JP2020115089A - Measurement of hardness of water - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、水の硬度の測定に関する。一態様において、本開示は、発光タンパク質指示薬を用いる、水の硬度の測定に関する。 The present disclosure relates to measuring water hardness. In one aspect, the present disclosure relates to measurement of water hardness using a photoprotein indicator.
水の硬度は、水に含まれるカルシウムとマグネシウムの濃度から算出される指標である。水の硬度の測定方法として、例えば、ｏ−クレゾールフタレインコンプレクソン、エリオクロムブラックＴ、カルマガイトなどの低分子化合物を発色試薬として利用した比色定量法が知られている（特許文献１及び２）。 Water hardness is an index calculated from the concentrations of calcium and magnesium contained in water. As a method for measuring the hardness of water, for example, a colorimetric quantification method using a low molecular compound such as o-cresolphthalein complexone, eriochrome black T, and calmagite as a color forming reagent is known (Patent Documents 1 and 2). ).
ルシフェラーゼ等の発光タンパク質は、ルシフェリンなどの発光基質の反応を触媒することで放射シグナルを生成でき、外部光源から完全に独立して発光できるタンパク質である。近年、最も明るいルシフェラーゼであるＮａｎｏＬｕｃ（Ｎｌｕｃ）が、深海エビのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ（Ｏｌｕｃ）を用いた遺伝子工学により開発された。最適な基質であるフリマジン（ｆｕｒｉｍａｚｉｎｅ）も開発された。
さらに、発光タンパク質と蛍光タンパク質とが融合された発光タンパク質も開発された。この融合発光タンパク質では、ドナーである発光タンパク質のエネルギーが、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によりアクセプターである蛍光タンパク質に伝達され発光が生じる。
この融合発光タンパク質の1つ例が、ナノランタンである。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼとイエロー蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓが結合され、イエローナノランタン（ＹＮＬ）が作り出された。また、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼとオレンジ蛍光タンパク質ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ２が結合され、オレンジナノランタン（ＯＮＬ）が作り出された。
さらに、エンハンストナノランタン（ｅＮＬ）シリーズが開発された。Ｎｌｕｃが、シアン蛍光タンパク質ｍＴｕｒｏｑｕｏｉｓｅ２、グリーン蛍光タンパク質ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、イエロー蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓ、オレンジ蛍光タンパク質ｍＫＯκ、及びレッド蛍光タンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏと結合され、シアンｅＮＬ(ＣｅＮＬ)、グリーンｅＮＬ（ＧｅＮＬ）、イエローｅＮＬ（ＹｅＮＬ）、オレンジイエロー（ＯｅＮＬ）、及びレッドｅＮＬ（ＲｅＮＬ）が、それぞれ、作り出された（非特許文献１）。
Photoproteins such as luciferase are proteins that can generate a radiative signal by catalyzing the reaction of a luminescent substrate such as luciferin and can emit light completely independently of an external light source. Recently, the brightest luciferase, NanoLuc (Nluc), was developed by genetic engineering using Oplophorus luciferase (Oluc) of deep-sea shrimp. The optimal substrate, furimazine, was also developed.
Furthermore, a luminescent protein in which a luminescent protein and a fluorescent protein are fused has also been developed. In this fusion photoprotein, the energy of the photoprotein that is the donor is transferred to the fluorescent protein that is the acceptor by Forster resonance energy transfer (FRET), and luminescence occurs.
One example of this fusion photoprotein is nanolanthanum. Renilla luciferase and the yellow fluorescent protein Venus were combined to create yellow nanolanthanum (YNL). In addition, Renilla luciferase and the orange fluorescent protein Kusabila Orange 2 were bound to produce orange nanolanthanum (ONL).
In addition, the Enhanced Nanolanthanum (eNL) series has been developed. Nluc is combined with cyan fluorescent protein mTuroquoise2, green fluorescent protein mNeonGreen, yellow fluorescent protein Venus, orange fluorescent protein mKOκ, and red fluorescent protein tdTomato, cyan eNL (CeNL), green eNL (GeNL), yellow eNL (YeNL), Orange yellow (OeNL) and red eNL (ReNL) were created respectively (Non-Patent Document 1).
生体タンパク質には、カルシウムを結合するタンパク質や、マグネシウムを結合するタンパク質が存在する。しかし、これらのタンパク質を水の硬度の測定に利用する試みは報告されていない。
そこで、本開示は、一態様において、融合発光タンパク質を利用して水の硬度を測定する方法を提供する。
Biological proteins include proteins that bind calcium and proteins that bind magnesium. However, no attempts have been reported to utilize these proteins for measuring the hardness of water.
Thus, in one aspect, the present disclosure provides a method of measuring the hardness of water using a fusion photoprotein.
本開示は、一態様において、発光タンパク質指示薬を用いて水の硬度を測定する方法であって、
前記発光タンパク質指示薬に水と発光基質とを接触させること、及び、
前記発光タンパク質指示薬の発光シグナルから水の硬度を判定又は算出することを含み、
前記発光タンパク質指示薬は、化学発光タンパク質の部分と、金属イオン結合タンパク質の部分と、蛍光タンパク質の部分とを有し、化学発光タンパク質部分と蛍光タンパク質部分との間に金属イオン結合タンパク質部分が連結されているタンパク質であり、
前記金属イオン結合タンパク質は、２価の金属陽イオン結合ドメインを有するタンパク質であり、
前記発光基質は、前記化学発光タンパク質の基質である、方法に関する。
The present disclosure provides, in one aspect, a method of measuring the hardness of water using a photoprotein indicator, comprising:
Contacting the photoprotein indicator with water and a luminescent substrate; and
Comprising determining or calculating the hardness of water from the luminescent signal of the photoprotein indicator,
The luminescent protein indicator has a chemiluminescent protein portion, a metal ion binding protein portion, and a fluorescent protein portion, and the metal ion binding protein portion is linked between the chemiluminescent protein portion and the fluorescent protein portion. Is a protein
The metal ion-binding protein is a protein having a divalent metal cation-binding domain,
The method, wherein the luminescent substrate is a substrate for the chemiluminescent protein.
本開示は、一態様において、発光タンパク質指示薬及び前記指示薬の発光基質が配置された試薬部と、前記試薬部が形成された基材とを有する水の硬度測定用デバイスであって、前記発光タンパク質指示薬及び前記発光基質は、前記試薬部に独立して配置されている、水の硬度測定用デバイスに関する。 The present disclosure provides, in one aspect, a device for measuring hardness of water, comprising a reagent part on which a luminescent protein indicator and a luminescent substrate of the indicator are arranged, and a base material on which the reagent part is formed, wherein the luminescent protein The indicator and the luminescent substrate relate to a water hardness measuring device which is independently arranged in the reagent section.
本開示は、一態様において、水の硬度測定用デバイスに試料水を供給することで発せられる発光シグナルを、撮像部を備える携帯情報端末で撮像すること、及び、前記携帯情報端末が備える情報処理手段により、前記撮像部で得られた発光シグナルの撮像データから水の硬度を判定又は算出することを含む、水の硬度の測定方法に関する。 In one aspect, the present disclosure captures an image of a luminescence signal emitted by supplying sample water to a device for measuring water hardness with a mobile information terminal including an imaging unit, and information processing included in the mobile information terminal. A method for measuring water hardness, which comprises determining or calculating water hardness from imaging data of a luminescence signal obtained by the imaging unit by means.
本開示は、一態様において、水の硬度測定用デバイス、該デバイスに水を供給することで発せられる発光シグナルを撮像可能な撮像部を備える携帯情報端末、及び、撮像部で得られた発光シグナルの撮像データから水の硬度を判定又は算出可能なアプリケーションソフトウェアを含む、水の硬度測定システムに関する。 In one aspect, the present disclosure provides a device for measuring water hardness, a portable information terminal including an imaging unit capable of imaging a luminescence signal emitted by supplying water to the device, and a luminescence signal obtained by the imaging unit. The present invention relates to a water hardness measurement system including application software capable of determining or calculating the water hardness from the imaged data of 1.
本開示によれば、一態様において、融合発光タンパク質を利用した水の硬度の測定方法を提供できる。
本開示によれば、その他の態様において、指示薬として１種類の融合発光タンパク質を用いる水の硬度の測定方法を提供できる。
According to the present disclosure, in one aspect, it is possible to provide a method for measuring water hardness using a fused photoprotein.
According to the present disclosure, in another aspect, it is possible to provide a method for measuring the hardness of water using one kind of fused photoprotein as an indicator.
本開示は、生体でカルシウム結合性のタンパク質、又は、マグネシウム結合タンパク質として機能するタンパク質が、水の硬度の測定に利用できるという知見に基づく。
本開示は、また、生体でカルシウム結合性のタンパク質、又は、マグネシウム結合タンパク質として機能するタンパク質は、水の硬度測定における濃度範囲では、カルシウム及びマグネシウムの両方を結合でき、１種類の発光タンパク質指示薬を利用して総硬度を測定できるという知見に基づく。
なお、本開示において、「カルシウムを結合すること」及び「マグネシウムを結合すること」は、特に言及がない場合、「カルシウムイオンを結合すること」及び「マグネシウムイオンを結合すること」を意味しうる。
The present disclosure is based on the finding that a protein that is calcium-binding in a living body or a protein that functions as a magnesium-binding protein can be used for measuring the hardness of water.
The present disclosure also discloses that a protein that functions as a calcium-binding protein in a living body or a protein that functions as a magnesium-binding protein can bind both calcium and magnesium in the concentration range of water hardness measurement, and can provide a single photoprotein indicator. Based on the finding that total hardness can be measured by utilizing
In the present disclosure, “binding calcium” and “binding magnesium” can mean “binding calcium ion” and “binding magnesium ion” unless otherwise specified. ..
本開示において、水の硬度とは、特に言及がない場合、水中のカルシウムイオン及びマグネシウムイオンの濃度から算出される総硬度を意味しうる。 In the present disclosure, the hardness of water may mean the total hardness calculated from the concentration of calcium ion and magnesium ion in water unless otherwise specified.
