JP2020089297A - Polylysine producing bacteria and methods for producing polylysine using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、副生物の生成が抑制され、それによりポリリジン生産量が向上したポリリジン生産菌、及び前記生産菌を用いるポリリジンの製造方法に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a polylysine-producing bacterium in which the production of by-products is suppressed and thereby the amount of polylysine produced is improved, and a method for producing polylysine using the above-mentioned bacterium.
ε−ポリ−Ｌ−リジン（以降、ＥＰＬとも記す）は、必須アミノ酸のＬ−リジンがε位置のアミノ基とα位のカルボキシル基を介して直鎖状に連なった化合物である。ＥＰＬは、強い抗菌活性や膜透過性を有し、さらに高い安全性を併せ持つことから、主に食品添加物の保存料として世界中で利用されている。
ＥＰＬは、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する放線菌の二次代謝産物として生産され、特にストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ａｌｂｕｌｕｓ）が有用な生産菌として知られている（特許文献１）。これまでに、様々な手法で、ＥＰＬ生産菌の優良株の作出が行われてきた。例えば、ニトロソグアニジン処理などの化学的変異処理によりＥＰＬアナログに耐性を有する変異株が取得されている（特許文献２〜４）。また、ストレプトミセス・アルブラスで機能し得る宿主ベクターも開発され、それを用いて該細菌へ遺伝子導入することによるＥＰＬ生産性の改良もなされている（特許文献５）。
ε-poly-L-lysine (hereinafter, also referred to as EPL) is a compound in which L-lysine of an essential amino acid is linearly linked via an amino group at the ε position and a carboxyl group at the α position. Since EPL has strong antibacterial activity and membrane permeability and further has high safety, it is mainly used as a preservative for food additives all over the world.
EPL is produced as a secondary metabolite of actinomycetes belonging to the genus Streptomyces, and particularly Streptomyces albrus (Streptomyces) is produced.
albulus) is known as a useful production bacterium (Patent Document 1). Up to now, excellent strains of EPL-producing bacteria have been produced by various methods. For example, mutant strains having resistance to EPL analogs have been obtained by chemical mutation treatment such as nitrosoguanidine treatment (Patent Documents 2 to 4). Further, a host vector capable of functioning in Streptomyces albulus has also been developed, and EPL productivity has been improved by introducing a gene into the bacterium using the host vector (Patent Document 5).
従来の変異体取得方法では、変異体の取得に時間を要するため効率的でなかったり、生産性の向上効果が限定的であったりして、必ずしも満足なものではなかった。
そこで本発明は、ゲノム配列解析及び網羅的遺伝子発現（トランスクリプトーム）解析に基づいた合理的な遺伝子工学的育種法により、ＥＰＬの生産性がさらに高められたストレプトミセス・アルブラスを提供することを課題とする。
The conventional method for obtaining a mutant is not always satisfactory because it takes time to obtain the mutant and is not efficient, or the effect of improving productivity is limited.
Therefore, the present invention provides Streptomyces albulus with further enhanced EPL productivity by a rational genetic engineering breeding method based on genome sequence analysis and comprehensive gene expression (transcriptome) analysis. It is an issue.
本発明者らは、ＥＰＬ生産菌であるストレプトミセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７株の全ゲノムを解読し、その機能解析を行ったところ、該細菌がＥＰＬ生合成遺伝子群の他にも、さらに３６もの二次代謝産物生合成経路に係る遺伝子群を有していることを明らかにした。そして、ストレプトミセス・アルブラスがＥＰＬ以外の代謝産物を併産しうるという知見に基づき、それら「他の代謝産物」の生産を抑制し、代謝フラックスをＥＰＬ生合成へ傾ける改変を行うことによりＥＰＬ高生産株を取得し得ることに想到し、本発明を完成させた。 The present inventors deciphered the entire genome of Streptomyces albulus NBRC14147 strain, which is an EPL-producing bacterium, and analyzed the function thereof. As a result, the bacterium further detected 36 secondary genes other than the EPL biosynthetic gene group. It was clarified that it has a gene group related to the metabolite biosynthetic pathway. Based on the finding that Streptomyces albus can co-produce metabolites other than EPL, the production of these "other metabolites" is suppressed and the EPL is increased by modifying the metabolic flux to EPL biosynthesis. The present invention has been completed based on the idea that a production strain can be acquired.
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路、テトラマイシン類合成経路、及びナイスタチン合成経路からなる群から選択されるいずれか１以上を破壊するように改変された、ストレプトマイセス・アルブラス（Streptmyces albulus）。
［２］前記ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路が、遺伝子クラスター１３に含まれる１以上の遺伝子の発現の減弱によって破壊されている、［１］に記載のストレプトマイセス・アルブラス。
［３］前記テトラマイシン類合成経路が、遺伝子クラスター１９に含まれる１以上の遺伝子の発現の減弱によって破壊されている、［１］に記載のストレプトマイセス・アルブラス。
［４］前記ナイスタチン合成経路が、遺伝子クラスター４及び５に含まれる１以上の遺伝子の発現の減弱によって破壊されている、［１］に記載のストレプトマイセス・アルブラス。
［５］前記１以上の遺伝子の発現が、前記１以上の遺伝子の不活性化によって減弱されている、［２］〜［４］のいずれかに記載のストレプトマイセス・アルブラス。
［６］前記１以上の遺伝子が欠失している、［５］に記載のストレプトマイセス・アルブラス。
［７］［１］〜［６］のいずれかに記載のストレプトマイセス・アルブラスを培地中で好気的に培養する工程、及び前記培地からε−ポリ−Ｌ−リジンを回収する工程を含む、ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。
That is, the present invention is as follows.
[1] A Streptmyces albulus modified to destroy any one or more selected from the group consisting of a diaminopropionic acid polymer synthetic pathway, a tetramycin synthetic pathway, and a nystatin synthetic pathway.
[2] The Streptomyces albulus according to [1], wherein the diaminopropionic acid polymer synthesis pathway is disrupted by attenuation of expression of one or more genes included in the gene cluster 13.
[3] The Streptomyces albulus according to [1], wherein the tetramycins synthetic pathway is disrupted by attenuation of the expression of one or more genes contained in the gene cluster 19.
[4] The Streptomyces albulus according to [1], wherein the nystatin synthetic pathway is disrupted by attenuation of the expression of one or more genes contained in gene clusters 4 and 5.
[5] The Streptomyces albulus according to any of [2] to [4], wherein the expression of the one or more genes is attenuated by inactivation of the one or more genes.
[6] The Streptomyces alblas of [5], wherein the one or more genes are deleted.
[7] A step of aerobically culturing Streptomyces albulus according to any one of [1] to [6] in a medium, and a step of recovering ε-poly-L-lysine from the medium , A method for producing ε-poly-L-lysine.
本発明により、ＥＰＬ生産能がより向上したストレプトミセス・アルブラスが提供される。該細菌を培養することにより、ＥＰＬを高収率で発酵生産することができ、また副生成物の産生を抑制することができる。その結果、ＥＰＬ生産量の増大に加え、生産コストの削減や、発酵液からのＥＰＬの分離・精製工程の簡略化も実現される。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention provides Streptomyces alblas with improved EPL productivity. By culturing the bacterium, EPL can be fermentatively produced at a high yield, and the production of by-products can be suppressed. As a result, in addition to the increase in the EPL production amount, the production cost can be reduced and the EPL separation/purification process from the fermentation liquor can be simplified.
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
＜１＞ε−ポリ−Ｌ−リジン（ＥＰＬ）生産菌
本発明の第一の態様は、ＥＰＬ生産菌である。
<1> ε-Poly-L-lysine (EPL)-producing bacterium The first aspect of the present invention is an EPL-producing bacterium.
本明細書において「ε−ポリ−Ｌ−リジン（ＥＰＬ）生産菌」という記載は、細菌を培地中で培養した場合に、培養培地中又は細菌細胞内でＥＰＬを生産し、放出若しくは分泌し、かつ／又は蓄積させる能力を有する細菌を意味する。
また、本明細書において「ε−ポリ−Ｌ−リジン（ＥＰＬ）生産能」という記載は、細菌を培地中で培養した場合に、培養培地又は細菌細胞からＥＰＬを回収することができるようなレベルまで、培養培地中又は細菌細胞内でＥＰＬを生産し、放出若しくは分泌し、かつ／又は蓄積させる細菌の能力を意味する。
In the present specification, the term "ε-poly-L-lysine (EPL)-producing bacterium" means that when a bacterium is cultured in a medium, EPL is produced, released or secreted in the culture medium or in the bacterial cells. And/or means a bacterium having the ability to accumulate.
In the present specification, the term "ε-poly-L-lysine (EPL)-producing ability" means a level at which EPL can be recovered from a culture medium or bacterial cells when the bacterium is cultured in the medium. Up to the ability of the bacterium to produce, release or secrete and/or accumulate EPL in the culture medium or in bacterial cells.
本発明のＥＰＬ生産菌を取得するために改変する細菌は、ストレプトマイセス・アルブラスを使用することができる。通常、ストレプトマイセス・アルブラスはＥＰＬ生産能を有するため、用いる株は特に限定されないが、好ましくは良好なＥＰＬ生産能で知られるストレプトマイセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７株が挙げられる。
ストレプトマイセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物資源センター（ＮＢＲＣ）（郵便番号：292-0818、住所：千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）から入手することができる。
また、ストレプトマイセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７株のゲノムは、大学共同利用機関法人 情報・システム研究機構 国立遺伝学研究所 ＤＤＢＪセンターに、アクセッションナンバー：BHXC01000001、BHXC01000002、BHXC01000003、BHXC01000004、BHXC01000005、BHXC01000006、BHXC01000007、及びBHXC01000008として登録されている。
As the bacterium to be modified to obtain the EPL-producing bacterium of the present invention, Streptomyces albulus can be used. Usually, since Streptomyces alblas has EPL-producing ability, the strain to be used is not particularly limited, but Streptomyces alblas NBRC14147 strain, which is known for its good EPL-producing ability, is preferable.
