The cells for treating Parkinson's disease according to the present invention include MFG-E8 (Milk fat globule-EGF factor 8), MFG-E8 fragments, and polypeptides and proteins containing either MFG-E8 or MFG-E8 fragments. It is characterized by producing one or more of them.
In addition, the cells for treating Parkinson's disease of the present invention can be produced by the following steps.
(A) A step of designing or preparing a polypeptide or protein containing MFG-E8, MFG-E8 fragment, and either MFG-E8 or MFG-E8 fragment, or a vector expressing any one or more of them (b). ) Steps for cells to take up the vector (c) Steps for selecting and culturing cells producing a polypeptide or protein containing either MFG-E8, MFG-E8 fragment, and MFG-E8 or MFG-E8 fragment. The cells for treating Parkinson's disease prepared by the above steps are stored and used for treatment, or MFG-E8, MFG-E8 fragments, and MFG-E8 or MFG-E8 fragments produced by the cells for treating Parkinson's disease. It can be used by concentrating, extracting, or purifying a polypeptide or protein containing any of the above.

本発明に係る治療用細胞の作製に用いられるMFG-E8の遺伝情報は、配列番号1に示されるヒトMFG-E8やアイソフォームに限られず、産生物が生体内でドパミン神経細胞を保護する活性を有する限りにおいて、ヒト以外のMFG-E8(MFG-E8ホモログ)の遺伝情報であってもよい。
MFG-E8ホモログの遺伝情報は、いずれの動物のものであってもよく、例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等の齧歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類などのホモログの遺伝情報であってよい。
一例として、マウス由来のMFG-E8の遺伝情報は学術誌へ記載されている(PLoS One. 2012;7(4):e36368. 及びPLoS One. 2011;6(11):e27685.)。
本発明に係る治療用細胞の作製に用いるMFG-E8ホモログの遺伝情報は、培養する再生医療等製品などの治療用細胞の由来に応じて適宜選択することができ、好ましくは培養する細胞の由来動物と同じ動物由来のMFG-E8ホモログの遺伝情報が用いられる。例えば、ヒト由来の治療用細胞を作製する場合は、ヒト由来のMFG-E8の遺伝情報を用いるのが好ましい。
一方で、本発明に係る医薬品製造用細胞の作製においては、抗体医薬品の製造に見られる様に、CHO(Chinese Hamster Ovary)細胞などのヒト以外のほ乳類由来のタンパク質高発現細胞株に対し、ヒト由来のMFG-E8の遺伝情報が用いられることも想定される。
The genetic information of MFG-E8 used for the production of therapeutic cells according to the present invention is not limited to the human MFG-E8 and isoform shown in SEQ ID NO: 1, and the activity of the product to protect dopamine neurons in vivo. As long as it has, it may be the genetic information of MFG-E8 (MFG-E8 homologue) other than human.
The genetic information of the MFG-E8 homolog may be from any animal, for example, rodents such as rats, mice, hamsters and guinea pigs, lagomorphs such as rabbits, pigs, cows, goats, sheep and the like. It may be genetic information of ungulates, rodents such as dogs and cats, and homologues such as humans, monkeys, red-tailed monkeys, marmosets, orangutans, and primates such as chimpanzees.
As an example, genetic information on MFG-E8 from mice has been published in academic journals (PLoS One. 2012; 7 (4): e36368. And PLoS One. 2011; 6 (11): e27685.).
The genetic information of the MFG-E8 homolog used for producing the therapeutic cells according to the present invention can be appropriately selected according to the origin of the therapeutic cells such as products for regenerative medicine to be cultured, and preferably the origin of the cells to be cultured. The genetic information of the MFG-E8 homolog from the same animal as the animal is used. For example, when producing therapeutic cells derived from humans, it is preferable to use the genetic information of MFG-E8 derived from humans.
On the other hand, in the production of cells for drug production according to the present invention, as seen in the production of antibody drugs, humans are opposed to protein-expressing cell lines derived from non-human mammals such as CHO (Chinese Hamster Ovary) cells. It is also assumed that the genetic information of the derived MFG-E8 will be used.

また、本発明に係る治療用細胞や医薬品製造用細胞の作製に用いられるMFG-E8の遺伝情報は、生体内でドパミン神経細胞の保護を促進する活性を有する限りにおいて、ヒトMFG-E8及びMFG-E8ホモログのアミノ酸配列を生成し得る、また任意長のポリペプチド(MFG-E8の断片)も産生し得るものとする。ポリペプチドの長さとしては、アミノ酸残基数で、例えば21〜100、好ましくは101〜200、より好ましくは201〜364とされる。好ましい断片の具体例としては、配列番号2から配列番号16に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド(10から364アミノ酸残基)が挙げられる。
なお、本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用されるものとする。
In addition, the genetic information of MFG-E8 used for producing therapeutic cells and pharmaceutical manufacturing cells according to the present invention is human MFG-E8 and MFG as long as it has an activity of promoting protection of dopamine neurons in vivo. It is assumed that the amino acid sequence of the -E8 homolog can be produced, and a polypeptide of arbitrary length (fragment of MFG-E8) can also be produced. The length of the polypeptide is, for example, 21 to 100, preferably 101 to 200, and more preferably 201 to 364 in terms of the number of amino acid residues. Specific examples of preferred fragments include polypeptides consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 2 to 16 (10 to 364 amino acid residues).
In addition, when used in this specification, "polypeptide" shall be used interchangeably with "peptide" or "protein".

さらに、本発明に係る治療用細胞や医薬品製造用細胞の作製に用いられるMFG-E8の遺伝情報は、生体内でドパミン神経細胞の保護を促進する活性を有する限り特に限定されない。すなわち、ヒトMFG-E8及びMFG-E8ホモログのアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を翻訳し得るヌクレオチド配列であってもよい。 Furthermore, the genetic information of MFG-E8 used for producing therapeutic cells and pharmaceutical manufacturing cells according to the present invention is not particularly limited as long as it has an activity of promoting protection of dopamine neurons in vivo. That is, it may be a nucleotide sequence capable of translating an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequences of human MFG-E8 and MFG-E8 homologues.

「1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により欠失、置換、挿入もしくは付加できる程度の数(好ましくは10個以下、より好ましくは7個以下、さらに好ましくは5個以下)のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を意味する。タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、当該タンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。 "Amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added" can be deleted, substituted, inserted or added by a known mutant polypeptide production method such as a site-specific mutagenesis method. It means an amino acid sequence in which a degree (preferably 10 or less, more preferably 7 or less, still more preferably 5 or less) of amino acids are deleted, substituted, inserted or added. It is well known in the art that some amino acids in a protein's amino acid sequence can be easily modified without significantly affecting the structure or function of the protein.

さらに、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。従って、「1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列」は、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に変異を導入した配列に該当するヌクレオチド配列に限定されるものではなく、天然に存在する変異体のアミノ酸配列に該当するヌクレオチド配列も含む。 Furthermore, it is also well known that in native proteins, there are variants that do not significantly alter the structure or function of the protein. Therefore, the "amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added" is limited to the nucleotide sequence corresponding to the sequence in which the mutation is artificially introduced by a known mutant polypeptide production method. It also includes nucleotide sequences that correspond to the amino acid sequences of naturally occurring variants.

本発明に係る治療用細胞や医薬品製造用細胞の作製に用いられるベクターは、天然から単離・精製されたMFG-E8タンパク質、組換えタンパク質又は合成タンパク質のヌクレオチド配列であってよく、翻訳後に化学修飾され得るものであってもよい。天然タンパク質のアミノ酸解析、組換えタンパク質の発現、タンパク質の合成あるいはこれらの遺伝子操作は、従来公知の手法によって行うことができる。 The vector used for producing the therapeutic cell or the pharmaceutical manufacturing cell according to the present invention may be a nucleotide sequence of an MFG-E8 protein, a recombinant protein or a synthetic protein isolated and purified from nature, and may be a chemical after translation. It may be something that can be modified. Amino acid analysis of natural proteins, expression of recombinant proteins, protein synthesis or gene manipulation of these can be performed by conventionally known methods.