［発光タンパク質指示薬／融合発光タンパク質］
本開示において、発光タンパク質指示薬は、一又は複数の実施形態において、水の硬度を測定するためのカルシウムイオン及びマグネシウムイオンの濃度に応じた発光シグナルを発する指示薬をいう。
本開示において、発光タンパク質指示薬は、一又は複数の実施形態において、化学発光タンパク質の部分と、金属イオン結合タンパク質の部分と、蛍光タンパク質の部分とを有し、化学発光タンパク質部分と蛍光タンパク質部分との間に金属イオン結合タンパク質部分が連結されている融合発光タンパク質である。
本開示において、発光タンパク質指示薬は、一又は複数の実施形態において、特に言及がない場合、前記融合発光タンパク質そのものを意味しうる。本開示は、一態様において、化学発光タンパク質部分と、金属イオン結合タンパク質部分と、蛍光タンパク質部分とを有し、化学発光タンパク質部分と蛍光タンパク質部分との間に金属イオン結合タンパク質部分が連結されている融合発光タンパク質に関する。該融合発光タンパク質は、本開示に係る水の硬度を測定する方法において、発光タンパク質指示薬として使用できる。
[Photoprotein indicator/fusion photoprotein]
In the present disclosure, a photoprotein indicator refers to an indicator that emits a luminescence signal depending on the concentration of calcium ion and magnesium ion for measuring the hardness of water in one or a plurality of embodiments.
In the present disclosure, the luminescent protein indicator, in one or more embodiments, has a chemiluminescent protein portion, a metal ion-binding protein portion, and a fluorescent protein portion, and has a chemiluminescent protein portion and a fluorescent protein portion. It is a fusion photoprotein in which a metal ion-binding protein moiety is linked between.
In the present disclosure, a photoprotein indicator, in one or more embodiments, may mean the fusion photoprotein itself unless otherwise stated. The present disclosure, in one aspect, has a chemiluminescent protein portion, a metal ion-binding protein portion, and a fluorescent protein portion, wherein the metal ion-binding protein portion is linked between the chemiluminescent protein portion and the fluorescent protein portion. Fusion photoprotein. The fused photoprotein can be used as a photoprotein indicator in the method for measuring the hardness of water according to the present disclosure.
本開示において、融合発光タンパク質は、一又は複数の実施形態において、水の硬度を測定する観点から、前記金属イオン結合タンパク質部分にカルシウムイオン又はマグネシウムイオンが結合することで前記化学発光タンパク質部分から前記蛍光タンパク質部分へ共鳴エネルギー移動が可能になるように連結されていることが好ましい。
本開示において、前記共鳴エネルギー移動は、一態様において、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）である。
一又は複数の実施形態において、前記化学発光タンパク質の部分はＦＲＥＴのドナーとなるものであり、前記蛍光タンパク質の部分はＦＲＥＴのアクセプターとなるものである。
In the present disclosure, in one or a plurality of embodiments, the fusion luminescent protein comprises, from the viewpoint of measuring the hardness of water, binding of a calcium ion or a magnesium ion to the metal ion-binding protein portion to form the chemiluminescent protein portion. It is preferably linked so as to allow resonance energy transfer to the fluorescent protein moiety.
In the present disclosure, the resonance energy transfer is, in one aspect, Forster resonance energy transfer (FRET).
In one or more embodiments, the chemiluminescent protein moiety serves as a FRET donor and the fluorescent protein moiety serves as a FRET acceptor.
［化学発光タンパク質の部分］
本開示における「化学発光タンパク質の部分」は、一又は複数の実施形態において、化学発光タンパク質に由来する。本開示において、化学発光タンパク質は、一又は複数の実施形態において、特定の化学的基質の発光生成反応を触媒するタンパク質である。前記化学発光タンパク質としては、一又は複数の実施形態において、ルシフェラーゼ、イクオリン、オベリン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
[Chemiluminescent protein part]
The “portion of chemiluminescent protein” in the present disclosure is derived from chemiluminescent protein in one or more embodiments. In the present disclosure, a chemiluminescent protein is, in one or more embodiments, a protein that catalyzes a luminescent production reaction of a particular chemimetric substrate. The chemiluminescent proteins include luciferase, aequorin, obelin, and combinations thereof in one or more embodiments.
化学発光タンパク質は、自然界に存在するルシフェラーゼ、イクオリン、及びオベリンを単離又はクローニングしたものでもよく、それらの改変体であってもよい。化学発光タンパク質の改変体は、一又は複数の実施形態において、化学発光機能特性（例えば、発光強度、発光色）に影響のない部分に変異（例えば欠失及び／又は置換）があり、かつ、該変異がない状態と比較して実質的に同じあるいは類似した化学発光機能特性を有する化学発光タンパク質である。また、化学発光タンパク質の改変体は、一又は複数の実施形態において、化学発光機能特性に影響する部分に変異（例えば欠失及び／又は置換）があり、かつ、該変異がない状態と比較して実質的に異なる化学発光機能特性を有する化学発光タンパク質である。 The chemiluminescent protein may be luciferase, aequorin, and obelin which are present in nature isolated or cloned, or may be a modified form thereof. The chemiluminescent protein variant has, in one or more embodiments, a mutation (eg, deletion and/or substitution) in a portion that does not affect chemiluminescent functional properties (eg, luminescence intensity, luminescent color), and It is a chemiluminescent protein having substantially the same or similar chemiluminescent functional properties as compared to the state without the mutation. In addition, in one or more embodiments, the modified chemiluminescent protein has a mutation (eg, deletion and/or substitution) in a portion that affects the chemiluminescent functional property, and is compared with a state in which there is no mutation. And a chemiluminescent protein having substantially different chemiluminescent functional properties.
ルシフェラーゼとしては、限定されない一又は複数の実施形態において、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ）、深海エビルシフェラーゼ（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ）、ウミホタルルシフェラーゼ（Ｖａｒｇｕｌａ／Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼ）、カイアシルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、Ｍｅｔｒｉｄｉａルシフェラーゼ）、渦鞭毛藻類ルシフェラーゼ、発光キノコ（ヤコウタケ：Ｍｙｃｅｎａ ｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓ、ツキヨタケ：Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｊａｐｉｎｉｃｕｓ）のルシフェラーゼ、サクラエビのルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ（Ｐｈｏｔｉｎｕｓルシフェラーゼ）、バクテリアルシフェラーゼ、Ａｋａｌｕｃ、Ｔｕｒｂｏｌｕｃなどが挙げられる。 The luciferase, in one or more embodiments without limitation, Renilla luciferase (Renilla luciferase), deep-sea shrimp luciferase (Oplophorus luciferase), Cypridina luciferase (Vargula / Cypridina luciferase), Kai reed luciferase (Gaussia luciferase, Metridia luciferase), vortex Luciferase from flagellated luciferase, luminescent mushrooms (Mycena chlorophos, Omphalotus japinicus), luciferase from cherry shrimp, firefly luciferase (Photinus luciferase), etc.
本開示において「化学発光タンパク質の部分」とは、融合発光タンパク質に組み込まれて（融合されて）いる化学発光タンパク質又はその一部をいう。「化学発光タンパク質の部分」は、化学発光タンパク質の全体でもよく、その一部でもよい。化学発光タンパク質の一部とは、一又は複数の実施形態において、Ｎ末端及び／又はＣ末端の一部が欠失しており、かつ、欠失していない状態と比較して実質的に同じあるいは類似した化学発光機能特性（例えば、発光強度、発光色）を有する前記化学発光タンパク質の部分である。
本開示における化学発光タンパク質は、市販のものを使用できる。
In the present disclosure, “a chemiluminescent protein portion” refers to a chemiluminescent protein or a part thereof that is incorporated (fused) in a fused light emitting protein. The “part of the chemiluminescent protein” may be the whole chemiluminescent protein or a part thereof. The part of the chemiluminescent protein is, in one or a plurality of embodiments, substantially the same as a state in which a part of the N-terminus and/or the C-terminus is deleted and is not deleted. Alternatively, it is a portion of the chemiluminescent protein having similar chemiluminescent functional properties (eg, luminescence intensity, luminescence color).
As the chemiluminescent protein in the present disclosure, a commercially available one can be used.
［発光基質］
本開示において、発光基質とは、本開示における化学発光タンパク質の発光基質をいう。例えば、ルシフェラーゼの発光基質は、ルシフェリンとよばれる。
一般的に、化学発光タンパク質と発光基質とは特異的な組み合わせであり、当業者であれば、化学発光タンパク質に対応する発光基質（ルシフェラーゼに対応するルシフェリン）を理解でき、あるいは、発光基質に対応する化学発光タンパク質（ルシフェリンに対応するルシフェラーゼ）を理解できる。
前記発光基質としては、限定されない一又は複数の実施形態において、ホタルルシフェリン、バクテリアルルシフェリン、渦鞭毛藻類ルシフェリン、ヴァルグリン、セレンテラジン（Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）、ＡｋａＬｕｍｉｎｅ−ＨＣｌ及びこれらの改変体、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。
[Luminescent substrate]
In the present disclosure, the luminescent substrate refers to the luminescent substrate of the chemiluminescent protein according to the present disclosure. For example, the luminescent substrate for luciferase is called luciferin.
Generally, a chemiluminescent protein and a luminescent substrate are a specific combination, and a person skilled in the art can understand a luminescent substrate corresponding to a chemiluminescent protein (luciferin corresponding to luciferase), or a luminescent substrate. The chemiluminescent protein (luciferase corresponding to luciferin) that understands can be understood.
As the luminescent substrate, in one or a plurality of non-limiting embodiments, firefly luciferin, bacterial luciferin, dinoflagellate luciferin, valgulin, coelenterazine, AkaLumine-HCl and variants thereof, and combinations thereof are used. Can be mentioned.
ホタルルシフェリン、バクテリアルルシフェリン、渦鞭毛藻類ルシフェリン、及びヴァルグリンは、それぞれ、ホタルルシフェラーゼ、バクテリアルシフェラーゼ、渦鞭毛藻類ルシフェラーゼ、及びウミホタルルシフェラーゼ（Ｖａｒｇｕｌａ／Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼ）のルシフェリンとなりうる。
また、セレンテラジンは、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ）、深海エビルシフェラーゼ（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ）、カイアシルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ）、イクオリン、及びオベリンの基質となりうる。
前記発光基質は、自然界に存在する基質を単離又は合成したものでもよく、それらの改変体であってもよい。
Firefly luciferin, bacterial luciferin, dinoflagellate luciferin, and vargulin can be luciferins of firefly luciferase, bacterial luciferase, dinoflagellate luciferase, and Cypridina luciferase, respectively.
