JP2020074722A

JP2020074722A - 細胞捕捉装置

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Publication number: JP2020074722A
Application number: JP2018210761A
Authority: JP
Inventors: 藤井　輝夫; Teruo Fujii; 輝夫藤井; 秀▲弦▼ 金; Soo-Hyeon Kim; 致済朴; Chieje Park
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2018-11-08
Filing date: 2018-11-08
Publication date: 2020-05-21
Anticipated expiration: 2038-11-08
Also published as: JP7191370B2

Abstract

【課題】単一細胞と細胞クラスターとを同時に、個別に、かつ、識別可能に捕捉することができるようにする。【解決手段】流体チャネルは、底板と、底板の上面側に形成された複数のマイクロウェルであって、細胞を捕捉するマイクロウェルとを含み、底板の上面には、複数のラインを含む一対の薄膜状の櫛歯電極と、各ラインの少なくとも一部の上面を覆うように形成された絶縁膜とが形成され、各櫛歯電極のライン同士は、流体の流れ方向に関して交互になるように配列され、各マイクロウェルは、絶縁膜を膜厚方向に貫通するように形成された貫通孔と、貫通孔の下面に位置するラインとを含み、一対の櫛歯電極に交流電圧を印加すると、電気力線が流体の流れ方向に関して互いに隣接するマイクロウェル同士を結ぶような電界が生じる。【選択図】図１

Description

本開示は、細胞を捕捉するための細胞捕捉装置に関するものである。

従来、流体中の各種の細胞を個別に解析するために、誘電泳動を用いて単一細胞を捕捉するマイクロウェルを備えるマイクロ流体デバイスが提案されている（例えば、特許文献１参照。）。このデバイスを使用することによって、マイクロウェルに単一細胞を効率よく捕捉することができる。

特開２０１２−０３４６４１号公報

しかしながら、前記従来の技術は、流体中に単一細胞と細胞クラスターとが混在する場合、捕捉された細胞が単一細胞であるか細胞クラスターであるかを識別することが困難であった。

近年、血中を循環する腫瘍細胞の場合、単一細胞と細胞クラスターとでは異なる転移能を示すことが明らかになってきており、単一細胞と細胞クラスターとを区別して同時に解析することが求められている。しかし、単一細胞と細胞クラスターとが混在する場合、捕捉対象の大きさの分布範囲が広いので、単一細胞と細胞クラスターとを網羅して捕捉することは、困難である。前述のデバイスで細胞クラスターを捕捉するために印加電圧を高くすると、複数の単一細胞が同一のマイクロウェルに捕捉されるので、捕捉された細胞が単一細胞であるか細胞クラスターであるかを識別することが困難であった。

ここでは、前記従来の技術の問題点を解決して、単一細胞と細胞クラスターとを同時に、個別に、かつ、識別可能に捕捉することができる細胞捕捉装置を提供することを目的とする。

そのために、細胞捕捉装置においては、細胞を含有する流体が流れる流体チャネルを備え、誘電泳動によって前記流体中の細胞を捕捉する細胞捕捉装置であって、前記流体チャネルは、底板と、該底板の上面側に形成された複数のマイクロウェルであって、前記細胞を捕捉するマイクロウェルとを含み、前記底板の上面には、複数のラインを含む一対の薄膜状の櫛歯電極と、各ラインの少なくとも一部の上面を覆うように形成された絶縁膜とが形成され、各櫛歯電極のライン同士は、前記流体の流れ方向に関して交互になるように配列され、各マイクロウェルは、前記絶縁膜を膜厚方向に貫通するように形成された貫通孔と、該貫通孔の下面に位置する前記ラインとを含み、前記一対の櫛歯電極に交流電圧を印加すると、電気力線が前記流体の流れ方向に関して互いに隣接するマイクロウェル同士を結ぶような電界が生じる。

他の細胞捕捉装置においては、さらに、各マイクロウェルの貫通孔の下面は１つのラインによって塞がれ、前記流体の流れ方向に関して互いに隣接するマイクロウェルの貫通孔の下面のラインは、互いに異なる櫛歯電極のラインである。

更に他の細胞捕捉装置においては、さらに、各櫛歯電極のライン同士の間に存在するスペースは、前記流体の流れ方向に関して互いに隣接するマイクロウェル同士の間に位置し、前記絶縁膜によって覆われている。

更に他の細胞捕捉装置においては、さらに、前記流体の流れ方向に関して互いに隣接するマイクロウェル同士は、前記流体の流れに直交する方向に関する位置が互いにずれている。

