JP2020124155A - Methods of protein biosynthesis and methods for modifying immature stop codons - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾してリードスルーさせタンパク質を生合成させる方法、および未成熟終止コドンの修飾方法に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for modifying a nucleobase constituting an immature stop codon formed by nonsense mutation for read-through to biosynthesize a protein, and a method for modifying an immature stop codon.
ナンセンス突然変異は、アミノ酸のコドンを終止コドンに変える変異である。変異によって生じた終止コドンは未成熟終止コドンと称され、未成熟終止コドン以降のタンパク質が翻訳されない。このような変異を起因とする疾患は、ナンセンス変異型遺伝子疾患と称され、例えば嚢胞性線維症（ＣＦ）、デュシェンヌ（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ）型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）などで、ナンセンス突然変異が知られている。 Nonsense mutations are mutations that change the codon of an amino acid into a stop codon. The stop codon generated by mutation is called an immature stop codon, and the protein after the immature stop codon is not translated. Diseases caused by such mutations are called nonsense mutation gene diseases, and nonsense mutations are known, for example, cystic fibrosis (CF), Duchenne muscular dystrophy (DMD), and the like.
未成熟終止コドンによって本来のタンパク質の生成が困難となった患者に特定の化合物を投与すると、未成熟終止コドンを読み飛ばして翻訳を継続する現象が観察され、この現象をリードスルーと称し、リードスルー可能な化合物をリードスルー化合物と称する。リードスルー化合物は、野生型正常タンパク質と同様なタンパク質を合成してナンセンス変異型遺伝子疾患を改善し、または疾患を治療することができると期待されている。このようなリードスルー活性を有する化合物として、アミノグリコシド系化合物が知られている（特許文献１）。 When a specific compound is administered to a patient who has difficulty in producing the original protein due to an immature stop codon, a phenomenon in which the immature stop codon is skipped and translation continues is observed, and this phenomenon is called read-through. A compound capable of passing through is referred to as a read-through compound. Readthrough compounds are expected to be able to synthesize proteins similar to wild-type normal proteins to ameliorate or treat nonsense mutant genetic diseases. An aminoglycoside compound is known as a compound having such a read-through activity (Patent Document 1).
しかしながら、アミノグリコシド系化合物は、難聴を併発させ、または腎障害のある患者で症状が悪化するなどの副作用が生じる恐れがある。また、標的となる未成熟終止コドンのみならず本来の終止コドンをもリードスルーして正常なタンパク質に余分なＣ末端ペプチドを付加する場合もある。 However, aminoglycoside compounds may cause side effects such as deafness or worsening of symptoms in patients with renal impairment. In addition, an extra C-terminal peptide may be added to a normal protein by reading through not only the target immature stop codon but also the original stop codon.
一方、未成熟終止コドンを構成するウリジンをシュードウリジン（Ψ）に置換するとリードスルーし得るという報告もある（非特許文献１）。しかしながら、哺乳動物細胞内で未成熟終止コドンを構成するウリジンをΨ化する方法は知られていない。 On the other hand, there is also a report that when uridine constituting the immature stop codon is replaced with pseudouridine (Ψ), readthrough can be performed (Non-patent Document 1). However, there is no known method for converting uridine, which constitutes an immature stop codon, into ψ in mammalian cells.
一方、ＲＮＡレベルでグアノシンからアデノシンへの突然変異を修正するために、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ１）のデアミナーゼドメインを使用する方法がある（非特許文献２）。修正目的の標的アデノシンを含むＲＮＡをＴａｒｇｅｔＲＮＡとした場合、図２に示すように、ＴａｒｇｅｔＲＮＡの相補鎖でＧｕｉｄｅＲＮＡを構成し、このＧｕｉｄｅＲＮＡにＭＳ２ＲＮＡ、ＭＳ２タンパク質およびＡＤＡＲ１を順次結合させた人工酵素複合体を調製して使用するものである。ＧｕｉｄｅＲＮＡによってＴａｒｇｅｔＲＮＡの近傍にＡＤＡＲ１が誘導される。ＧｕｉｄｅＲＮＡとして、標的アデノシンに対応する核酸塩基がシチジンであるものを使用すると、標的アデノシンはＧｕｉｄｅＲＮＡのシチジンとミスマッチであるためＴａｒｇｅｔＲＮＡから弾き出され、ＡＤＡＲ１による脱アミノ化が容易となる。脱アミノ化によりアデノシンがイノシンに変換されると、翻訳中にグアノシンとして読み取られるという。しかしながら、非特許文献２には、アデノシンデアミナーゼ以外の記載は存在しない。 On the other hand, there is a method of using the deaminase domain of adenosine deaminase (ADAR1) that acts on RNA to correct the mutation of guanosine to adenosine at the RNA level (Non-Patent Document 2). When the RNA containing the target adenosine to be modified is Target RNA, as shown in FIG. 2, a Guide RNA is constituted by a complementary strand of Target RNA, and an artificial enzyme complex in which MS 2 RNA, MS 2 protein and ADAR1 are sequentially bound to this Guide RNA is prepared. It is prepared and used. Guide RNA induces ADAR1 in the vicinity of Target RNA. When a GuideRNA whose nucleobase corresponding to the target adenosine is cytidine is used as the GuideRNA, the target adenosine is mismatched with the cytidine of the GuideRNA and is repelled from the TargetRNA to facilitate deamination by ADAR1. When adenosine is converted to inosine by deamination, it is read as guanosine during translation. However, Non-Patent Document 2 has no description other than adenosine deaminase.
上記現状に鑑みて、本発明は、ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡの未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾する方法を提供するものである。 In view of the above situation, the present invention provides a method for modifying a nucleobase that constitutes an immature stop codon of mRNA containing an immature stop codon formed by nonsense mutation.