In addition, coelenterazine can be a substrate for Renilla luciferase (Renilla luciferase), deep-sea luciferase (Oplophorus luciferase), kaisyl luciferase (Gaussia luciferase), aequorin, and oberin.
The luminescent substrate may be a naturally occurring substrate isolated or synthesized, or a modified form thereof.
［蛍光タンパク質の部分］
本開示における「蛍光タンパク質の部分」は、一又は複数の実施形態において、蛍光タンパク質に由来する。本開示において、蛍光タンパク質は、一又は複数の実施形態において、上述したドナーである化学発光タンパク質のエネルギーのアクセプターとして機能することができ、ドナーのエネルギーを吸収して蛍光発光できるものが挙げられる。前記蛍光タンパク質は、一又は複数の実施形態において、前記化学発光タンパク質の発光の強度を強めるか、又は、発光の色を変更できるものが挙げられる。
蛍光タンパク質は、自然界に存在するものを単離又はクローニングしたものでもよく、市販されているものでもよく、それらの改変体であってもよい。様々な色の蛍光タンパク質が開発されており、これらを利用することで、本開示に係る融合発光タンパク質の発光の色を様々に設計することができる。
蛍光タンパク質の改変体は、一又は複数の実施形態において、蛍光特性（例えば、発光強度、発光色）に影響のない部分に変異（例えば欠失及び／又は置換）があり、かつ、該変異がない状態と比較して実質的に同じあるいは類似した蛍光特性を有する蛍光タンパク質である。また、蛍光タンパク質の改変体は、一又は複数の実施形態において、蛍光特性（例えば、発光強度、発光色）に影響する部分に変異（例えば欠失及び／又は置換）があり、かつ、該変異がない状態と比較して実質的に異なる蛍光特性を有する蛍光タンパク質である。
[Fluorescent protein part]
The "portion of fluorescent protein" in the present disclosure is derived from a fluorescent protein in one or more embodiments. In the present disclosure, in one or a plurality of embodiments, the fluorescent protein can function as an acceptor of energy of the chemiluminescent protein that is the above-described donor, and can absorb the energy of the donor and emit fluorescence. In one or a plurality of embodiments, examples of the fluorescent protein include those capable of increasing the intensity of luminescence of the chemiluminescent protein or changing the color of luminescence.
The fluorescent protein may be a naturally occurring protein isolated or cloned, a commercially available protein, or a modified form thereof. Fluorescent proteins of various colors have been developed, and by utilizing these, various colors of luminescence of the fusion luminescent protein according to the present disclosure can be designed.
In one or a plurality of embodiments, the variant of the fluorescent protein has a mutation (for example, deletion and/or substitution) in a portion that does not affect the fluorescence property (for example, emission intensity, emission color), and the mutation is It is a fluorescent protein that has substantially the same or similar fluorescent properties compared to the absence. In one or a plurality of embodiments, the variant of the fluorescent protein has a mutation (for example, deletion and/or substitution) in a portion that affects the fluorescent property (for example, emission intensity, emission color), and the mutation It is a fluorescent protein having substantially different fluorescence properties as compared to the absence thereof.
。
蛍光タンパク質としては、限定されない一又は複数の実施形態において、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質、及び赤色蛍光タンパク質が挙げられ、より具体的な限定されない一又は複数の実施形態において、Azurite, bsDronpa, Cerulean, Citrine, Clover, CyOFP1, Dendra2, Dreiklang, Dronpa2, Dronpa3, DsRed, EBFP, EBFP2, ECFP, EGFP, Emerald, eqFP650, eqFP670, EYFP, Fast-FT, FusionRed, Gamillus, hmKeima8.5, IFP1.4, IFP2.0, iRFP670, iRFP682, iRFP702, iRFP713, iRFP720, Kaeda, KikGR, Kohinoor, LSSmCherry, LSSmKate2, LSSmOrange, mAG1, mAmetrine, mAmetrine1.2, mApple, mBlueberry2, mCardinal, mCerulean3, mCherry, mCherry2, mClover3, mCyRFP1, Medium-FT, mEOS2, mEOS3.1, mEOS3.2, mGarnet2, mIFP2, miniSOG, miRFP670, miRFP720, mKalama1, mKate2, mK-GO, mKOkappa, mKO1, mKO2, mlris, mMaroon1, mNeonGreen, mNeptune, mNeptune2, mNeptune2.5, mNeptune681, mNeptune684, mOrange, mOrange2, mPlum, mRFP1, mRuby2, mRuby3, mScarlet, mScarlet-H, mScarlet-I, mStable, mStrawberry, mTagBFP2, mTFP1, mTurquoise, mTurquoise2, Neptune, NowGFP, oxFP series, Padron, PA-GFP, PAmCherry1, PAmCherry2, PAmCherry3, Phanta, PS-CFP, PS-CFP2, PSLSSmKate, PSmOrange, RDSmCherry1, rsCherry, rsEGFP, rsEGFP2, rsTagRFP, SBFP2, shyRFP, Sirius, skylan NS, skylan S, Slow-FT, SPOON, TagBFP, TagCFP, TagFP635, TagGFP, TagGFP2, TagRFP, TagRFP657, TagRFP675, TagRFP-T, TagYFP, T-Sapphire, TurboFP602, TurboGFP, TurboRFP, TurboYFP, UnaG, Venus、並びにこれらの円順列変異体などが挙げられる。これらの蛍光タンパク質の詳細は、例えば、https://sites.google.com/site/ilovegfp/Home/fpsなどを参照できる。
..
Fluorescent proteins include, in one or more non-limiting embodiments, green fluorescent proteins, blue fluorescent proteins, cyan fluorescent proteins, yellow-green fluorescent proteins, yellow fluorescent proteins, orange fluorescent proteins, and red fluorescent proteins, and more specifically. In one or more non-limiting embodiments, Azurite, bsDronpa, Cerulean, Citrine, Clover, CyOFP1, Dendra2, Dreiklang, Dronpa2, Dronpa3, DsRed, EBFP, EBFP2, ECFP, EGFP, Emerald, eqFP650, eqFP670, EYFP, Fast-FT, FusionRed, Gamillus, hmKeima8.5, IFP1.4, IFP2.0, iRFP670, iRFP682, iRFP702, iRFP713, iRFP720, Kaeda, KikGR, Kohinoor, LSSmCherry, LSSmKate2, LSSmOrange, mAG1, mAmetrine, mAmetrine1.2, mApple, mBlueberry2, mCardinal, mCerulean3, mCherry, mCherry2, mClover3, mCyRFP1, Medium-FT, mEOS2, mEOS3.1, mEOS3.2, mGarnet2, mIFP2, miniSOG, miRFP670, miRFP720, mKalama1, mKate2, mKapp mKO1, mKO2, mlris, mMaroon1, mNeonGreen, mNeptune, mNeptune2, mNeptune2.5, mNeptune681, mNeptune684, mOrange, mOrange2, mPlum, mRFP1, mRuby2, mRuby3, mScarlet, mScarlet-H, mScarlet-Str, m,Stable, mScarlet-B,mStable, mSeplet mTFP1, mTurquoise, mTurquoise2, Neptune, NowGFP, oxFP series, Padron, PA-GFP, PAmCherry1, PAmChe rry2, PAmCherry3, Phanta, PS-CFP, PS-CFP2, PSLSSmKate, PSmOrange, RDSmCherry1, rsCherry, rsEGFP, rsEGFP2, rsTagRFP, SBFP2, shyRFP, Sirius, skylan NS, skylan S, Slow-FT, SPOON, TagBFP. Examples include TagFP635, TagGFP, TagGFP2, TagRFP, TagRFP657, TagRFP675, TagRFP-T, TagYFP, T-Sapphire, TurboFP602, TurboGFP, TurboRFP, TurboYFP, UnaG, Venus, and circular permutants thereof. For details of these fluorescent proteins, refer to, for example, https://sites.google.com/site/ilovegfp/Home/fps.
本開示において「蛍光タンパク質の部分」とは、融合発光タンパク質に組み込まれて（融合されて）いる蛍光タンパク質又はその一部をいう。「蛍光タンパク質の部分」は、蛍光タンパク質の全体でもよく、その一部でもよい。蛍光タンパク質の一部とは、一又は複数の実施形態において、Ｎ末端及び／又はＣ末端の一部が欠失しており、かつ、欠失していない状態と比較して実質的に同じあるいは類似した蛍光特性を有する蛍光タンパク質の部分である。
本開示における蛍光タンパク質は、市販のものを使用してもよい。
In the present disclosure, the “portion of fluorescent protein” refers to a fluorescent protein or a part thereof which is incorporated (fused) in a fused luminescent protein. The “portion of the fluorescent protein” may be the whole fluorescent protein or a part thereof. In one or a plurality of embodiments, a part of the fluorescent protein means that a part of the N-terminal and/or the C-terminal is deleted, and the fluorescent protein is substantially the same as the undeleted state. It is a portion of a fluorescent protein that has similar fluorescent properties.
Commercially available fluorescent proteins may be used in the present disclosure.
［金属イオン結合タンパク質の部分］
本開示における金属イオン結合タンパク質部分は、一又は複数の実施形態において、金属イオン結合タンパク質に由来する。本開示において、金属イオン結合タンパク質は、一又は複数の実施形態において、水の硬度を測定する際に、水中のカルシウム及びマグネシウムと結合性を有するタンパク質である。金属イオン結合タンパク質は、さらなる一又は複数の実施形態において、水の硬度を測定する際に、水中のカルシウム又はマグネシウムと結合することで構造変化を生じるタンパク質である。
[Metal ion binding protein part]
The metal ion-binding protein portion in the present disclosure is, in one or more embodiments, derived from a metal ion-binding protein. In the present disclosure, the metal ion-binding protein is a protein having a binding property to calcium and magnesium in water when measuring hardness of water in one or a plurality of embodiments. In one or more further embodiments, the metal ion-binding protein is a protein that causes a structural change by binding with calcium or magnesium in water when measuring the hardness of water.