更に他の細胞捕捉装置においては、さらに、前記マイクロウェルの直径は、前記細胞の直径よりも小さい。

更に他の細胞捕捉装置においては、さらに、前記マイクロウェルは、複数であって異なる直径のものを含み、前記流体チャネルにおいて前記流体の流れの上流側に単一細胞の直径よりも小さな直径のものが位置し、前記流体の流れの下流側に単一細胞の直径以上の直径であって細胞クラスターの等価直径よりも小さな直径のものが位置するように配置されている。

更に他の細胞捕捉装置においては、さらに、前記マイクロウェルの深さは、前記細胞の半径よりも小さい。

更に他の細胞捕捉装置においては、さらに、前記マイクロウェルは、複数であって異なる直径のものを含み、前記流体チャネルにおいて前記流体の流れの最上流側に最小の直径のものが位置し、下流に向かうにつれて直径が漸増し、最下流側に最大の直径のものが位置するように配置されている。

本開示によれば、単一細胞と細胞クラスターとを同時に、個別に、かつ、識別可能に捕捉することができる。

本実施の形態における背景を示す模式図である。本実施の形態における捕捉のターゲットの概念を示す図である。本実施の形態における細胞捕捉装置の構成を示す概略図である。本実施の形態における細胞捕捉装置の概略分解図である。本実施の形態における細胞捕捉装置の床部の概略上面図である。本実施の形態における細胞捕捉装置のマイクロウェルの構成を示す概略断面図である。誘電泳動の原理を説明する図である。従来の細胞捕捉装置の床部の概略上面図である。従来の細胞捕捉装置のマイクロウェルの構成を示す概略断面図である。従来の細胞捕捉装置のマイクロウェルにおける電気力線の変化を示す図である。従来の細胞捕捉装置によって捕捉された細胞を示す顕微鏡写真である。従来及び本実施の形態における細胞捕捉装置によって捕捉された細胞を示す顕微鏡写真であって図１１の要部拡大写真である。従来の細胞捕捉装置のマイクロウェルに捕捉された細胞の分布を示す図である。本実施の形態における細胞捕捉装置のマイクロウェルにおける電気力線の変化を示す図である。本実施の形態における細胞捕捉装置のマイクロウェルに捕捉された細胞を示す図である。本実施の形態における第１の実験の概要を示す図である。本実施の形態における第１の実験の結果を示す図である。本実施の形態における第２の実験の概要を示す図である。本実施の形態における第２の実験の結果を示す写真である。本実施の形態における第２の実験の結果を示す第１の図である。本実施の形態における第２の実験の結果を示す第２の図である。

以下、実施の形態について図面を参照しながら詳細に説明する。

図１は本実施の形態における背景を示す模式図、図２は本実施の形態における捕捉のターゲットの概念を示す図である。

本実施の形態は、単一細胞と細胞クラスターとを同時に、個別に、かつ、識別可能に捕捉することができる細胞捕捉装置を提案する。

がん患者の末梢血に含まれる血中循環腫瘍細胞は、がんの原発巣の大きさと相関があり、血中循環腫瘍細胞の細胞クラスターは、単一細胞よりも高い転移能があると報告されている。図１に示されるように、がんの原発巣（primary lesion）の細胞は、血管(blood vessel)内に浸潤(infiltration)し、循環腫瘍細胞(circulationg tumor cell:CTC) や循環腫瘍細胞クラスター(CTC cluster) として、白血球(WBC) や赤血球(RBC) とともに、血中を循環する。図２に示されるような循環腫瘍細胞クラスター、すなわち、循環腫瘍細胞の細胞クラスターは、単一細胞が複数個（例えば、２〜５０個）集合したものであるが、循環腫瘍細胞の２〜５〔％〕程度の割合で存在する。しかし、細胞クラスターは、単一細胞よりも転移能が２３〜５０倍高いと言われている。

したがって、がん及びがん転移の予測・予後の精度を向上させるためには、血中循環腫瘍細胞の単一細胞及び細胞クラスターを網羅して同時に解析する液体細胞診（liquid biopsy)の実現が求められている。本実施の形態における細胞捕捉装置は、このような液体細胞診に寄与するものであり、がん転移のメカニズムを把握する基礎研究のみならず、血液を用いる低侵襲ながん診断医療への応用も期待することができる。

