JP2020039279A - Transformant and method of evaluating sample material using the transformant - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、レポーターアッセイに利用できる形質転換体及び当該形質転換体を用いた供試物質の評価方法に関する。 The present invention relates to a transformant that can be used for a reporter assay and a method for evaluating a test substance using the transformant.
内分泌攪乱物質は、生物の内分泌作用を撹乱し、生殖機能阻害や悪性腫瘍等を引き起こす可能性のある物質である。内分泌攪乱物質は、ホルモン様作用物質（Hormonally Active Agents）とも呼称され、生体内に取り込まれると極微量であっても、正常なホルモン作用に影響を与える。内分泌攪乱物質は、例えば、本来、ホルモンが結合すべき受容体に結合することで生体に対する作用を発現する。内分泌攪乱物質による生体への作用としては、ホルモンと類似の作用がもたらされる場合と、当該ホルモンと反対の作用がもたらされる場合とがある。 An endocrine disrupting substance is a substance that disrupts the endocrine action of an organism and may cause reproductive function inhibition, malignant tumors, and the like. Endocrine disruptors are also referred to as hormone-like active agents (Hormonally Active Agents), and when incorporated into a living body, affect the normal hormonal action even in a very small amount. An endocrine disrupter, for example, exerts an effect on a living body by binding to a receptor to which a hormone should originally bind. The action of the endocrine disrupting substance on the living body may be similar to that of a hormone, or may be opposite to the hormone.
例えば、農薬や殺虫剤、塗料、防錆剤等の成分には、エストロジェン様作用又はアンドロジェン様作用を示す内分泌攪乱物質として知られている化合物が含まれており、人体への影響が懸念されている。 For example, components such as pesticides, insecticides, paints, and rust inhibitors contain compounds known as endocrine disruptors that exhibit estrogenic or androgenic effects, and there is a concern that they may affect the human body. ing.
一方、節足動物に特有の幼若ホルモン（Juvinele hormone：JH）の働きを制御する化学物質が殺虫剤として開発されている。幼若ホルモンは、様々な節足動物において変態や生殖を制御する特徴的なホルモンである。昆虫では、幼若ホルモンを受容体MET（Methoprene-tolerant）（ショウジョウバエではGce（Germ-cell-expressed）も存在）が受容すると下流のKruppel homolog 1（Kr-h1）の転写活性化を介して最終的な生理機能の発現に至る。したがって、幼若ホルモンが正常に働かないと、幼若ホルモンを有する節足動物は生存することができない。特に、哺乳動物は幼若ホルモンを持たないため、幼若ホルモンの働きを制御する化学物質を殺虫剤として利用しても、ヒトに対する安全性が高いと考えられてきた。なお、幼若ホルモンにはいくつかの種類があり、甲虫目や膜翅目、双翅目などの多くの昆虫ではJHIIIが、鱗翅目ではJHIとJHIIが知られている。 On the other hand, chemicals that control the action of juvenile hormone (JH), which is unique to arthropods, have been developed as insecticides. Juvenile hormone is a characteristic hormone that controls metamorphosis and reproduction in various arthropods. In insects, when juvenile hormone is accepted by the receptor MET (Methoprene-tolerant) (Gce (germ-cell-expressed) is also present in Drosophila), it is deactivated through transcriptional activation of downstream Kruppel homolog 1 (Kr-h1). Expression of physiological functions. Therefore, arthropods with juvenile hormones cannot survive unless the juvenile hormones work properly. In particular, since mammals do not have juvenile hormone, it has been considered that humans are highly safe even if chemicals that control the action of juvenile hormone are used as insecticides. There are several types of juvenile hormones. JHIII is known in many insects such as Coleoptera, Hymenoptera, and Diptera, and JHI and JHII are known in Lepidoptera.
例えば、特許文献１には、幼若ホルモン（JH）に応答して下流の遺伝子の転写を活性化する応答配列（幼若ホルモン応答性配列（JH応答配列））をカイコにおいて見いだしたこと、当該JH応答配列をレポーター遺伝子と組み合わせて使用することで、JH応答性を評価するレポーターアッセイを構築したことが開示されている。 For example, Patent Document 1 discloses that a response element (juvenile hormone responsive element (JH responsive element)) that activates transcription of a downstream gene in response to juvenile hormone (JH) was found in a silkworm. It is disclosed that a reporter assay for evaluating JH responsiveness was constructed by using a JH response element in combination with a reporter gene.
ところで、一般に、ミジンコは通常、単為生殖で雌個体のみを産出するが、環境が悪化すると雄個体を産出し受精し、耐久卵という環境変化に強い卵を産出する特性をもつことが知られている。近年、オオミジンコに関して、幼若ホルモンに曝されると雄個体を産出すると報告されており、幼若ホルモン受容体にリガンドとして作用する又は幼若ホルモン受容体の機能を阻害する物質も新たに内分泌攪乱物質として考えることができる。そのため、有害生物における幼若ホルモンに対して特異的にその機能を制御する化学物質の早期開発が求められている。 By the way, in general, Daphnia produces only female individuals by parthenogenesis, but it is known that when the environment deteriorates, it produces male individuals and fertilizes them, and has the property of producing eggs that are resistant to environmental changes called durable eggs. ing. In recent years, it has been reported that Daphnia magna produces male individuals when exposed to juvenile hormone, and substances that act as ligands for juvenile hormone receptors or inhibit the function of juvenile hormone receptors are also newly endocrine disrupting. Can be considered as a substance. Therefore, early development of chemical substances that specifically control the function of juvenile hormones in pests is required.
幼若ホルモン作用を評価する方法として、オオミジンコ個体を使用した繁殖毒性試験があるが、試験期間に長期間要することや、飼育・評価に技術を要するといった問題がある（非特許文献１）。また、培養細胞を用いて幼若ホルモン作用を評価する系も確立されているが、飼育・継代に技術を要するといった問題がある。また、非特許文献２には、オオミジンコにおける幼若ホルモン受容体遺伝子（MET遺伝子）及びJH応答配列の複数の候補が開示されている。 As a method for evaluating juvenile hormone action, there is a reproductive toxicity test using Daphnia magna, but there are problems that it takes a long time for the test period and requires techniques for breeding and evaluation (Non-Patent Document 1). Although a system for evaluating the action of juvenile hormone using cultured cells has been established, there is a problem that techniques are required for rearing and subculture. Non-Patent Document 2 discloses a plurality of candidates for juvenile hormone receptor gene (MET gene) and JH response element in Daphnia magna.
上述のように、幼若ホルモンを含む各種ホルモンのそれぞれについて内分泌攪乱物質が存在する。このため、所定の化合物が如何なる内分泌攪乱作用を有するかは、各種のホルモンそれぞれに対して評価系を準備する必要があった。このように、所定の化合物における内分泌撹乱作用を評価するには、多くの工数が必要となり評価に要するコストが高くなるといった問題があった。 As mentioned above, endocrine disruptors exist for each of the various hormones, including the juvenile hormone. For this reason, it was necessary to prepare an evaluation system for each type of hormone to determine what endocrine disrupting action the given compound has. As described above, in order to evaluate the endocrine disrupting effect of a given compound, there has been a problem that many man-hours are required and the cost required for the evaluation is high.
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、多くの内分泌攪乱作用を評価することができる形質転換体及びこれを用いた供試物質の評価方法を提供することを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a transformant capable of evaluating many endocrine disrupting effects and a method for evaluating a test substance using the same, in view of the above-mentioned circumstances.
上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、オオミジンコにおける幼若ホルモン応答配列が多くの内分泌攪乱物質に対して応答性を示すことを見いだし、本発明を完成するに至った。
本発明は以下を包含する。
In order to achieve the above object, the present inventors have conducted intensive studies and as a result, found that the juvenile hormone response element in Daphnia magna shows responsiveness to many endocrine disruptors, and completed the present invention. .
The present invention includes the following.
（１）宿主細胞に、内分泌攪乱物質受容体をコードする核酸と、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有する応答配列及びレポーター遺伝子を有する核酸とを導入してなる形質転換体。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列（5’-TTTTTATTTTTCTGGTTA-3’）
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に対して１又は２個の塩基が置換、欠失又は付加された塩基配列
（２）上記内分泌攪乱物質受容体は、節足動物における幼若ホルモン受容体であることを特徴とする（１）記載の形質転換体。
（３）上記節足動物における幼若ホルモン受容体は、甲殻類又は昆虫類の幼若ホルモン受容体であることを特徴とする（２）記載の形質転換体。
（４）上記甲殻類の幼若ホルモン受容体は、オオミジンコの幼若ホルモン受容体であることを特徴とする（３）記載の形質転換体。
（５）オオミジンコの幼若ホルモン受容体は、以下（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であることを特徴とする（４）記載の形質転換体。
（ｃ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号３に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、幼若ホルモン受容体転写因子活性を有するタンパク質
（６）上記応答配列は、上記（ａ）及び/又は上記（ｂ）に示す塩基配列を複数単位含むことを特徴とする（１）記載の形質転換体。
（７）上記（ｂ）の塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列における５’末端から１２〜１８番目の塩基から選ばれる１又は２個の塩基が置換又は欠失した塩基配列であるか、若しくは配列番号１に示す塩基配列における５’末端から１２〜１８番目の塩基の３’末端側に１又は２個の塩基が付加された塩基配列である（１）記載の形質転換体。
（８）転写共役因子をコードする核酸を更に導入したことを特徴とする（１）記載の形質転換体。
（９）上記宿主細胞は酵母であることを特徴とする（１）記載の形質転換体。
（１０）上記（１）乃至（９）いずれか記載の形質転換体に供試物質を接触させる工程と、上記形質転換細胞における上記レポーター遺伝子の発現を測定する工程とを含み、上記レポーター遺伝子の発現量に基づいて上記供試物質と内分泌攪乱物質受容体との相互作用を評価することを特徴とする、供試物質の評価方法。
（１１）上記レポーター遺伝子の発現量が供試物質の接触後に増加する場合、内分泌攪乱物質受容体のアゴニストと判断することを特徴とする（１０）記載の評価方法。
（１２）上記供試物質を内分泌攪乱物質、ホルモン及び内分泌攪乱物質受容体のアゴニストからなる群から選ばれる少なくとも１つの物質とともに上記形質転換体に接触させ、上記レポーター遺伝子の発現量が、当該物質を単独で接触させたときと比較して低下している場合、内分泌攪乱物質受容体のアンタゴニストと判断することを特徴とする（１０）記載の評価方法。
（１３）上記（１）乃至（９）いずれか記載の形質転換体を含む、内分泌攪乱物質測定用キット。
(1) A transformant obtained by introducing, into a host cell, a nucleic acid encoding an endocrine disruptor receptor and a nucleic acid having a response sequence having the following nucleotide sequence (a) or (b) and a reporter gene.