金属イオン結合タンパク質としては、生体又は細胞において、カルシウム結合タンパク質、若しくは、マグネシウム結合タンパク質として知られているタンパク質、又はそれらの改変体が挙げられる。
生体又は細胞においてカルシウムを結合しうる機能を有するタンパク質、及び、マグネシウムを結合しうる機能を有するタンパク質は、水の硬度を測定する場合のカルシウム濃度及びマグネシウム濃度では、カルシウム及びマグネシウムの双方と結合しうるタンパク質として機能するという知見に、本開示は一態様において基づく。
本開示に係る融合発光タンパク質は、このような金属イオン結合タンパク質部分を有することにより、一又は複数の実施形態において、１種類の融合発光タンパク質によってでも、水の硬度が測定できるようになる。
Examples of metal ion-binding proteins include proteins known as calcium-binding proteins or magnesium-binding proteins in living organisms or cells, or modified forms thereof.
A protein having a function of binding calcium in a living body or a cell and a protein having a function of binding magnesium bind to both calcium and magnesium at the calcium concentration and the magnesium concentration when measuring the hardness of water. The present disclosure is based, in one aspect, on the finding that it functions as a toxic protein.
Since the fused photoprotein according to the present disclosure has such a metal ion-binding protein portion, in one or a plurality of embodiments, the hardness of water can be measured even by one type of fused photoprotein.
金属イオン結合タンパク質としては、２価の金属陽イオン結合ドメインを有するタンパク質が挙げられる。
２価の金属イオンとしては、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンが挙げられる。２価の金属陽イオン結合ドメインとしては、一又は複数の実施形態において、カルシウム結合ドメインが挙げられる。
カルシウム結合ドメインとしては、一又は複数の実施形態において、ＥＦハンドモチーフ、ドッケリンモチーフが挙げられる。
より具体的な限定されない一又は複数の実施形態において、金属イオン結合タンパク質としては、水の硬度を測定する観点から、Ｃｅｎ３、カルモジュリン、Ｔｗｉｔｃｈ−３などが挙げられ、好ましくはＣｅｎ３が挙げられる。
Examples of the metal ion binding protein include proteins having a divalent metal cation binding domain.
Examples of the divalent metal ion include calcium ion and/or magnesium ion. The divalent metal cation binding domain, in one or more embodiments, includes a calcium binding domain.
Examples of the calcium-binding domain include an EF hand motif and a dockerin motif in one or more embodiments.
In one or more more specific non-limiting embodiments, examples of the metal ion-binding protein include Cen3, calmodulin, and Twitch-3, and preferably Cen3, from the viewpoint of measuring the hardness of water.
前記金属イオン結合タンパク質は、一又は複数の実施形態において、水の硬度を測定する観点から、カルシウムとの結合定数Ｋａは、０．２５ｍＭ〜２．５ｍＭが好ましく、マグネシウムとの結合定数Ｋａは、０．４１ｍＭ〜１．２５ｍＭが好ましい。 In one or a plurality of embodiments, the metal ion-binding protein preferably has a binding constant Ka with calcium of 0.25 mM to 2.5 mM, and a binding constant Ka with magnesium of from the viewpoint of measuring the hardness of water. 0.41 mM-1.25 mM is preferable.
前記金属イオン結合タンパク質は、一又は複数の実施形態において、生体又は細胞においてカルシウム結合タンパク質、又は、マグネシウム結合タンパク質として知られているタンパク質を単離又はクローニングしたものでもよく、それらの改変体であってもよい。該タンパク質の改変体は、一又は複数の実施形態において、カルシウム及びマグネシウムへの結合能に影響のない部分に変異（例えば欠失及び／又は置換）があり、かつ、該変異がない状態と比較して実質的に同じあるいは類似したカルシウム及びマグネシウムへの結合能を有するタンパク質である。また、該タンパク質の改変体は、一又は複数の実施形態において、カルシウム及びマグネシウムへの結合能に影響する部分に変異（例えば欠失及び／又は置換）があり、かつ、該変異がない状態と比較して実質的に異なるカルシウム及びマグネシウムへの結合能を有するタンパク質である。 In one or a plurality of embodiments, the metal ion-binding protein may be a protein known as a calcium-binding protein or a magnesium-binding protein isolated or cloned in a living body or a cell, and is a modified form thereof. May be. In one or more embodiments, the variant of the protein has a mutation (eg, deletion and/or substitution) in a portion that does not affect the binding ability to calcium and magnesium, and is compared with a state in which there is no mutation. It is a protein having substantially the same or similar binding ability to calcium and magnesium. In one or a plurality of embodiments, the variant of the protein has a mutation (for example, deletion and/or substitution) in a portion that affects the binding ability to calcium and magnesium, and has no mutation. It is a protein having binding ability to calcium and magnesium which are substantially different from each other.
本開示において、「金属イオン結合タンパク質の部分」とは、融合発光タンパク質に組み込まれて（融合されて）いる金属イオン結合タンパク質又はその一部をいう。「金属イオン結合タンパク質の部分」は、金属イオン結合タンパク質の全体でもよく、その一部でもよい。金属イオン結合タンパク質の一部とは、一又は複数の実施形態において、Ｎ末端及び／又はＣ末端の一部が欠失しており、かつ、欠失していない状態と比較して実質的に同じあるいは類似したカルシウム及びマグネシウムへの結合能を有する前記金属イオン結合タンパク質の部分である。 In the present disclosure, the “portion of the metal ion-binding protein” refers to the metal ion-binding protein incorporated in (fused to) the fusion photoprotein or a part thereof. The “part of the metal ion-binding protein” may be the whole metal ion-binding protein or a part thereof. The part of the metal ion-binding protein is, in one or a plurality of embodiments, a part of the N-terminal and/or the C-terminal is deleted, and is substantially equivalent to a state in which it is not deleted. It is a portion of the metal ion-binding protein having the same or similar binding ability to calcium and magnesium.
本開示に係る融合発光タンパク質における前記３つの部分の連結順序は、一又は複数の実施形態において、Ｎ末端側から、化学発光タンパク質部分、金属イオン結合タンパク質部分、及び蛍光タンパク質部分の順であってもよく、Ｎ末端側から、蛍光タンパク質部分、金属イオン結合タンパク質部分、及び化学発光タンパク質部分の順であってもよい。 In one or a plurality of embodiments, the order of connecting the three parts in the fusion luminescent protein according to the present disclosure is, in order from the N-terminal side, a chemiluminescent protein part, a metal ion-binding protein part, and a fluorescent protein part. The fluorescent protein portion, the metal ion-binding protein portion, and the chemiluminescent protein portion may be arranged in this order from the N-terminal side.
本開示に係る融合発光タンパク質は、一又は複数の実施形態において、水の硬度を測定する観点から、化学発光タンパク質部分と、金属イオン結合タンパク質部分と、蛍光タンパク質部分とが、以下の条件を満たすように融合（連結）されていることが好ましい。
（１）金属イオン結合タンパク質部分にカルシウムイオン又はマグネシウムイオンが結合していない場合、化学発光タンパク質部分から蛍光タンパク質部分へ共鳴エネルギー移動が起こらず、発光基質を加えても化学発光タンパク質の発光しか起こらない。
（２）金属イオン結合タンパク質部分にカルシウムイオン又はマグネシウムイオンが結合した場合、金属イオン結合タンパク質部分の構造が変化し、化学発光タンパク質部分から蛍光タンパク質部分へ共鳴エネルギー移動が可能になり、発光基質が加えられると蛍光発光が起こる。
一又は複数の実施形態において、前記３つの部分の連結する際に、各部分のＮ末端及びＣ末端の少なくとも一端から、１〜１０個のアミノ酸配列を欠失させることにより、上記（１）及び（２）の条件を満たしやすくすることができる。
In one or a plurality of embodiments, in the fusion luminescent protein according to the present disclosure, the chemiluminescent protein portion, the metal ion-binding protein portion, and the fluorescent protein portion satisfy the following conditions from the viewpoint of measuring the hardness of water. Are preferably fused (connected) as described above.
(1) When calcium ion or magnesium ion is not bound to the metal ion-binding protein portion, resonance energy transfer does not occur from the chemiluminescent protein portion to the fluorescent protein portion, and even if a luminescent substrate is added, only chemiluminescent protein light emission occurs. Absent.
(2) When calcium ion or magnesium ion is bound to the metal ion-binding protein portion, the structure of the metal ion-binding protein portion is changed, resonance energy transfer from the chemiluminescent protein portion to the fluorescent protein portion becomes possible, and the luminescent substrate becomes Fluorescence emission occurs when added.
In one or a plurality of embodiments, when ligating the three parts, by deleting 1 to 10 amino acid sequences from at least one end of the N-terminal and C-terminal of each part, the above (1) and The condition (2) can be easily satisfied.
本開示に係る融合発光タンパク質は、一又は複数の実施形態において、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質であってもよいし、化学合成により合成したタンパク質であってもよい。遺伝子組み換え技術による組み換えタンパク質の作製としては、一又は複数の実施形態において、本開示に係る融合発光タンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主を用いて作製する方法、或いは、無細胞系で作製する方法が挙げられる。本開示に係る融合発光タンパク質は、タグタンパク質を利用するなどして精製してもよい。 The fused luminescent protein according to the present disclosure may be a recombinant protein produced by a gene recombination technique or a protein synthesized by chemical synthesis in one or more embodiments. In one or a plurality of embodiments, a recombinant protein can be produced by a gene recombination technique by using a host transformed with an expression vector containing a gene encoding the fusion luminescent protein according to the present disclosure, or Examples include a method of producing in a cell line. The fused luminescent protein according to the present disclosure may be purified by using a tag protein.