上記ヌクレオチド配列には、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。目的タンパク質を細胞外に分泌させる場合には、目的タンパク質遺伝子の5’末端にシグナル配列をコードする塩基配列を導入すればよい。シグナル配列をコードする塩基配列は、動物細胞が分泌発現できるシグナル配列をコードする塩基配列であれば特に限定されないが、宿主が動物細胞である場合には、MFG-E8・シグナル配列、インシュリン・シグナル配列、α-インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。 The nucleotide sequence may further include a nucleotide sequence encoding a signal sequence. When the target protein is secreted extracellularly, a base sequence encoding a signal sequence may be introduced at the 5'end of the target protein gene. The base sequence encoding the signal sequence is not particularly limited as long as it is a base sequence encoding a signal sequence that can be secreted and expressed by an animal cell, but when the host is an animal cell, the MFG-E8 signal sequence and the insulin signal A sequence, an α-interferon signal sequence, an antibody molecule / signal sequence, etc. can be used.

上記タンパク質類をコードする核酸ホモログは、ヒト由来のMFG-E8遺伝子をコードするmRNAから合成したヌクレオチドに基づいて作製したプライマーやプローブを使用する周知の技術によって、ヒト以外の他の哺乳動物由来の、該遺伝子を発現することが公知の細胞や組織から調製したcDNAライブラリーから取得することができる。そのような技術には、PCR法、ハイブリダイゼーション法(サザン法、ノーザン法等)等が含まれる。 Nucleic acid homologues encoding the above proteins are derived from mammals other than humans by a well-known technique using primers and probes prepared based on nucleotides synthesized from mRNA encoding the human-derived MFG-E8 gene. , Can be obtained from a cDNA library prepared from cells or tissues known to express the gene. Such techniques include PCR methods, hybridization methods (Southern method, Northern method, etc.) and the like.

PCR法は、ポリメラーゼ連鎖反応であり、これは、二本鎖DNAを一本鎖に解離するための変性(denaturing)工程(約94〜96℃、約30秒〜1分)、プライマーを鋳型の一本鎖DNAに結合するためのアニーリング(annealing)工程(約55〜68℃、約30秒〜1分)、DNA鎖を伸長するための伸長(extension)工程(約72℃、約30秒〜1分)からなるサイクルを1サイクルとして約25〜40サイクルを実施する。また、変性工程の前に、約94〜95℃で約5〜12分の前加熱処理を行い、伸長工程の最終サイクル後に、さらに72℃で約7〜15分の伸長反応を実施することができる。PCRは、市販のサーマルサイクラーにて、耐熱性DNAポリメラーゼ[例えば、AmpliTaq Gold(登録商標)(Applied Biosystems)等]、MgCl2、dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)等を含有するPCRバッファー中で、センス及びアンチセンスプライマー(サイズ:約17〜30b、好ましくは20〜25b)と鋳型DNAの存在下で行う。増幅されたDNAは、アガロースゲル電気泳動で分離・精製(臭化エチジウム染色)することができる。 The PCR method is a polymerase chain reaction, which involves a denaturing step (about 94-96 ° C, about 30 seconds-1 minute) to dissociate double-stranded DNA into single strands, using a primer as a template. Annealing step to bind to single-stranded DNA (about 55-68 ° C, about 30 seconds to 1 minute), extension step to extend DNA strand (about 72 ° C, about 30 seconds ~) Approximately 25 to 40 cycles are carried out with a cycle consisting of 1 minute) as one cycle. In addition, before the modification step, a preheat treatment at about 94 to 95 ° C. for about 5 to 12 minutes can be performed, and after the final cycle of the extension step, an extension reaction at 72 ° C. for about 7 to 15 minutes can be carried out. it can. PCR is performed using a commercially available thermal cycler in a PCR buffer containing a heat-resistant DNA polymerase [for example, AmpliTaq Gold (registered trademark) (Applied Biosystems), etc.], MgCl 2 , dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), etc. In the presence of sense and antisense primers (size: about 17-30b, preferably 20-25b) and template DNA. The amplified DNA can be separated and purified (ethidium bromide staining) by agarose gel electrophoresis.

ハイブリダイゼーションは、約20〜100b又はそれ以上の長さの標識プローブと二本鎖を形成して目的核酸を検出する技法である。例えば、約1〜5×Standard Saline Citrate (SSC)、室温〜約40℃でのハイブリダイゼーション、その後の約0.1〜1×SSC、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、約45〜65℃の洗浄を行う。ここで、1×SSCは、150mM NaCl、15mM Na-クエン酸、pH7.0の溶液を指す。このような条件は、配列同一性が約80%以上、好ましくは85%以上の核酸を検出することを可能にする方法として知られている。 Hybridization is a technique for detecting a nucleic acid of interest by forming a double strand with a labeled probe having a length of about 20 to 100 b or longer. For example, about 1-5 x Standard Saline Citrate (SSC), hybridization at room temperature to about 40 ° C, then about 0.1-1 x SSC, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), washing at about 45-65 ° C. Do. Here, 1 × SSC refers to a solution of 150 mM NaCl, 15 mM Na-citric acid, pH 7.0. Such conditions are known as a method that makes it possible to detect nucleic acids having a sequence identity of about 80% or more, preferably 85% or more.

上記核酸はベクターに挿入され、本発明の治療用細胞や医薬品製造用細胞の有効成分であるポリペプチドやタンパク質の生産のために使用される。 The nucleic acid is inserted into a vector and used for the production of a polypeptide or protein which is an active ingredient of a therapeutic cell or a pharmaceutical manufacturing cell of the present invention.

ベクターは、例えばプラスミド、ファージ、ウイルス等を含む。プラスミドの例は、非限定的に、大腸菌由来プラスミド(例えばpRSET、pTZ19R、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119等)、枯草菌由来プラスミド(例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来プラスミド(例えばYEp13、YEp24、YCp50等)、Tiプラスミド等が挙げられ、ファージの例はλファージ等が挙げられ、さらに、ウイルスベクターの例は、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルス等の動物ウイルスベクター、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクター等が挙げられる。さらに、ヒト遺伝子治療用ベクターも使われ得る。さらにベクターを用いた遺伝子導入法に代わり、CRISPR/Cas9タンパク質を用いたゲノム編集技術も使われ得る。 Vectors include, for example, plasmids, phages, viruses and the like. Examples of plasmids include, but are not limited to, Escherichia coli-derived plasmids (eg, pRSET, pTZ19R, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, etc.), bacteriophage-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, etc.), yeast-derived plasmids (eg, YEp13, YEp24, etc.). YCp50, etc.), Ti plasmid, etc., examples of phage include λ phage, etc., and examples of viral vectors include retrovirus, vaccinia virus, lentivirus, adenovirus, adeno-associated virus, Sendai virus, etc. Examples thereof include animal viral vectors and insect viral vectors such as bacteriophage. In addition, human gene therapy vectors can also be used. Furthermore, instead of the gene transfer method using a vector, a genome editing technique using a CRISPR / Cas9 protein can also be used.

ベクターは、目的DNAを組み込むためのポリリンカーもしくはマルチクローニングサイトを含んでもよく、また、該DNAを発現するためにいくつかの制御エレメントを含むことができる。制御エレメントには、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリA付加シグナル、複製開始点、選択マーカー、リボソーム結合配列、ターミネーター等が含まれる。 The vector may include a polylinker or multicloning site for incorporating the DNA of interest, and may also include several regulatory elements to express the DNA. Control elements include, for example, promoters, enhancers, polyA addition signals, replication origins, selectable markers, ribosome binding sequences, terminators and the like.

