JP2020054279A - Primers that specifically amplify at least part of a base sequence complementary to 23s rrna of pseudomonas aeruginosa and methods for detecting pseudomonas aeruginosa utilizing the same - Google Patents
Primers that specifically amplify at least part of a base sequence complementary to 23s rrna of pseudomonas aeruginosa and methods for detecting pseudomonas aeruginosa utilizing the same Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020054279A JP2020054279A JP2018187032A JP2018187032A JP2020054279A JP 2020054279 A JP2020054279 A JP 2020054279A JP 2018187032 A JP2018187032 A JP 2018187032A JP 2018187032 A JP2018187032 A JP 2018187032A JP 2020054279 A JP2020054279 A JP 2020054279A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pseudomonas aeruginosa
- rrna
- sequence complementary
- primer
- base sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Abstract
Description
本発明は、院内感染の原因菌であるシュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅するプライマーおよびこれを利用したシュードモナス・エルギノーサの検出方法に関する。 The present invention relates to a primer that specifically amplifies at least a part of a nucleotide sequence complementary to 23S rRNA of Pseudomonas aeruginosa, which is a causative agent of hospital-acquired infection, and a method for detecting Pseudomonas aeruginosa using the same.
シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）は、健常人であれば感染症を引き起こすリスクは極めて低い菌であるが、外科手術・がん治療・移植手術などによって抵抗力が低下した患者においては、術後感染症、人工呼吸器関連肺炎や重篤な菌血症の起因菌となる。また近年では、シュードモナス・エルギノーサ感染症の予防治療に有効であったフルオロキノロン系 （シプロフロキサシン、レボフロキサシンなど）、カルバペネム系（イミペネム、メロペネムなど）、アミノグリコシド系（アミカシンなど）の抗菌薬に対して耐性を持つ多剤耐性シュードモナス・エルギノーサが出現し、大きな社会問題となっている。 Pseudomonas aeruginosa is a bacterium that has a very low risk of causing infections in healthy individuals, but can be used in patients whose resistance has decreased due to surgery, cancer treatment, or transplant surgery. Cause respiratory distress, ventilator-associated pneumonia and severe bacteremia. In recent years, antibacterial drugs such as fluoroquinolones (ciprofloxacin, levofloxacin, etc.), carbapenems (imipenem, meropenem, etc.), and aminoglycosides (amikacin, etc.) have been effective in the prevention and treatment of Pseudomonas aeruginosa infections. The emergence of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa, which is highly resistant, has become a major social problem.
現在、易感染患者（immunocompromised host）における感染症起因菌の院内検査方法として、選択培地や専用の培養ボトルを用いた培養法が用いられているが（非特許文献１）、菌の検出から同定までに３〜７日程度の日数が必要とされ、迅速性や正確性に欠ける点が問題であった。さらにシュードモナス・エルギノーサによる感染症は、重症病態の経過を辿るため、臨床検体からの本菌の迅速高感度な検出法の確立が、(i)起因菌の早期同定による適切な抗菌薬の選択と早期治療に繋がり、より高い治癒率、合併症予防をもたらすこと、(ii)不必要な多剤併用療法を回避し、新たな薬剤耐性菌の出現を予防しうること、などから臨床において重要な課題であった。また、院内において、多剤耐性P. aeruginosaのアウトブレイクが発生した場合には、不顕性感染患者の検出や病原菌の媒介因子の同定が重要である。さらに、多剤耐性P. aeruginosaに対する適切な抗菌薬の使用は重要な課題であり、常に適切な抗菌薬を選択すべく、抗菌薬使用時における病態と起因菌の定期的なモニタリングが望まれている。 At present, as a method for in-hospital examination of infectious disease-causing bacteria in immunocompromised hosts, a culture method using a selective medium or a dedicated culture bottle is used (Non-patent Document 1), but identification based on detection of bacteria. It takes about 3 to 7 days by the time, and lacks quickness and accuracy. In addition, since infections caused by Pseudomonas aeruginosa follow severe disease, the establishment of a rapid and sensitive method for detecting this bacterium from clinical specimens requires (i) selection of appropriate antibacterial drugs by early identification of the causative bacteria. It is important in clinical practice because it leads to early treatment, leads to higher cure rate and prevention of complications, and (ii) avoids unnecessary combination therapy and can prevent the emergence of new drug-resistant bacteria. It was an issue. In the case of outbreaks of multidrug-resistant P. aeruginosa in hospitals, it is important to detect subclinical infections and identify mediators of pathogenic bacteria. Furthermore, the use of appropriate antimicrobial agents for multidrug-resistant P. aeruginosa is an important issue, and regular monitoring of the pathology and pathogens during antimicrobial use is desired in order to always select the appropriate antimicrobial agent. I have.
一方、我々は、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法による血液中細菌の迅速（所要時間約６時間）かつ高感度（１ｃｅｌｌ／ｍｌより検出可）な定量法を構築し（非特許文献２）、様々な病態の患者の血液中細菌の検出に有効であることを明らかにしてきた（非特許文献３〜６）。しかしながらシュードモナス・エルギノーサを血液、糞便等から高感度に分別定量可能な技術の報告は認められない。
On the other hand, we have constructed a rapid (required time of about 6 hours) and highly sensitive (detectable from 1 cell / ml) quantification method of bacteria in blood by a quantitative RT-PCR method (Non-Patent Document 2). It has been clarified that it is effective for detecting bacteria in blood of patients with pathological conditions (
本発明の課題は、シュードモナス・エルギノーサ感染の早期診断へ利用できる技術を提供することである。 An object of the present invention is to provide a technique that can be used for early diagnosis of Pseudomonas aeruginosa infection.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、これまでほとんど公知になっていなかったシュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡを利用することにより上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。 The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, have found that the above problems can be solved by using 23S rRNA of Pseudomonas aeruginosa, which has been hardly known until now, and completed the present invention. I let it.
すなわち、本発明は、シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅することを特徴とするプライマーである。 That is, the present invention is a primer characterized in that it specifically amplifies at least a part of a nucleotide sequence complementary to 23S rRNA of Pseudomonas aeruginosa.
また、本発明は、 以下の工程（１）〜（４）
（１）試料からＲＮＡを抽出する工程
（２）（１）で抽出したＲＮＡに相補的な塩基配列を作製する工程
（３）シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅することを特徴とするプライマーと、（２）で作製した塩基配列を用いて増幅反応を行う工程
（４）増幅の有無を確認する工程
を含むことを特徴とするシュードモナス・エルギノーサの検出方法
である。
Further, the present invention provides the following steps (1) to (4)
(1) Step of extracting RNA from sample (2) Step of preparing base sequence complementary to RNA extracted in (1) (3) At least part of base sequence complementary to 23S rRNA of Pseudomonas aeruginosa A step of performing an amplification reaction using a primer characterized in that it specifically amplifies and a base sequence prepared in (2), and (4) a step of confirming the presence or absence of amplification, of Pseudomonas aeruginosa. It is a detection method.