次に、本実施の形態における細胞捕捉装置の構成について説明する。

図３は本実施の形態における細胞捕捉装置の構成を示す概略図、図４は本実施の形態における細胞捕捉装置の概略分解図、図５は本実施の形態における細胞捕捉装置の床部の概略上面図、図６は本実施の形態における細胞捕捉装置のマイクロウェルの構成を示す概略断面図、図７は誘電泳動の原理を説明する図である。なお、図３において、（ａ）は全体構成を示す断面図、（ｂ−１）及び（ｂ−２）は（ａ）におけるＡ部拡大図、（ｃ−１）及び（ｃ−２）は（ａ）におけるＢ部拡大図である。

図において、１０は、本実施の形態における細胞捕捉装置としてのマイクロ流体装置であり、流体チャネル１１と、該流体チャネル１１の周囲を画定する底板としてのチャネル底板１２、チャネル天板１３、チャネル上流端壁１４ａ及びチャネル下流端壁１４ｂとを備える。また、前記チャネル天板１３におけるチャネル上流端壁１４ａ近傍部分及びチャネル下流端壁１４ｂ近傍部分には、インレット開口１５及びアウトレット開口１６が形成され、細胞混濁液、すなわち、細胞を含む流体は、前記インレット開口１５から流体チャネル１１内に流入し、前記アウトレット開口１６から流体チャネル１１外へ流出する。なお、矢印３１は、流体チャネル１１内での流体の流れを示し、矢印３２はアウトレット開口１６から流出する流体の流れを示している。該流体は、例えば、アウトレット開口１６に接続された図示されないポンプによって吸引されることにより、矢印３２で示されるように流出する。そして、図３（ａ）に示されるように、インレット開口１５から流体チャネル１１内に流入する流体に含まれる細胞であって単独で存在するもの、すなわち、単一細胞４１は、チャネル底板１２の上面側に形成されたマイクロウェル１７に捕捉される。また、前記流体に含まれる細胞であって複数個が結合したもの、すなわち、細胞クラスター４２も前記マイクロウェル１７に捕捉される。

図４に示されるように、前記マイクロ流体装置１０は、表面に櫛歯電極２２が形成され、さらに、該櫛歯電極２２に被さるように絶縁膜２３が形成された基板２１の上に載置されたカバー部材２４を備える。

前記櫛歯電極２２は、例えば、ＩＴＯ（インジウムスズ酸化物）から成る薄膜状の一対の部材であって、図５に示されるように、第１櫛歯電極２２Ａ及び第２櫛歯電極２２Ｂから成る。前記第１櫛歯電極２２Ａ及び第２櫛歯電極２２Ｂは、各々、矢印３１の方向（流れ方向）に延在する基部２２ａと、該基部２２ａから矢印３１に直交する方向（流れに直交する方向）に延出する複数のライン２２ｂとを含んでいる。そして、図５に示されるように、平面視において櫛の歯のように配列された第１櫛歯電極２２Ａの複数のライン２２ｂと第２櫛歯電極２２Ｂの複数のライン２２ｂとは、互いに噛み合うように、相手方のライン２２ｂ同士の間に入り込んでいる。したがって、流れ方向に関して、第１櫛歯電極２２Ａのライン２２ｂと第２櫛歯電極２２Ｂのライン２２ｂとが交互になるように、配置されている。すなわち、第１櫛歯電極２２Ａのライン２２ｂと第２櫛歯電極２２Ｂのライン２２ｂとは、インターデジテイテッド電極(interdegitated electrodes) となっている。なお、隣接する第１櫛歯電極２２Ａのライン２２ｂと第２櫛歯電極２２Ｂのライン２２ｂとの間には、流れに直交する方向に延在する幅の狭いスペース２２ｃが存在する。該スペース２２ｃは、櫛歯電極２２の存在しない部分である。

また、前記絶縁膜２３は、例えば、フォトレジストの被膜であり、各ライン２２ｂの少なくとも一部の上面を覆うように形成されている。前記基板２１は、例えば、ガラス板である。さらに、カバー部材２４は、例えば、シリコーンゴムの一種であるポリジメチルシロキサン(PDMS)から成り、その下面側に流体チャネル１１が形成されている。そして、前記チャネル底板１２は、前記基板２１、櫛歯電極２２及び絶縁膜２３を有し、前記チャネル天板１３、チャネル上流端壁１４ａ及びチャネル下流端壁１４ｂは、カバー部材２４の一部であって、一体的に形成されたものである。

前記流体チャネル１１の長さ（図３（ａ）における左右方向の寸法）は、例えば、４〜５〔ｃｍ〕であり、高さ（図３（ａ）における上下方向の寸法）は、例えば、５０〔μｍ〕であるが、これに限定されるものではなく、任意に設定することができる。なお、前記基板２１、櫛歯電極２２、絶縁膜２３、流体チャネル１１が形成されたカバー部材２４等の製造方法は、前記特許文献１に記載の発明と同様であるので、その説明を省略する。