(A) base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (5′-TTTTTATTTTTCTGGTTA-3 ′)
(B) a base sequence in which one or two bases are substituted, deleted or added to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (2) The endocrine disruptor receptor is a juvenile hormone receptor in arthropods The transformant according to (1), wherein
(3) The transformant according to (2), wherein the juvenile hormone receptor in the arthropod is a crustacean or insect juvenile hormone receptor.
(4) The transformant according to (3), wherein the juvenile hormone receptor of the crustacean is a juvenile hormone receptor of Daphnia magna.
(5) The transformant according to (4), wherein the juvenile hormone receptor of Daphnia magna is a protein of the following (c) or (d).
(C) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (d) a protein consisting of an amino acid sequence having 70% or more identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and having juvenile hormone receptor transcription factor activity (6) The transformant according to (1), wherein the response sequence contains a plurality of units of the nucleotide sequence shown in (a) and / or (b).
(7) Whether the base sequence of (b) is a base sequence in which one or two bases selected from the 12th to 18th bases from the 5 'end in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 have been substituted or deleted. Or the base sequence of (1), wherein one or two bases are added to the 3 'end of the 12th to 18th bases from the 5' end in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(8) The transformant according to (1), wherein a nucleic acid encoding a transcription coupling factor is further introduced.
(9) The transformant according to (1), wherein the host cell is yeast.
(10) a step of contacting a test substance with the transformant according to any one of (1) to (9), and a step of measuring the expression of the reporter gene in the transformed cell; A method for evaluating a test substance, comprising evaluating the interaction between the test substance and an endocrine disruptor receptor based on the expression level.
(11) The evaluation method according to (10), wherein when the expression level of the reporter gene increases after contact with a test substance, the reporter gene is determined to be an agonist of an endocrine disruptor receptor.
(12) bringing the test substance into contact with the transformant together with at least one substance selected from the group consisting of an endocrine disrupting substance, a hormone and an agonist of an endocrine disrupting substance receptor; The method according to (10), wherein when the amount is lower than that of the case of contacting alone, it is determined that the antagonist is an endocrine disrupter receptor antagonist.
(13) A kit for measuring an endocrine disrupter, comprising the transformant according to any one of (1) to (9).
本発明に係る形質転換体は、レポーター遺伝子の発現制御領域にオオミジンコ由来の幼若ホルモン応答配列を有するため、作用の異なる様々な内分泌攪乱物質に対して応答性を示すことができる。 Since the transformant according to the present invention has a juvenile hormone response element derived from Daphnia magna in the expression control region of the reporter gene, it can exhibit responsiveness to various endocrine disrupting substances having different actions.
また、本発明に係る供試物質の評価方法は、レポーター遺伝子の発現制御領域にオオミジンコ由来の幼若ホルモン応答配列を有する形質転換体を用いることで、様々な内分泌攪乱作用をレポーター遺伝子の発現に基づいて評価することができる。 In addition, the method for evaluating a test substance according to the present invention uses a transformant having a juvenile hormone response element derived from Daphnia magna in the expression control region of the reporter gene, so that various endocrine disrupting effects are exerted on the expression of the reporter gene. It can be evaluated based on:
本発明に係る形質転換体は、宿主細胞に、内分泌攪乱物質受容体をコードする核酸と、所定の塩基配列を有する応答配列及びレポーター遺伝子を有する核酸とを導入したものである。 The transformant according to the present invention is obtained by introducing a nucleic acid encoding an endocrine disrupter receptor and a nucleic acid having a response sequence having a predetermined base sequence and a reporter gene into a host cell.
応答配列としては、配列番号１に示す塩基配列からなる単位を１又は複数個含む配列を挙げることができる。配列番号１に示す塩基配列は、Molecular and Cellular Endocrinology 247, (2006) p. 91-102に開示されているように、オオミジンコ（Daphnia magna）におけるヘモグロビン遺伝子（hb2遺伝子）の上流に位置するプロモーター配列（以下、phb2配列）に含まれている。このphb2配列は、オオミジンコにおける転写因子の一つであるMETタンパク質と相互作用し、下流のhb2遺伝子の発現を転写レベルで正に制御する機能を有している。 Examples of the response sequence include a sequence containing one or more units consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. As disclosed in Molecular and Cellular Endocrinology 247, (2006) p. 91-102, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a promoter sequence located upstream of the hemoglobin gene (hb2 gene) in Daphnia magna. (Hereinafter, phb2 sequence). This phb2 sequence interacts with the MET protein, one of the transcription factors in Daphnia magna, and has the function of positively controlling the expression of the downstream hb2 gene at the transcriptional level.
ただし、応答配列は、配列番号１に示したphb2配列に限定されず、配列番号１に示す塩基配列に対して１又は２個の塩基が置換、欠失又は付加された塩基配列からなる単位を１又は複数個含む配列であっても良い。なお、配列番号１に示す塩基配列に対して２個の変異（置換、欠失又は付加）を有する場合には配列番号１に示す塩基配列に対して88.9％の同一性を有し、配列番号１に示す塩基配列に対して１個の変異（置換、欠失又は付加）を有する場合には配列番号１に示す塩基配列に対して99.4％の同一性を有する。 However, the response sequence is not limited to the phb2 sequence shown in SEQ ID NO: 1, and a unit consisting of a base sequence in which one or two bases have been substituted, deleted or added to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 The arrangement may include one or more. In the case of having two mutations (substitution, deletion or addition) with respect to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, it has 88.9% identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, When it has one mutation (substitution, deletion or addition) with respect to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, it has 99.4% identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
配列番号１に示す塩基配列に対して１又は２個の塩基が置換、欠失又は付加された塩基配列であっても、オオミジンコにおける転写因子の一つであるMETタンパク質と相互作用し、下流のhb2遺伝子の発現を転写レベルで正に制御する機能を保持することができる。 Even if one or two nucleotides are substituted, deleted or added to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, it interacts with MET protein, which is one of transcription factors in Daphnia magna, It can retain the function of positively controlling the expression of the hb2 gene at the transcription level.
ここで、上述した変異（置換、欠失又は付加）の位置は、特に限定されないが、例えば、配列番号１に示す塩基配列における５’末端から１２〜１８番目の領域にあることが好ましい。詳細には、変異の種類が置換又は欠失の場合、配列番号１に示す塩基配列における５’末端から１２〜１８番目の塩基から選ばれる１又は２個の塩基が置換又は欠失していることが好ましい。また、変異の種類が付加の場合、配列番号１に示す塩基配列における５’末端から１２〜１８番目の塩基の３’末端側に１又は２個の塩基が付加していることが好ましい。 Here, the position of the above mutation (substitution, deletion or addition) is not particularly limited, but is preferably, for example, in the 12th to 18th region from the 5 'end in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Specifically, when the type of mutation is substitution or deletion, one or two bases selected from the 12th to 18th bases from the 5 'end in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 are substituted or deleted. Is preferred. When the type of mutation is addition, it is preferable that one or two bases are added to the 3 'end of the 12th to 18th bases from the 5' end in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
上述した変異（置換、欠失又は付加）の部位を、配列番号１に示す塩基配列における５’末端から１２〜１８番目の領域とすることで、オオミジンコにおける転写因子の一つであるMETタンパク質と相互作用し、下流のhb2遺伝子の発現を転写レベルで正に制御する機能を確実に保持することができる。 By setting the site of the above-mentioned mutation (substitution, deletion or addition) to the 12th to 18th region from the 5 ′ end in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, MET protein, which is one of transcription factors in Daphnia magna, It can reliably maintain the function of interacting and positively controlling the expression of the downstream hb2 gene at the transcriptional level.
また、応答配列としては、配列番号１に示す塩基配列からなる単位と、配列番号１に示す塩基配列に対して１又は２個の塩基が置換、欠失又は付加された塩基配列からなる単位とを含む配列であってもよい。これら単位を含む応答配列としては、これら単位のうち一方が複数個含まれていても良いし、両方が複数個含まれていても良い。 As the response sequence, a unit consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a unit consisting of a base sequence in which one or two bases are substituted, deleted or added to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 May be included. The response array including these units may include a plurality of one of these units or a plurality of both.
応答配列として上述した単位を複数個含む場合には、各単位を隣接するように配置しても良いし、１〜複数個の塩基からなるスペーサーを介して各単位を配置しても良い。スペーサーの塩基長としては、特に限定されず、１〜１００塩基長とすることができ、また、１〜９０塩基長とすることが好ましく、１〜８０塩基長とすることが好ましく、１〜７０塩基長とすることが好ましく、１〜６０塩基長とすることが好ましく、１〜５０塩基長とすることが好ましく、１〜４０塩基長とすることが好ましく、１〜３０塩基長とすることが好ましく、１〜２０塩基長とすることが好ましく、１〜１０塩基長とすることが好ましい。 When a plurality of the above-mentioned units are included as a response sequence, the units may be arranged so as to be adjacent to each other, or each unit may be arranged via a spacer consisting of one or more bases. The base length of the spacer is not particularly limited and can be 1 to 100 bases, is preferably 1 to 90 bases, is preferably 1 to 80 bases, and is 1 to 70 bases. The base length is preferably 1 to 60 bases, more preferably 1 to 50 bases, preferably 1 to 40 bases, and 1 to 30 bases. The length is preferably 1 to 20 bases, and more preferably 1 to 10 bases.