更に、本発明は、配列番号４〜７に記載の塩基配列で示されるシュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列および当該配列に相補的なシュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡである。 Furthermore, the present invention provides a nucleotide sequence complementary to the Pseudomonas aeruginosa 23S rRNA represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 4 to 7, and a Pseudomonas aeruginosa 23S rRNA complementary to the sequence.
本発明のプライマーは、シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅することができる。 The primer of the present invention can specifically amplify at least a part of a nucleotide sequence complementary to 23S rRNA of Pseudomonas aeruginosa.
そのため、このプライマーを利用すれば、シュードモナス・エルギノーサを血液、糞便等から高感度に、かつ、迅速に分別定量可能となり、シュードモナス・エルギノーサによる院内感染を制御することができる。 Therefore, if this primer is used, Pseudomonas aeruginosa can be separated and quantified with high sensitivity and quickly from blood, feces, etc., and hospital-acquired infection by Pseudomonas aeruginosa can be controlled.
本発明のプライマーは、シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部、好ましくはプライマーで挟まれた配列を特異的に増幅するものである。ここで特異的に増幅とは、シュードモナス・エルギノーサ以外の微生物の２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列を増幅しないことを言い、例えば、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（P. pseudoalcaligenes）、シュードモナス・ステュゼリ（P. stutzeri）、シュードモナス・ルテオラ（P. luteola）、シュードモナス・オリジハビタンス（P. oryzihabitans）、シュードモナス・プチーダ（P. putida）、シュードモナス・トラッシー（P. tolaasii）、シュードモナス・アルカリゲネス（P. alcaligenes）、シュードモナス・フルオレッセンス（P. fluorescens）等のシュードモナス・エルギノーサの近縁種の２３Ｓ ｒＲＮＡを増幅しないことを言う。なお、本発明のプライマーによれば、シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡを、例えば、血液中であれば１ｃｅｌｌ／ｍｌ以上で、糞便であれば１００ｃｅｌｌｓ／ｇ以上で特異的に増幅することができる。 The primer of the present invention specifically amplifies at least a part of a base sequence complementary to 23S rRNA of Pseudomonas aeruginosa, preferably a sequence sandwiched between the primers. Here, the term “specific amplification” means that a base sequence complementary to 23S rRNA of a microorganism other than Pseudomonas aeruginosa is not amplified. For example, Pseudomonas pseudoalcaligenes (P. pseudoalcaligenes), P. stutzeri (P. stutzeri) Pseudomonas luteola, P. luteola, P. oryzihabitans, P. putida, P. putida, P. tolaasii, P. alcaligenes, P. alcaligenes -Does not amplify 23S rRNA of a closely related species of Pseudomonas aeruginosa, such as P. fluorescens. According to the primer of the present invention, 23S rRNA of Pseudomonas aeruginosa can be specifically amplified at, for example, 1 cell / ml or more in blood and 100 cells / g or more in feces.
本発明のプライマーとしては、シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列を基に作製することができる、例えば、複数のシュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列、より具体的には配列番号３〜８の何れかに記載の塩基配列で示されるシュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列、好ましくはこれらの全てに記載の塩基配列で示されるシュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列と、上記したシュードモナス・エルギノーサの近縁種の２３Ｓ ｒＲＮＡについて、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ ソフトウェア（Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res 22: 4673-80）を用いて整列を行った後、シュードモナス・エルギノーサに特異的な配列をもとにプライマーの設計を行えばよい。このプライマーについて、その他の細菌の ｒＲＮＡ遺伝子配列に相補的な塩基配列と交差しないことを、例えば、NCBI BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）により確認すればよい。 The primer of the present invention can be prepared based on a nucleotide sequence complementary to 23S rRNA of Pseudomonas aeruginosa, for example, a plurality of nucleotide sequences complementary to 23S rRNA of Pseudomonas aeruginosa, more specifically A nucleotide sequence complementary to the Pseudomonas aeruginosa 23S rRNA represented by the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 3 to 8, preferably complementary to the Pseudomonas aeruginosa 23S rRNA represented by the nucleotide sequence described in all of them. Clustal X software (Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting) for the basic nucleotide sequence and the above-mentioned 23S rRNA of a closely related species of Pseudomonas aeruginosa. , position-specific gap penalties and After alignment using weight matrix choice. Nucleic Acids Res 22: 4673-80), primers may be designed based on sequences specific to Pseudomonas aeruginosa. For example, it was confirmed by NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) that this primer did not cross the nucleotide sequence complementary to the rRNA gene sequence of other bacteria. do it.
本発明のプライマーとして好ましいものとしては以下のものが挙げられる。
s-Pa-F（配列番号１）
GTCGTCTTTTAGATGACGAAGTGG
s-Pa-R（配列番号２）
TGGTATCTTCGACCAGCCAGA
Preferred examples of the primer of the present invention include the following.
s-Pa-F (SEQ ID NO: 1)
GTCGTCTTTTAGATGACGAAGTGG
s-Pa-R (SEQ ID NO: 2)
TGGTATCTTCGACCAGCCAGA
なお、上記プライマーは、当業者によく知られた通常のＤＮＡの合成法、例えば、ＤＮＡ合成機を用いて得ることもできるし、シグマアルドリッチジャパン社やライフテクノロジーズジャパン社などのＤＮＡ合成業者等に合成を依頼して得ることができる。 The above primer can be obtained by a conventional DNA synthesis method well known to those skilled in the art, for example, using a DNA synthesizer, or by a DNA synthesizer such as Sigma-Aldrich Japan or Life Technologies Japan. It can be obtained by requesting synthesis.
また、上記プライマーの設計で利用したシュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列（配列番号３〜８）は以下の菌株由来である。なお、シュードモナス・エルギノーサ ＡＴＣＣ１０１４５ Type strainとシュードモナス・エルギノーサ ＤＳＭ６１９５の２３Ｓ ｒＲＮＡは同一の配列であり、シュードモナス・エルギノーサ ＡＴＣＣ１５４４２とシュードモナス・エルギノーサ ＪＣＭ５９６１の２３Ｓ ｒＲＮＡは同一の配列であった。
シュードモナス・エルギノーサ ＡＴＣＣ１０１４５ 基準株（Type strain）
（配列番号３）
シュードモナス・エルギノーサ ＡＴＣＣ９０２７
（配列番号４）
シュードモナス・エルギノーサ ＡＴＣＣ１５４４２
（配列番号５）
シュードモナス・エルギノーサ ＪＣＭ２７７６
（配列番号６）
シュードモナス・エルギノーサ ＪＣＭ５９６１
（配列番号７）
シュードモナス・エルギノーサ ＤＳＭ６１９５
（配列番号８）
ＡＴＣＣ：10801 University Boulevard Manassas, VA 20110 USA
ＪＣＭ：〒３０５−００７４ 日本国茨城県つくば市高野台３−１−１ 理化学研究所 バイオリソース研究センター 微生物材料開発室（ＪＣＭ）
ＤＳＭ：DSM's Head Office Het Overloon 16411 TE Heerlen, the Netherlands.