図５に示されるように、第１櫛歯電極２２Ａ及び第２櫛歯電極２２Ｂには、交流電源２６から、正弦波の交流電圧（例えば、５〔ＭＨｚ〕、約０．８〜３〔Ｖ〕）が印加される。すると、図６に示されるように、互いに隣接する第１櫛歯電極２２Ａのライン２２ｂと第２櫛歯電極２２Ｂのライン２２ｂとの間に電界が生じるので、誘電泳動(Dielectrophoresis:DEP) によって、単一細胞４１はマイクロウェル１７に捕捉される。なお、図６において、３５は電気力線を示し、３４は細胞に作用する誘電泳動力（Ｆ_DEP）を示し、３３は細胞に作用する流体の流れの力（Ｆ_flow）を示している。また、マイクロウェル１７は、絶縁膜２３を膜厚方向に貫通するように形成された貫通孔２３ａであり、上面が開放され、下面がライン２２ｂによって塞がれている。

誘電泳動の原理は、既に知られており、正の誘電泳動の場合、図７に示されるように、粒子は電界強度の強い方向に向けて移動する。また、誘電泳動力（Ｆ_DEP）は、次の式（１）で表される。

なお、流れ方向に関して互いに隣接するマイクロウェル１７同士は、流体チャネル１１の幅方向（図５における上下方向）に関する位置が互いにずれている。すなわち、流れ方向に関して互いに隣接するマイクロウェル１７同士は、流れ方向に平行な同一直線上には、位置しないように配列されている。これは、流れ方向に関して互いに隣接するマイクロウェル１７同士が流れ方向に平行な同一直線上に位置するようにすると、細胞が上流側のマイクロウェル１７で捕捉された場合に、下流側のマイクロウェル１７の上を通過する細胞がいなくなってしまうからである。

また、図５及び６に示されるように、貫通孔２３ａは各ライン２２ｂの真上に形成され、矢印３１の方向に関して互いに隣接するマイクロウェル１７の下面は、互いに隣接するライン２２ｂによって塞がれている。したがって、交流電源２６から第１櫛歯電極２２Ａ及び第２櫛歯電極２２Ｂに印加された交流電圧によって生じる電界の様子を仮想的に示す電気力線３５は、矢印３１の方向に関して互いに隣接するマイクロウェル１７同士を結ぶようになる。これにより、図３（ｂ−１）に示されるように、誘電泳動力３４によってマイクロウェル１７に引き寄せられた単一細胞４１が、図３（ｂ−２）に示されるように、マイクロウェル１７に捕捉されると、電気力線３５がほとんど消滅し、他の単一細胞４１には誘電泳動力３４が作用しないことになる。したがって、１個の単一細胞４１がマイクロウェル１７に捕捉されると、当該マイクロウェル１７に他の単一細胞４１が捕捉されることがない。すなわち、各マイクロウェル１７に捕捉される単一細胞４１は、１個のみである。また、図３（ｃ−１）に示されるように、誘電泳動力３４によってマイクロウェル１７に引き寄せられた細胞クラスター４２が、図３（ｃ−２）に示されるように、マイクロウェル１７に捕捉された場合も、同様に、電気力線３５がほとんど消滅し、他の単一細胞４１や細胞クラスター４２には誘電泳動力３４が作用しないことになる。なお、細胞クラスター４２の場合には、一番下に位置する１個の細胞のみがマイクロウェル１７内に捕捉される。

次に、本実施の形態におけるマイクロ流体装置１０の動作ないし作用を、従来のマイクロ流体装置と比較しつつ、説明する。まず、従来のマイクロ流体装置の動作ないし作用を説明する。

図８は従来の細胞捕捉装置の床部の概略上面図、図９は従来の細胞捕捉装置のマイクロウェルの構成を示す概略断面図、図１０は従来の細胞捕捉装置のマイクロウェルにおける電気力線の変化を示す図、図１１は従来の細胞捕捉装置によって捕捉された細胞を示す顕微鏡写真、図１２は従来及び本実施の形態における細胞捕捉装置によって捕捉された細胞を示す顕微鏡写真であって図１１の要部拡大写真、図１３は従来の細胞捕捉装置のマイクロウェルに捕捉された細胞の分布を示す図である。なお、図１０において、（ａ）は細胞が捕捉されていない状態を示す図、（ｂ）は細胞が捕捉された状態を示す図であり、図１２において、（ａ）は従来の細胞捕捉装置によって複数個の単一細胞が捕捉された状態を示す写真、（ｂ）は本実施の形態における細胞捕捉装置によって１個の細胞クラスターが捕捉された状態を示す写真である。