また本発明は、ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡの未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾してリードスルーさせ、前記ｍＲＮＡの全長を翻訳することを特徴とする、タンパク質を生合成させる方法を提供するものである。 Further, the present invention is characterized in that the nucleobase constituting the immature stop codon of the mRNA containing the immature stop codon formed by nonsense mutation is modified and read through, and the full length of the mRNA is translated. A method for biosynthesizing a protein is provided.
本発明者は、未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾したところ、メチル化やハロゲン化によって未成熟終止コドンを構成する核酸塩基に官能基を導入すると未成熟終止コドンがリードスルーされることを見出し、本発明を完成させた。未成熟終止コドンのウラシルがメチルウラシルやフルオロウラシルに修飾されることで未成熟終止コドンがリードスルーされ、ポリペプチド鎖の生合成が継続されることは、従来全く知られていない。 The present inventor has modified the nucleobase that constitutes the immature stop codon. When the functional group is introduced into the nucleobase that constitutes the immature stop codon by methylation or halogenation, the immature stop codon is read through. Then, the present invention has been completed. It has not been known at all that the immature stop codon is read-through and the biosynthesis of the polypeptide chain is continued by modifying the uracil of the immature stop codon to methyluracil or fluorouracil.
すなわち、本発明は、ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡにおいて、前記未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾してリードスルーさせ、前記ｍＲＮＡの全長を翻訳することを特徴とする、タンパク質を生合成させる方法を提供するものである。 That is, the present invention is characterized in that, in an mRNA containing an immature stop codon formed by nonsense mutation, the nucleobases constituting the immature stop codon are modified and read through to translate the full length of the mRNA. And a method for biosynthesizing a protein.
また本発明は、前記修飾が、ウラシル、アデニン、またはグアニンに、アルキル基、ハロゲン、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、アシル基およびエーテル結合からなる群から選択されるいずれか１種以上の官能基を導入すること、または脱アミノ化、酸化、還元することである、前記方法を提供するものである。 Further, the present invention provides that the above-mentioned modification is uracil, adenine, or guanine, and any one or more functional groups selected from the group consisting of an alkyl group, a halogen, an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group, an acyl group, and an ether bond. Is introduced or deamination, oxidation, reduction is provided.
また本発明は、前記修飾される核酸塩基が、ウラシルおよび／またはアデニンであることを特徴とする、前記方法を提供するものである。 The present invention also provides the above method, wherein the modified nucleobase is uracil and/or adenine.
また本発明は、前記ｍＲＮＡは、ナンセンス突然変異型疾患で発現されたものである、前記方法を提供するものである。 The present invention also provides the above method, wherein the mRNA is expressed in a nonsense mutation type disease.
更に本発明は、ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡにおいて、前記未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾する方法であって、ＲＮＡ修飾酵素の活性部位を、前記ｍＲＮＡに相補的な塩基鎖を用いて塩基配列特異的に誘導して前記酵素を作用させ、もって前記核酸塩基を修飾することを特徴とする、未成熟終止コドンの修飾方法を提供するものである。 Furthermore, the present invention is a method for modifying a nucleobase constituting the immature stop codon in an mRNA containing the immature stop codon formed by nonsense mutation, wherein an active site of an RNA modifying enzyme is added to the mRNA. The present invention provides a method for modifying an immature stop codon, which comprises inducing a base sequence in a specific manner using a complementary base chain to cause the enzyme to act, thereby modifying the nucleobase.
また本発明は、前記修飾が、ウラシル、アデニン、またはグアニンに、アルキル基、ハロゲン、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、アシル基およびエーテル結合からなる群から選択されるいずれか１種以上の官能基を導入すること、または脱アミノ化、酸化、還元することである、前記未成熟終止コドンの修飾方法を提供するものである。 Further, the present invention provides that the above-mentioned modification is uracil, adenine, or guanine, and any one or more functional groups selected from the group consisting of an alkyl group, a halogen, an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group, an acyl group, and an ether bond. The method of modifying the immature stop codon is to introduce, or deaminate, oxidize, and reduce.
加えて、本発明は、ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡにおいて、前記未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を化学的に塩基修飾する方法であって、化学的な塩基修飾用の活性基を、前記ｍＲＮＡに相補的な塩基鎖を用いて塩基配列特異的に誘導して反応せしめ、もって前記核酸塩基を修飾することを特徴とする、未成熟終止コドンの修飾方法を提供するものである。 In addition, the present invention is a method of chemically modifying the nucleobases constituting the immature stop codon in an mRNA containing the immature stop codon formed by nonsense mutation, which comprises chemically modifying the base. A method for modifying an immature stop codon, which comprises reacting an active group for use in a base sequence-specific induction with a complementary base chain to the mRNA to react with the mRNA, thereby modifying the nucleobase. To do.
また本発明は、前記未成熟終止コドンの修飾方法で、前記未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾することを特徴とする、前記タンパク質を生合成させる方法を提供するものである。 The present invention also provides a method for biosynthesizing the protein, which comprises modifying the nucleobase constituting the immature stop codon by the method for modifying the immature stop codon.
本発明によれば、ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾してリードスルーさせることで、ｍＲＮＡの全長が翻訳されたタンパク質を生合成することができる。 According to the present invention, a protein in which the full-length mRNA is translated can be biosynthesized by modifying the nucleobases constituting the immature stop codon formed by nonsense mutation and making them read through.
本発明によれば、ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡに、当該ｍＲＮＡに相補的な塩基鎖を用いてＲＮＡ修飾酵素の活性部位や化学的な塩基修飾用の活性基を塩基配列特異的に誘導し、前記酵素を作用させ、または化学的な塩基修飾用の活性基を作用させることで、未成熟終止コドンの核酸塩基を修飾することができる。 According to the present invention, an mRNA containing an immature stop codon formed by nonsense mutation is provided with an active site of an RNA modifying enzyme or an active group for chemical base modification by using a base chain complementary to the mRNA. The nucleobase of the immature stop codon can be modified by specifically inducing a base sequence, allowing the enzyme to act, or acting an active group for chemical base modification.
