JP2020029411A

JP2020029411A - Anti-dehydroepiandrosterone sulfate antibody

Info

Publication number: JP2020029411A
Application number: JP2018154905A
Authority: JP
Inventors: 龍司小林; Ryuji Kobayashi
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2018-08-21
Filing date: 2018-08-21
Publication date: 2020-02-27

Abstract

To provide antibodies showing high reactivity with dehydroepiandrosterone sulfate.SOLUTION: Provided is an antibody characterized by having high reactivity with dehydroepiandrosterone sulfate.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、抗デヒドロエピアンドロステロンサルフェート抗体に関するものである。 The present invention relates to anti-dehydroepiandrosterone sulfate antibodies.

デヒドロエピアンドロステロンサルフェート（ＤＨＥＡ−Ｓ）は主に副腎皮質から分泌されるステロイドホルモンの一種として知られている。そしてこのホルモンは、副腎皮質に疾患があると異常な血中濃度を示すことが分かっている。そのためＤＨＥＡ―Ｓは、各種副腎皮質疾患の診断マーカーとして利用されている。 Dehydroepiandrosterone sulfate (DHEA-S) is known as a type of steroid hormone secreted mainly from the adrenal cortex. It has been found that this hormone shows abnormal blood levels when there is a disease in the adrenal cortex. Therefore, DHEA-S is used as a diagnostic marker for various adrenal cortical diseases.

ＤＨＥＡ−Ｓの血中濃度測定では通常、抗ＤＨＥＡ−Ｓ抗体を用いた競合法が利用されている。この方法ではまず、固相化された抗ＤＨＥＡ−Ｓ抗体をアルカリホスファターゼなどの酵素で標識されたＤＨＥＡ−Ｓ（以下、標識ＤＨＥＡ−Ｓ）と検体との混合物に加え反応させる。そして、その後これを洗浄し、固相に結合している標識ＤＨＥＡ−Ｓから出るシグナルを測定する。検体中のＤＨＥＡ−Ｓ濃度が低い時には多くの標識ＤＨＥＡ−Ｓが固相に結合して強いシグナルが出る。しかし、血中ＤＨＥＡ−Ｓ濃度が高くなると固相に結合する標識ＤＨＥＡ−Ｓが減り、弱いシグナルとなる。このシグナル変化の割合を調べることにより、血中のＤＨＥＡ−Ｓ濃度を求めることができる（図１）。 In the measurement of blood concentration of DHEA-S, a competition method using an anti-DHEA-S antibody is usually used. In this method, first, an immobilized anti-DHEA-S antibody is added to a mixture of a specimen and DHEA-S (hereinafter, labeled DHEA-S) labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase and reacted. Then, this is washed, and a signal emitted from the labeled DHEA-S bound to the solid phase is measured. When the DHEA-S concentration in the sample is low, many labeled DHEA-Ss bind to the solid phase and a strong signal is emitted. However, when the blood DHEA-S concentration increases, the amount of labeled DHEA-S bound to the solid phase decreases, resulting in a weak signal. By examining the rate of this signal change, the DHEA-S concentration in blood can be determined (FIG. 1).

以上のようなＤＨＥＡ−Ｓ測定系を構築するためには、抗ＤＨＥＡ−Ｓ抗体が必要となる。しかし現在までに報告されている抗ＤＨＥＡ−Ｓ抗体は抗原との反応性が低く、高感度な測定系を構築する上で大きな課題となっていた。 In order to construct a DHEA-S measurement system as described above, an anti-DHEA-S antibody is required. However, the anti-DHEA-S antibodies reported to date have low reactivity with antigens, and have been a major problem in constructing a highly sensitive measurement system.

本発明の課題は、デヒドロエピアンドロステロンサルフェートとの高い反応性を示す抗体を提供することである。 It is an object of the present invention to provide an antibody that shows high reactivity with dehydroepiandrosterone sulfate.