選択マーカーの例は、薬剤耐性遺伝子(例えばネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等)、栄養要求性相補遺伝子(例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子、HIS3遺伝子、LEU2遺伝子、URA3遺伝子等)等である。 Examples of selectable markers are drug resistance genes (eg neomycin resistance gene, ampicillin resistance gene, canamycin resistance gene, puromycin resistance gene, etc.), nutritional requirement complementary genes (eg dihydrofolate reductase (DHFR) gene, HIS3 gene, LEU2 gene, etc.) , URA3 gene, etc.).

動物細胞を宿主とする場合、プロモーターとして、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター、ヒトCMV初期遺伝子プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター、メタロチオネインプロモーター、多角体プロモーター等が例示される。 When an animal cell is used as a host, examples of the promoter include SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, human CMV early gene promoter, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, metallotionein promoter, and polyhedron promoter. To.

形質転換又はトランスフェクションとしては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、アグロバクテリウム法、ウイルス感染法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法、リポフェクション法等が挙げられる。 Examples of transformation or transfection include electroporation method, spheroplast method, lithium acetate method, calcium phosphate method, Agrobacterium method, virus infection method, liposome method, microinjection method, gene gun method, lipofection method and the like. Can be mentioned.

[基礎培地]
本発明に係る治療用細胞の培養及び輸送に用いる培地の組成は、治療用細胞や医薬品製造用細胞の培養のために従来用いられている培地と同様でもよい。このような培地としては、例えば、動物組織に由来する細胞の培養に用いられている以下の培地が挙げられる。
[Basic medium]
The composition of the medium used for culturing and transporting the therapeutic cells according to the present invention may be the same as the medium conventionally used for culturing the therapeutic cells and the cells for manufacturing pharmaceutical products. Examples of such a medium include the following media used for culturing cells derived from animal tissues.

RPMI-1640培地、EagleのMEM培地、ダルベッコ改変MEM培地、Glasgow’s MEM培地、α-MEM培地、199培地、IMDM培地、DMEM培地、Hybridoma Serum free培地、Chemically Defined Hybridoma Serum Free培地、Ham’s Medium F-12、Ham’s Medium F-10、Ham’s Medium F12K、ATCC-CRCM30、DM-160、DM-201、BME、Fischer、McCoy’s 5A、Leibovitz’s L-15、RITC80-7、MCDB105、MCDB107、MCDB131、MCDB153、MCDB201、NCTC109、NCTC135、Waymouth’s MB752/1、CMRL-1066、Williams’ medium E、Brinster’s BMOC-3 Medium、E8 Medium(以上サーモフィッシャーサイエンティフィック社)、ReproFF2、Primate ES Cell Medium、ReproStem(以上リプロセル株式会社)、ProculAD(ロート製薬株式会社)、MSCBM-CD、MSCGM-CD(以上Lonza社)、EX-CELL302培地(SAFC社)またはEX-CELL-CD-CHO(SAFC社)、ReproMedTM iPSC Medium(リプロセル株式会社)、Cellartis MSC Xeno-Free Culture Medium(タカラバイオ株式会社)、TeSR-E8 (株式会社ベリタス)、StemFit(登録商標)AK02N、AK03N(味の素株式会社)及びこれらの混合物。 RPMI-1640 Medium, Eagle's MEM Medium, Dalbecco Modified MEM Medium, Glasgow's MEM Medium, α-MEM Medium, 199 Medium, IMDM Medium, DMEM Medium, Hybridoma Serum Free Medium, Chemically Defined Hybridoma Serum Free Medium, Ham's Medium F-12 , Ham's Medium F-10, Ham's Medium F12K, ATCC-CRCM30, DM-160, DM-201, BME, Fischer, McCoy's 5A, Leibovitz's L-15, RITC80-7, MCDB105, MCDB107, MCDB131, MCDB153, MCDB201, NCTC109 , NCTC135, Waymouth's MB752 / 1, CMRL-1066, Williams' medium E, Brinster's BMOC-3 Medium, E8 Medium (Thermo Fisher Scientific), ReproFF2, Prime ES Cell Medium, ReproStem (Repro Cell Co., Ltd.), ProculAD (Roto Pharmaceutical Co., Ltd.), MSCBM-CD, MSCGM-CD (Lonza), EX-CELL302 medium (SAFC) or EX-CELL-CD-CHO (SAFC), ReproMedTM iPSC Medium (ReproCel Co., Ltd.) , Cellartis MSC Xeno-Free Culture Medium (Takara Bio Co., Ltd.), TeSR-E8 (Veritas Co., Ltd.), StemFit (registered trademark) AK02N, AK03N (Ajinomoto Co., Ltd.) and mixtures thereof.

本発明に係る治療用細胞の培養、輸送及び保存に用いる培地には、MFG-E8を予め添加することも出来る。培地へのMFG-E8の添加濃度は、特に限定されないが、例えば1μg/mL〜5μg/mLとできる。 MFG-E8 can also be added in advance to the medium used for culturing, transporting and storing the therapeutic cells according to the present invention. The concentration of MFG-E8 added to the medium is not particularly limited, but can be, for example, 1 μg / mL to 5 μg / mL.

本発明に係る治療用細胞は投与される際に培地成分を含むこともあり得る。培地はMFG-E8を予め添加することも出来る。治療用細胞を投与する際に投与液に含まれるMFG-E8の添加濃度は、特に限定されないが、例えば0.1mg/mL〜1mg/mLとできる。 The therapeutic cells according to the present invention may also contain media components upon administration. MFG-E8 can be added to the medium in advance. The concentration of MFG-E8 added to the administration solution when the therapeutic cells are administered is not particularly limited, but can be, for example, 0.1 mg / mL to 1 mg / mL.

また、培地には、必要に応じて細胞の生存又は増殖に必要な生理活性物質及び栄養因子などを添加できる。これらの添加物は、予め培地へ添加されていてもよく、細胞培養中に添加されてもよい。 In addition, physiologically active substances and nutritional factors necessary for cell survival or proliferation can be added to the medium as needed. These additives may be added to the medium in advance or may be added during cell culture.

生理活性物質としては、インシュリン、IGF-1、トランスフェリン、アルブミンまたは補酵素Q10などが挙げられる。
栄養因子としては、糖、アミノ酸、ビタミン、加水分解物または脂質などが挙げられる。
糖としては、グルコース、マンノースまたはフルクトースなどが挙げられ、1種または2種以上を組み合わせて用いられる。
アミノ酸としてはL-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-システイン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシンまたはL-バリンなどが挙げられ、1種または2種以上を組み合わせて用いられる。
ビタミンとしては、d-ビオチン、D-パントテン酸、コリン、葉酸、myo-イノシトール、ナイアシンアミド、ピロドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミンまたはDL-α-トコフェロールなどが挙げられ、1種または2種以上を組み合わせて用いられる。
加水分解物としては、大豆、小麦、米、えんどう豆、とうもろこし、綿実、酵母抽出物などを加水分解したものが挙げられる。
脂質としては、コレステロール、リノール酸またはリノレイン酸などが挙げられる。
Physiologically active substances include insulin, IGF-1, transferrin, albumin or coenzyme Q10 and the like.
Nutritional factors include sugars, amino acids, vitamins, hydrolysates or lipids.
Examples of the sugar include glucose, mannose, fructose and the like, and one kind or a combination of two or more kinds is used.
Amino acids include L-alanine, L-arginine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-cysteine, L-glutamic acid, L-glutamine, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, Examples thereof include L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine or L-valine, and one or a combination of two or more thereof is used.
Examples of vitamins include d-biotin, D-pantothenic acid, choline, folic acid, myo-inositol, niacinamide, pyrodoxal, riboflavin, thiamine, cyanocobalamin or DL-α-tocopherol, and one or a combination of two or more. Is used.
Examples of the hydrolyzate include those obtained by hydrolyzing soybean, wheat, rice, peas, corn, cottonseed, yeast extract and the like.
Lipids include cholesterol, linoleic acid, linoleic acid and the like.