本発明の第一は、ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡにおいて、前記未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾してリードスルーさせ、前記ｍＲＮＡの全長を翻訳することを特徴とする、タンパク質を生合成させる方法である。本発明において、「ナンセンス突然変異」とは、アミノ酸のコドンを終止コドンに変える変異をいい、「未成熟終止コドン」とは、ナンセンス突然変異によって、正常な終止コドンより５’末端側に出現した終止コドンを意味する。終止コドンには、ＵＡＡ、ＵＡＧおよびＵＧＡの３種がある。また、「リードスルー」とは、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳の際に未成熟終止コドンにいずれかのアミノ酸を対応させてポリペプチド鎖の生合成を継続させることを意味する。また、「核酸塩基の修飾」とは、未成熟終止コドンを構成するウラシル（Ｕ）のピリミジン骨格、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）のプリン骨格に官能基を導入すること、または脱アミノ化、酸化、還元することを意味する。以下、本発明を詳細に説明する。 In the first aspect of the present invention, in an mRNA containing an immature stop codon formed by nonsense mutation, the nucleobases constituting the immature stop codon are modified and read through to translate the full length of the mRNA. It is a characteristic method of biosynthesizing a protein. In the present invention, the "nonsense mutation" refers to a mutation that changes a codon of an amino acid into a stop codon, and the "immature stop codon" appears at the 5'-terminal side of a normal stop codon due to a nonsense mutation. Means stop codon. There are three types of stop codons, UAA, UAG and UGA. In addition, "read-through" means to associate any amino acid with an immature stop codon and continue the biosynthesis of a polypeptide chain during translation of mRNA into protein. In addition, “modification of nucleobase” means introducing a functional group into the pyrimidine skeleton of uracil (U) or the purine skeleton of adenine (A) and guanine (G), which constitutes an immature stop codon, or deamination. Means to oxidize and reduce. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
タンパク質は、細胞内のリボソームがｍＲＮＡ上を５’→３’方向に動きつつｍＲＮＡのコドンを読み取り、アミノアシルｔＲＮＡがコドンの指定するアミノ酸をリボソーム上に運び、各アミノ酸がペプチド結合してポリペプチド鎖を伸長して生合成される。終止コドンには対応するアミノ酸がなく、この位置でタンパク質合成が終了される。従来から、未成熟終止コドンのリードスルー化合物として、アミノグリコシド系抗生物質等が知られているが、翻訳を司るリボソームへ作用すると考えられている。これに対し、本発明の特徴は、未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾することで、未成熟終止コドンにアミノアシルｔＲＮＡを結合させ、またはサプレッサーｔＲＮＡに未成熟終止コドンに適当なアミノ酸を割り当て、いずれかのアミノ酸を対応させてポリペプチド鎖の生合成を継続させる点に特徴がある。アミノグリコシド系抗生物質等は、翻訳を司るリボソームへ作用してリードスルーすると考えられているが、本願発明は未成熟終止コドンを修飾するものでありリボソーム自体への直接作用でないため、副作用が少ないと期待される。 A protein reads the codon of mRNA while the intracellular ribosome moves in the 5′→3′ direction on the mRNA, and aminoacyl-tRNA carries the amino acid designated by the codon onto the ribosome, and each amino acid is peptide-bonded to form a polypeptide chain. Is elongated and biosynthesized. There is no corresponding amino acid in the stop codon and protein synthesis is terminated at this position. Conventionally, aminoglycoside antibiotics and the like have been known as read-through compounds for immature stop codons, but they are considered to act on the ribosome that controls translation. On the other hand, the feature of the present invention is to modify an nucleobase constituting an immature stop codon to bind an aminoacyl tRNA to the immature stop codon or to assign an appropriate amino acid to the suppressor tRNA to the immature stop codon. The feature is that the biosynthesis of the polypeptide chain is continued by making any of the amino acids correspond. Aminoglycoside antibiotics and the like are thought to act on the ribosome that controls translation to lead through, but the present invention modifies the immature stop codon and is not a direct action on the ribosome itself, and therefore has few side effects. Be expected.
本発明において、未成熟終止コドンを構成する核酸塩基としては、ウラシル、アデニン、グアニンのいずれでもよい。核酸塩基を構成するピリミジン骨格やプリン骨格に導入する官能基としては、メチル基、エチル基などのアルキル基、フッ素、塩素などのハロゲン、アミノ基や水酸基、カルボキシル基、アセチル基などのアシル基、エーテル結合がある。また、脱アミノ化、酸化、還元するものであってもよい。例えば、アデニンを構成するアミノ基を脱アミノ化したり、ウラシル、グアニン、アデニンの−ＮＨを酸化してピリミジン骨格やプリン骨格に更に二重結合を導入したり、ウラシルの＝Ｏ（ケトン）を還元して水酸基を導入してもよい。本発明においては、核酸塩基をアルキル化、ハロゲン化に修飾することが好ましい。後記する実施例に示すように、ウラシルにメチル基を導入し、またはフッ素化すると、リードスルーすることが判明した。好ましい官能基は、メチル基、フッ素、アミノ基、水酸基であり、核酸塩基の還元物であってもよい。修飾された核酸塩基としては、ジヒドロウラシル、ヒドログアニン、ヒドロアデニン、メチルウラシル、メチルグアニン、メチルアデニン、フッ化ウラシル、フッ化グアニン、フッ化アデニン、アミノウラシル、アミノアデニン、水酸化ウラシル、水酸化アデニンなどが好ましい。本発明では特に、５−メチルウラシル、５−フルオロウラシル、５−塩化ウラシル等を好適に使用することができる。 In the present invention, the nucleobase constituting the immature stop codon may be uracil, adenine or guanine. As a functional group to be introduced into the pyrimidine skeleton or purine skeleton constituting a nucleobase, a methyl group, an alkyl group such as an ethyl group, a halogen such as fluorine or chlorine, an amino group or a hydroxyl group, a carboxyl group, an acyl group such as an acetyl group, There is an ether bond. In addition, it may be a compound that undergoes deamination, oxidation, or reduction. For example, deamination of the amino group that constitutes adenine, oxidation of -NH of uracil, guanine, and adenine to introduce a double bond into the pyrimidine skeleton or purine skeleton, or reduction of uracil =O (ketone) Then, a hydroxyl group may be introduced. In the present invention, it is preferable to modify the nucleobase by alkylation or halogenation. As shown in Examples described later, it was found that the introduction of a methyl group into uracil or fluorination leads to read-through. Preferred functional groups are a methyl group, a fluorine group, an amino group and a hydroxyl group, and may be a reduced product of a nucleic acid base. Modified nucleobases include dihydrouracil, hydroguanine, hydroadenine, methyluracil, methylguanine, methyladenine, uracil fluoride, guanine fluoride, adenine fluoride, aminouracil, aminoadenine, uracil hydroxide, hydroxylation. Adenine and the like are preferable. In the present invention, 5-methyluracil, 5-fluorouracil, 5-uracil chloride and the like can be particularly preferably used.