本発明に係る抗体は、デヒドロエピアンドロステロンサルフェートとの高い反応性があることを特徴とする。 The antibody according to the present invention is characterized by having high reactivity with dehydroepiandrosterone sulfate.

また、本発明に係る抗体の一態様においては、配列番号３に記載のＨ鎖配列が含まれる。 One embodiment of the antibody according to the present invention includes the H chain sequence set forth in SEQ ID NO: 3.

また、本発明に係る抗体の一態様においては、配列番号４に記載のＬ鎖配列が含まれる。 Further, one embodiment of the antibody according to the present invention includes the L chain sequence set forth in SEQ ID NO: 4.

また、本発明に係る抗体の一態様においては、配列番号５に記載のＬ鎖配列が含まれる。 One embodiment of the antibody according to the present invention includes the L chain sequence set forth in SEQ ID NO: 5.

また、本発明に係る抗体の一態様においては、配列番号３に記載のＨ鎖配列と配列番号４に記載のＬ鎖配列が含まれる。 One embodiment of the antibody according to the present invention includes the H chain sequence described in SEQ ID NO: 3 and the L chain sequence described in SEQ ID NO: 4.

また、本発明に係る抗体の一態様においては、配列番号３に記載のＨ鎖配列と配列番号５に記載のＬ鎖配列が含まれる。 One embodiment of the antibody according to the present invention includes the H chain sequence described in SEQ ID NO: 3 and the L chain sequence described in SEQ ID NO: 5.

本発明によれば、高感度なＤＨＥＡ−Ｓ測定系を構築できる。 According to the present invention, a highly sensitive DHEA-S measurement system can be constructed.

競合法によるＤＨＥＡ−Ｓ測定の原理図である。It is a principle diagram of DHEA-S measurement by a competition method. Ｈ鎖変異体１の検量線を示した図である。FIG. 3 is a diagram showing a calibration curve of H chain mutant 1. Ｌ鎖変異体１の検量線を示した図である。FIG. 3 is a diagram showing a calibration curve of L chain mutant 1. Ｈ鎖変異体１とＬ鎖変異体１を掛け合わせた変異体の検量線を示した図である。FIG. 3 is a diagram showing a calibration curve of a mutant obtained by multiplying H chain mutant 1 and L chain mutant 1. Ｈ鎖変異体１とＬ鎖変異体２を掛け合わせた変異体の検量線を示した図である。FIG. 3 is a diagram showing a calibration curve of a mutant obtained by multiplying H chain mutant 1 and L chain mutant 2. 各変異体の抗原検出感度の比較を示した図である。FIG. 4 is a diagram showing a comparison of antigen detection sensitivity of each mutant.

本発明の抗体は、デヒドロエピアンドロステロンサルフェート（ＤＨＥＡ−Ｓ）との高い反応性があることを特徴とする。以下、本発明の一実施形態について説明する。 The antibody of the present invention is characterized by having high reactivity with dehydroepiandrosterone sulfate (DHEA-S). Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described.

本発明の抗体としては、例えば、配列番号３に記載のＨ鎖配列が含まれる抗体、配列番号４に記載のＬ鎖配列が含まれる抗体、配列番号５に記載のＬ鎖配列が含まれる抗体、配列番号３に記載のＨ鎖配列と配列番号４に記載のＬ鎖配列が含まれる抗体、配列番号３に記載のＨ鎖配列と配列番号５に記載のＬ鎖配列が含まれる抗体が挙げられる。 Examples of the antibody of the present invention include an antibody containing the H chain sequence of SEQ ID NO: 3, an antibody containing the L chain sequence of SEQ ID NO: 4, and an antibody containing the L chain sequence of SEQ ID NO: 5. An antibody comprising the H chain sequence of SEQ ID NO: 3 and the L chain sequence of SEQ ID NO: 4, and an antibody comprising the H chain sequence of SEQ ID NO: 3 and the L chain sequence of SEQ ID NO: 5. Can be

本発明の抗体は、ＤＨＥＡ−Ｓとの反応性があれば特にその由来が限定されるものではなく、マウス、ラット、ヒト、ラクダ、ウサギ、魚類などに由来する抗体を利用することができ、ＤＨＥＡ−Ｓとの反応性があれば特にその由来が限定されるものではなく、マウス、ラット、ヒト、ラクダ、ウサギ、魚類などに由来する抗体を利用することができる。 The origin of the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it has reactivity with DHEA-S, and an antibody derived from mouse, rat, human, camel, rabbit, fish and the like can be used, The origin of DHEA-S is not particularly limited as long as it has reactivity with DHEA-S. Antibodies derived from mice, rats, humans, camels, rabbits, fish, and the like can be used.