従来のマイクロ流体装置では、図８に示されるように、貫通孔２３ａは、隣接するライン２２ｂ同士の間のスペース２２ｃに対応する位置において絶縁膜２３に形成されているので、マイクロウェル１７の下面には、互いに隣接する第１櫛歯電極２２Ａのライン２２ｂと第２櫛歯電極２２Ｂのライン２２ｂとが、スペース２２ｃを挟んで、存在する。したがって、図９に示されるように、電気力線３５は、１つのマイクロウェル１７内において、互いに隣接するライン２２ｂ同士を結ぶようになる。

そして、図１０には、前記マイクロウェル１７周囲における電界のシミュレーション結果が示されていて、矢印は、前記式（１）における∇Ｅ²を表している。なお、シミュレーションは、流体チャネル１１の高さが５０〔μｍ〕、マイクロウェル１７の深さが４〔μｍ〕、第１櫛歯電極２２Ａ及び第２櫛歯電極２２Ｂに印加される交流電圧の周波数が５〔ＭＨｚ〕であり、電圧が１〔Ｖ〕であるものとして行われた。図１０（ａ）には、細胞が捕捉されていない状態のマイクロウェル１７周辺の電界の状態が示されている。また、図１０（ｂ）には、１個の細胞が捕捉された状態のマイクロウェル１７周辺の電界の状態が示されている。図１０（ａ）と図１０（ｂ）とを比較すると、１個の細胞が捕捉されると、マイクロウェル１７の縁の近辺で∇Ｅ²が大きくなることが分かる。そのため、１個の細胞が捕捉されているマイクロウェル１７には他の細胞が引き付けられて捕捉されやすくなり、その結果、複数の単一細胞４１が同一のマイクロウェル１７に捕捉されやすくなってしまう。そして、同一のマイクロウェル１７に捕捉された複数の単一細胞４１は、細胞クラスター４２との識別が困難であるから、マイクロウェル１７に捕捉された細胞が単一細胞４１であるのか細胞クラスター４２であるのかを判別することが困難になってしまう。

図１１には、従来の細胞捕捉装置のマイクロウェル１７に捕捉された細胞を示すチャネル底板１２上面の顕微鏡写真が示されている。なお、前記マイクロウェル１７の直径は５０〔μｍ〕である。そして、図１２（ａ）は、同一のマイクロウェル１７に捕捉された複数の単一細胞４１を示す拡大写真であり、図１２（ｂ）は、マイクロウェル１７に捕捉された細胞クラスター４２を示す拡大写真である。これらの写真を見ると、マイクロウェル１７に捕捉された細胞が、複数の単一細胞４１であるのか細胞クラスター４２であるのかの判別が困難であることを理解することができる。また、図１３は、直径の異なるマイクロウェル１７に捕捉された細胞の数の分布を示している。このことから、直径の大きなマイクロウェル１７は、複数の単一細胞４１を捕捉する率が高いので、使用が困難であることが分かる。

次に、本実施の形態におけるマイクロ流体装置１０の動作ないし作用を説明する。

図１４は本実施の形態における細胞捕捉装置のマイクロウェルにおける電気力線の変化を示す図、図１５は本実施の形態における細胞捕捉装置のマイクロウェルに捕捉された細胞を示す図である。なお、図１４において、（ａ）は細胞が捕捉されていない状態を示す図、（ｂ）は細胞が捕捉された状態を示す図であり、図１５において、（ａ）は単一細胞が捕捉された状態を示す顕微鏡写真、（ｂ）は単一細胞が捕捉された状態を示す断面図である。

前述のように、従来のマイクロ流体装置では、マイクロウェル１７の下面に、互いに隣接する第１櫛歯電極２２Ａのライン２２ｂと第２櫛歯電極２２Ｂのライン２２ｂとが、スペース２２ｃを挟んで存在するのに対し、本実施の形態におけるマイクロ流体装置１０では、図５及び６に示されるように、流れ方向に関して互いに隣接するマイクロウェル１７の下面は、互いに隣接するライン２２ｂによって塞がれている。したがって、電気力線３５は、従来のマイクロ流体装置では、１つのマイクロウェル１７内において、互いに隣接するライン２２ｂ同士を結ぶようになるのに対して、本実施の形態におけるマイクロ流体装置１０では、流れ方向に関して互いに隣接するマイクロウェル１７同士を結ぶようになる。