リードスルーによって、ｍＲＮＡの全長を翻訳することができる。生成するタンパク質は、ナンセンス突然変異が無い場合に生合成される野生型タンパク質や、野生型タンパク質において、未成熟終止コドンに割り当てられたアミノ酸が相違するタンパク質となる。野生型タンパク質は、特定の機能を有する機能性タンパク質であることが多く、ナンセンス突然変異型疾患においては機能性タンパク質が生合成されない結果、各種症状が発現する。本発明によれば、野生型タンパク質の発揮する機能を有するタンパク質を生合成することができるため、ナンセンス突然変異型疾患の治療に役立てることができる。このようなナンセンス突然変異型疾患としては、サラセミア、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、毛細血管拡張性運動失調、ハーラー疾患、血友病、テイ−サックス病などを例示することができる。 Readthrough allows translation of the full length of mRNA. The produced protein is a wild-type protein that is biosynthesized in the absence of a nonsense mutation, or a protein that differs from the wild-type protein in the amino acid assigned to the immature stop codon. The wild-type protein is often a functional protein having a specific function, and various symptoms occur as a result of the non-synthesis of the functional protein in the nonsense mutation type disease. According to the present invention, a protein having a function exerted by a wild-type protein can be biosynthesized, which can be useful for treating a nonsense mutation type disease. Such nonsense mutation-type diseases include thalassemia, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Parkinson's disease, cystic fibrosis, muscular dystrophy, ataxia-telangiectasia, Haarler's disease, hemophilia, Tay- Sachs disease etc. can be illustrated.
本発明によれば、未成熟終止コドンのみがリードスルーされるため、本来の終止コドンがリードスルーされることがない。 According to the present invention, since only the immature stop codon is read through, the original stop codon is not read through.
本発明の第二は、ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡにおいて、前記未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾する方法であって、ＲＮＡ修飾酵素の活性部位を、前記ｍＲＮＡに相補的な塩基鎖を用いて塩基配列特異的に誘導して前記酵素を作用させ、もって前記核酸塩基を修飾することを特徴とする、未成熟終止コドンの修飾方法である。この方法により未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を修飾すると、未成熟終止コドンがリードスルーされ、ｍＲＮＡの全長が翻訳されタンパク質が生合成される。 A second aspect of the present invention is a method for modifying a nucleobase constituting the immature stop codon in an mRNA containing the immature stop codon formed by nonsense mutation, wherein the active site of the RNA modifying enzyme is A method for modifying an immature stop codon, which comprises inducing a base sequence specifically using a base chain complementary to mRNA to cause the enzyme to act, thereby modifying the nucleobase. By modifying the nucleobase that constitutes the immature stop codon by this method, the immature stop codon is read through, the entire length of the mRNA is translated, and the protein is biosynthesized.
ＲＮＡ修飾酵素としては、広く、ＲＮＡを構成する核酸塩基のピリミジン骨格やプリン骨格に官能基を導入し、または脱アミノ化、酸化、還元することができる酵素が挙げられる。ＲＮＡを構成する核酸塩基に、メチル基、エチル基などのアルキル基、フッ素、塩素などのハロゲン、アミノ基や水酸基、カルボキシル基、アセチル基などのアシル基、エーテル結合などの官能基を導入できる各種酵素を賜与することができる。また、ＲＮＡを構成する核酸塩基を脱アミノ化、酸化、還元することができる酵素であってもよい。このような酵素は、天然酵素であってもよく、また、特定の官能基を導入するために新たに調製された人工酵素であってもよい。本発明ではこのようなＲＮＡ修飾酵素をそのまま使用してもよく、このような酵素の活性部位のみを使用してもよい。更には、ＲＮＡ修飾酵素やその活性部位に変異を導入し、より酵素活性を高めた活性部位を使用してもよい。ＲＮＡ修飾酵素の多くは既に遺伝子情報が公開されているため、クローニングにより入手することができる。 As the RNA-modifying enzyme, a wide variety of enzymes can be mentioned, which are capable of introducing a functional group into the pyrimidine skeleton or purine skeleton of nucleobases constituting RNA, or capable of deamination, oxidation and reduction. Various groups that can introduce alkyl groups such as methyl and ethyl groups, halogens such as fluorine and chlorine, amino groups and hydroxyl groups, carboxyl groups, acyl groups such as acetyl groups, and functional groups such as ether bonds into nucleobases that compose RNA You can give an enzyme. Further, it may be an enzyme capable of deaminating, oxidizing, and reducing the nucleobases constituting RNA. Such an enzyme may be a natural enzyme or an artificial enzyme newly prepared for introducing a specific functional group. In the present invention, such an RNA modifying enzyme may be used as it is, or only the active site of such an enzyme may be used. Furthermore, an RNA-modifying enzyme or an active site having a higher enzyme activity may be used by introducing a mutation into the active site. Most RNA-modifying enzymes have gene information already disclosed, and thus can be obtained by cloning.