さらに、本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、２重特異性抗体のいずれであってもよく、これらの抗体の混合物であってもよく、融合タンパク質の形態をとっていても構わない。 Furthermore, the antibody of the present invention may be any of a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, and a bispecific antibody, may be a mixture of these antibodies, or may be in the form of a fusion protein.

本発明の抗体と融合される化合物に関しては特にその種類が限定されるわけではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、アビジン、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ホーセラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼなどのタンパク質分子、ＨｉｓタグやＦｌａｇタグやｃＭｙｃタグなどのペプチドタグを融合させることも可能である。 The type of the compound fused with the antibody of the present invention is not particularly limited, but a fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP), glutathione-S-transferase (GST), avidin, alkaline phosphatase (ALP) It is also possible to fuse protein molecules such as horseradish peroxidase (HRP) and luciferase, and peptide tags such as His tag, Flag tag and cMyc tag.

以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。 Examples will be shown below, and the embodiments of the present invention will be described in more detail. Of course, the present invention is not limited to the following examples, and it goes without saying that various aspects are possible in detail. Furthermore, the present invention is not limited to the above-described embodiments, and various changes can be made within the scope shown in the claims, and embodiments obtained by appropriately combining the disclosed technical means are also described. Included in the technical scope of the invention. In addition, all of the documents described in this specification are incorporated by reference.

本実施例に使用した薬品の組成及びｐＨは以下に示す通りである。
炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）
１２ｍＭ炭酸ナトリウム
３８ｍＭ炭酸水素ナトリウム
洗浄緩衝液（ｐＨ７．４）
１ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン
７．５ｍＭ塩化ナトリウム
０．０５％ｔｗｅｅｎ２０
ブロッキング緩衝液（ｐＨ７．５）
８．１ｍＭりん酸水素二ナトリウム・１２水和物
１．５ｍＭりん酸水素カリウム
１３７ｍＭ塩化ナトリウム
２．７ｍＭ塩化カリウム
１％スキムミルク
インキュベーション緩衝液（ｐＨ７．５）
８．１ｍＭりん酸水素二ナトリウム・１２水和物
１．５ｍＭりん酸水素カリウム
１３７ｍＭ塩化ナトリウム
２．７ｍＭ塩化カリウム
０．１％スキムミルク
ＡＬＰ緩衝液（ｐＨ９．８）
１Ｍジエタノールアミン
０．５ｍＭ塩化マグネシウム
１０ｍＭ４−メチルウンベリフェリルリン酸 The composition and pH of the chemical used in this example are as shown below.
Carbonate buffer (pH 9.6)
12 mM sodium carbonate 38 mM sodium bicarbonate wash buffer (pH 7.4)
1 mM Tris (hydroxymethyl) -aminomethane 7.5 mM sodium chloride 0.05% tween 20
Blocking buffer (pH 7.5)
8.1 mM disodium hydrogen phosphate dodecahydrate 1.5 mM potassium hydrogen phosphate 137 mM sodium chloride 2.7 mM potassium chloride 1% skim milk incubation buffer (pH 7.5)
8.1 mM disodium hydrogen phosphate dodecahydrate 1.5 mM potassium hydrogen phosphate 137 mM sodium chloride 2.7 mM potassium chloride 0.1% skim milk ALP buffer (pH 9.8)
1M diethanolamine 0.5mM magnesium chloride 10mM 4-methylumbelliferyl phosphate