The Streptomyces alblas NBRC14147 strain should be obtained from the Biological Resource Center (NBRC), National Institute for Product Evaluation Technology (NBRC) (zip code: 292-0818, address: 2-5-8 Kazusa, Kamasa, Kisarazu, Chiba). You can
The genome of Streptomyces albrus NBRC14147 strain is available at the accession number BHXC01000001, BHXC01000002, BHXC01000003, BHXC01000004, BHXC01000005, BHXC01000006, BHXC01000006, BHXC01000006, BHXCC1001000006 And are registered as BHXC01000008.
本発明のＥＰＬ生産菌は、ストレプトマイセス・アルブラスにおいてＥＰＬ生産条件下において機能発現している二次代謝産物生合成経路、具体的にはＥＰＬ以外の二次代謝産物の生合成が抑制されている。すなわち、本発明のＥＰＬ生産菌は、ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路、テトラマイシン類合成経路、及びナイスタチン合成経路からなる群から選択されるいずれか１以上を破壊するように改変された、ストレプトマイセス・アルブラスである。 The EPL-producing bacterium of the present invention has a secondary metabolite biosynthetic pathway that is functionally expressed in Streptomyces albus under EPL-producing conditions, specifically, the biosynthesis of secondary metabolites other than EPL is suppressed. There is. That is, the EPL-producing bacterium of the present invention is Streptomyces modified so as to destroy any one or more selected from the group consisting of a diaminopropionic acid polymer synthetic pathway, a tetramycin synthetic pathway, and a nystatin synthetic pathway.・It is Albrus.
ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路、テトラマイシン類合成経路、又はナイスタチン合成経路は、それぞれ、該経路に関与する酵素等のタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現の減弱により、特に、細菌の染色体上にあるクラスター４、５、１３又は１９に含まれる１以上の遺伝子の発現を、該遺伝子の不活性化等により減弱させることにより破壊することができるが、これに限定されない。 The diaminopropionic acid polymer synthesis pathway, the tetramycins synthesis pathway, or the nystatin synthesis pathway is reduced in the expression of at least one gene encoding a protein such as an enzyme involved in the pathway, and thus, particularly on the bacterial chromosome. The expression of one or more genes contained in a given cluster 4, 5, 13 or 19 can be disrupted by, but not limited to, attenuation by inactivating the genes.
「ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路」は、ストレプトマイセス・アルブラスの二次代謝産物の１つであるジアミノプロピオン酸ポリマーが生合成される経路を指す。
ストレプトマイセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７株の全ゲノム解析及び遺伝子破壊実験により、ストレプトマイセス・アルブラスの遺伝子クラスター１３が、ジアミノプロピオン酸ポリマー生合成に関与する遺伝子群であることが明らかになった。クラスター１３は、ＮＢＲＣ１４１４７株のゲノムSequence6（アクセッションナンバー：BHXC01000006.1）上の第６０２４０３〜６１５８５１塩基に位置し、配列番号１に示される塩基配列の遺伝子群である。
クラスター１３の全機能は解明されていないが、少なくとも９つのＯＲＦ（ＯＲＦ１〜９）が含まれることが分かっている。ＯＲＦ４がコードするオルニチンシクロデアミナーゼにより、Ｌ−オルニチンがＬ−プロリンに変換されるとともにアンモニアが脱離し、ＯＲＦ５がコードするシステインシンターゼによりＬ−セリンと前記アンモニアからＬ−２，３−ジアミノプロピオン酸へ変換され、さらにＥＰＬ合成酵素等の既知のアミノ酸ポリマー合成酵素とは全く構造の異なるＯＲＦ１、２がコードする酵素によりポリマー化されてポリ−Ｌ−ジアミノプロピオン酸が生成されるものと推測される。したがって、ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路は、クラスター１３に含まれる１以上の遺伝子、好ましくはＯＲＦ１〜９のいずれかを含む遺伝子、より好ましくは遺伝子群全体の発現を減弱させることにより破壊される。
"Diaminopropionic acid polymer synthetic route" refers to a route in which diaminopropionic acid polymer, which is one of the secondary metabolites of Streptomyces albus, is biosynthesized.
Whole genome analysis and gene disruption experiments of Streptomyces albulus NBRC14147 strain revealed that gene cluster 13 of Streptomyces albras is a gene group involved in diaminopropionic acid polymer biosynthesis. Cluster 13 is a group of genes having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, which is located at bases 602403 to 615851 on the genome sequence 6 (accession number: BHXC01000006.1) of the NBRC14147 strain.
The entire function of cluster 13 has not been elucidated, but it has been shown to contain at least 9 ORFs (ORFs 1-9). Ornithine cyclodeaminase encoded by ORF4 converts L-ornithine to L-proline and desorbs ammonia, and cysteine synthase encoded by ORF5 converts L-serine and the ammonia into L-2,3-diaminopropionic acid. It is presumed that poly-L-diaminopropionic acid is converted and further polymerized by an enzyme encoded by ORFs 1 and 2 having a completely different structure from known amino acid polymer synthases such as EPL synthase. Therefore, the diaminopropionic acid polymer synthesis pathway is disrupted by attenuating the expression of one or more genes contained in cluster 13, preferably a gene containing any of ORFs 1 to 9, more preferably the entire gene group.
「テトラマイシン類合成経路」は、ストレプトマイセス・アルブラスの二次代謝産物の１つであるテトラマイシン類が生合成される経路を指す。ここで、「テトラマイシン類」は、２４−デメチル−２４−エチルテトリンＡ、２４−デメチル−２４−エチル−４−ヒドロキシテトリンＡ、テトリンＡ、４-ヒドロキシテトリンＡを含む環状化合物を指す。
本発明者らにより、ストレプトマイセス・アルブラスの遺伝子クラスター１９が、テトラマイシン類生合成に関与する遺伝子群であることが明らかになった。クラスター１９は、ＮＢＲＣ１４１４７株のゲノムSequence6（アクセッションナンバー：BHXC01000006.1）上の第１６５８６０２〜１７５８８０１塩基に位置し、配列番号２に示される塩基配列の遺伝子群である。
クラスター１９の機能はまだほとんど解明されていないが、該クラスターを欠損させたストレプトマイセス・アルブラスにおいてテトラマイシン類の生成が抑制されることが確認されている。したがって、テトラマイシン類合成経路は、クラスター19に含まれる１以上の遺伝子、好ましくは遺伝子群全体の発現を減弱させることにより破壊される。
The “tetramycin synthetic pathway” refers to a pathway in which tetramycin, which is one of the secondary metabolites of Streptomyces albulus, is biosynthesized. Here, "tetramycins" refer to cyclic compounds containing 24-demethyl-24-ethyltetrin A, 24-demethyl-24-ethyl-4-hydroxytetrin A, tetrin A, 4-hydroxytetrin A.
The present inventors have revealed that the gene cluster 19 of Streptomyces albulus is a gene group involved in tetramycin biosynthesis. Cluster 19 is a gene group having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:2, which is located at bases 1658602 to 1758801 on genome sequence 6 (accession number: BHXC01000006.1) of NBRC14147 strain.
Although the function of cluster 19 has hardly been elucidated yet, it has been confirmed that the production of tetramycins is suppressed in Streptomyces albus that lacks the cluster. Therefore, the tetramycin synthetic pathway is disrupted by attenuating the expression of one or more genes contained in cluster 19, preferably the entire group of genes.
「ナイスタチン合成経路」は、ストレプトマイセス・アルブラスの二次代謝産物の１つであるナイスタチンが生合成される経路を指す。
本発明者らにより、ストレプトマイセス・アルブラスの遺伝子クラスター４及び５として配列未解読領域を介して二分されている遺伝子群が、ナイスタチン生合成に関与することが明らかになった。クラスター４及び５は、ＮＢＲＣ１４１４７株のゲノムSequence1（アクセッションナンバー：BHXC01000001.1）上の第３１３１５７〜３５０５８４塩基（配列番号３）と、Sequence2（アクセッションナンバー：BHXC01000002.1）上の第１〜９６７３３塩基（配列番号４）にまたがって存在する遺伝子群である。
クラスター４及び５の機能はまだほとんど解明されていないが、該クラスターを欠損させたストレプトマイセス・アルブラスにおいてナイスタチンの生成が抑制されることが確認されている。したがって、ナイスタチン合成経路は、クラスター４及び５に含まれる１以上の遺伝子、好ましくは遺伝子群全体の発現を減弱させることにより破壊される。
“Nystatin synthetic pathway” refers to the pathway by which nystatin, one of the secondary metabolites of Streptomyces albulus, is biosynthesized.
The present inventors have revealed that genes clustered as Streptomyces albulus gene clusters 4 and 5 through a sequence uncoding region are involved in nystatin biosynthesis. Clusters 4 and 5 consisted of nucleotides 313157 to 350584 (SEQ ID NO: 3) on the Sequence 1 (accession number: BHXC01000001.1) of the NBRC14147 strain and 1 to 96733 nucleotides on Sequence 2 (accession number: BHXC01000002.1). It is a gene group existing across bases (SEQ ID NO: 4).
Although the functions of clusters 4 and 5 have hardly been elucidated yet, it has been confirmed that the production of nystatin is suppressed in Streptomyces albus that lacks the clusters. Therefore, the nystatin synthetic pathway is disrupted by attenuating the expression of one or more genes contained in clusters 4 and 5, preferably the entire group of genes.
「合成経路」又は「代謝経路」と呼んでもよい「経路」は、１つのバイオ分子種を他のものへと変換するための１組の同化又は異化（生）化学反応を意味するものとすることができる。よって、「経路」は、その中間体によって結び付けられた一連の（生）化学反応（すなわち、１つの反応の１以上の生成物が、後続する１以上の反応等の１又は複数の基質となっている）を含むことができる。「経路」という記載の意味は、通常は当業者に明らかである。 A "pathway", which may be referred to as a "synthetic pathway" or a "metabolic pathway", shall mean a set of anabolic or catabolic (bio)chemical reactions to convert one biomolecular species into another. be able to. Thus, a "pathway" is a series of (bio)chemical reactions (ie, one or more products of one reaction becomes one or more substrates for one or more subsequent reactions, etc.) linked by its intermediates. Are included). The meaning of the description "route" is usually clear to the person skilled in the art.
