JP2020132575A - Angiogenesis inducing agent - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、血管新生促進剤に関する。 The present invention relates to an angiogenesis promoter.
血管新生は、生体にとって生理的反応であり、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）等の種々の細胞増殖因子によって起こることが知られている。
中でも、ＶＥＧＦは強力な血管新生促進因子であり、がん細胞等からも産生され、がんに血管新生を促進することにより、がんを増悪させる因子としても知られている。
また、血管新生はがんの増殖、糖尿病性網膜症、動脈硬化等の病態進展・憎悪に関わっている一方、血管新生を促進することによる虚血性疾患の改善（創傷治癒の促進や、閉塞性末梢血管疾患や虚血性心疾患等の治療）に血管新生療法が期待されている。
Angiogenesis is a physiological response to the body and is a variety of cells such as vascular endothelial growth factor (VEGF), hepatocyte growth factor (HGF), fibroblast growth factor (FGF) and platelet-derived growth factor (PDGF). It is known to be caused by growth factors.
Among them, VEGF is a potent angiogenesis-promoting factor, is also produced by cancer cells and the like, and is also known as a factor that exacerbates cancer by promoting angiogenesis in cancer.
In addition, while angiogenesis is involved in the progression and exacerbation of pathological conditions such as cancer growth, diabetic retinopathy, and arteriosclerosis, improvement of ischemic disease by promoting angiogenesis (promotion of wound healing and obstruction) Angiogenesis therapy is expected for (treatment of peripheral vascular disease, ischemic heart disease, etc.).
既にＦＧＦが褥瘡、皮膚潰瘍治療の外用剤として広く臨床に使用され、近年、虚血組織の血流確保のため、細胞療法、遺伝子治療や、血管新生因子の局所直接投与等が試みられている。例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）については、虚血性心疾患等に対する動物実験において有効性が確認されている（非特許文献１）。
また、慢性動脈閉塞症（閉塞性動脈硬化症又はビュルガー病）を対象としたＨＧＦ遺伝子による血管新生遺伝子治療についての臨床試験も行われている。加えて、ＶＥＧＦについても虚血性疾患における遺伝子治療に用いられている（非特許文献２）。
しかしながら、血管新生因子は、強力な細胞増殖、移動、分化、血管新生を示すとともに、種々の癌遺伝子産物との相同性が指摘されているため、血管新生因子による無制限な増殖は細胞の癌化や腫瘍の悪性化を引き起こす可能性が高い。
FGF has already been widely used clinically as an external preparation for the treatment of pressure ulcers and skin ulcers, and in recent years, cell therapy, gene therapy, local direct administration of angiogenic factors, etc. have been attempted to secure blood flow in ischemic tissues. .. For example, basic fibroblast growth factor (bFGF) has been confirmed to be effective in animal experiments for ischemic heart disease and the like (Non-Patent Document 1).
In addition, clinical trials on angiogenic gene therapy using the HGF gene for chronic arterial occlusion (arteriosclerosis obliterans or Bürger's disease) are also being conducted. In addition, VEGF is also used for gene therapy in ischemic diseases (Non-Patent Document 2).
However, since angiogenesis factors show strong cell proliferation, migration, differentiation, and angiogenesis, and homology with various oncogene products has been pointed out, unlimited proliferation by angiogenesis factors causes canceration of cells. And is likely to cause malignancy of the tumor.
また、バルトネラ属細菌のバルトネラ・ヘンセレ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）及びバルトネラ・クインタナ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｑｕｉｎｔａｎａ）はヒトに感染すると、猫ひっかき病や細菌性血管腫を起こす病原細菌として知られており、血管内皮細胞の細胞増殖を促進して感染局所の血管新生を惹起することが知られている（非特許文献３）。
しかしながら、これまでに、これらバルトネラ属細菌による血管新生促進作用の原因物質は特定されていない。
In addition, Bartonella henselae and Bartonella quintana, which are bacteria of the genus Bartonella, are known as pathogenic bacteria that cause cat scratch disease and bacterial hemangiomas when infecting humans, and cells of vascular endothelial cells. It is known to promote proliferation and induce angiogenesis at the site of infection (Non-Patent Document 3).
However, so far, the causative substances of the angiogenesis-promoting action of these Bartonella bacteria have not been identified.
これまでに知られている血管新生因子とは異なる新たな血管新生因子を見出すことは、血管新生関連の基礎研究をはじめ、血管新生療法や再生医療の分野において有用であると考えられた。
本発明が解決しようとする課題は、血管新生促進作用を有する新規ペプチドを提供することである。
Finding new angiogenic factors different from the previously known angiogenic factors was considered to be useful in the fields of angiogenesis therapy and regenerative medicine, including basic research related to angiogenesis.
An object to be solved by the present invention is to provide a novel peptide having an angiogenesis-promoting action.
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、アミノ酸配列は知られていたものの、その機能が解明されていなかったタンパク質の部分配列を有するペプチドが、血管新生作用を有することを見出し、本発明を完成した。 As a result of diligent studies to solve the above problems, the present inventors have found that a peptide having a partial sequence of a protein whose amino acid sequence is known but whose function has not been elucidated has an angiogenic effect. The heading, the present invention was completed.
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）
（ｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むペプチド、又は
（ｉｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失を有するアミノ酸配列を含むペプチド、を含有する血管新生促進剤。
（２）
（１）に記載の血管新生促進剤を含む、医薬。
（３）
（１）に記載の血管新生促進剤を含む、虚血性疾患治療薬。
（４）
（ｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、血管新生促進作用を有するペプチド、又は
（ｉｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失を有するアミノ酸配列を有し、血管新生促進作用を有するペプチド。
（５）
（４）に記載のペプチドをコードする核酸。
（６）
（５）に記載の核酸を有する発現ベクター。
That is, the present invention is as follows.
(1)
(I) A peptide containing the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 6.
(Ii) A peptide containing an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 6, or (iii) represented by any of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 6. An angiogenesis-promoting agent containing a peptide containing an amino acid sequence in which one or more amino acids of the amino acid sequence are added, substituted or deleted.
(2)
A medicament containing the angiogenesis-promoting agent according to (1).
(3)
An ischemic disease therapeutic agent containing the angiogenesis-promoting agent according to (1).
(4)
(I) A peptide containing the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 6.
(Ii) A peptide having an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 6 and having an angiogenesis-promoting action, or (iii) SEQ ID NO: 1 to sequence. A peptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids of the amino acid sequence represented by any of No. 6 have additions, substitutions or deletions, and has an angiogenesis-promoting action.
(5)
A nucleic acid encoding the peptide according to (4).
(6)
An expression vector having the nucleic acid according to (5).
本発明によれば、血管新生促進作用を有する新規ペプチドを提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a novel peptide having an angiogenesis-promoting action.
以下、本発明を実施するための形態について以下詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。 Hereinafter, embodiments for carrying out the present invention will be described in detail below. The present invention is not limited to the following embodiments, and can be variously modified and implemented within the scope of the gist thereof.