そして、本実施の形態におけるマイクロ流体装置１０では、マイクロウェル１７周囲における電界のシミュレーション結果は、図１４に示されるようになる。なお、シミュレーションの条件は、第１櫛歯電極２２Ａ及び第２櫛歯電極２２Ｂに印加される交流電圧の電圧が１．４〔Ｖ〕である点を除いて、図１０に示される場合と同様である。図１４（ａ）には、細胞が捕捉されていない状態のマイクロウェル１７周辺の電界の状態が示され、図１４（ｂ）には、１個の細胞が捕捉された状態のマイクロウェル１７周辺の電界の状態が示されている。図１４（ｂ）と図１０（ｂ）とを比較すると、本実施の形態におけるマイクロ流体装置１０では、１個の細胞が捕捉された場合、マイクロウェル１７の縁の近辺で∇Ｅ²が大きくならず、むしろ小さくなることが分かる。したがって、本実施の形態におけるマイクロ流体装置１０では、１個の細胞が捕捉されているマイクロウェル１７には他の細胞が引き付けられることがなく、複数の単一細胞４１が同一のマイクロウェル１７に捕捉されることがない。

また、本実施の形態におけるマイクロ流体装置１０では、マイクロウェル１７の直径及び深さの値を比較的小さくすることが望ましい。例えば、図１５（ｂ）に示されるように、捕捉の対象である単一細胞４１の直径の平均値が１５〔μｍ〕である場合、マイクロウェル１７の直径は、単一細胞４１の直径の平均値より小さな値、例えば、１２〔μｍ〕とすることが望ましく、マイクロウェル１７の深さは、単一細胞４１の半径の平均値より小さな値、例えば、４〔μｍ〕とすることが望ましい。このようにすると、図１５（ａ）に示されるように、ほとんどすべてのマイクロウェル１７に１個の単一細胞４１が捕捉される。また、細胞クラスター４２の場合も、図３（ｃ−２）に示されるように、一番下に位置する１個の細胞がマイクロウェル１７に捕捉されることによって、その全体が当該マイクロウェル１７に捕捉される。

なお、本実施の形態において、「細胞の直径」とは、１個の細胞の直径を意味し、単一細胞４１の場合には当該単一細胞４１を構成する単一の細胞の直径であり、また、細胞クラスター４２の場合には当該細胞クラスター４２を構成する複数の細胞のうちの１個の細胞の直径であって、当該細胞クラスター４２全体を一つとして把握したときの等価直径（相当直径）ではない。

次に、本実施の形態におけるマイクロ流体装置１０を使用して発明者が行った実験の結果について説明する。

図１６は本実施の形態における第１の実験の概要を示す図、図１７は本実施の形態における第１の実験の結果を示す図、図１８は本実施の形態における第２の実験の概要を示す図、図１９は本実施の形態における第２の実験の結果を示す写真、図２０は本実施の形態における第２の実験の結果を示す第１の図、図２１は本実施の形態における第２の実験の結果を示す第２の図である。なお、図１９において、（ａ）〜（ｃ）は経過時間毎の顕微鏡写真である。

第１の実験は、１つのマイクロウェル１７に、単一細胞４１が１個のみ捕捉されることを確認するために行われた。そのため、単一細胞４１のみを含む流体が流体チャネル１１に導入された。また、評価指標として設定された、次の式（２）及び（３）で表される単一細胞占有率（Single cell ocuupancy)と、捕捉効率（Trap efficiency)とが計測された。

なお、図１６に示されるように、マイクロウェル１７は、複数種類の直径（例えば、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２２〔μｍ〕）を含み、流体チャネル１１の最上流側に最小の直径のものが位置し、下流に向かうにつれて直径が漸増し、最下流側に最大の直径のものが位置するようにチャネル底板１２に配置された。また、マイクロウェル１７の深さは４〔μｍ〕とし、流体チャネル１１の高さが５３〔μｍ〕、流体の流量が５〔μｌ／ｍｉｎ〕に設定された。

図１７には、第１の実験の結果として、単一細胞占有率及び捕捉効率と、電界強度との関係が示されている。電界強度を上昇させると、捕捉効率が増加するが、単一細胞占有率は低下しないことが分かる。このことから、本実施の形態におけるマイクロ流体装置１０は、第１櫛歯電極２２Ａ及び第２櫛歯電極２２Ｂに印加される交流電圧の電圧を高くしてもよい、と言える。