本発明のＥＰＬ生産菌は、前記３つの経路のいずれか１以上が破壊されていることが好ましいが、より好ましくは２つ以上が破壊されており、さらに好ましくは３つが破壊されている。前記３つの経路が破壊されている態様としては、ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路が破壊されている態様、テトラマイシン類合成経路が破壊されている態様、ナイスタチン合成経路が破壊されている態様、ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路とテトラマイシン類合成経路とが破壊されている態様、ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路とナイスタチン合成経路とが破壊されている態様、テトラマイシン類合成経路とナイスタチン合成経路とが破壊されている態様、及びジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路とテトラマイシン類合成経路とナイスタチン合成経路とが破壊されている態様のいずれでもよい。
また、ＥＰＬの収量増加の観点から、好ましくはジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路が破壊されていることが好ましい。また、テトラマイシン類合成経路又はナイスタチン合成経路が破壊されている態様は、副生成物の低下によりＥＰＬの精製が容易になる点で好ましい。
In the EPL-producing bacterium of the present invention, it is preferable that any one or more of the above three pathways is destroyed, more preferably two or more are destroyed, and further preferably three are destroyed. As a mode in which the above three pathways are disrupted, a mode in which the diaminopropionic acid polymer synthetic pathway is disrupted, a mode in which the tetramycins synthetic pathway is disrupted, a mode in which the nystatin synthetic pathway is disrupted, and diaminopropion An aspect in which the acid polymer synthetic pathway and the tetramycins synthetic pathway are disrupted, an aspect in which the diaminopropionic acid polymer synthetic pathway and the nystatin synthetic pathway are disrupted, a tetramycin synthetic pathway and the nystatin synthetic pathway are disrupted And the diaminopropionic acid polymer synthetic pathway, the tetramycins synthetic pathway, and the nystatin synthetic pathway are disrupted.
Further, from the viewpoint of increasing the EPL yield, it is preferable that the diaminopropionic acid polymer synthesis pathway is disrupted. In addition, a mode in which the tetramycin synthetic pathway or the nystatin synthetic pathway is disrupted is preferable in that purification of EPL can be facilitated by reducing byproducts.
「〜経路を破壊するように改変されたストレプトマイセス・アルブラス」という記載は、改変されていないストレプトマイセス・アルブラス、例えば、野生型株又は親株、例えば、ＮＢＲＣ１４１４７株のように、前記経路が破壊されていない菌と比較して、改変された菌では、該経路の１以上の（生）化学反応を介する炭素の流束がより低いか、又は存在すらしないような様式で細菌が改変されたことを意味するものとすることができる。ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路、テトラマイシン類合成経路、又はナイスタチン合成経路を破壊するように改変されたストレプトマイセス・アルブラスにおいては、改変されていないストレプトマイセス・アルブラスの経路における炭素の流束と比較して、同経路の１以上の（生）化学反応を介する炭素の流束は、９９％以下、９５％以下、９０％以下、８５％以下、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、又は０％とすることができる。 The description "Streptomyces albulus modified to disrupt the pathway" refers to unmodified Streptomyces albrus, such as the wild-type strain or parent strain, e.g., the NBRC14147 strain, wherein the pathway is As compared to non-disrupted bacteria, the modified bacteria modify the bacteria in such a way that the flux of carbon through one or more (bio)chemical reactions of the pathway is lower or even absent. Can mean that. In Streptomyces albulus modified to disrupt the diaminopropionic acid polymer synthetic pathway, the tetramycin synthetic pathway, or the nystatin synthetic pathway, the carbon flux in the unmodified Streptomyces albulus pathway and By comparison, the flux of carbon through one or more (bio)chemical reactions of the same route is 99% or less, 95% or less, 90% or less, 85% or less, 80% or less, 75% or less, 70% or less. , 65% or less, 60% or less, 55% or less, 50% or less, 45% or less, 40% or less, 35% or less, 30% or less, 25% or less, 20% or less, 15% or less, 10% or less, 5 % Or less, or 0%.
また、「〜経路を破壊するように改変されたストレプトマイセス・アルブラス」という
記載は、改変された菌において、同経路が減弱されているような様式で、菌が改変されたことを意味するものとすることもできる。
「改変された細菌において、〜経路が減弱されている」という記載は、改変された菌において、同経路由来の酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現が減弱されているような様式で、菌が改変されたことを意味するものとすることができる。例えば、ジアミノプロピオン酸ポリマー合成経路由来の酵素をコードするＯＲＦ１〜９から選択される１又は数個の遺伝子の発現を減弱させることができ、その発現を減弱させることのできる遺伝子の組合せは特に限定されない。
Further, the description "- Streptomyces albulus modified so as to destroy the pathway" means that in the modified bacterium, the bacterium was modified in such a manner that the same pathway is attenuated. It can also be one.
The description "in the modified bacterium, the ~ pathway is attenuated" means that in the modified bacterium, the expression of at least one gene encoding an enzyme derived from the same pathway is attenuated. May have been modified. For example, the expression of one or several genes selected from ORFs 1 to 9 encoding enzymes derived from the diaminopropionic acid polymer synthesis pathway can be attenuated, and the combination of genes that can attenuate the expression is particularly limited. Not done.
「数個の遺伝子」という記載は、２以上の遺伝子、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の遺伝子を意味するものとすることができる。したがって、「１又は数個の遺伝子」という記載は、単一の遺伝子、オペロン、又は遺伝子クラスター全体を意味するものとすることができる。したがって、「１又は数個の遺伝子」という記載及び「少なくとも１つの遺伝子」という記載は等価であるとする。 The phrase "several genes" can mean more than one gene, for example 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more genes. Thus, the phrase "one or several genes" can mean a single gene, an operon, or an entire gene cluster. Therefore, the description “one or several genes” and the description “at least one gene” are equivalent.
「クラスターに含まれる少なくとも１つの遺伝子の発現を減弱させるよう改変したストレプトマイセス・アルブラス」という記載は、改変されていない同クラスターを含むストレプトマイセス・アルブラス、例えば、野生型又は親株と比較して、改変した菌において、同クラスターに含まれる少なくとも１つの遺伝子の発現が減少しているような様式で、菌が改変されたことを意味するものとすることができる。
「減弱」又は「減弱された」という記載は、細菌中の１以上の酵素の量又は活性が減少するか、又は存在しなくなり、これにより遺伝子産物の活性が減少するか、又は完全に除去されるよう、破壊対象の経路由来の酵素をコードする細菌中の少なくとも１つの遺伝子を減弱させるか、又は改変することを意味するものとすることができる。
The description "Streptomyces alblas modified to reduce the expression of at least one gene contained in the cluster" refers to a Streptomyces alblas containing the unmodified cluster, eg, wild type or parent strain. Then, the modified bacterium can mean that the bacterium has been modified in such a manner that the expression of at least one gene contained in the same cluster is decreased.
The phrase "attenuated" or "attenuated" means that the amount or activity of one or more enzymes in the bacterium is reduced or absent, thereby reducing the activity of the gene product or completely eliminating it. Thus, at least one gene in a bacterium that encodes an enzyme from the pathway to be disrupted may be meant to be attenuated or altered.
「クラスターに含まれる少なくとも１つの遺伝子が不活性化された」という記載は、改変された遺伝子クラスターに含まれる遺伝子の少なくとも１つが、改変されていない遺伝子又は改変されていない同クラスターを含む菌と比較して、完全に不活性であるか、又は非機能性であるタンパク質をコードすることを意味するものとすることができる。
遺伝子の一部の欠失又は全遺伝子の欠失、遺伝子によってコードされるタンパク質中でアミノ酸の置換を引き起こす１以上の塩基の交換（ミスセンス変異）、ストップコドンの導入（ナンセンス変異）、遺伝子のリーディングフレームのシフトを引き起こす１又は２の塩基の欠失、薬剤耐性遺伝子及び／又は転写終止信号の挿入、又はプロモータ（１又は複数）、エンハンサ（１又は複数）、アテニュエータ（１又は複数）、リボソーム結合部位（１又は複数）（ＲＢＳ）等などの遺伝子発現を調節する配列を含む、遺伝子の隣接する領域の改変のために、破壊対象のクラスターに含まれる改変されたＤＮＡ領域の少なくとも１つが、遺伝子を自然に発現することができないということも可能である。遺伝子クラスターに含まれる少なくとも１つの遺伝子の不活性化は、例えば、ＵＶ照射又はニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を使用する変異誘発処理、部位特異的変異誘発、相同組換えを使用する遺伝子破壊、及び／又は「Red/ET-駆動組込み（Red/ET-driven integration）」又は「λRed/ET-媒介組込み（λRed/ET-mediated integration）」に基づいた挿入−欠失変異誘発（Yu D.ら、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 2000, 97（11）:5978-5983; Datsenko K.A.とWanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97（12）:6640-6645; Zhang Y.ら、Nature Genet., 1998, 20:123-128）などの従来の方法によって行うこともできる。
The description "at least one gene included in the cluster has been inactivated" means that at least one of the genes included in the modified gene cluster is an unmodified gene or a bacterium containing the same unmodified cluster. By comparison, it may be meant to encode a protein that is completely inactive or non-functional.