本発明の血管新生促進剤は、以下のいずれかのペプチドを含有する。
（ｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むペプチド、又は
（ｉｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失を有するアミノ酸配列を含むペプチド。
本発明においては、当該ペプチドを大腸菌の発現系で作製することに成功しており、遺伝子組換え技術を用いて大量作製することが可能である。また、大腸菌系で作製したペプチドは、標的とする細胞特異性、特に癌細胞の生育・癌血管新生への影響を検討し、血管内皮細胞を培養している培地中に添加することで細胞増殖を促進させること、さらに、マトリックスゲル上で血管内皮細胞の管腔形成を促進することが確認できている。
The angiogenesis-promoting agent of the present invention contains any of the following peptides.
(I) A peptide containing the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 6.
(Ii) A peptide containing an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 6, or (iii) represented by any of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 6. A peptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids of the amino acid sequence are added, substituted or deleted.
In the present invention, the peptide has been successfully produced in an expression system of Escherichia coli, and can be produced in large quantities using a gene recombination technique. In addition, the peptide prepared in the Escherichia coli system was examined for its specificity as a target cell, especially its effect on cancer cell growth and cancer angiogenesis, and cell proliferation was performed by adding it to the medium in which vascular endothelial cells were cultured. It has been confirmed that it promotes vascular formation of vascular endothelial cells on the matrix gel.
配列番号１で示されるアミノ酸配列は、バルトネラ・ヘンセレ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）が産生するタンパク質の全長８７４残基中２５位から５３４位までの領域に相当するアミノ酸配列である。
配列番号２で示されるアミノ酸配列は、バルトネラ・ヘンセレが産生するタンパク質の全長８７４残基中２５位から５１３位までの領域に相当するアミノ酸配列である。
配列番号３で示されるアミノ酸配列は、バルトネラ・ヘンセレが産生するタンパク質の全長８７４残基中２５位から５０１位までの領域に相当するアミノ酸配列である。
配列番号４で示されるアミノ酸配列は、バルトネラ・ヘンセレが産生するタンパク質の全長８７４残基中２５位から４８５位までの領域に相当するアミノ酸配列である。
配列番号５で示されるアミノ酸配列は、バルトネラ・ヘンセレが産生するタンパク質の全長８７４残基中２５位から４３４位までの領域に相当するアミノ酸配列である。
全長８７４残基のタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号７で示される。
配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、オートトランスポーターの一つであり、配列番号７で示されるアミノ酸配列の２５位から４２３位までの領域は、オートトランスポーターのＰａｓｓｅｎｇｅｒドメインに相当する。
The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence corresponding to the region from position 25 to position 534 of the total length of 874 residues of the protein produced by Bartonella henselae.
The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is an amino acid sequence corresponding to the region from position 25 to position 513 of the total length of 874 residues of the protein produced by Bartonella Hensere.
The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is an amino acid sequence corresponding to the region from position 25 to position 501 in the total length of 874 residues of the protein produced by Bartonella Hensere.
The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is an amino acid sequence corresponding to the region from position 25 to position 485 in the total length of 874 residues of the protein produced by Bartonella Hensere.
The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 is an amino acid sequence corresponding to the region from position 25 to position 434 of the total length of 874 residues of the protein produced by Bartonella Hensere.
The amino acid sequence of the protein with a total length of 874 residues is shown by SEQ ID NO: 7.
The protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7 is one of the auto transporters, and the region from position 25 to position 423 of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7 corresponds to the Passenger domain of the auto transporter. ..
本発明において、「オートトランスポーター」とは、細菌のもつ分泌装置の一つ（Ｖ型分泌装置）であり、Ｃ末端領域（β−ｂａｒｒｅｌドメイン）が外膜を貫通し、そこに生じたチャネルを介して、自身のＮ末端領域（Ｐａｓｓｅｎｇｅｒドメイン）を菌体外に分泌させるタンパク質である。
オートトランスポーターによってＰａｓｓｅｎｇｅｒドメインのアミノ酸配列は異なり、様々な機能を有することが知られている。
In the present invention, the "autotransporter" is one of the secretion apparatus (V-type secretion apparatus) possessed by bacteria, and the C-terminal region (β-barrel domain) penetrates the outer membrane and the channel generated therein. It is a protein that secretes its own N-terminal region (Passenger domain) to the outside of the bacterium.
It is known that the amino acid sequence of the Passenger domain differs depending on the auto transporter and has various functions.
バルトネラ・ヘンセレ ＡＴＣＣ４９８８２株のゲノム配列は、ゲノム配列ＩＤ：ＮＣ＿００５９５６．１として、データベース上に公開されているため、アミノ酸配列も公知となっている。
配列番号７は、Ｇｅｎｅ ＩＤ：ＢＨ０５５１０又はＡＹＴ＿ＲＳ０２８６０，Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：ＷＰ＿０１１１８０４８１，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０Ｈ３ＬＸＸ９として公知となっているが、血管新生促進能を有することについては知られていない。実際、タンパク質データベースＵｎｉＰｒｏｔにおいても、当該タンパク質の機能については、「Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ」となっている。
本発明においては、当該タンパク質のＮ末端領域のアミノ酸配列からなるペプチドを、配列番号１〜配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するペプチドとしている。
Since the genome sequence of the Bartonella Hensere ATCC49882 strain is published on the database as the genome sequence ID: NC_005956.1, the amino acid sequence is also known.
SEQ ID NO: 7 is known as Gene ID: BH05510 or AYT_RS02860, Protein access Number: WP_011180481, UniProtKB: A0A0H3LXX9, but is not known to have angiogenesis-promoting ability. In fact, even in the protein database UniProt, the function of the protein is "Uncharactized protein".
In the present invention, the peptide consisting of the amino acid sequence of the N-terminal region of the protein is defined as the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 5.
本発明の血管新生促進剤の一態様としては、配列番号７で示されるアミノ酸配列中２５位から４３４位までの領域に相当するアミノ酸配列を有していれば、Ｃ末端のアミノ酸は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中から適宜選択してよい。
例えば、配列番号５で示されるアミノ酸配列においては、Ｃ末端のアミノ酸は、配列番号７で示されるアミノ酸配列における４３４位であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列においては、Ｃ末端のアミノ酸は、配列番号７で示されるアミノ酸配列における５３４位であるから、本発明の血管新生促進剤として、配列番号７で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端が２５位のアミノ酸であれば、Ｃ末端のアミノ酸は、４３４位から５３４位のアミノ酸から任意に選択してもよく、４２４位から６１２位のアミノ酸から任意に選択してもよい。
また、この時、以下に記載するように、配列番号７で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端が２５位のアミノ酸ではないアミノ酸をＮ末端のアミノ酸として有していてもよい。
As one aspect of the angiogenesis-promoting agent of the present invention, if the amino acid sequence corresponding to the region from the 25th position to the 434th position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 is possessed, the amino acid at the C-terminal is the amino acid SEQ ID NO: It may be appropriately selected from the amino acid sequences shown in 7.
For example, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, the C-terminal amino acid is at position 434 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the C-terminal amino acid is. Since it is at position 534 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, as the angiogenesis-promoting agent of the present invention, if the amino acid at the N-terminal is the 25-position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, the amino acid at the C-terminal is It may be arbitrarily selected from the amino acids at positions 434 to 534, or may be arbitrarily selected from the amino acids at positions 424 to 612.
Further, at this time, as described below, in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7, an amino acid whose N-terminal is not the 25-position amino acid may be included as the N-terminal amino acid.