本発明に係る形質転換体において、上述した応答配列は、下流のレポーター遺伝子の転写を制御する発現制御領域に配置される。発現制御領域とは、下流の遺伝子の転写を制御している領域であり、通常は遺伝子の上流（センス鎖の５’側領域）の領域を意味する。より具体的に、発現制御領域は、通常、下流遺伝子の転写開始部位から上流側の数千塩基の範囲とすることができ、例えば、転写開始部位から上流５ｋｂ以内、好ましくは４ｋｂ以内、３ｋｂ以内、２ｋｂ以内、１ｋｂ以内、５００ｂ以内、３００ｂ以内とすることができる。 In the transformant according to the present invention, the above-described response element is located in an expression control region that controls transcription of a downstream reporter gene. The expression control region is a region that controls transcription of a downstream gene, and usually means a region upstream of the gene (5 ′ side region of the sense strand). More specifically, the expression control region can be usually in the range of several thousand bases upstream from the transcription start site of the downstream gene, for example, within 5 kb upstream, preferably within 4 kb, and within 3 kb from the transcription start site. , Within 2 kb, within 1 kb, within 500 b, and within 300 b.
さらに、発現制御領域には、上述した応答配列の他に、転写因子が結合する領域、エンハンサー領域等が含まれていても良い。例えば、上述した応答配列を含む発現制御領域は、オオミジンコにおけるhb2遺伝子の発現制御領域であって当該応答配列を含む所定の長さの領域、例えば、当該応答配列を含む２０ｂの領域、３０ｂの領域、４０ｂの領域、５０ｂの領域、６０ｂの領域、７０ｂの領域、８０ｂの領域、９０ｂの領域又は１００ｂの領域とすることができる。 Further, the expression control region may include, in addition to the response element described above, a region to which a transcription factor binds, an enhancer region, and the like. For example, the expression control region containing the response element described above is an expression control region of the hb2 gene in Daphnia magna, and a region of a predetermined length containing the response element, for example, a region of 20b containing the response element and a region of 30b. , 40b area, 50b area, 60b area, 70b area, 80b area, 90b area, or 100b area.
本発明に係る形質転換体は、以上のように構成された、応答配列を有する発現制御領域の下流にレポーター遺伝子を有している。レポーター遺伝子としては、特に限定されず、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ (GUS) 遺伝子及びGFP遺伝子等を挙げることができる。なお、レポーター遺伝子としては、上述した従来公知の遺伝子に限定されず、上述したhb2遺伝子をレポーター遺伝子としても良い。すなわち、如何なる遺伝子であれ、転写レベルの発現量をモニターできればレポーター遺伝子として使用することができる。 The transformant according to the present invention has a reporter gene downstream of the expression control region having a response element constructed as described above. The reporter gene is not particularly limited, and includes, for example, a chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene, a lacZ gene, a luciferase gene, a β-glucuronidase (GUS) gene, and a GFP gene. The reporter gene is not limited to the above-described conventionally known genes, and the above-described hb2 gene may be used as the reporter gene. That is, any gene can be used as a reporter gene if the expression level of the transcription level can be monitored.
一方、本発明に係る形質転換体は、内分泌攪乱物質受容体をコードする核酸を有している。内分泌攪乱物質受容体とは、所定のホルモンがリガンドとして作用する受容体であって、当該ホルモン様の作用を有する内分泌攪乱物質もまた作用する受容体を意味する。内分泌攪乱物質受容体は、細胞膜受容体及び核内受容体の何れも含む意味である。本発明に係る形質転換体において、内分泌攪乱物質受容体としては、特定のホルモン又は内分泌攪乱物質の存在下にて上述した応答配列に相互作用し、転写因子活性を示す受容体とすることが好ましい。 On the other hand, the transformant according to the present invention has a nucleic acid encoding an endocrine disruptor receptor. An endocrine disrupter receptor is a receptor on which a predetermined hormone acts as a ligand, and means a receptor on which an endocrine disrupter having the hormone-like action also acts. An endocrine disruptor receptor is meant to include both cell membrane receptors and nuclear receptors. In the transformant according to the present invention, the endocrine disrupting substance receptor is preferably a receptor that interacts with the above-described response element in the presence of a specific hormone or an endocrine disrupting substance and exhibits transcription factor activity. .
内分泌攪乱物質としては、特に限定されず、内分泌攪乱作用を有することが公知である物質、内分泌攪乱物質を有することが疑われている物質の双方を含む意味である。例えば、内分泌攪乱物質としては、女性ホルモン（エストロジェン）に対してアゴニスト作用を有する物質又はアゴニスト作用を有する物質、男性ホルモン（アンドロジェン）に対してアゴニスト作用を有する物質又はアゴニスト作用を有する物質を挙げることができる。なお、内分泌攪乱物質としては、これら女性ホルモン又は男性ホルモンに対する攪乱作用を有する物質に限定されず、例えば甲状腺ホルモン、成長ホルモン、副腎皮質ホルモン又はインシュリンに対する攪乱作用を有する物質も含む意味である。 The endocrine disrupting substance is not particularly limited, and is meant to include both a substance known to have an endocrine disrupting action and a substance suspected of having an endocrine disrupting substance. For example, examples of the endocrine disrupting substance include a substance having an agonistic action or an agonistic action on female hormones (estrogens), a substance having an agonistic action on male hormones (androgens), and a substance having an agonistic action. be able to. The endocrine disrupting substance is not limited to a substance having a disrupting action on these female hormones or male hormones, but also includes, for example, a substance having a disrupting action on thyroid hormone, growth hormone, adrenocortical hormone or insulin.
したがって、内分泌攪乱物質受容体とは、上述した各種ホルモンに対する受容体であるエストロジェン受容体、アンドロジェン受容体、甲状腺ホルモン受容体、成長ホルモン受容体、副腎皮質ホルモン受容体又はインシュリン受容体を挙げることができる。 Therefore, endocrine disruptor receptors include estrogen receptor, androgen receptor, thyroid hormone receptor, growth hormone receptor, adrenocortical hormone receptor or insulin receptor, which are receptors for the various hormones described above. Can be.
また、本発明において、内分泌攪乱物質には、節足動物が特異的に有している幼若ホルモンに対してアゴニスト作用又はアンタゴニスト作用を有する物質が含まれる。したがって、内分泌攪乱物質受容体としては、幼若ホルモン受容体（MET）もまた含まれる。 Further, in the present invention, the endocrine disrupting substance includes a substance having an agonistic action or an antagonistic action on a juvenile hormone which an arthropod specifically has. Thus, endocrine disruptor receptors also include juvenile hormone receptors (METs).
幼若ホルモン受容体としては、特に限定されないが、昆虫類、甲殻類、クモ類及びムカデ類を含む節足動物における幼若ホルモン受容体とすることができる。なかでも、節足動物における幼若ホルモン受容体としては、甲殻類又は昆虫類の幼若ホルモン受容体とすることが好ましい。 The juvenile hormone receptor is not particularly limited, but may be a juvenile hormone receptor in arthropods including insects, crustaceans, spiders and centipedes. Among them, the juvenile hormone receptor in arthropods is preferably a crustacean or insect juvenile hormone receptor.
昆虫類としては、カブトムシ及びゴミムシ等を含む甲虫目（鞘翅目）、チョウ及びガを含むチョウ目（鱗翅目）、ハエ、カ及びアブを含むハエ目（双翅目）、ハチ及びアリを含むハチ目（膜翅目）、セミ及びカメムシを含むカメムシ目（半翅目）、バッタ及びコオロギを含むバッタ目（直翅目）、トンボを含むトンボ目（蜻蛉目）を挙げることができる。本発明に係る形質転換体には、これら昆虫類由来の幼若ホルモン受容体をコードする核酸を使用することができる。 Insects include beetles (Coleoptera) including beetles and beetles, Lepidoptera (Lepidoptera) including butterflies and moths, and fly flies (Diptera) including flies, mosquitoes and flies, and bees and ants Examples include the order Hymenoptera, Hemiptera (Hemiptera), including cicadas and stink bugs, Grasshoppers (Orthoptera), including locusts and crickets, and Dragonflies (dragonflies), including dragonflies. For the transformant according to the present invention, a nucleic acid encoding a juvenile hormone receptor derived from these insects can be used.
より具体的には、ハエ目に属するキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の幼若ホルモン受容体をコードする核酸を使用することができる（He Q et al. ; J Biol Chem. 289 (40), p. 27874-27885 (2014)参照）。 More specifically, a nucleic acid encoding a juvenile hormone receptor of Drosophila melanogaster belonging to the order Fly can be used (He Q et al .; J Biol Chem. 289 (40), p. 27874-27885 (2014)).
また、甲殻類としては、エビ、カニ、オキアミ、フジツボ及びミジンコを含む甲殻亜門に含まれる動物を挙げることができる。本発明に係る形質転換体には、これら甲殻類由来の幼若ホルモン受容体をコードする核酸を使用することができる。 In addition, examples of the crustaceans include animals included in the crustacea including shrimp, crab, krill, barnacles, and daphnia. Nucleic acids encoding these crustacean-derived juvenile hormone receptors can be used in the transformant of the present invention.