Deletion of a part of the gene or deletion of the entire gene, exchange of one or more bases that causes amino acid substitution in the protein encoded by the gene (missense mutation), introduction of stop codon (nonsense mutation), reading of gene Deletion of 1 or 2 bases causing frame shift, insertion of drug resistance gene and/or transcription termination signal, or promoter(s), enhancer(s), attenuator(s), ribosome binding At least one of the modified DNA regions contained in the cluster to be disrupted is the gene because of the modification of the adjacent region of the gene, which includes a sequence (1 or more) (RBS) and the like sequences that regulate gene expression. It is also possible that it cannot be naturally expressed. Inactivation of at least one gene comprised in the gene cluster may be performed by mutagenesis treatment using, for example, UV irradiation or nitrosoguanidine (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine), site-directed mutagenesis, Gene disruption using homologous recombination and/or insertion based on “Red/ET-driven integration” or “λRed/ET-mediated integration”- Deletion mutagenesis (Yu D. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 2000, 97 (11):5978-5983; Datsenko KA and Wanner BL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97 (12):6640-6645; Zhang Y. et al., Nature Genet. , 1998, 20:123-128).
「クラスターに含まれる少なくとも１つの遺伝子の発現が減弱された」という記載は、１又は数個の遺伝子の発現が減弱された改変されたストレプトマイセス・アルブラスにおける同クラスターに含まれる改変された１又は数個の遺伝子によってコードされる１又は数個のタンパク質の量が、例えば、野生型株又は親株、例えば、ＮＢＲＣ１４１４７株な
どの改変されていない菌と比較して、低減されていることを意味するものとすることができる。
The expression "the expression of at least one gene included in the cluster is attenuated" refers to the modified 1 included in the same cluster in modified Streptomyces albulus in which the expression of one or several genes is attenuated. Or that the amount of one or several proteins encoded by several genes is reduced compared to an unmodified fungus, eg a wild type strain or a parent strain, eg NBRC14147 strain It can be
「クラスターに含まれる少なくとも１つの遺伝子が減弱された」という記載は、改変されたストレプトマイセス・アルブラスが、同クラスターに含まれる１以上の遺伝子に機能的に連結した１以上の領域を含むことを意味するものとすることができ、これには、同クラスターに含まれる遺伝子の発現を調節する配列、例えば、プロモータ、エンハンサ、アテニュエータ及び転写終止信号、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、及び他の発現調節要素（これらは改変され、同クラスターに含まれる少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの減少に帰着している）、並びに他の例（例えば、WO95/34672; Carrier T.A. とKeasling J.D., Biotechnol. Prog., 1999, 15:58-64参照）が含まれる。「遺伝子に機能的に連結した」という記載は、「１以上の遺伝子に機能的に連結した」という記載の具体例であり、１又は複数の制御領域が、ヌクレオチド配列の発現（例えば、増強された、増加した、構成的な、基本的な、反終止的な、減弱された、脱制御された、減少した又は抑圧された発現）、特に、ヌクレオチド配列によってコードされる遺伝子産物の発現を可能とする様式で、核酸分子又は遺伝子のヌクレオチド配列に連結されたことを意味するものとすることができる。 The description that “at least one gene included in the cluster is attenuated” means that the modified Streptomyces arbus includes one or more regions operably linked to one or more genes included in the same cluster. , Which include sequences that regulate the expression of genes in the same cluster, such as promoters, enhancers, attenuators and transcription termination signals, ribosome binding sites (RBS), and other expression sequences. Regulatory elements, which have been modified resulting in reduced expression levels of at least one gene in the same cluster, as well as other examples (eg WO95/34672; Carrier TA and Keasling JD, Biotechnol. Prog. , 1999, 15:58-64). The phrase "operably linked to a gene" is a specific example of the phrase "operably linked to one or more genes," in which one or more regulatory regions are expressed (eg, enhanced) in the nucleotide sequence. Increased, constitutive, basal, anti-termination, attenuated, deregulated, decreased or repressed expression), in particular the expression of the gene product encoded by the nucleotide sequence. In this manner, it can mean that it is linked to the nucleotide sequence of a nucleic acid molecule or gene.
クラスターに含まれる少なくとも１つの遺伝子の発現は、染色体ＤＮＡ上のプロモータなどの発現調節配列をより弱いものに交換することにより減弱させることができる。プロモータの強さは、ＲＮＡ合成の開始動作の頻度によって特定される。プロモータの強さ及び強いプロモータを評価する方法の例は、Goldstein M.A.ら（Goldstein M.A.とDoi R.H., 「バイオテクノロジーにおける原核プロモータ」, Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1:105-128）等に記載されている。更に、国際公開WO00/18935に開示されているように、標的遺伝子のプロモータ領域にいくつかのヌクレオチドについてヌクレオチド置換を導入することにより、プロモータが弱くなるよう改変することもできる。更に、シャイン・ダルガーノ（ＳＤ）配列における、及び／又はＳＤ配列と開始コドンとの間のスペーサにおける、及び／又はリボソーム結合部位（ＲＢＳ）中で開始コドンから直ぐ上流及び／又は下流の配列におけるいくつかのヌクレオチドの置換は、ｍＲＮＡの転写効率に大きく影響を与えることが知られている。このＲＢＳの改変は、破壊対象のクラスターに含まれる少なくとも１つの遺伝子の転写を減少させることと組合せることができる。 The expression of at least one gene contained in the cluster can be attenuated by replacing an expression control sequence such as a promoter on the chromosomal DNA with a weaker one. Promoter strength is specified by the frequency of initiation of RNA synthesis. Examples of promoter strength and methods for evaluating strong promoters are described in Goldstein MA et al. (Goldstein MA and Doi RH, “Prokaryotic promoters in biotechnology”, Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1:105-128). Have been described. Further, as disclosed in WO00/18935, the promoter can be modified to be weak by introducing nucleotide substitutions for some nucleotides in the promoter region of the target gene. Furthermore, how many in the Shine-Dalgarno (SD) sequence and/or in the spacer between the SD sequence and the start codon and/or in the ribosome binding site (RBS) immediately upstream and/or downstream of the start codon. It is known that such nucleotide substitution has a great influence on the transcription efficiency of mRNA. This modification of RBS can be combined with reducing the transcription of at least one gene contained in the cluster to be disrupted.
クラスターに含まれる少なくとも１つの遺伝子の発現は、トランスポゾン又は挿入配列（ＩＳ）の、遺伝子のコード領域への（米国特許第5,175,107号）、又は遺伝子の発現を調節する領域における挿入によって、又は紫外線照射（ＵＶ照射）若しくはニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を用いる変異誘発などの従来の方法によって減弱させることもできる。更に、部位特異的変異の取込みは、例えば、λRed/ET-媒介組込みに基づいて、公知の染色体校正方法によって行うことができる。 The expression of at least one gene contained in the cluster may be achieved by insertion of a transposon or insertion sequence (IS) into the coding region of the gene (US Pat. No. 5,175,107), or in a region that regulates expression of the gene, or by UV irradiation. It can also be attenuated by conventional methods such as (UV irradiation) or mutagenesis with nitrosoguanidine (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine). Furthermore, the incorporation of site-specific mutations can be performed by known chromosome proofreading methods, for example based on λRed/ET-mediated integration.
破壊対象のクラスターに含まれる遺伝子の存在又は非存在は、染色体ＤＮＡの制限処理を行った後に、遺伝子配列に基づいたプローブを使用するサザンブロッティング、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）等を行うことによって測定することができる。遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティング、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等を含む種々の周知の方法を使用し、遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量を測定することによって決定することができる。遺伝子によってコードされるタンパク質の量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後にイムノブロッティングアッセイ（ウエスタンブロッティング解析）、又はタンパク質サンプルの質量分析解析等を行うことを含む公知の方法によって測定することができる。 The presence or absence of the gene contained in the cluster to be destroyed is measured by subjecting the chromosomal DNA to restriction treatment, followed by Southern blotting using a probe based on the gene sequence, fluorescence in situ hybridization (FISH), etc. can do. The level of gene expression can be determined by measuring the amount of mRNA transcribed from the gene using various well known methods including Northern blotting, quantitative RT-PCR and the like. The amount of protein encoded by the gene can be measured by a known method including performing SDS-PAGE and then performing immunoblotting assay (western blotting analysis), mass spectrometry analysis of a protein sample, or the like.
前述のようにクラスター１３は配列番号１に示される塩基配列を有し、クラスター１９
は配列番号２に示される塩基配列を有し、クラスター４及び５は配列番号３及び４に示される塩基配列を有する。ストレプトマイセス・アルブラスの株間で、ＤＮＡ配列が幾分異なり得ることから、前記各クラスター又はそれに含まれる遺伝子の配列は前記配列にそれぞれ示す遺伝子に限定されるものではないが、該配列番号の変異体（variant）ヌクレオチド配列またはそれに相同なものであって、それぞれ該クラスターに含まれる遺伝子がコードするタンパク質の変異体をコードする遺伝子を含むものとすることができる。
As described above, the cluster 13 has the base sequence shown in SEQ ID NO:1, and the cluster 19
Has the base sequence shown in SEQ ID NO:2, and clusters 4 and 5 have the base sequence shown in SEQ ID NOS:3 and 4. Since the DNA sequences of Streptomyces albrus strains may differ to some extent, the sequences of the above-mentioned clusters or genes contained therein are not limited to the genes shown in the above-mentioned sequences, respectively. It may include a variant nucleotide sequence or a homologue thereof, each encoding a variant of a protein encoded by a gene included in the cluster.