The nucleotide sequence complementary to the 23S rRNA of Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NOs: 3 to 8) used in designing the primers was derived from the following strains. The 23S rRNA of Pseudomonas aeruginosa ATCC10145 Type strain and Pseudomonas aeruginosa DSM6195 had the same sequence, and the 23S rRNA of Pseudomonas aeruginosa ATCC15442 and Pseudomonas aeruginosa JCM5961 had the same sequence.
Pseudomonas aeruginosa ATCC10145 Reference strain (Type strain)
(SEQ ID NO: 3)
Pseudomonas aeruginosa ATCC9027
(SEQ ID NO: 4)
Pseudomonas aeruginosa ATCC15442
(SEQ ID NO: 5)
Pseudomonas aeruginosa JCM2776
(SEQ ID NO: 6)
Pseudomonas aeruginosa JCM5961
(SEQ ID NO: 7)
Pseudomonas aeruginosa DSM 6195
(SEQ ID NO: 8)
ATCC: 10801 University Boulevard Manassas, VA 20110 USA
JCM: 3-1-1 Takanodai, Tsukuba, Ibaraki, Japan 305-0074 Japan Microbiological Materials Development Office (JCM), RIKEN BioResource Research Center
DSM: DSM's Head Office Het Overloon 16411 TE Heerlen, the Netherlands.
上記シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列のうち、配列番号４〜７に記載の塩基配列で示されるシュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列は新規のものである。 Among the nucleotide sequences complementary to the Pseudomonas aeruginosa 23S rRNA, the nucleotide sequences complementary to the Pseudomonas aeruginosa 23S rRNA represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 4 to 7 are novel.
以上説明した本発明のプライマーは、シュードモナス・エルギノーサを検出する方法（以下、「本発明検出方法」という）に利用することができる。 The primer of the present invention described above can be used in a method for detecting Pseudomonas aeruginosa (hereinafter, referred to as the “detection method of the present invention”).
具体的に本発明検出方法は、以下の工程（１）〜（４）
（１）試料からＲＮＡを抽出する工程
（２）（１）で抽出したＲＮＡに相補的な塩基配列を作製する工程
（３）シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅することを特徴とするプライマーと、（２）で作製した塩基配列を用いて増幅反応を行う工程
（４）増幅の有無を確認する工程
を含む。
Specifically, the detection method of the present invention comprises the following steps (1) to (4)
(1) Step of extracting RNA from sample (2) Step of preparing base sequence complementary to RNA extracted in (1) (3) At least part of base sequence complementary to 23S rRNA of Pseudomonas aeruginosa A step of performing an amplification reaction using a primer characterized by specific amplification and the base sequence prepared in (2), and (4) a step of confirming the presence or absence of amplification.
本発明検出方法の工程（１）において用いられる試料としては、特に限定されないが、例えば、血液、糞便、喀痰、尿、臓器、洗浄液、組織、細胞が挙げられる。これらの試料の中でも血液、糞便が好ましい。 The sample used in step (1) of the detection method of the present invention is not particularly limited, and includes, for example, blood, feces, sputum, urine, organs, washings, tissues, and cells. Among these samples, blood and feces are preferable.
上記試料からＲＮＡを抽出する方法は、特に限定されないが、例えば、フェノールやクロロホルム、ベンジルクロライドなどの有機溶剤を用いて抽出する方法や、ガラスビーズ振盪により物理的に菌体を破砕する方法、アルカリを直接添加する方法、加熱処理による方法、あるいはプロテアーゼ処理法等の方法が挙げられる。また、試料からＲＮＡを抽出するにあたり、市販のＲＮＡ抽出キットを用いてもよい。これらの方法の中でもプロテアーゼ処理を含む方法がＲＮＡの抽出の所要時間が短く、かつ抽出効率が高い点から好ましい。 The method for extracting RNA from the sample is not particularly limited, but includes, for example, a method of extracting with an organic solvent such as phenol, chloroform, and benzyl chloride, a method of physically disrupting cells by shaking glass beads, and a method of alkaline. , A method of heat treatment, a method of protease treatment, and the like. In extracting RNA from a sample, a commercially available RNA extraction kit may be used. Among these methods, a method including a protease treatment is preferable because the time required for RNA extraction is short and the extraction efficiency is high.
具体的に、試料として血液や糞便を用いる場合、ＲＮＡの抽出は、ホットフェノール法（文献： Matsuda K, Tsuji H, Asahara T, Kado Y, Nomoto K. (2007) Sensitive quantitative detection of commensal bacteria by rRNA-targeted reverse transcription-PCR. Appl Environ Microbiol 73: 32-39.）等に基づいて行うことができる。また、抽出したＲＮＡに相補的な塩基配列を作製する工程では、逆転写酵素を用いた公知の方法で行うことができる。 Specifically, when blood or feces are used as a sample, RNA is extracted by the hot phenol method (Reference: Matsuda K, Tsuji H, Asahara T, Kado Y, Nomoto K. (2007) Sensitive quantitative detection of commensal bacteria by rRNA -targeted reverse transcription-PCR. Appl Environ Microbiol 73: 32-39.) and the like. The step of preparing a base sequence complementary to the extracted RNA can be performed by a known method using reverse transcriptase.
本発明検出方法の工程（３）において、上記したシュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅するプライマーと、（２）で作製した塩基配列を用いた増幅反応には、例えばＰＣＲ等の公知のプライマーを用いる増幅反応が利用できる。これらの増幅反応の中でもＰＣＲが好ましい。また、これら増幅反応は公知の条件を用いることができる。更に、これら増幅反応は、市販のＰＣＲキット等を利用してもよい。また、（２）と（３）の工程を併せてＲＴ−ＰＣＲ法で行ってもよい。 In step (3) of the detection method of the present invention, a primer specifically amplifying at least a part of the nucleotide sequence complementary to the 23S rRNA of Pseudomonas aeruginosa, and amplification using the nucleotide sequence prepared in (2) For the reaction, for example, an amplification reaction using a known primer such as PCR can be used. Among these amplification reactions, PCR is preferred. Known conditions can be used for these amplification reactions. Furthermore, these amplification reactions may utilize a commercially available PCR kit or the like. Further, the steps (2) and (3) may be performed together by the RT-PCR method.