また、本発明の血管新生促進剤の一態様として、配列番号７で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端が２５位のアミノ酸であれば、Ｃ末端のアミノ酸は、５３４位よりＣ末端よりに位置するアミノ酸から任意に選択してもよい。
すなわち、配列番号７で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末から６１３位以降のアミノ酸配列は、膜貫通ドメインと予想されるため、Ｎ末から６１２位までのアミノ酸配列から選ばれる任意のアミノ酸をＣ末端のアミノ酸として有していてもよく、本発明の血管新生促進剤として、特に有している必要はないが、配列番号７で示されるアミノ酸配列の６１３位以降のアミノ酸配列の任意のアミノ酸配列を有していてもよい。
Further, as one aspect of the angiogenesis-promoting agent of the present invention, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, if the amino acid at the N-terminal is the 25th position, the amino acid at the C-terminal is located from the 534th position to the C-terminal. It may be arbitrarily selected from amino acids.
That is, in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7, the amino acid sequence from the N-terminal to the 613th position is expected to be a transmembrane domain, so any amino acid selected from the amino acid sequence from the N-terminal to the 612th position is C-terminal. It may be possessed as an amino acid of the above, and it is not particularly necessary to have it as the angiogenesis promoter of the present invention, but any amino acid sequence of the amino acid sequence after the 613th position of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7 can be used. You may have.
本発明の血管新生促進剤の一態様としては、配列番号７で示されるアミノ酸配列における部分配列を有するペプチドであって、Ｎ末端側アミノ酸として、２５位のアミノ酸を有し、アミノ酸数を４１０以上とするペプチドであってもよい。
配列番号７で示されるアミノ酸配列における部分配列としてのアミノ酸数は、４１０以上であれば、その部分配列となるように、８７３以下であってよく、８００以下、７００以下、６００以下、５５０以下、５４０以下、５３０以下、５２０以下、５１０以下であってもよい。
One aspect of the angiogenesis-promoting agent of the present invention is a peptide having a partial sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, having an amino acid at position 25 as an N-terminal amino acid, and having an amino acid number of 410 or more. It may be a peptide.
The number of amino acids as a partial sequence in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7 may be 873 or less so as to be the partial sequence as long as it is 410 or more, 800 or less, 700 or less, 600 or less, 550 or less, It may be 540 or less, 530 or less, 520 or less, and 510 or less.
配列番号６で示されるアミノ酸配列は、バルトネラ・クインタナ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｑｕｉｎｔａｎａ）が産生するタンパク質の全長８６３残基中２５位から５２６位までの領域に相当するアミノ酸配列である。
全長８６３残基のタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号８で示される。
配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、オートトランスポーターの一つであり、配列番号５で示されるアミノ酸配列の２５位から４１５位までの領域は、オートトランスポーターのＰａｓｓｅｎｇｅｒドメインに相当すると考えられる。
The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is an amino acid sequence corresponding to the region from position 25 to position 526 of the total length of 863 residues of the protein produced by Bartonella quintana.
The amino acid sequence of the protein with a total length of 863 residues is shown in SEQ ID NO: 8.
The protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 is one of the auto transporters, and the region from the 25th position to the 415th position of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 corresponds to the Passenger domain of the auto transporter. Conceivable.
バルトネラ・クインタナ Ｔｏｕｌｏｕｓｅ株のゲノム配列は、ゲノム配列ＩＤ：ＮＣ＿００５９５５．１として、データベース上に公開されているため、アミノ酸配列も公知となっている。
配列番号８は、Ｇｅｎｅ ＩＤ：ＢＱ０４６８０又はＢＱ＿ＲＳ０２３７０，Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：ＷＰ＿０１１１７９２５４．１，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０Ｈ３ＬＴＶ４として公知となっているが、血管新生促進能を有することについては知られていない。実際、タンパク質データベースＵｎｉＰｒｏｔにおいても、当該タンパク質の機能については、「Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ」となっている。
本発明においては、当該タンパク質のＮ末端領域の５０２残基のアミノ酸配列からなるペプチドを、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するペプチドとしている。
Since the genome sequence of the Bartonella quintana Toulouse strain is published on the database as the genome sequence ID: NC_005955.1, the amino acid sequence is also known.
SEQ ID NO: 8 is known as Gene ID: BQ04680 or BQ_RS02370, Protein access Number: WP_011179254.1, UniProtKB: A0A0H3LTV4, but is not known to have angiogenesis-promoting ability. In fact, even in the protein database UniProt, the function of the protein is "Uncharactized protein".
In the present invention, the peptide consisting of the amino acid sequence of 502 residues in the N-terminal region of the protein is defined as the peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
本発明の血管新生促進剤の一態様としては、配列番号８で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端が２５位のアミノ酸であれば、Ｃ末端のアミノ酸は、４１５位から６１４位のアミノ酸から任意に選択してもよい。
また、この時、以下に記載するように、配列番号８で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端が２５位のアミノ酸ではないアミノ酸をＮ末端のアミノ酸として有していてもよい。
As one aspect of the angiogenesis-promoting agent of the present invention, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, if the amino acid at the N-terminal is the 25th amino acid, the amino acid at the C-terminal is arbitrarily selected from the amino acids at the 415th to 614th positions. You may choose.
Further, at this time, as described below, in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 8, an amino acid whose N-terminal is not the 25-position amino acid may be included as the N-terminal amino acid.
また、本発明の血管新生促進剤の一態様として、配列番号８で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端が２５位のアミノ酸であれば、Ｃ末端のアミノ酸は、５２６位よりＣ末端よりに位置するアミノ酸から任意に選択してもよい。
すなわち、配列番号８で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末から６１５位以降のアミノ酸配列は、膜貫通ドメインと予想されるため、Ｎ末から６１４位までのアミノ酸配列から選ばれる任意のアミノ酸をＣ末端のアミノ酸として有していてもよく、本発明の血管新生促進剤として、特に有している必要はないが、配列番号８で示されるアミノ酸配列の６１５位以降のアミノ酸配列の任意のアミノ酸配列を有していてもよい。
Further, as one aspect of the angiogenesis-promoting agent of the present invention, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, if the amino acid at the N-terminal is the 25-position amino acid, the C-terminal amino acid is located from the 526-position to the C-terminal. It may be arbitrarily selected from amino acids.
That is, in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 8, the amino acid sequence from the N-terminal to the 615th position is expected to be a transmembrane domain, so any amino acid selected from the amino acid sequence from the N-terminal to the 614-position is C-terminal. It may be possessed as an amino acid of the above, and it is not particularly necessary to have it as the angiogenesis promoter of the present invention, but any amino acid sequence of the amino acid sequence after the 615th position of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 can be used. You may have.