（１）抗原溶液の調製
ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡ）を１００ｍｇ量り取り、１０ｍｌの５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）へ溶かした。次にリンカーが導入されているＤＨＥＡ−Ｓを１４ｍｇ量り取り、２００μｌのジメチルホルムアミドヘ溶かした。その後、このＤＨＥＡ−Ｓ溶液をＢＳＡ溶液へ加え、室温で３０分反応させた。そして、この反応液を透析チューブの中へ入れてからＰＢＳ溶液に対して透析し、未反応のＤＨＥＡ−Ｓを除去した。透析後は透析チューブの中からＤＨＥＡ−Ｓで標識されたＢＳＡを回収し、免疫用の抗原として利用した。 (1) Preparation of antigen solution 100 mg of bovine serum albumin (hereinafter, BSA) was weighed and dissolved in 10 ml of 50 mM borate buffer (pH 8.5). Next, 14 mg of DHEA-S into which the linker had been introduced was weighed and dissolved in 200 μl of dimethylformamide. Then, this DHEA-S solution was added to the BSA solution and reacted at room temperature for 30 minutes. Then, the reaction solution was put into a dialysis tube, and then dialyzed against a PBS solution to remove unreacted DHEA-S. After dialysis, BSA labeled with DHEA-S was recovered from the dialysis tube and used as an antigen for immunization.

（２）実験動物への免疫
免疫動物としてマウス（雌、ＢＡＬＢ／ｃ、４週齢）を用意した。次に、１ｍｇ／ｍｌの抗原溶液とフロイントコンプリートアジュバンドの１：１混合溶液を調製した。そして、この混合液を氷上で超音波にかけ、乳化させた。その後、この溶液を用意してあるマウスの腹腔へ１００μｌずつ注入し、免疫した。
初回の免疫を行った１週間後、フロイントインコンプリートアジュバンドで上述の乳化混合溶液を作成し、マウスの腹腔へ１００μｌずつ注入して再度免疫した。そして２回目の免疫以降はこの免疫作業を１週間おきに３か月間繰り返し行った。 (2) Immunization to experimental animals Mice (female, BALB / c, 4 weeks old) were prepared as immunized animals. Next, a 1: 1 mixed solution of a 1 mg / ml antigen solution and Freund's complete adjuvant was prepared. Then, the mixture was subjected to ultrasonic waves on ice to emulsify the mixture. Thereafter, 100 μl of this solution was injected into the abdominal cavity of the prepared mouse for immunization.
One week after the first immunization, the above-mentioned emulsified mixed solution was prepared with Freund's complete adjuvant, and the mice were immunized again by injecting 100 μl into the peritoneal cavity of the mice. After the second immunization, this immunization was repeated every other week for three months.

（３）細胞融合
３か月間の免疫後、免疫したマウスから脾臓を摘出した。そして、ここからＢ細胞を単離し、ミエローマ細胞と混ぜて電気融合法により細胞融合させ、融合細胞を回収して融合細胞用培地（Ｅ−ＲＤＦ＋１０％ウシ血清＋５％ＢＭコンディムド＋ＨＡＴ）に懸濁し、１．１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう細胞密度を調整した。その後、この細胞懸濁液を３８４プレートへまき、３７℃、５％ＣＯ_２の環境で培養した。 (3) Cell fusion After immunization for 3 months, spleens were excised from the immunized mice. Then, B cells are isolated therefrom, mixed with myeloma cells and subjected to cell fusion by an electrofusion method, and the fused cells are collected and suspended in a medium for fused cells (E-RDF + 10% bovine serum + 5% BM condimed + HAT). The cell density was adjusted to be 1.1 × 10 ⁴ cells / ml. Then, this cell suspension was spread on a 384 plate and cultured at 37 ° C. in an environment of 5% CO ₂ .