「変異体タンパク質」という記載は、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加のいずれであるかに拘らず、破壊対象のクラスターに含まれる遺伝子がコードするタンパク質の配列と比較して、配列中に１又は数個の変更を有するが、それぞれ同タンパク質のものと類似する活性又は機能を依然として維持するか、又は同タンパク質の三次元構造が、野生型又は改変されていないタンパク質に対して有意に変更されていないタンパク質を意味するものとすることができる。変異体タンパク質における変更の数は、タンパク質の三次元構造中の位置又はアミノ酸残基の種類に依存し、厳密には限定されるものではないが、１〜３０個、他の例では１〜１５個、他の例では１〜１０個、更に他の例では１〜５個とすることができる。あるいは、破壊対象のクラスターに含まれる遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列に対して８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は９８％以上のパラメータ「同一性」として特定される相同性を有し得る。 The description "mutant protein" refers to a protein encoded by a gene contained in a cluster to be destroyed, regardless of whether one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted, and/or added. Has one or a few alterations in the sequence compared to the sequence of, but still retains an activity or function similar to that of the protein, respectively, or the three-dimensional structure of the protein is wild-type or modified. It can mean a protein that has not been significantly altered relative to the unmodified protein. The number of alterations in the mutant protein depends on the position in the three-dimensional structure of the protein or the type of amino acid residue, and is not strictly limited, but is 1 to 30, and in other examples 1 to 15 The number may be 1 to 10 in another example, and 1 to 5 in still another example. Alternatively, 80% or more, 90% or more, 95% or more, or 98% or more of the homology specified as the parameter “identity” with respect to the amino acid sequence of the protein encoded by the gene included in the cluster to be destroyed is identified. You can
１又は数個のアミノ酸残基の例示的な置換、欠失、挿入、及び／付加は、保存的な１又は数個の変異とすることができる。代表的な保存的な変異は、保存的な置換である。保存的な置換は、限定されるものではないが、置換部位が芳香族アミノ酸である場合は互いにPhe, Trp及びTyrの間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合はAla, Leu, Ile及びValの間で、置換部位が親水性アミノ酸である場合はGlu, Asp, Gln, Asn, Ser, His及びThrの間で、置換部位が極性アミノ酸である場合はGln及びAsnの間で、置換部位が塩基性アミノ酸である場合はLys, Arg及びHisの間で、置換部位が酸性アミノ酸である場合はAsp及びGluの間で、置換部位が水酸基を有するアミノ酸である場合はSer及びThrの間で置換を引き起こす置換とすることができる。保存的な置換の例には、AlaについてのSer又はThrの置換、ArgについてのGln, His又はLysの置換、AsnについてのGlu, Gln, Lys, His又はAspの置換、AspについてのAsn, Glu又はGlnの置換、CysについてのSer又はAlaの置換、GlnについてのAsn, Glu, Lys, His, Asp又はArgの置換、GluについてのAsn, Gln, Lys又はAspの置換、GlyについてのProの置換、HisについてのAsn, Lys, Gln, Arg又はTyrの置換、IleについてのLeu, Met, Val又はPheの置換、Leu についてのIle, Met, Val又はPheの置換、LysについてのAsn, Glu, Gln, His又はArgの置換、MetについてのIle, Leu, Val又はPheの置換、PheについてのTrp, Tyr, Met, Ile又はLeu の置換、SerについてのThr又はAla の置換、Thr についてのSer又はAlaの置換、TrpについてのPhe又はTyrの置換、TyrについてのHis, Phe又はTrpの置換、及びValについてのMet, Ile又はLeuの置換が含まれる。 Exemplary substitutions, deletions, insertions, and/or additions of one or several amino acid residues can be conservative one or several mutations. A typical conservative mutation is a conservative substitution. Conservative substitutions include, but are not limited to, between Phe, Trp, and Tyr when the substitution site is an aromatic amino acid, and Ala, Leu, Ile, and Ile when the substitution site is a hydrophobic amino acid. Between Val, between Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, His and Thr when the substitution site is a hydrophilic amino acid, and between Gln and Asn when the substitution site is a polar amino acid, the substitution site Between Lys, Arg and His when is a basic amino acid, between Asp and Glu when the substitution site is an acidic amino acid, and between Ser and Thr when the substitution site is an amino acid having a hydroxyl group. It can be a substitution that causes a substitution. Examples of conservative substitutions include Ser or Thr for Ala, Gln, His or Lys for Arg, Glu, Gln, Lys, His or Asp for Asn, Asn, Glu for Asp. Or Gln substitution, Ser or Ala substitution for Cys, Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg substitution for Gln, Asn, Gln, Lys or Asp substitution for Glu, Pro substitution for Gly , Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr substitution for His, Leu, Met, Val or Phe substitution for Ile, Ile, Met, Val or Phe substitution for Leu, Asn, Glu, Gln for Lys , Substitution of His or Arg, Substitution of Ile, Leu, Val or Phe for Met, Substitution of Trp, Tyr, Met, Ile or Leu for Phe, Substitution of Thr or Ala for Ser, Ser or Ala for Thr Substitution, Phe or Tyr substitution for Trp, His, Phe or Trp substitution for Tyr, and Met, Ile or Leu substitution for Val.
タンパク質又はＤＮＡの相同性の程度を評価するために、ＢＬＡＳＴサーチ、ＦＡＳＴＡサーチ及びＣｌｕｓｔａｌＷ法などのいくつかの計算方法を使用することができる。ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）サーチは、プログラムblastp, blastn, blastx, megablast, tblastn及びtblastxによって用い
られるヒューリスティックなサーチアルゴリズムであり、これらのプログラムは、Samuel
K.とAltschul S.F. （「一般的なスコアリングスキームを使用することにより分子配列特徴の統計的な有意性を評価する方法」Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-2268; 「分子配列におけるマルチプルな高スコアリング断片についての応用と統計」Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-5877）の統計的な方法を使用するその所見に有意性を帰するものである。コンピュータプログラムＢＬＡＳＴにより、３つのパラメータ：スコア、同一性及び類似性が計算される。ＦＡＳＴＡサーチ法は、Pearson W.R. （「FASTP及びFASTAを用いる迅速で感度の高い配列比較」, Methods Enzymol., 1990, 183:63-98
）によって記載されている。ＣｌｕｓｔａｌＷ法は、Thompson J.D.ら（「CLUSTAL W：配列の重み付け、位置特異的ギャップペナルティ及びウエイトマトリックス選択により斬新的なマルチプル配列の並びの感度を改良する」, Nucleic Acids Res., 1994, 22:4673-4680）によって記載されている。
Several computational methods can be used to assess the degree of protein or DNA homology, such as the BLAST search, the FASTA search and the ClustalW method. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) search is a heuristic search algorithm used by the programs blastp, blastn, blastx, megablast, tblastn and tblastx. , Samuel
K. and Altschul SF ("Methods for assessing statistical significance of molecular sequence features by using a general scoring scheme" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-2268; "Applications and Statistics for Multiple Highly Scoring Fragments in Molecular Sequences" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-5877) attributed their significance using the statistical method. It is a thing. The computer program BLAST calculates three parameters: score, identity and similarity. The FASTA search method is based on Pearson WR ("Fast and Sensitive Sequence Comparison Using FASTP and FASTA", Methods Enzymol., 1990, 183:63-98.
). The Clustal W method is used by Thompson JD et al. (“CLUSTAL W: Improving novel alignment sensitivity of multiple sequences by sequence weighting, position-specific gap penalty and weight matrix selection”, Nucleic Acids Res., 1994, 22:4673. -4680).
さらに、破壊対象のクラスター又はそれに含まれる遺伝子は、変異体ヌクレオチド配列とすることができる。「変異体ヌクレオチド配列」という記載は、標準的な遺伝子コード表（例えば、Lewin B., 「遺伝子VIII」（Genes VIII）, 2004, Pearson Education, Inc., Upper Saddle River, NJ 07458参照）に従ういずれかの同義アミノ酸コドンを使用して、破壊対象のクラスター又はそれに含まれる遺伝子がコードするタンパク質をコードするヌクレオチド配列を意味するものとすることができ、これは、同タンパク質の「変異体タンパク質」と呼ぶこともできる。 Further, the cluster to be disrupted or the gene contained therein can be a mutant nucleotide sequence. The description of "variant nucleotide sequence" follows any standard gene code table (see, for example, Lewin B., "Gene VIII" (Genes VIII), 2004, Pearson Education, Inc., Upper Saddle River, NJ 07458). The synonymous amino acid codon may be used to mean a nucleotide sequence encoding a protein encoded by a cluster to be destroyed or a gene contained therein, which is referred to as a “variant protein” of the protein. You can also call it.
また、「変異体ヌクレオチド配列」という記載は、限定されるものではないが、ストリンジェントな条件下で、破壊対象のクラスター又はそれに含まれる遺伝子の配列に相補的なヌクレオチド配列、又はストリンジェントな条件下でヌクレオチド配列から調製することのできるプローブ（ただし、これは活性又は機能性のタンパク質をコードする）とハイブリダイズするヌクレオチド配列を意味するものとすることもできる。「ストリンジェントな条件」には、特異的なハイブリッド、例えば、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴを使用した場合に、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上のパラメータ「同一性」として特定される相同性を有するハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッド、例えば、前記より低い相同性を有するハイブリッドが形成されないものが含まれる。例えば、ストリンジェントな条件は、６０℃又は６５℃において、１×ＳＳＣ（標準クエン酸ナトリウム又は標準塩化ナトリウム）の塩濃度、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、又は他の例では、０．１カケルＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回以上洗浄すること、又は他の例では、２回又は３回洗浄することにより例示されるものとすることができる。洗浄の継続時間は、ブロッティングのために使用する膜の種類に依存し、通常は、製造業者によって推奨されたものとすることができる。例えば、ストリンジェントな条件下において、アマシャム・ハイボンド（登録商標）−Ｎ＋の正荷電ナイロン膜（ＧＥヘルスケア）について推奨された洗浄の継続時間は１５分である。洗浄工程は、２〜３回行うことができる。プローブとして、配列番号１、２、３又は４に示す配列に相補的な配列の一部を使用することもできる。この種プローブは、配列番号１、２、３又は４に示す配列に基づいて調製したプライマーとしてのオリゴヌクレオチド、及び鋳型としてのヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を使用し、ＰＣＲによって作製することができる。プローブの長さは、＞５０ｂｐであることが推奨されており、これは、ハイブリダイゼーション条件に依存して適切に選択することができ、通常は１００ｂｐ〜１ｋｂｐである。例えば、約３００ｂｐの長さを有するＤＮＡ断片をプローブとして使用する場合は、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件は、５０℃、６０℃又は６５℃で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより例示されるものとすることができる。 In addition, the description of “variant nucleotide sequence” is not limited, but it is a stringent condition, a nucleotide sequence complementary to the cluster of the disruption target or the sequence of the gene contained therein, or a stringent condition. It can also mean a nucleotide sequence which hybridizes with a probe which can be prepared from the nucleotide sequence below, which in turn codes for an active or functional protein. "Stringent conditions" include specific hybrids, for example, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98 when using the computer program BLAST. Hybrids are formed that have a homology specified as a parameter “identity” of greater than or equal to 99%, or greater than 99%, and non-specific hybrids, such as those in which hybrids with lower homology are not formed. For example, stringent conditions are: salt concentration of 1×SSC (standard sodium citrate or standard sodium chloride), 0.1% SDS (sodium dodecyl sulfate) at 60° C. or 65° C., or 0 in other examples. It may be exemplified by one or more washes with 1 Kakeru SSC, 0.1% SDS, or in another example, two or three washes. The duration of the wash depends on the type of membrane used for blotting and can usually be that recommended by the manufacturer. For example, under stringent conditions, the recommended cleaning duration for Amersham Highbond®-N+ positively charged nylon membranes (GE Healthcare) is 15 minutes. The washing process can be performed 2-3 times. As the probe, a part of the sequence complementary to the sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4 can be used. This seed probe can be prepared by PCR using an oligonucleotide prepared as a primer based on the sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4 and a DNA fragment containing a nucleotide sequence as a template. The length of the probe is recommended to be >50 bp, which can be appropriately selected depending on the hybridization conditions, usually 100 bp to 1 kbp. For example, when a DNA fragment having a length of about 300 bp is used as a probe, the washing conditions after hybridization are those exemplified by 2×SSC, 0.1% SDS at 50° C., 60° C. or 65° C. Can be
細菌は、既に言及した性質に加えて、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の栄養要求、薬剤耐性、薬剤感受性、及び薬剤依存性などの他の特定の性質を有するものとすることができる。 In addition to the properties already mentioned, the bacterium may have other specific properties such as different nutritional requirements, drug resistance, drug sensitivity, and drug dependence without departing from the scope of the present invention. it can.