本発明の血管新生促進剤は、血管新生を促すことにより症状を改善し得る分野で用いることができる。
血管新生を促すことにより症状を改善し得る疾患としては、特に限定されるものではないが、例えば、虚血性疾患が挙げられる。
本明細書において、虚血性疾患とは、動脈が血栓や塞栓等の要因により狭窄又は閉塞された血管の下流に存在する組織において、血液供給が減少して細胞死が進行する疾患を意味する。本発明の血管新生促進剤により、そのような損傷部位において、血管新生が促されることにより、細胞死等が起きていても、かかる状況を改善し得る。
虚血性疾患を対象として、特に限定されるものではないが、例えば、本発明の血管新生促進剤を創傷治癒促進、特に毛細血管の分布が乏しく治癒に時間がかかる腱や靭帯の損傷修復の促進、特発性大腿骨頭壊死症、動脈硬化等による血管閉塞に伴う虚血症状の改善等において用いることができる。また、虚血性疾患として、閉塞性末梢血管疾患や虚血性心疾患等も挙げられる。再生医療分野で本発明の血管新生促進剤を用いる場合には、移植細胞や臓器を製造する際の血管新生の促進に利用可能である。
本発明の血管新生促進剤は、血管新生研究、再生医療研究分野において血管新生促進活性をもつ研究用試薬としても利用することができる。本発明の血管新生促進剤は、研究用試薬として、血管新生研究や癌研究分野において、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ及びＰＤＧＦ等の細胞増殖因子に加えた、新たな血管新生因子として利用可能である。
また、本発明の血管新生促進剤は、血管新生を促進してもよく、血管新生を誘導してもよい。すなわち、本発明の血管新生促進剤は、血管新生誘導剤として理解されてもよい。
The angiogenesis-promoting agent of the present invention can be used in a field where symptoms can be improved by promoting angiogenesis.
Diseases that can improve symptoms by promoting angiogenesis include, but are not limited to, ischemic diseases.
As used herein, the ischemic disease means a disease in which a blood supply is reduced and cell death progresses in a tissue existing downstream of a blood vessel in which an artery is narrowed or occluded due to a factor such as thrombus or embolism. The angiogenesis-promoting agent of the present invention promotes angiogenesis at such an injured site, so that even if cell death or the like occurs, such a situation can be improved.
For ischemic diseases, for example, the angiogenesis-promoting agent of the present invention promotes wound healing, and particularly promotes repair of damage to tendons and ligaments that take a long time to heal due to poor distribution of capillaries. , Idiopathic osteonecrosis of the femoral head, improvement of ischemic symptoms associated with vascular occlusion due to arteriosclerosis, etc. In addition, examples of ischemic diseases include obstructive peripheral vascular disease and ischemic heart disease. When the angiogenesis-promoting agent of the present invention is used in the field of regenerative medicine, it can be used to promote angiogenesis in the production of transplanted cells and organs.
The angiogenesis-promoting agent of the present invention can also be used as a research reagent having angiogenesis-promoting activity in the fields of angiogenesis research and regenerative medicine research. The angiogenesis-promoting agent of the present invention can be used as a research reagent in the fields of angiogenesis research and cancer research as a new angiogenesis factor in addition to cell growth factors such as VEGF, HGF, FGF and PDGF.
In addition, the angiogenesis-promoting agent of the present invention may promote angiogenesis or induce angiogenesis. That is, the angiogenesis promoter of the present invention may be understood as an angiogenesis inducer.
また、バルトネラ症においては、感染局所おいて菌体外に本発明の血管新生促進剤に係るペプチドが分泌され、血管内皮細胞に作用すると考えられる。感染部位又は血中から本発明の血管新生促進剤に係るペプチドを検出することができれば、バルトネラ症のバイオマーカーとして新たな診断法の開発につなげることも期待できる。
したがって、本発明における配列番号１〜配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するペプチド等を、標的とするバルトネラ症の新規診断マーカーとすることができる。
Further, in Bartonella disease, it is considered that the peptide according to the angiogenesis-promoting agent of the present invention is secreted outside the cells at the site of infection and acts on vascular endothelial cells. If the peptide according to the angiogenesis-promoting agent of the present invention can be detected from the infected site or blood, it can be expected to lead to the development of a new diagnostic method as a biomarker for Bartonella disease.
Therefore, peptides and the like having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 6 in the present invention can be used as a new diagnostic marker for target Bartonella disease.
本発明においては、以下のペプチドも提供する。
（ｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、血管新生促進作用を有するペプチド、又は
（ｉｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失を有するアミノ酸配列を有し、血管新生促進作用を有するペプチド。
本発明においては、本発明の血管新生促進剤としては、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのペプチドを利用可能である。
The following peptides are also provided in the present invention.
(I) A peptide containing the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 6.
(Ii) A peptide having an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 6 and having an angiogenesis-promoting action, or (iii) SEQ ID NO: 1 to sequence. A peptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids of the amino acid sequence represented by any of No. 6 have additions, substitutions or deletions, and has an angiogenesis-promoting action.
In the present invention, any of the peptides (i) to (iii) above can be used as the angiogenesis-promoting agent of the present invention.
本明細書においてアミノ酸配列を構成する「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、人工のアミノ酸変異体や誘導体を含む。アミノ酸は慣用的な一文字表記又は三文字表記で示される場合もある。本明細書における「アミノ酸」としては、天然タンパク質性Ｌ−アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物等が挙げられる。
非天然アミノ酸としては、例えば、主鎖の構造が天然型と異なる、α，α−二置換アミノ酸（α−メチルアラニン等）、Ｎ−アルキル−α−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、β−アミノ酸、α−ヒドロキシ酸や、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、ホモヒスチジン等）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジン等）、及び側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸等）等が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の血管新生促進剤としてのペプチドについては、天然アミノ酸からなるアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましいが、そのアミノ酸配列の一部において天然アミノ酸以外のアミノ酸が含まれていてもよい。
As used herein, the term "amino acid" constituting the amino acid sequence is used in the broadest sense, and includes artificial amino acid variants and derivatives in addition to natural amino acids. Amino acids may also be indicated in the conventional one-letter or three-letter notation. Examples of the "amino acid" in the present specification include natural proteinaceous L-amino acids, unnatural amino acids, chemically synthesized compounds having characteristics known in the art that are characteristic of amino acids, and the like.
Examples of unnatural amino acids include α, α-disubstituted amino acids (α-methylalanine, etc.), N-alkyl-α-amino acids, D-amino acids, β-amino acids, and α, which have different main chain structures from the natural type. -Hydroxyic acid, amino acids with different side chain structures (norleucine, homohistidine, etc.), amino acids with excess methylene in the side chain ("homo" amino acids, homophenylalanine, homohistidine, etc.), and in the side chain Examples include, but are not limited to, amino acids (such as cysteine acid) in which the carboxylic acid functional group of the above is replaced with a sulfonic acid group.
The peptide as the angiogenesis-promoting agent of the present invention is preferably a peptide having an amino acid sequence consisting of natural amino acids, but an amino acid other than the natural amino acid may be contained in a part of the amino acid sequence.
本明細書において「１から複数個のアミノ酸の付加、置換又は欠失を有する」という場合、付加、置換又は欠失されるアミノ酸の個数は、結果として得られるペプチドが血管新生促進作用を有する限り特に限定されないが、例えば、１個〜２０個の範囲の整数とすることができる。「１個のアミノ酸の付加、置換又は欠失を有」していてもよく、「１〜２０個のアミノ酸の付加、置換又は欠失を有」していてもよく、１〜２０個の範囲内であれば、１〜任意の整数個のアミノ酸の付加、置換又は欠失を有していてもよい。
すなわち、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、あるいは１個のアミノ酸の付加、置換又は欠失を有していてもよい。
アミノ酸の付加、置換又は欠失の位置は、血管新生促進剤としての機能が保持される限り、アミノ酸が欠失、置換又は付加されるアミノ酸配列中のどこの位置であってもよい。
In the present specification, when "having one to a plurality of amino acid additions, substitutions or deletions", the number of amino acids added, substituted or deleted is as long as the resulting peptide has an angiogenesis-promoting effect. Although not particularly limited, for example, it may be an integer in the range of 1 to 20. It may be "with the addition, substitution or deletion of one amino acid", or "with the addition, substitution or deletion of 1 to 20 amino acids", in the range of 1 to 20. Within, it may have additions, substitutions or deletions of 1 to any integer number of amino acids.
