JP2020028277A - Method for detecting glycosaminoglycan degrading enzyme, or inhibitory substance of the same - Google Patents
Method for detecting glycosaminoglycan degrading enzyme, or inhibitory substance of the same Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020028277A JP2020028277A JP2018157686A JP2018157686A JP2020028277A JP 2020028277 A JP2020028277 A JP 2020028277A JP 2018157686 A JP2018157686 A JP 2018157686A JP 2018157686 A JP2018157686 A JP 2018157686A JP 2020028277 A JP2020028277 A JP 2020028277A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gel
- enzyme
- glycosaminoglycan
- proteoglycan
- staining
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 96
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 96
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 title claims abstract description 93
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 title claims abstract description 36
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 38
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 47
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 28
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 claims description 25
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 claims description 25
- 210000002184 nasal cartilage Anatomy 0.000 claims description 20
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 20
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 20
- 239000000975 dye Substances 0.000 abstract description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 145
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 85
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 70
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 70
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 29
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 23
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 23
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 23
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 23
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical class FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 108010023736 Chondroitinases and Chondroitin Lyases Proteins 0.000 description 21
- 102000011413 Chondroitinases and Chondroitin Lyases Human genes 0.000 description 21
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 20
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 20
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 14
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 13
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 12
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 12
- 238000007805 zymography Methods 0.000 description 12
- -1 etc.) Proteins 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 10
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 10
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 9
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 9
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 9
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 9
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 7
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 7
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 6
- 108090000819 Chondroitin-sulfate-ABC endolyases Proteins 0.000 description 6
- 102000037716 Chondroitin-sulfate-ABC endolyases Human genes 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 6
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 5
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 4
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 4
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 229920002567 Chondroitin Polymers 0.000 description 3
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N chondroitin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@H](O)C=C(C(O)=O)O1 DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N 0.000 description 3
- KXKPYJOVDUMHGS-OSRGNVMNSA-N chondroitin sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(O)=O)O1 KXKPYJOVDUMHGS-OSRGNVMNSA-N 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 3
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 3
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 239000012557 regeneration buffer Substances 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 2-(2-cyanopropan-2-yldiazenyl)-2-methylpropanenitrile Chemical compound N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010022901 Heparin Lyase Proteins 0.000 description 2
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L dermatan sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C([O-])=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 150000002313 glycerolipids Chemical class 0.000 description 2
- 125000001976 hemiacetal group Chemical group 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N keratan Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@H]3[C@H]([C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H](O)[C@@H]3O)O)[C@H](NC(C)=O)[C@H]2O)COS(O)(=O)=O)O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@@H]1O KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 125000003696 stearoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- RYCNUMLMNKHWPZ-SNVBAGLBSA-N 1-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C RYCNUMLMNKHWPZ-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 1
- STMDPCBYJCIZOD-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-dinitroanilino)-4-methylpentanoic acid Chemical group CC(C)CC(C(O)=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O STMDPCBYJCIZOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- FNEHAOQZWPHONV-UHFFFAOYSA-N 9h-carbazole;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 FNEHAOQZWPHONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004342 Benzoyl peroxide Substances 0.000 description 1
- OMPJBNCRMGITSC-UHFFFAOYSA-N Benzoylperoxide Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OOC(=O)C1=CC=CC=C1 OMPJBNCRMGITSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 1
- 108010056731 Chondro-4-Sulfatase Proteins 0.000 description 1
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 241000723298 Dicentrarchus labrax Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BCUVLMCXSDWQQC-KCDKBNATSA-N Galactose 6-sulfate Chemical compound OS(=O)(=O)OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O BCUVLMCXSDWQQC-KCDKBNATSA-N 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100024025 Heparanase Human genes 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000288 Keratan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 241000277338 Oncorhynchus kisutch Species 0.000 description 1
- 241000277275 Oncorhynchus mykiss Species 0.000 description 1
- 241000277277 Oncorhynchus nerka Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241000588767 Proteus vulgaris Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000005937 allylation reaction Methods 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium peroxydisulfate Substances [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VAZSKTXWXKYQJF-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)OOS([O-])=O VAZSKTXWXKYQJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000981 basic dye Substances 0.000 description 1
- 235000019400 benzoyl peroxide Nutrition 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical compound N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 description 1
- 150000001783 ceramides Chemical class 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 150000001841 cholesterols Chemical class 0.000 description 1
- 108010048826 chondro-6-sulfatase Proteins 0.000 description 1
- 108010048429 chondroitinase B Proteins 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940051593 dermatan sulfate Drugs 0.000 description 1
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000012156 elution solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108010037536 heparanase Proteins 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 108010006406 heparinase II Proteins 0.000 description 1
- 108010083213 heparitinsulfate lyase Proteins 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-CLQWQSTFSA-N l-iduronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-CLQWQSTFSA-N 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 1
- 108700041430 link Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 150000004668 long chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- UOXRPRZMAROFPH-IESLQMLBSA-N lysophosphatidylinositol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)COP(O)(=O)OC1[C@H](O)[C@@H](O)C(O)[C@@H](O)[C@H]1O UOXRPRZMAROFPH-IESLQMLBSA-N 0.000 description 1
- 150000002759 monoacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- JRKICGRDRMAZLK-UHFFFAOYSA-L peroxydisulfate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O JRKICGRDRMAZLK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 229940007042 proteus vulgaris Drugs 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 239000012966 redox initiator Substances 0.000 description 1
- 238000009938 salting Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 150000003408 sphingolipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000005918 transglycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、グリコサミノグリカン分解酵素又はその阻害物質の検出方法、該検出方法に利用できるゲル、該検出方法のためのキットなどに関する。 The present invention relates to a method for detecting a glycosaminoglycan degrading enzyme or an inhibitor thereof, a gel that can be used for the detection method, a kit for the detection method, and the like.
ザイモグラフィー法は、検出対象酵素の基質を含有させた電気泳動用ゲルを、検出対象酵素又は被検試料（該酵素を含む可能性のある試料）とともに電気泳動し、次いでゲルをインキュベートし（つまり、酵素反応条件下で酵素反応させ）、次いでゲルを染色剤で処理して基質を染色することで、酵素分解産物の有無を確認する方法である。ザイモグラフィー用ゲルとしてカゼイン又はゼラチンを基質として含有したポリアクリルアミドゲルが、ＭＭＰ−９（マトリックスプロテアーゼ−９）等のプロテアーゼの検出用として汎用されている。ゼラチンを含有する電気泳動用ゲルにサンプルをロードして電気泳動し、ゲルを酵素反応条件下でインキュベーションした後、クマシーブルー等の染色液でゲルを染色する方法である。クマシーブルーはゼラチンと反応して青色を呈するところ、プロテアーゼが存在しているとゲル中のゼラチンが分解されるため青色に染色されない。したがって、青色に染色されない非着色部分についてプロテアーゼ活性を検出できる。 In the zymography method, an electrophoresis gel containing a substrate for an enzyme to be detected is electrophoresed together with the enzyme to be detected or a test sample (a sample that may contain the enzyme), and then the gel is incubated (ie, This is a method in which the presence or absence of enzymatic degradation products is confirmed by treating the gel with a stain and staining the substrate. As a gel for zymography, a polyacrylamide gel containing casein or gelatin as a substrate is widely used for detecting a protease such as MMP-9 (matrix protease-9). In this method, a sample is loaded on an electrophoresis gel containing gelatin, electrophoresed, the gel is incubated under enzyme reaction conditions, and then the gel is stained with a staining solution such as Coomassie blue. Coomassie blue reacts with gelatin to give a blue color. If protease is present, gelatin in the gel is decomposed, so that it does not stain blue. Therefore, protease activity can be detected in the non-colored portion that is not stained blue.
ザイモグラフィー法はグリコサミノグリカン分解酵素活性の検出にも応用が試みられている。例えば、コンドロイチン硫酸にエチレンジアミンを介してアリルグリシジルエーテルを結合させたコンドロイチン硫酸誘導体を合成し、この誘導体を含有させたポリアクリルアミドゲルにグリコサミノグリカン分解酵素の一種であるコンドロイチナーゼABCをロードして電気泳動し、次いで酵素反応条件下で該ゲルをインキュベートし、アルシアンブルーでゲルを染色し、非染色部分の存在に基づいてコンドロイチナーゼABC活性を検出する方法である（特許文献１）。この方法では、基質となるグリコサミノグリカン誘導体を調製するに際し、グリコサミノグリカンに対する還元処理、アミノ化処理及びアリル化処理を要するため、煩雑で且つ長時間（数日間）を要し、また、コストも高い。 The zymography method has also been applied to the detection of glycosaminoglycan degrading enzyme activity. For example, a chondroitin sulfate derivative in which allyl glycidyl ether is bonded to chondroitin sulfate via ethylenediamine is synthesized, and chondroitinase ABC, which is a kind of glycosaminoglycan degrading enzyme, is loaded on a polyacrylamide gel containing this derivative. And incubating the gel under enzyme reaction conditions, staining the gel with Alcian Blue, and detecting chondroitinase ABC activity based on the presence of the unstained portion (Patent Document 1). . In this method, when a glycosaminoglycan derivative to be used as a substrate is prepared, a reduction treatment, an amination treatment and an allylation treatment for the glycosaminoglycan are required, so that it is complicated and requires a long time (several days). , The cost is also high.
本発明は、簡便に、グリコサミノグリカン分解酵素を検出する方法、該酵素の阻害物質を検出する方法、これら検出に利用できるゲル、これら検出のためのキットなどを提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for simply detecting a glycosaminoglycan degrading enzyme, a method for detecting an inhibitor of the enzyme, a gel that can be used for the detection, a kit for the detection, and the like. .