＜２＞ＥＰＬの製造方法
前述した本発明のストレプトマイセス・アルブラスは、ＥＰＬの製造に好適に用いることができる。すなわち、本発明の第二の態様は、本発明のＥＰＬ生産菌を用いるＥＰＬの製造方法である。
<2> Method for producing EPL The above-mentioned Streptomyces albulus of the present invention can be suitably used for producing EPL. That is, the second aspect of the present invention is a method for producing EPL using the EPL-producing bacterium of the present invention.
本発明のＥＰＬの製造方法は、ＥＰＬ生産菌である本発明のストレプトマイセス・アルブラスを培地中で好気的に培養する工程（培養工程）、及び前記培地からε−ポリ−Ｌ−リジンを回収する工程（回収工程）を含む。 The method for producing EPL of the present invention comprises a step of aerobically culturing Streptomyces albulus of the present invention which is an EPL-producing bacterium in a medium (culturing step), and ε-poly-L-lysine from the medium. It includes a step of collecting (collecting step).
培養工程は本発明のＥＰＬ生産菌にＥＰＬを生成させ培地中に蓄積させるものである。本工程は、微生物を使用してＥＰＬを製造する従来の発酵法と同様の方法で行うことができる。
本発明のストレプトマイセス・アルブラスの培養培地は、合成又は天然培地、例えば、炭素源、窒素源、硫黄源、無機イオン、及び必要に応じて他の有機及び無機成分を含む典型的な培地とすることができる。
炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、ショ糖、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース、及び澱粉の加水分解物などの糖類；グリセリン、マンニトール、及びソルビトールなどのアルコール；グルコン酸、フマル酸、クエン酸、リンゴ酸、及びコハク酸などの有機酸等を使用することができる。その含有量は０．１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましい。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、及びリン酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩；酵母エキス、ペプトン、カゼイン加水分解物、アミノ酸、大豆加水分解物などの有機窒素；アンモニアガス；アンモニア水等を使用することができる。その含有量は０．１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
硫黄源としては、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン等を含むものとすることができる。その含有量は０．１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましい。
無機イオンとしては、リン酸イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、硫酸イオン等を与えるものが挙げられる。その含有量は０．１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
The culturing step is for the EPL-producing bacterium of the present invention to generate EPL and accumulate it in the medium. This step can be performed by a method similar to the conventional fermentation method of producing EPL using a microorganism.
The culture medium of Streptomyces albulus of the present invention is a synthetic or natural medium, for example, a typical medium containing a carbon source, a nitrogen source, a sulfur source, inorganic ions, and optionally other organic and inorganic components. can do.
Examples of carbon sources include glucose, lactose, galactose, fructose, sucrose, arabinose, maltose, xylose, trehalose, ribose, and sugars such as starch hydrolysates; alcohols such as glycerin, mannitol, and sorbitol; gluconic acid, fumarate. Organic acids such as acids, citric acid, malic acid, and succinic acid can be used. The content is preferably 0.1 to 10% (w/v).
As the nitrogen source, use inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate; organic nitrogen such as yeast extract, peptone, casein hydrolyzate, amino acid, soybean hydrolyzate; ammonia gas; ammonia water, etc. be able to. The content is preferably 0.1 to 5% (w/v).
The sulfur source may include ammonium sulfate, magnesium sulfate, ferrous sulfate, manganese sulfate and the like. The content is preferably 0.1 to 10% (w/v).
Examples of the inorganic ion include those which give a phosphate ion, a potassium ion, a sodium ion, a magnesium ion, a zinc ion, an iron ion, a manganese ion, a nickel ion, a sulfate ion and the like. The content is preferably 0.1 to 5% (w/v).
培養は、好気的条件下で好ましくは１０〜１５０時間、より好ましくは２０〜１２０時間振とう培養、攪拌培養等により行うことができる。培養温度は、好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは２５〜３５℃とする。培地のｐＨは、好ましくは３〜８、より好ましくは４〜７に調整する。ｐＨは、無機若しくは有機の酸性又はアルカリ性物質、並びにアンモニアガスを使用することにより調整すればよい。
また、培養工程の途中で、炭素源や窒素源を逐次添加してもよい。また、Ｌ−リジンを液体培地に添加することが好ましく、その量は通常０．１〜２％（ｗ／ｖ）である。また、クエン酸、リンゴ酸を添加することは好ましく、その量は通常０．１〜５％(ｗ／ｖ)である。
Culturing can be carried out under aerobic conditions, preferably 10 to 150 hours, more preferably 20 to 120 hours by shaking culture, stirring culture, or the like. The culture temperature is preferably 15 to 40°C, more preferably 25 to 35°C. The pH of the medium is preferably adjusted to 3-8, more preferably 4-7. The pH may be adjusted by using an inorganic or organic acidic or alkaline substance and ammonia gas.
In addition, a carbon source and a nitrogen source may be sequentially added during the culture process. Further, L-lysine is preferably added to the liquid medium, and the amount thereof is usually 0.1 to 2% (w/v). Further, it is preferable to add citric acid and malic acid, and the amount thereof is usually 0.1 to 5% (w/v).
回収工程は、培養工程の後の培地から細胞及び細胞の残骸などの不溶固体成分を遠心分離又は膜ろ過によって液体培地から除去した後、カチオン交換クロマトグラフィーによりＥＰＬを精製し、濃縮した後、アセトン、エタノール等の有機溶媒で晶析することにより行うことができるが、これに限定されない。 In the recovery step, insoluble solid components such as cells and cell debris are removed from the liquid medium by centrifugation or membrane filtration from the medium after the culturing step, EPL is purified by cation exchange chromatography, concentrated, and then acetone is added. It can be carried out by crystallization with an organic solvent such as ethanol, but is not limited thereto.
以下、具体的な実験例をあげて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の態様にのみ限定されない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to specific experimental examples, but the present invention is not limited to the following embodiments.
＜実施例１＞ストレプトマイセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７株の網羅的遺伝子発現解析
ＥＰＬ生産菌であるストレプトマイセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７株の網羅的遺伝子発現解析（トランスクリプトーム解析）を行った。
（１）ストレプトマイセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７株の培養
M3G培地（グルコース5wt%、酵母エキス0.5wt%、硫酸アンモニウム1wt%、K2HPO40.08wt%
、KH2PO4 0.136wt%、MgSO4・7H2O 0.05wt%、ZnSO4・7H2O 0.004wt%、FeSO4・7H2O 0.003wt%（pH 6.8））を用いて、ストレプトマイセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７を培養した。30℃で20時間好気的に培養して得た100mLの前培養液を1Lの培地に加え、3L容ジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）を使用して30℃、500rpm、通気量3.0 L/minで好気的に培養した。菌体の増殖に伴って培養液のpHは徐々に低下したため、培養液pHが4.2に達した時点（培養開始後12時間）から10w/v%アンモニア水を添加して培養液pHを4.2に維持した。この培養過程において、ＥＰＬの生産はpH4.2に低下した後にのみ観察された。従って、培養開始8時間後及び35時間後に培養液から遠心分離により菌体を回収し、それぞれ生育期菌体及び生産期菌体とした。
<Example 1> Comprehensive gene expression analysis of Streptomyces albulus NBRC14147 strain An exhaustive gene expression analysis (transcriptome analysis) of Streptomyces albrus NBRC14147 strain, which is an EPL-producing strain, was performed.
(1) Culture of Streptomyces albulus NBRC14147 strain
M3G medium (glucose 5 wt%, yeast extract 0.5 wt%, ammonium sulfate 1 wt%, K 2 HPO 4 0.08 wt%
, KH 2 PO 4 0.136wt%, MgSO 4 /7H 2 O 0.05wt%, ZnSO 4 /7H 2 O 0.004wt%, FeSO 4 /7H 2 O 0.003wt% (pH 6.8)) -Albulus NBRC14147 was cultured. Add 100 mL of preculture liquid obtained by culturing aerobically at 30°C for 20 hours to 1 L of medium, and use 3 L jar fermenter (Maruhishi Bioengine) at 30°C, 500 rpm, aeration rate The culture was performed aerobically at 3.0 L/min. Since the pH of the culture solution gradually decreased with the growth of the bacterial cells, when the pH of the culture solution reached 4.2 (12 hours after the start of culture), 10 w/v% ammonia water was added to bring the pH of the culture solution to 4.2. Maintained. During this culture process, EPL production was observed only after the pH had dropped to 4.2. Therefore, 8 hours and 35 hours after the start of the culture, the cells were collected from the culture solution by centrifugation to obtain cells in the growth phase and cells in the production phase, respectively.