That is, 1 to 20, 1 to 19, 1 to 18, 1 to 17, 1 to 16, 1 to 15, 1 to 14, 1 to 13, 1 to 12, 1 to 11 1 to 10 pieces, 1 to 9 pieces, 1 to 8 pieces, 1 to 7 pieces, 1 to 6 pieces, 1 to 5 pieces, 1 to 4 pieces, 1 to 3 pieces, 1 to 2 pieces, or 1 piece May have additions, substitutions or deletions of amino acids.
The position of the addition, substitution or deletion of the amino acid may be any position in the amino acid sequence in which the amino acid is deleted, substituted or added as long as the function as an angiogenesis promoter is maintained.
本明細書において、「８０％以上の相同性を有する」とは、変異前のアミノ酸配列と当該アミノ酸配列から変異した配列を有するペプチドのアミノ酸配列一致が最大になるようにアライメントしたときに、共通するアミノ酸残基の数が、変異前のアミノ酸配列のアミノ酸数の８０％以上であることを意味する。
相同性は８０％以上であって、血管新生促進剤としての機能を保持する限り特に限定されないが、例えば８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上とすることができる。
本明細書において、配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列と「８０％以上の同一性を有する」とは、配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列と変異した配列を有するペプチドのアミノ酸配列を比較して、一致が最大になるようにアライメントしたときに、共通するアミノ酸残基の数が、配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列のアミノ酸数の８０％以上であることを意味する。
In the present specification, "having 80% or more homology" is common when the amino acid sequence before the mutation and the peptide having the sequence mutated from the amino acid sequence are aligned so as to maximize the amino acid sequence match. It means that the number of amino acid residues to be used is 80% or more of the number of amino acids in the amino acid sequence before the mutation.
The homology is 80% or more, and is not particularly limited as long as the function as an angiogenesis promoter is maintained, but may be, for example, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, 99% or more. it can.
In the present specification, the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 6 and "having 80% or more identity" are the amino acid sequences represented by any of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 6. When the amino acid sequences of the peptides having the mutated sequence are compared and aligned to maximize the match, the number of common amino acid residues is the amino acid sequence shown by any of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6. It means that it is 80% or more of the number of amino acids in.
本明細書において配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列の「１から複数個のアミノ酸の付加、置換又は欠失を有する」あるいは配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列と「８０％以上の同一性を有する」とは、そのペプチドの構造において、配列番号７又は８で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端側アミノ酸が２５位のアミノ酸であってもよいが、２５位のアミノ酸よりＮ末端側のアミノ酸をＮ末端アミノ酸として有してもよく、また、２５位のアミノ酸よりＣ末端側のアミノ酸をＮ末端アミノ酸として有してよい。
なお、配列番号７又は８で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末から１〜２４位のアミノ酸配列は、シグナル配列といえるので、本発明の血管新生促進剤としてのペプチドとして、配列番号７又は８で示されるアミノ酸配列の１〜２４位のアミノ酸配列の任意のアミノ酸配列を有していてもよい。
また、本発明の血管新生促進剤としてのペプチドは、そのペプチドの構造において、配列番号７又は８で示されるアミノ酸配列の部分構造となるアミノ酸配列をそのまま有していてもよく、その部分構造となるアミノ酸配列の一部アミノ酸が付加、置換又は欠失されていてもよく、その部分構造となるアミノ酸配列と相同性が８０％以上となるようなアミノ酸配列として有していてもよい。
In the present specification, the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 6 "has addition, substitution or deletion of one to a plurality of amino acids" or is indicated by either SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6. The term "having 80% or more identity" with the amino acid sequence obtained may mean that the amino acid on the N-terminal side is the 25-position amino acid in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 8 in the structure of the peptide. , The amino acid on the N-terminal side of the 25-position amino acid may be held as the N-terminal amino acid, or the amino acid on the C-terminal side of the 25-position amino acid may be held as the N-terminal amino acid.
In the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7 or 8, the amino acid sequence at positions 1 to 24 from the N-terminal can be said to be a signal sequence. Therefore, as the peptide as the angiogenesis-promoting agent of the present invention, SEQ ID NO: 7 or 8 can be used. It may have an arbitrary amino acid sequence of the amino acid sequence at positions 1 to 24 of the indicated amino acid sequence.
Further, the peptide as the angiogenesis-promoting agent of the present invention may have an amino acid sequence which is a partial structure of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 8 in the structure of the peptide, and may have the partial structure as it is. A part of the amino acid of the amino acid sequence may be added, substituted or deleted, and the amino acid sequence may have an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence constituting the partial structure.
本発明の血管新生促進剤となるペプチドについては、従来公知の方法により製造することができる。 The peptide serving as the angiogenesis-promoting agent of the present invention can be produced by a conventionally known method.
本発明は、本発明のペプチドをコードする核酸をも提供する。
当該核酸としては、特に限定されるものではないが、例えば、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ及びウイルスベクター等の任意の適切なベクター中に含まれうるＤＮＡ又はＲＮＡ分子として提供され得る。
本発明の核酸は、本発明のペプチドをコードしている核酸であれば特に限定されるものではないが、ベクター中に取り込まれた形態であり得る。
ベクター中においては、転写や翻訳に必要な因子と共に取り込まれて、それら因子と連続して、あるいは、不連続に存在する。
本明細書において、「ベクター」は、クローニングベクターや、発現ベクターを包含する意味で用いられ、ホスト、好適には、細胞を形質転換し、導入された配列の発現（例えば転写及び翻訳）を促進するように、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）をホスト細胞に導入することができるビヒクルを意味する。
本発明の核酸としては、本発明のペプチドのアミノ酸配列の各アミノ酸をコードするコドンが連続する核酸であることが好ましいが、本発明のペプチドをコードする核酸と相補的な塩基配列を有する核酸であってもよい。
本発明のペプチドをコードする核酸と相補的な塩基配列を有する核酸も、従来公知の方法により、本発明のペプチドをコードする核酸とすることができるので、かかる相補的な塩基配列を有する核酸も本発明に包含される。
The present invention also provides nucleic acids encoding the peptides of the invention.
The nucleic acid is not particularly limited, but may be provided as a DNA or RNA molecule that can be contained in any suitable vector such as a plasmid, cosmid, episome, artificial chromosome, phage and viral vector.
The nucleic acid of the present invention is not particularly limited as long as it is a nucleic acid encoding the peptide of the present invention, but may be in a form incorporated into a vector.
In the vector, it is incorporated together with the factors necessary for transcription and translation, and exists continuously or discontinuously with those factors.