具体的に、増幅反応として、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いた場合、抽出したＲＮＡを鋳型として、市販のＲＴ−ＰＣＲキット等で、４０〜６０℃で２０〜４０分間、８０〜９５℃で１０〜２０分間、ＲＴ反応を行い、次いで、９０〜９８℃で１０〜３０秒間、５０〜７０℃で１０〜３０秒間、７０〜８０℃で２０〜４０秒間を１サイクルとするＰＣＲ反応を４０〜６０サイクル行えばよい。 Specifically, when quantitative RT-PCR is used as an amplification reaction, the extracted RNA is used as a template with a commercially available RT-PCR kit or the like at 40 to 60 ° C for 20 to 40 minutes, and at 80 to 95 ° C for 10 to 40 minutes. The RT reaction is performed for 〜20 minutes, and then the PCR reaction is performed at 90 to 98 ° C. for 10 to 30 seconds, 50 to 70 ° C. for 10 to 30 seconds, and 70 to 80 ° C. for 20 to 40 seconds. It may be performed for 60 cycles.
本発明検出方法の工程（４）において、増幅の有無の確認は、アガロースゲル電気泳動等の公知の方法で行うことができる。この増幅が有った場合には、試料中にシュードモナス・エルギノーサが含まれていたと判断することができる。 In step (4) of the detection method of the present invention, the presence or absence of amplification can be confirmed by a known method such as agarose gel electrophoresis. If this amplification is present, it can be determined that Pseudomonas aeruginosa was contained in the sample.
以上説明した本発明検出方法により、シュードモナス・エルギノーサをＲＮＡ抽出等に３時間程度、増幅反応に３時間程度の計６時間程度で迅速に検出することができる。特に、本発明検出方法では、シュードモナス・エルギノーサを高感度で検出することができる。具体的には、試料が血液の場合、血液１ｍｌ中の１ｃｅｌｌのシュードモナス・エルギノーサを検出することが可能である。また、試料が糞便の場合には、糞便１ｇ中の１００ｃｅｌｌのシュードモナス・エルギノーサを検出することが可能である。 According to the detection method of the present invention described above, Pseudomonas aeruginosa can be rapidly detected in about 3 hours for RNA extraction or the like and about 3 hours for amplification reaction, for a total of about 6 hours. In particular, the detection method of the present invention can detect Pseudomonas aeruginosa with high sensitivity. Specifically, when the sample is blood, it is possible to detect 1 cell of Pseudomonas aeruginosa in 1 ml of blood. When the sample is feces, it is possible to detect 100 cells of Pseudomonas aeruginosa in 1 g of feces.
また、本発明検出方法を実施するためには、本発明のプライマーを含むシュードモナス・エルギノーサの検出キットを利用することもできる。このキットには、更に、酵素試薬等の本発明のプライマーによりシュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部を増幅可能な試薬、ポジティブ・コントロールとなる菌のＲＮＡ等を含ませてもよい。酵素試薬としては、鎖置換活性を有する鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ等の核酸合成酵素、ｄＮＴＰ等の核酸合成の基質等の組合せが挙げられる。 In order to carry out the detection method of the present invention, a Pseudomonas aeruginosa detection kit containing the primer of the present invention can also be used. The kit further contains a reagent capable of amplifying at least a part of the nucleotide sequence complementary to 23S rRNA of Pseudomonas aeruginosa with the primers of the present invention such as an enzyme reagent, and RNA of a bacterium serving as a positive control. You may. Examples of the enzyme reagent include a combination of a nucleic acid synthesizing enzyme having a strand displacement activity such as a template-dependent DNA polymerase and a substrate for nucleic acid synthesis such as dNTP.
なお、本発明のプライマーは、上記した通り、シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列を特異的に増幅するものであるから、これをプライマーを用いた他の病原菌等の検出キット等にも利用できることは言うまでもない。 As described above, since the primer of the present invention specifically amplifies a nucleotide sequence complementary to 23S rRNA of Pseudomonas aeruginosa, it is used in a kit for detecting other pathogenic bacteria using the primer. Needless to say, it can also be used.
以下、本発明を実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
実 施 例 １
プライマーの作製およびこれを用いたシュードモナス・エルギノーサの検出：
＜材料および方法＞
（１）使用菌株
使用菌株を表１に示した。各菌株の培養条件も表１に示した。各菌株の純培養菌液(DAPI染色法により菌数計測)から、松田らの方法（Matsuda K, Tsuji H, Asahara T, Kado Y, Nomoto K. (2007) Sensitive quantitative detection of commensal bacteria by rRNA-targeted reverse transcription-PCR. Appl Environ Microbiol 73: 32-9.）にて２ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌの菌数に相当する総ＲＮＡおよび総ＤＮＡを抽出して以下の実験に供した。
Example 1
Preparation of primers and detection of Pseudomonas aeruginosa using the same:
<Materials and methods>
(1) Used strains Used strains are shown in Table 1. The culture conditions of each strain are also shown in Table 1. Matsuda et al. (Matsuda K, Tsuji H, Asahara T, Kado Y, Nomoto K. (2007) Sensitive quantitative detection of commensal bacteria by rRNA-) Applied Environ Microbiol 73: 32-9.), total RNA and total DNA corresponding to the number of cells of 2 × 10 8 cells / ml were extracted and subjected to the following experiment.
A : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて37℃、140rpmの条件で18時間振盪培養
B : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて37℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
C : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて30℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
D : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて26℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
E: 液体培養, ニュートリエント液体培地 (ニッスイ) にて26℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
a : 平板培養, BHI平板培地 (Becton Dickinson) にて37℃、18時間培養
Ｔ：基準株
A: Liquid culture, shake culture at 37 ° C, 140 rpm for 18 hours in BHI liquid medium (Becton Dickinson)
B: Liquid culture, shake culture in BHI liquid medium (Becton Dickinson) at 37 ° C, 140 rpm for 22 hours
C: Liquid culture, shake culture in BHI liquid medium (Becton Dickinson) at 30 ° C and 140 rpm for 22 hours
D: Liquid culture, shake culture in BHI liquid medium (Becton Dickinson) at 26 ° C, 140 rpm for 22 hours
E: Liquid culture, Nutrient liquid medium (Nissui) with shaking at 26 ° C, 140 rpm for 22 hours
a: Plate culture, culture on BHI plate medium (Becton Dickinson) at 37 ° C for 18 hours
T : Reference stock
（２）２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列解読
公共データベースには、Ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ（ＹＩＴ ６１０８Ｔ）以外のシュードモナス・エルギノーサ菌株および近縁種の２３Ｓｒ ＲＮＡ配列が登録されていなかったことから、シュードモナス・エルギノーサ ６菌株および近縁種８菌株を対象（表１）に、２３Ｓ ｒＲＮＡ解読用のプライマー（表２）（配列番号９〜２６）を新たに設計して２３Ｓｒ ＲＮＡ遺伝子配列の解読を実施した。ＲＴ−ＰＣＲにはQiagen One Step RT-PCR kit(Qiagen)を用い、５０℃、３０分間、９５℃、１５分間の条件で逆転写反応を行った後、９４℃、２０秒、各プライマーセットのアニーリング温度で２０秒、７２℃で目的の増幅サイズに合わせた秒数を１サイクルとして、４５サイクル反応させた。さらに、増幅したＤＮＡ断片をシーケンス解析し、プライマーウォーキングによって２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の全長を決定した（図１）。シーケンシングはBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied BiosystemsTM, Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いて反応させ、精製後、3500 Genetic Analyzer（Applied BiosystemsTM, Thermo Fisher Scientific Inc.）で実施した。これによりシュードモナス・エルギノーサ６菌株および近縁種８菌株の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列を得た（シュードモナス・エルギノーサ６菌株の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列に相補的な塩基配列は配列番号３〜８に記載のもの、近縁種８菌株の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列に相補的な塩基配列は配列番号２７〜３４に記載のもの）。
(2) Decoding 23S rRNA gene sequence In the public database, no Pseudomonas aeruginosa strains other than Type strain (YIT 6108 T ) and 23S rRNA sequences of closely related species were registered. With respect to eight related strains (Table 1), 23S rRNA gene sequences were decoded by newly designing primers for decoding 23S rRNA (Table 2) (SEQ ID NOS: 9 to 26). Using a Qiagen One Step RT-PCR kit (Qiagen) for RT-PCR, a reverse transcription reaction was performed under the conditions of 50 ° C., 30 minutes, 95 ° C., 15 minutes, and then 94 ° C., 20 seconds, for each primer set. The reaction was carried out at an annealing temperature of 20 seconds and at 72 ° C. for 45 cycles, with one second corresponding to the target amplification size as one cycle. Furthermore, the amplified DNA fragment was subjected to sequence analysis, and the full length of the 23S rRNA gene sequence was determined by primer walking (FIG. 1). Sequencing was performed using a BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems ™ , Thermo Fisher Scientific Inc.), purified, and then performed with a 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems ™ , Thermo Fisher Scientific Inc.). Thus, 23S rRNA sequences of 6 strains of Pseudomonas aeruginosa and 8 strains of closely related species were obtained (base sequences complementary to 23S rRNA sequences of 6 strains of Pseudomonas aeruginosa strains are those of SEQ ID NOs: 3 to 8; The nucleotide sequences complementary to the 23S rRNA sequences of eight strains are those described in SEQ ID NOs: 27 to 34).
（３）特異的プライマーの設計
（２）で得られたシュードモナス・エルギノーサ６菌株および近縁種８菌株の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列に相補的な塩基配列（１４菌株）について、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘソフトウェアを用いて整列を行った後、シュードモナス・エルギノーサに特異的な配列をもとにプライマーの設計を行った（表３：配列番号１〜２）。なお、その他の細菌のｒＲＮＡ遺伝子配列に相補的な塩基配列と交差しないことをNCBI BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）により確認した。
(3) Design of specific primers The base sequences (14 strains) complementary to the 23S rRNA sequences of 6 Pseudomonas aeruginosa strains and 8 closely related strains obtained in (2) were aligned using Clustal X software. After that, primers were designed based on sequences specific to Pseudomonas aeruginosa (Table 3: SEQ ID NOS: 1 and 2). It was confirmed by NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) that it did not cross the nucleotide sequence complementary to the rRNA gene sequences of other bacteria.
（４）プライマーの特異性の検討
合成したプライマーの特異性の検討には、代表的な腸内細菌および感染症起因菌の２１菌種（２１菌株）、ならびにシュードモナス・エルギノーサ６菌株および近縁種９菌種１２株（計３９菌株）を対象とした（表４）。２ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌの菌数に相当する濃度となるよう調整したＲＮＡを鋳型として、RNase free water（AmbionTM、Thermo Fisher Scientific Inc.）で適宜希釈し、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法１反応当り１×１０５ｃｅｌｌｓ相当から１×１０１ｃｅｌｌｓ相当のＲＮＡを調製した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ法にはQiagen OneStep RT-PCR kitを用い、９４℃、２０秒、６０℃、２０秒、７２℃、３５秒を１サイクルとして、４５サイクル反応させた。
(4) Examination of Specificity of Primers To examine the specificity of the synthesized primers, 21 species (21 strains) of typical enteric bacteria and infectious disease-causing bacteria, and 6 strains of Pseudomonas aeruginosa and related species The target was 12 strains of 9 strains (39 strains in total) (Table 4). Using RNA adjusted to a concentration corresponding to the number of cells of 2 × 10 8 cells / ml as a template, the RNA was appropriately diluted with RNase free water (Ambion ™ , Thermo Fisher Scientific Inc.), and 1 reaction per quantitative RT-PCR was performed. An RNA equivalent to 1 × 10 1 cells was prepared from an equivalent of × 10 5 cells. For the quantitative RT-PCR method, a Qiagen OneStep RT-PCR kit was used, and the reaction was performed for 45 cycles, with 94 ° C, 20 seconds, 60 ° C, 20 seconds, 72 ° C, and 35 seconds as one cycle.
A : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて37℃、140rpmの条件で18時間振盪培養
B : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて37℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
C : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて30℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
D : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて26℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
E : 液体培養, ニュートリエント液体培地 (ニッスイ) にて30℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
F : 液体培養, ニュートリエント液体培地 (ニッスイ) にて26℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
a : 平板培養, BHI平板培地 (Becton Dickinson) にて37℃、18時間培養
Ｔ：基準株
Ref.1：Matsuda K, Tsuji H, Asahara T, Kado Y, Nomoto K. (2007) Sensitive quantitative detection of commensal bacteria by rRNA-targeted reverse transcription-PCR. Appl Environ Microbiol 73: 32-9.
Ref.2：Matsuda K, Tsuji H, Asahara T, Takahashi T, Kubota H, Nagata S, Yamashiro Y, Nomoto K. (2012) Sensitive quantification of Clostridium difficile cells by reverse transcription-quantitative PCR targeting rRNA molecules. Appl Environ Microbiol 78: 5111-8.
Ref.3：Matsuda K, Tsuji H, Asahara T, Matsumoto K, Takada T, Nomoto K. (2009) Establishment of an analytical system for the human fecal microbiota, based on reverse transcription-quantitative PCR targeting of multicopy rRNA molecules. Appl Environ Microbiol 75: 1961-9.
A: Liquid culture, shake culture at 37 ° C, 140 rpm for 18 hours in BHI liquid medium (Becton Dickinson)
B: Liquid culture, shake culture in BHI liquid medium (Becton Dickinson) at 37 ° C, 140 rpm for 22 hours
C: Liquid culture, shake culture in BHI liquid medium (Becton Dickinson) at 30 ° C and 140 rpm for 22 hours
D: Liquid culture, shake culture in BHI liquid medium (Becton Dickinson) at 26 ° C, 140 rpm for 22 hours
E: Liquid culture, shake culture in nutrient liquid medium (Nissui) at 30 ° C and 140 rpm for 22 hours
F: Liquid culture, shake culture in nutrient liquid medium (Nissui) at 26 ° C, 140 rpm for 22 hours
a: Plate culture, culture on BHI plate medium (Becton Dickinson) at 37 ° C for 18 hours
T : Reference stock
Ref.1: Matsuda K, Tsuji H, Asahara T, Kado Y, Nomoto K. (2007) Sensitive quantitative detection of commensal bacteria by rRNA-targeted reverse transcription-PCR. Appl Environ Microbiol 73: 32-9.