特に、甲殻類由来の幼若ホルモン受容体をコードする核酸のなかでも、特に、ミジンコ科に属する動物由来の幼若ホルモン受容体をコードする核酸を使用することが好ましい。ミジンコ科に属する動物としては、トガリネコゼミジンコ（Ceriodaphnia cornuta）、アミメネコゼミジンコ（Ceriodaphnia reticulata）、ニセネコゼミジンコ（Ceriodaphnia dubia）、キレオネコゼミジンコ（Ceriodaphnia megalops）、ヒメネコゼミジンコ（Ceriodaphnia pulchella）及びネコゼミジンコ（Ceriodaphnia quadrangular）等のネコゼミジンコ属（Ceriodaphnia）に属する動物；タイリクミジンコ（Daphnia similis）、オオミジンコ（Daphnia magna）、ミジンコ（Daphnia pulex）、オオビワミジンコ（Daphnia pulicaria）、マギレミジンコ（Daphnia ambigua）、オナシミジンコ（Daphnia obtuse）、ビワミジンコ（Daphnia biwaensis）、ハリナガミジンコ（Daphnia longispina）、カワリハリナガミジンコ（Daphnia rosea）、ウスカワハリナガミジンコ（Daphnia hyaline）、カブトミジンコ（Daphnia galeata）、エゾハリナガミジンコ（Daphnia ezoensis）、カムリハリナガミジンコ（Daphnia cuculata）、Daphnia cristata及びトガリハリナガミジンコ（Daphnia longiremis）等のミジンコ属（Daphnia）に属する動物；アオムキミジンコ（Scapholeberis mucronata）及びタイリクアオムキミジンコ（Scapholeberis kingi）等のアオムキミジンコ属（Scapholeberis）に属する動物；並びにトガリオカメミジンコ（Simocephalus serrulatus）、トゲオカメミジンコ（Simocephalus exspinosus）、オカメミジンコ（Simocephalus vetulus）、オオオカメミジンコ（Simocephalus vetuloides）及びニッポンテングオカメミジンコ（Simocephalus japonica）等のオカメミジンコ属（Simocephalus）に属する動物を挙げることができる。 In particular, among nucleic acids encoding juvenile hormone receptors derived from crustaceans, it is particularly preferable to use nucleic acids encoding juvenile hormone receptors derived from animals belonging to the family Daphnia. Examples of the animals belonging to the Daphnia family include the water flea (Ceriodaphnia cornuta), the water flea (Ceriodaphnia reticulata), the mud flea (Ceriodaphnia dubia), the cynoplanetidae (Ceriodaphnia megalops), and the water fowl (Ceriodaphnia ulphida ella ulch). Animals belonging to the genus Ceriodaphnia, such as Daphnia quadrangular; Daphnia similis, Daphnia magna, Daphnia pulex, Daphnia pulicaria, Daphnia ambi , Daphnia obtuse, Daphnia biwaensis, Daphnia longispina, Daphnia rosea, Daphnia rosea, Daphnia hyaline, Daphnia galeata Animals belonging to the genus Daphnia, such as Daphnia ezoensis, Daphnia cuculata, Daphnia cristata, and Daphnia longiremis; animals belonging to the genus Daphnia; Scapholeberis mucronata; Animals belonging to the genus Scapholeberis (Scapholeberis kingi) and the like; and the lycopodium Daphnia magna (Simocephalus serrulatus), the giant turtle Daphnia magna (Simocephalus exspinosus), the marine Daphnia magna (Simocephalus vetulus), and the giant petrel (Simocephalus cephalus) Examples include animals belonging to the genus Simocephalus, such as the dolphin (Simocephalus japonica).
これらの中でも特に、ミジンコ属（Daphnia）に属する動物の幼若ホルモン受容体をコードする核酸を使用することが好ましく、更にオオミジンコ（Daphnia magna）の幼若ホルモン受容体をコードする核酸を使用することがより好ましい。オオミジンコの幼若ホルモン受容体のアミノ酸配列を配列番号３に示し、当該幼若ホルモン受容体をコードする核酸の塩基配列を配列番号２に示す。 Among them, it is particularly preferable to use a nucleic acid encoding a juvenile hormone receptor of an animal belonging to the genus Daphnia, and further to use a nucleic acid encoding a juvenile hormone receptor of Daphnia magna. Is more preferred. The amino acid sequence of juvenile hormone receptor of Daphnia magna is shown in SEQ ID NO: 3, and the nucleotide sequence of the nucleic acid encoding the juvenile hormone receptor is shown in SEQ ID NO: 2.
ただし、本発明に係る形質転換体は、配列番号３に示すアミノ酸配列からなる幼若ホルモン受容体をコードする核酸を有するものに限定されず、配列番号３に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性、好ましくは８０％以上の同一性、より好ましくは９０％以上の同一性、更に好ましくは９５％以上の同一性、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、幼若ホルモン受容体転写因子活性を有するタンパク質をコードする核酸を有するものであってもよい。 However, the transformant according to the present invention is not limited to a transformant having a nucleic acid encoding a juvenile hormone receptor consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and is 70% or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. An amino acid sequence having at least 80% identity, more preferably at least 80% identity, even more preferably at least 95% identity, and most preferably at least 98% identity. It may have a nucleic acid encoding a protein having juvenile hormone receptor transcription factor activity.
なお、アミノ酸配列間の同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の割合として算出される。 The value of identity between amino acid sequences can be calculated by a BLASTN or BLASTX program in which the BLAST algorithm is implemented (default setting). In addition, the identity value is calculated as a percentage of all amino acid residues compared by calculating a completely identical amino acid residue when a pair of amino acid sequences are subjected to pairwise alignment analysis.
また、本発明に係る形質転換体は、配列番号３に示すアミノ酸配列からなる幼若ホルモン受容体をコードする核酸を有するものに限定されず、配列番号２の塩基配列からなる核酸の相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされ、且つ、幼若ホルモン受容体転写因子活性を有するタンパク質をコードする核酸を有するものであっても良い。「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。 Further, the transformant according to the present invention is not limited to a transformant having a nucleic acid encoding a juvenile hormone receptor consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, but may have a complementary strand of a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. It may have a nucleic acid that is encoded by a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to all or a part thereof and that encodes a protein having juvenile hormone receptor transcription factor activity. `` Stringent conditions '' means conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed, and can be appropriately determined by referring to, for example, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition). it can. Specifically, the stringency can be set according to the temperature at the time of Southern hybridization or the salt concentration contained in the solution, and the temperature at the washing step of Southern hybridization or the salt concentration contained in the solution. More specifically, as stringent conditions, for example, the sodium concentration is 25 to 500 mM, preferably 25 to 300 mM, and the temperature is 42 to 68 ° C, preferably 42 to 65 ° C. More specifically, 5 × SSC (83 mM NaCl, 83 mM sodium citrate) is at a temperature of 42 ° C.
ここで所定の塩基配列からなる核酸によりコードされるタンパク質における幼若ホルモン受容体転写因子活性は以下のように評価することができる。すなわち、まず、評価対象の核酸と、上述したphb2配列及びその下流に配したレポーター遺伝子とを導入した形質転換体を準備する。そして、得られた形質転換体を幼若ホルモンの存在下又は非存在下で培養し、レポーター遺伝子の発現を測定する。幼若ホルモンの存在下におけるレポーター遺伝子の発現量が、幼若ホルモンの非存在下におけるレポーター遺伝子の発現量よりも有意に大であれば、評価対象の核酸は、幼若ホルモン受容体転写因子活性を有するタンパク質をコードしていることとなる。 Here, juvenile hormone receptor transcription factor activity in a protein encoded by a nucleic acid having a predetermined base sequence can be evaluated as follows. That is, first, a transformant into which the nucleic acid to be evaluated, the phb2 sequence described above, and a reporter gene arranged downstream thereof are introduced is prepared. Then, the obtained transformant is cultured in the presence or absence of juvenile hormone, and the expression of the reporter gene is measured. If the expression level of the reporter gene in the presence of the juvenile hormone is significantly greater than the expression level of the reporter gene in the absence of the juvenile hormone, the nucleic acid to be evaluated will have an activity of juvenile hormone receptor transcription factor. Will be encoded.
ところで、本発明に係る形質転換体は、上述した核酸や応答配列及びレポーター遺伝子に加えて、転写共役因子をコードする遺伝子を更に有していても良い。転写共役因子としては、特に限定されないが、Tai、SRC、FISC、CBP、P300、TIF2、AIB、ARA70、ASC2及びERAP140を挙げることができる。これら転写共役因子をコードする遺伝子を導入することで、内分泌攪乱物質受容体によるレポーター遺伝子の転写促進活性を更に活性化することができる。 By the way, the transformant according to the present invention may further have a gene encoding a transcription coupling factor in addition to the above-described nucleic acid, response element and reporter gene. Examples of the transcription coupling factor include, but are not particularly limited to, Tai, SRC, FISC, CBP, P300, TIF2, AIB, ARA70, ASC2, and ERAP140. By introducing genes encoding these transcription coupling factors, the transcription promoting activity of the reporter gene by the endocrine disrupter receptor can be further activated.
一方、本発明に係る形質転換体における宿主細胞は、酵母であり、出芽酵母であることが好ましい。宿主となる酵母内に、上述した核酸や応答配列及びレポーター遺伝子等を導入する方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を適用することができる。遺伝子の導入方法としては、例えば、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポソームを用いた方法、エレクトロポレーション法、ウイルスベクターを用いる方法及びマイクロピペットインジェクション法等があげられる。なお、本発明に係る形質転換体において、上述した核酸や応答配列及びレポーター遺伝子等の導入は、分析に用いることが可能であれば、一過性型の導入でもよく、宿主染色体へ組み込むことで導入しても良いし、自律複製・分配可能な人工染色体又はプラスミド型の導入でもよい。 On the other hand, the host cell in the transformant according to the present invention is a yeast, and is preferably a budding yeast. The method for introducing the above-described nucleic acid, response sequence, reporter gene, and the like into the yeast serving as a host is not particularly limited, and a conventionally known method can be applied. Examples of the method for introducing a gene include a lithium acetate method, a calcium phosphate method, a method using a liposome, an electroporation method, a method using a virus vector, and a micropipette injection method. In the transformant according to the present invention, the introduction of the nucleic acid, the response element, the reporter gene, and the like described above may be a transient type, as long as it can be used for analysis. It may be introduced, or an artificial chromosome or plasmid type that can be replicated and distributed autonomously may be introduced.