As used herein, the term "vector" is used to include a cloning vector or an expression vector, transforming a host, preferably a cell, and promoting the expression (eg, transcription and translation) of the introduced sequence. As such, it means a vehicle capable of introducing a DNA or RNA sequence (eg, a foreign gene) into a host cell.
The nucleic acid of the present invention is preferably a nucleic acid in which codons encoding each amino acid of the amino acid sequence of the peptide of the present invention are continuous, but a nucleic acid having a base sequence complementary to the nucleic acid encoding the peptide of the present invention. There may be.
Since a nucleic acid having a base sequence complementary to the nucleic acid encoding the peptide of the present invention can be made into a nucleic acid encoding the peptide of the present invention by a conventionally known method, a nucleic acid having such a complementary base sequence can also be used. Included in the present invention.
本発明は、本発明の核酸を含むベクターをも提供する。
当該ベクターには、転写や翻訳に必要な因子が含まれていてよい。
核酸を含むベクターがホストにおいて、ペプチドの発現を引き起こすために、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の転写や翻訳の調節因子を含んでいてもよい。
プラスミドや、ベクターとしては、特に限定されるものではなく、公知のプラスミドやベクターを用いることが可能である。
The present invention also provides a vector containing the nucleic acid of the present invention.
The vector may contain factors necessary for transcription or translation.
A vector containing a nucleic acid may contain transcriptional or translational regulators such as promoters, enhancers, terminators, etc. in order to induce expression of the peptide in the host.
The plasmid or vector is not particularly limited, and a known plasmid or vector can be used.
本発明において、本発明の核酸及び／又はベクターによってトランスフェクションされた形質転換体を含む。形質転換体としては、本発明のペプチドを発現させるホスト、好ましくは細胞である。
本明細書において、「形質転換」は、ホスト、好ましくは細胞が導入後の遺伝子又は配列を発現して、所望のペプチドを産生するように、核酸やベクターをホストに導入することを意味する。
導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを、好ましくはベクターの形態で含むホスト、好ましくは細胞は、「形質転換」された形質転換体である。
In the present invention, the transformants transfected with the nucleic acids and / or vectors of the present invention are included. The transformant is a host expressing the peptide of the present invention, preferably a cell.
As used herein, "transformation" means introducing a nucleic acid or vector into a host such that the host, preferably the cell, expresses the gene or sequence after introduction and produces the desired peptide.
A host, preferably a cell, comprising the introduced DNA or RNA, preferably in the form of a vector, is a "transformed" transformant.
本発明のペプチドは、本発明の核酸、ベクターや形質転換体を用いて製造することが可能であり、大腸菌を初めとした細菌、動物細胞、昆虫細胞等を用いたタンパク質発現系によりペプチドを調製することが可能である。
本発明のペプチドは、従来公知の方法により化学合成することも可能である。
The peptide of the present invention can be produced by using the nucleic acid, vector or transformant of the present invention, and the peptide is prepared by a protein expression system using bacteria such as Escherichia coli, animal cells, insect cells and the like. It is possible to do.
The peptide of the present invention can also be chemically synthesized by a conventionally known method.
ペプチドの精製方法も特に限定されるものではなく、一般には、カラムクロマトグラフィーにより精製される。 The method for purifying the peptide is not particularly limited, and the peptide is generally purified by column chromatography.
本発明においては、
（ｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、血管新生促進作用を有するペプチド、又は
（ｉｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失を有するアミノ酸配列を有し、血管新生促進作用を有するペプチドの用途は、特に限定されるものではないが、医薬用途が挙げられる。
本発明の医薬は、本発明のペプチドを含有し、本発明のペプチドが血管新生促進作用を有することにより、当該作用に基づいて医薬として利用可能となる。
当該医薬としては、虚血性疾患治療薬として用いることも可能である。
In the present invention
(I) A peptide containing the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 6.
(Ii) A peptide having an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 6 and having an angiogenesis-promoting action, or (iii) SEQ ID NO: 1 to sequence. The use of the peptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids of the amino acid sequence represented by any of No. 6 has additions, substitutions or deletions and has an angiogenesis promoting action is not particularly limited. However, there are pharmaceutical uses.
The drug of the present invention contains the peptide of the present invention, and the peptide of the present invention has an angiogenesis-promoting action, so that the drug can be used as a medicine based on the action.
As the drug, it can also be used as a therapeutic agent for ischemic diseases.
本発明における医薬は、医薬製剤の製造法として一般的に用いられている公知の方法（例えば、日本薬局方に記載の方法）に従って、製造することができる。
医薬製剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、錠剤（例えば、糖衣錠、フィルムコーティング錠、舌下錠、口腔内崩壊錠を含む）、散剤、顆粒剤（例えば、細粒を含む）、カプセル剤（例えば、ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、液剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤を含む）、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤を含む）坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤を含む）、ペレット、吸入剤（例えば、経鼻剤、経肺剤を含む）、及び点滴剤等が挙げられる。
固形製剤となる、錠剤、散剤、顆粒剤等は、従来公知の技術を用いて徐放性製剤や速崩性製剤としてもよい。
これら医薬製剤は、経口的又は非経口的（例、局所、直腸、静脈投与等）に投与することができる。
The drug according to the present invention can be produced according to a known method generally used as a method for producing a pharmaceutical preparation (for example, the method described in the Japanese Pharmacopoeia).
The pharmaceutical preparation is not particularly limited, and for example, tablets (including, for example, sugar-coated tablets, film-coated tablets, sublingual tablets, orally disintegrating tablets), powders, granules (including, for example, fine granules). , Capsules (including, for example, soft capsules, microcapsules), liquids, troches, syrups, emulsions, suspensions, injections (eg, subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections) Includes agents), external preparations (including, for example, nasal preparations, transdermal preparations, ointments) suppositories (including, for example, rectal suppositories, vaginal suppositories), pellets, inhalants (eg, nasal preparations) , Including transpulmonary agents), and drip agents and the like.
Tablets, powders, granules, etc., which are solid preparations, may be sustained-release preparations or quick-disintegrating preparations by using conventionally known techniques.
These pharmaceutical preparations can be administered orally or parenterally (eg, topical, rectal, intravenous administration, etc.).
医薬製剤とするにあたって用いられる薬理学的に許容される添加剤としては、本技術分野においてはん用される成分を用いることが可能である。
当該添加剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等が挙げられる。
必要に応じて、当該添加剤として、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等を適宜、適量用いてもよい。
As a pharmacologically acceptable additive used in making a pharmaceutical preparation, it is possible to use an ingredient used in the art.
The additives are not particularly limited, but are, for example, excipients, lubricants, binders, disintegrants, solvents, solubilizers, suspending agents, isotonic agents, buffers and the like. Examples include painkillers.
If necessary, an appropriate amount of preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners, adsorbents, wetting agents and the like may be used as the additives.