さらに、培地には、カナマイシン、ストレプトマイシン、ペニシリンまたはハイグロマイシンなどの抗生物質を必要に応じて添加してもよい。シアル酸等の酸性物質を培地に添加する場合には、培地のpHを細胞の成育に適した中性域であるpH5〜9、好ましくはpH6〜8に調整することが望ましい。 In addition, antibiotics such as kanamycin, streptomycin, penicillin or hygromycin may be added to the medium as needed. When an acidic substance such as sialic acid is added to the medium, it is desirable to adjust the pH of the medium to pH 5 to 9, preferably pH 6 to 8, which is a neutral range suitable for cell growth.

本発明に係る治療用細胞の培養及び輸送に係る培地は、血清を含まない培地、即ち無血清培地であってよい。本発明に係る培地は、血清を含有することもできるが、異種動物由来成分の混入防止の観点からは血清を含有しないことが好ましい。ここで、無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。無血清培地は、精製された血液由来成分や動物組織由来成分(例えば、増殖因子)を含有していてもよい。 The medium for culturing and transporting therapeutic cells according to the present invention may be a serum-free medium, that is, a serum-free medium. Although the medium according to the present invention may contain serum, it is preferable that the medium does not contain serum from the viewpoint of preventing contamination with components derived from different animals. Here, the serum-free medium means a medium containing no unprepared or unpurified serum. The serum-free medium may contain purified blood-derived components and animal tissue-derived components (for example, growth factors).

本発明に係る培地は、血清と同様に、血清代替物についてもこれを含んでいても含んでいなくともよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、脂質リッチアルブミン及び組換えアルブミン等のアルブミン代替物、植物デンプン、デキストラン、タンパク質加水分解物、トランスフェリン又は他の鉄輸送体、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3’-チオグリセロールあるいはこれらの均等物などが挙げられ得る。血清代替物の具体例として、例えば、国際公開第98/30679号記載の方法により調製されるものや、市販のknockout Serum Replacement(KSR社)、Chemically-defined Lipid concentrated(Life Technologies社)及びGlutamax(Life Technologies社)などが挙げられる。 The medium according to the present invention may or may not contain a serum substitute as well as serum. Serum substitutes include, for example, albumin substitutes such as albumin, lipid-rich albumin and recombinant albumin, plant starch, dextran, protein hydrolyzate, transferrin or other iron transporters, fatty acids, insulin, collagen precursors, trace amounts. Elements such as 2-mercaptoethanol, 3'-thioglycerol or equivalents thereof may be mentioned. Specific examples of serum substitutes include those prepared by the method described in International Publication No. 98/30679, commercially available knockout Serum Replacement (KSR), Chemically-defined Lipid concentrated (Life Technologies) and Glutamax (Life Technologies). Life Technologies) and so on.

ここで、本発明が対象とする「医薬品の産生細胞、又は再生医療等製品の細胞」は、幹細胞を含む。幹細胞は分化増殖能を有する未熟な細胞をいい、複能性幹細胞(multipotent stem cell)等が含まれる。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。 Here, the "cells producing pharmaceutical products or cells of products such as regenerative medicine" targeted by the present invention include stem cells. Stem cells refer to immature cells having the ability to differentiate and proliferate, and include multipotent stem cells and the like. Multipotent stem cells mean cells that have the ability to differentiate into multiple types of tissues and cells, but not all types.

複能性幹細胞としては、特に、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞及び生殖幹細胞等の体性幹細胞等が挙げられる。複能性幹細胞は、好ましくは間葉系幹細胞である。なお、間葉系幹細胞とは、骨芽細胞、軟骨芽細胞及び脂肪芽細胞等の間葉系の細胞全て又はいくつかへの分化が可能な幹細胞又はその前駆細胞の集団を広義に意味する。 Examples of the pluripotent stem cell include somatic stem cells such as mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, bone marrow stem cells and reproductive stem cells. Multipotent stem cells are preferably mesenchymal stem cells. The mesenchymal stem cell broadly means a group of stem cells or progenitor cells capable of differentiating into all or some mesenchymal cells such as osteoblasts, chondroblasts and lipoblasts.

ここで、本発明に係る培養方法に用いられる培養器は、特に限定されないが、フラスコ、ディッシュ、シャーレ、マイクロウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック及びステンレスタンクなどが挙げられ得る。これらの培養器の基材も、特に限定されず、ガラスや、ポリプロピレン及びポリスチレンなどの各種プラスチックとできる。従来、培養器の基材表面への細胞の接着を誘導するため、基材表面に足場をコーティングすることが行われていた。このような足場には、コラーゲン、ゼラチン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ラミニン、ラミニンの一部構造体、フィブロネクチン及びこれら混合物(例えばマトリゲル)並びに溶解細胞膜調製物(Lancet. 2005 May 7-13;365(9471):1636-1641.)などが用いられている。 Here, the incubator used in the culture method according to the present invention is not particularly limited, and examples thereof include flasks, dishes, petri dishes, microwell plates, microslides, chamber slides, tubes, trays, culture bags, and stainless steel tanks. obtain. The base material of these incubators is also not particularly limited, and may be glass or various plastics such as polypropylene and polystyrene. Conventionally, a scaffold has been coated on the surface of a base material in order to induce cell adhesion to the surface of the base material of an incubator. Such scaffolds include collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin, some structures of laminin, fibronectin and mixtures thereof (eg, Matrigel) and lysed cell membrane preparations (Lancet. 2005 May). 7-13; 365 (9471): 1636-1641.) Etc. are used.

治療用細胞の培養密度は、細胞の生存率の向上等の所望の効果を達成し得るような密度である限り特に限定されない。好ましくは約1.0×101〜1.0×107細胞/mL、より好ましくは約1.0×102〜1.0×107細胞/mL、さらにより好ましくは約1.0×103〜1.0×107細胞/mL、最も好ましくは約3.0×104〜1.0×107細胞/mLである。 The culture density of therapeutic cells is not particularly limited as long as it is a density that can achieve desired effects such as improvement of cell viability. Preferably about 1.0 × 10 1 to 1.0 × 10 7 cells / mL, more preferably about 1.0 × 10 2 to 1.0 × 10 7 cells / mL, even more preferably about 1.0 × 10 3 to 1.0 × 10 7 cells / mL. , Most preferably about 3.0 × 10 4 to 1.0 × 10 7 cells / mL.

温度、CO2濃度、溶存酸素濃度及びpHなどの培養条件は、従来技術に基づいて適宜設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが30〜40℃、好ましくは37℃であり得る。CO2濃度は、1〜10%、好ましくは2〜5%であり得る。酸素分圧は、1〜10%であり得る。 Culture conditions such as temperature, CO 2 concentration, dissolved oxygen concentration and pH can be appropriately set based on the prior art. For example, the culture temperature is not particularly limited, but can be 30 to 40 ° C, preferably 37 ° C. The CO 2 concentration can be 1-10%, preferably 2-5%. The oxygen partial pressure can be 1-10%.