また、第２の実験は、マイクロウェル１７に、１個の単一細胞４１及び１つの細胞クラスター４２が捕捉されることを確認するために行われた。そのため、単一細胞４１及び細胞クラスター４２を含む流体が流体チャネル１１に導入された。なお、マイクロウェル１７は、図１８に示されるように、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２２〔μｍ〕の直径のから成り、流体チャネル１１の最上流側に最小の直径のものが位置し、下流に向かうにつれて直径が漸増し、最下流側に最大の直径のものが位置するようにチャネル底板１２に配置された。また、上流側には、単一細胞４１の直径よりも小さな直径のマイクロウェル１７が位置し、下流側には、単一細胞４１の直径以上であるが、細胞クラスター４２の等価直径よりも小さな直径のマイクロウェル１７が位置するように配置された。さらに、マイクロウェル１７の深さは４〔μｍ〕とし、流体チャネル１１の高さが５３〔μｍ〕、流体の流量が５〔μｌ／ｍｉｎ〕、第１櫛歯電極２２Ａ及び第２櫛歯電極２２Ｂに印加される交流電圧の電圧が２．１〔Ｖ〕に設定された。

図１９に示されるように、例えば、０．３〔ｓｅｃ〕が経過した時点では、細胞クラスター４２がマイクロウェル１７に捕捉されたことが分かる。より詳細には、細胞クラスター４２に含まれる１個の細胞のみがマイクロウェル１７内に捕捉されたことが分かる。

また、図２０には、第２の実験の結果として、細胞の割合と、マイクロウェル１７の直径との関係が示されている。直径の小さなマイクロウェル１７に捕捉される細胞の場合は、単一細胞４１である割合が高いが、マイクロウェル１７の直径が増加するにつれて細胞クラスター４２の割合が高くなることが分かる。なお、本実施の形態におけるマイクロ流体装置１０では、前述のように、複数の単一細胞４１が同一のマイクロウェル１７に捕捉されることがないので、チャネル底板１２上面を撮影した顕微鏡写真に基づいて、マイクロウェル１７に捕捉された細胞が単一細胞４１であるか細胞クラスター４２であるかを容易に識別することができる。このことから、本実施の形態におけるマイクロ流体装置１０は、１個の単一細胞４１及び１つの細胞クラスター４２を捕捉可能であることが分かる。

さらに、図２１には、第２の実験の結果として、サンプルとして流体チャネル１１に導入された流体内における（sample）単一細胞４１及び細胞クラスター４２の細胞数の分布とマイクロウェル１７に捕捉された（on device)単一細胞４１及び細胞クラスター４２の細胞数の分布との比較が示されている。このことから、両者における細胞数の分布は、ほとんど同じであることが分かる。

なお、本実施の形態においては、マイクロウェル１７の直径が１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２２〔μｍ〕である例について説明したが、マイクロウェル１７の直径は必ずしもこれに限定されるものではなく、例えば、８〔μｍ〕以下であってもよいし、３０〔μｍ〕以上であってもよい。また、マイクロウェル１７の深さも４〔μｍ〕に限定されるものではなく、適宜変更することができる。

このように、本実施の形態において、マイクロ流体装置１０は、細胞を含有する流体が流れる流体チャネル１１を備え、誘電泳動によって流体中の細胞を捕捉する装置である。そして、流体チャネル１１は、チャネル底板１２と、チャネル底板１２の上面側に形成された複数のマイクロウェル１７であって、細胞を捕捉するマイクロウェル１７とを含み、チャネル底板１２の上面には、複数のライン２２ｂを含む一対の薄膜状の櫛歯電極２２と、各ライン２２ｂの少なくとも一部の上面を覆うように形成された絶縁膜２３とが形成され、各櫛歯電極２２のライン２２ｂ同士は、流体の流れ方向に関して交互になるように配列され、各マイクロウェル１７は、絶縁膜２３を膜厚方向に貫通するように形成された貫通孔２３ａと、貫通孔２３ａの下面に位置するライン２２ｂとを含み、一対の櫛歯電極２２に交流電圧を印加すると、電気力線３５が流体の流れ方向に関して互いに隣接するマイクロウェル１７同士を結ぶような電界が生じる。

これにより、１個の細胞が捕捉されるとマイクロウェル１７には他の細胞が引き付けられることがなく、複数の細胞が同一のマイクロウェル１７に捕捉されることがない。したがって、１つのマイクロウェル１７には、細胞が１個のみ捕捉される。