［水の硬度の測定方法］
本開示に係る水の硬度の測定方法は、本開示に係る発光タンパク質指示薬（融合発光タンパク質）に測定試料である水と発光基質とを接触させること、及び、前記発光タンパク質指示薬の発光シグナルから水の硬度を判定又は算出することを含む。
硬度を測定する水としては、従来、硬度が測定されており、硬度の変動幅が予想できる水が挙げられる。硬度を測定する水としては、特に制限されないが、飲料水、水道水、湧水、井戸水、流水、地下水、工業用水などが挙げられる。
本開示に係る発光タンパク質指示薬が水及び発光基質と接触すると、カルシウム及びマグネシウム濃度に依存した発光が生ずる。この発光のシグナルに基づいて水の硬度を測定する。
発光のシグナルに基づく水の硬度の測定は、一又は複数の実施形態において、発光シグナルデータに基づく計算に基づいてもよい。例えば、携帯情報端末に発光シグナルテータを取り込み、該データを携帯情報末端のアプリ等で、あるいは、ネットを介して、測定を行うことが挙げられる。
発光のシグナルに基づく水の硬度の測定は、一又は複数の実施形態において、化学発光タンパク質の発光強度と蛍光タンパク質の発光強度とを測定し、それらの比を指標とすることを含む。発光強度の比に基づいた検量線を予め作成しておいてもよい。
発光のシグナルに基づく水の硬度の測定は、一又は複数の実施形態において、発光の様子を撮像して撮像データに変換し、該データの解析値を指標とすることを含む。例えば、撮像データから化学発光タンパク質に由来する色の輝度と蛍光タンパク質に由来する色の輝度とを得て、それらの比を指標とすることを含む。輝度の比に基づいた検量線を予め作成しておいてもよい。撮像データを用いた水の硬度の測定は、一又は複数の実施形態において、撮像データを得るためのカメラと、該撮像データを解析して水の硬度を測定するアプリケーションソフトウェアを備えた情報端末機（例えば、スマートフォン）によって簡便に行うことができる。
発光のシグナルに基づく水の硬度の測定は、一又は複数の実施形態において、発光の様子をあらかじめ発光色で分類された表などと比べて目視で行ってもよい。
本開示において、水の硬度の測定とは、一又は複数の実施形態において、水の硬度の判定、及び／又は、水の硬度の算出を意味しうる。水の硬度は、国によって異なる算出方法を採用する場合があるが、カルシウム濃度及びマグネシウム濃度を算出の基礎とする点で共通するから、その算出方法に合わせて、適宜、適切な水の硬度の判定、及び／又は、算出が可能である。水の硬度の計算方法の一又は複数の実施形態は、水中のカルシウム及びマグネシウムをＣａＣＯ３に換算した値（ｍｇ／Ｌ）として算出する方法が挙げられる。
本開示において、水の硬度の判定は、一又は複数の実施形態において、軟水と硬水のいずれかに属するか判定をすること、軟水、中硬水、硬水及び超硬水のいずれかに属するか判定すること、あるいは、所定の硬度範囲に属するかどうかの判定をすることを含む。
[Measurement method of water hardness]
The method for measuring the hardness of water according to the present disclosure includes contacting a luminescent protein indicator (fused luminescent protein) according to the present disclosure with water as a measurement sample and a luminescent substrate, and measuring the water content from the luminescent signal of the luminescent protein indicator. Determining or calculating the hardness of.
As the water for measuring the hardness, water whose hardness has been conventionally measured and whose fluctuation range can be expected can be mentioned. The water for measuring the hardness is not particularly limited, and examples thereof include drinking water, tap water, spring water, well water, running water, ground water, industrial water and the like.
When the photoprotein indicator according to the present disclosure comes into contact with water and a luminescent substrate, luminescence that depends on calcium and magnesium concentration occurs. The hardness of water is measured based on this luminescence signal.
The measurement of water hardness based on the luminescence signal may, in one or more embodiments, be based on calculations based on the luminescence signal data. For example, it is possible to incorporate a luminescence signal data into a portable information terminal and measure the data with an application or the like at the end of the portable information or via the net.
The measurement of water hardness based on the luminescence signal includes, in one or a plurality of embodiments, measuring the luminescence intensity of the chemiluminescent protein and the luminescence intensity of the fluorescent protein and using the ratio thereof as an index. A calibration curve based on the emission intensity ratio may be created in advance.
In one or a plurality of embodiments, measuring the hardness of water based on a luminescence signal includes capturing an image of the state of luminescence, converting it into imaging data, and using an analysis value of the data as an index. For example, it includes obtaining the luminance of the color derived from the chemiluminescent protein and the luminance of the color derived from the fluorescent protein from the imaging data and using the ratio thereof as an index. A calibration curve based on the brightness ratio may be created in advance. In one or a plurality of embodiments, the measurement of water hardness using imaged data includes an information terminal device including a camera for obtaining imaged data and application software for analyzing the imaged data and measuring water hardness. (For example, a smartphone) can be easily performed.
In one or a plurality of embodiments, the hardness of water based on the luminescence signal may be visually measured by comparing the state of luminescence with a table in which the luminescence colors are classified in advance.
In the present disclosure, measurement of water hardness may mean determination of water hardness and/or calculation of water hardness in one or more embodiments. Although different hardness calculation methods may be used depending on the country, they are common in that they use calcium and magnesium concentrations as the basis for calculation. It can be judged and/or calculated. One or more embodiments of the method of calculating the hardness of water include a method of calculating calcium and magnesium in water as CaCO 3 converted values (mg/L).
In the present disclosure, the determination of the hardness of water is, in one or a plurality of embodiments, determining whether it belongs to soft water or hard water, and determining whether it belongs to any of soft water, medium hard water, hard water, and super hard water. Or determining whether or not it belongs to a predetermined hardness range.
［デバイス］
本開示に係る水の硬度の測定方法における、本開示に係る発光タンパク質指示薬に測定試料である水と発光基質とを接触させることは、デバイスを利用できる。
本開示に係るデバイスは、一又は複数の実施形態において、本開示に係る発光タンパク質指示薬及び該指示薬の発光基質が配置された試薬部と、前記試薬部が形成された基材とを有する。
試薬部には、少なくとも、本開示に係る発光タンパク質指示薬と発光基質とが配置される。
[device]
In the method for measuring the hardness of water according to the present disclosure, a device can be used to bring the photoprotein indicator according to the present disclosure into contact with water as a measurement sample and a luminescent substrate.
A device according to the present disclosure has, in one or a plurality of embodiments, a reagent part in which the photoprotein indicator according to the present disclosure and a luminescent substrate of the indicator are arranged, and a base material on which the reagent part is formed.
At least the photoprotein indicator according to the present disclosure and a luminescent substrate are arranged in the reagent part.
本開示に係るデバイスにおいて、発光タンパク質指示薬と発光基質とは、独立して配置されている。発光タンパク質指示薬と発光基質とは、一又は複数の実施形態において、これらが配置された試薬部に水を供給すると、発光タンパク質指示薬と発光基質とが反応して発光シグナルを発生可能なように配置されている。これにより、試薬部に水を供給すると、発光タンパク質指示薬と発光基質とが接触（混合）して発光シグナルを生じさせることができる。このような構成を有する本開示のデバイスによれば、一又は複数の実施形態において、より高いシグナル・ノイズ比を有し、また、励起光が不要であるため特別な測定装置や測定設備が不要であるという効果を好ましくは奏しうる。また、本開示のデバイスによれば、一又は複数の実施形態において、ユーザーが、自身が所持する携帯情報端末等の撮像手段によって撮像することにより、生じる発光シグナルを検出することができ、またそのユーザーが撮像することにより得られたデータを用いて迅速な測定、判定又は診断等を行うことができる。 In the device according to the present disclosure, the photoprotein indicator and the luminescent substrate are arranged independently. In one or a plurality of embodiments, the photoprotein indicator and the luminescent substrate are arranged such that when water is supplied to the reagent part in which they are arranged, the photoprotein indicator and the luminescent substrate react with each other to generate a luminescent signal. Has been done. Thereby, when water is supplied to the reagent part, the luminescent protein indicator and the luminescent substrate can come into contact (mix) with each other to generate a luminescent signal. According to the device of the present disclosure having such a configuration, in one or a plurality of embodiments, it has a higher signal-to-noise ratio, and since no excitation light is required, no special measurement device or measurement equipment is required. The effect of being preferably can be exhibited. Further, according to the device of the present disclosure, in one or a plurality of embodiments, a user can detect a luminescence signal generated by capturing an image with an image capturing unit such as a portable information terminal owned by the user, and It is possible to perform quick measurement, determination, diagnosis, etc. using the data obtained by the user capturing an image.
本開示において「独立して配置」としては、一又は複数の実施形態において、発光タンパク質指示薬と発光基質とが、試料等の液体が接触することなしに反応が生じない状態で配置されていることが挙げられる。独立して配置としては、一又は複数の実施形態において、隣接する発光タンパク質指示薬と発光基質とが物理的に（あるいは空間的に）分離して配置されていることが挙げられる。また、独立して配置は、一又は複数の実施形態において、発光タンパク質指示薬と発光基質とが反応しない状態（例えば乾燥状態）であれば、互いに接触して配置された形態を含みうる。 In the present disclosure, "independently arranged" means that, in one or a plurality of embodiments, the photoprotein indicator and the luminescent substrate are arranged in a state in which a reaction does not occur without contact with a liquid such as a sample. Are listed. As the independent arrangement, in one or a plurality of embodiments, adjacent photoprotein indicator and luminescent substrate are physically (or spatially) separated from each other. In addition, in one or a plurality of embodiments, the independent placement may include a configuration in which the photoprotein indicator and the luminescent substrate are placed in contact with each other as long as they do not react (for example, in a dry state).
発光タンパク質指示薬及び発光基質は、一又は複数の実施形態において、パターニングされて配置されていてもよい。パターニングの形状としては、一又は複数の実施形態において、ドット状、ライン状、又はサークル状等が挙げられる。発光タンパク質指示薬と発光基質との接触率を高め、より高い発光シグナルを発生させる点から、一又は複数の実施形態において、発光タンパク質指示薬と発光基質とが交互にかつモザイク状にパターニングされていることが好ましい。再現性を向上できる点から、パターニングは微細であることが好ましい。 The photoprotein indicator and the luminescent substrate may be patterned and arranged in one or more embodiments. As the patterning shape, in one or a plurality of embodiments, a dot shape, a line shape, a circle shape, or the like can be given. In order to increase the contact rate between the photoprotein indicator and the luminescence substrate and generate a higher luminescence signal, in one or more embodiments, the photoprotein indicator and the luminescence substrate are alternately and mosaic-patterned. Is preferred. From the viewpoint of improving reproducibility, fine patterning is preferable.