[医薬品の産生細胞、又は再生医療等製品の細胞の製造方法]
本発明に係る培養細胞は、特に幹細胞を用いることで、幹細胞を含む細胞組成物の製造方法あるいは幹細胞からの分化細胞を含む細胞組成物の製造に応用できる。本発明に係る治療用細胞の製造方法を幹細胞又は分化細胞を含む細胞組成物の製造方法に適用することで、生体内へのMFG-E8の連続的な投与が不要となる。
ここで言う「再生医療等製品」は、以下に掲げる製品であって、政令で定めるものをいう。
(1)人又は動物の細胞に培養等の加工を施したものであって、
A、身体の構造・機能の再建・修復・形成するもの
B、疾病の治療・予防を目的として使用するもの
(2)遺伝子治療を目的として、人の細胞に導入して使用するもの
独立行政法人医薬品医療機器総合機構(Oharmaceuticals and Medical Devices Agency)のホームページを参照[https://www.pmda.go.jp/review-services/drug-reviews/about-reviews/ctp/0007.html]。
[Method for manufacturing cells for pharmaceutical products or cells for products such as regenerative medicine]
The cultured cells according to the present invention can be applied to a method for producing a cell composition containing stem cells or a cell composition containing differentiated cells from stem cells, particularly by using stem cells. By applying the method for producing therapeutic cells according to the present invention to the method for producing a cell composition containing stem cells or differentiated cells, continuous administration of MFG-E8 into a living body becomes unnecessary.
The term "regenerative medicine product" as used herein refers to the products listed below, which are specified by Cabinet Order.
(1) Human or animal cells that have been subjected to processing such as culturing.
A, Reconstruction / restoration / formation of body structure / function
B, Used for the purpose of treating / preventing diseases (2) Used by introducing into human cells for the purpose of gene therapy The website of the Pharmaceuticals and Medical Devices Agency (Pharmaceuticals and Medical Devices Agency) See [https://www.pmda.go.jp/review-services/drug-reviews/about-reviews/ctp/0007.html].

本発明に係る幹細胞を含む細胞組成物の製造方法の具体的な工程は、例えば以下の通りである。
(a)幹細胞を培養する工程。
(b)幹細胞へベクターを導入する工程。
(c)MFG-E8を産生する治療用細胞を増殖、維持、保存、輸送する工程。
Specific steps of the method for producing a cell composition containing stem cells according to the present invention are as follows, for example.
(A) Step of culturing stem cells.
(B) The step of introducing a vector into stem cells.
(C) A step of proliferating, maintaining, preserving, and transporting therapeutic cells that produce MFG-E8.

工程(a)は、幹細胞を増殖、維持する工程である。工程(a)は、幹細胞培養のための従来方法を適用して行えばよく、足場及び/又は血清(あるいは血清抽出物等)の存在下での培養であってもよい。 Step (a) is a step of proliferating and maintaining stem cells. Step (a) may be carried out by applying a conventional method for culturing stem cells, and may be culturing in the presence of a scaffold and / or serum (or serum extract or the like).

工程(b)は、幹細胞へベクターを導入する工程であり、工程(c)は、本発明に係る遺伝子操作方法によって、作製された治療用細胞を、増殖、維持する工程である。工程(b)でベクターを導入された幹細胞は、再度工程(a)に付して継代を行ってもよい。また、工程(b)と工程(c)との間に、工程(b)で得られた遺伝子導入細胞を識別する工程を行ってもよい。この追加工程によってMFG-E8産生細胞のみを純化することができる。さらに、工程(a)において、血清を用いている場合には、工程(b)と工程(c)との間に、工程(b)で得られた細胞を無血清培地や緩衝液で洗浄する工程を行ってもよい。また、発明者らはヒト脂肪由来間葉系幹細胞がMFG-E8を発現・分泌する特徴を持つことを明らかとしていることから(非特許文献6)、遺伝子導入操作を行わないヒト脂肪由来間葉系幹細胞についても同様の解釈がなされる。 Step (b) is a step of introducing a vector into stem cells, and step (c) is a step of proliferating and maintaining therapeutic cells produced by the gene manipulation method according to the present invention. Stem cells into which the vector has been introduced in step (b) may be subcultured again in step (a). Further, a step of identifying the gene-introduced cells obtained in the step (b) may be performed between the step (b) and the step (c). Only MFG-E8 producing cells can be purified by this additional step. Further, when serum is used in the step (a), the cells obtained in the step (b) are washed with a serum-free medium or a buffer solution between the steps (b) and the step (c). The process may be performed. In addition, since the inventors have clarified that human adipose-derived mesenchymal stem cells have the characteristic of expressing and secreting MFG-E8 (Non-Patent Document 6), human adipose-derived mesenchymal cells without gene transfer manipulation are performed. The same interpretation is made for line stem cells.

[分化細胞を含む細胞組成物の製造方法]
本発明に係る幹細胞から分化細胞を含む細胞組成物を製造する方法では、上記工程(a)において増殖した幹細胞を分化誘導する。幹細胞の分化誘導法自体は公知の手法によって行うことができる。例えばレチノイン酸などの分化誘導剤を培地に添加することにより、足場非存在下で、幹細胞を神経系細胞などへ分化させることが可能となる。また、分化誘導を工程(b)の後に別途の工程として行ってもよく、その場合には公知の手法によって分化誘導の処理を行えばよい。
[Method for producing cell composition containing differentiated cells]
In the method for producing a cell composition containing differentiated cells from stem cells according to the present invention, the stem cells proliferated in the above step (a) are induced to differentiate. The method for inducing differentiation of stem cells itself can be performed by a known method. For example, by adding a differentiation inducer such as retinoic acid to the medium, it becomes possible to differentiate stem cells into nervous system cells and the like in the absence of a scaffold. Further, the differentiation induction may be performed as a separate step after the step (b), and in that case, the differentiation induction process may be performed by a known method.

[細胞組成物]
本発明に係る、MFG-E8等を産生する幹細胞及び/又は分化細胞を含む細胞組成物は、さらなる幹細胞の培養のため、あるいは再生医療等製品の細胞製造のために利用され得る。
[Cell composition]
The cell composition containing stem cells and / or differentiated cells producing MFG-E8 or the like according to the present invention can be used for further culturing stem cells or for cell production of products such as regenerative medicine.

ここで、本発明に係る細胞組成物は、前述の製造方法により得られ、小さな細胞塊のような分散した幹細胞が、培養後の培地成分を含む組成物であり得る。
凍結保存等の保存に用いられる場合、本発明に係る再生医療等製品の細胞は、公知の細胞保存液の他に、上述したような培地の成分、血清あるいはその代替物、又はDMSO等の有機溶剤へ混合されていてもよい。この場合、血清又はその代替物の濃度は、特に限定されるものではないが、1〜50%(v/v)、好ましくは5〜20%(v/v)であり得る。有機溶剤の濃度は、特に限定されるものではないが、0〜50%(v/v)、好ましくは5〜20%(v/v)であり得る。
本発明に係る再生医療等製品の細胞は、移植、静脈注射、脳室内投与及び脳実質内投与などの手段によって患者に適用することができる。
Here, the cell composition according to the present invention can be a composition obtained by the above-mentioned production method, in which dispersed stem cells such as small cell clusters contain a culture medium component after culturing.
When used for storage such as cryopreservation, the cells of the product for regenerative medicine according to the present invention include, in addition to the known cell preservation solution, the above-mentioned medium components, serum or a substitute thereof, or an organic substance such as DMSO. It may be mixed with a solvent. In this case, the concentration of serum or a substitute thereof is not particularly limited, but may be 1 to 50% (v / v), preferably 5 to 20% (v / v). The concentration of the organic solvent is not particularly limited, but may be 0 to 50% (v / v), preferably 5 to 20% (v / v).
The cells of the regenerative medicine product according to the present invention can be applied to a patient by means such as transplantation, intravenous injection, intracerebroventricular administration and intracranial administration.

[実施例1:ラット中脳黒質のドパミン神経細胞に対するMFG-E8の保護効果]
LPS投与パーキンソン病モデルラットを作製し、中脳黒質のドパミン神経細胞に対するMFG-E8の保護効果を調べた。
[Example 1: Protective effect of MFG-E8 on dopaminergic neurons in the substantia nigra of rat midbrain]
LPS-administered Parkinson's disease model rats were prepared and the protective effect of MFG-E8 on dopaminergic neurons in the substantia nigra of the midbrain was investigated.