ＲＮＡ修飾酵素の活性部位を未成熟終止コドンに誘導するには、未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡに相補的な塩基鎖を用いる。未成熟終止コドンの修正対象の核酸塩基を「標的核酸塩基」と称すると、「相補的な塩基鎖」とは、ｍＲＮＡの標的核酸塩基にＲＮＡ修飾酵素を誘導するために使用され、ｍＲＮＡを構成する核酸塩基と相補な核酸塩基で構成される塩基鎖である。説明の便宜のため、この相補的な塩基鎖を「ガイドＲＮＡ」と称する。例えば、未成熟終止コドンとしてＵＡＡを含むｍＲＮＡとして５’−ＣＵＧＣＵＡＡＧＡＣＡ−３’の相補鎖は、３プライム末端から５プライム末端に向かって記載すると、３’−ＧＡＣＧＡＵＵＣＵＧＵ−５’となる。ガイドＲＮＡは、ｍＲＮＡを構成する核酸塩基の全てが相補的な塩基で構成されてもよく、上記例では、３’−ＧＡＣＧＡＵＵＣＵＧＵ−５’をガイドＲＮＡとして使用することができる。一方、標的核酸塩基に酵素を誘導できればよく、ガイドＲＮＡは、ｍＲＮＡを構成する核酸塩基の一部に相補的でない核酸塩基が含まれていてもよい。上記例で説明すると、ＧＡＣを除いた３’−ＧＡＵＵＣＵＧＵ−５’であってもよい。更に、ガイドＲＮＡは、標的核酸塩基に対応する核酸塩基が、ミスマッチ塩基対であることが好ましい。例えば未成熟終止コドンを構成するウラシルを修飾する場合には、３プライム末端から５プライム末端に向かって記載する３’−ＧＡＣＧＣＵＵＣＵＧＵ−５’を使用する。標的核酸塩基であるウラシルはガイドＲＮＡのシトシンとミスマッチであるため弾き出され、ＲＮＡ修飾酵素を効率的に標的核酸塩基に作用させることができる。本発明では、ガイドＲＮＡとして、標的核酸塩基がウラシルやアデニンである場合はミスマッチ塩基対としてシトシンが、グアニンの場合はアデニンまたはウラシルであることが好ましい。 To induce the active site of the RNA modifying enzyme to the immature stop codon, a base chain complementary to the mRNA containing the immature stop codon is used. When the nucleobase whose immature stop codon is to be corrected is referred to as the “target nucleobase”, the “complementary base chain” is used to induce an RNA-modifying enzyme to the target nucleobase of mRNA, and constitutes the mRNA. Is a base chain composed of a nucleobase complementary to the nucleobase. For convenience of explanation, this complementary base chain is referred to as “guide RNA”. For example, the complementary strand of 5'-CUGCUAAGACA-3' as mRNA containing UAA as the immature stop codon is 3'-GACGAUCUGU-5' when described from the 3 prime end to the 5 prime end. The guide RNA may be composed of bases in which all the nucleic acid bases constituting mRNA are complementary, and in the above example, 3'-GACGAUCUGU-5' can be used as the guide RNA. On the other hand, the guide RNA may include a nucleobase that is not complementary to a part of the nucleobases composing the mRNA, as long as the enzyme can be induced to the target nucleobase. Explaining in the above example, it may be 3'-GAUUCUGU-5' excluding GAC. Further, in the guide RNA, the nucleobase corresponding to the target nucleobase is preferably a mismatch base pair. For example, when modifying uracil which constitutes an immature stop codon, 3'-GACGCUUCUGU-5' described from 3 prime end to 5 prime end is used. Since the target nucleobase, uracil, is mismatched with cytosine of the guide RNA, it is repelled, and the RNA modifying enzyme can efficiently act on the target nucleobase. In the present invention, the guide RNA is preferably cytosine as the mismatch base pair when the target nucleic acid base is uracil or adenine, and is preferably adenine or uracil when it is guanine.
ガイドＲＮＡにＲＮＡ修飾酵素やその活性部位を結合させる方法として、非特許文献２記載のＭＳ２システムを使用することができる。ＭＳ２システムは、ＭＳ２ファージ由来のＲＮＡ結合コートタンパク質とそれに特異的に結合するＲＮＡを含む。ＭＳ２ファージはＲＮＡウイルスであり、そのゲノムは＋鎖のｍＲＮＡとして機能する１本鎖ＲＮＡである。大腸菌に感染すると、ファージの増殖に必要な遺伝子の翻訳に引き続き−鎖のＲＮＡが合成され、この−鎖ＲＮＡを鋳型とし＋鎖のＲＮＡが合成される。ＭＳ２ファージは、ＲＮＡに基づいてＭＳ２ファージのコートタンパク質を合成するが、コートタンパク質の蓄積に伴いコートタンパク質が複製遺伝子の上流に結合する。すなわち、ＭＳ２ファージでは、ウイルスタンパク質が翻訳の鋳型となったウイルスｍＲＮＡと結合することを特徴を有する。ＭＳ２システムはこれらを利用してタンパク質とＲＮＡをさせるものである。 The MS2 system described in Non-Patent Document 2 can be used as a method for binding the RNA modifying enzyme or its active site to the guide RNA. The MS2 system comprises an RNA binding coat protein from the MS2 phage and RNA that specifically binds to it. MS2 phage is an RNA virus and its genome is single-stranded RNA that functions as +-strand mRNA. Upon infection of Escherichia coli, following the translation of the gene required for phage growth, −strand RNA is synthesized, and using this −strand RNA as a template, +strand RNA is synthesized. MS2 phage synthesizes the coat protein of MS2 phage based on RNA, and the coat protein binds to the upstream of the replication gene as the coat protein accumulates. That is, the MS2 phage is characterized in that the viral protein binds to the viral mRNA that serves as a translation template. The MS2 system utilizes these to generate proteins and RNA.