本開示のデバイスにおいて、試薬部は基材に形成されている。試薬部は、一又は複数の実施形態において、１枚の基材の同一平面に形成されていてもよいし、２枚の基材によって挟み込まれるように形成されていてもよい。 In the device of the present disclosure, the reagent portion is formed on the base material. In one or a plurality of embodiments, the reagent part may be formed on the same plane of one base material, or may be formed so as to be sandwiched between two base materials.
図５に、特に限定されないパターニングの形状を例示する。図５Ａでは、１枚の基材１１上にドット状の発光タンパク質指示薬１３及び発光基質１４が交互にモザイク状にパターニングされることにより試薬部１２が形成されている。図５Ｂでは、２枚の基材１１の一方の面に発光タンパク質指示薬１３と発光基質１４とがそれぞれドット状にパターニングされ、発光タンパク質指示薬３と発光基質１４とがパターニングされた面が向かい合うように２枚の基材１１が配置されることにより試薬部１２が形成されている。図５Ｃ及びＤでは、それぞれ、１枚の基材１１上に発光タンパク質指示薬１３と発光基質１４とがライン状又はサークル状にパターニングされることにより試薬部１２が形成されている。 FIG. 5 illustrates a patterning shape which is not particularly limited. In FIG. 5A, the reagent portion 12 is formed by alternately patterning the dot-shaped photoprotein indicator 13 and the luminescent substrate 14 on one substrate 11 in a mosaic pattern. In FIG. 5B, the photoprotein indicator 13 and the luminescent substrate 14 are dot-patterned on one surface of each of the two substrates 11, and the photoprotein indicator 3 and the luminescent substrate 14 are arranged so that the patterned surfaces face each other. The reagent portion 12 is formed by disposing the two base materials 11. In each of FIGS. 5C and 5D, the reagent portion 12 is formed by patterning the photoprotein indicator 13 and the luminescent substrate 14 on one substrate 11 in a line shape or a circle shape.
発光タンパク質指示薬及び発光基質は、水の供給前に発光タンパク質指示薬と発光基質とが反応することを低減する点から、一又は複数の実施形態において、乾燥状態であることが好ましい。 The photoprotein indicator and the luminescent substrate are preferably in a dry state in one or a plurality of embodiments from the viewpoint of reducing the reaction between the photoprotein indicator and the luminescent substrate before the supply of water.
基材の材質は、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態において、パラフィン、テフロン（登録商標）等のフッ素系材料、ガラス、ポリプロピレン、織布、不織布、及び紙等が挙げられる。基材の材質は、高い発光シグナルを検出できる点から、一又は複数の実施形態において、疎水性であることが好ましい。 The material of the base material is not particularly limited, and in one or a plurality of embodiments, paraffin, a fluorine-based material such as Teflon (registered trademark), glass, polypropylene, woven cloth, non-woven cloth, paper, and the like can be given. .. The material of the base material is preferably hydrophobic in one or a plurality of embodiments from the viewpoint that a high luminescence signal can be detected.
［デバイスの製造方法］
本開示に係る製造方法は、一又は複数の実施形態において、本開示のデバイスの製造方法である。本開示の製造方法は、発光タンパク質指示薬と発光基質とが独立して配置されるように基材にパターニングすることを含む。
[Device manufacturing method]
A manufacturing method according to the present disclosure is, in one or a plurality of embodiments, a manufacturing method of a device according to the present disclosure. The manufacturing method of the present disclosure includes patterning a substrate such that a photoprotein indicator and a luminescent substrate are independently arranged.
発光タンパク質指示薬と発光基質とのパターニングとしては、一又は複数の実施形態において、発光タンパク質指示薬と発光基質とが配置された箇所に水を供給すると、発光タンパク質指示薬と発光基質とが接触（混合）して発光シグナルを発生可能なように、これらを独立して配置することにより行うことができる。 As the patterning of the photoprotein indicator and the luminescent substrate, in one or a plurality of embodiments, when water is supplied to the location where the photoprotein indicator and the luminescent substrate are arranged, the photoprotein indicator and the luminescent substrate come into contact (mixing). These can be arranged independently so that a luminescence signal can be generated.
パターニングの方法としては、一又は複数の実施形態において、発光タンパク質指示薬又は発光基質の溶液を、所定のパターン形状に配置して乾燥させることにより行うことができる。パターニングは、一又は複数の実施形態において、インクジェットプリンター等の公知の技術を用いて行うことができる。 As a patterning method, in one or a plurality of embodiments, a solution of a photoprotein indicator or a luminescent substrate can be arranged in a predetermined pattern shape and dried. The patterning can be performed using a known technique such as an inkjet printer in one or a plurality of embodiments.
［デバイスを用いた水の硬度の測定方法］
本開示に係る検出方法は、一又は複数の実施形態において、本開示に係るデバイスを用いて、水の硬度を測定する方法である。
[Method of measuring hardness of water using device]
The detection method according to the present disclosure is, in one or a plurality of embodiments, a method of measuring the hardness of water using the device according to the present disclosure.
本態様の方法は、一又は複数の実施形態において、本開示に係るデバイスの試薬部に水を供給すること、及び試料を供給することにより生じた発光シグナルを利用することを含む。本開示のデバイスによれば励起光が不要であるため、発光シグナルのデータ化は、一又は複数の実施形態において、携帯情報端末（スマートフォン等）及びデジタルカメラ等の撮像手段により行うことができる。 The method of this aspect, in one or more embodiments, comprises supplying water to the reagent portion of the device according to the present disclosure, and utilizing the luminescent signal generated by supplying the sample. According to the device of the present disclosure, since excitation light is unnecessary, data conversion of a luminescence signal can be performed by an imaging means such as a mobile information terminal (smartphone) and a digital camera in one or a plurality of embodiments.
本開示の検出方法は、一又は複数の実施形態において、室温又は環境温度で行うことができる。水を供給してから観察するまでの時間としては、一又は複数の実施形態において、数秒から数分程度、又は、数秒から１分程度が挙げられる。 The detection method of the present disclosure can be performed at room temperature or ambient temperature in one or more embodiments. In one or a plurality of embodiments, the time from the supply of water to the observation is, for example, several seconds to several minutes, or several seconds to 1 minute.
［水の硬度測定システム］
本開示は、一態様において、本開示に係るデバイス、該デバイスに水を供給することで発せられる発光シグナルを撮像可能な撮像部を備える携帯情報端末、及び、撮像部で得られた発光シグナルの撮像データから水の硬度を判定又は算出可能なアプリケーションソフトウェアを含む、水の硬度測定システムに関する。
前記撮像部を備える携帯情報端末としては、一又は複数の実施形態において、カメラを備えるスマートフォン、カメラを備えるタブレット等が挙げられる。
前記アプリケーションソフトウェアとしては、一又は複数の実施形態において、得られた発光シグナルの撮像データと、携帯情報端末に記憶された情報又はネットを介して得られた情報とに基づいて水の硬度の測定を行い、携帯情報末端に表示する処理を該末端に行わせるソフトウェアが挙げられる
前記アプリケーションソフトウェアとしては、その他の一又は複数の実施形態において、得られた発光シグナルの撮像データをネットを介してサーバに送り、サーバで測定された結果を受信して携帯情報末端に表示する処理を該末端に行わせるソフトウェアが挙げられる。
[Water hardness measurement system]
In one aspect, the present disclosure provides a device according to the present disclosure, a mobile information terminal including an imaging unit capable of capturing an emission signal emitted by supplying water to the device, and a emission signal obtained by the imaging unit The present invention relates to a water hardness measurement system including application software capable of determining or calculating water hardness from imaging data.
In one or a plurality of embodiments, examples of the portable information terminal including the image capturing unit include a smartphone including a camera and a tablet including a camera.
As the application software, in one or more embodiments, measurement of water hardness based on imaging data of the obtained luminescence signal and information stored in a mobile information terminal or information obtained via a net. Examples of the application software include a software for performing a process of displaying the mobile information at the end of the mobile information in one or a plurality of other embodiments. There is software for sending to the end of the portable information and displaying the result at the end of the mobile information.
［核酸］
本開示は、一態様において、本開示に係る融合発光タンパク質をコードする核酸に関する。本開示において、核酸は、合成ＤＮＡ，ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡから選択される一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、並びにこれらのＤＮＡの転写生成物が挙げられる。
[Nucleic acid]
The disclosure relates in one aspect to a nucleic acid encoding a fusion photoprotein according to the disclosure. In the present disclosure, nucleic acids include single-stranded or double-stranded DNA selected from synthetic DNA, cDNA, genomic DNA and plasmid DNA, and transcription products of these DNAs.
［発現カセット］
本開示は、一態様において、本開示に係る融合発光タンパク質をコードする核酸を含む発現カセットに関する。該発現カセットにおいて、前記核酸は、導入する宿主細胞に応じた発現調節配列が作動的に連結されている。発現調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター等が挙げられ、その他には、開始コドン、イントロンのスプライシングシグナル、及び停止コドンなどが挙げられる。
[Expression cassette]
The present disclosure relates in one aspect to an expression cassette comprising a nucleic acid encoding a fusion photoprotein according to the present disclosure. In the expression cassette, the nucleic acid is operably linked with an expression control sequence depending on the host cell to be introduced. Examples of the expression control sequence include a promoter, an enhancer, a transcription terminator, and the like. Other examples include a start codon, an intron splicing signal, and a stop codon.
［ベクター］
本開示は、一態様において、本開示に係る融合発光タンパク質を発現可能なベクターに関する。本開示は、その他の態様において、本開示に係るベクターは、一又は複数の実施形態において、本開示に係る核酸又は発現カセットを有する発現ベクターである。本開示に係るベクターは、発現させたい細胞（宿主）に応じた発現ベクター系を適宜選択して使用できる。本開示に係るベクターに利用できるベクターとしては、限定されない一又は複数の実施形態として、プラスミド、コスミド、ＹＡＣＳ、ウイルス（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、エピソームＥＢＶなど）ベクター及びファージベクター、並びに、アグロバクテリウム法のためのバイナリーベクターが挙げられる。
[vector]
The present disclosure relates, in one aspect, to a vector capable of expressing the fused photoprotein of the present disclosure. In another aspect of the present disclosure, the vector of the present disclosure is, in one or more embodiments, an expression vector having the nucleic acid or expression cassette of the present disclosure. The vector according to the present disclosure can be used by appropriately selecting an expression vector system depending on the cell (host) to be expressed. As a vector that can be used as the vector according to the present disclosure, as one or a plurality of non-limiting embodiments, a plasmid, cosmid, YACS, virus (eg, adenovirus, retrovirus, episomal EBV, etc.) vector and phage vector, and agro vector, Binary vectors for the bacterium method are mentioned.
