JP2020051835A - 被験試料の評価方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(A)単球と被験試料とを接触させ、TRPV4の活性化によって引き起こされる生理学的事象を測定するステップ、
(B)単球のTRPV4の機能の抑制条件下に、当該単球と被験試料とを接触させ、TRPV4の活性化によって引き起こされる生理学的事象を測定するステップ、および
(C)ステップ(A)および(B)で測定された生理学的事象に基づき、被験試料による単球のTRPV4に対する活性促進作用を評価し、当該活性促進作用の評価結果に基づき、前記被験試料が有する抗炎症作用を評価するステップ
を含む方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
測定法1では、生理学的事象として、前記「(i)単球のTRPV4の活性化に起因する炎症関連因子またはそのmRNAの発現量の減少」が用いられる。測定法1は、
(1a)単球と炎症惹起物質とを接触させるステップ、および
(1b)炎症関連因子またはそのmRNAの発現量を測定するステップ
を含む。
測定法2では、生理学的事象として、前記「(ii)単球のTRPV4の活性化に起因する単球からM1型マクロファージへの分化の抑制」が用いられる。単球からM1型マクロファージの分化は、単球とGM−CSFとを接触させることによって行なうことができる。測定法2は、
(2a)単球と顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(以下、「GM−CSF」という)とを接触させるステップ、および
(2b)M1型マクロファージの数を測定するステップ
を含む。
測定法3では、生理学的事象として、前記「(iii)単球のTRPV4の活性化に起因する単球の細胞内カルシウムイオン濃度の増加」が用いられる。単球の細胞内カルシウムイオン濃度は、カルシウム指示薬を単球に導入し、単球内のカルシウムイオンと結合したカルシウム指示薬の量を指標として測定することができる。
[蛍光強度比]=[第1蛍光強度]/[第2蛍光強度] (I)
に基づいて求めることができる。
測定法4では、生理学的事象として、前記「(iv)単球のTRPV4の活性化に起因する単球の膜電位の増加」が用いられる。単球の膜電位の測定法としては、例えば、ホールセル法、セルアタッチ法などのパッチクランプ法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
<指標(1a)>
ステップ(A)で測定された炎症関連因子の発現量がステップ(B)で測定された炎症関連因子の発現量と比べて少ないこと
<指標(1b)>
ステップ(A)で測定された炎症関連因子のmRNAの発現量がステップ(B)で測定された炎症関連因子のmRNAの発現量と比べて少ないこと
<指標(2a)>
ステップ(A)で測定されたM1型マクロファージの数がステップ(B)で測定されたM1型マクロファージの数と比べて少ないこと
<指標(3a)>
ステップ(A)で測定された単球の細胞内カルシウムイオン濃度がステップ(B)で測定された単球の細胞内カルシウムイオン濃度と比べて高いこと
<指標(4a)>
ステップ(A)で測定された単球の膜電位がステップ(B)で測定された単球の膜電位と比べて大きいこと
BSA:ウシ血清アルブミン
EDTA:エチレンジアミン四酢酸
FBS:ウシ胎仔血清
GAPDH:グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素
LPS:リポ多糖
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
PFA:パラホルムアルデヒド
ヒトリンパ球分離用媒体〔GEヘルスケア社製、商品名:Ficoll−Paque PLUS〕を用い、密度勾配遠心法にしたがい、健常ボランティアの末梢血から末梢血単核細胞を分離した。末梢血単核細胞2.0×108個にACK溶解緩衝液(組成:150mM塩化アンモニウム、10mM炭酸水素カリウムおよび0.1mM EDTA)4mLを添加した。得られた混合物を15分間室温で静置することにより、前記混合物中の赤血球を溶血させた。
ヒト単球株化細胞THP−1を培地A〔0.5%(v/v)FBS含有RPMI1640培地〕において、37℃の5%(v/v)二酸化炭素雰囲気中で培養した。LPS〔シグマ−アルドリッチ(SIGMA−Aldrich)社製、商品名:Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4〕と、TRPV4アゴニスト〔和光純薬(株)製、商品名:GSK1016790A〕とを表1に示される濃度となるように培地Aに添加した。その後、THP−1をさらに6時間培養した。なお、LPSは、炎症性サイトカインIL−1βの発現を誘導する。
捕捉用抗体液100μLをELISAプレートの各ウェルに入れた。前記ELISAプレートを4℃で一晩(約8時間)インキュベートした。前記ELISAプレートの各ウェル中の液体成分を除去した後、各ウェルを洗浄液〔0.05%(v/v)ポリオキシエチレンソルビタンモノウタラート(Tween−20)含有PBS溶液〕300μLで4回洗浄した。洗浄後のELISAプレートの各ウェルから残存している洗浄液を除去した。