まず、ＲＮＡ修飾酵素やその活性部位の遺伝子配列をクローニングすれば、ＭＳ２コートタンパク質とＲＮＡ修飾酵素とのキメラタンパク質（ＭＳ２コートタンパク質−ＲＮＡ修飾酵素の活性部位）を生成することができる。また、ＭＳ２ＲＮＡにガイドＲＮＡを結合させてＲＮＡ鎖（ガイドＲＮＡ−ＭＳ２ＲＮＡ）を調製することができる。ＭＳ２ＲＮＡとＭＳ２タンパク質とは強い結合性を有するため、キメラタンパク質（ＭＳ２コートタンパク質−ＲＮＡ修飾酵素の活性部位）とＲＮＡ鎖（ガイドＲＮＡ−ＭＳ２ＲＮＡ）とを混合し、またはこれらを共に細胞内で発現させると、ガイドＲＮＡ−ＭＳ２ＲＮＡ−ＭＳ２タンパク質−ＲＮＡ修飾酵素の活性部位とを含む複合体を得ることができる。この複合体は、細胞内でガイドＲＮＡによってｍＲＮＡと相補的に結合する。未成熟終止コドンの近傍にＲＮＡ修飾酵素の活性部位が誘導されると標的核酸塩基の修飾を効率的に行うことができる。 First, by cloning the RNA modifying enzyme and the gene sequence of its active site, a chimeric protein of MS2 coat protein and RNA modifying enzyme (MS2 coat protein-active site of RNA modifying enzyme) can be produced. Further, an RNA chain (guide RNA-MS2RNA) can be prepared by binding a guide RNA to MS2RNA. Since MS2 RNA and MS2 protein have strong binding properties, a chimeric protein (MS2 coat protein-active site of RNA modifying enzyme) and an RNA chain (guide RNA-MS2 RNA) are mixed or both are expressed intracellularly. And a guide RNA-MS2 RNA-MS2 protein-RNA modifying enzyme active site can be obtained. This complex complementarily binds to mRNA in cells by the guide RNA. When the active site of the RNA modifying enzyme is introduced near the immature stop codon, the target nucleobase can be efficiently modified.
本発明の第三は、ナンセンス突然変異によって形成された未成熟終止コドンを含むｍＲＮＡにおいて、前記未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を化学的に塩基修飾する方法であって、化学的な塩基修飾用の活性基を、前記ｍＲＮＡに相補的な塩基鎖を用いて塩基配列特異的に誘導して反応せしめ、もって前記核酸塩基を修飾することを特徴とする、未成熟終止コドンの修飾方法である。この方法により未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を化学的に修飾すると、未成熟終止コドンがリードスルーされ、ｍＲＮＡの全長が翻訳されタンパク質が生合成される。 A third aspect of the present invention is a method for chemically modifying the nucleobases constituting the immature stop codon in an mRNA containing the immature stop codon formed by nonsense mutation, which comprises chemical base modification. Is a method for modifying an immature stop codon, characterized in that the active group for use is induced in a base sequence-specific manner by using a base chain complementary to the above-mentioned mRNA to react, and thereby the above-mentioned nucleobase is modified. .. By chemically modifying the nucleobase that constitutes the immature stop codon by this method, the immature stop codon is read through, the entire length of mRNA is translated, and the protein is biosynthesized.
「化学的な塩基修飾用の活性基」としては、メチル基、エチル基などのアルキル基、フッ素、塩素などのハロゲン、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、アセチル基などのアシル基およびエーテル結合がある。第二の発明に準じて、ｍＲＮＡの標的核酸塩基に化学的な塩基修飾用の活性基を誘導するために使用され、かつｍＲＮＡを構成する核酸塩基と相補な核酸塩基で構成される塩基鎖をガイドＲＮＡとする。ガイドＲＮＡを使用すれば、第二の発明に準じて、ＭＳ２システムを利用して、ガイドＲＮＡ−ＭＳ２ＲＮＡ−ＭＳ２タンパク質−化学的な塩基修飾用の活性基とを含む複合体を得ることもできる。この複合体を使用すると、細胞内でガイドＲＮＡによってｍＲＮＡと相補的に結合し、これにより標的核酸塩基の化学的な修飾を効率的に行うことができる。例えば、化学的な塩基修飾用の活性基がフッ素である場合には、ガイドＲＮＡ−ＭＳ２ＲＮＡ−ＭＳ２タンパク質−フッ素となり、標的核酸塩基にフッ素を導入することができる。一方、ＭＳ２システムを使用せず、例えば上記したガイドＲＮＡ等の相補的な人工核酸鎖に、直接官能基を結合した化合物複合体を用いることもできる。化学的な塩基修飾用の活性基がフッ素である場合には、相補的な人工核酸鎖（例えばガイドＲＮＡ）−フッ素となり、標的核酸塩基にフッ素を導入することができる。なお、何れの場合でも、必要に応じて紫外線照射、加熱などのエネルギー付加を行い反応を促進させることもできる。 The "active group for chemical base modification" includes an alkyl group such as a methyl group and an ethyl group, a halogen such as fluorine and chlorine, an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group, an acyl group such as an acetyl group, and an ether bond. .. According to the second invention, a base chain composed of a nucleobase complementary to a nucleobase constituting mRNA and used for inducing an active group for chemical base modification into a target nucleobase of mRNA is formed. Use as guide RNA. If the guide RNA is used, a complex containing guide RNA-MS2RNA-MS2 protein-active group for chemical base modification can be obtained by utilizing the MS2 system according to the second invention. When this complex is used, it can be complementarily bound to mRNA by the guide RNA in the cell, and thereby the chemical modification of the target nucleobase can be efficiently performed. For example, when the active group for chemical base modification is fluorine, it becomes guide RNA-MS2RNA-MS2 protein-fluorine, and fluorine can be introduced into the target nucleic acid base. On the other hand, without using the MS2 system, for example, a compound complex in which a functional group is directly bound to a complementary artificial nucleic acid chain such as the guide RNA described above can be used. When the active group for chemical base modification is fluorine, it becomes a complementary artificial nucleic acid chain (for example, guide RNA)-fluorine, and fluorine can be introduced into the target nucleic acid base. In any case, the reaction can be promoted by adding energy such as ultraviolet irradiation or heating, if necessary.