また、各マイクロウェル１７の貫通孔２３ａの下面は１つのライン２２ｂによって塞がれ、流体の流れ方向に関して互いに隣接するマイクロウェル１７の貫通孔２３ａの下面のライン２２ｂは、互いに異なる櫛歯電極２２のライン２２ｂである。さらに、各櫛歯電極２２のライン２２ｂ同士の間に存在するスペース２２ｃは、流体の流れ方向に関して互いに隣接するマイクロウェル１７同士の間に位置し、絶縁膜２３によって覆われている。さらに、流体の流れ方向に関して互いに隣接するマイクロウェル１７同士は、流体の流れに直交する方向に関する位置が互いにずれている。さらに、マイクロウェル１７の直径は、細胞の直径よりも小さい。さらに、マイクロウェル１７は、複数であって異なる直径のものを含み、流体チャネル１１において流体の流れの上流側に単一細胞４１よりも小さな直径のものが位置し、流体の流れの下流側に単一細胞４１の直径以上の直径であって細胞クラスター４２の等価直径よりも小さな直径のものが位置するように配置されている。さらに、マイクロウェル１７の深さは、細胞の半径よりも小さい。さらに、マイクロウェル１７は、複数であって異なる直径のものを含み、流体チャネル１１において流体の流れの最上流側に最小の直径のものが位置し、下流に向かうにつれて直径が漸増し、最下流側に最大の直径のものが位置するように配置されている。

なお、本明細書の開示は、好適で例示的な実施の形態に関する特徴を述べたものである。ここに添付された特許請求の範囲内及びその趣旨内における種々の他の実施の形態、修正及び変形は、当業者であれば、本明細書の開示を総覧することによって、当然に考え付くことである。

本開示は、細胞捕捉装置に適用することができる。

１０マイクロ流体装置
１１流体チャネル
１２チャネル底板
１７マイクロウェル
２２櫛歯電極
２２Ａ第１櫛歯電極
２２Ｂ第２櫛歯電極
２２ｂライン
２２ｃスペース
２３絶縁膜
２３ａ貫通孔
３５電気力線

Claims

細胞を含有する流体が流れる流体チャネルを備え、誘電泳動によって前記流体中の細胞を捕捉する細胞捕捉装置であって、
前記流体チャネルは、底板と、該底板の上面側に形成された複数のマイクロウェルであって、前記細胞を捕捉するマイクロウェルとを含み、
前記底板の上面には、複数のラインを含む一対の薄膜状の櫛歯電極と、各ラインの少なくとも一部の上面を覆うように形成された絶縁膜とが形成され、各櫛歯電極のライン同士は、前記流体の流れ方向に関して交互になるように配列され、
各マイクロウェルは、前記絶縁膜を膜厚方向に貫通するように形成された貫通孔と、該貫通孔の下面に位置する前記ラインとを含み、
前記一対の櫛歯電極に交流電圧を印加すると、電気力線が前記流体の流れ方向に関して互いに隣接するマイクロウェル同士を結ぶような電界が生じることを特徴とする細胞捕捉装置。
各マイクロウェルの貫通孔の下面は１つのラインによって塞がれ、前記流体の流れ方向に関して互いに隣接するマイクロウェルの貫通孔の下面のラインは、互いに異なる櫛歯電極のラインである請求項１に記載の細胞捕捉装置。
各櫛歯電極のライン同士の間に存在するスペースは、前記流体の流れ方向に関して互いに隣接するマイクロウェル同士の間に位置し、前記絶縁膜によって覆われている請求項２に記載の細胞捕捉装置。
前記流体の流れ方向に関して互いに隣接するマイクロウェル同士は、前記流体の流れに直交する方向に関する位置が互いにずれている請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞捕捉装置。
前記マイクロウェルの直径は、前記細胞の直径よりも小さい請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞捕捉装置。
前記マイクロウェルは、複数であって異なる直径のものを含み、前記流体チャネルにおいて前記流体の流れの上流側に単一細胞の直径よりも小さな直径のものが位置し、前記流体の流れの下流側に単一細胞の直径以上の直径であって細胞クラスターの等価直径よりも小さな直径のものが位置するように配置されている請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞捕捉装置。
前記マイクロウェルの深さは、前記細胞の半径よりも小さい請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞捕捉装置。
前記マイクロウェルは、複数であって異なる直径のものを含み、前記流体チャネルにおいて前記流体の流れの最上流側に最小の直径のものが位置し、下流に向かうにつれて直径が漸増し、最下流側に最大の直径のものが位置するように配置されている請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞捕捉装置。