[IL−1β相対値(倍)]
=[試料のIL−1β質量濃度]/[実験番号1−1の試料のIL−1β質量濃度] (II)
にしたがい、IL−1β相対値を求めた。
調製例1で得られた単離単球を培地A〔0.5%(v/v)FBS含有RPMI1640培地〕において、37℃の5%(v/v)二酸化炭素雰囲気中で培養した。前記培地AにおけるTRPV4アンタゴニスト〔トクリス(TOCRIS)社製、商品名:HC067047〕の濃度を0μMまたは30μMに調製し、単離単球をさらに30分間培養した。
実施例1において、実験番号1−1〜1−5の試料を用いる代わりに実験番号2−1〜2−8の試料を用いたことを除き、実施例1と同様の操作を行ない、吸光度を測定した。定量用標品の吸光度を測定することにより、吸光度とIL−1β質量濃度との関係式を得た。吸光度とIL−1β質量濃度との関係式を用い、各試料のIL−1β質量濃度を算出した。各試料のIL−1β質量濃度を用い、式(III)
[IL−1β相対値(倍)]
=[試料のIL−1β質量濃度]/[実験番号2−1の試料のIL−1β質量濃度] (III)
にしたがい、IL−1β相対値を求めた。
LPS〔シグマ−アルドリッチ(SIGMA−Aldrich)社製、商品名:Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4〕およびTRPV4アゴニスト〔和光純薬(株)製、商品名:GSK1016790A〕を表3に示される濃度となるように前記培地Aに添加し、培地B〜Dを得た。
THP−1を培地A(実験番号3−1)、培地B(実験番号3−2)、培地C(実験番号3−3)または培地D(実験番号3−4)において、37℃の5%(v/v)二酸化炭素雰囲気中で培養した。培養開始から6時間経過時にTHP−1を回収し、PBSで洗浄した。
[IL−1β ΔCt]
=[試料のIL−1β Ct値]−[GAPDH Ct値の平均値] (IV)
にしたがい、IL−1β ΔCtを求めた。つぎに、実験番号3−1のIL−1β ΔCt値を1としたときの各実験番号のIL−1β ΔCtの相対値を算出した。以下において、IL−1β ΔCtの相対値をmRNA量の増加度として用いた。
LPS〔シグマ−アルドリッチ(SIGMA−Aldrich)社製、商品名:Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4〕およびTRPV4アゴニスト〔和光純薬(株)製、商品名:GSK1016790A〕を表5に示される濃度となるように前記培地Aに添加し、培地E〜Gを得た。
調製例1で得られた単離単球を培地A(実験番号4−1)、培地E(実験番号4−2)、培地F(実験番号4−3)または培地G(実験番号4−4)において、37℃の5%(v/v)二酸化炭素雰囲気中で培養した。培養開始から6時間経過時に単離単球を回収し、PBSで洗浄した。
単球株化細胞THP−1を培地Aにおいて、37℃の5%(v/v)二酸化炭素雰囲気中で培養した。カルシウムキレート化剤〔アール・アンド・ディーシステムズ社製、商品名:BAPTA−AM〕を表6に示される濃度となるように添加した。カルシウムキレート化剤の添加時から30分間経過後、LPS〔シグマ−アルドリッチ(SIGMA−Aldrich)社製、商品名:Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4〕と、TRPV4アゴニスト〔和光純薬(株)製、商品名:GSK1016790A〕を表6に示される濃度となるように添加し、THP−1をさらに6時間培養した。
実施例1において、実験番号1−1〜1−5の試料を用いる代わりに実験番号5−1〜5−4の試料を用いたことを除き、実施例1と同様の操作を行ない、吸光度を測定した。定量用標品の吸光度を測定することで得られた吸光度とIL−1β質量濃度の関係式を用い、試料に含まれるIL−1βの質量濃度を算出した。
FBSおよび抗生物質〔ギブコ社製、商品名:Antibiotic−Antimycotic〕をFBSの濃度が20%(v/v)、抗生物質の濃度が1%(V/V)となるようにRPMI1630培地に添加し、培地Hを得た。
M−CSF〔シェナンドー社製、製品番号:100−03〕、TRPV4アゴニスト〔和光純薬(株)製、商品名:GSK1016790A〕およびTRPV4アンタゴニスト〔シグマ−アルドリッチ社製、商品名:GSK2193874〕を表8に示される濃度となるように培地Hに添加し、培地L〜Nを得た。
調製例1で得られた単離単球を、培地H(実験番号6−1)、培地I(実験番号6−2)、培地J(実験番号6−3)、培地K(実験番号6−4)、培地L(実験番号6−5)、培地M(実験番号6−6)または培地N(実験番号6−7)が入った培養容器において、37℃の5%(v/v)二酸化炭素雰囲気中で培養した。なお、培養開始から2日間および5日間経過時に、新鮮な培地を単離単球の培養系に追加した。