（２）培養菌体からのTotal RNAの抽出
生育期菌体及び生産期菌体それぞれを、Tris-HCl飽和フェノール／クロロホルム混合液に懸濁し、超音波で菌体を破砕した。菌体破砕液にトリイソプロピルナフタレン硫酸塩を含んだトリス／フェノール混合液を加え、良く混合後遠心分離し、水層のみを分取することでタンパク質などの不純物を除去した。分取した水層に酢酸ナトリウム、イソプロパノールを加え、静置した後、遠心分離し、上清を捨て、70v/v%エタノールを加えた。さらにこれを良く混合後、遠心分離して上清をきれいに取り除き沈殿を回収した。続いて回収した沈殿を適当な緩衝溶液に懸濁した後、塩化リチウムを加え静置し、遠心分離した。上清を捨て、沈殿したRNAを70v/v%エタノールでリンスし、風乾後適当な緩衝液に溶解させてRNA試料とした。RNA試料に対して、A260、A260/A280の吸光度測定、アガロース電気泳動により純度確認を行なった。
(2) Extraction of Total RNA from Cultured Cells The growing cells and the producing cells were suspended in a Tris-HCl saturated phenol/chloroform mixed solution and sonicated to disrupt the cells. A tris/phenol mixed solution containing triisopropylnaphthalene sulfate was added to the disrupted cell suspension, mixed well and centrifuged, and only the aqueous layer was separated to remove proteins and other impurities. Sodium acetate and isopropanol were added to the separated aqueous layer, and the mixture was left standing and then centrifuged, the supernatant was discarded, and 70 v/v% ethanol was added. Further, this was thoroughly mixed and then centrifuged to remove the supernatant cleanly and collect the precipitate. Subsequently, the collected precipitate was suspended in an appropriate buffer solution, lithium chloride was added, and the mixture was left standing and centrifuged. The supernatant was discarded, the precipitated RNA was rinsed with 70 v/v% ethanol, air-dried, and then dissolved in an appropriate buffer to prepare an RNA sample. The RNA sample was subjected to A260, A260/A280 absorbance measurement, and agarose electrophoresis to confirm purity.
（３）シーケンスライブラリーの調製及びシーケンシング
抽出したRNA試料から、Ribo-ZeroTM Magnetic Kit (Gram-Positive Bacteria)によってrRNAを除去した。得られたmRNAを断片化し、逆転写反応により一本鎖cDNAを合成した。これを鋳型としてdUTPを取り込ませた二本鎖cDNAを合成した後、両末端を平滑化・リン酸化処理を施し、更に3’-dA突出処理を行ってIndexアダプターと連結した。続いてアダプターと連結した二本鎖cDNAを鋳型としてdUTPを持つ鎖を増幅しないポリメラーゼによりＰＣＲ増幅したものをシーケンスライブラリーとした。このライブラリーからHiSeq PE Rapid
Cluster Kit v2-HSを用いてクラスター形成を行い、イルミナ社製次世代シーケンサー（HiSeq 2500）を用いて塩基配列を取得した。シーケンス解析の結果、得られた総リード数は47,724,626（総塩基数4,772,462,600塩基）であった。
(3) Preparation of Sequence Library and Sequencing rRNA was removed from the extracted RNA sample by Ribo-Zero™ Magnetic Kit (Gram-Positive Bacteria). The obtained mRNA was fragmented and single-stranded cDNA was synthesized by reverse transcription reaction. After synthesizing a double-stranded cDNA incorporating dUTP using this as a template, both ends were subjected to blunting/phosphorylation treatment, and further subjected to 3′-dA overhanging treatment to ligate to the Index adapter. Subsequently, a double-stranded cDNA linked to an adapter was used as a template and PCR-amplified with a polymerase that did not amplify a chain having dUTP to obtain a sequence library. From this library HiSeq PE Rapid
Cluster formation was performed using Cluster Kit v2-HS, and the nucleotide sequence was obtained using a next-generation sequencer (HiSeq 2500) manufactured by Illumina. As a result of sequence analysis, the total number of reads obtained was 47,724,626 (total number of bases 4,772,462,600 bases).
（４）シーケンスデータ解析
このリード配列をGenedata Profiler Genome (Genedata社)を用いてＮＢＲＣ１４１４７株のゲノムデータにマッピングした結果、97.8％のリードがマッピングされた。その後、マッピングで得られたゲノム位置情報からアノテーションを行い、遺伝子ごと、転写産物毎に発現量の算出を行った。得られた一次データからFPKM(Fragments Per Kilobase of
exon per Million mapped fragments)値を用いた正規化処理、フィルタリング（リードカウント16未満の除去）、対数変換（logFPKM値）を行った。これらのデータ前処理を行った後、Integrative Genome Viewerソフトウエアを用いて、前述のＮＢＲＣ１４１４７株のゲノムデータからAntiSMASHにより検出された３７の推定二次代謝産物生合成遺伝子群について発現量比較解析を行った。
(4) Sequence data analysis As a result of mapping this read sequence to the genomic data of the NBRC14147 strain using Genedata Profiler Genome (Genedata), 97.8% of reads were mapped. Then, annotation was performed from the genomic position information obtained by mapping, and the expression level was calculated for each gene and each transcript. From the obtained primary data, FPKM (Fragments Per Kilobase of
Normalization processing using exon per Million mapped fragments) value, filtering (removal of less than 16 read counts), and logarithmic conversion (logFPKM value) were performed. After preprocessing these data, comparative expression analysis was performed on 37 putative secondary metabolite biosynthesis genes detected by AntiSMASH from the genomic data of the NBRC14147 strain described above using the Integrative Genome Viewer software. It was
その結果、オペロンを形成するＥＰＬ合成酵素遺伝子及び分解酵素遺伝子（クラスター５）は、ＥＰＬ生産期に顕著に発現量が増加することが確認された。これはＮＢＲＣ１４１４７株が培養後期にＥＰＬを生産すると言う事実ともよく一致する。
また、興味深いことにOrn cyclodeaminase遺伝子、Cysteine Synthase遺伝子、及びNRPS様酵素遺伝子を含む二次代謝遺伝子群（クラスター１３）の発現量も同様にＥＰＬ生産期に顕著に増加することが確認された。なお、別の実験において、該クラスターを破壊し
た株では、非破壊株では著量生産されるジアミノプロピオン酸ポリマーが非検出となった。一方、Zhaoxian Xuらにより（Scientific Reports, 5:17400 (2015)）ジアミノプロピオン酸ポリマー生合成遺伝子として同定されている遺伝子（pdaps）は、トランスクリプトーム解析において二次代謝期に全く発現していないことが判明し、実際に当該遺伝子を破壊しても、当該ポリマーの生産は維持された。これらのことから、pdaps遺伝子ではなくクラスター１３がジアミノプロピオン酸ポリマーの生合成に関与する遺伝子群であることが確認された。
As a result, it was confirmed that the expression levels of the EPL synthase gene and the degrading enzyme gene (cluster 5) forming the operon markedly increased during the EPL production period. This is in good agreement with the fact that the NBRC14147 strain produces EPL in the latter stage of culture.
In addition, it was confirmed that the expression levels of the secondary metabolic gene group (cluster 13) including the Orn cyclodeaminase gene, the Cysteine Synthase gene, and the NRPS-like enzyme gene also increased remarkably during the EPL production period. In another experiment, in the strain in which the cluster was disrupted, the diaminopropionic acid polymer, which was produced in a large amount in the non-disrupted strain, was not detected. On the other hand, the gene (pdaps) identified by Zhaoxian Xu et al. (Scientific Reports, 5:17400 (2015)) as a diaminopropionate polymer biosynthesis gene is not expressed at all in the secondary metabolic phase in the transcriptome analysis. It was found that even when the gene was actually destroyed, the production of the polymer was maintained. From these facts, it was confirmed that cluster 13, not the pdaps gene, is a group of genes involved in the biosynthesis of diaminopropionic acid polymer.
さらに、Streptomyces ahygroscopicus由来のテトラマイシン生合成遺伝子群と９８％の相同性を示すTypeI ポリケチド合成酵素遺伝子群(クラスター１９)もＥＰＬ生産期に発現上昇することが確認された。なお、別の実験において、該クラスターを破壊した株では、テトラマイシンの生産が検出されなくなることから、クラスター１９はテトラマイシンの生合成に関与する遺伝子群であることが確認された。 Furthermore, it was also confirmed that the expression of the Type I polyketide synthase gene group (cluster 19) showing 98% homology with the tetramycin biosynthetic gene group derived from Streptomyces ahygroscopicus (cluster 19) was also increased during the EPL production period. In another experiment, tetramycin production was not detected in the strain in which the cluster had been disrupted, confirming that cluster 19 is a gene group involved in tetramycin biosynthesis.
さらに、Streptomyces albulus CK-15株由来のナイスタチン生合成遺伝子群とそれぞれ９７％及び９９％の相同性を示すクラスター４及び５もＥＰＬ生産期に発現上昇することが確認された。該遺伝子クラスターはゲノムデータ上では二分されているが、CK-15株由来のナイスタチン生合成遺伝子群との比較から互いに隣接して１つの遺伝子群を構成していると考えられた。実際に、別の実験において、該クラスターを一括破壊した株では、ナイスタチンの生成量が非検出となったことから、クラスター４及び５はゲノム上では隣接して存在しており、ナイスタチン生合成に関与することが確認された。 Furthermore, it was also confirmed that the clusters 4 and 5 showing 97% and 99% homology with the nystatin biosynthetic gene group derived from Streptomyces albulus CK-15 strain, respectively, had increased expression during the EPL production period. Although the gene cluster is divided into two in the genomic data, it was considered that one gene group was adjacent to each other by comparison with the nystatin biosynthesis gene group derived from the CK-15 strain. In fact, in another experiment, in the strain in which the cluster was disrupted collectively, the amount of nystatin produced was undetectable, so that clusters 4 and 5 exist adjacent to each other on the genome, and thus the nystatin biosynthesis is not detected. It was confirmed to be involved.