1.実験方法・実験手技
(1)Crl:CD(SD)(雄、6週齢)ラットを用いた。
(2)LPS(Lipopolysaccharides from Escherichia coli 026:B6,SIGMA,L2762)、配列番号2に示すMFG-E8断片(MFG-E8 protein Leu24-Cys387、製品URL;https://www.rndsystems.com/products/recombinant-human-mfg-e8-protein-cf_2767-mf#product-details)を用いた。
(3)投与薬は、被験物質A(LPSを0μg、MFG-E8断片を0μg/1μL含む)、被験物質B(LPSを1μg、MFG-E8断片を0μg/1μL含む)、被験物質C(LPSを1μg、MFG-E8断片を200ng/1μL含む)を用いた。溶媒は超純水(ミリQ水)を用いた。組織切片はZEISS Axioskop 2 plus顕微鏡を用いて観察された。
1. 1. Experimental method / procedure (1) Crl: CD (SD) (male, 6 weeks old) rats were used.
(2) LPS (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 026: B6, SIGMA, L2762), MFG-E8 fragment shown in SEQ ID NO: 2 (MFG-E8 protein Leu24-Cys387, product URL; https://www.rndsystems.com/products / recombinant-human-mfg-e8-protein-cf_2767-mf # product-details) was used.
(3) The drugs to be administered are test substance A (containing 0 μg of LPS and 0 μg / 1 μL of MFG-E8 fragment), test substance B (containing 1 μg of LPS and 0 μg / 1 μL of MFG-E8 fragment), and test substance C (LPS). 1 μg and 200 ng / 1 μL of MFG-E8 fragment were used). Ultrapure water (millimeter water) was used as the solvent. Tissue sections were observed using a ZEISS Axioskop 2 plus microscope.

2.投与検体の注入
動物へベントバルビタールナトリウム(東京化成工業株式会)40mg/kgを腹腔内投与(投与液量:0.8mL/kg)し麻酔する。麻酔後、頭皮にレボブピバカイン塩酸塩(ポプスカイン(登録商標)0.25%注、丸石製薬株式会社)0.L-mLを皮下投与する。次に動物の頭頂部の毛を刈り、頭部を脳定位固定装置に固定する。頭皮をヨードチンキで消毒後に切開して、頭蓋骨を露出させ、頭蓋骨上の結合組織を綿棒で取り除いたのち、ブロワーで乾燥させてbregmaの位置を見やすくする。歯科用ドリルを用いてbregmaより右側方2.0mm、後方5.3mmの頭蓋骨にステンレスパイプ刺入用の穴を開ける。骨表面から7.8mmの深さまで外径0.5mmのシリコンチューブ及びマイクロシリンジに接続されたステンレスパイプを垂直に刺入する。黒質内に投与検体1μLをマイクロシリンジポンプで5分間かけて注入する。注入後は、ステンレスパイプを挿入したまま5分間静置し、ステンレスパイプをゆっくりと上げたのち、ステンレスパイプを取り外す。その後、頭蓋穴を非吸収性骨髄止血剤(ネストップ、アルフレッサファーマ株式会社)で塞ぎ、頭皮を縫合する。動物を脳定位固定装置から外し、飼育ケージに戻す。なお、ステンレスパイプ及びシリコンチューブは滅菌済みのものを使用した。
2. 2. Injection of administration sample Intraperitoneal administration of 40 mg / kg of bentobarbital sodium (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (administration solution volume: 0.8 mL / kg) is performed to anesthetize the animal. After anesthesia, levobupivacaine hydrochloride (Popskine (registered trademark) 0.25% injection, Maruishi Pharmaceutical Co., Ltd.) 0.L-mL is subcutaneously administered to the scalp. Next, the hair on the crown of the animal is shaved and the head is fixed to the brain localization device. After disinfecting the scalp with iodine tincture, an incision is made to expose the skull, the connective tissue on the skull is removed with a cotton swab, and then dried with a blower to make it easier to see the location of bregma. Using a dental drill, make a hole for inserting a stainless steel pipe in the skull 2.0 mm to the right of bregma and 5.3 mm behind. A silicon tube with an outer diameter of 0.5 mm and a stainless steel pipe connected to a microsyringe are inserted vertically from the bone surface to a depth of 7.8 mm. Inject 1 μL of the administered sample into the substantia nigra with a microsyringe pump over 5 minutes. After injection, let stand for 5 minutes with the stainless steel pipe inserted, slowly raise the stainless steel pipe, and then remove the stainless steel pipe. Then, the cranial hole is closed with a non-absorbable bone marrow hemostatic agent (Nestop, Alfresa Pharma Corporation), and the scalp is sutured. Remove the animal from the brain localization device and return it to the rearing cage. The stainless steel pipe and the silicon tube used were sterilized.

3.脳の摘出
投与検体を注入した2週間後に脳を摘出する。
動物をベントバルビタールナトリウム(40mg/kg、投与液量:1mL/kg、腹腔内投与)麻酔下で背位に固定する。開胸して心臓を露出させ、下行大動脈の血流を鉗子で止める。左心室をハサミで切開し、輸血チューブと連結したマウス用ディスポーザブル経ロゾンデの先端を左心室から大動脈に導き、経ロゾンデ先端をクレンメで固定する。心耳を切開し、生理食塩液300mLを、輸血チューブを通して灌流・放血して安楽死させる。その後、4%パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液300mLを灌流し、固定する。固定後は、頭蓋骨を外して全脳を摘出する。摘出した脳は、4%パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液の入ったサンプル瓶内で、冷蔵下、浸漬固定する。
3. 3. Brain removal Two weeks after injecting the administered sample, the brain is removed.
Animals are fixed in the doggy style under anesthesia with bentobarbital sodium (40 mg / kg, dosage: 1 mL / kg, intraperitoneal administration). Thoracotomy is performed to expose the heart and blood flow in the descending aorta is stopped with forceps. The left ventricle is incised with scissors, the tip of the disposable translosonde for mice connected to the blood transfusion tube is guided from the left ventricle to the aorta, and the tip of the translosonde is fixed with a clamp. An incision is made in the heart and ear, and 300 mL of physiological saline is perfused and exsanguinated through a blood transfusion tube for euthanasia. Then, perfuse 300 mL of 4% paraformaldehyde / phosphate buffer and fix. After fixation, the skull is removed and the entire brain is removed. The removed brain is immersed and fixed in a sample bottle containing 4% paraformaldehyde / phosphate buffer under refrigeration.

4.ラット脳における免疫染色(Tyrosine Hydroxylase:HT染色)
摘出した脳は、常法に従ってパラフィンブロックを作製する。その後、投与検体注入領域を中心に切片を作製する。得られた切片は、TH抗体を用いてTH免疫染色を実施する。
4. Immunostaining in rat brain (Tyrosine Hydroxylase: HT staining)
The removed brain prepares a paraffin block according to a conventional method. Then, a section is prepared around the administration sample injection area. The obtained sections are subjected to TH immunostaining with TH antibody.

5.免疫染色
1)脱パラフィン→アルコール→DW
2)PBS洗浄
3)オートクレーブによる賦活化 120℃、10分
4)PBS洗浄
5)1%過酸化水素/メタノール
6)PBS洗浄
7)スキムミルクにて非特異反応のブロック
8)一次抗体:Rabbit polyclonaL-to Tyrosine Hydroxylase
4℃/1h 100倍希釈 [sbcam: ab112]
9)PBS洗浄
10)ヒストファイン シンプルステイン ラットMAX-PO(MULTI)
11)PBS洗浄
12)DABで発色→DWでストップ
13)核染色(マイヤーのヘマトキシリン)→水洗→アルコール脱水→キシレン透徹
5. Immunostaining
1) Deparaffinization → alcohol → DW
2) PBS cleaning
3) Activation by autoclave 120 ℃, 10 minutes
4) PBS cleaning
5) 1% hydrogen peroxide / methanol
6) PBS cleaning
7) Block non-specific reactions with skim milk
8) Primary antibody: Rabbit polyclona L-to Tyrosine Hydroxylase
4 ° C / 1h 100-fold dilution [sbcam: ab112]
9) PBS cleaning
10) Hist Fine Simple Stain Rat MAX-PO (MULTI)
11) PBS cleaning
12) Color development with DAB → Stop with DW
13) Nuclear staining (Meyer's hematoxylin) → Washing with water → Dehydration of alcohol → Transparent xylene