本発明によれば、未成熟終止コドンを構成する核酸塩基を特定し、この標的核酸塩基のみを修飾することができるため、本来の終止コドンをリードスルーすることがない。このため、正常タンパク質のＣ末端に更にポリペプチド鎖が結合する異常タンパク質の生合成を回避することができる。 According to the present invention, it is possible to identify a nucleobase that constitutes an immature stop codon and modify only this target nucleobase, so that the original stop codon is not read through. Therefore, abnormal protein biosynthesis in which a polypeptide chain is further bound to the C-terminus of a normal protein can be avoided.
本発明によって生合成されるタンパク質は、未成熟終止コドンにアミノ酸が割り当てられたポリペプチド鎖であり、未成熟終止コドンに野生型タンパク質と異なるアミノ酸が割り当てられた場合でも野生型タンパク質と同様の機能を期待することができる。したがって、本発明のタンパク質を生合成させる方法は、ナンセンス変異型遺伝子疾患の治療に有効に使用することができる。例えば、上記したガイドＲＮＡ−ＭＳ２ＲＮＡ−ＭＳ２タンパク質−ＲＮＡ修飾酵素の活性部位を含む複合体や、ガイドＲＮＡ−ＭＳ２ＲＮＡ−ＭＳ２タンパク質−化学的な塩基修飾用の活性基、ガイドＲＮＡ−化学的な塩基修飾用の活性基を含む複合体を患者に投与すると、細胞内のタンパク質合成機能を利用して、ｍＲＮＡが発現した組織内でタンパク質を生合成させることができる。 The protein biosynthesized by the present invention is a polypeptide chain in which an amino acid is assigned to the immature stop codon, and even when an amino acid different from the wild type protein is assigned to the immature stop codon, the same function as that of the wild type protein is obtained. Can be expected. Therefore, the method for biosynthesizing the protein of the present invention can be effectively used for the treatment of nonsense mutant gene diseases. For example, a complex containing the above-mentioned guide RNA-MS2RNA-MS2 protein-RNA modifying enzyme active site, guide RNA-MS2RNA-MS2 protein-active group for chemical base modification, guide RNA-chemical base modification When a complex containing an active group is used for administration to a patient, the protein synthesis function in cells can be utilized to biosynthesize the protein in the tissue in which mRNA is expressed.
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples. However, the present invention is not limited to these.
（実施例１）
ＲＢＳ（Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ）配列（ＡＡＧＧＡＧ）、Ｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣ）、開始コドン（ＡＵＧ）、Ｈｉｓ−Ｔａｇ、終止コドン（ＵＡＡ）、ＦＬＡＧ配列、終止コドン（ＵＡＧ）を含む配列番号１と、配列番号１において、前記終止コドンＵＡＡのＵが、それぞれＡ、Ψ、５ｍｅｔｈｙｌＵ、および５ｆｌｕｏｒｏＵである配列番号２〜５のリボ核酸鎖を製造委託して使用した。なお、配列番号１は対照、配列番号２は陽性対照である。
(Example 1)
Sequence number 1 including RBS (Ribosome Binding Site) sequence (AAGGAG), Kozak sequence (GCCACC), start codon (AUG), His-Tag, stop codon (UAA), FLAG sequence, stop codon (UAG), and SEQ ID NO: In 1, the ribonucleic acid chains of SEQ ID NOs: 2 to 5 in which the U of the stop codon UAA is A, Ψ, 5methylU, and 5fluorU, respectively, were used by contract manufacturing. In addition, SEQ ID NO: 1 is a control, and SEQ ID NO: 2 is a positive control.