Ref.2: Matsuda K, Tsuji H, Asahara T, Takahashi T, Kubota H, Nagata S, Yamashiro Y, Nomoto K. (2012) Sensitive quantification of Clostridium difficile cells by reverse transcription-quantitative PCR targeting rRNA molecules.Appl Environ Microbiol 78: 5111-8.
Ref.3: Matsuda K, Tsuji H, Asahara T, Matsumoto K, Takada T, Nomoto K. (2009) Establishment of an analytical system for the human fecal microbiota, based on reverse transcription-quantitative PCR targeting of multicopy rRNA molecules.Appl Environ Microbiol 75: 1961-9.
（５）定量的ＲＴ−ＰＣＲ法および定量的ＰＣＲ法によるプライマー検出感度の検討
上記で用いたシュードモナス・エルギノーサ６菌株のＲＮＡ（あるいはＤＮＡ）を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法（あるいは定量的ＰＣＲ法）１反応当り１×１０４ｃｅｌｌｓから１×１０−２ｃｅｌｌｓに相当するように１０倍段階希釈し、この希釈ＲＮＡ（あるいはＤＮＡ）を鋳型に定量的ＲＴ−ＰＣＲ法（あるいは定量的ＰＣＲ法）を行った。得られたＣＴ値と菌数との相関の検討から、定量的解析が可能な菌数の下限値を求めた（定量的ＲＴ−ＰＣＲは３連にて実施）。
(5) Examination of primer detection sensitivity by quantitative RT-PCR and quantitative PCR The quantitative RT-PCR (or quantitative PCR) of RNA (or DNA) of the 6 strains of Pseudomonas aeruginosa used above was 1 the reaction per 1 × 10 4 to 10-fold serial dilutions to correspond to 1 × 10 -2 cells from cells, subjected to quantitative RT-PCR method (or quantitative PCR) the diluted RNA (or DNA) as a template Was. From a study of the correlation between the obtained C T value and the number of bacteria was determined the lower limit value of the number of bacteria capable of quantitative analysis (quantitative RT-PCR is carried out in triplicate).
（６）ヒト末梢血中のシュードモナス・エルギノーサの検出感度および定量性の検討
健常成人の末梢血液（正常ヒト全血液・Ａ型、４５０ｍｌ、コージンバイオ社、ＣｏｄｅＮｏ．１２０８１４４５）を試験に用いた。２．７ｍｌの末梢血液に、最終菌数が１００、１０１、１０２、１０３および１０４ＣＦＵ／ｍｌ（血液）となるようＢＨＩ液体培地で適宜希釈した０．３ｍｌのシュードモナス・エルギノーサ ＹＩＴ ６１０８Ｔ菌液を添加した（試験は各菌数レベルごとに４連にて実施）。各３ｍｌのサンプルのうち、１ｍｌを定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、１ｍｌを培養法による菌数測定に供した。なお、検量線の作成には、ＹＩＦ−ＳＣＡＮ（登録商標）（個々の細菌がもつ特徴的遺伝子配列をターゲットとして細菌を選択的に定量する装置）用のスタンダードＲＮＡ（シュードモナス・エルギノーサ ＹＩＴ ６１０８Ｔ）を用いた。培養法によるＣＦＵカウントは、ＢＨＩ平板培地上で同じ試料を培養することによって決定した。
(6) Detection sensitivity and quantification of Pseudomonas aeruginosa in human peripheral blood Peripheral blood of normal adults (normal human whole blood type A, 450 ml, Kojin Bio Inc., Code No. 12081445) was used for the test. To 2.7ml of peripheral blood, the final number of bacteria is 10 0, 10 1, 10 2, 10 3 and 10 4 CFU / ml (blood) and so as Pseudomonas aeruginosa YIT of 0.3ml diluted appropriately with BHI broth 6108 T bacterial solution was added (tests were performed in quadruplicate for each bacterial count level). Of each 3 ml sample, 1 ml was subjected to a quantitative RT-PCR method and 1 ml was subjected to cell count measurement by a culture method. The calibration curve was prepared by using standard RNA (Pseudomonas aeruginosa YIT 6108 T ) for YIF-SCAN (registered trademark) (a device that selectively quantifies bacteria by targeting the characteristic gene sequence of each bacterium). Was used. CFU counts by culture were determined by culturing the same samples on BHI plate media.
＜結果＞
（ａ）プライマーの特異性
代表的な腸内細菌および感染症起因菌の２１菌種（２１菌株）、ならびにシュードモナス・エルギノーサ６菌株および近縁種 ９菌種１２株（計３９菌株）と今回設計したプライマー『ｓ−Ｐａ−Ｆ／ｓ−Ｐａ−Ｒ』との交差反応性を調べたところ、当該プライマーはシュードモナス・エルギノーサ６菌株に対してのみ高い特異性を有しており、供試した他の菌株に対しては交差反応性を示さなかった（表５）。
<Result>
(A) Specificity of primers Designed with 21 representative strains of intestinal bacteria and infectious disease-causing bacteria (21 strains), 6 strains of Pseudomonas aeruginosa and 9 related species (12 strains in total) (39 strains in total) When the cross-reactivity with the primer "s-Pa-F / s-Pa-R" was examined, the primer had high specificity only for Pseudomonas aeruginosa 6 strains. Did not show cross-reactivity to the strain (Table 5).
（+: ＞104cells相当のCT値, -: ＜101cellsのCT値あるいは非検出）。
Ｔ：基準株
(+: CT value equivalent to> 10 4 cells,-: CT value of <10 1 cells or not detected).
T : Reference stock
次いでシュードモナス・エルギノーサ６菌株に対する特異性を解析した。一反応あたり１０５ｃｅｌｌｓとなるように各菌株ＲＮＡ鋳型として定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を行い、菌数を算出した。なお、検量線の作成には、ＹＩＦ−ＳＣＡＮ用のスタンダードＲＮＡ（シュードモナス・エルギノーサ ＹＩＴ ６１０８Ｔ）を用いた。その結果、定量値が５．１〜５．４（ｌｏｇ１０ｃｅｌｌｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎ）の範囲に収まり、シュードモナス・エルギノーサ６菌株をほぼ同等に定量可能なことが示された（データは未掲載）。 Subsequently, the specificity for the 6 strains of Pseudomonas aeruginosa was analyzed. We performed quantitative RT-PCR analysis as each strain RNA template such that the 10 5 cells per reaction, were calculated number of bacteria. Note that a standard curve for YIF-SCAN (Pseudomonas aeruginosa YIT 6108 T ) was used for preparing the calibration curve. As a result, the quantification value was within the range of 5.1 to 5.4 (log 10 cells / reaction), indicating that the six strains of Pseudomonas aeruginosa could be quantified almost equally (data not shown).