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、グリコサミノグリカン複合体が電気泳動用ゲルに保持されて流出しないこと及びグリコサミノグリカン複合体を基質として用いることで上記の課題を解決しうることを見出し、本発明を完成させた。代表的な本発明は以下のとおりである。 The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems.As a result, the glycosaminoglycan complex is retained on the gel for electrophoresis and does not flow out, and the use of the glycosaminoglycan complex as a substrate allows It has been found that the above problem can be solved, and the present invention has been completed. A typical present invention is as follows.
項１．
被検試料中のグリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質を検出する方法であって、以下の工程：
（ａ）グリコサミノグリカン複合体を基質として含有した電気泳動用ゲルを被検試料存在下で電気泳動する工程、
（ｂ）電気泳動後のゲルをインキュベーションする工程、及び
（ｃ）インキュベーション後のゲルを染色剤で処理する工程
を含む方法。
項２．
グリコサミノグリカン複合体がプロテオグリカンである項１に記載の方法。
項３．
プロテオグリカンがサケ鼻軟骨プロテオグリカンである項２に記載の方法。
項４．
染色剤がアルシアンブルーである項１〜３のいずれかに記載の方法。
項５．
グリコサミノグリカン複合体を基質として含有する、電気泳動を使用してグリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質を検出するためのゲル。
項６．
グリコサミノグリカン複合体がプロテオグリカンである項５に記載のゲル。
項７．
プロテオグリカンがサケ鼻軟骨プロテオグリカンである項６に記載のゲル。
項８．
項５〜７のいずれかに記載のゲルを含む、グリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質の検出用キット。
Item 1.
A method for detecting a glycosaminoglycan degrading enzyme or an inhibitor of the enzyme in a test sample, comprising the following steps:
(A) electrophoresing an electrophoresis gel containing a glycosaminoglycan complex as a substrate in the presence of a test sample,
(B) a step of incubating the gel after electrophoresis, and (c) treating the gel after incubation with a stain.
Item 2.
Item 2. The method according to Item 1, wherein the glycosaminoglycan complex is a proteoglycan.
Item 3.
Item 3. The method according to Item 2, wherein the proteoglycan is salmon nasal cartilage proteoglycan.
Item 4.
Item 4. The method according to any one of Items 1 to 3, wherein the dye is Alcian Blue.
Item 5.
A gel containing a glycosaminoglycan complex as a substrate for detecting a glycosaminoglycan degrading enzyme or an inhibitor of the enzyme using electrophoresis.
Item 6.
Item 6. The gel according to Item 5, wherein the glycosaminoglycan complex is a proteoglycan.
Item 7.
Item 7. The gel according to Item 6, wherein the proteoglycan is salmon nasal cartilage proteoglycan.
Item 8.
Item 8. A kit for detecting a glycosaminoglycan degrading enzyme or an inhibitor of the enzyme, comprising the gel according to any one of Items 5 to 7.
本発明によれば、ザイモグラフィー法において、グリコサミノグリカン分解酵素又はその阻害物質を簡便に高感度で検出できる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, a glycosaminoglycan decomposing enzyme or its inhibitor can be detected simply and with high sensitivity in a zymography method.
以下、本発明のグリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質を検出する方法、電気泳動を使用してグリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質を検出するためのゲル、グリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質の検出用キットなどについて説明する。 Hereinafter, a method for detecting a glycosaminoglycan degrading enzyme or an inhibitor of the enzyme of the present invention, a gel for detecting a glycosaminoglycan degrading enzyme or an inhibitor of the enzyme using electrophoresis, glycosamino A glycan degrading enzyme or a kit for detecting an inhibitor of the enzyme will be described.
＜グリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質を検出する方法＞
本発明の一実施形態は、被検試料中のグリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質を検出する方法であって、以下の工程：
（ａ）グリコサミノグリカン複合体を基質として含有した電気泳動用ゲルを被検試料存在下で電気泳動する工程、
（ｂ）電気泳動後のゲルをインキュベーションする工程、及び
（ｃ）インキュベーション後のゲルを染色剤で処理する工程
を含む方法、である（以下、単に本発明の検出方法と称することがある）。
<Method for detecting glycosaminoglycan degrading enzyme or inhibitor of the enzyme>
One embodiment of the present invention is a method for detecting a glycosaminoglycan degrading enzyme or an inhibitor of the enzyme in a test sample, comprising the following steps:
(A) electrophoresing an electrophoresis gel containing a glycosaminoglycan complex as a substrate in the presence of a test sample,
(B) a step of incubating the gel after electrophoresis, and (c) a step of treating the gel after incubation with a staining agent (hereinafter sometimes simply referred to as the detection method of the present invention).
被検試料は、グリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質を含有する可能性のある試料である。グリコサミノグリカン分解酵素を含有する可能性のある試料としては、例えば、グリコサミノグリカン分解作用を有する微生物、該微生物を培養した培地、該微生物の菌体破砕物、生体由来試料などが挙げられるが、これらに限定されない。また、阻害物質を含有する可能性のある試料は、グリコサミノグリカン分解作用を有する又はこの作用を抑制する微生物、該微生物を培養した培地、該微生物の菌体破砕物、生体由来試料、合成品などが挙げられるが、これらに限定されない。被検試料は、ゲル化、電気泳動、酵素反応、染色処理等に適した形態とされてもよく、例えば水等の溶媒に溶解、懸濁、希釈等されてもよい。 The test sample is a sample that may contain a glycosaminoglycan degrading enzyme or an inhibitor of the enzyme. Examples of a sample that may contain a glycosaminoglycan degrading enzyme include, for example, a microorganism having a glycosaminoglycan degrading action, a medium in which the microorganism is cultured, a crushed cell of the microorganism, a biological sample, and the like. But not limited to these. In addition, a sample that may contain an inhibitor is a microorganism having or inhibiting the action of degrading glycosaminoglycan, a medium in which the microorganism is cultured, a crushed cell of the microorganism, a biologically derived sample, But are not limited to these. The test sample may be in a form suitable for gelation, electrophoresis, enzymatic reaction, staining, and the like, and may be dissolved, suspended, diluted, or the like in a solvent such as water.
本発明において検出対象はグリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質である。グリコサミノグリカン分解酵素は特に限定されないが、例えばコンドロイチナーゼ（コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼACI、コンドロイチナーゼACII、コンドロイチナーゼB、コンドロイチナーゼC、コンドロ-4-スルファターゼ、コンドロ-6-スルファターゼなど）、ヒアルロニダーゼ、ヘパリナーゼ（ヘパリナーゼI、ヘパリナーゼII、ヘパリナーゼIIIなど）、ヘパラナーゼなどが挙げられる。好ましくはコンドロイチナーゼ又はヒアルロニダーゼである。 In the present invention, the detection target is a glycosaminoglycan degrading enzyme or an inhibitor of the enzyme. Glycosaminoglycan degrading enzymes are not particularly limited. For example, chondroitinases (chondroitinase ABC, chondroitinase ACI, chondroitinase ACII, chondroitinase B, chondroitinase C, chondro-4-sulfatase, chondro- 6-sulfatase, etc.), hyaluronidase, heparinase (heparinase I, heparinase II, heparinase III, etc.), heparanase and the like. Preferably, it is chondroitinase or hyaluronidase.
グリコサミノグリカン分解酵素の阻害物質は特に限定されず、該酵素によるグリコサミノグリカンの分解を阻害するものであれば、生体由来の材料であっても、合成品であっても、微生物由来の材料であってもよい。 Inhibitors of the glycosaminoglycan degrading enzyme are not particularly limited, as long as they inhibit the degradation of glycosaminoglycan by the enzyme, even if it is a biologically-derived material, a synthetic product, or a microorganism-derived material. Material may be used.
本発明においてグリコサミノグリカン分解酵素の検出は、工程（ｃ）における染色処理において、染色された場合には酵素活性が検出されなかった、染色されなかった場合には酵素活性が検出された、と判断できる。したがって、被検試料が単一物質又はこれに近い場合は、酵素活性の検出によって該物質又は被検試料中で主体となっている物質が酵素であると判断でき、被検試料が複数物質の混合物である場合には、酵素活性の検出によって被検試料中に酵素の存在が確認される。 In the present invention, the glycosaminoglycan degrading enzyme is detected in the staining treatment in the step (c), when the enzyme activity is not detected when stained, or when the enzyme is not stained, Can be determined. Therefore, when the test sample is a single substance or close to this, it can be determined by enzyme activity detection that the substance or the substance mainly in the test sample is an enzyme, and the test sample is composed of multiple substances. In the case of a mixture, the presence of the enzyme in the test sample is confirmed by detecting the enzyme activity.
本発明においてグリコサミノグリカン分解酵素の阻害物質の検出は、工程（ｂ）において被検試料の存在下でゲルを酵素反応に供し、工程（ｃ）における染色処理において、染色された場合には該酵素の阻害活性が検出された、染色されなかった場合には該酵素の阻害活性が検出されなかった、と判断できる。したがって、被検試料が単一物質又はこれに近い場合は、阻害活性の検出によって該物質又は被検試料中で主体となっている物質が阻害物質であると判断でき、被検試料が複数物質の混合物である場合には、阻害活性の検出によって被検試料中に阻害物質の存在が確認される。 In the present invention, the detection of an inhibitor of glycosaminoglycan degrading enzyme is performed by subjecting the gel to an enzymatic reaction in the presence of a test sample in step (b), and staining the gel in the staining treatment in step (c). When the inhibitory activity of the enzyme was detected, and when the enzyme was not stained, it can be determined that the inhibitory activity of the enzyme was not detected. Therefore, when the test sample is a single substance or a substance close to this, it can be determined that the substance or a substance mainly in the test sample is an inhibitor by detecting the inhibitory activity, and the test sample is In the case of a mixture of the above, the presence of the inhibitor in the test sample is confirmed by detecting the inhibitory activity.