［形質転換体］
本開示は、一態様において、本開示に係る融合発光タンパク質を発現する形質転換体に関する。本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示に係る核酸又はベクターを有する形質転換体に関する。本開示の形質転換体は、一又は複数の実施形態において、本開示の核酸、発現カセット又はベクターを宿主に導入することによって作成することができる。宿主としては、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、微生物等が挙げられる。
[Transformant]
In one aspect, the present disclosure relates to a transformant expressing the fusion photoprotein according to the present disclosure. The present disclosure relates, in one or more embodiments, to a transformant having the nucleic acid or vector according to the present disclosure. The transformant of the present disclosure, in one or more embodiments, can be created by introducing the nucleic acid, expression cassette or vector of the present disclosure into a host. Examples of the host include animal cells, plant cells, insect cells, microorganisms and the like.
本開示はさらに以下の限定されない一又は複数の実施形態に関する。
〔１〕 発光タンパク質指示薬を用いて水の硬度を測定する方法であって、
前記発光タンパク質指示薬に水と発光基質とを接触させること、及び、
前記発光タンパク質指示薬の発光シグナルから水の硬度を判定又は算出することを含み、
前記発光タンパク質指示薬は、化学発光タンパク質の部分と、金属イオン結合タンパク質の部分と、蛍光タンパク質の部分とを有し、化学発光タンパク質部分と蛍光タンパク質部分との間に金属イオン結合タンパク質部分が連結されているタンパク質であり、
前記金属イオン結合タンパク質は、２価の金属陽イオン結合ドメインを有するタンパク質であり、
前記発光基質は、前記化学発光タンパク質の基質である、方法。
〔２〕 前記発光タンパク質指示薬は、金属イオン結合タンパク質部分にカルシウムイオン又はマグネシウムイオンが結合することで化学発光タンパク質部分から前記蛍光タンパク質部分へ共鳴エネルギー移動が可能なように連結されている、〔１〕記載の方法。
〔３〕 前記化学発光タンパク質がルシフェラーゼ、イクオリン、オベリン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される発光タンパク質である、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕 前記基質が、ホタルルシフェリン、バクテリアルルシフェリン、渦鞭毛藻類ルシフェリン、ヴァルグリン、セレンテラジン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される物質である、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕 前記金属イオン結合タンパク質は、ＥＦハンドモチーフ又はドッケリンモチーフを有するタンパク質である、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕 発光タンパク質指示薬及び前記指示薬の発光基質が配置された試薬部と、前記試薬部が形成された基材とを有し、
前記発光タンパク質指示薬は、化学発光タンパク質の部分と、金属イオン結合タンパク質の部分と、蛍光タンパク質の部分とを有し、化学発光タンパク質部分と蛍光タンパク質部分との間に金属イオン結合タンパク質部分が連結されているタンパク質であり、
前記金属イオン結合タンパク質は、２価の金属陽イオン結合ドメインを有するタンパク質であり、
前記発光タンパク質指示薬及び前記発光基質は、前記試薬部に独立して配置されている、水の硬度測定用デバイス。
〔７〕 〔６〕に記載のデバイスに水を供給することで発せられる発光シグナルを、撮像部を備える携帯情報端末で撮像すること、及び、
前記携帯情報端末が備える情報処理手段により、前記撮像部で得られた発光シグナルの撮像データから水の硬度を判定又は算出することを含む、水の硬度の測定方法。
〔８〕 〔６〕に記載のデバイス、該デバイスに水を供給することで発せられる発光シグナルを撮像可能な撮像部を備える携帯情報端末、及び、撮像部で得られた発光シグナルの撮像データから水の硬度を判定又は算出可能なアプリケーションソフトウェアを含む、水の硬度測定システム。
The disclosure further relates to one or more of the following non-limiting embodiments.
[1] A method for measuring the hardness of water using a photoprotein indicator,
Contacting the photoprotein indicator with water and a luminescent substrate; and
Comprising determining or calculating the hardness of water from the luminescent signal of the photoprotein indicator,
The luminescent protein indicator has a chemiluminescent protein portion, a metal ion-binding protein portion, and a fluorescent protein portion, and the metal ion-binding protein portion is linked between the chemiluminescent protein portion and the fluorescent protein portion. Is a protein
The metal ion-binding protein is a protein having a divalent metal cation-binding domain,
The method wherein the luminescent substrate is a substrate for the chemiluminescent protein.
[2] The photoprotein indicator is linked so that resonance energy transfer is possible from the chemiluminescent protein part to the fluorescent protein part by binding calcium ion or magnesium ion to the metal ion binding protein part, [1 ] The method described.
[3] The method according to [1] or [2], wherein the chemiluminescent protein is a luminescent protein selected from the group consisting of luciferase, aequorin, obelin, and combinations thereof.
[4] In any one of [1] to [3], wherein the substrate is a substance selected from the group consisting of firefly luciferin, bacterial luciferin, dinoflagellate luciferin, valgulin, coelenterazine, and combinations thereof. The method described.
[5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the metal ion-binding protein is a protein having an EF hand motif or a dockerin motif.
[6] A reagent part in which a photoprotein indicator and a luminescent substrate of the indicator are arranged, and a base material in which the reagent part is formed,
The luminescent protein indicator has a chemiluminescent protein portion, a metal ion-binding protein portion, and a fluorescent protein portion, and the metal ion-binding protein portion is linked between the chemiluminescent protein portion and the fluorescent protein portion. Is a protein
The metal ion-binding protein is a protein having a divalent metal cation-binding domain,
The device for measuring water hardness, wherein the photoprotein indicator and the luminescent substrate are independently arranged in the reagent part.
[7] Imaging a luminescence signal emitted by supplying water to the device according to [6] with a portable information terminal including an imaging unit, and
A method of measuring water hardness, which comprises determining or calculating water hardness from imaging data of a luminescence signal obtained by the imaging unit, by means of an information processing unit included in the portable information terminal.
[8] From the device according to [6], a portable information terminal including an imaging unit capable of imaging a luminescence signal emitted by supplying water to the device, and imaging data of the luminescence signal obtained by the imaging unit A water hardness measurement system including application software capable of determining or calculating water hardness.
以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。 Hereinafter, the present disclosure will be described in more detail with reference to Examples, but these are merely illustrative and the present disclosure is not limited to these Examples.
［発光タンパク質指示薬１の作製］
発光タンパク質指示薬となる融合発光タンパク質を以下のように作製した。
化学発光タンパク質としてＮａｎｏＬｕｃ、金属イオン結合タンパク質としてカルシウム／マグネシウムイオン結合タンパク質Ｃｅｎ３（ヒト由来ＨｓＣｅｎ３）、及び、蛍光タンパク質としてＶｅｎｕｓを使用し、Ｎ末端側からＶｅｎｕｓ、ＨｓＣｅｎ３、及びＮａｎｏＬｕｃの順で連結させた融合発光タンパク質を作成し、発光タンパク質指示薬１とした。
なお、ＨｓＣｅｎ３は、Ｃ末端側から７アミノ酸残基を欠失させたて連結した。
[Preparation of photoprotein indicator 1]
A fused photoprotein as a photoprotein indicator was prepared as follows.
NanoLuc was used as a chemiluminescent protein, calcium/magnesium ion-binding protein Cen3 (human-derived HsCen3) was used as a metal ion-binding protein, and Venus was used as a fluorescent protein. A fused photoprotein was prepared and designated as photoprotein indicator 1.
In addition, HsCen3 was linked by deleting 7 amino acid residues from the C-terminal side.
［実験例１］
発光タンパク質指示薬１のカルシウムイオンとマグネシウムイオンに対する発光特性を確認した。その結果を図１に示す。
図１Ａ及びＢは、それぞれ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下（黒線）又は非存在下（灰線）での発光タンパク質指示薬１の発光スペクトルを示す。図１において、発光スペクトルは、等発光点（５０６ｎｍ）でノーマライズした。
図１Ａ及びＢから、発光タンパク質試薬１は、カルシウムイオンと結合して発光強度が強くなり、また、マグネシウムイオンと結合して発光強度が強くなることが示された。
図１Ｃ及びＤは、それぞれ、発光タンパク質指示薬１に対するカルシウムイオン及びマグネシウムイオンの滴定曲線（ヒルプロット曲線）を示す。カルシウムイオンに対するＫｄは、３５５μＭ（ヒル係数１．０４）であり、マグネシウムイオンに対するＫｄは、４．７ｍＭ（ヒル係数１．６）であった。
図１A-Dはすべて、発光タンパク質濃度4 nM、発光基質濃度10 nM、総量100 μLの反応液に対して行った。
[Experimental Example 1]
The luminescence property of the photoprotein indicator 1 for calcium ion and magnesium ion was confirmed. The result is shown in FIG.
1A and B show the emission spectra of photoprotein indicator 1 in the presence (black line) or absence (grey line) of 10 mM CaCl 2 and 10 mM MgCl 2 , respectively. In FIG. 1, the emission spectrum was normalized at the iso-emission point (506 nm).
From FIG. 1A and B, it was shown that the photoprotein reagent 1 binds to calcium ions to increase the luminescence intensity, and also binds to magnesium ions to increase the luminescence intensity.
1C and 1D show titration curves (Hill plot curves) of calcium ion and magnesium ion for photoprotein indicator 1, respectively. The Kd for calcium ions was 355 μM (Hill coefficient 1.04) and the Kd for magnesium ions was 4.7 mM (Hill coefficient 1.6).
All of FIGS. 1A to 1D were performed on a reaction solution having a photoprotein concentration of 4 nM, a luminescence substrate concentration of 10 nM, and a total volume of 100 μL.