以上のように構成された本発明に係る形質転換体は、供試物質と内分泌攪乱物質受容体との相互作用の評価、及び当該供試物質について相互作用に起因する内分泌攪乱作用の有無を評価する系に使用することができる。特に、本発明に係る形質転換体を利用する場合、上述した応答配列を使用するため、特定の内分泌攪乱作用に限定されず、供試物質について内分泌攪乱作用の有無を評価することができる。 The transformant according to the present invention configured as described above evaluates the interaction between the test substance and the endocrine disrupter receptor, and evaluates whether the test substance has an endocrine disrupting action caused by the interaction. It can be used for systems that do In particular, when the transformant according to the present invention is used, since the above-mentioned response element is used, the presence or absence of an endocrine disrupting effect can be evaluated for the test substance without being limited to a specific endocrine disrupting effect.
ここで、供試物質としては、特に限定されず、如何なる物質であっても良い。供試物質としては、例えば、低分子化合物、高分子化合物、ペプチド、単一化合物、複数の化合物を含む組成物、培養物、抽出物、天然物及び合成化合物を挙げることができる。 Here, the test substance is not particularly limited, and may be any substance. Examples of the test substance include a low molecular compound, a high molecular compound, a peptide, a single compound, a composition containing a plurality of compounds, a culture, an extract, a natural product, and a synthetic compound.
具体的には、供試物質の存在下又は非存在下に形質転換体を培養し、それぞれのレポーター遺伝子の発現を測定する。供試物質の存在下におけるレポーター遺伝子の発現量が、供試物質の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現量と比較して有意に大である場合、当該供試物質は内分泌攪乱物質受容体と相互作用し、上述した応答配列を介して遺伝子発現を正に制御するアゴニスト作用を有すると判断することができる。すなわち、この場合、供試物質がアゴニスト作用を有する内分泌攪乱物質である可能性が高いと判断できる。 Specifically, the transformant is cultured in the presence or absence of the test substance, and the expression of each reporter gene is measured. If the expression level of the reporter gene in the presence of the test substance is significantly greater than the expression level of the reporter gene in the absence of the test substance, the test substance interacts with the endocrine disruptor receptor. It can be determined that the compound has an agonistic effect that positively controls gene expression via the above-described response element. That is, in this case, it can be determined that the test substance is highly likely to be an endocrine disrupting substance having an agonistic action.
或いは、供試物質及び内分泌攪乱物質受容体に対するアゴニスト作用を有する物質の存在下又は非存在下に形質転換体を培養し、それぞれのレポーター遺伝子の発現を測定する。供試物質の存在下におけるレポーター遺伝子の発現量が、供試物質の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現量と比較して有意に小である場合、当該供試物質は、内分泌攪乱物質受容体に対するアゴニスト作用を阻害し、上述した応答配列を介した遺伝子発現を負に制御するアンタゴニスト作用を有すると判断することができる。すなわち、この場合、供試物質がアンタゴニスト活性を有する内分泌攪乱物質である可能性が高いと判断できる。なお、内分泌攪乱物質受容体に対するアゴニスト作用を有する物質とは、内分泌攪乱物質受容体に作用するホルモン、当該ホルモンに対応する内分泌攪乱物質、内分泌攪乱物質受容体に対するアゴニスト化合物から選ばれる物質を意味する。 Alternatively, the transformant is cultured in the presence or absence of a test substance and a substance having an agonistic action on an endocrine disrupter receptor, and the expression of each reporter gene is measured. If the expression level of the reporter gene in the presence of the test substance is significantly smaller than the expression level of the reporter gene in the absence of the test substance, the test substance is expressed against the endocrine disruptor receptor. It can be determined that the compound has an antagonistic action that inhibits the agonist action and negatively regulates the gene expression mediated by the response element described above. That is, in this case, it can be determined that the test substance is highly likely to be an endocrine disrupting substance having antagonist activity. The substance having an agonistic action on an endocrine disrupting substance receptor means a substance selected from a hormone acting on an endocrine disrupting substance receptor, an endocrine disrupting substance corresponding to the hormone, and an agonistic compound against the endocrine disrupting substance receptor. .
以上のように本発明に係る形質転換体を使用することで、非常に簡便な操作によって供試物質に関する内分泌攪乱作用を評価することができる。すなわち、本発明に係る形質転換体は、内分泌攪乱物質の測定用途に利用することができ、供試物質に関する内分泌攪乱作用を評価する内分泌攪乱物質測定用キットとすることができる。 As described above, by using the transformant according to the present invention, the endocrine disrupting effect on the test substance can be evaluated by a very simple operation. That is, the transformant according to the present invention can be used for measuring endocrine disrupting substances, and can be used as an endocrine disrupting substance measurement kit for evaluating the endocrine disrupting action of a test substance.
特に、オオミジンコにおける幼若ホルモン受容体をコードする核酸と、上述した応答配列及びレポーター遺伝子とを導入した形質転換体を使用した場合には、特に、ミジンコ科に属する動物に対する供試物質の内分泌攪乱作用を正当に評価することができる。 In particular, when a nucleic acid encoding a juvenile hormone receptor in Daphnia magna and a transformant into which the above-described response element and reporter gene have been introduced are used, particularly, endocrine disruption of the test substance to animals belonging to the family Daphniaceae. The effect can be justified.
本発明に係る形質転換体は、宿主として酵母を利用しているため、動物細胞が有しているp450等の薬物代謝系による供試物質の分解といった影響を排し、供試物質の内分泌攪乱作用を正確に評価することができる。 Since the transformant according to the present invention utilizes yeast as a host, it eliminates the effects of decomposition of the test substance by a drug metabolizing system such as p450 that animal cells have, and disrupts endocrine disruption of the test substance. The effect can be accurately evaluated.
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the technical scope of the present invention is not limited to the following Examples.
［形質転換酵母の作製］
本実施例では、下記に示す各レポータープラスミド、各転写因子（内分泌攪乱物質受容体）プラスミド、各転写共役因子プラスミドをそれぞれ作製し、出芽酵母株へ導入することで形質転換酵母を作製した。
[Preparation of transformed yeast]
In this example, each reporter plasmid, each transcription factor (endocrine disruptor receptor) plasmid, and each transcription coupling factor plasmid shown below were prepared and introduced into a budding yeast strain to prepare a transformed yeast.
［レポータープラスミドの作製］
配列番号１に示されるオオミジンコ（Daphnia magna）ヘモグロビン遺伝子の上流配列（phb2配列）を含むオリゴDNA（配列番号４）及び配列番号４に相補なオリゴDNA（配列番号５）を作製し、これらのオリゴDNAをアニーリングした。アニーリングの際は、95℃で2分間インキュベートした後、90℃から37℃まで30分かけて徐々に温度を低下させた。アニーリング後、phb2配列が1個又は連続して3個アニーリングしたものを精製した。そして、Wolf S S et al., Biotechniques. 20 (4), p. 568-573 (1996) に記載された方法に準じて作製したβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を有するプラスミドpRW95-3のSpeIサイトに、これらphb2配列が1個又は連続して3個アニーリングしたものをそれぞれ挿入した。phb2配列が1個挿入されたプラスミドをレポータープラスミドＡ、連続して3個挿入されたプラスミドをレポータープラスミドＢとした。
[Preparation of reporter plasmid]
An oligo DNA (SEQ ID NO: 4) containing the upstream sequence (phb2 sequence) of the Daphnia magna hemoglobin gene shown in SEQ ID NO: 1 and an oligo DNA (SEQ ID NO: 5) complementary to SEQ ID NO: 4 were prepared. The DNA was annealed. During annealing, the temperature was gradually lowered from 90 ° C to 37 ° C over 30 minutes after incubation at 95 ° C for 2 minutes. After annealing, one or three consecutive phb2 sequences were annealed and purified. These phb2s were added to the SpeI site of plasmid pRW95-3 having the β-galactosidase gene prepared according to the method described in Wolf SS et al., Biotechniques. 20 (4), p. 568-573 (1996). One or three consecutively annealed sequences were inserted. The plasmid into which one phb2 sequence was inserted was called reporter plasmid A, and the plasmid into which three phb2 sequences were inserted consecutively was called reporter plasmid B.
また、phb2配列の周辺配列85bpを含んだ領域を挿入したプラスミドも作製した。作製方法は、前記配列番号４のオリゴDNAをphb2配列の周辺配列85bpを含んだ領域を含むオリゴDNA（配列番号６）に、及び前記配列番号５のオリゴDNAを配列番号６に相補的なオリゴDNA（配列番号７）に変えた以外は同様に行った。phb2配列の周辺配列85bpを含んだ領域が連続して3個挿入されたプラスミドをレポータープラスミドＣとした。 In addition, a plasmid into which a region containing the 85 bp peripheral sequence of the phb2 sequence was inserted was also prepared. The production method is as follows: the oligo DNA of SEQ ID NO: 4 is used as an oligo DNA (SEQ ID NO: 6) containing a region containing 85 bp of the peripheral sequence of the phb2 sequence; The same operation was performed except that the DNA was changed to (SEQ ID NO: 7). The plasmid into which three consecutive regions containing the phb2 sequence and the peripheral sequence of 85 bp were inserted was designated as reporter plasmid C.
phb2配列を含むレポータープラスミドＡ〜Ｃと比較するため、キイロショウジョウバエのKr-h1遺伝子の幼若ホルモン応答配列を含んだ領域（DmJHRR）を挿入したプラスミドを作製した（比較例）。DmJHRRは、He Q et al. ; J Biol Chem. 289 (40), p. 27874-27885 (2014) に記載されている。作製方法は、前記配列番号４のオリゴDNAをDmJHRR配列を含むオリゴDNA（配列番号８）に、及び前記配列番号５のオリゴDNAを配列番号８に相補的なオリゴDNA（配列番号９）に変えた以外は前記の方法に準じた。DmJHRR配列が連続して3個挿入されたプラスミドを、DmJHRRレポータープラスミドとした。 For comparison with reporter plasmids A to C containing the phb2 sequence, a plasmid was prepared in which a region (DmJHRR) containing the juvenile hormone response element of the Kr-h1 gene of Drosophila melanogaster was inserted (Comparative Example). DmJHRR is described in He Q et al .; J Biol Chem. 289 (40), p. 27874-27885 (2014). The production method is as follows: the oligo DNA of SEQ ID NO: 4 is changed to an oligo DNA containing the DmJHRR sequence (SEQ ID NO: 8), and the oligo DNA of SEQ ID NO: 5 is changed to an oligo DNA complementary to SEQ ID NO: 8 (SEQ ID NO: 9). Other than the above, the above method was followed. A plasmid into which three DmJHRR sequences were continuously inserted was used as a DmJHRR reporter plasmid.