本発明のペプチドの投与量及び投与方法は、特に限定されるものではなく、投与対象、症状等に応じて適宜選択してよい。
本発明のペプチドの投与量は、特に限定されるものではなく、例えば、一日につき約０.０１〜１０００ｍｇであり、当該範囲内で、約０．１ｍｇ以上、約１ｍｇ以上、約２ｍｇ以上、約５ｍｇ以上、約１０ｍｇ以上としてもよく、約５００ｍｇ以下、約２００ｍｇ以下、約１００ｍｇ以下、約５０ｍｇ以下、約２０ｍｇ以下、約１０ｍｇ以上としてもよい。
当該投与量のペプチドを一日の投与回数に応じて、分割して投与してもよい。
投与回数は、一日あたり１回であってもよく、２回であってもよく、３回であってもよく、投与時間も、食後、食前、食間、空腹時、就寝前等適宜設定してよい。
投与間隔も、特に限定されるものではなく、例えば、毎日、１日おき、２日おき、１週間おき、隔週と適宜設定して投与してよい。
The dose and method of administration of the peptide of the present invention are not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the administration target, symptoms and the like.
The dose of the peptide of the present invention is not particularly limited, and is, for example, about 0.01 to 1000 mg per day, and within the range, about 0.1 mg or more, about 1 mg or more, about 2 mg or more, It may be about 5 mg or more and about 10 mg or more, and may be about 500 mg or less, about 200 mg or less, about 100 mg or less, about 50 mg or less, about 20 mg or less, and about 10 mg or more.
The peptide of the said dose may be divided and administered according to the number of administrations per day.
The number of administrations may be once, twice, or three times a day, and the administration time may be appropriately set after meals, before meals, between meals, on an empty stomach, before bedtime, and the like. You can.
The administration interval is also not particularly limited, and may be appropriately set to, for example, every other day, every two days, every other week, or every other week.
投与対象となる対象は特に限定されるものではなく、例えば、患者が挙げられる。投与対象としての患者も特に限定されるものではなく、小児であっても、大人であってもよく、その場合の投与量は適宜設定される。
本発明の血管新生促進剤は、それを必要とする対象、例えば、患者に、薬理学的に、薬学的に、あるいは製薬学的に有効量投与することにより、医薬として用い得る。好適には、有効量の本発明のペプチドを対象に投与することにより、血管新生を促すことにより症状を改善し得る疾患の治療又は予防に用いてもよく、その場合、血管新生を促すことにより症状を改善し得る疾患の治療方法又は予防方法が提供される。
The subject to be administered is not particularly limited, and examples thereof include patients. The patient to be administered is not particularly limited, and may be a child or an adult, and the dose in that case is appropriately set.
The angiogenesis-promoting agent of the present invention can be used as a medicine by administering an effective amount pharmacologically, pharmaceutically or pharmaceutically effective to a subject in need thereof, for example, a patient. Preferably, by administering an effective amount of the peptide of the present invention to a subject, it may be used for the treatment or prevention of a disease that can improve the symptoms by promoting angiogenesis, in which case, by promoting angiogenesis. A method of treating or preventing a disease that can improve the symptoms is provided.
本発明においては、本発明の血管新生促進剤による作用を高める目的として、本発明の血管新生促進剤の用量を減じることを目的として、また、所望の薬効を高める目的として、他の薬剤と併用してもよい。
他の薬剤との併用においては、合剤であってもよく、併用剤として、両者を単剤として投与してもよい。単剤同士を併用して患者に投与する場合には、同時に投与してもよく、別時に投与してもよい。
In the present invention, in combination with other agents for the purpose of enhancing the action of the angiogenesis-promoting agent of the present invention, for the purpose of reducing the dose of the angiogenesis-promoting agent of the present invention, and for the purpose of enhancing the desired efficacy. You may.
In combination with other drugs, it may be a combination drug, or both may be administered as a single agent as a combination drug. When the single agents are administered in combination to a patient, they may be administered at the same time or at different times.
配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする核酸及び配列番号６のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする核酸のクローニング
配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド（ぺプチド１）をコードする核酸は、Bartonella henselae ATCC49882株のゲノムDNAを鋳型にPCRで増幅した。
プライマー配列は以下のとおりである。
Forward: AGTGAGAATAAGAATAGGGCG（配列番号９）
Reverse: TGACTGCTGTTGTTCATCAG（配列番号１０）
配列番号６のアミノ酸配列を有するペプチド（ぺプチド６）をコードする核酸はBartonella quintana Toulouse株のゲノムDNAを鋳型にPCRで増幅した。
プライマー配列は以下のとおりである。
Forward: GGTAAAAGCCGTAATGCAGG（配列番号１５）
Reverse: CGGTTTCTGCTGTTCATCAC（配列番号１６）
Cloning the nucleic acid encoding the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the nucleic acid encoding the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 The nucleic acid encoding the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (peptide 1) is Bartonella. The genomic DNA of the henselae ATCC 49882 strain was used as a template and amplified by PCR.
The primer sequence is as follows.
Forward: AGTGAGAATAAGAATAGGGCG (SEQ ID NO: 9)
Reverse: TGACTGCTGTTGTTCATCAG (SEQ ID NO: 10)
The nucleic acid encoding the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (peptide 6) was amplified by PCR using the genomic DNA of the Bartonella quintana Toulouse strain as a template.
The primer sequence is as follows.
Forward: GGTAAAAGCCGTAATGCAGG (SEQ ID NO: 15)
Reverse: CGGTTTCTGCTGTTCATCAC (SEQ ID NO: 16)
なお、配列番号２〜５のアミノ酸配列を有するペプチド（それぞれ、ペプチド２〜５という）をコードする核酸のクローニングには以下のプライマー配列を用いた。Forward配列は共通である。
（配列番号２）
Reverse: TTTTTCTAAAAATGGAATCGTC（配列番号１１）
（配列番号３）
Reverse: ATGCTGTGCATCTCTCAAATG（配列番号１２）
（配列番号４）
Reverse: TTCATTATTTTTTCTACGGGTAGTCTG（配列番号１３）
（配列番号５）
Reverse: ATTATTCGAACGATCTGCC（配列番号１４）
また、配列番号７における２５位〜２７４位のアミノ酸配列を有するぺプチド（ペプチド７）をコードする核酸のクローニングには以下のプライマー配列を用い、
Forward: AGTGAGAATAAGAATAGGGCG（配列番号９）
Reverse: TCGCTCACCAACTCCG（配列番号１７）
配列番号７における１３４位〜５３４位のアミノ酸配列を有するぺプチド（ペプチド８）をコードする核酸のクローニングには以下のプライマー配列を用いた。
Forward: AATGGAGTAGTGGGGCAG（配列番号１８）
Reverse: TGACTGCTGTTGTTCATCAG（配列番号１０）
The following primer sequences were used for cloning the nucleic acids encoding the peptides having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 5 (referred to as peptides 2 to 5, respectively). The Forward array is common.
(SEQ ID NO: 2)
Reverse: TTTTTCTAAAAATGGAATCGTC (SEQ ID NO: 11)
(SEQ ID NO: 3)
Reverse: ATGCTGTGCATCTCTCAAATG (SEQ ID NO: 12)
(SEQ ID NO: 4)
Reverse: TTCATTATTTTTTCTACGGGTAGTCTG (SEQ ID NO: 13)
(SEQ ID NO: 5)
Reverse: ATTATTCGAACGATCTGCC (SEQ ID NO: 14)
In addition, the following primer sequence was used for cloning the nucleic acid encoding the peptide (peptide 7) having the amino acid sequence at positions 25 to 274 in SEQ ID NO: 7.