工程（ａ）では、グリコサミノグリカン複合体を基質として含有した電気泳動用ゲルを被検試料存在下で電気泳動する。 In the step (a), an electrophoresis gel containing a glycosaminoglycan complex as a substrate is electrophoresed in the presence of a test sample.
電気泳動用ゲルは、グリコサミノグリカン分解酵素の基質であるグリコサミノグリカン複合体を含有する。グリコサミノグリカン複合体はタンパク質又は脂質にグリコサミノグリカンが結合した複合体であり、例えばプロテオグリカン、脂質結合グリコサミノグリカンである。好ましくはプロテオグリカンである。 The gel for electrophoresis contains a glycosaminoglycan complex that is a substrate for glycosaminoglycan degrading enzymes. The glycosaminoglycan complex is a complex in which glycosaminoglycan is bound to a protein or lipid, for example, proteoglycan or lipid-bound glycosaminoglycan. Preferably, it is proteoglycan.
グリコサミノグリカン複合体を構成するグリコサミノグリカン（酸性ムコ多糖）は、Ｄ−グルコサミン又はＤ−ガラクトサミンと、Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−イズロン酸及び／又はＤ−ガラクトースの２糖の繰り返し単位を基本骨格として構成される多糖であり、動物等の天然物から抽出されたもの、微生物を培養して得られたもの、化学的若しくは酵素的に合成されたもの等のいずれも使用することができる。具体的には、例えばヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸（いわゆるコンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロイチン硫酸Ｋ等）、コンドロイチンポリ硫酸、デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂとも称される）、ヘパリン、ケラタン硫酸、ケラタンポリ硫酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、検出対象となるグリコサミノグリカン分解酵素に応じて適宜選択できる。例えば、コンドロイチナーゼを検出対象とするのであれば、コンドロイチン硫酸Ａ及び／又はコンドロイチン硫酸Ｃがグリコサミノグリカン複合体を構成するグリコサミノグリカンとして好ましい。これらのグリコサミノグリカンは通常使用される塩であってもよい。 The glycosaminoglycan (acid mucopolysaccharide) constituting the glycosaminoglycan complex is a repeating unit of disaccharide of D-glucosamine or D-galactosamine and D-glucuronic acid, L-iduronic acid and / or D-galactose. Is a polysaccharide composed as a basic skeleton, and any of those extracted from natural products such as animals, those obtained by culturing microorganisms, and those chemically or enzymatically synthesized can be used. it can. Specifically, for example, hyaluronic acid, chondroitin, chondroitin sulfate (so-called chondroitin sulfate A, chondroitin sulfate C, chondroitin sulfate E, chondroitin sulfate K, etc.), chondroitin polysulfate, dermatan sulfate (also called chondroitin sulfate B), heparin , Keratan sulfate and keratan polysulfate, but are not limited thereto, and can be appropriately selected according to the glycosaminoglycan degrading enzyme to be detected. For example, if chondroitinase is to be detected, chondroitin sulfate A and / or chondroitin sulfate C are preferable as glycosaminoglycans constituting a glycosaminoglycan complex. These glycosaminoglycans may be commonly used salts.
プロテオグリカンは、グリコサミノグリカン及びタンパク質が結合した構造を有する化合物である。グリコサミノグリカンは、２糖の繰り返し構造を有する酸性糖であり、通常、一方はアミノ糖であり、もう一方がウロン酸であることが知られている。そのため、プロテオグリカンの検出には、ウロン酸を検出するための常法の１つであるカルバゾール硫酸法（例えば特開２０１７−０６６０９７号公報に開示の方法）を用いることができる。 Proteoglycans are compounds having a structure in which glycosaminoglycans and proteins are bound. Glycosaminoglycan is an acidic sugar having a repeating disaccharide structure, and it is generally known that one is an amino sugar and the other is uronic acid. Therefore, for detection of proteoglycan, a carbazole sulfate method (for example, a method disclosed in JP-A-2017-066607), which is one of the conventional methods for detecting uronic acid, can be used.
また、タンパク質に櫛の歯状にグリコサミノグリカンが結合した化合物はプロテオグリカンモノマーとも呼ばれ、該プロテオグリカンモノマーにおけるタンパク質はコアタンパク質とも呼ばれる。特に、生体内では、プロテオグリカンモノマーがリンクタンパク質を介してヒアルロン酸と結合した会合体を形成していると考えられており、該会合体はプロテオグリカン集合体（proteoglycan aggregate）とも呼ばれる。なお、本明細書において、「プロテオグリカン」とは、プロテオグリカンモノマー及びプロテオグリカン集合体を包含する意味で用いられる。また、ヒアルロン酸はグリコサミノグリカンの一種である。 A compound in which glycosaminoglycan is bonded to a protein in a comb-like shape is also called a proteoglycan monomer, and the protein in the proteoglycan monomer is also called a core protein. In particular, in vivo, it is considered that a proteoglycan monomer forms an aggregate bound to hyaluronic acid via a link protein, and the aggregate is also called a proteoglycan aggregate. In the present specification, “proteoglycan” is used to mean a proteoglycan monomer and a proteoglycan aggregate. Hyaluronic acid is a type of glycosaminoglycan.
プロテオグリカンとしては、例えば、動物の軟骨（動物軟骨）由来のプロテオグリカン、糖鎖改変型プロテオグリカン、ウシ血清アルブミンにグリコサミノグリカンが結合した複合体などが挙げられ、好ましくは魚類の軟骨由来のプロテオグリカン（魚類軟骨プロテオグリカン）、より好ましくは魚類の頭部の軟骨由来のプロテオグリカン（魚類頭部軟骨プロテオグリカン）、より一層好ましくはサケの鼻の軟骨プロテオグリカン（サケ鼻軟骨プロテオグリカン）である。魚類としては、サケ科サケ属の魚が好ましく、具体的には、マス（カラフトマス、サクラマス、サツキマス等）、サケ（シロザケ、ベニザケ、ギンザケ、マスノスケ、スチールヘッド等）などが例示される。また、サメ、タラ等も用いることができる。これらの中でも、サケ又はマスが好ましい。また、軟骨としては特に制限されず、例えば、頭部軟骨を用いることができる。頭部軟骨の中では、特に、鼻軟骨が好ましい。また、通常、魚類（特に、サケやマス）が食品製品等へ加工される際に頭部は廃棄されることから、頭部軟骨の入手コストは安く、大量に安定供給され得るという利点もある。また、プロテオグリカンとしては、市販のプロテオグリカンを使用することもできる。 Examples of the proteoglycan include, for example, proteoglycan derived from animal cartilage (animal cartilage), sugar chain-modified proteoglycan, a complex in which glycosaminoglycan is bound to bovine serum albumin, and preferably proteoglycan derived from fish cartilage ( Fish cartilage proteoglycans), more preferably proteoglycans derived from cartilage of fish heads (fish head cartilage proteoglycans), and even more preferably salmon nasal cartilage proteoglycans (salmon nasal cartilage proteoglycans). As the fish, fish of the genus Salmonidae are preferred, and specific examples thereof include trout (such as white trout, salmon, and salmon), salmon (white salmon, sockeye salmon, coho salmon, chimney salmon, steelhead, and the like). Also, sharks, cod, and the like can be used. Among them, salmon or trout is preferred. The cartilage is not particularly limited, and for example, head cartilage can be used. Among the head cartilage, nasal cartilage is particularly preferable. In addition, since fish (especially salmon and trout) are usually discarded when the head is processed into food products or the like, there is an advantage that the cost of obtaining head cartilage is low and a large amount can be stably supplied. . In addition, a commercially available proteoglycan can be used as the proteoglycan.