（４）スクリーニング
融合細胞の培養後、培養上清中に分泌された抗体と抗原との反応性をＥＬＩＳＡ法によって下記の通り調べた。
（Ａ）抗マウス抗体を０．５μｇ／ｍｌとなるように炭酸緩衝液へ溶かし、この溶液をＥＬＩＳＡ用プレート（３８４ウェル）の各ウェルへ５０μｌずつ分注した。その後、このプレートを室温で１時間静置し、洗浄緩衝液で各ウェルを３回洗浄した。
（Ｂ）ブロッキング緩衝液を各ウェルに１００μｌずつ加えてから室温で１時間静置した。その後、各ウェルを洗浄緩衝液で１回洗浄した。
（Ｃ）インキュベーション緩衝液を各ウェルに５０μｌずつ加えた。
（Ｄ）培養上清を各ウェルに２μｌずつ加えてから室温で１時間静置した。その後、各ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。
（Ｅ）標識ＤＨＥＡ−Ｓを含むインキュベーション緩衝液を５０μｌずつ各ウェルに加え、室温で１時間静置した。その後、各ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。
（Ｆ）ＡＬＰ緩衝液を各ウェルに５０μｌ加え、３０分静置した。
（Ｇ）蛍光強度を測定し（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ３６０ｎｍ／Ｅｍｉｓｓｉｏｎ４６５ｎｍ）、抗原と反応性のある抗体が含まれるウェルを調べた。 (4) Screening After culturing the fused cells, the reactivity between the antibody secreted in the culture supernatant and the antigen was examined by ELISA as follows.
(A) The anti-mouse antibody was dissolved in a carbonate buffer at a concentration of 0.5 μg / ml, and this solution was dispensed at 50 μl to each well of an ELISA plate (384 wells). The plate was then left at room temperature for 1 hour and each well was washed three times with wash buffer.
(B) 100 μl of a blocking buffer was added to each well, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour. Thereafter, each well was washed once with wash buffer.
(C) 50 μl of incubation buffer was added to each well.
(D) 2 μl of the culture supernatant was added to each well, and then left at room temperature for 1 hour. Thereafter, each well was washed three times with wash buffer.
(E) 50 μl of an incubation buffer containing labeled DHEA-S was added to each well and left at room temperature for 1 hour. Thereafter, each well was washed three times with wash buffer.
(F) 50 μl of ALP buffer was added to each well, and the mixture was allowed to stand for 30 minutes.
(G) The fluorescence intensity was measured (Excitation 360 nm / Emission 465 nm), and the wells containing the antibody reactive with the antigen were examined.

（５）クローニング
スクリーニングにより、抗原と強く反応する抗体が含まれるウェルを同定した。このウェルから細胞を回収し、細胞培養用培地（Ｅ−ＲＤＦ＋１０％ウシ血清）に懸濁して３７℃、５％ＣＯ_２の環境で培養した。その後、細胞の生育が確認できたら下記の通り限界希釈を行い、細胞を単クローン化した。
（Ａ）回収した細胞を、６．４ｍｌの細胞培養用培地へ懸濁した。
（Ｂ）この細胞懸濁液を細胞培養用プレート（３８４ウェル）の各ウェルへ５０μｌずつ６４ウェル分だけ分注した。
（Ｃ）残された３．２ｍｌの細胞懸濁液に新たな細胞培養用培地を等量加え、よく懸濁した。
（Ｄ）この細胞懸濁液を細胞培養用プレート（３８４ウェル）の各ウェルへ５０μｌずつ６４ウェル分だけ分注した。
（Ｅ）ウェル中にある細胞数の期待値が１ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ以下となるまで上記の希釈・分注操作を繰り返した。
（Ｆ）細胞培養プレートを３７℃、５％ＣＯ_２の環境下におき、培養した。
（Ｇ）培養上清中に分泌された抗体と抗原との反応性をＥＬＩＳＡ法で調べた。なお、ＥＬＩＳＡの条件は、スクリーニングの際に行ったＥＬＩＳＡと全く同じ条件を用いた。
（Ｈ）抗原と強く反応する抗体が含まれるウェルの中から特に、ウェル中にある細胞数の期待値が１ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ以下となっているものだけを選抜した。そして、これらのウェルを顕微鏡で観察し、細胞が単クローン化されていることを確認した。その後、このウェルから細胞を回収した。 (5) Cloning A well containing an antibody that strongly reacted with the antigen was identified by screening. The cells were collected from the wells, suspended in a cell culture medium (E-RDF + 10% bovine serum), and cultured in an environment of 37 ° C. and 5% CO ₂ . Thereafter, when cell growth was confirmed, limiting dilution was performed as described below, and the cells were cloned.
(A) The collected cells were suspended in 6.4 ml of cell culture medium.
(B) This cell suspension was dispensed to each well of a cell culture plate (384 wells) by 50 μl for 64 wells.
(C) An equal amount of a fresh cell culture medium was added to the remaining 3.2 ml of the cell suspension, and the cells were well suspended.
(D) This cell suspension was dispensed to each well of a cell culture plate (384 wells) by 50 μl for 64 wells.
(E) The above dilution / dispensing operation was repeated until the expected value of the number of cells in the well became 1 cell / well or less.
(F) The cell culture plate was placed in an environment of 37 ° C. and 5% CO ₂ and cultured.
(G) The reactivity between the antibody secreted in the culture supernatant and the antigen was examined by ELISA. The conditions of the ELISA were exactly the same as those used in the screening.
(H) From wells containing antibodies that strongly react with the antigen, only those in which the expected value of the number of cells in the wells was 1 cell / well or less were selected. Then, these wells were observed under a microscope to confirm that the cells were cloned. Thereafter, cells were collected from this well.