（ｂ）プライマーの検出感度
シュードモナス・エルギノーサ６菌株に対するプライマー『ｓ−Ｐａ−Ｆ／ｓ−Ｐａ−Ｒ』の検出感度を検討した。全ＲＮＡを鋳型とした定量的ＲＴ−ＰＣＲ法による解析では、供した全６菌株において、１×１０−２〜１×１０４ｃｅｌｌｓの範囲で菌数に対して高い相関を示し、かつ高い検出感度を有していた（図２、下限値：１×１０−２ｃｅｌｌｓ）。全ＤＮＡを鋳型にした定量的ＰＣＲ法による解析でも、ＣＴ値と菌数の間には高い相関が認められたが、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法に比べて１００倍程度感度が低いことが明らかになった（図２、下限値：１×１００ ｃｅｌｌｓ）。今回検討した６菌株の近似式はほぼ一致した（図２）。
(B) Sensitivity of detection of primer The detection sensitivity of the primer "s-Pa-F / s-Pa-R" for Pseudomonas aeruginosa 6 strains was examined. In the analysis by the quantitative RT-PCR method using the total RNA as a template, all of the 6 strains provided showed a high correlation with the number of bacteria in the range of 1 × 10 −2 to 1 × 10 4 cells and high detection. It had sensitivity (FIG. 2, lower limit: 1 × 10 −2 cells). In analysis by quantitative PCR that the total DNA was used as a template, high but the correlation was observed, clearly have a low order of 100 times more sensitive than the quantitative RT-PCR method between the C T value and the number of bacteria (FIG. 2, lower limit: 1 × 10 0 cells). The approximate expressions of the six strains examined this time were almost the same (FIG. 2).
（ｃ）定量的RT-PCR法と培養法による末梢血に添加した シュードモナス・エルギノーサの検出菌数の相関
定量的ＲＴ−ＰＣＲ法と培養法はいずれも末梢血に添加した１ｃｅｌｌのシュードモナス・エルギノーサ ＹＩＴ ６１０８Ｔを検出可能であった。また、ＣＴ値と培養法で求めた生菌数の間には、それぞれ血液１ｍｌ当り１００〜１０４ＣＦＵの範囲で高い相関が認められた（図３、近似式：ｙ＝０．８１６９ｘ−０．１６２、Ｒ２＝０．９８９６）。
(C) Correlation between the number of detected bacteria of Pseudomonas aeruginosa added to peripheral blood by quantitative RT-PCR method and culture method Both quantitative RT-PCR method and culture method of 1 cell Pseudomonas aeruginosa YIT added to peripheral blood 6108 T was detectable. Between the C T value and the number of viable cells determined by the culture method, a high correlation in the range of blood 1ml per 10 0 to 10 4 CFU were observed respectively (Fig. 3, approximate equation: y = 0.8169x -0.162,
以上の結果より、本発明のプライマーでは定量的ＲＴ−ＰＣＲ法（ＹＩＦ−ＳＣＡＮ）により血液１ｍｌ中の１ｃｅｌｌのシュードモナス・エルギノーサを検出することが可能であり、臨床検体中の本菌の検出に有用なプライマーであることが示された。 From the above results, it is possible to detect 1 cell of Pseudomonas aeruginosa in 1 ml of blood by the quantitative RT-PCR method (YIF-SCAN) with the primer of the present invention, which is useful for detecting this bacterium in clinical samples. It was shown that it was a good primer.
実 施 例 ２
ヒト糞便中のシュードモナス・エルギノーサの検出：
健康な３名のボランティアの糞便を混ぜ合わせ、この糞便に９倍量のＴＳＢ培地を添加して激しく攪拌し、糞便１０倍希釈液を作製した。−８０℃にて凍結保存されているシュードモナス・エルギノーサ ＹＩＴ ６１０８Ｔのビーズストック１個を１０ｍｌのＴＳＢ培地に添加して培養した後、この培養液を用いて９００μｌの糞便１０倍希釈液に、最終菌数が１０２ＣＦＵ／ｇ（糞便）となるように調製した。また、対照としてシュードモナス・エルギノーサ ＹＩＴ ６１０８Ｔを添加していない糞便１０倍希釈液を調製した。
Example 2
Detection of Pseudomonas aeruginosa in human feces:
The feces of three healthy volunteers were mixed, and a 9-fold amount of TSB medium was added to the feces and vigorously stirred to prepare a 10-fold diluted feces solution. One bead stock of Pseudomonas aeruginosa YIT 6108 T cryopreserved at −80 ° C. was added to 10 ml of TSB medium and cultured, and the resulting culture was used to prepare 900 μl of a 10-fold diluted feces solution. It was prepared such that the number of bacteria was 10 2 CFU / g (feces). As a control, a 10-fold diluted stool solution to which Pseudomonas aeruginosa YIT 6108 T was not added was prepared.
シュードモナス・エルギノーサ ＹＩＴ ６１０８Ｔを１０２ＣＦＵ／ｇで添加した糞便１０倍希釈液について、上記実施例１と同様にして、ＲＮＡを抽出した後、ＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、陽性反応を示した。また、対照であるシュードモナス・エルギノーサ ＹＩＴ ６１０８Ｔを添加していない糞便１０倍希釈液はＲＴ−ＰＣＲを行っても陽性反応を示さなかった。 A 10-fold diluted stool to which Pseudomonas aeruginosa YIT 6108 T was added at 10 2 CFU / g was subjected to RT-PCR after extracting RNA in the same manner as in Example 1 above, and a positive reaction was shown. . In addition, a 10-fold diluted stool solution to which no control, Pseudomonas aeruginosa YIT 6108 T was added, did not show a positive reaction even when RT-PCR was performed.
実 施 例 ３
シュードモナス・エルギノーサの検出キット：
以下を含むシュードモナス・エルギノーサの検出キットを作製した。
・プライマーｓ−Ｐａ−Ｆ
・プライマーｓ−Ｐａ−Ｒ
・鎖置換活性を有する鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ
・ｄＮＴＰ
・ポジティブ・コントロールとなる菌（シュードモナス・エルギノーサの標準菌株(Pseudomonas aeruginosa ATCC10145T)のＲＮＡ
Example 3
Pseudomonas aeruginosa detection kit:
A Pseudomonas aeruginosa detection kit comprising the following was prepared.
・ Primer s-Pa-F
・ Primer s-Pa-R
Template-dependent DNA polymerase having strand displacement activity dNTP
・ RNA of positive control bacteria (Pseudomonas aeruginosa ATCC10145 T )
本発明によれば、シュードモナス・エルギノーサを血液、糞便等から高感度に、かつ、迅速に分別定量可能なため、シュードモナス・エルギノーサによる院内感染を制御することができる。また、本プライマーと薬剤耐性プライマーを併用することで、多剤耐性緑膿菌のモニタリングが可能となる。 According to the present invention, Pseudomonas aeruginosa can be separated and quantified with high sensitivity and quickly from blood, feces, etc., so that nosocomial infection by Pseudomonas aeruginosa can be controlled. In addition, by using this primer in combination with a drug-resistant primer, multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa can be monitored.