［転写因子発現プラスミドの作製］
オオミジンコ幼若ホルモン受容体（DampaMET）発現プラスミドの作製のため、まず、CEN6/ARS4断片を作製した。酵母の自律的複製起点（ARS）とセントロメア配列（CEN）を含むDNA断片を、レポータープラスミドpYTβを鋳型として、CEN/ARS増幅用プライマーpUdp6 I-SceI CEN6 FW（配列番号１０）及びpUdp6 I-SceI ARS4 RE（配列番号１１）を用いたPCR（製品名：TaKaRa Thermal Cycler Dice TP600 Gradient タカラバイオ株式会社製）により増幅した。PCRは、94℃で20秒、58℃で20秒、72℃で1分30秒のサイクルを35サイクル実施した。
[Preparation of transcription factor expression plasmid]
First, a CEN6 / ARS4 fragment was prepared for preparing a Daphnia magna juvenile hormone receptor (DampaMET) expression plasmid. A DNA fragment containing the yeast autonomous origin of replication (ARS) and the centromere sequence (CEN) was obtained by using the reporter plasmid pYTβ as a template, CEN / ARS amplification primers pUdp6 I-SceI CEN6 FW (SEQ ID NO: 10) and pUdp6 I-SceI Amplification was performed by PCR (product name: TaKaRa Thermal Cycler Dice TP600 Gradient manufactured by Takara Bio Inc.) using ARS4 RE (SEQ ID NO: 11). In the PCR, 35 cycles were performed at 94 ° C for 20 seconds, 58 ° C for 20 seconds, and 72 ° C for 1 minute and 30 seconds.
PCRにより増幅させたPCR断片を、制限酵素AatIIで切断して直鎖状にしたプラスミドpUdp6とともに、酵母野生株（Saccharomyces cerevisiae）W303a（MATa, ade2, his3, leu2, trp1, ura3）に酢酸リチウム法により導入した。pUdp6は、両方向プロモーター領域gal1、gal10及びgal10の下流にCYCターミネーターを持ち、gal1の下流にADHターミネーターを持ち、さらにウラシル選択マーカーURA3遺伝子を持つプラスミドである。相同組換えによりCEN6/ARS4断片がpUdp6に挿入されたプラスミドを酵母から抽出し、さらに大腸菌DH5α株に導入して得られた低コピーエピソーマル型ベクターをpUdp13とした。なお、CEN6/ARS4配列の外側には認識配列18bpの制限酵素I-SceIの認識配列が導入されており、マルチクローニングサイトへの目的遺伝子のクローニング後、I-SceIで切断してCEN6/ARS4断片を切り出すことで、容易にゲノム挿入型に変換することが可能である。 The PCR fragment amplified by PCR was digested with the restriction enzyme AatII to form a linear plasmid pUdp6, and the yeast strain (Saccharomyces cerevisiae) W303a (MATa, ade2, his3, leu2, trp1, ura3) was treated with the lithium acetate method. Introduced by pUdp6 is a plasmid having a CYC terminator downstream of the bidirectional promoter regions gal1, gal10, and gal10, an ADH terminator downstream of gal1, and a uracil selection marker URA3 gene. A plasmid in which the CEN6 / ARS4 fragment was inserted into pUdp6 by homologous recombination was extracted from yeast, and further introduced into Escherichia coli DH5α strain, and the low-copy episomal vector obtained was named pUdp13. A recognition sequence for the 18-bp restriction enzyme I-SceI was introduced outside the CEN6 / ARS4 sequence.After cloning the target gene into the multicloning site, the CEN6 / ARS4 fragment was cut with I-SceI. By cutting out, it is possible to easily convert it into a genome insertion type.
次に、DampaMET遺伝子のcDNAのオープンリーディングフレーム（ORF）を、抱卵したオオミジンコ成体のcDNAを鋳型として、DampaMET用プライマーとしてMET FW2（配列番号１２）及びMET REV-3（配列番号１３）を用いたPCRにより増幅した。PCRは、94℃で20秒、58℃で20秒、72℃で2分30秒のサイクルを35サイクル実施した。 Next, MET FW2 (SEQ ID NO: 12) and MET REV-3 (SEQ ID NO: 13) were used as primers for DampaMET using the open reading frame (ORF) of the cDNA of the DamaMET gene as a template for the adult Daphnia magna inoculated. Amplified by PCR. For the PCR, 35 cycles were performed at 94 ° C for 20 seconds, 58 ° C for 20 seconds, and 72 ° C for 2 minutes and 30 seconds.
増幅させたDampaMET遺伝子のcDNAを、制限酵素BamHIおよびHindIIIで切断した前記プラスミドpUdp13とともに野生酵母株W303aに酢酸リチウム法で導入した。この方法により、DampaMET遺伝子のcDNAをプラスミドpUdp13のGAL10プロモーターの下流に挿入したものをpUdp13 DapmaMetとした。酵母細胞内で構築されたpUdp13-DapmaMetを回収し、大腸菌DH5α株に導入して増幅した。 The amplified cDNA of the DampaMET gene was introduced into the wild yeast strain W303a by the lithium acetate method together with the plasmid pUdp13 cut with the restriction enzymes BamHI and HindIII. According to this method, the cDNA of the DampaMET gene inserted downstream of the GAL10 promoter of the plasmid pUdp13 was designated as pUdp13 DapmaMet. PUdp13-DapmaMet constructed in yeast cells was collected, introduced into E. coli DH5α strain, and amplified.
続いて、pUdp13-DapmaMetを制限酵素I-SceIで切断してCEN6/ARS4配列を切り出すことで、ゲノム挿入型に変換した。これによって、DampaMET遺伝子を有し、その上流にプロモーターを有するDampaMET発現プラスミドpUdp15-DampaMETを得た。 Subsequently, pUdp13-DapmaMet was digested with the restriction enzyme I-SceI to cut out the CEN6 / ARS4 sequence, thereby converting it to a genome insertion type. As a result, a DampaMET expression plasmid pUdp15-DampaMET having the DampaMET gene and having a promoter upstream thereof was obtained.
同様にキイロショウジョウバエ幼若ホルモン受容体（DmMET）発現プラスミドを作製した。まず、DmMET遺伝子のcDNAのORFを、キイロショウジョウバエ幼虫cDNA（Clontech社製）を鋳型として、DmMET用プライマーDmMET Fwd（配列番号１４）及びDmMET Rev（配列番号１５）を用いたPCRにより増幅した。PCRは、98℃で10秒、55℃で30秒、68℃で1分30秒のサイクルを25サイクル実施した。 Similarly, a plasmid expressing Drosophila melanogaster juvenile hormone receptor (DmMET) was prepared. First, the ORF of the cDNA of the DmMET gene was amplified by PCR using DmMET primers DmMET Fwd (SEQ ID NO: 14) and DmMET Rev (SEQ ID NO: 15), using Drosophila melanogaster cDNA (Clontech) as a template. For PCR, 25 cycles of 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 1 minute and 30 seconds were performed.
増幅させたDmMET遺伝子のcDNAを、制限酵素SmaI及びEcoRIで切断した。切断した前記DmMET遺伝子のcDNAを、制限酵素SmaI及びEcoRIで切断したプラスミドpUdp6のGAL10プロモーターの下流に挿入した。これによって、DmMET遺伝子を有し、その上流にプロモーターを有するDmMET発現プラスミドpUdp6-DmMETを得た。 The amplified cDNA of the DmMET gene was digested with restriction enzymes SmaI and EcoRI. The cleaved cDNA of the DmMET gene was inserted downstream of the GAL10 promoter of the plasmid pUdp6 cut with the restriction enzymes SmaI and EcoRI. As a result, a DmMET expression plasmid pUdp6-DmMET having the DmMET gene and having a promoter upstream thereof was obtained.
［転写共役因子発現プラスミドの作製］
本実施例では、特に、キイロショウジョウバエTai（DmTai）遺伝子を含む転写因子発現プラスミド（以下、pESC-Leu-DmTaiとする）とオオミジンコ転写共役因子発現（SRC）プラスミド（以下、pESC-Leu-DampaSRC(1-2221)とする）を作製して用いた。pESC-Leu-DmTaiは、Ito-Harashima S et al. FEBS Open Bio. 7(7): p. 995-1008 (2017)に準じて作製した。
[Preparation of Transcription Coupling Factor Expression Plasmid]
In this example, in particular, a transcription factor expression plasmid containing a Drosophila Tai (DmTai) gene (hereinafter, referred to as pESC-Leu-DmTai) and a Daphnia magna transcription coupling factor expression (SRC) plasmid (hereinafter, pESC-Leu-DampaSRC ( 1-2221)). pESC-Leu-DmTai was prepared according to Ito-Harashima S et al. FEBS Open Bio. 7 (7): p. 995-1008 (2017).
また、pESC-Leu-DampaSRC(1-2221)は以下の方法で作製した。まず、オオミジンコSRC（DampaSRC）遺伝子のcDNAのORFを、抱卵したオオミジンコ成体のcDNAを鋳型として、SRC用プライマーSRC-F1F-pESC（配列番号１６）及びSRC-F4short-pESC（配列番号１７）を用いたPCRにより増幅した。PCRは、94℃で20秒、58℃で10秒、72℃で7分のサイクルを35サイクル実施した。 In addition, pESC-Leu-DampaSRC (1-2221) was prepared by the following method. First, SRC primers SRC-F1F-pESC (SEQ ID NO: 16) and SRC-F4short-pESC (SEQ ID NO: 17) were used, using ORF of the Daphnia magna SRC (DampaSRC) gene cDNA as a template, and the cDNA of the adult Daphnia magna incubated as a template. Amplified by PCR. In the PCR, 35 cycles were performed at 94 ° C for 20 seconds, 58 ° C for 10 seconds, and 72 ° C for 7 minutes.
次に、プラスミドpESC-Leu（Agilent technology社製）を制限酵素SpeI及びPacIで切断し、増幅したDampaSRC遺伝子のcDNAを野生酵母株W303aに酢酸リチウム法で導入することで、プラスミドpESC-Leuのgal1プロモーター領域の下流に前記DampaSRC遺伝子のcDNAを挿入したpESC-Leu-DampaSRC(1-2221)を得た。酵母細胞内で構築されたpESC-Leu-DampaSRC(1-2221)を回収し、大腸菌DH5α株に導入して増幅した。 Next, the plasmid pESC-Leu (manufactured by Agilent technology) was digested with restriction enzymes SpeI and PacI, and the amplified cDNA of the DampaSRC gene was introduced into a wild-type yeast strain W303a by the lithium acetate method. PESC-Leu-DampaSRC (1-2221) was obtained in which the cDNA of the DampaSRC gene was inserted downstream of the promoter region. PESC-Leu-DampaSRC (1-2221) constructed in yeast cells was collected, introduced into E. coli DH5α strain, and amplified.
［形質転換体酵母の作製］
まず、出芽酵母株W303aの菌体を、YPD培地（1％酵母エキス、2％ペプトン、2％D(+)-グルコース）中で、濁度（O.D.660）が1〜2になるまで、30℃で培養した。培養した菌体を、ソリューションＡ（0.1mol/L Lithium acetate、10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、1mmol/L EDTA）で洗浄した後、濁度（O.D.660）が150となるように、ソリューションＡにピペットを用いて再懸濁した。菌体の懸濁液を、1.5mLマイクロチューブに100μLずつ分注して、30℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、前記チューブに、制限酵素EcoRVで処理し、直鎖状としたpUdp15-DampaMET 5μg、キャリアーDNA（商品名SALMON TESTES DNA for hybridization、SIGMA社製）150μgを含むTEバッファー（10mM Tris、1mM EDTA、pH8.0）を20μL添加し、さらに、ソリューションＢを850μL添加し、緩やかに混合し、混合液を得た。ソリューションＢは、ソリューションＡにポリエチレングリコール4000を所定量混合したものである。
[Preparation of transformed yeast]
First, cells of the budding yeast strain W303a were placed in YPD medium (1% yeast extract, 2% peptone, 2% D (+)-glucose) at 30 ° C. until the turbidity (OD660) became 1-2. And cultured. After washing the cultured cells with solution A (0.1 mol / L Lithium acetate, 10 mmol / L Tris-HCl (pH 7.5), 1 mmol / L EDTA), the turbidity (OD660) becomes 150, Resuspended in Solution A with a pipette. The cell suspension was dispensed in 100 μL aliquots into 1.5 mL microtubes and incubated at 30 ° C. for 1 hour. After incubation, a TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA) containing 5 μg of linearized pUdp15-DampaMET treated with the restriction enzyme EcoRV and 150 μg of carrier DNA (trade name: SALMON TESTES DNA for hybridization, manufactured by SIGMA) was added to the tube. , PH 8.0) was added, and 850 μL of solution B was further added, followed by gentle mixing to obtain a mixed solution. Solution B is obtained by mixing solution A with a predetermined amount of polyethylene glycol 4000.
前記混合液を30℃で30分インキュベートし、42℃で15分間熱処理した後、さらに、10分間室温に放置した。その後、5,000rpmで1分間遠心分離し、前記混合液から酵母菌体を集菌した。集菌した酵母菌体を、5〜10mLのYPD培地に懸濁し、30℃で一晩培養した。培養後の酵母菌体を集菌し、洗浄した後、0.9％NaCl溶液に懸濁し、懸濁液100μLを、Aureobasidin A（0.5g/mL）を含むYPDに2％の寒天を加えた選択培地に塗布し、培養した。Aureobasidin A耐性を示した酵母株を、gal1プロモーター及びMET遺伝子のcDNA領域が染色体上に組込まれた形質転換酵母として選択した。 The mixture was incubated at 30 ° C. for 30 minutes, heat-treated at 42 ° C. for 15 minutes, and further left at room temperature for 10 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged at 5,000 rpm for 1 minute, and yeast cells were collected from the mixture. The collected yeast cells were suspended in 5 to 10 mL of YPD medium and cultured at 30 ° C. overnight. After collecting and washing the yeast cells after culturing, the cells are suspended in 0.9% NaCl solution, and 100 μL of the suspension is added to YPD containing Aureobasidin A (0.5 g / mL) to which 2% agar is added. And cultured. A yeast strain showing Aureobasidin A resistance was selected as a transformed yeast in which the gal1 promoter and the cDNA region of the MET gene were integrated on the chromosome.
次に、前記pUdp15-DampaMETを導入した形質転換酵母に、pESC-Leu-DmTaiを導入した。この際、形質転換酵母の選択培地は、表１及び２に示す前培養培地にトリプトファンを100mg添加した培養培地を使用した。 Next, pESC-Leu-DmTai was introduced into the transformed yeast into which pUdp15-DampaMET had been introduced. At this time, as a selective medium for the transformed yeast, a culture medium obtained by adding 100 mg of tryptophan to the preculture medium shown in Tables 1 and 2 was used.
次に、前記pUdp15-DampaMET及びpESC-Leu-DmTaiを導入した酵母にレポータープラスミドＡを酢酸リチウム法により導入した。選択培地には、表１及び２の前培養培地を使用した。得られた形質転換酵母を形質転換酵母１とした。同様の方法で、形質転換酵母１のレポータープラスミドＡに変えてレポータープラスミドＢを導入した形質転換酵母を形質転換酵母２とした。同様に、形質転換酵母２のpUdp15-DampaMETに変えてpUdp6-DmMETを導入した形質転換酵母を形質転換酵母３とした。形質転換酵母１のpESC-Leu-DmTaiとレポータープラスミドＡに変えて、それぞれpESC-Leu-DampaSRC(1-2221)とレポータープラスミドＣを導入した形質転換酵母を形質転換酵母４とした。 Next, the reporter plasmid A was introduced into the yeast into which pUdp15-DampaMET and pESC-Leu-DmTai had been introduced by the lithium acetate method. As the selection medium, the preculture medium shown in Tables 1 and 2 was used. The resulting transformed yeast was designated as transformed yeast 1. In the same manner, transformed yeast into which reporter plasmid B was introduced instead of reporter plasmid A of transformed yeast 1 was designated as transformed yeast 2. Similarly, the transformed yeast into which pUdp6-DmMET was introduced instead of pUdp15-DampaMET of transformed yeast 2 was designated as transformed yeast 3. The transformed yeast into which pESC-Leu-DampaSRC (1-2221) and reporter plasmid C were respectively introduced in place of pESC-Leu-DmTai and reporter plasmid A of the transformed yeast 1 was designated as transformed yeast 4.
本実施例の比較として、形質転換酵母２及び形質転換酵母３のレポータープラスミドＢに変えてDmJHRRレポータープラスミドを導入した形質転換酵母をそれぞれ形質転換酵母５及び形質転換酵母６とした。本実施例で作製した形質転換体を表３に纏めた。 As a comparison of this example, the transformed yeasts in which the DmJHRR reporter plasmid was introduced instead of the reporter plasmid B of the transformed yeast 2 and the transformed yeast 3 were designated as the transformed yeast 5 and the transformed yeast 6, respectively. The transformants prepared in this example are summarized in Table 3.
これら形質転換酵母１〜６を用いて以下の試験例を実施した。 The following test examples were performed using these transformed yeasts 1 to 6.
［試験例１］幼若ホルモンに対する形質転換酵母のレポーター活性測定
形質転換酵母１、２、３及び４について、表１の前培養培地を用いて、前培養培地の濁度（O.D.595）が1.0程度になるよう、30℃で18時間、前培養を行った。前培養した菌体液5μLとジメチルスルホアミド（DMSO）を用いて幼若ホルモン物質であるJHIIIを10μMに希釈した溶液1μLを表４に示す本培養培地100μLと96ウェルプレート内で混合し、30℃で18時間、静置培養を行い、反応液を調整した。これを処理区とした。
[Test Example 1] Measurement of reporter activity of transformed yeast against juvenile hormone For transformed yeasts 1, 2, 3 and 4, the turbidity (OD595) of the preculture medium was about 1.0 using the preculture medium shown in Table 1. The preculture was performed at 30 ° C. for 18 hours. A pre-cultured 5 μL of the bacterial cell fluid and 1 μL of a 10 μM solution of JHIII, a juvenile hormone substance, diluted with 10 μM of dimethylsulfonamide (DMSO) were mixed with 100 μL of the main culture medium shown in Table 4 in a 96-well plate at 30 ° C. For 18 hours to prepare a reaction solution. This was treated as a treatment area.
なお、本培養培地のドロップアウトパウダーは、表２に示した前培養培地用のドロップアウトパウダー成分のうちトリプトファン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン及びウラシルを未添加とした。JHIII希釈溶液の代わりにDMSO 1μLを添加した反応液を無処理区とした。調製した各反応液を5μLずつ採取し、新たな96ウェルプレートの各ウェルに分注した。その後、各ウェルに、溶菌液（Ｚバッファー：60mM Na2HPO4、40mM NaH2PO4、1mM MgCl2、10mM KCl、2mM ジチオスレイトール、0.20％ N-Lauroylsarcosine sodium salt）と1mg/mL ONPG（オルソニトロフェニルガラクトピラノシド）を混合した測定試薬を100μL分注し、37℃で30分間反応させた。その後、マイクロプレートリーダー（商品名ARVO X5；Perkinelmer社製）を用いて、各反応液の波長405nmにおける吸光度（O.D.405）及び濁度（O.D.595）を測定した。そして、下記式に示す誘導増加量（Increase of induction）を算出した。 In addition, the dropout powder of the main culture medium was such that tryptophan, leucine, tyrosine, phenylalanine and uracil among the dropout powder components for the preculture medium shown in Table 2 were not added. The reaction solution to which 1 μL of DMSO was added instead of the JHIII diluted solution was used as an untreated section. 5 μL of each prepared reaction solution was collected and dispensed to each well of a new 96-well plate. Then, lysate (Z buffer: 60 mM Na 2 HPO 4 , 40 mM NaH 2 PO 4 , 1 mM MgCl 2 , 10 mM KCl, 2 mM dithiothreitol, 0.20% N-Lauroylsarcosine sodium salt) and 1 mg / mL ONPG (Z buffer: 100 μL of a measurement reagent mixed with (orthonitrophenylgalactopyranoside) was dispensed, and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the absorbance (OD405) and the turbidity (OD595) at a wavelength of 405 nm of each reaction solution were measured using a microplate reader (trade name: ARVO X5; manufactured by Perkinelmer). Then, an increase in induction represented by the following equation was calculated.
誘導増加量は、Ito-Harashima S et al., FEBS Open Bio. 7(7): p. 995-1008 (2017) に記載されており、誘導増加量が0より大きい値の場合、その物質に対してレポーター活性を有すると解析される。試験は３連又は５連制で実施した。本試験例１の結果を表５に示した。 The induction increase is described in Ito-Harashima S et al., FEBS Open Bio. 7 (7): p. 995-1008 (2017). It is analyzed to have reporter activity. The test was performed in triplicate or quintuple. Table 5 shows the results of Test Example 1.
表５に示したように、本発明に係る形質転換酵母１、２、３及び４は、JHIIIの存在下においてレポーター遺伝子の発現が強く誘導されていることがわかる。したがって、試験例１の結果から、応答配列の数や転写因子プラスミドの種類、転写共役因子プラスミドの種類に関わらず、phb2配列を含むレポータープラスミドが導入された形質転換体であれば、節足動物類等に対して幼若ホルモン様作用を示す物質（内分泌攪乱物質）が検出できることが明らかとなった。 As shown in Table 5, it can be seen that the transformed yeasts 1, 2, 3, and 4 according to the present invention have strongly induced reporter gene expression in the presence of JHIII. Therefore, from the results of Test Example 1, regardless of the number of response elements, the type of transcription factor plasmid, and the type of transcription conjugation factor plasmid, if the transformant into which the reporter plasmid containing the phb2 sequence was introduced was an arthropod It was revealed that a substance (endocrine disrupting substance) having juvenile hormone-like action on species and the like can be detected.
［試験例２］性ホルモン及び内分泌攪乱作用を有する疑いのあるとされる化学物質に対する形質転換酵母のレポーター活性測定
形質転換酵母２、３、５及び６を用いて、性ホルモンである17β-エストラジオール及びテストステロン、内分泌攪乱作用を有する疑いのあるとされる化学物質である4-ノニルフェノール、ビスフェノールA、1,1,1-トリクロロ-2,2-ビス（4-クロロフェニル）エタン（DDT）、2,2-ビス（4-クロロフェニル）-1,1-ジクロロエチレン（DDE）、ディルドリンに対するレポーター活性の測定を行った。試験方法は試験例１に準じた。結果を表６に示した。
Test Example 2 Measurement of Reporter Activity of Transformed Yeast on Sex Hormones and Chemical Substances Suspected to Have Endocrine Disrupting Action Using transformed yeasts 2, 3, 5 and 6, 17β-estradiol, a sex hormone, was used. And testosterone, 4-nonylphenol, bisphenol A, 1,1,1-trichloro-2,2-bis (4-chlorophenyl) ethane (DDT), a chemical suspected of having endocrine disrupting effects The reporter activity for 2-bis (4-chlorophenyl) -1,1-dichloroethylene (DDE) and dieldrin was measured. The test method was in accordance with Test Example 1. The results are shown in Table 6.
表６に示したように、本発明に係る形質転換酵母２及び３は、内分泌攪乱物質の種類に関わらず全ての系においてレポーター遺伝子の発現が誘導されており、供試した全ての内分泌攪乱物質に対してphb2配列が応答性を示すことが確認できた。これに対して、表６に示したように、キイロショウジョウバエの幼若ホルモン応答配列（DmJHRR）を有する形質転換酵母５及び６は、4-ノニルフェノールを用いた系においてのみレポーター遺伝子の発現が誘導されており、その他の内分泌攪乱物質に対してDmJHRRが応答性を示さないことがわかった。この結果から、phb2配列を用いたレポーターアッセイにより、多様な作用を示す内分泌攪乱物質を検出できることが明らかとなった。 As shown in Table 6, in the transformed yeasts 2 and 3 according to the present invention, the expression of the reporter gene was induced in all systems regardless of the type of endocrine disrupting substance, and all the tested endocrine disrupting substances were tested. It was confirmed that the phb2 sequence showed responsiveness to. In contrast, as shown in Table 6, in transformed yeasts 5 and 6 having a Drosophila juvenile hormone response element (DmJHRR), reporter gene expression was induced only in a system using 4-nonylphenol. DmJHRR showed no response to other endocrine disruptors. These results revealed that a reporter assay using the phb2 sequence can detect endocrine disrupting substances having various actions.
［試験例３］アンドロジェン受容体アンタゴニスト物質に対するレポーター活性の測定
試験例１に準じて、アンドロジェン受容体アンタゴニスト活性を示すヒドロキシフルタミド、DDE、ペンタクロロフェノールナトリウムに対するレポーター活性を測定した。本試験例３では形質転換酵母２を用い、アンタゴニスト活性を評価するため、テストステロン存在下で実施した。結果を表７に示した。
Test Example 3 Measurement of Reporter Activity for Androgen Receptor Antagonist According to Test Example 1, reporter activity for hydroxyflutamide, DDE, and sodium pentachlorophenol exhibiting androgen receptor antagonist activity was measured. In Test Example 3, the transformed yeast 2 was used in the presence of testosterone to evaluate antagonist activity. The results are shown in Table 7.
表７に示したように、本発明に係る形質転換酵母２は、供試した全てのアンドロジェン受容体アンタゴニスト物質は、テストステロンのみの場合と比較してレポーター遺伝子の発現が低下したことがわかった。この結果から、phb2配列を含んだ形質転換体を用いることで、アンタゴニスト活性を示す内分泌攪乱物質を検出できることが明らかとなった。 As shown in Table 7, in the transformed yeast 2 according to the present invention, all the androgen receptor antagonist substances tested showed that the expression of the reporter gene was reduced as compared with the case of testosterone alone. . These results revealed that the use of a transformant containing the phb2 sequence enables detection of an endocrine disrupter exhibiting antagonist activity.
［試験例４］既存農薬活性成分に対する形質転換酵母のレポーター活性測定
試験例１に準じて、既存農薬活性成分であるメパニピリム、ベンチアバリカルブイソプロピル、ピリベンカルブ、ピロキサスルホン、フェンキノトリオンについて、形質転換酵母２を用いて内分泌攪乱作用をそれぞれ測定した。なお、供試した既存農薬活性成分は、全て内分泌攪乱作用を示さないことが明らかとなっている物質である。結果を表８に示した。
[Test Example 4] Measurement of reporter activity of transformed yeast for existing pesticide active ingredient According to Test Example 1, the characteristics of the existing pesticide active ingredients mepanipyrim, bentivalicarb isopropyl, pyribencarb, pyroxasulfone, and phenquinotrione The endocrine disrupting effect was measured using the converted yeast 2. In addition, the existing pesticidal active ingredients tested are all substances that have been found not to exhibit endocrine disrupting effects. The results are shown in Table 8.
表８に示したように、phb2配列を含んだ形質転換体において、供試した全ての既存農薬活性成分に対してレポーター遺伝子の発現誘導が見られなかった。この結果から、転写因子活性を有する内分泌攪乱物質受容体をコードする核酸と、phb2配列及びレポーター遺伝子を導入した形質転換体は、内分泌攪乱物質を選択的に検出できることが示された。 As shown in Table 8, in the transformant containing the phb2 sequence, expression induction of the reporter gene was not observed for all of the existing pesticide active ingredients tested. The results showed that a transformant into which a nucleic acid encoding an endocrine disruptor receptor having a transcription factor activity and a phb2 sequence and a reporter gene were introduced could selectively detect endocrine disrupters.
Claims (13)
（ａ）配列番号１に示す塩基配列（5’-TTTTTATTTTTCTGGTTA-3’）
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に対して１又は２個の塩基が置換、欠失又は付加された塩基配列 A transformant obtained by introducing, into a host cell, a nucleic acid encoding an endocrine disrupter receptor and a nucleic acid having a response sequence having the following nucleotide sequence (a) or (b) and a reporter gene.
(A) base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (5′-TTTTTATTTTTCTGGTTA-3 ′)
(B) a base sequence in which one or two bases have been substituted, deleted or added to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1
（ｃ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号３に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、幼若ホルモン受容体転写因子活性を有するタンパク質 The transformant according to claim 4, wherein the juvenile hormone receptor of Daphnia magna is a protein of the following (c) or (d).
(C) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (d) a protein consisting of an amino acid sequence having 70% or more identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and having juvenile hormone receptor transcription factor activity
上記形質転換細胞における上記レポーター遺伝子の発現を測定する工程とを含み、
上記レポーター遺伝子の発現量に基づいて上記供試物質と内分泌攪乱物質受容体との相互作用を評価することを特徴とする、供試物質の評価方法。 Contacting a test substance with the transformant according to any one of claims 1 to 9,
Measuring the expression of the reporter gene in the transformed cells,
A method for evaluating a test substance, comprising: evaluating an interaction between the test substance and an endocrine disruptor receptor based on the expression level of the reporter gene.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021215451A1 (en) * | 2020-04-21 | 2021-10-28 | クミアイ化学工業株式会社 | Nucleic acid capable of interacting with endocrine disruptor receptor, and use thereof |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021215451A1 (en) * | 2020-04-21 | 2021-10-28 | クミアイ化学工業株式会社 | Nucleic acid capable of interacting with endocrine disruptor receptor, and use thereof |
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