プロテオグリカンの調製方法は公知であり、例えば特開２０１６−１６０２２６号公報、国際公開第２０１２／０９９２１６号、特開２００９−１７３７０２号公報、特開２００２−０６９０９７号公報などに記載の方法を参照して調製できる。例えば、サケ鼻軟骨プロテオグリカンは、ミンチにしたサケの鼻軟骨から溶出溶媒として酢酸を用いて粗プロテオグリカンを溶出した後、得られる溶出液を濾過してから遠心分離し、その上澄液に食塩飽和エタノールを加えて遠心分離することにより得られる粗プロテオグリカンを含む半固形沈殿物を酢酸に溶解し、次いで透析することにより分離精製することにより約２５０ｋＤａ〜４５０ｋＤａの分子量で調製できる。これとは別に、凍結させたサケの鼻軟骨を破砕し、これに水を加え、温度０℃〜２０℃、ｐＨ４．８〜７で処理する工程、得られた固液混合物を遠心分離し、最上部の脂質層と中間層の水層を取り除き、沈殿物を回収する工程、得られた沈殿物を乾燥し、微粉末化する工程、得られた乾燥微粉末に、溶媒としてエタノールを加え、残存脂質を抽出除去する工程、最後にエタノールを除去する工程を経てサケ鼻軟骨プロテオグリカンを調製してもよい。さらに、サケ鼻軟骨プロテオグリカンは、サケの鼻軟骨を凍結した後、１小片が０．００１〜０．５ｇとなるようにブレンダー等を用いて破砕し、８０℃以上、好ましくは１００℃の水中で、３時間より長い時間、好ましくは４時間加熱して抽出を行い、遠心分離（５０００ｒｐｍ、２０分。４℃）し、不溶物を取り除いて上清を回収し、これを凍結乾燥することにより製造することもできるが、これらに限定されるものではない。 Methods for preparing proteoglycans are known, for example, with reference to the methods described in JP-A-2006-160226, WO2012 / 099216, JP-A-2009-173702, JP-A-2002-069097 and the like. Can be prepared. For example, salmon nasal cartilage proteoglycan is obtained by eluting crude proteoglycan from minced salmon nasal cartilage using acetic acid as an elution solvent, filtering the resulting eluate, centrifuging the eluate, and salting the supernatant with salt saturation A semi-solid precipitate containing a crude proteoglycan obtained by adding ethanol and centrifuging is dissolved in acetic acid, and then separated and purified by dialysis to obtain a molecular weight of about 250 kDa to 450 kDa. Separately, a step of crushing frozen salmon nasal cartilage, adding water thereto, treating at a temperature of 0 ° C. to 20 ° C., and a pH of 4.8 to 7, centrifuging the obtained solid-liquid mixture, Removing the uppermost lipid layer and the aqueous layer of the intermediate layer, recovering the precipitate, drying the obtained precipitate, and pulverizing, and adding ethanol as a solvent to the obtained dry fine powder, Salmon nasal cartilage proteoglycan may be prepared through a step of extracting and removing residual lipids and finally a step of removing ethanol. Further, salmon nasal cartilage proteoglycan is obtained by freezing salmon nasal cartilage and then crushing using a blender or the like so that one piece becomes 0.001 to 0.5 g, in water at 80 ° C or higher, preferably 100 ° C. Extraction by heating for longer than 3 hours, preferably 4 hours, extraction, centrifugation (5000 rpm, 20 minutes, 4 ° C.) to remove insolubles, collect supernatant, and freeze-dry to produce However, the present invention is not limited thereto.
糖鎖改変型プロテオグリカンは、構成糖の一部または全部を欠損させること、糖転移反応によって欠損させた構成糖を新たな構成糖に置換して糖鎖を組み換えることや糖鎖に新たな構成糖を付加して糖鎖を伸長することなど、糖鎖の構成糖が人為的に欠損、置換、付加されたプロテオグリカンであり、特開２００９−２７８９０７号公報、K, Takagaki et al., Biochemistry, 33(21), 6503-6507, 1994.、H, Saitoh et al., J. Biol. Chem., 270, 3741-3747, 1995.などの記載に準じて調製することができる。 Sugar chain-modified proteoglycans are capable of partially or wholly deficient constituent sugars, substituting constituent sugars deficient by the transglycosylation reaction with new constituent sugars, recombining sugar chains, and adding new structures to sugar chains. Sugar chain constituent sugars are artificially deleted, substituted, and added proteoglycans, such as by adding sugars to extend sugar chains. Proteoglycans are described in JP-A-2009-278907, K, Takagaki et al., Biochemistry, 33 (21), 6503-6507, 1994., H, Saitoh et al., J. Biol. Chem., 270, 3741-3747, 1995.
ウシ血清アルブミンにグリコサミノグリカンが結合した複合体は、例えば、ウシ血清アルブミンにグリコサミノグリカンを結合させた合成型プロテオグリカンであり、The Journal of Biological Chemistry, 1989, vol 264, p8012-8018.に記載されているものを使用できる。 The complex in which glycosaminoglycan is bound to bovine serum albumin is, for example, a synthetic proteoglycan in which glycosaminoglycan is bound to bovine serum albumin.The Journal of Biological Chemistry, 1989, vol 264, p8012-8018. Can be used.
プロテオグリカンの分子量は、電気泳動中及び染色処理中にゲル内に保持されやすい点から、１００ｋＤａ以上が好ましく、５００ｋＤａ以上がより好ましく、また、ゲル作製時の溶解度や市販品の入手容易性の観点から、２５００ｋＤａ以下が好ましく、１５００ｋＤａ以下がより好ましく、１０００ｋＤａ以下がより好ましい。なお、プロテオグリカンの分子量は、特開２０１７−０６６０９７号公報に記載された「ウロン酸量クロマトグラム」を作成することにより確認する方法によって決定される値である。 The molecular weight of proteoglycan is preferably 100 kDa or more, more preferably 500 kDa or more, because it is easily retained in the gel during electrophoresis and staining, and from the viewpoint of solubility during gel preparation and availability of commercial products. 2500 kDa or less is preferable, 1500 kDa or less is more preferable, and 1000 kDa or less is more preferable. In addition, the molecular weight of proteoglycan is a value determined by a method of confirming by creating a "uronic acid amount chromatogram" described in JP-A-2017-0666097.
脂質結合グリコサミノグリカンは、例えばグリコサミノグリカンに脂質が結合した物質、好ましくはグリコサミノグリカンに脂質が化学的に結合した物質であり、例えば特開平４−０８０２０１号公報、特開平４−０８０２０２号公報、特開平９−０３０９７９号公報、特開２００３−３３５８０１号公報、特開２００４−１７０１９４号公報等に開示されている。本発明ではこれら開示の脂質結合グリコサミノグリカンを使用してもよい。 The lipid-bound glycosaminoglycan is, for example, a substance in which a lipid is bound to glycosaminoglycan, preferably a substance in which a lipid is chemically bound to glycosaminoglycan. For example, JP-A-4-080201, JP-A-4-080201 -080202, JP-A-9-030979, JP-A-2003-335801, JP-A-2004-170194, and the like. In the present invention, the lipid-bound glycosaminoglycans of these disclosures may be used.
また、グリコサミノグリカンに結合させる脂質としては、動物、植物、微生物等の天然物由来、又は化学的若しくは酵素的に合成若しくは部分的に分解された複合脂質又は単純脂質を使用することができ、リン脂質等のグリセロ脂質、長鎖の脂肪酸、長鎖の脂肪酸アミン、コレステロール類、スフィンゴ脂質、セラミド等いずれも使用できる。特にホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルトレオニン、エタノールアミンプラスマロゲン、セリンプラスマロゲン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルイノシトール等のリン脂質、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール等の中性脂質等のグリセロ脂質が好ましい。この中でも特に１級アミノ基を有するリン脂質が好ましい。脂質中のアシル基の鎖長及び不飽和度は特に限定されないが、炭素数６以上のものが好ましい。アシル基としては例えばパルミトイル（ヘキサデカノイル）又はステアロイル（オクタデカノイル）などが例示される。また、これらの脂質は通常使用される塩であってもよい。 Further, as the lipid to be bound to glycosaminoglycan, complex lipids or simple lipids derived from natural products such as animals, plants, and microorganisms, or chemically or enzymatically synthesized or partially degraded can be used. And glycerolipids such as phospholipids, long-chain fatty acids, long-chain fatty acid amines, cholesterols, sphingolipids, and ceramides. Glycerolipids such as phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidyl-leonine, ethanolamine plasmalogen, serine plasmalogen, lysophosphatidylcholine, phospholipids such as lysophosphatidylinositol, monoacylglycerol, and neutral lipids such as diacylglycerol are preferred. . Of these, phospholipids having a primary amino group are particularly preferred. The chain length and the degree of unsaturation of the acyl group in the lipid are not particularly limited, but those having 6 or more carbon atoms are preferred. Examples of the acyl group include palmitoyl (hexadecanoyl) and stearoyl (octadecanoyl). In addition, these lipids may be commonly used salts.
グリコサミノグリカンの脂質との結合位置は特に限定されるものではないが、グリコサミノグリカンの末端部が好ましく、グリコサミノグリカンの還元末端への結合がより好ましい。また、結合の形態は、特に化学結合が好ましく、その中でも共有結合による結合が最も好ましい。 The binding position of the glycosaminoglycan to the lipid is not particularly limited, but is preferably at the end of the glycosaminoglycan, and more preferably at the reducing end of the glycosaminoglycan. The form of the bond is particularly preferably a chemical bond, and among them, a bond by a covalent bond is most preferable.
グリコサミノグリカンと脂質とが共有結合した脂質結合グリコサミノグリカンの場合、グリコサミノグリカンのカルボキシル基（ラクトンを含む）、ホルミル基（ヘミアセタール基も含む）、水酸基又は１級アミノ基と、脂質のカルボキシル基、ホルミル基若しくは１級アミノ基、又は脂質に別途導入された前記基との間で形成される酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）、エステル結合又はアミノアルキル結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）によって共有結合したものが好ましい。 In the case of a lipid-bound glycosaminoglycan in which a glycosaminoglycan and a lipid are covalently bonded, a carboxyl group (including a lactone), a formyl group (including a hemiacetal group), a hydroxyl group or a primary amino group of the glycosaminoglycan , A carboxyl group, a formyl group or a primary amino group of a lipid, or an acid amide bond (—CO—NH—), an ester bond or an aminoalkyl bond (—CH Those covalently bonded by 2- NH-) are preferable.