LPS〔シグマ−アルドリッチ社製、製品番号:L2630〕、K3CpG〔ジーン・デザイン(Gene Design)社製、製品番号:CN65003)、Pam3CSK4〔インビトロジェン社製、製品番号:tlrl−pms〕、poly I:C〔シグマ−アルドリッチ社製、製品番号:p1530〕およびTRPV4アゴニスト〔和光純薬(株)製、商品名:GSK1016790A〕を表10に示される濃度となるように培地Aに添加し、血清飢餓培地1〜9を得た。
LPS〔シグマ−アルドリッチ社製、製品番号:L2630〕、K3CpG〔ジーン・デザイン(Gene Design)社製、製品番号:CN65003)、Pam3CSK4〔インビトロジェン社製、製品番号:tlrl−pms〕、poly I:C〔シグマ−アルドリッチ社製、製品番号:p1530〕およびTRPV4アゴニスト〔和光純薬(株)製、商品名:GSK1016790A〕を表11に示される濃度となるように培地Aに添加し、通常培地1〜9を得た。
(1)血清飢餓培養
調製例1で得られた単離単球を血清飢餓培地1(実験番号7−1)、血清飢餓培地2(実験番号7−2)、血清飢餓培地3(実験番号7−3)、血清飢餓培地4(実験番号7−4)、血清飢餓培地5(実験番号7−5)、血清飢餓培地6(実験番号7−6)、血清飢餓培地7(実験番号7−7)、血清飢餓培地8(実験番号7−8)または血清飢餓培地9(対照;実験番号7−9)において、37℃の5%(v/v)二酸化炭素雰囲気中で6時間培養した。
実施例7(1)において、血清飢餓培地1、血清飢餓培地2、血清飢餓培地3、血清飢餓培地4、血清飢餓培地5、血清飢餓培地6、血清飢餓培地7、血清飢餓培地8または血清飢餓培地9を用いる代わりに通常培地1(実験番号8−1)、通常培地2(実験番号8−2)、通常培地3(実験番号8−3)、通常培地4(実験番号8−4)、通常培地5(実験番号8−5)、通常培地6(実験番号8−6)、通常培地7(実験番号8−7)、通常培地8(実験番号8−8)または通常培地9(対照;実験番号8−9)を用いたことを除き、実施例7(1)と同様の操作を行ない、TRPV4の活性化によって発現量が減少した炎症関連因子を調べた。
配列番号:2は、IL−1βリバースプライマーの配列である。
配列番号:3は、GAPDHフォワードプライマーの配列である。
配列番号:4は、GAPDHリバースプライマーの配列である。
Claims (1)
- 被験試料が有する抗炎症作用を評価する被験試料の評価方法であって、被験試料と単球とを接触させ、単球のTRPV4の活性化によって引き起こされる生理学的事象を測定し、当該生理学的事象に基づき、前記被験試料が有する抗炎症作用を評価することを特徴とする被験試料の評価方法。
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JP2018179975A JP7199891B2 (ja) | 2018-09-26 | 2018-09-26 | 被験試料の評価方法 |
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Citations (3)
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---|---|---|---|---|
JP2008512475A (ja) * | 2004-09-07 | 2008-04-24 | スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション | アゴニストによるtrpv4チャネル受容体の活性化方法 |
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2018
- 2018-09-26 JP JP2018179975A patent/JP7199891B2/ja active Active
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SANTONI, G. ET AL.: ""Immuno-Transient Receptor Potential Ion Channels": The Role in Monocyte- and Macrophage-Mediated", FRONTIERS IN IMMUNOLOGY, vol. 9, JPN6022027417, 6 June 2018 (2018-06-06), pages 1273, ISSN: 0004817204 * |
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XU, S. ET AL.: "A novel TRPV4-specific agonist inhibits monocyte adhesion and atherosclerosis", ONCOTARGET, vol. 7, JPN6022027421, 2016, pages 37622 - 37635, ISSN: 0004817201 * |
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