＜実施例２＞クラスター１３破壊株の構築
（１）クラスター１３破壊プラスミドの構築
ストレプトマイセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７株の染色体ＤＮＡを鋳型として、クラスター１３の上流及び下流領域それぞれ約3-kbpを以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、それぞれLeft arm及び Right armとした。同様にpUC19-aac(3)IV-codAプラスミドからアプラマイシン耐性遺伝子（aac(3)IV）を含む約2.4-kbp領域をPCR増幅した。
<Example 2> Construction of cluster 13-disrupted strain (1) Construction of cluster 13-disrupted plasmid Using the chromosomal DNA of Streptomyces albulus NBRC14147 strain as a template, approximately 3-kbp each of the upstream and downstream regions of cluster 13 were prepared as the following primers. PCR amplification was carried out to obtain Left arm and Right arm, respectively. Similarly, an approximately 2.4-kbp region containing the apramycin resistance gene (aac(3)IV) was PCR-amplified from the pUC19-aac(3)IV-codA plasmid.
BamHI及びHindIIIで消化したpK18mobプラスミドと、PCR増幅したLeft arm、Right arm、及びaac(3)IV断片とを混合し、ギブソンアッセンブリー反応により連結した。反応産物でE. coli NEB10βコンピテントセルを形質転換し、ネオマイシン及びアプラマイシンに二重耐性を示すクローンからプラスミドを抽出し、制限マッピングによりクラスター１３破壊プラスミド(pK18mob-Δcluster 13)の構築を確認した。 The pK18mob plasmid digested with BamHI and HindIII was mixed with the PCR-amplified Left arm, Right arm, and aac(3)IV fragments and ligated by Gibson assembly reaction. E. coli NEB10β competent cells were transformed with the reaction product, a plasmid was extracted from a clone showing dual resistance to neomycin and apramycin, and the construction of a cluster 13 disruption plasmid (pK18mob-Δcluster 13) was confirmed by restriction mapping. ..
（２）ストレプトマイセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７株におけるクラスター１３破壊株の構築
前記構築したプラスミドpK18mob-Δcluster13をE. coli ET12567株へ導入し、更にpUB3
07プラスミドを有するE. coli ET12567株との三親性接合伝達によってストレプトマイセス・アルブラスＮＢＲＣ１４１４７株へ導入した（参考文献：J Am Chem Soc 134:12434-12437、2012）。その後、アプラマイシン耐性且つネオマイシン感受性株をクラスター１３破壊候補株として選抜した。この候補株から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型として、以下のプライマーを用いたマルチプレックスPCRによりクラスター１３の欠失及びaac(3)IV遺伝子との置換、すなわち当該遺伝子群の破壊を確認した。
(2) Construction of cluster 13 disrupted strain in Streptomyces albrus NBRC14147 strain The plasmid pK18mob-Δcluster13 constructed above was introduced into E. coli ET12567 strain, and pUB3 was further introduced.
It was introduced into the Streptomyces albulus NBRC14147 strain by triparental conjugal transfer with the E. coli ET12567 strain containing the 07 plasmid (reference document: J Am Chem Soc 134:12434-12437, 2012). Then, apramycin resistant and neomycin sensitive strains were selected as cluster 13 disruption candidate strains. Using the chromosomal DNA extracted from this candidate strain as a template, deletion of cluster 13 and substitution with the aac(3)IV gene, that is, disruption of the gene group was confirmed by multiplex PCR using the following primers.
その結果、取得した候補株染色体ＤＮＡからはクラスター１３のorf3遺伝子（配列番号１の７３９１〜８３９８番目の塩基配列）の増幅は認められず、且つaac(3)IV遺伝子の増幅が確認されたことから、クラスター１３の破壊を確認した。この一連の操作により作出した株をS. albulus Δcluster 13株とした。 As a result, no amplification of the orf3 gene of cluster 13 (7391 to 8398th nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1) was observed from the obtained candidate strain chromosomal DNA, and amplification of the aac(3)IV gene was confirmed. From this, the destruction of the cluster 13 was confirmed. The strain produced by this series of operations was designated as S. albulus Δcluster 13 strain.
＜実施例３＞クラスター１３破壊株と非破壊株とのＥＰＬ生産性の比較
M3G培地（グルコース5wt%、酵母エキス0.5wt%、硫酸アンモニウム1wt%、K2HPO4 0.08wt%、KH2PO4 0.136wt%、MgSO4・7H2O 0.05wt%、ZnSO4・7H2O 0.004wt%、FeSO4・7H2O 0.003wt%（pH 6.8））を用いて、S. albulus NBRC14147株及びS. albulus Δcluster 13株をそれぞれ培養した。30℃で20時間好気的に培養して得た100mLの前培養液を1Lの培地にそれぞれ加え、3L容ジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）を使用して30℃、400rpm、通気量3.0 L/minで好気的に培養した。菌体の増殖に伴って培養液のpHは徐々に低下したため、培養液pHが4.2に達した時点（培養開始後12時間）から10w/v%アンモニア水を添加して培養液pHを4.2に維持した。培養開始後24時間からフィード液（グルコース 50wt%、硫酸アンモニウム5wt%）を適宜追加してグルコース濃度をコントロールし、8時間、16時間ごとに培養液を回収して、ＥＰＬの生産を確認しつつ120時間まで培養を実施した。
なお、培養液中に蓄積したＥＰＬは、メチルオレンジを用いたItzhakiの方法（Analitical Biochemistry vol. 50, 569-574(1972)）によって定量した。すなわち、培養液上清０．１ｍＬに0.1 Mリン酸バッファー（ｐＨ6.9）1.9 mLを加えた液に1 mMメチルオレンジ水溶液2 mLを混合し、30℃で30分放置後、生じたＥＰＬとメチルオレンジの複合体を遠心分離によって除去し、その上清の465 nmにおける吸光度を測定した。一方、ＥＰＬの標準品を用いて作製した検量線から、ＥＰＬ量を算出した。さらにグルコース消費量からＥＰＬの対糖収率も算出した。
<Example 3> Comparison of EPL productivity between the cluster 13 disrupted strain and the non-disrupted strain
M3G medium (glucose 5 wt%, yeast extract 0.5 wt%, ammonium sulfate 1 wt%, K2HPO4 0.08 wt%, KH2PO4 0.136 wt%, MgSO4/7H2O 0.05 wt%, ZnSO4/7H2O 0.004 wt%, FeSO4/7H2O 0.003 wt% (pH 6.8 )) was used to culture the S. albulus NBRC14147 strain and the S. albulus Δcluster 13 strain, respectively. 100 mL of preculture liquid obtained by culturing aerobically at 30°C for 20 hours was added to 1 L of the medium, and 3 L jar fermenter (Maruhishi Bioengine) was used at 30°C, 400 rpm, aeration The culture was performed aerobically at a volume of 3.0 L/min. Since the pH of the culture solution gradually decreased with the growth of the bacterial cells, when the pH of the culture solution reached 4.2 (12 hours after the start of culture), 10 w/v% ammonia water was added to bring the pH of the culture solution to 4.2. Maintained. From 24 hours after the start of the culture, a feed solution (glucose 50 wt%, ammonium sulfate 5 wt%) was appropriately added to control the glucose concentration, and the culture solution was collected every 8 hours and 16 hours to confirm the production of EPL. Cultivation was performed up to time.
The EPL accumulated in the culture medium was quantified by the Itzhaki method using methyl orange (Analitical Biochemistry vol. 50, 569-574 (1972)). That is, 1 mL of a 1 mM methyl orange aqueous solution was mixed with a solution obtained by adding 1.9 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 6.9) to 0.1 mL of the culture supernatant, and allowed to stand at 30° C. for 30 minutes, and then the resulting EPL The methyl orange complex was removed by centrifugation and the absorbance of the supernatant was measured at 465 nm. On the other hand, the EPL amount was calculated from the calibration curve prepared using the EPL standard product. Further, the yield of EPL from sugar was calculated from the glucose consumption.
図１にＥＰＬ量を、図２に対糖収率をそれぞれ示す。クラスター１３を破壊したストレプトマイセス・アルブラスでは、非破壊株に比べてＥＰＬ産生量が１．５倍に、対糖収率が１．６倍に向上した。 FIG. 1 shows the EPL amount, and FIG. 2 shows the sugar yield. In Streptomyces albulus that disrupted cluster 13, the EPL production amount was improved 1.5 times and the sugar yield was improved 1.6 times compared to the non-disrupted strain.
クラスター１９、４又は５破壊株についても、実施例２と同様の遺伝子工学的手法による方法で構築することができ、同様に培養によるＥＰＬ生産における産生量の向上を導けることは明白である。 It is clear that the cluster 19, 4 or 5 disrupted strains can also be constructed by the method of the genetic engineering method similar to that in Example 2, and similarly, the production amount in EPL production by culture can be improved.
本発明により、ＥＰＬ生産能がより向上したストレプトミセス・アルブラスが提供され
る。該細菌を培養することにより、ＥＰＬを高収率で発酵生産することができ、また副生成物の産生を抑制することができる。その結果、ＥＰＬ生産量の増大に加え、生産コストの削減や、発酵液からのＥＰＬの分離・精製工程の簡略化も実現されるため、本発明は産業上の利用可能性が高い。
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention provides Streptomyces alblas with improved EPL productivity. By culturing the bacterium, EPL can be fermentatively produced at a high yield, and the production of by-products can be suppressed. As a result, in addition to the increase in EPL production amount, production cost reduction and simplification of the EPL separation/purification process from the fermentation liquor are realized, so that the present invention has high industrial applicability.
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