6.実験結果
(1)結果を図1から3に示す。
(2)被験物質A(LPSを0μg、MFG-E8断片を0μg/1μL含む)を投与された中脳黒質では、TH染色陽性細胞が顕微鏡写真中に118.0±28.6 cells観察された(図1A、図3)。
(3)被験物質B(LPSを1μg、MFG-E8断片を0μg/1μL含む)を投与された中脳黒質では、TH染色陽性細胞が顕微鏡写真中に31.0±13.2 cells観察された(図1B、図3)。
(4)被験物質C(LPSを1μg、MFG-E8断片を200ng/1μL含む)を投与された中脳黒質では、TH染色陽性細胞が顕微鏡写真中に73.7±38.6 cells観察された(図1C、図3)。
(5)この測定では被験物質BグループはAグループに比べて有意に細胞数が減少した(*、P<0.05、n=3)(実施例1、図1と3)。
6. Experimental Results (1) The results are shown in FIGS. 1 to 3.
(2) In the substantia nigra to which test substance A (containing 0 μg of LPS and 0 μg / 1 μL of MFG-E8 fragment) was administered, TH staining-positive cells were observed in micrographs as 118.0 ± 28.6 cells (Fig. 1A). , Fig. 3).
(3) In the substantia nigra to which test substance B (containing 1 μg of LPS and 0 μg / 1 μL of MFG-E8 fragment) was administered, TH staining-positive cells were observed in micrographs as 31.0 ± 13.2 cells (Fig. 1B). , Fig. 3).
(4) In the substantia nigra to which test substance C (containing 1 μg of LPS and 200 ng / 1 μL of MFG-E8 fragment) was administered, TH staining-positive cells were observed in micrographs as 73.7 ± 38.6 cells (Fig. 1C). , Fig. 3).
(5) In this measurement, the number of cells in the test substance B group was significantly reduced as compared with the A group (*, P <0.05, n = 3) (Example 1, FIGS. 1 and 3).

(6)画像内のTH陽性発色部位の面積比率を、画像解析ソフトImage J 1.440(http://imagej.nih.gov/ij)を用いて測定した。
(7)被験物質Bを投与された中脳黒質では、免疫組織染色の陽性発色部位が、被験物質A(1.0±0.1 [被験物質Aの測定値を1とした相対値を示す])に比べて有意に減少した(**、P<0.01、0.56±0.1、n=3)。一方、被験物質Bを投与された中脳黒質では、被験物質Aに対する有意な減少は認められなかった(0.8±0.3、n=3)(実施例1、図1と2)。
(6) The area ratio of the TH-positive colored part in the image was measured using the image analysis software Image J 1.440 (http://imagej.nih.gov/ij).
(7) In the substantia nigra to which test substance B was administered, the positive color development site of immunohistochemical staining was the test substance A (1.0 ± 0.1 [showing a relative value with the measured value of test substance A as 1]). It decreased significantly (**, P <0.01, 0.56 ± 0.1, n = 3). On the other hand, in the substantia nigra of the midbrain to which the test substance B was administered, no significant decrease was observed with respect to the test substance A (0.8 ± 0.3, n = 3) (Example 1, FIGS. 1 and 2).

7.考察
MFG-E8断片を含まないLPS単独の投与では、投与2週間後において投与部位である中脳黒質のTH染色陽性細胞の有意な減少が観察された。一方、MFG-E8断片とLPSの共投与を行うと、投与2週間後の組織切片による観察では、LPS単独の投与に比べてTH染色陽性細胞の有意な減少は認められなかった。
これらの結果から、MFG-E8断片が生体内においてドパミン神経細胞の保護効果を有することが明らかとなった。
7. Consideration
Administration of LPS alone without the MFG-E8 fragment was observed to significantly reduce TH staining-positive cells in the substantia nigra of the midbrain at the administration site 2 weeks after administration. On the other hand, when the MFG-E8 fragment and LPS were co-administered, no significant decrease in TH staining-positive cells was observed in the tissue sections observed 2 weeks after the administration as compared with the administration of LPS alone.
From these results, it was clarified that the MFG-E8 fragment has a protective effect on dopaminergic neurons in vivo.

Claims (17)