［実験例２］
発光タンパク質指示薬１のｐＨ及び他の金属イオンの影響を確認した。その結果を図２に示す。
図２Ａは、さまざまなｐＨで、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下（黒線）又は非存在下（灰線）での発光タンパク質指示薬１の発光強度比を比較した。すべての測定は３回行い、その平均値を示した。発光強度比は、Ｖｅｎｕｓのピーク（５２５ｎＭ）をＮａｎｏＬｕｃのピーク（４５５ｎＭ）で割って算出した。
図２Ｂは、３μＭのカリウムイオン、ヒ素イオン、亜鉛イオン、銅イオン、コバルトイオン、カドミウムイオン、鉛イオン、マンガンイオン、ニッケルイオン又は鉄イオンの存在下（左バー）、同金属イオンと１０ｍＭ ＭｇＣｌ２との共存下（中バー）、及び、同金属イオンと１０ｍＭ ＣａＣｌ２との共存下（右バー）で、発光タンパク質指示薬１の発光強度比を比較した。すべての測定は３回行い、ＳＥＭをエラーバーで示した。発光強度比は、Ｖｅｎｕｓのピーク（５２５ｎＭ）をＮａｎｏＬｕｃのピーク（４５５ｎＭ）で割って算出した。
図２Ａ及びＢより、発光タンパク質指示薬１は、ｐＨの変化に対して安定であり、また、異なる金属イオン存在下においてもカルシウムイオン及びマグネシウムイオンに特異性が高いことが示された。
[Experimental Example 2]
The effects of pH of the photoprotein indicator 1 and other metal ions were confirmed. The result is shown in FIG.
FIG. 2A compares the luminescence intensity ratio of photoprotein indicator 1 in the presence (black line) or absence (grey line) of 10 mM MgCl 2 at various pHs. All measurements were performed 3 times and the average value was shown. The emission intensity ratio was calculated by dividing the peak of Venus (525 nM) by the peak of NanoLuc (455 nM).
FIG. 2B shows the presence of 3 μM potassium ion, arsenic ion, zinc ion, copper ion, cobalt ion, cadmium ion, lead ion, manganese ion, nickel ion or iron ion (left bar) and the same metal ion and 10 mM MgCl 2 The luminescence intensity ratio of the photoprotein indicator 1 was compared under the coexistence with (Middle bar) and under the coexistence of the same metal ion and 10 mM CaCl 2 (Right bar). All measurements were performed in triplicate and SEM is shown in error bars. The emission intensity ratio was calculated by dividing the peak of Venus (525 nM) by the peak of NanoLuc (455 nM).
From FIGS. 2A and 2B, it was shown that the photoprotein indicator 1 is stable against changes in pH and has high specificity for calcium and magnesium ions even in the presence of different metal ions.
［実験例３］
図３Ａに示す濃度のＣａＣＯ３水溶液、図３Ｂに示す濃度のＣａＣｌ２及びＭｇＣｌ２の混合水溶液、及び、６種類の市販ミネラルウォーター（ＣＭＷ１−６）を試料水とした場合の発光タンパク質指示薬１の発光強度比を測定した。その結果を図３Ｃ−Ｅに示す。
図３Ａ及び３Ｂの硬度の値（Ｓｃａｌｅ）及び分類（Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、ＵＳＧＳ（アメリカ地質調査所）が規定した水硬度（全硬度）の算出方法による値と分類である。
図３Ｃは、図３Ａに示す濃度のＣａＣＯ３水溶液の結果であり、図３Ｄは、図３Ｂに示す濃度のＣａＣｌ２及ＭｇＣｌ２の混合水溶液の結果であり、そして、図３Ｅは、６種類の市販ミネラルウォーター（ＣＭＷ１−６）の結果である。
図３に示す通り、発光タンパク質指示薬１は、水硬度に依存した発光強度比を示した。
[Experimental Example 3]
A CaCO 3 aqueous solution having a concentration shown in FIG. 3A, a mixed aqueous solution of CaCl 2 and MgCl 2 having a concentration shown in FIG. 3B, and a photoprotein indicator 1 when 6 kinds of commercially available mineral water (CMW1-6) were used as sample waters The emission intensity ratio was measured. The results are shown in FIGS. 3C-E.
The hardness value (Scale) and classification (Classification) in FIGS. 3A and 3B are values and classification according to a method of calculating water hardness (total hardness) defined by USGS (American Geological Survey).
FIG. 3C is the result of CaCO 3 aqueous solution having the concentration shown in FIG. 3A, FIG. 3D is the result of mixed aqueous solution of CaCl 2 and MgCl 2 having the concentration shown in FIG. 3B, and FIG. It is a result of commercial mineral water (CMW1-6).
As shown in FIG. 3, the photoprotein indicator 1 showed a luminescence intensity ratio depending on water hardness.
［実験例４］
実験例３で使用した試料水を用いた発光タンパク質指示薬１の発光をスマートフォンのカメラで撮像し、その撮像データから発光強度比を算出した。その結果を図４に示す。
図４Ａ，Ｃ，及びＥは、ぞれぞれ、実験３で用いた試料水；３Ａに示す濃度のＣａＣＯ３水溶液、図３Ｂに示す濃度のＣａＣｌ２及びＭｇＣｌ２の混合水溶液、及び、６種類の市販ミネラルウォーター（ＣＭＷ１−６）をタンパク質発光指示薬で発光させたときの様子をスマートフォンのカメラで撮像した取り込んだ画像である。
図４Ｂ，Ｄ，及びＦは、ぞれぞれ、図４Ａ，Ｃ，及びＥの画像データを画像分析してＲＧＢ画像比（Ｂｌｕｅ／Ｇｒｅｅｎ）を算出した結果を示す。コントロールとして、１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＫＣｌを使用した。
図４に示すとおり、スマートフォンで取り込んだ画像データの画像分析で得られた発光強度比も、試料水の硬度に依存していた。これにより、スマートフォン等の携帯情報端末で撮像したデータに基づいて水の硬度が判定・算出できることが示された。
[Experimental Example 4]
The luminescence of the photoprotein indicator 1 using the sample water used in Experimental Example 3 was imaged with the camera of the smartphone, and the luminescence intensity ratio was calculated from the imaged data. The result is shown in FIG.
4A, C, and E are the sample water used in Experiment 3, respectively; the CaCO 3 aqueous solution having the concentration shown in 3A, the mixed aqueous solution of CaCl 2 and MgCl 2 having the concentration shown in FIG. 3B, and 6 kinds. 3 is a captured image of a state in which commercially available mineral water (CMW1-6) of No. 1 is made to emit light by a protein light emission indicator, which is taken by a camera of a smartphone.
4B, D, and F show the results of calculating the RGB image ratio (Blue/Green) by analyzing the image data of FIGS. 4A, C, and E, respectively. As a control, 10 mM MOPS (pH 7.2) and 100 mM KCl were used.
As shown in FIG. 4, the emission intensity ratio obtained by the image analysis of the image data captured by the smartphone also depended on the hardness of the sample water. This shows that the hardness of water can be determined and calculated based on the data captured by a mobile information terminal such as a smartphone.
Claims (8)
前記発光タンパク質指示薬に水と発光基質とを接触させること、及び、
前記発光タンパク質指示薬の発光シグナルから水の硬度を判定又は算出することを含み、
前記発光タンパク質指示薬は、化学発光タンパク質の部分と、金属イオン結合タンパク質の部分と、蛍光タンパク質の部分とを有し、化学発光タンパク質部分と蛍光タンパク質部分との間に金属イオン結合タンパク質部分が連結されているタンパク質であり、
前記金属イオン結合タンパク質は、２価の金属陽イオン結合ドメインを有するタンパク質であり、
前記発光基質は、前記化学発光タンパク質の基質である、方法。 A method for measuring the hardness of water using a photoprotein indicator,
Contacting the photoprotein indicator with water and a luminescent substrate; and
Comprising determining or calculating the hardness of water from the luminescent signal of the photoprotein indicator,
The luminescent protein indicator has a chemiluminescent protein portion, a metal ion binding protein portion, and a fluorescent protein portion, and the metal ion binding protein portion is linked between the chemiluminescent protein portion and the fluorescent protein portion. Is a protein
The metal ion-binding protein is a protein having a divalent metal cation-binding domain,
The method wherein the luminescent substrate is a substrate for the chemiluminescent protein.
前記発光タンパク質指示薬は、化学発光タンパク質の部分と、金属イオン結合タンパク質の部分と、蛍光タンパク質の部分とを有し、化学発光タンパク質部分と蛍光タンパク質部分との間に金属イオン結合タンパク質部分が連結されているタンパク質であり、
前記金属イオン結合タンパク質は、２価の金属陽イオン結合ドメインを有するタンパク質であり、
前記発光タンパク質指示薬及び前記発光基質は、前記試薬部に独立して配置されている、水の硬度測定用デバイス。 A photoprotein indicator and a reagent part on which a luminescent substrate of the indicator is arranged, and a base material on which the reagent part is formed,
The luminescent protein indicator has a chemiluminescent protein portion, a metal ion-binding protein portion, and a fluorescent protein portion, and the metal ion-binding protein portion is linked between the chemiluminescent protein portion and the fluorescent protein portion. Is a protein
The metal ion-binding protein is a protein having a divalent metal cation-binding domain,
The device for measuring water hardness, wherein the photoprotein indicator and the luminescent substrate are independently arranged in the reagent part.
前記携帯情報端末が備える情報処理手段により、前記撮像部で得られた発光シグナルの撮像データから水の硬度を判定又は算出することを含む、水の硬度の測定方法。 Imaging a luminescence signal emitted by supplying water to the device according to claim 6 with a personal digital assistant including an imaging unit; and
A method of measuring water hardness, which comprises determining or calculating water hardness from imaging data of a luminescence signal obtained by the imaging unit, by means of an information processing unit included in the portable information terminal.
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| Title |
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| 齊藤健太，永井健治: "高輝度化学発光タンパク質Nano-lanternの開発 化学発光イメージングへの誘い", 化学と生物, vol. 52, no. 10, JPN7022004213, 2014, pages 646 - 650, ISSN: 0004867010 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP7148136B2 (en) | 2022-10-05 |
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