なお、上記共有結合に関与するアミノ基、カルボキシル基、ホルミル基（ヘミアセタール基を含む）、水酸基はグリコサミノグリカン又は脂質に元来存在するもの、これらに化学的処理を施すことによって形成されたもの、或いは上記官能基を末端に有するスペーサー化合物を、予めグリコサミノグリカン又は脂質と反応させることによって別途導入されたもののいずれであってもよい。 The amino group, carboxyl group, formyl group (including hemiacetal group) and hydroxyl group involved in the covalent bond are those originally present in glycosaminoglycans or lipids, and are formed by subjecting them to chemical treatment. Or a spacer compound having the above-mentioned functional group at the terminal, which has been separately introduced by previously reacting with a glycosaminoglycan or a lipid.
グリコサミノグリカン複合体を基質として含有した電気泳動用ゲルは、グリコサミノグリカン複合体を含有した一般的な電気泳動に使用されるゲルであってもよい。このようなゲルは、従来の電気泳動用ゲルを調製する方法に準じて行うことができる。例えば、ポリアクリルアミドゲルを使用する場合は、アクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（Bis）を含む水溶液にグリコサミノグリカン複合体を加えて、均一に混合し、これを重合開始剤、例えば過硫酸塩（過硫酸アンモニウムなど）、過酸化ベンゾイル等の過酸化物、アゾビスイソブチロニトリル等のアゾ化合物や酸化剤と還元剤よりなるレドックス開始剤を用いて重合してゲルを調製できる。また、重合促進剤（例えばN,N,N',N'−テトラメチルエチレンジアミン（TEMED））や界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS））を添加してもよい。 The gel for electrophoresis containing the glycosaminoglycan complex as a substrate may be a gel used for general electrophoresis containing the glycosaminoglycan complex. Such a gel can be prepared according to a conventional method for preparing a gel for electrophoresis. For example, when a polyacrylamide gel is used, a glycosaminoglycan complex is added to an aqueous solution containing acrylamide and N, N'-methylenebisacrylamide (Bis), and the mixture is uniformly mixed. Gels can be prepared by polymerization using a persulfate (such as ammonium persulfate), a peroxide such as benzoyl peroxide, an azo compound such as azobisisobutyronitrile, or a redox initiator composed of an oxidizing agent and a reducing agent. Further, a polymerization accelerator (for example, N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine (TEMED)) or a surfactant (for example, sodium dodecyl sulfate (SDS)) may be added.
好ましいゲルは分離性能及び親水性の点からポリアクリルアミドゲルである。また、ポリアクリルアミドゲルは、一般のポリアクリルアミドゲルの場合と同様に、濃縮ゲルと分離ゲルの２枚作製し重ね合わせることもできる。この場合、基質は分離ゲルに含有させることが好ましい。ポリアクリルアミドゲルにおけるポリアクリルアミドの含有量は、例えば２〜４０％（w/v）であり、好ましくは１０〜３５％（w/v）である。 A preferred gel is a polyacrylamide gel in terms of separation performance and hydrophilicity. As in the case of a general polyacrylamide gel, two polyacrylamide gels, a concentrated gel and a separation gel, can be prepared and superposed. In this case, the substrate is preferably contained in the separation gel. The content of polyacrylamide in the polyacrylamide gel is, for example, 2 to 40% (w / v), and preferably 10 to 35% (w / v).
ゲル作製時のグリコサミノグリカン複合体の使用量は、該複合体がゲルに保持される限り特に制限されないが、例えば０．０１mg／ml〜５０mg／ml、好ましくは０．５mg／ml〜１０mg／ml、より好ましくは０．１mg／ml〜１．０mg／mlである。グリコサミノグリカン複合体の使用量が上記範囲にあると、検出感度を確保しつつ、さらに、該複合体の水への溶解性も十分でありハンドリングが向上する。なお、この使用量は、濃縮ゲルと分離ゲルとを作製する場合には、該複合体を含ませる一方のゲル（好ましくは分離ゲル）を作製する際の量である。 The amount of the glycosaminoglycan complex used for preparing the gel is not particularly limited as long as the complex is retained in the gel, but is, for example, 0.01 mg / ml to 50 mg / ml, preferably 0.5 mg / ml to 10 mg. / Ml, more preferably 0.1 mg / ml to 1.0 mg / ml. When the amount of the glycosaminoglycan complex used is in the above range, the solubility of the complex in water is sufficient and the handling is improved while ensuring the detection sensitivity. In addition, when the concentrated gel and the separation gel are prepared, the used amount is the amount for preparing one gel (preferably the separation gel) containing the complex.
本発明においては、上記ゲルを被検試料存在下で電気泳動する。電気泳動は酵素反応が進行せず、かつ、失活しない条件であれば、特に限定されず、ザイモグラフィー法における電気泳動に準じて行うことができる。電気泳動用の緩衝液としてはザイモグラフィー法の電気泳動において使用される一般的な緩衝液を使用できる。 In the present invention, the gel is electrophoresed in the presence of a test sample. The electrophoresis is not particularly limited as long as the enzyme reaction does not proceed and is not deactivated, and can be performed according to electrophoresis in zymography. As a buffer for electrophoresis, a general buffer used in zymography electrophoresis can be used.
電気泳動後、必要に応じてゲルを再生用緩衝液（洗浄用緩衝液）で洗浄する。SDSが存在する場合はこれにより除去される。この緩衝液としてはザイモグラフィー法にて一般に再生用（洗浄用）として使用されている緩衝液を使用できる。 After the electrophoresis, the gel is optionally washed with a regeneration buffer (wash buffer). This removes the SDS, if present. As this buffer, a buffer generally used for regeneration (for washing) by zymography can be used.
次いで、ゲルは工程（ｂ）においてインキュベーションされる。つまり、電気泳動後のゲルを酵素反応条件におき酵素反応を進行できる状態とすればよい。例えば、酵素の検出を目的とする場合にあっては、電気泳動後のゲルを緩衝液に酵素反応可能な条件下で浸すことによってインキュベーションでき、阻害物質の検出を目的とする場合にあっては、例えば、電気泳動後のゲルを酵素を含有する緩衝液に酵素反応可能な条件で浸すことでインキュベーションできるが、これらに限定されない。酵素反応条件は、酵素の種類、基質の種類等に応じて、緩衝液の種類、ｐＨ、温度、反応時間などを決めることができる。この緩衝液としてはザイモグラフィー法にて一般に酵素反応用（例えば、インキュベーション用）として使用されている緩衝液を使用できる。また、この緩衝液には酵素に応じた補因子を添加してもよく、これにより酵素反応を促進できる。 The gel is then incubated in step (b). That is, the gel after the electrophoresis may be placed under the enzyme reaction conditions so that the enzyme reaction can proceed. For example, when the purpose is to detect an enzyme, the gel can be incubated by immersing the gel after electrophoresis in a buffer solution under conditions that allow the enzyme reaction. For example, the gel can be incubated by immersing the gel after electrophoresis in a buffer containing an enzyme under conditions that allow an enzyme reaction, but is not limited thereto. As the enzyme reaction conditions, the type of buffer, pH, temperature, reaction time, and the like can be determined according to the type of enzyme, the type of substrate, and the like. As this buffer, a buffer generally used for enzyme reaction (for example, for incubation) in zymography can be used. Further, a cofactor depending on the enzyme may be added to this buffer, so that the enzyme reaction can be promoted.
酵素反応後、プロテアーゼ（例えば、アクチナーゼＥ、トリプシン、ペプシン）で処理して、ゲル内のタンパク質成分を除去してもよい。タンパク質は、その分量や種類などによって染色を抑制し、偽陽性を呈することがありえ、そのような場合はプロテアーゼ処理が有用である。プロテアーゼ処理は、例えば、プロテアーゼを含むリン酸緩衝液にゲルを浸すことで行うことができる。 After the enzymatic reaction, the gel may be treated with a protease (eg, actinase E, trypsin, pepsin) to remove protein components in the gel. Depending on the amount and type of the protein, staining can be suppressed and false positive can be exhibited. In such a case, protease treatment is useful. The protease treatment can be performed, for example, by immersing the gel in a phosphate buffer containing a protease.
次いで、ゲルは工程（ｃ）において染色剤で染色処理される。染色剤は、基質（グリコサミノグリカン複合体）及び酵素分解産物（グリコサミノグリカン）に応じて適宜選択される。つまり、染色剤は、基質と反応してゲルを染色し、かつ、酵素分解産物では染色しない性質を備えたものであればよい。染色剤は、例えばアルシアンブルー、Stains Allを使用でき、好ましくはアルシアンブルーである。アルシアンブルーは、グリコサミノグリカンのカルボキシル基及び硫酸基と反応するが、ｐＨが低いとき（ｐＨが１．０以下）はカルボキシル基と反応せず、硫酸基のみと反応するので、染色液のｐＨを１．０以下とすることによって選択的に硫酸基を含むグリコサミノグリカンのみを染色することもできる。染色処理は、例えば、ゲルを染色液に浸すことで行うことができる。染色処理における、染色剤の濃度、染色液のｐＨ、染色処理の温度、染色処理の時間などの条件は、染色液の種類、被染色物（基質又は酵素分解産物）の種類などに応じて適宜選択すればよい。 Next, the gel is stained with a stain in step (c). The staining agent is appropriately selected depending on the substrate (glycosaminoglycan complex) and the enzymatic degradation product (glycosaminoglycan). In other words, the staining agent may be any as long as it has a property of reacting with the substrate to stain the gel and not staining with the enzyme degradation product. As the staining agent, for example, Alcian Blue and Stains All can be used, and Alcian Blue is preferable. Alcian blue reacts with the carboxyl group and sulfate group of glycosaminoglycan, but when the pH is low (pH of 1.0 or less), it does not react with the carboxyl group but reacts only with the sulfate group. By adjusting the pH of the solution to 1.0 or less, only glycosaminoglycans containing a sulfate group can be selectively stained. The staining treatment can be performed, for example, by immersing the gel in a staining solution. Conditions such as the concentration of the staining agent, the pH of the staining solution, the temperature of the staining process, and the time of the staining process in the staining process are appropriately determined according to the type of the staining solution, the type of the substrate to be stained (substrate or enzyme degradation product), and the like. Just choose.