（６）遺伝子配列の取得
ＲＮｅａｓｙＰｌｕｓＭｉｃｒｏｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、回収した細胞からｍＲＮＡを精製した。その後、このｍＲＮＡをテンプレートとし、ＳｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔＲＴｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。次に、このｃＤＮＡをテンプレートとし、抗体のＨ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子をＰＣＲ法でそれぞれ増幅させた。なお、この時行ったＰＣＲでは、ＭｏｕｓｅＩｇＧＬｉｂｒａｒｙＰｒｉｍｅｒＳｅｔ（ＰＲＯＧＥＮ社）をプライマーとして用いた。その後、このＰＣＲ産物の遺伝子配列を解析し、ＤＨＥＡ−Ｓと反応性のある抗体のＨ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子の全長配列を決定した。この時、Ｈ鎖配列は配列番号１、Ｌ鎖配列は配列番号２の通りであることが確認された。 (6) Acquisition of Gene Sequence mRNA was purified from the collected cells using RNeasy Plus Micro kit (QIAGEN). Thereafter, using this mRNA as a template, cDNA was synthesized using a Sensiscript RT kit (QIAGEN). Next, using this cDNA as a template, the H chain gene and the L chain gene of the antibody were each amplified by PCR. In the PCR performed at this time, Mouse IgG Library Primer Set (PROGEN) was used as a primer. Thereafter, the gene sequence of this PCR product was analyzed, and the full-length sequences of the H chain gene and the L chain gene of the antibody reactive with DHEA-S were determined. At this time, it was confirmed that the H chain sequence was as shown in SEQ ID NO: 1 and the L chain sequence was as in SEQ ID NO: 2.