MFG-E8(Milk fat globule-EGF factor 8)、MFG-E8断片、ならびにMFG-E8又はMFG-E8断片のいずれかを含むポリペプチドやタンパク質、これらいずれか又は二種以上を有効成分とするドパミン神経細胞保護のための組成物。
MFG-E8 (Milk fat globule-EGF factor 8), MFG-E8 fragment, and polypeptide or protein containing either MFG-E8 or MFG-E8 fragment, dopamine containing any one or more of these as an active ingredient Composition for nerve cell protection.
前記ポリペプチドやタンパク質が、以下の(A)から(E)のいずれかで示される請求項1に記載のドパミン神経細胞保護のための組成物。
(A) 配列番号1又は2のアミノ酸配列で示されるタンパク質。
(B) 配列番号3から16で示されるアミノ酸配列のいずれか又は二種以上を含んでなるポリペプチドやタンパク質。
(C) (A)又は(B)で示されるポリペプチドやタンパク質において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含む、ポリペプチドやタンパク質。
(D) (A)から(C)で示されるポリペプチドやタンパク質において、配列番号1における下記と同等の修飾ないし官能部位を備えるポリペプチドやタンパク質。
[Disulfide bond部位]
配列番号1において、27-38番目、32-55番目、57-66番目、70-225番目、212-216番目、230-387番目の組み合わせで示されるアミノ酸。
[糖鎖修飾部位]
配列番号1において、228番目、238番目、325番目、329番目、350番目のアミノ酸。
[Phosphoserin修飾部位]
配列番号1において、42番目のアミノ酸。
(E) (A)から(D)に記載のいずれかのアミノ酸配列が二量体化されたポリペプチドやタンパク質。
The composition for protecting dopamine neurons according to claim 1, wherein the polypeptide or protein is represented by any of the following (A) to (E).
(A) The protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2.
(B) A polypeptide or protein comprising any or two or more of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 16.
(C) A polypeptide or protein containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the polypeptide or protein represented by (A) or (B).
(D) In the polypeptides and proteins shown in (A) to (C), the polypeptides and proteins having the same modification or functional site as the following in SEQ ID NO: 1.
[Disulfide bond site]
The amino acids shown in the combinations of positions 27-38, 32-55, 57-66, 70-225, 212-216, and 230-387 in SEQ ID NO: 1.
[Sugar chain modification site]
In SEQ ID NO: 1, the 228th, 238th, 325th, 329th and 350th amino acids.
[Phosphoserin modification site]
The 42nd amino acid in SEQ ID NO: 1.
(E) A polypeptide or protein in which any of the amino acid sequences described in (A) to (D) is dimerized.
前記ポリペプチドやタンパク質が、10から387残基のアミノ酸配列を含む請求項1又は2に記載のドパミン神経細胞保護のための組成物。
The composition for protecting dopamine neurons according to claim 1 or 2, wherein the polypeptide or protein contains an amino acid sequence of 10 to 387 residues.
MFG-E8、MFG-E8断片、ならびにMFG-E8又はMFG-E8断片のいずれかを含むポリペプチドやタンパク質、これらのいずれか又は二種以上が、細胞により産生される請求項1から3のいずれかに記載のドパミン神経細胞保護のための組成物。
Any of claims 1 to 3 in which a polypeptide or protein containing either MFG-E8, MFG-E8 fragment, and either MFG-E8 or MFG-E8 fragment, or any one or more of these, is produced by a cell. A composition for protecting dopamine neurons according to the drug.
前記細胞が、医薬品の産生細胞、又は再生医療等製品の細胞である請求項4に記載のドパミン神経細胞保護のための組成物。
The composition for protecting dopamine neurons according to claim 4, wherein the cells are cells producing pharmaceutical products or cells of products such as regenerative medicine.
前記細胞が、ヒト医薬品産生用細胞、又はヒト細胞である請求項5に記載のドパミン神経細胞保護のための組成物。
The composition for protecting dopamine neurons according to claim 5, wherein the cell is a human drug-producing cell or a human cell.
前記細胞が、MFG-E8、MFG-E8断片、ならびにMFG-E8又はMFG-E8断片のいずれかを含むポリペプチドやタンパク質を発現するヒト医薬品の産生細胞、又はヒト再生医療等製品の細胞である請求項4又は5に記載のドパミン神経細胞保護のための組成物。
The cells are cells producing human pharmaceutical products expressing polypeptides or proteins containing MFG-E8, MFG-E8 fragments, and either MFG-E8 or MFG-E8 fragments, or cells of products such as human regenerative medicine. The composition for protecting dopamine neurons according to claim 4 or 5.
前記細胞、またはその細胞の産生物が、ヒトを対象とした医薬品、又は再生医療等製品である請求項4から7のいずれかに記載のドパミン神経細胞保護のための組成物。
The composition for protecting dopamine neurons according to any one of claims 4 to 7, wherein the cell or a product of the cell is a drug for humans or a product such as regenerative medicine.
前記ドパミン神経細胞が、ヒトドパミン神経細胞である請求項1から8のいずれかに記載のドパミン神経細胞保護のための組成物。
The composition for protecting dopamine neurons according to any one of claims 1 to 8, wherein the dopamine neurons are human dopamine neurons.
前記ドパミン神経細胞が、生体内ドパミン神経細胞、又は治療用ドパミン神経細胞である請求項1から9のいずれかに記載のドパミン神経細胞保護のための組成物。
The composition for protecting dopamine neurons according to any one of claims 1 to 9, wherein the dopamine neurons are in vivo dopamine neurons or therapeutic dopamine neurons.
効果部位が生体内である、請求項1から10のいずれかに記載のドパミン神経細胞保護のための組成物。
The composition for protecting dopamine neurons according to any one of claims 1 to 10, wherein the site of effect is in vivo.
前記効果部位が神経組織である請求項11に記載のドパミン神経細胞保護のための組成物。
The composition for protecting dopamine neurons according to claim 11, wherein the site of effect is nerve tissue.
請求項4から12に記載のドパミン神経細胞保護のための組成物、又は組成物を産生する細胞。
The composition for protecting dopamine neurons according to claims 4 to 12, or a cell producing the composition.
請求項13に記載の細胞の製造方法であって、
(a)MFG-E8、MFG-E8断片、ならびにMFG-E8又はMFG-E8断片のいずれかを含むポリペプチドやタンパク質、これらいずれか又は二種以上を発現するベクターを設計又は作製する工程と、
(b)細胞が前記ベクターを取り込む工程と、
(c)MFG-E8、MFG-E8断片、ならびにMFG-E8又はMFG-E8断片のいずれかを含むポリペプチドやタンパク質を産生する細胞を選別し培養する工程と、
(d)細胞を保存、もしくは細胞が産生したMFG-E8、MFG-E8断片、ならびにMFG-E8又はMFG-E8断片のいずれかを含むポリペプチドやタンパク質を濃縮、抽出、または精製する工程と、
を含むドパミン神経細胞保護のための細胞、及び細胞由来の組成物の製造方法。
13. The method for producing a cell according to claim 13.
(A) A step of designing or preparing a polypeptide or protein containing MFG-E8, MFG-E8 fragment, and either MFG-E8 or MFG-E8 fragment, or a vector expressing any one or more of them.
(B) The step of the cells taking up the vector and
(C) A step of selecting and culturing cells producing a polypeptide or protein containing MFG-E8, MFG-E8 fragment, and either MFG-E8 or MFG-E8 fragment.
(D) A step of conserving cells or concentrating, extracting, or purifying a polypeptide or protein containing either MFG-E8, MFG-E8 fragments, and MFG-E8 or MFG-E8 fragments produced by cells.
A method for producing a cell for protecting dopamine neurons, and a composition derived from the cell.
前記ベクターが発現ベクターである、請求項14に記載のパーキンソン病治療のための組成物、又は組成物を産生する細胞の製造方法。
The composition for treating Parkinson's disease according to claim 14, wherein the vector is an expression vector, or a method for producing a cell producing the composition.
請求項14、15記載の組成物と同等のMFG-E8、MFG-E8断片、ならびにMFG-E8又はMFG-E8断片のいずれかを含むポリペプチドやタンパク質を内在性で発現する治療用細胞のドパミン神経細胞保護のための利用。
Dopamine for therapeutic cells that endogenously express a polypeptide or protein containing either the MFG-E8, MFG-E8 fragment, and either the MFG-E8 or MFG-E8 fragment equivalent to the compositions of claims 14 and 15. Use for nerve cell protection.
以下の(A)から(E)のいずれかで示されるドパミン神経細胞を保護する組成物。
(A) 配列番号1又は2のアミノ酸配列で示されるタンパク質。
(B) 配列番号3から16で示されるアミノ酸配列のいずれか又は二種以上を含んでなるポリペプチドやタンパク質。
(C) (A)又は(B)で示されるポリペプチドやタンパク質において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含む、ポリペプチドやタンパク質。
(D) (A)から(C)で示されるポリペプチドやタンパク質において、配列番号1における下記と同等の修飾ないし官能部位を備えるポリペプチドやタンパク質。
[Disulfide bond部位]
配列番号1において、27-38番目、32-55番目、57-66番目、70-225番目、212-216番目、230-387番目の組み合わせで示されるアミノ酸。
[糖鎖修飾部位]
配列番号1において、228番目、238番目、325番目、329番目、350番目のアミノ酸。
[Phosphoserin修飾部位]
配列番号1において、42番目のアミノ酸。
(E) (A)から(D)に記載のいずれかのアミノ酸配列が二量体化されたポリペプチドやタンパク質。


A composition that protects dopaminergic neurons represented by any of the following (A) to (E).
(A) The protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2.
(B) A polypeptide or protein comprising any or two or more of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 16.
(C) A polypeptide or protein containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the polypeptide or protein represented by (A) or (B).
(D) In the polypeptides and proteins shown in (A) to (C), the polypeptides and proteins having the same modification or functional site as the following in SEQ ID NO: 1.
[Disulfide bond site]
The amino acids shown in the combinations of positions 27-38, 32-55, 57-66, 70-225, 212-216, and 230-387 in SEQ ID NO: 1.
[Sugar chain modification site]
In SEQ ID NO: 1, the 228th, 238th, 325th, 329th and 350th amino acids.
[Phosphoserin modification site]
The 42nd amino acid in SEQ ID NO: 1.
(E) A polypeptide or protein in which any of the amino acid sequences described in (A) to (D) is dimerized.


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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003155251A (en) * 2001-11-20 2003-05-27 Japan Science & Technology Corp Promoter and inhibitor for removing apoptosis cell in the body

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003155251A (en) * 2001-11-20 2003-05-27 Japan Science & Technology Corp Promoter and inhibitor for removing apoptosis cell in the body

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FEBS LETTERS, vol. 588, JPN6022038829, 2014, pages 2952 - 2956, ISSN: 0005032480 *
JOURNAL OF NEUROSCIENCE, vol. 32, JPN6022038828, 2012, pages 2657 - 2666, ISSN: 0005032479 *
MEDIATORS OF INFLAMMATION, JPN6022053374, 2016, pages 5628486, ISSN: 0005032482 *
NEUROBIOLOGY OF DISEASE, vol. 51, JPN6022038827, 2013, pages 192 - 201, ISSN: 0005032478 *
岡山医学会雑誌, vol. 98, JPN6022053373, 1986, pages 439 - 456, ISSN: 0005032481 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022030563A1 (en) 2020-08-04 2022-02-10 凸版印刷株式会社 Laminate, card, card manufacturing method, card production method, information recording sheet for card, and card using same

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