染色処理後のゲルは洗浄されて、ゲルから染色液が除去されてもよい。この際の洗浄液は、例えば、染色液から染色剤を除いた液とすることができる。 The gel after the staining treatment may be washed, and the stain solution may be removed from the gel. The washing solution at this time can be, for example, a solution obtained by removing the staining agent from the staining solution.
グリコサミノグリカン分解酵素を検出する方法では、染色処理後のゲルにおける非染色部分の存在によって酵素活性を検出できる。 In the method for detecting glycosaminoglycan degrading enzyme, the enzyme activity can be detected by the presence of an unstained portion in the gel after the staining treatment.
一方、グリコサミノグリカン分解酵素の阻害物質を検出する方法では、染色処理後のゲルにおける染色部分の存在によって酵素阻害活性を検出できる。 On the other hand, in the method for detecting an inhibitor of glycosaminoglycan degrading enzyme, the enzyme inhibitory activity can be detected by the presence of a stained portion in the gel after the staining treatment.
なお、非染色部分とは染色剤で所定の色に染色されなかった部分をいう。 The unstained portion refers to a portion that has not been dyed in a predetermined color with a dye.
＜グリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質を検出するためのゲル＞
本発明の一実施形態は、グリコサミノグリカン複合体を基質として含有する、電気泳動を使用してグリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質を検出するためのゲル、である（以下、単に本発明のゲルと称することがある）。
<Gel for detecting glycosaminoglycan degrading enzyme or inhibitor of the enzyme>
One embodiment of the present invention is a gel containing a glycosaminoglycan complex as a substrate, for detecting a glycosaminoglycan degrading enzyme or an inhibitor of the enzyme using electrophoresis (hereinafter, referred to as a gel). Simply referred to as the gel of the present invention).
本発明のゲルは、例えば、本発明の検出方法や、ザイモグラフィー法によりグリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質を検出するために使用できる。本発明のゲルには上記本発明の検出方法におけるゲルに関する説明が適用される。 The gel of the present invention can be used, for example, for detecting a glycosaminoglycan degrading enzyme or an inhibitor of the enzyme by the detection method of the present invention or zymography. The description of the gel in the detection method of the present invention is applied to the gel of the present invention.
＜グリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質の検出用キット＞
本発明の一実施形態は、本発明のゲルを含む、グリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質の検出用キット、である（以下、単に本発明のキットと称することがある）。本発明のキットは、本発明のゲルの他に、緩衝液、洗浄液、染色液、ｐＨ調整剤、エタノール、使用説明書など、電気泳動用キット又はザイモグラフィー用キットに必要な他の任意の構成要素を適宜含めることができる。
<Kit for detecting glycosaminoglycan degrading enzyme or inhibitor of the enzyme>
One embodiment of the present invention is a kit for detecting a glycosaminoglycan degrading enzyme or a substance inhibiting the enzyme, which comprises the gel of the present invention (hereinafter, may be simply referred to as a kit of the present invention). The kit of the present invention includes, in addition to the gel of the present invention, any other components required for an electrophoresis kit or a zymography kit, such as a buffer solution, a washing solution, a staining solution, a pH adjuster, ethanol, and an instruction manual. Elements can be included as appropriate.
本発明によれば、ザイモグラフィー法において、グリコサミノグリカン分解酵素又はその阻害物質を簡便に高感度で検出できる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, a glycosaminoglycan decomposing enzyme or its inhibitor can be detected simply and with high sensitivity in a zymography method.
以下、実施例等を参照して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに示された態様に限定されるものではない。また、実施例等において使用したプロテオグリカン、酵素等は以下のとおりである。 Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples and the like, but the present invention is not limited to the embodiments shown in these. In addition, proteoglycans, enzymes, and the like used in Examples and the like are as follows.
プロテオグリカンとして、サケ鼻軟骨プロテオグリカン（富士フイルム和光純薬株式会社；分子量分布の最頻値は540kDa）を使用し、これを水に10mg／mlで溶解した水溶液を分離ゲル作製に使用した。 Salmon nasal cartilage proteoglycan (Fujifilm Wako Pure Chemical Co., Ltd .; mode of molecular weight distribution: 540 kDa) was used as proteoglycan, and an aqueous solution obtained by dissolving this at 10 mg / ml in water was used for separation gel preparation.
ゼラチンとして、ナカライテスク株式会社製のゼラチンを使用した。
コンドロイチナーゼとして、コンドロイチナーゼABC（Proteus vulgaris由来酵素、Sigma-Aldrichから入手可能）を使用した。
ヒアルロニダーゼとして、ウシ精巣ヒアルロニダーゼ（Sigma-Aldrichから入手可能）を使用した。
３０％アクリルアミドストック溶液として、29ｇのアクリルアミド及び１ｇのＮ’，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを純水100mlに溶解したものを使用した。
アルシアンブルー染色液（pH1.0）として、0.5％アルシアンブルー、20％エタノール及び10％酢酸の組成で調製したものを使用した。塩基性色素であるアルシアンブルーは、酸性ムコ物質のカルボキシル基及び／又は硫酸基とイオン結合して青色へ変色する。アルシアンブルー染色液中のpHが2.5では両基に、pH1.0以下の溶液中では硫酸基にのみ結合する。
クマシーブルー染色液として、0.25％クマシーブリリアントブルー R-250、5％エタノール及び7.5％酢酸の組成で調製したものを使用した。クマシーブリリアントブルーは、酸性バッファー条件下において、タンパク質の塩基性又は疎水性残基に結合し、鈍い赤褐色から濃い青色へと変色する。
電気泳動バッファーとして、25mM Tris-HCl（pH8.3）、192mMグリシン及び0.1％SDSの組成で調製したものを用いた。
洗浄液として、20％エタノール及び10％酢酸の組成の水溶液を使用した。
Gelatin manufactured by Nacalai Tesque, Inc. was used.
Chondroitinase ABC (an enzyme from Proteus vulgaris, available from Sigma-Aldrich) was used as chondroitinase.
Bovine testis hyaluronidase (available from Sigma-Aldrich) was used as hyaluronidase.
As a 30% acrylamide stock solution, a solution prepared by dissolving 29 g of acrylamide and 1 g of N ', N'-methylenebisacrylamide in 100 ml of pure water was used.
As the Alcian blue staining solution (pH 1.0), a solution prepared with a composition of 0.5% Alcian blue, 20% ethanol and 10% acetic acid was used. Alcian blue, which is a basic dye, changes color to blue by ionic bonding with a carboxyl group and / or a sulfate group of the acidic muco substance. When the pH in the Alcian Blue staining solution is 2.5, it binds to both groups, and in the solution having a pH of 1.0 or less, it binds only to the sulfate group.
As the Coomassie Blue staining solution, one prepared with a composition of 0.25% Coomassie Brilliant Blue R-250, 5% ethanol and 7.5% acetic acid was used. Coomassie brilliant blue binds to basic or hydrophobic residues of proteins under acidic buffer conditions and changes color from dull reddish brown to dark blue.
As an electrophoresis buffer, one prepared with a composition of 25 mM Tris-HCl (pH 8.3), 192 mM glycine and 0.1% SDS was used.
As the washing solution, an aqueous solution having a composition of 20% ethanol and 10% acetic acid was used.
（実施例１）
プロテオグリカン又はゼラチンを含有するポリアクリルアミドゲル
常法に従って、表１及び表２に示す材料から、プロテオグリカンを1mg／mlで含む分離ゲルとこれを含まない濃縮ゲル（ともに7.5％SDS−ポリアクリルアミドゲル；90mm×80mm×1mmサイズ）を作製し、分離ゲルに濃縮ゲルを重層した。
Polyacrylamide gel containing proteoglycan or gelatin Separation gel containing proteoglycan at 1 mg / ml and concentrated gel containing no proteoglycan (both 7.5% SDS-polyacrylamide gel; 90 mm × 80 mm × 1 mm size) and a concentrated gel was layered on the separation gel.
重層したゲルを電気泳動（4℃、20mA、100分間）した後、電気泳動済みゲルを再生用緩衝液（2.5％ Triton X-100、50mM Tris-HCl（pH7.5）及び100mM NaCl）に浸し室温で１時間緩やかに振とうして、SDSを除去した。その後、このゲルを、アルシアンブルー染色液又はクマシーブルー染色液に室温で２時間浸し、染色した。洗浄液で洗浄して余剰な染色液を取り除いた。ゲルの染色の様子を図１に示す。 After electrophoresis of the overlaid gel (4 ° C, 20 mA, 100 minutes), the electrophoresed gel is immersed in a regeneration buffer (2.5% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 100 mM NaCl). SDS was removed by gentle shaking at room temperature for 1 hour. Thereafter, this gel was immersed in Alcian Blue staining solution or Coomassie Blue staining solution at room temperature for 2 hours to stain. Washing was performed with a washing solution to remove excess staining solution. FIG. 1 shows the state of gel staining.
対照として、プロテオグリカンに代えてゼラチンを１mg／mlで使用した分離ゲルを用い、同様に電気泳動、染色及び洗浄した。ゲルの染色の様子を図１に示す。 As a control, a separation gel using gelatin at 1 mg / ml instead of proteoglycan was used, and electrophoresis, staining and washing were performed in the same manner. FIG. 1 shows the state of gel staining.