（７）変異体の作成及び性能評価
配列番号１に記載のＨ鎖と配列番号２に記載のＬ鎖とを含む野生型抗体をベースとして変異体を複数デザインし、各変異体の発現ベクターを作成した。そして、このベクターをＣＯＳ細胞へ導入し、各変異体を一過性発現させた。各変異体を含むこの培養上清を用いてそれぞれその性能を以下の通り評価した。
初めに、アルカリホスファターゼ（以下、ＡＬＰ）で標識されたＤＨＥＡ−Ｓ（以下、ＣＪ）を抗マウスＩｇＧ抗体固定化粒子へ一定量加えて混ぜた。次に、ＤＨＥＡ−Ｓ濃度が既知であるキャリブレーター溶液（Ｃａｌ１〜６）を用意し、ここにそれぞれ一定量加えた。更に変異体が含まれる溶液をここに一定量加え、１０分間インキュベーションした。その後Ｂ／Ｆ分離を行なってからＡＬＰの基質を加え、固相に結合しているＣＪから発せられるシグナルを検出した。そしてＤＨＥＡ−Ｓが全く含まれないキャリブレーター溶液（Ｃａｌ１）を加えた時のシグナル（Ｂ０）を１００％として、各キャリブレーター溶液（Ｃａｌ２〜６）を加えた時のシグナル（Ｂ）をそれぞれ相対的な値［（Ｂ／Ｂ０）×１００］として算出した。ＤＨＥＡ−Ｓ濃度を横軸（対数）、Ｂ／Ｂ０（％）を縦軸にとり、各キャリブレーター溶液使用時の測定結果をプロットして検量線を作成した。そして（Ｂ／Ｂ０）×１００＝５０％となる時のキャリブレーター濃度（Ｃ_５０）を指標とし、各変異体の抗原検出感度を定量的に評価した（この値が小さいほど、抗原検出感度が高いことを意味している）。なお、この一連の操作は東ソー社製ＡＩＡ−６００ＩＩを用いて３７℃にて全自動で行った。以上の方法で各変異体の抗原検出感度を評価したところ、野生型抗体よりも抗原検出感度が高くなっている変異体を見つけることができた（図２−図６）。 (7) Preparation of mutants and evaluation of performance A plurality of mutants were designed based on a wild-type antibody containing the H chain of SEQ ID NO: 1 and the L chain of SEQ ID NO: 2, and the expression vector of each mutant was determined. Created. Then, this vector was introduced into COS cells, and each mutant was transiently expressed. Using the culture supernatant containing each mutant, its performance was evaluated as follows.
First, a certain amount of DHEA-S (hereinafter, CJ) labeled with alkaline phosphatase (hereinafter, ALP) was added to the anti-mouse IgG antibody-immobilized particles and mixed. Next, calibrator solutions (Cal1 to Cal6) having known DHEA-S concentrations were prepared, and fixed amounts were respectively added thereto. Further, a fixed amount of a solution containing the mutant was added thereto, and the mixture was incubated for 10 minutes. Then, after performing B / F separation, an ALP substrate was added, and a signal emitted from the CJ bound to the solid phase was detected. The signal (B0) when the calibrator solution (Cal1) containing no DHEA-S was added was defined as 100%, and the signal (B) when each calibrator solution (Cal2 to 6) was added was relative to each other. It was calculated as the value [(B / B0) × 100]. The DHEA-S concentration was plotted on the horizontal axis (logarithm) and B / B0 (%) was plotted on the vertical axis, and the measurement results when each calibrator solution was used were plotted to create a calibration curve. Using the calibrator concentration (C ₅₀ ) when (B / B0) × 100 = 50% as an index, the antigen detection sensitivity of each mutant was quantitatively evaluated (the smaller this value, the higher the antigen detection sensitivity). That means). This series of operations was performed automatically at 37 ° C. using AIA-600II manufactured by Tosoh Corporation. When the antigen detection sensitivity of each mutant was evaluated by the above method, mutants having higher antigen detection sensitivity than the wild-type antibody could be found (FIGS. 2 to 6).

Claims

An antibody characterized by having high reactivity with dehydroepiandrosterone sulfate.

The antibody according to claim 1, wherein the antibody comprises the H chain sequence set forth in SEQ ID NO: 3.

The antibody according to claim 1, wherein the antibody comprises the L chain sequence of SEQ ID NO: 4.

The antibody according to claim 1, comprising the L chain sequence of SEQ ID NO: 5.

The antibody according to claim 1, wherein the antibody comprises the H chain sequence described in SEQ ID NO: 3 and the L chain sequence described in SEQ ID NO: 4.

The antibody according to claim 1, wherein the antibody comprises the H chain sequence described in SEQ ID NO: 3 and the L chain sequence described in SEQ ID NO: 5.