Forward: AGTGAGAATAAGAATAGGGCG (SEQ ID NO: 9)
Reverse: TCGCTCACCAACTCCG (SEQ ID NO: 17)
The following primer sequences were used for cloning the nucleic acid encoding the peptide (peptide 8) having the amino acid sequence at positions 134 to 534 in SEQ ID NO: 7.
Forward: AATGGAGTAGTGGGGCAG (SEQ ID NO: 18)
Reverse: TGACTGCTGTTGTTCATCAG (SEQ ID NO: 10)
配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドあるいは配列番号６のアミノ酸配列を有するペプチドの調製
得られたPCR産物は、pASK-IBA17plus（IBA GmbH）に組み込み、大腸菌BL21株で発現させた。
大腸菌BL21株内で無水テトラサイクリンによる発現誘導を3時間行い、遠心分離することにより菌体を回収し、超音波処理により菌体を破砕した。続いて、Strep-tag融合タンパク質として発現させたタンパク質を、Strep-Tactinレジン (IBA-GmbH)を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
Preparation of peptide having amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or peptide having amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 The obtained PCR product was incorporated into pASK-IBA17plus (IBA GmbH) and expressed in Escherichia coli BL21 strain.
Expression was induced in Escherichia coli BL21 strain with anhydrous tetracycline for 3 hours, and the cells were recovered by centrifugation and crushed by ultrasonic treatment. Subsequently, the protein expressed as a Strep-tag fusion protein was purified by affinity chromatography using a Strep-Tactin resin (IBA-GmbH).
細胞増殖促進活性の測定
ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC、PromoCell）を96ウェルプレートに播種後、種々の増殖因子（ペプチド１又はペプチド２ 1 μg/mL、VEGF（富士フイルム和光純薬：223-01311） 20 ng/mL、bFGF（Sigma-Aldrich：SRP3043） 20 ng/mL）を添加し、3日間培養した。培養後の細胞をHoechst 33342及びCellMask Deep Redで蛍光染色し、イメージングアナライザーOpera Phenix（PerkinElmer）を用いて細胞数を測定した。
結果を図６に示す。アミノ酸鎖長の異なる種々のペプチドを用いて細胞増殖促進活性の測定結果を図７に示す。
Measurement of cell growth promoting activity After seeding human umbilical vein endothelial cells (HUVEC, PromoCell) in a 96-well plate, various growth factors (peptide 1 or peptide 2 1 μg / mL, VEGF (Fujifilm Wako Pure Drug: 223-01311) ) 20 ng / mL and bFGF (Sigma-Aldrich: SRP3043) 20 ng / mL) were added and cultured for 3 days. The cultured cells were fluorescently stained with Hoechst 33342 and CellMask Deep Red, and the number of cells was measured using an imaging analyzer Opera Phenix (PerkinElmer).
The results are shown in FIG. FIG. 7 shows the measurement results of the cell growth promoting activity using various peptides having different amino acid chain lengths.
安定性の測定
ペプチド１をそれぞれ、未処理、凍結融解処理（3回）、37℃ 3時間処理、95℃ 10分間処理した。
HUVECを一晩培養した後、培地をM199/10% FCSに交換し、各種処理したペプチド１を添加し、4日間培養した。
細胞数を定量した結果を図８に示す。
Stability measurement Peptide 1 was treated untreated, freeze-thawed (3 times), treated at 37 ° C for 3 hours, and treated at 95 ° C for 10 minutes, respectively.
After culturing HUVEC overnight, the medium was replaced with M199 / 10% FCS, various treated peptides 1 were added, and the cells were cultured for 4 days.
The result of quantifying the number of cells is shown in FIG.
種々の培養細胞に対する細胞増殖促進作用
VEGF 20 ng/mL、bFGF 20 ng/mL、ペプチド１又はペプチド６ 1 μg/mLを各細胞を培養している培地に添加し、3日培養後の細胞数を計測した。
未処理（Control）の細胞数を100%として結果を図９に示す。
Cell growth promoting action on various cultured cells
VEGF 20 ng / mL, bFGF 20 ng / mL, peptide 1 or peptide 6 1 μg / mL was added to the medium in which each cell was cultured, and the number of cells after culturing for 3 days was counted.
The results are shown in FIG. 9, assuming that the number of untreated (Control) cells is 100%.
HUVECの管腔形成試験
bFGF 20 ng/mL, VEGF 20 ng/mL, ペプチド１及びペプチド２ 200 μg/mLのいずれかを含む1%ウシ胎児血清含有Medium 199培地（Thermo Fisher社）でHUVECを懸濁後、ゼラチンコートディッシュ（コーニング社）に播種して24時間培養後、HUVECを回収した。Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix（Thermo Fisher社）を各ウェルに50 μLずつ加えてゲル化させた96ウェルプレートを準備しておき、そこに回収したHUVECを2.0×104 個/ウェルになるように播種して、上記と同じ培地中で12時間培養して管腔を形成させた。形成された管腔はCalcein AM（Cell Biolab社）で蛍光染色後、Opera Phenixで画像を撮影し、画像処理ソフトHarmony（Perkin Elmer社）を用いて1視野あたりの管腔の全長を計測した。
結果を図１０に示す。
HUVEC lumen formation test
After suspending HUVEC in Medium 199 medium (Thermo Fisher) containing 1% fetal bovine serum containing either bFGF 20 ng / mL, VEGF 20 ng / mL, peptide 1 or peptide 2 200 μg / mL, gelatin coated dish After seeding in (Corning) and culturing for 24 hours, HUVEC was recovered. Prepare a 96-well plate gelled by adding 50 μL of Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix (Thermo Fisher) to each well, and collect 2.0 × 10 4 HUVECs / well. The seeds were sown so as to form a lumen and cultured in the same medium as above for 12 hours. The formed lumen was fluorescently stained with Calcein AM (Cell Biolab), an image was taken with Opera Phenix, and the total length of the lumen per visual field was measured using image processing software Harmony (Perkin Elmer).
The results are shown in FIG.
本発明の血管新生促進剤は、新規な血管新生因子として、血管新生関連の基礎研究をはじめ、血管新生療法や再生医療の分野等で利用でき、産業上の利用可能性を有する。 The angiogenesis-promoting agent of the present invention can be used as a novel angiogenesis factor in the fields of angiogenesis-related basic research, angiogenesis therapy, regenerative medicine, etc., and has industrial applicability.
Claims (6)
（ｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むペプチド、又は
（ｉｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失を有するアミノ酸配列を含むペプチド、を含有する血管新生促進剤。 (I) A peptide containing the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 6.
(Ii) A peptide containing an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 6, or (iii) represented by any of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 6. An angiogenesis-promoting agent containing a peptide containing an amino acid sequence in which one or more amino acids of the amino acid sequence are added, substituted or deleted.
（ｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、血管新生促進作用を有するペプチド、又は
（ｉｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失を有するアミノ酸配列を有し、血管新生促進作用を有するペプチド。 (I) A peptide containing the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 6.
(Ii) A peptide having an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to SEQ ID NO: 6 and having an angiogenesis-promoting action, or (iii) SEQ ID NO: 1 to sequence. A peptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids of the amino acid sequence represented by any of No. 6 have additions, substitutions or deletions, and has an angiogenesis-promoting action.
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