Claims (6)
（１）試料からＲＮＡを抽出する工程
（２）（１）で抽出したＲＮＡに相補的な塩基配列を作製する工程
（３）シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅することを特徴とするプライマーと、（２）で作製した塩基配列を用いて増幅反応を行う工程
（４）増幅の有無を確認する工程
を含むことを特徴とするシュードモナス・エルギノーサの検出方法。 The following steps (1) to (4)
(1) Step of extracting RNA from sample (2) Step of preparing base sequence complementary to RNA extracted in (1) (3) At least part of base sequence complementary to 23S rRNA of Pseudomonas aeruginosa A step of performing an amplification reaction using a primer characterized in that it specifically amplifies and a base sequence prepared in (2), and (4) a step of confirming the presence or absence of amplification, of Pseudomonas aeruginosa. Detection method.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018187032A JP7194548B2 (en) | 2018-10-02 | 2018-10-02 | Primer for specifically amplifying at least part of base sequence complementary to 23S rRNA of Pseudomonas aeruginosa and method for detecting Pseudomonas aeruginosa using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018187032A JP7194548B2 (en) | 2018-10-02 | 2018-10-02 | Primer for specifically amplifying at least part of base sequence complementary to 23S rRNA of Pseudomonas aeruginosa and method for detecting Pseudomonas aeruginosa using the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2020054279A true JP2020054279A (en) | 2020-04-09 |
| JP7194548B2 JP7194548B2 (en) | 2022-12-22 |
Family
ID=70105397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2018187032A Active JP7194548B2 (en) | 2018-10-02 | 2018-10-02 | Primer for specifically amplifying at least part of base sequence complementary to 23S rRNA of Pseudomonas aeruginosa and method for detecting Pseudomonas aeruginosa using the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7194548B2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114107532A (en) * | 2021-12-20 | 2022-03-01 | 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) | Molecular target for identifying pseudomonas aeruginosa and quantitative detection method thereof |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008054660A (en) * | 2006-06-29 | 2008-03-13 | Millipore Corp | Filter device for isolating nucleic acid |
| JP2011510612A (en) * | 2007-04-02 | 2011-04-07 | ジェン−プロウブ インコーポレイテッド | Compositions, kits and related methods for detection and / or monitoring of Pseudomonasa eruginosa |
-
2018
- 2018-10-02 JP JP2018187032A patent/JP7194548B2/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008054660A (en) * | 2006-06-29 | 2008-03-13 | Millipore Corp | Filter device for isolating nucleic acid |
| JP2011510612A (en) * | 2007-04-02 | 2011-04-07 | ジェン−プロウブ インコーポレイテッド | Compositions, kits and related methods for detection and / or monitoring of Pseudomonasa eruginosa |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114107532A (en) * | 2021-12-20 | 2022-03-01 | 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) | Molecular target for identifying pseudomonas aeruginosa and quantitative detection method thereof |
| CN114107532B (en) * | 2021-12-20 | 2023-12-05 | 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) | Molecular target for identifying pseudomonas aeruginosa and quantitative detection method thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP7194548B2 (en) | 2022-12-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Redondo et al. | A novel RT-PCR for the detection of Helicobacter pylori and identification of clarithromycin resistance mediated by mutations in the 23S rRNA gene | |
| Wiemer et al. | Real-time multiplex PCR for simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella, Shigella and Yersinia species in fecal samples | |
| Naser et al. | Culture of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis from the blood of patients with Crohn's disease | |
| Griffin et al. | Comparative analysis of Edwardsiella isolates from fish in the eastern United States identifies two distinct genetic taxa amongst organisms phenotypically classified as E. tarda | |
| Suardana | Analysis of nucleotide sequences of the 16S rRNA gene of novel Escherichia coli strains isolated from feces of human and Bali cattle | |
| Keenan et al. | Screening for enterotoxigenic Bacteroides fragilis in stool samples | |
| Aminshahidi et al. | Diarrheagenic Escherichia coli and Shigella with high rate of extended-spectrum Beta-lactamase production: two predominant etiological agents of acute diarrhea in Shiraz, Iran | |
| Ma et al. | Molecular characterization of fecal microbiota in patients with viral diarrhea | |
| Sarria-Guzmán et al. | Identification of antibiotic resistance cassettes in class 1 integrons in Aeromonas spp. strains isolated from fresh fish (Cyprinus carpio L.) | |
| Karch et al. | New aspects in the pathogenesis of enteropathic hemolytic uremic syndrome | |
| JP2008283895A (en) | Method for detecting diarrheagenic escherichia coli | |
| Werner et al. | Comparison of direct cultivation on a selective solid medium, polymerase chain reaction from an enrichment broth, and the BD GeneOhm™ VanR Assay for identification of vancomycin-resistant enterococci in screening specimens | |
| Huang et al. | Quadruplex real-time PCR assay for detection and identification of Vibrio cholerae O1 and O139 strains and determination of their toxigenic potential | |
| Ranjbar et al. | The frequency of resistance genes in Salmonella enteritidis strains isolated from cattle | |
| JP2013520186A (en) | Assays and kits for serotyping of Pseudomonas aeruginosa and oligonucleotide sequences useful in such methods and kits | |
| Soo et al. | Rapid and sensitive detection of Acinetobacter baumannii using loop-mediated isothermal amplification | |
| Amoako et al. | Rapid detection and identification of Bacillus anthracis in food using pyrosequencing technology | |
| Miller et al. | Globicatella sanguinis osteomyelitis and bacteremia: review of an emerging human pathogen with an expanding spectrum of disease | |
| Ramazanzadeh et al. | Molecular characterization of Vibrio cholerae Isolated from clinical samples in Kurdistan province, Iran | |
| Poursina et al. | Overexpression of spoT gene in coccoid forms of clinical Helicobacter pylori isolates | |
| Trakhna et al. | Rapid Aeromonas hydrophila identification by TaqMan PCR assay: comparison with a phenotypic method | |
| Harada et al. | Prevalence and antimicrobial susceptibility of Enterobacteriaceae isolated from retail pepper in Vietnam | |
| Mi et al. | Heterogeneity of Helicobacter pylori strains isolated from patients with gastric disorders in Guiyang, China | |
| Pu et al. | Investigation of Streptococcus agalactiae using pcs B‐based LAMP in milk, tilapia and vaginal swabs in Haikou, China | |
| Noguchi et al. | Using the tannase gene to rapidly and simply identify Staphylococcus lugdunensis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210811 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20220608 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220615 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220809 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221014 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20221014 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20221207 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20221212 |
|
| R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 7194548 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |