JP2020036582A - Arabinose isomerase variant - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細菌アラビノースイソメラーゼの変異体、該変異体をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ポリヌクレオチド又は該ベクターを含む宿主細胞、アラビノースイソメラーゼの変異体の生産方法、及びタガトースを生産する方法等に関する。 The present invention provides a mutant of bacterial arabinose isomerase, a polynucleotide encoding the mutant, a vector containing the polynucleotide, a host cell containing the polynucleotide or the vector, a method for producing a mutant of arabinose isomerase, and tagatose. It relates to the production method.
タガトースは、砂糖の92%の甘味を持ち、砂糖と同様の風味を有するが、砂糖の38%のカロリーしか有さず、また血糖の上昇や虫歯の原因とならないことから、代替甘味料として用いられる。さらに、タガトースは、2001年にFAO及びWHOから安全性が宣言され、2003年には日本でも食品添加物として認められたことから、医療食やダイエット食、健康食等様々な食品への応用が期待されている。 Tagatose has a sweetness of 92% of sugar and a flavor similar to sugar, but has only 38% of calories of sugar and is not used as an alternative sweetener because it does not raise blood sugar or cause tooth decay. Can be Furthermore, tagatose was declared safe by FAO and WHO in 2001, and was approved as a food additive in Japan in 2003, so it can be applied to various foods such as medical foods, diet foods, and health foods. Expected.
タガトースは、工業的には主にガラクトースを原料とする化学的又は酵素的異性化によって生産される。化学的異性化に対して、酵素的異性化には副産物が少ないなどの利点が有り、様々な微生物由来のアラビノースイソメラーゼが酵素として使われてきた。しかしながら、微生物由来のアラビノースイソメラーゼは反応速度が非常に遅いという問題がある。これは、タガトースの原料となるガラクトースがアラビノースイソメラーゼの本来の基質ではないため、基質利用率が低いことに一因がある。ガラクトースに対する反応性を改善するための試みとして、例えば非特許文献１は、Geobacillus thermodenitrificans由来のアラビノースイソメラーゼの280位のフェニルアラニンをアスパラギンに、450位のシステインをセリンに、475位のアスパラギンをリシンに置換することで、ガラクトースに対するイソメラーゼ活性が改善することを報告している。しかしながら、当該変異を有するアラビノースイソメラーゼについても、ガラクトースに対するイソメラーゼ活性は必ずしも満足できるものではなかった。
Tagatose is industrially produced mainly by chemical or enzymatic isomerization using galactose as a raw material. In contrast to chemical isomerization, enzymatic isomerization has advantages such as fewer by-products, and arabinose isomerase derived from various microorganisms has been used as an enzyme. However, arabinose isomerase derived from microorganisms has a problem that the reaction rate is extremely slow. One reason for this is that galactose, which is a raw material of tagatose, is not an original substrate of arabinose isomerase, and thus the substrate utilization is low. As an attempt to improve the reactivity to galactose, for example, Non-Patent
本発明は、ガラクトースからタガトースへのイソメラーゼ活性が高められたアラビノースイソメラーゼの変異体を提供すること等を課題とする。 An object of the present invention is to provide a mutant of arabinose isomerase in which isomerase activity from galactose to tagatose is increased.
本発明者は、配列番号1の18位に対応する位置のアミノ酸を、トレオニン、セリン、アスパラギン、及びグルタミンからなる群より選択されるアミノ酸に置換することで、ガラクトースからタガトースへのイソメラーゼ活性が高められることを見出し、本発明を完成させた。 The present inventors have increased the isomerase activity from galactose to tagatose by replacing the amino acid at the position corresponding to position 18 of SEQ ID NO: 1 with an amino acid selected from the group consisting of threonine, serine, asparagine, and glutamine. And completed the present invention.
本発明は、以下の態様を包含する。
（１）配列番号1の18位に対応する位置にトレオニン、セリン、アスパラギン、及びグルタミンからなる群より選択されるアミノ酸を含む、細菌アラビノースイソメラーゼの変異体。
（２）配列番号1の18位に対応する位置にトレオニン又はセリンを含む、（１）に記載の変異体。
（３）配列番号1の234位に対応する位置にシステインをさらに含む、（１）又は（２）に記載の変異体。
（４）配列番号1の280位に対応する位置にアスパラギン、
配列番号1の450位に対応する位置にセリン、及び
配列番号1の475位に対応する位置にリシン、
の少なくとも一つ以上をさらに含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の変異体。
（５）細菌が、Bacillaceae科細菌である、（１）〜（４）のいずれかに記載の変異体。
（６）変異体が、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選択されるアミノ酸配列：
（ｉ）配列番号1のアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号1のアミノ酸配列において、18位以外の位置において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列、及び
（ｉｉｉ）配列番号1のアミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の変異体。
（７）野生型アラビノースイソメラーゼに比べて、ガラクトースに対するイソメラーゼ活性が増加した、（１）〜（６）のいずれかに記載の変異体。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載の変異体をコードするポリヌクレオチド。
（９）（８）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（１０）（８）に記載のポリヌクレオチド又は（９）に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（１１）（１０）に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、アラビノースイソメラーゼの変異体を生産する方法。
（１２）（１）〜（７）のいずれかに記載のアラビノースイソメラーゼの変異体をガラクトースに接触させ、ガラクトースをタガトースに異性化する工程を含む、タガトースを生産する方法。
（１３）異性化工程が、ホウ酸の存在下で行われる、（１２）に記載の方法。
The present invention includes the following aspects.
(1) A variant of bacterial arabinose isomerase comprising an amino acid selected from the group consisting of threonine, serine, asparagine, and glutamine at a position corresponding to position 18 of SEQ ID NO: 1.
(2) The mutant according to (1), which contains threonine or serine at a position corresponding to position 18 in SEQ ID NO: 1.
(3) The mutant according to (1) or (2), further comprising a cysteine at a position corresponding to position 234 of SEQ ID NO: 1.
(4) asparagine at a position corresponding to position 280 of SEQ ID NO: 1,
Serine at a position corresponding to position 450 of SEQ ID NO: 1, and lysine at a position corresponding to position 475 of SEQ ID NO: 1,
The mutant according to any one of (1) to (3), further comprising at least one of the following.
(5) The mutant according to any one of (1) to (4), wherein the bacterium is a Bacillaceae bacterium.
(6) an amino acid sequence in which the mutant is selected from the group consisting of the following (i) to (iii):
(I) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
(Ii) an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added at a position other than position 18 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and (iii) 90% of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence having the above sequence identity,
The mutant according to any one of (1) to (5), comprising:
(7) The mutant according to any one of (1) to (6), wherein isomerase activity on galactose is increased as compared to wild-type arabinose isomerase.
(8) A polynucleotide encoding the mutant according to any one of (1) to (7).
(9) A vector comprising the polynucleotide according to (8).
(10) A host cell comprising the polynucleotide according to (8) or the vector according to (9).
(11) A method for producing a mutant of arabinose isomerase, comprising a step of culturing the host cell according to (10).
(12) A method for producing tagatose, comprising a step of contacting the mutant of arabinose isomerase according to any one of (1) to (7) with galactose to isomerize galactose to tagatose.
(13) The method according to (12), wherein the isomerization step is performed in the presence of boric acid.
本発明のアラビノースイソメラーゼ変異体は、野生型アラビノースイソメラーゼに比べて、ガラクトースに対するイソメラーゼ活性が増加したものであり得る。 The mutant arabinose isomerase of the present invention may have increased isomerase activity on galactose as compared to wild-type arabinose isomerase.
（アラビノースイソメラーゼの変異体）
L-アラビノースイソメラーゼ（EC 5.3.1.4）（以下、本明細書では単に「アラビノースイソメラーゼ」とも記載する）は、以下の反応を触媒する異性化酵素である：L-アラビノース←→L-リブロース
アラビノースイソメラーゼは、さらにガラクトースを基質として以下の反応を触媒することが知られている：D-ガラクトース←→D-タガトース
一態様において、本発明は、配列番号1の18位に対応する位置にトレオニン、セリン、アスパラギン、及びグルタミンからなる群より選択されるアミノ酸を含む、細菌アラビノースイソメラーゼの変異体に関する。
(Mutant of arabinose isomerase)
L-arabinose isomerase (EC 5.3.1.4) (hereinafter also simply referred to as “arabinose isomerase”) is an isomerase that catalyzes the following reaction: L-arabinose ← → L-ribulose arabinose isomerase Is further known to catalyze the following reaction using galactose as a substrate: D-galactose ← → D-tagatose In one embodiment, the present invention provides threonine, serine at a position corresponding to position 18 of SEQ ID NO: 1. A mutant of bacterial arabinose isomerase, comprising an amino acid selected from the group consisting of, asparagine, and glutamine.
本発明の変異体を作製するための基準となる細菌アラビノースイソメラーゼとしては、任意の細菌由来のものを用いることができる。例えば、Bacillaceae科細菌（例えばGeobacillus属、Anoxybacillus属、Bacillus属細菌等）、Alicyclobacillaceae科細菌（例えばAlicyclobacillus属細菌等）、又はMicrobacteriaceae科細菌（例えばMicrobacterium属細菌等）由来のアラビノースイソメラーゼを用いることができる。例えば、Geobacillus stearothermophilus、Geobacillus kaustophilus、Geobacillus sp.、Anoxybacillus flavithermus、Bacillus sp.、Alicyclobacillus kakegawensis、Microbacterium esteraromaticum由来のアラビノースイソメラーゼを用いることができる。あるいは、各種の細菌アラビノースイソメラーゼ遺伝子をもとに作製されたキメラタンパク質を用いることもできる。 As a bacterial arabinose isomerase used as a criterion for producing the mutant of the present invention, those derived from any bacteria can be used. For example, arabinose isomerase derived from a Bacillaceae bacterium (eg, a genus Geobacillus, Anoxybacillus, a bacillus genus, etc.), an Alicyclobacillaceae bacterium (eg, a genus Alicyclobacillus genus), or a Microbacteriaceae bacterium (eg, a bacterium belonging to the genus Microbacterium) can be used. . For example, arabinose isomerase derived from Geobacillus stearothermophilus, Geobacillus kaustophilus, Geobacillus sp., Anoxybacillus flavithermus, Bacillus sp., Alicyclobacillus kakegawensis, and Microbacterium esteraromaticum can be used. Alternatively, a chimeric protein produced based on various bacterial arabinose isomerase genes can be used.
本明細書において、アミノ酸位置の対応関係は、例えば、既成のアミノ酸の相同性解析用ソフト、例えば、GENETYX（GENETYX社製）等を用いて、各種アラビノースイソメラーゼのアミノ酸配列を比較することにより、容易に特定することができる。例えば、配列番号1のアミノ酸配列の位置Ｘに対応するアラビノースイソメラーゼのアミノ酸位置は、該アラビノースイソメラーゼのアミノ酸配列を配列番号1のアミノ酸配列とアラインメントすることによって特定することができる。例えば、「配列番号1の18位に対応する位置」は、配列番号3のアミノ酸配列の18位、配列番号5、７又は9のアミノ酸配列の17位であってよい。図1に、Geobacillus stearothermophilusの2菌株（Geobacillus stearothermophilus-1、Geobacillus stearothermophilus-2）、Geobacillus stearothermophilus、Geobacillus kaustophilus、Geobacillus sp. ZGt-1、及びAnoxybacillus flavithermusのアラビノースイソメラーゼのアラインメント結果を示す。このように配列番号1のアミノ酸配列とのアラインメント結果を参照して各アミノ酸配列における対応する位置を定めることができる。 In the present specification, the correspondence between amino acid positions can be easily determined by comparing the amino acid sequences of various arabinose isomerases using, for example, existing amino acid homology analysis software such as GENETYX (manufactured by GENETYX). Can be specified. For example, the amino acid position of arabinose isomerase corresponding to position X of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 can be specified by aligning the amino acid sequence of the arabinose isomerase with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. For example, “the position corresponding to position 18 of SEQ ID NO: 1” may be position 18 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or position 17 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, 7, or 9. 1 shows arabinose isomerase of two strains of Geobacillus stearothermophilus (Geobacillus stearothermophilus-1, Geobacillus stearothermophilus-2), Geobacillus stearothermophilus, Geobacillus kaustophilus, Geobacillus sp. ZGt-1, and Anoxybacillus flavithermus. Thus, the corresponding position in each amino acid sequence can be determined with reference to the alignment result with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
一実施形態において、アラビノースイソメラーゼ変異体における配列番号1の18位に対応する位置のアミノ酸は、トレオニン、セリン、アスパラギン、及びグルタミンからなる群より選択される中性アミノ酸であり、好ましくはトレオニン又はセリンである。 In one embodiment, the amino acid at the position corresponding to position 18 of SEQ ID NO: 1 in the arabinose isomerase variant is a neutral amino acid selected from the group consisting of threonine, serine, asparagine, and glutamine, preferably threonine or serine It is.
一実施形態において、本発明のアラビノースイソメラーゼ変異体は、配列番号1の18位に対応する位置の変異以外の変異をさらに含んでもよい。前記変異は、何らかの特定の効果を意図して人為的に導入されたものでもよく、ランダムに、又は非人為的に導入されたものでもよい。本発明の変異体は、例えば、Kim B.J. et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, vol. 98, issue 22, pp.9271-81に記載の変異を含むことができる。本発明の変異体は、例えば、配列番号1の280位に対応する位置にアスパラギン、配列番号1の450位に対応する位置にセリン、及び配列番号1の475位に対応する位置にリシンの少なくとも一つ以上、例えば二つ又は三つ全てをさらに含んでよい。これらの変異に加えて、又はこれらの変異に代えて、本発明の変異体は、例えば、配列番号1の234位に対応する位置にシステイン又はメチオニン、例えばシステインを含んでよい。これらの変異に加えて、又はこれらの変異に代えて、本発明の変異体は、配列番号1の386位に対応する位置にリシン、アルギニン、又はヒスチジン、例えばリシン、及び／又は配列番号1の320位に対応する位置にトレオニン、セリン、アスパラギン、及びグルタミン、例えばトレオニンを含んでもよい。 In one embodiment, the arabinose isomerase variant of the invention may further comprise a mutation other than the mutation at the position corresponding to position 18 of SEQ ID NO: 1. The mutation may be artificially introduced for the purpose of any particular effect, or may be randomly or non-artificially introduced. The mutant of the present invention can include, for example, the mutation described in Kim B.J. et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, vol. 98, issue 22, pp. 9271-81. Variants of the present invention include, for example, at least asparagine at a position corresponding to position 280 of SEQ ID NO: 1, serine at a position corresponding to position 450 of SEQ ID NO: 1, and lysine at a position corresponding to position 475 of SEQ ID NO: 1. It may further comprise one or more, for example two or all three. In addition to or in place of these mutations, variants of the present invention may include, for example, a cysteine or methionine, eg, cysteine, at a position corresponding to position 234 of SEQ ID NO: 1. In addition to or in place of these mutations, the variants of the present invention may provide a lysine, arginine, or histidine such as lysine, and / or a histidine at a position corresponding to position 386 of SEQ ID NO: 1. Threonine, serine, asparagine, and glutamine, such as threonine, may be included at the position corresponding to position 320.
一実施形態において、本発明の変異体は、配列番号1の234位に対応する位置にシステイン、配列番号1の386位に対応する位置にリシン、及び配列番号1の320位に対応する位置にトレオニンの少なくとも一つ以上、並びに／又は
配列番号1の280位に対応する位置にアスパラギン、配列番号1の450位に対応する位置にセリン、及び配列番号1の475位に対応する位置にリシンの少なくとも一つ以上を含む。
In one embodiment, the variant of the invention comprises a cysteine at a position corresponding to position 234 of SEQ ID NO: 1, a lysine at a position corresponding to position 386 of SEQ ID NO: 1, and a position corresponding to position 320 of SEQ ID NO: 1. At least one or more of threonine and / or asparagine at a position corresponding to position 280 of SEQ ID NO: 1, serine at a position corresponding to position 450 of SEQ ID NO: 1, and lysine at a position corresponding to position 475 of SEQ ID NO: 1. Including at least one or more.
一実施形態において、本発明の変異体は、配列番号1の18位に対応する位置におけるアミノ酸変異（及び任意に本明細書に記載の他のアミノ酸変異）を含み、かつ以下の（i）〜（iii）からなる群より選択されるアミノ酸配列：
（i）配列番号1のアミノ酸配列、
（ii）配列番号1のアミノ酸配列において、18位（さらに、上記の変異を含む場合には、これらの変異の位置）以外の位置において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列、及び
（iii）配列番号1のアミノ酸配列に対して例えば80％以上、85%以上、又は90%以上、好ましくは95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、又は99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
In one embodiment, the variant of the present invention comprises an amino acid mutation at the position corresponding to position 18 of SEQ ID NO: 1 (and optionally other amino acid mutations described herein), and (Iii) an amino acid sequence selected from the group consisting of:
(I) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
(Ii) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, one or several amino acids are substituted, deleted, or added at a position other than position 18 (and, in the case of including the above mutation, the position of these mutations). Amino acid sequence, and (iii) for example, 80% or more, 85% or more, or 90% or more, preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Includes amino acid sequences having at least% sequence identity.
本明細書において、「1又は数個」の範囲は、1から10個、好ましくは1から7個、さらに好ましくは1から5個、特に好ましくは1から3個、あるいは1個又は2個である。 In the present specification, the range of `` one or several '' is 1 to 10, preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 3, or 1 or 2 is there.
本明細書において、本明細書において、アミノ酸配列及び塩基配列に関する同一性の値は、複数の配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、BLAST、及びGENETYX）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。同一性の決定方法の詳細については、例えばAltschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977及びAltschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990を参照されたい。 As used herein, in the present specification, the identity value relating to an amino acid sequence and a base sequence is set to a default value using software for calculating the identity between a plurality of sequences (for example, FASTA, DANASYS, BLAST, and GENETYX). Shows the value calculated by setting. For details of the method for determining identity, see, for example, Altschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977 and Altschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990. .
一実施形態において、本発明のアラビノースイソメラーゼ変異体は、野生型アラビノースイソメラーゼに比べて、ガラクトースをタガトースに変換するイソメラーゼ活性が増加している。ガラクトースに対するイソメラーゼ活性の増加の程度は限定しないが、本明細書に記載の変異を導入しないアラビノースイソメラーゼ（例えば変異体に対応する野生型アラビノースイソメラーゼ）の活性を100%としたときの、本発明のアラビノースイソメラーゼ変異体の相対活性は105%以上、110%以上、115%以上、好ましくは120%&以上、130%&以上、135%以上、又は140%以上であってよい。ガラクトースに対するイソメラーゼ活性の程度は、公知の方法に従って行うことができ、例えばZ. Dische and E. Borenfreund, J. Biol. Chem., 192 (2), 1951, 583-587に記載の方法に従って、実施例の記載に従って測定することができる。 In one embodiment, the arabinose isomerase variant of the present invention has increased isomerase activity for converting galactose to tagatose, as compared to wild-type arabinose isomerase. The degree of increase in the isomerase activity for galactose is not limited, but the activity of the arabinose isomerase not introducing the mutation described herein (for example, the wild-type arabinose isomerase corresponding to the mutant) is defined as 100% of the activity of the present invention. The relative activity of the arabinose isomerase variant may be 105% or more, 110% or more, 115% or more, preferably 120% & more, 130% & more, 135% or more, or 140% or more. The degree of isomerase activity on galactose can be determined according to a known method, for example, according to the method described in Z. Dische and E. Borenfreund, J. Biol. Chem., 192 (2), 1951, 583-587. It can be measured as described in the examples.
アラビノースイソメラーゼ変異体のアラビノースに対するイソメラーゼ活性は、限定しないが、野生型アラビノースイソメラーゼの活性と同等以下であってよい。 The isomerase activity of the arabinose isomerase mutant on arabinose is not limited, but may be equal to or lower than the activity of wild-type arabinose isomerase.
本発明のアラビノースイソメラーゼ変異体は、野生型アラビノースイソメラーゼに比べて、高温（例えば、50℃以上、60℃以上、又は70℃以上）で高い活性を有し得る。 The arabinose isomerase mutant of the present invention can have higher activity at a higher temperature (for example, 50 ° C. or higher, 60 ° C. or higher, or 70 ° C. or higher) as compared with wild-type arabinose isomerase.
（ポリヌクレオチド）
一態様において、本発明は、本発明のアラビノースイソメラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド（以下、「アラビノースイソメラーゼ遺伝子」とも記載する）に関する。ポリヌクレオチドの配列は、アラビノースイソメラーゼ変異体のアミノ酸配列に基づいて容易に定めることができる。例えば、配列番号1、3、5、7、及び9のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとして、それぞれ配列番号2、4、6、8、及び10のポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、以下の（i）〜（iii）からなる群より選択されるヌクレオチド配列：
（i）配列番号2、4、6、8、及び10からなる群から選択されるヌクレオチド配列、
（ii）前記（i）のいずれかのヌクレオチド配列において、1又は数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、及び
（iii）前記（i）のいずれかのヌクレオチド配列に対して80％以上、85%以上、又は90%以上、好ましくは95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、又は99%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列
を含んでよい。
(Polynucleotide)
In one aspect, the present invention relates to a polynucleotide encoding the arabinose isomerase variant of the present invention (hereinafter, also referred to as “arabinose isomerase gene”). The polynucleotide sequence can be easily determined based on the amino acid sequence of the arabinose isomerase variant. For example, polynucleotides encoding the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, and 9 include the polynucleotides of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, and 10, respectively. The polynucleotide of the present invention is, for example, a nucleotide sequence selected from the group consisting of the following (i) to (iii):
(I) a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, and 10;
(Ii) a nucleotide sequence in which one or several nucleotides have been substituted, deleted or added in any of the nucleotide sequences of (i), and (iii) a nucleotide sequence of any of (i) It may comprise a nucleotide sequence having a sequence identity of 80% or more, 85% or more, or 90% or more, preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
これらのアラビノースイソメラーゼをコードするヌクレオチドは、公知の遺伝子のクローニング方法により得ることができる。例えば、アラビノースイソメラーゼ生産能を有する細菌の細胞から常法に従って、ゲノムDNA又はmRNAを抽出し、ゲノムDNA又はmRNA由来のcDNAを鋳型としたPCRによりアラビノースイソメラーゼをコードするヌクレオチドを得ることができる。プライマーは、各ヌクレオチドの配列に基づいて設計することができる。 The nucleotides encoding these arabinose isomerases can be obtained by known gene cloning methods. For example, genomic DNA or mRNA is extracted from bacterial cells having arabinose isomerase-producing ability according to a conventional method, and nucleotides encoding arabinose isomerase can be obtained by PCR using genomic DNA or mRNA-derived cDNA as a template. Primers can be designed based on the sequence of each nucleotide.
また、アラビノースイソメラーゼをコードするヌクレオチドは、常法に従って化学合成により調製することもできる。 In addition, nucleotides encoding arabinose isomerase can also be prepared by chemical synthesis according to a conventional method.
（アラビノースイソメラーゼ遺伝子の変異処理）
アラビノースイソメラーゼ遺伝子の変異処理は、公知の方法で行うことができる。例えば、アラビノースイソメラーゼ遺伝子を変異原と接触させる方法；放射線照射法；遺伝子工学的手法を用いる方法等を用いることができる。
(Mutation of arabinose isomerase gene)
The mutation treatment of the arabinose isomerase gene can be performed by a known method. For example, a method of bringing an arabinose isomerase gene into contact with a mutagen; a radiation irradiation method; a method using genetic engineering techniques, and the like can be used.
変異原となる薬剤としては、例えば、エチルメタンスルホネート、N−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、又は5−ブロモウラシル等を挙げることができる。 Examples of the mutagenic agent include ethyl methanesulfonate, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, nitrite, sulfurous acid, hydrazine, and 5-bromouracil.
放射線照射の例としては、例えばUV照射、ガンマ線照射、X線照射、重イオンビーム照射が挙げられる。 Examples of radiation irradiation include, for example, UV irradiation, gamma ray irradiation, X-ray irradiation, and heavy ion beam irradiation.
遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、例えばMolecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-8,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。 Site-directed mutagenesis, one of the genetic engineering techniques, is useful because it is a technique that can introduce a specific mutation at a specific position.For example, Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-8, John Wiley & Sons (1987-1997), and the like.
（ベクター、宿主細胞）
一態様において、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。ベクターの例としては、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等が挙げられる。本発明のベクターには、当分野で通常使用されるプロモーター、エンハンサー等の発現制御配列、選択マーカー遺伝子等を適宜含めることができる。ベクターは、本発明のポリヌクレオチドの細胞への導入及び発現のために好適な市販のものを利用することもできる。ベクターの細胞への導入は、特に限定するものではないが、塩化カルシウム、ポリエチレングリコール、DEAE-デキストラン、両親媒性ペプチド、塩基性リン脂質、ポリリシン等を用いる法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション等を適宜使用することができる。
(Vector, host cell)
In one aspect, the present invention relates to a vector comprising the above polynucleotide. Examples of the vector include a bacteriophage, a cosmid, and a plasmid used for transforming a prokaryotic cell. The vector of the present invention can appropriately contain expression control sequences such as promoters and enhancers commonly used in the art, a selection marker gene and the like. As the vector, a commercially available vector suitable for introducing and expressing the polynucleotide of the present invention into cells can also be used. The introduction of the vector into the cells is not particularly limited, but includes methods using calcium chloride, polyethylene glycol, DEAE-dextran, amphipathic peptides, basic phospholipids, polylysine, etc., electroporation, microinjection, etc. It can be used as appropriate.
一態様において、本発明は、上記ポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、限定されないが、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、及び植物細胞等であり、好ましくは大腸菌等の細菌細胞である。 In one aspect, the present invention relates to a host cell comprising the above polynucleotide or vector. Host cells include, but are not limited to, bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, yeast cells, insect cells, animal cells (eg, mammalian cells), plant cells, and the like, and preferably bacterial cells such as Escherichia coli.
（アラビノースイソメラーゼ変異体の生産方法）
一態様において、本発明は、上記宿主細胞を培養する工程を含む、アラビノースイソメラーゼ変異体の生産方法に関する。培養は各種公知の方法で行うことができ、固体培養法でもよいが、好ましくは液体培養法により培養する。
(Method for producing arabinose isomerase mutant)
In one aspect, the present invention relates to a method for producing an arabinose isomerase mutant, comprising a step of culturing the above host cell. The culture can be performed by various known methods, and may be a solid culture method, but is preferably performed by a liquid culture method.
本発明の方法は、上記宿主細胞を、アラビノースイソメラーゼタンパク質を発現し得る条件下で培養する工程、及び任意に培養物又は培養液からアラビノースイソメラーゼを単離する工程を含んでよい。ここでアラビノースイソメラーゼを発現しうる条件とは、アラビノースイソメラーゼ遺伝子が転写、翻訳され、当該遺伝子によりコードされるポリペプチドが産生されることをいう。 The method of the present invention may include a step of culturing the host cell under conditions capable of expressing the arabinose isomerase protein, and optionally, a step of isolating arabinose isomerase from the culture or culture solution. Here, the condition under which arabinose isomerase can be expressed means that the arabinose isomerase gene is transcribed and translated to produce a polypeptide encoded by the gene.
また、上記宿主細胞を培養する培地及び培養条件は、宿主細胞に応じて公知の条件に従って設定することができる。 In addition, the culture medium and culture conditions for culturing the host cells can be set according to known conditions according to the host cells.
培養終了後、培養物又は培養液からのアラビノースイソメラーゼの単離は、通常の方法を用いて行うことができ、粗精製であっても、精製であってもよい。例えば、培養物を用いる場合、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等して、又はリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を得ることができる。そして、得られた溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、上清に硫安、アルコール、又はアセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、アラビノースイソメラーゼの粗酵素を得ることができる。 After completion of the culture, the isolation of arabinose isomerase from the culture or the culture solution can be performed using a conventional method, and may be either crude purification or purification. For example, when a culture is used, the present enzyme can be obtained by subjecting cells to ultrasonic disruption treatment, grinding treatment, or the like, or using a lytic enzyme such as lysozyme in a conventional manner. The resulting solution is filtered, centrifuged or the like to remove the solid portion, and the supernatant is fractionated by adding ammonium sulfate, alcohol, acetone, or the like, and the precipitate is collected to obtain a crude enzyme of arabinose isomerase. Obtainable.
上記アラビノースイソメラーゼの粗酵素よりさらに精製を行ってもよい。精製は、当分野で通常使用されている方法、例えば遠心分離、各種クロマトグラフィー、ウエスタンブロッティング等によって行うことができる。 The crude arabinose isomerase may be further purified from the crude enzyme. Purification can be performed by a method commonly used in the art, for example, centrifugation, various types of chromatography, Western blotting, and the like.
（タガトースを生産する方法）
一態様において、本発明は、本明細書に記載のアラビノースイソメラーゼの変異体をガラクトースに接触させ、ガラクトースをタガトースに変換する工程を含む、タガトースを生産する方法に関する。
(How to produce tagatose)
In one aspect, the present invention relates to a method for producing tagatose, comprising contacting a mutant of arabinose isomerase described herein with galactose and converting galactose to tagatose.
ガラクトースは、以下の反応に従って、アラビノースイソメラーゼによりタガトースに異性化される。：D-ガラクトース←→D-タガトース
変換する工程の条件は限定しないが、例えば40℃以上、50℃以上、又は55℃以上の温度で、また80℃以下、70℃以下、又は65℃以下の温度で、例えば約60℃の温度で行うことができる。また、変換工程は、例えば6以上、7以上、又は7.5以上のpHで、また9以下、8以下、又は8.5以下のpHで、例えば約8のpHで行うことができる。また、変換工程は、例えば10分以上、20分以上、又は25分以上の時間、また2時間以下、1時間以下、又は40分以下の時間、例えば約30分の時間行うことができる。
Galactose is isomerized to tagatose by arabinose isomerase according to the following reaction. : D-galactose ← → D-tagatose The conditions of the conversion step are not limited, but for example, at a temperature of 40 ° C. or more, 50 ° C. or more, or 55 ° C. or more, and 80 ° C. or less, 70 ° C. or less, or 65 ° C. or less It can be carried out at a temperature, for example at a temperature of about 60 ° C. Also, the conversion step can be performed at a pH of, for example, 6 or more, 7 or more, or 7.5 or more, and at a pH of 9 or less, 8 or less, or 8.5 or less, for example, a pH of about 8. Further, the conversion step can be performed, for example, for 10 minutes or more, 20 minutes or more, or 25 minutes or more, or 2 hours or less, 1 hour or less, or 40 minutes or less, for example, about 30 minutes.
変換工程は、ホウ酸の存在下で行うことができる。これにより、ガラクトースからタガトースへの変換速度を高めることができる。ホウ酸の濃度は限定しないが、例えば20mM以上、50mM以上、100mM以上、又は150mM以上の濃度で、また1000mM以下、400mM以下、300mM以下、又は250mM以下の濃度で、例えば約200mMの濃度で用いることができる。 The conversion step can be performed in the presence of boric acid. Thereby, the conversion speed from galactose to tagatose can be increased. Although the concentration of boric acid is not limited, for example, at a concentration of 20 mM or more, 50 mM or more, 100 mM or more, or 150 mM or more, and at a concentration of 1000 mM or less, 400 mM or less, 300 mM or less, or 250 mM or less, for example, used at a concentration of about 200 mM be able to.
本発明の方法は、上記変換工程に加えて、タガトースを精製する工程を含んでもよい。精製工程は、公知の方法を用いて行うことができ、例えばイオン交換体を用いる液体クロマトグラフィー等を用いてタガトースを精製することができる。精製工程で分離されたガラクトースは、リサイクルして再度上記反応の基質としてもよい。 The method of the present invention may include a step of purifying tagatose in addition to the above conversion step. The purification step can be performed using a known method. For example, tagatose can be purified using liquid chromatography or the like using an ion exchanger. The galactose separated in the purification step may be recycled and used again as a substrate for the above reaction.
また、精製又は未精製タガトースに対し、任意に活性炭処理法による脱色してもよいし、さらに濃縮及び／又は結晶化してもよい。 Further, the purified or unpurified tagatose may be optionally decolorized by an activated carbon treatment method, or may be further concentrated and / or crystallized.
生産されたタガトースの用途は限定しないが、例えば食品組成物（飲料、動物用飼餌料を含み、例えばヒトの医療食やダイエット食、健康食等が挙げられる）及び医薬品組成物の原料とすることができる。 The use of the produced tagatose is not limited. For example, it is used as a raw material for a food composition (including beverages, animal feeds, for example, a human medical diet, a diet diet, a healthy diet, etc.) and a pharmaceutical composition. Can be.
以下、実施例を参照して本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited by those examples.
（材料と方法）
変異導入箇所と候補アミノ酸の検索
既にX 線結晶構造解析が終了したGeobacillus kaustophilus由来アラビノースイソメラーゼ（PDB ID: 4R1Q）（以下、GKAIとも記載する。アミノ酸配列：配列番号5）の情報を基に、molecular operating environment （MOE） software （Chemical Computing Group）を用いて、基質結合部位付近のアミノ酸で、基質との結合に直接関与しないアミノ酸の部位をアラニンスキャニングにより検索した。なお、GKAIはGeobacillus stearothermophilusアラビノースイソメラーゼ（以下GSAIとも記載する。アミノ酸配列：配列番号1）と97%の相同性を有する。
(Materials and methods)
Search for mutation sites and candidate amino acids Based on the information of Geobincillus kaustophilus arabinose isomerase (PDB ID: 4R1Q) (hereinafter also referred to as GKAI; amino acid sequence: SEQ ID NO: 5) for which X-ray crystal structure analysis has already been completed. Using an operating environment (MOE) software (Chemical Computing Group), amino acid sites near the substrate binding site that were not directly involved in binding to the substrate were searched for by alanine scanning. GKAI has 97% homology with Geobacillus stearothermophilus arabinose isomerase (hereinafter also referred to as GSAI; amino acid sequence: SEQ ID NO: 1).
一般的には、基質と結合するアミノ酸を検索するが、本実施例では変異後のアラビノースイソメラーゼ（以下AIとも記載する）安定性を考慮し、基質結合に関与しないアミノ酸に変異を導入した。置換するアミノ酸の候補は、MOE を用いて検索し、変異導入後のGSAI安定性を計算して選別した。 Generally, amino acids that bind to a substrate are searched for. In this example, mutations were introduced into amino acids that do not participate in substrate binding in consideration of the stability of arabinose isomerase (hereinafter also referred to as AI) after mutation. Amino acid candidates to be substituted were searched using MOE, and GSAI stability after mutagenesis was calculated and selected.
アラビノースイソメラーゼの発現と精製
アラビノースイソメラーゼをコードするaraA遺伝子を、pGEM-T Easy-GSAI（D. Fitriani and B. Saksono, Hayati J. Biosci., 17 (2), 2010, 58-62）を鋳型として用いるPCRにより増幅した。増幅した断片をNdeI/BamHIで消化したpET15bに導入した。構築したベクターであるpET15b-GSAIの配列は、シークエンスによりaraA遺伝子を含んでいることを確認した。pET15b-GSAIを有する大腸菌BL21 Star (DE3)を0.4%グルコースを含むLB-アンピシリン培地にて160 rpmで撹拌しながら37℃で一晩前培養し、1%の前培養物を100 mL LB-アンピシリン培地に加え、130rpmで撹拌しながら18℃でインキュベートした。600 nmの光学密度が1.0に達した後に、0.2 mM イソプロピル-β-Dチオガラクトシド（IPTG）を添加してGSAIの合成を誘導した。130rpmで撹拌しながら18℃で一晩インキュベートした後、細胞を遠心分離で回収し、50 mM Tris-HClバッファー(pH8.0)で再懸濁した。細胞を超音波で破砕し、サンプルの上清をHisTrap HP（1 mL; GE Healthcare）カラムに供し、20〜500 mMイミダゾールのグラジエントで溶出することで精製を行った。基質特異性とキネティックパラメーターの実験では、さらにHiTrap Q HP（1 mL; GE Healthcare）カラムを用い、0〜1 M NaClのグラジエントで溶出した酵素を用いた。得られた画分は、50 mM Tris-HClバッファー(pH7.5)で透析し、イミダゾールを除いた。GSAIの純度はSDS-PAGEで確認し、タンパク質濃度はBCA法を用いて常法に従って測定した。
Expression and purification of arabinose isomerase Using the araA gene encoding arabinose isomerase as a template, pGEM-T Easy-GSAI (D. Fitriani and B. Saksono, Hayati J. Biosci., 17 (2), 2010, 58-62) Amplified by PCR used. The amplified fragment was introduced into pET15b digested with NdeI / BamHI. The sequence of the constructed vector, pET15b-GSAI, was confirmed by sequencing to contain the araA gene. E. coli BL21 Star (DE3) having pET15b-GSAI was pre-incubated overnight at 37 ° C. with stirring at 160 rpm in an LB-ampicillin medium containing 0.4% glucose. The medium was added and incubated at 18 ° C. with stirring at 130 rpm. After the optical density at 600 nm reached 1.0, 0.2 mM isopropyl-β-D thiogalactoside (IPTG) was added to induce the synthesis of GSAI. After overnight incubation at 18 ° C. with stirring at 130 rpm, cells were harvested by centrifugation and resuspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). The cells were disrupted by sonication, and the sample supernatant was applied to a HisTrap HP (1 mL; GE Healthcare) column and purified by elution with a gradient of 20-500 mM imidazole. In experiments of substrate specificity and kinetic parameters, an enzyme eluted with a gradient of 0 to 1 M NaCl using a HiTrap Q HP (1 mL; GE Healthcare) column was also used. The obtained fraction was dialyzed against a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) to remove imidazole. The purity of GSAI was confirmed by SDS-PAGE, and the protein concentration was measured using a BCA method according to a conventional method.
候補アミノ酸の変異導入と発現
選別した候補アミノ酸をQuikChange（登録商標） II XL Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）を用い、変異を導入した。変異体を得るためのテンプレートとしては、上記pET15b-GSAIを用いた。変異を導入したGSAI遺伝子を含むプラスミドをカルシウム法により常法に従って大腸菌（E. coli BL21 Star (DE3)）に導入した。この大腸菌を、96穴タイタープレートで、200 μL LB-アンピシリン培地において、1000 × 10 r/min (Mix-EVR, TAITEC)で撹拌しながら一晩培養した。培地を除いた後で、菌体を21.1 μLの50 mM Tris-HClバッファー(pH8.0)で再懸濁し、−80℃で1時間冷凍した。その後、60℃で30分間保温することによって、タンパク質を溶出させた。この粗酵素液3 μLの活性を以下の様にプレートリーダーで測定することで、優良変異体の選別を行った。3 μLの上記粗酵素溶液を含む26.4 μLの反応溶液（50 mM D-ガラクトース、1 mM MnCl2、及び50 mM Tris-HClバッファー(pH 8.0)）を、60℃で30分間反応させた。生成したL-リブロース（D-タガトース）量を、Z. Dische and E. Borenfreund, J. Biol. Chem., 192 (2), 1951, 583-587に記載の方法に従って、cysteine-carbazole-sulfuric acid法を用いてプレートリーダーにより測定した。具体的には、反応溶液をシステイン-カルバゾール硫酸溶液（3mM L-cystein、8.4 M H2SO4, 0.3 mM carbazole）に加え（通常の測定では、反応液100μlをシステイン-カルバゾール硫酸溶液960μlに加え、変異体のスクリーニングでは反応液26.4 μLにシステイン-カルバゾール硫酸溶液を254μl加えた）、60℃で30分間反応させた後、Benchmark PlusTM Microplate Spectrophotometer (Bio-Rad Laboratories)を用いて560 nmで発色を測定し、標準曲線により生成したL−リブロース（D−タガトース）を算出した。
Mutation Introduction and Expression of Candidate Amino Acid Mutations were introduced from the selected candidate amino acids using QuikChange (registered trademark) II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). The above pET15b-GSAI was used as a template for obtaining the mutant. The plasmid containing the GSAI gene into which the mutation was introduced was introduced into Escherichia coli (E. coli BL21 Star (DE3)) by a calcium method according to a conventional method. This E. coli was cultured overnight in a 96-well titer plate in 200 μL LB-ampicillin medium at 1000 × 10 r / min (Mix-EVR, TAITEC) with stirring. After removing the medium, the cells were resuspended in 21.1 μL of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) and frozen at −80 ° C. for 1 hour. Thereafter, the protein was eluted by keeping the temperature at 60 ° C. for 30 minutes. An excellent mutant was selected by measuring the activity of 3 μL of the crude enzyme solution using a plate reader as follows. 26.4 μL of a reaction solution (50 mM D-galactose, 1 mM MnCl 2 , and 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0)) containing 3 μL of the above crude enzyme solution was reacted at 60 ° C. for 30 minutes. The amount of L-ribulose (D-tagatose) produced was determined according to the method described in Z. Dische and E. Borenfreund, J. Biol. It was measured by a plate reader using the method. Specifically, the reaction solution was added to a cysteine-carbazole sulfate solution (3 mM L-cystein, 8.4 MH 2 SO 4 , 0.3 mM carbazole) (in a normal measurement, 100 μl of the reaction solution was added to 960 μl of the cysteine-carbazole sulfate solution, screening of the mutants reaction solution 26.4 [mu] L cysteine - was added 254μl carbazole sulfuric acid solution) and allowed to react at 60 ° C. 30 minutes, the color development at 560 nm using Benchmark Plus TM Microplate Spectrophotometer (Bio- Rad Laboratories) L-Ribulose (D-tagatose) was measured and calculated based on the standard curve.
優良変異体について、上記「アラビノースイソメラーゼの発現と精製」に従って、発現精製を行った。また、酵素（0.01 μg／μL）を30〜80℃で1時間保温し、そのL-アラビノースをL-リブロースに変換する残存活性を上記の通りcysteine-carbazole-sulfuric acid法により測定し変異による熱安定性の変化がないかを確認した。 Expression and purification of the superior mutant were performed according to the above “Expression and purification of arabinose isomerase”. In addition, the enzyme (0.01 μg / μL) was incubated at 30-80 ° C. for 1 hour, and the residual activity of converting L-arabinose to L-ribulose was measured by the cysteine-carbazole-sulfuric acid method as described above, and the heat due to the mutation was measured. It was confirmed that there was no change in stability.
GSAI変異体の性質検討
作製したGSAI 変異体の詳細な基質特異性、熱安定性などの諸性質の検討を行った。また、以下の通りキネティックパラメーターを測定した。まず、10〜200 mM D-ガラクトース及び5〜100 mM L-アラビノースを含む反応溶液（1 mM MnCl2を含む50 mM Tris-HClバッファー(pH 8.0)又は200 mMホウ酸バッファー(ホウ酸を水で溶解し、NaOHでpH 8.0に調整)）を、酵素と60℃で30分間保温した。生成したL−リブロース（D−タガトース）量を、上記の通り、cysteine-carbazole-sulfuric acid法を用いてプレートリーダーにより560 nmで測定した。L-アラビノースを基質とするときは酵素を1μg用い、D-ガラクトースの時は酵素を5 μg用いた。キネティックパラメーター(Km (mM), kcat (min-1), Vmax (U mg-1))は、GraphPad Prism 7 (GraphPad software)を用いて算出した。酵素反応速度論により、変異体の基質に対する反応速度の変化を考察した。
Examination of properties of GSAI mutants Various properties such as substrate specificity and thermal stability of the produced GSAI mutants were examined. In addition, kinetic parameters were measured as follows. First, a reaction solution containing 10 to 200 mM D-galactose and 5 to 100 mM L-arabinose (a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 1 mM MnCl 2 or a 200 mM borate buffer (boric acid in water). (Dissolved and adjusted to pH 8.0 with NaOH)) and incubated with the enzyme at 60 ° C for 30 minutes. The amount of L-ribulose (D-tagatose) produced was measured at 560 nm by a plate reader using the cysteine-carbazole-sulfuric acid method as described above. When L-arabinose was used as the substrate, 1 μg of the enzyme was used, and when D-galactose was used, 5 μg of the enzyme was used. Kinetic parameters (Km (mM), kcat (min -1 ), Vmax (U mg -1 )) were calculated using GraphPad Prism 7 (GraphPad software). The change in the reaction rate of the mutant to the substrate was considered by enzyme kinetics.
GSAI変異体の作製
活性中心付近の塩基配列にランダムに変異を導入するため、Diversify（登録商標） PCR Random Mutagenesis Kit（Clontech Laboratories, Inc.）を用いたエラープローンPCRを行い、変異を導入した。
Preparation of GSAI Mutant In order to introduce a mutation randomly into the nucleotide sequence near the active center, error-prone PCR was performed using Diversify (registered trademark) PCR Random Mutagenesis Kit (Clontech Laboratories, Inc.) to introduce the mutation.
エラープローンPCRは活性中心付近の領域を2つ、すなわち残基17〜129と残基186〜448に分けて行った。プライマーセットは、残基17〜129には、F: TTTGGTTTGTAACGGGAAGC（配列番号11）及びR: AATCCGTATTCCCGGTCACC（配列番号12）を用い、残基186〜448には、F: TGGCTCGTTTTGGCGACAAC（配列番号13）及びR: ACCGCAAATGAGAAGCACGT（配列番号14）を用いた。得られたPCR断片はメガプライマーとして用い、GSAIの変異体H18Tが組み込まれたpET15b-H18Tプラスミドを鋳型にしてPCRを行うことにより、ランダムに変異が導入されたPCR断片をGSAI発現ベクターに組み込んだ。 Error-prone PCR was performed by dividing the region near the active center into two regions: residues 17 to 129 and residues 186 to 448. The primer set used F: TTTGGTTTGTAACGGGAAGC (SEQ ID NO: 11) and R: AATCCGTATTCCCGGTCACC (SEQ ID NO: 12) for residues 17 to 129, and F: TGGCTCGTTTTGGCGACAAC (SEQ ID NO: 13) and R for residues 186 to 448. : ACCGCAAATGAGAAGCACGT (SEQ ID NO: 14) was used. The obtained PCR fragment was used as a megaprimer, and PCR was performed using the pET15b-H18T plasmid in which the GSAI mutant H18T was incorporated as a template, whereby the PCR fragment into which the mutation was randomly introduced was incorporated into the GSAI expression vector. .
変異を導入したGSAI発現ベクターを、上記「候補アミノ酸の変異導入と発現」において記載したのと同様の方法で大腸菌に導入し、優良変異体を選抜した。ただし、反応溶液中のバッファーとしては50 mM Tris-HClバッファー(pH 8.0)ではなく50 mM McIlvaineバッファー(pH 6.0)を用い、生成したD-タガトース量を算出した。また、残存活性は、D-ガラクトースをD−タガトースに変換する活性を測定した。 The GSAI expression vector into which the mutation was introduced was introduced into Escherichia coli in the same manner as described in “Mutation and Expression of Candidate Amino Acids”, and excellent mutants were selected. However, as a buffer in the reaction solution, a 50 mM McIlvaine buffer (pH 6.0) was used instead of a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), and the amount of generated D-tagatose was calculated. The residual activity was measured for the activity of converting D-galactose to D-tagatose.
作製した変異体の至適pHの測定
様々なpH下での活性を測定するために、pH5.0から8.0で野生型、H18TY234C変異体、及びH18T変異体の活性を測定した。pH5.0からpH6.5では50mM McIlvaine bufferを用い、pH6.5からpH8.0では50mM Tris-HCl bufferを用いた。活性測定には上記アラビノースイソメラーゼ5μgと基質D-ガラクトースを用い、60℃で上記方法を用い測定した。
Measurement of optimal pH of the prepared mutants In order to measure the activity under various pH, the activities of the wild type, H18TY234C mutant, and H18T mutant were measured at pH 5.0 to 8.0. From pH 5.0 to pH 6.5, 50 mM McIlvaine buffer was used, and from pH 6.5 to pH 8.0, 50 mM Tris-HCl buffer was used. The activity was measured at 60 ° C. using the above method using 5 μg of the above arabinose isomerase and the substrate D-galactose.
（結果）
配列番号1のアミノ酸配列の18位のHisがThrに変異したH18T変異体、及び18位のHisがSerに変異したH18S変異体を獲得した。図2に、配列番号1のアミノ酸配列の18位のHisをThrに置換したH18T変異体、及び18位のHisをSerに置換したH18S変異体の、L-アラビノース及びD-ガラクトースに対する相対活性を示す。図2に示される通り、H18T及びH18S変異体は、野生型酵素（WT）と比較して、アラビノースに対する比活性は同様であったが、ガラクトースに対する比活性が約1.4倍上昇していた。
(result)
An H18T mutant in which His at position 18 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was mutated to Thr and an H18S mutant in which His at position 18 was mutated to Ser were obtained. In FIG. 2, the relative activity of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 for the H18T mutant in which His at position 18 was substituted with Thr, and the H18S mutant in which His at position 18 was substituted for Ser was L-arabinose and D-galactose. Show. As shown in FIG. 2, the H18T and H18S mutants had the same specific activity to arabinose as compared to the wild-type enzyme (WT), but increased the specific activity to galactose by about 1.4 times.
図3に、H18T変異体及びH18S変異体の各温度におけるD-ガラクトースに対する比活性（A）及び相対活性（B）を示す。図3に示される通り、H18T及びH18S変異体の熱安定性については、野生型酵素とほぼ同様であった。 FIG. 3 shows the specific activity (A) and relative activity (B) for D-galactose at each temperature of the H18T mutant and the H18S mutant. As shown in FIG. 3, the heat stability of the H18T and H18S mutants was almost the same as the wild-type enzyme.
表1に、ホウ酸の存在下又は非存在下でのガラクトースを基質として用いた際の比活性等の値を示す。また、図4に、ガラクトースを基質として用いた際の、野生型酵素及びH18T変異体のホウ酸の存在下又は非存在下での反応速度を示す。 Table 1 shows the values of specific activity and the like when galactose was used as a substrate in the presence or absence of boric acid. FIG. 4 shows the reaction rates of the wild-type enzyme and the H18T mutant in the presence or absence of boric acid when galactose was used as a substrate.
表1及び図4に示される通り、H18T変異体では、ホウ酸の添加により反応速度が野生型酵素と比べて顕著に上昇していた。これは、H18T変異体がホウ酸の存在下で野生型酵素より反応速度が特に優れていることを示している。 As shown in Table 1 and FIG. 4, in the H18T mutant, the addition of boric acid significantly increased the reaction rate as compared to the wild-type enzyme. This indicates that the H18T mutant is particularly superior in reaction rate to the wild-type enzyme in the presence of boric acid.
続いて、配列番号1のアミノ酸配列の18位のHisがThrに変異したH18T変異体に基づいて、さらに234位のTyrがCysに変異したH18TY234C変異体、386位のGluがLysに変異したH18TE386K変異体、及び320位のLysがThrに変異したH18TK320T変異体を作製し、比活性を測定した。図5に、H18TY234C、H18TE386K、及びH18TK320T変異体の、pH6.0における比活性を示す。図5に示される通り、H18TY234C、H18TE386K、及びH18TK320T変異体は、pH6.0中において、野生型酵素と比較して、比活性がそれぞれ約2.9、1.6、1.3倍上昇していた。また、pH6.0、70℃で1時間処理後の残存活性はそれぞれ約81%、60%、及び30％であり（データ示さず）、特にH18TY234Cは変異導入後でも熱安定性を維持していた。 Subsequently, based on the H18T mutant in which His at position 18 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was mutated to Thr, a H18TY234C mutant in which Tyr at position 234 was mutated to Cys, and H18TE386K in which Glu at position 386 was mutated to Lys Mutants and H18TK320T mutants in which Lys at position 320 was mutated to Thr were prepared and their specific activities were measured. FIG. 5 shows the specific activities of the H18TY234C, H18TE386K, and H18TK320T mutants at pH 6.0. As shown in FIG. 5, the H18TY234C, H18TE386K, and H18TK320T mutants had about 2.9, 1.6, and 1.3-fold increase in specific activity compared to the wild-type enzyme at pH 6.0. The residual activities after treatment at pH 6.0 and 70 ° C for 1 hour were about 81%, 60%, and 30%, respectively (data not shown). In particular, H18TY234C maintained thermal stability even after mutagenesis. Was.
次にさらに広い範囲のpH中での比活性を測定した。図6に、H18TY234C変異体、H18T変異体、及び野生型の様々なpHにおける比活性を示す。図6に示す通り、H18TY234C変異体の至適pHの範囲域は野生型やH18Tと比べ広くなり、pH7.5での比活性が野生型と比較して約2倍であるのに対し、pH6.0での比活性は約3倍に上昇した。 Next, the specific activity in a wider range of pH was measured. FIG. 6 shows the specific activities of the H18TY234C mutant, the H18T mutant, and the wild type at various pHs. As shown in FIG. 6, the optimal pH range of the H18TY234C mutant is wider than that of the wild-type or H18T, and the specific activity at pH 7.5 is about twice as large as that of the wild-type. The specific activity at .0 increased about 3-fold.
本発明により、野生型アラビノースイソメラーゼに比べて、ガラクトースに対するイソメラーゼ活性が増加したアラビノースイソメラーゼ変異体が提供される。当該変異体により、効率的にタガトースを生産することが可能となる。タガトースは、医療食やダイエット食、健康食等様々な食品への応用が期待されていることから、本発明の産業上の利用可能性は高い。 According to the present invention, an arabinose isomerase mutant having an increased isomerase activity on galactose as compared to wild-type arabinose isomerase is provided. The mutant enables efficient production of tagatose. Tagatose is expected to be applied to various foods such as medical foods, diet foods, and health foods, and thus has high industrial applicability of the present invention.
Claims (13)
配列番号1の450位に対応する位置にセリン、及び
配列番号1の475位に対応する位置にリシン、
の少なくとも一つ以上をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体。 Asparagine at a position corresponding to position 280 of SEQ ID NO: 1,
Serine at a position corresponding to position 450 of SEQ ID NO: 1, and lysine at a position corresponding to position 475 of SEQ ID NO: 1,
The mutant according to any one of claims 1 to 3, further comprising at least one of the following.
（ｉ）配列番号1のアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号1のアミノ酸配列において、18位以外の位置において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列、及び
（ｉｉｉ）配列番号1のアミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異体。 An amino acid sequence in which the mutant is selected from the group consisting of the following (i) to (iii):
(I) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
(Ii) an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added at a position other than position 18 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and (iii) 90% of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence having the above sequence identity,
The mutant according to any one of claims 1 to 5, comprising:
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| BIOTECHNOLOGY LETTERS, vol. 28, JPN6023022558, 2006, pages 145 - 149, ISSN: 0005076075 * |
| JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSISB:ENZYMATIC, vol. 43, JPN6023022564, 2006, pages 108 - 112, ISSN: 0005076074 * |
| JOURNAL OFAPPLIED MICROBIOLOGY, vol. 101, JPN6023022561, 2006, pages 213 - 221, ISSN: 0005076072 * |
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