図１からは、アルシアンブルー染色によって、プロテオグリカン含有ゲルが均一に濃い青色で染色され、プロテオグリカン中のコンドロイチン硫酸が検出されたことがわかる。クマシーブルー染色では、ゼラチン含有ゲルが紫色に染色されたのに対し、プロテオグリカン含有ゲルは染色されず、該ゲル中のタンパク質の量が少ないことがわかる。 From FIG. 1, it can be seen that the gel containing proteoglycan was uniformly stained with dark blue by Alcian blue staining, and chondroitin sulfate in proteoglycan was detected. In Coomassie blue staining, the gelatin-containing gel was stained purple, while the proteoglycan-containing gel was not stained, indicating that the amount of protein in the gel was small.
（実施例２）
コンドロイチナーゼ活性の検出
分離ゲルにおけるプロテオグリカン濃度を0.1mg／ml又は0.5mg／mlに代えた以外は実施例１と同様にして、分離ゲルと濃縮ゲルを作製し重層した。所定量のコンドロイチナーゼをSDSサンプル緩衝液（62.5mM Tris-HCl（pH6.8）、2％SDS及び5％ショ糖）に希釈したサンプル液を作製した。１アプライ当たりのコンドロイチナーゼ量（mU）は第１レーンから順に次のとおりである。
10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.16、0.08、0.04、0.02（mU）
(Example 2)
Detection of chondroitinase activity Separated gel and concentrated gel were prepared and layered in the same manner as in Example 1 except that the concentration of proteoglycan in the separated gel was changed to 0.1 mg / ml or 0.5 mg / ml. A sample solution was prepared by diluting a predetermined amount of chondroitinase in SDS sample buffer (62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS and 5% sucrose). The amount of chondroitinase per application (mU) is as follows in order from the first lane.
10, 5, 2.5, 1.25, 0.63, 0.31, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02 (mU)
なお、コンドロイチナーゼの１ユニットは、pH8.0、37℃で１分間に、コンドロイチン硫酸Ａから1.0μmolの2-アセトアミド-2-デオキシ-3-O-（β-D-グルコ-4-エン-ピラノシルウロン酸）-4-O-スルホ-D-ガラクトースを、又は、コンドロイチン硫酸Ｃから1.0μmolの2-アセトアミド-2-デオキシ-3-O-（β-D-グルコ-4-エン-ピラノシルウロン酸）-6-O-スルホ-D-ガラクトースを遊離させる酵素量である。 One unit of chondroitinase was prepared by converting 1.0 μmol of 2-acetamido-2-deoxy-3-O- (β-D-gluco-4-ene from chondroitin sulfate A in 1 minute at pH 8.0 and 37 ° C. -Pyranosyluronic acid) -4-O-sulfo-D-galactose or 1.0 μmol of 2-acetamido-2-deoxy-3-O- (β-D-gluco-4-en-pyranosyluronic acid from chondroitin sulfate C ) The amount of enzyme that releases 6-O-sulfo-D-galactose.
濃縮ゲルにレーンを作製し、各々のレーンに10μlのサンプル液をアプライした後、実施例１と同様にして電気泳動処理及び再生用緩衝液処理した。次いで、ゲルをインキュベーション用緩衝液（50mM Tris-HCl（pH7.5）及び60mM 酢酸ナトリウム）に浸して37℃で16時間振とうした。次いで、ゲルを、0.1mg／mlアクチナーゼＥ（科研製薬製）を含むリン酸緩衝液に浸して37℃で4時間振とうした。次いで、実施例１と同様にしてアルシアンブルー染色及び洗浄を行った。ゲルの染色の様子を図２に示す。 Lanes were prepared in the concentrated gel, 10 μl of the sample solution was applied to each lane, and electrophoresis and a buffer for regeneration were performed in the same manner as in Example 1. Next, the gel was immersed in an incubation buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 60 mM sodium acetate) and shaken at 37 ° C. for 16 hours. Next, the gel was immersed in a phosphate buffer containing 0.1 mg / ml actinase E (manufactured by Kaken Pharmaceutical) and shaken at 37 ° C. for 4 hours. Next, Alcian blue staining and washing were performed in the same manner as in Example 1. FIG. 2 shows the state of staining of the gel.
図２において青色に染色された部分はプロテオグリカン中のコンドロイチン硫酸が検出されたことを意味し、青色に染色されなかった部分は、コンドロイチン硫酸が検出されなかったことを意味する。したがって、非染色部分の存在によって、プロテオグリカン中のコンドロイチン硫酸がコンドロイチナーゼによって分解されたことが確認できる。また、非染色部分は、コンドロイチナーゼの量に依存して見られた。 In FIG. 2, the portion stained in blue means that chondroitin sulfate in proteoglycan was detected, and the portion not stained in blue means that chondroitin sulfate was not detected. Therefore, it can be confirmed that chondroitin sulfate in proteoglycan was degraded by chondroitinase due to the presence of the unstained portion. The unstained portion was found depending on the amount of chondroitinase.
プロテオグリカン濃度0.1mg／mlのゲル及び0.5mg／mlのゲルの双方において、第１レーン〜第８レーンにおいて非染色バンドが目視で確認できたことから、コンドロイチナーゼの活性の検出限界量は0.08mUであった。プロテオグリカン濃度0.5mg／mlのゲルでは高濃度のコンドロイチナーゼの活性が明瞭に検出された。また、画像処理ソフトウェアのImageJによる染色結果の解析においても第１レーン〜第８レーンにおいて非染色バンドの存在が確認できた。さらに、ImageJの解析では、コンドロイチナーゼの濃度とバンド（非染色部分）の光学密度との間の相関において直線性（正比例）が認められたことから、被検試料内に含有される酵素量を相対的に定量し得ることが確認された。例えば、酵素標準品を用いて検量線を作成しておけば被検試料中の酵素量の定量が可能となる。 In both the gels having a proteoglycan concentration of 0.1 mg / ml and the gel having a proteoglycan concentration of 0.5 mg / ml, unstained bands were visually confirmed in lanes 1 to 8; therefore, the detection limit of chondroitinase activity was 0.08. mU. In the gel having a proteoglycan concentration of 0.5 mg / ml, the activity of chondroitinase at a high concentration was clearly detected. In the analysis of the staining results by ImageJ of the image processing software, the presence of unstained bands was confirmed in lanes 1 to 8. Furthermore, ImageJ analysis showed that the correlation between the concentration of chondroitinase and the optical density of the band (unstained portion) was linear (directly proportional), indicating the amount of enzyme contained in the test sample. Was relatively quantified. For example, if a calibration curve is prepared using an enzyme standard, the amount of enzyme in the test sample can be determined.
（実施例３）
ヒアルロニダーゼ活性の検出
実施例１と同様にして、プロテオグリカンを0.1mg／mlで含む分離ゲルと濃縮ゲルを作製し重層した。所定量のヒアルロニダーゼ（Sigma-Aldrichから入手可能）をSDSサンプル緩衝液（62.5mM Tris-HCl（pH6.8）、2％SDS、5％ショ糖及び0.005％ブロモフェノールブルー）に希釈したサンプル液を作製した。１アプライ当たりのヒアルロニダーゼ量（ng）は第１レーンから順に次のとおりである。
500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、2.0、1.0（ng）
(Example 3)
Detection of Hyaluronidase Activity In the same manner as in Example 1, a separation gel containing 0.1 mg / ml of proteoglycan and a concentrated gel were prepared and overlaid. A sample solution prepared by diluting a predetermined amount of hyaluronidase (available from Sigma-Aldrich) into SDS sample buffer (62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 5% sucrose and 0.005% bromophenol blue) was used. Produced. The amount of hyaluronidase per application (ng) is as follows in order from the first lane.
500, 250, 125, 62.5, 31.3, 15.6, 7.8, 3.9, 2.0, 1.0 (ng)
なお、ヒアルロニダーゼの１ユニットは、2.0mL反応混液（pH5.7、37℃）においてA６６０値を0.330／分の速度で変化させる酵素量である。 Incidentally, 1 unit of hyaluronidase is an enzyme amount that changes with 0.330 / min the A 660 values in 2.0mL reaction mixture (pH5.7,37 ℃).
重層したゲルとヒアルロニダーゼを含むサンプル液で実施例２と同様にして、電気泳動し、再生用緩衝液処理した。次いで、ゲルをインキュベーション用緩衝液（150mM NaCl及び100mM 酢酸ナトリウム；pH5.0又はpH7.0）に浸して37℃で16時間振とうした。次いで、ゲルを、1.0mg／mlアクチナーゼＥ（科研製薬製）を含むリン酸緩衝液に浸して37℃で4時間振とうした。次いで、実施例２と同様にしてアルシアンブルー染色及び洗浄を行った。ゲルの染色の様子を図３に示す。 In the same manner as in Example 2, electrophoresis was carried out using a layered gel and a sample solution containing hyaluronidase, followed by treatment with a buffer for regeneration. The gel was then immersed in incubation buffer (150 mM NaCl and 100 mM sodium acetate; pH 5.0 or pH 7.0) and shaken at 37 ° C. for 16 hours. Next, the gel was immersed in a phosphate buffer containing 1.0 mg / ml actinase E (manufactured by Kaken Pharmaceutical) and shaken at 37 ° C. for 4 hours. Subsequently, Alcian blue staining and washing were performed in the same manner as in Example 2. FIG. 3 shows the state of gel staining.