配列番号１：AAG GAG GCC ACC AUG UGC UGC CAC CAU CAC CAC CAU CAC UGC GAC CUC GAG UAA GAC UAC AAG GAC GAC GAC GAU AAG AUC UAG SEQ ID NO: 1 AAG GAG GCC ACC AUG UGC UGC CAC CAU CAC CAC CAU CAC UGC GAC CUC GAG UAA GAC UAC AAG GAC GAC GAC GAU AAG AUC UAG
配列番号２：AAG GAG GCC ACC AUG UGC UGC CAC CAU CAC CAC CAU CAC UGC GAC CUC GAG AAA GAC UAC AAG GAC GAC GAC GAU AAG AUC UAG Sequence number 2: AAG GAG GCC ACC AUG UGC UGC CAC CAU CAC CAC CAU CAC UGC GAC CUC GAG AAA GAC UAC AAG GAC GAC GAC GAU AAG AUC UAG
配列番号３：AAG GAG GCC ACC AUG UGC UGC CAC CAU CAC CAC CAU CAC UGC GAC CUC GAG Ψ-AA GAC UAC AAG GAC GAC GAC GAU AAG AUC UAG Sequence number 3: AAG GAG GCC ACC AUG UGC UGC CAC CAU CAC CAC CAU CAC UGC GAC CUC GAG Ψ-AA GAC UAC AAG GAC GAC GAC GAU AAG AUC UAG
配列番号４：AAG GAG GCC ACC AUG UGC UGC CAC CAU CAC CAC CAU CAC UGC GAC CUC GAG 5methylU-AA GAC UAC AAG GAC GAC GAC GAU AAG AUC UAG Sequence number 4: AAG GAG GCC ACC AUG UGC UGC CAC CAU CAC CAC CAU CAC UGC GAC CUC GAG 5methylU-AA GAC UAC AAG GAC GAC GAC GAU AAG AUC UAG
配列番号５：AAG GAG GCC ACC AUG UGC UGC CAC CAU CAC CAC CAU CAC UGC GAC CUC GAG 5fluoroU-AA GAC UAC AAG GAC GAC GAC GAU AAG AUC UAG SEQ ID NO: 5: AAG GAG GCC ACC AUG UGC UGC CAC CAU CAC CAC CAU CAC UGC GAC CUC GAG 5fluoroU-AA GAC UAC AAG GAC GAC GAC GAU AAG AUC UAG
無細胞翻訳キット（ジーンフロンティア社製、ＰＵＲＥｆｌｅｘ（登録商標）２．０）を使用し、添付のマニュアルに従って反応液を調製し、前記配列番号１〜５のいずれかのリボ核酸鎖を添加してインビトロ翻訳を行い、ＲＩＰＡ Ｂｕｆｆｅｒを１μＬ添加して反応を終了させた。得られた反応液にＲＩＰＡ Ｂｕｆｆｅｒを添加して希釈し、一部をニトロセルロースメンブレンに滴下し、３０分放置（乾燥）後、ＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０：最終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）内で１５分震盪し、次いでブロッキング溶液（プライムワン）に浸して４℃で一晩放置した。その後、ＴＢＳ−Ｔで軽く洗浄した後、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｆｌａｇ ｔａｇ Ｒａｂｂｉｔ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を１次抗体として滴下し、メンブレンフィルムで挟み室温で２時間放置した。これをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した後にＦＬＡＧ抗体用二次抗体（プロテインＧ ＨＲＰ）を滴下、１次抗体と同様にメンブレンフィルムで挟み９０分、室温で放置し、ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。その後ラップ上でメンブレンに検出溶液としてＥＣＬ溶液を添加してＬＡＳ３０００（富士フィルム）を利用して化学発光を検出した。 Using a cell-free translation kit (PUREflex (registered trademark) 2.0 manufactured by Gene Frontier Co., Ltd.), a reaction solution was prepared according to the attached manual, and the ribonucleic acid chain of any one of SEQ ID NOS: 1 to 5 was added. In vitro translation was performed, and 1 μL of RIPA Buffer was added to terminate the reaction. RIPA Buffer was added to the obtained reaction solution to dilute it, and a part of it was added dropwise to a nitrocellulose membrane and left for 30 minutes (drying) and then in TBS-T (TBS-Tween 20: final concentration 0.05% Tween 20). Shake for 15 minutes, then soak in blocking solution (Prime One) and let stand overnight at 4°C. Then, after lightly washing with TBS-T, an anti-FLAG antibody (Flag tag Rabbit Polyclonal antibody) was dropped as a primary antibody, sandwiched with a membrane film and left at room temperature for 2 hours. After this was washed 4 times with TBS-T, a secondary antibody for FLAG antibody (protein G HRP) was dropped, sandwiched with a membrane film in the same manner as the primary antibody, left at room temperature for 90 minutes, and washed with TBS-T. After that, an ECL solution was added to the membrane as a detection solution on the lap, and chemiluminescence was detected using LAS3000 (Fuji Film).
結果を図１に示す。なお、図１において×１は原液を、×１０、×１００、×１０００はそれぞれ１０倍、１００倍、１０００倍希釈を示す。５ｆｌｕｏｒｏＵおよび５ｍｅｔｈｙｌＵを使用したサンプルでは抗ＦＬＡＧ抗体にポジティブなシグナルが出現した。 The results are shown in Figure 1. In FIG. 1, x1 indicates the stock solution, and x10, x100, and x1000 indicate 10-fold, 100-fold, and 1000-fold dilutions, respectively. A positive signal appeared in the anti-FLAG antibody in the samples using 5fluoroU and 5methylU.
Claims (8)
ＲＮＡ修飾酵素の活性部位を、前記ｍＲＮＡに相補的な塩基鎖を用いて塩基配列特異的に誘導して前記酵素を作用させ、もって前記核酸塩基を修飾することを特徴とする、未成熟終止コドンの修飾方法。 A method for modifying a nucleobase constituting the immature stop codon in an mRNA containing the immature stop codon formed by nonsense mutation, comprising:
An immature stop codon, characterized in that the active site of an RNA modifying enzyme is specifically induced by a base sequence using a base chain complementary to the mRNA to cause the enzyme to act, thereby modifying the nucleobase. Modification method.
化学的な塩基修飾用の活性基を、前記ｍＲＮＡに相補的な塩基鎖を用いて塩基配列特異的に誘導して反応せしめ、もって前記核酸塩基を修飾することを特徴とする、未成熟終止コドンの修飾方法。 A method for chemically modifying a nucleobase constituting the immature stop codon in an mRNA containing the immature stop codon formed by nonsense mutation, comprising:
An immature stop codon, characterized in that an active group for chemical base modification is induced by a base sequence specific reaction using a base chain complementary to the mRNA to react, thereby modifying the nucleobase. Modification method.
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