図３において青色に染色された部分はプロテオグリカン中のコンドロイチン硫酸が検出されたことを意味し、青色に染色されなかった部分は、コンドロイチン硫酸が検出されなかったことを意味する。したがって、非染色部分の存在によって、プロテオグリカン中のコンドロイチン硫酸がヒアルロニダーゼによって分解されたことが確認できる。また、非染色部分は、ヒアルロニダーゼの量に依存して見られた。 In FIG. 3, the portion stained in blue means that chondroitin sulfate in proteoglycan was detected, and the portion not stained in blue means that chondroitin sulfate was not detected. Therefore, it can be confirmed that chondroitin sulfate in proteoglycan was degraded by hyaluronidase due to the presence of the unstained portion. The unstained portion was found depending on the amount of hyaluronidase.
酵素反応がpH5.0条件のゲル（図３上図）とpH7.0条件のゲル（図３下図）の双方において、第１レーン〜第８レーンにおいて非染色バンドが目視で確認でき、ヒアルロニダーゼの活性の検出限界量は3.9ng（第８レーン）であった。 In both the gel where the enzyme reaction was at pH 5.0 (upper figure in FIG. 3) and the gel with pH 7.0 condition (lower figure in FIG. 3), unstained bands were visually observed in lanes 1 to 8 and hyaluronidase was The detection limit of the activity was 3.9 ng (8th lane).
また、画像処理ソフトウェアImageJによる染色結果の解析においては、pH5.0条件のゲルについて第１レーン〜第７レーンまで、pH7.0条件のゲルについて第１レーン〜第１０レーンまで、非染色バンドの存在が確認できた。さらに、ImageJの解析では、ヒアルロニダーゼの濃度とバンド（非染色部分）の光学密度との間の相関において概ね直線性（正比例）が認められたことから、被検試料内に含有される酵素量を相対的に定量し得ることが確認された。例えば、酵素標準品を用いて検量線を作成しておけば被検試料中の酵素量の定量が可能となる
。
In the analysis of the staining results by the image processing software ImageJ, the unstained band was analyzed for the gel under the pH 5.0 condition from the first lane to the seventh lane, and the gel under the pH 7.0 condition from the first lane to the tenth lane. The existence was confirmed. Furthermore, in the analysis of ImageJ, the correlation between the concentration of hyaluronidase and the optical density of the band (unstained portion) was found to be approximately linear (directly proportional), so the amount of enzyme contained in the test sample was determined. It was confirmed that it could be relatively quantified. For example, if a calibration curve is prepared using an enzyme standard, the amount of enzyme in the test sample can be determined.
（実施例４）
反応液のpHによる影響（コンドロイチナーゼ）
実施例１と同様にして、プロテオグリカンを0.1mg／mlで含む分離ゲルと濃縮ゲルを作製し重層した。2mUのコンドロイチナーゼ又は100ngのヒアルロニダーゼをSDSサンプル緩衝液（62.5mM Tris-HCl（pH6.8）、2％SDS、5％ショ糖及び0.005％ブロモフェノールブルー）に希釈したサンプル液を作製した。
(Example 4)
Effect of pH of reaction solution (chondroitinase)
In the same manner as in Example 1, a separation gel and a concentrated gel containing proteoglycan at 0.1 mg / ml were prepared and overlaid. A sample solution was prepared by diluting 2 mU of chondroitinase or 100 ng of hyaluronidase in SDS sample buffer (62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 5% sucrose and 0.005% bromophenol blue).
重層したゲルとコンドロイチナーゼを含むサンプル液で実施例２と同様にして、電気泳動し、再生用緩衝液処理した。次いで、ゲルをインキュベーション用緩衝液（60mM NaCl及び50mM クエン酸ナトリウム（pH3.5、pH5.0、pH6.0）、又60mM NaCl及びTris-HCl（pH7.5））に浸して37℃で16時間振とうした。次いで、ゲルを、1.0mg／mlアクチナーゼＥ（科研製薬製）を含むリン酸緩衝液に浸して37℃で4時間振とうした。次いで、実施例２と同様にしてアルシアンブルー染色及び洗浄を行った。ゲルの染色の様子を図４に示す。 Electrophoresis was carried out in the same manner as in Example 2 using a sample solution containing the layered gel and chondroitinase, and treated with a buffer for regeneration. The gel is then immersed in an incubation buffer (60 mM NaCl and 50 mM sodium citrate (pH 3.5, pH 5.0, pH 6.0) or 60 mM NaCl and Tris-HCl (pH 7.5)) at 37 ° C. for 16 hours. Shake time. Next, the gel was immersed in a phosphate buffer containing 1.0 mg / ml actinase E (manufactured by Kaken Pharmaceutical) and shaken at 37 ° C. for 4 hours. Subsequently, Alcian blue staining and washing were performed in the same manner as in Example 2. FIG. 4 shows the state of gel staining.
図４中、pH5.0条件のゲル、pH6.0条件のゲル及びpH7.5条件のゲルにおいて、非染色バンドが目視できたことから、コンドロイチナーゼの活性及びヒアルロニダーゼの活性が検出され、一方、pH3.5条件のゲルでは非染色部分が目視できなかった。また、画像処理ソフトウェアImageJによる染色結果の解析においても同様であった。この結果、試験された酵素はpH3.5条件ではコンドロイチン硫酸を分解しないと判断された。 In FIG. 4, unstained bands were visually observed in the gels of pH 5.0 condition, the gel condition of pH 6.0 condition and the gel condition of pH 7.5, so that the activity of chondroitinase and the activity of hyaluronidase were detected. In the gel at pH 3.5, the unstained portion was not visible. The same applies to the analysis of the staining results by the image processing software ImageJ. As a result, it was determined that the tested enzyme did not degrade chondroitin sulfate at pH 3.5.
（実施例５）
阻害物質の検出モデル（リバースザイモグラフィーへの適用）
実施例２と同様にして、プロテオグリカンを0.1mg／mlで含む分離ゲルと濃縮ゲルを作製し重層し、電気泳動し、再生用緩衝液処理した。次いで、ゲルを、ヒアルロニダーゼを0.5mg／mlで含み、150mM NaCl、50mM Tris-HCl（pH7.5）及び1mM MgCl2のインキュベーション用緩衝液に浸し、37℃で16時間振とうした。次いで、ゲルを、1.0mg／mlアクチナーゼＥ（科研製薬製）を含むリン酸緩衝液に浸して37℃で4時間振とうした。次いで、実施例２と同様にしてアルシアンブルー染色及び洗浄を行った。ヒアルロニダーゼを含まないこと以外は同じ用緩衝液を使用した場合についても同様に染色及び洗浄を行った。ゲルの染色の様子を図５に示す。
(Example 5)
Inhibitor detection model (application to reverse zymography)
In the same manner as in Example 2, a separation gel and a concentrated gel containing proteoglycan at 0.1 mg / ml were prepared, overlaid, electrophoresed, and treated with a regeneration buffer. The gel was then immersed in an incubation buffer containing 0.5 mg / ml hyaluronidase, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 1 mM MgCl 2 and shaken at 37 ° C. for 16 hours. Next, the gel was immersed in a phosphate buffer containing 1.0 mg / ml actinase E (manufactured by Kaken Pharmaceutical) and shaken at 37 ° C. for 4 hours. Subsequently, Alcian blue staining and washing were performed in the same manner as in Example 2. Staining and washing were performed similarly when the same buffer was used except that hyaluronidase was not included. The state of the staining of the gel is shown in FIG.
図５において青色に染色された部分はプロテオグリカン中のコンドロイチン硫酸が検出されたことを意味し、青色に染色されなかった部分はコンドロイチン硫酸が検出されなかったことを意味する。したがって、ヒアルロニダーゼ含有緩衝液に浸されたゲルではゲル中のプロテオグリカンに含まれるコンドロイチン硫酸が酵素によってほぼ完全に分解され、ヒアルロニダーゼを含有しない緩衝液に浸されたゲルではゲル中のプロテオグリカンに含まれるコンドロイチン硫酸が酵素によって分解されなかったことを確認できた。
そうすると、コンドロイチナーゼやヒアルロニダーゼ等の酵素の阻害物質を含む被検試料をアプライしたゲルを電気泳動した場合、該酵素を含有するインキュベーション用緩衝液に電気泳動したゲルを浸すことによって、酵素活性が阻害されてコンドロイチン硫酸が分解されず、したがって染色処理によってコンドロイチン硫酸が染色されて、阻害活性を検出できることが確認できることとなる。
In FIG. 5, the portion stained in blue means that chondroitin sulfate in proteoglycan was detected, and the portion not stained in blue means that chondroitin sulfate was not detected. Therefore, in a gel immersed in a buffer containing hyaluronidase, chondroitin sulfate contained in the proteoglycan in the gel is almost completely decomposed by the enzyme, and in a gel immersed in a buffer containing no hyaluronidase, chondroitin contained in the gel proteoglycan is contained. It was confirmed that the sulfuric acid was not decomposed by the enzyme.
Then, when a gel prepared by applying a test sample containing an inhibitor of an enzyme such as chondroitinase or hyaluronidase is electrophoresed, the enzyme activity is increased by immersing the electrophoresed gel in an incubation buffer containing the enzyme. It is inhibited and chondroitin sulfate is not decomposed, so that the chondroitin sulfate is stained by the staining treatment, and it can be confirmed that the inhibitory activity can be detected.
Claims (8)
（ａ）グリコサミノグリカン複合体を基質として含有した電気泳動用ゲルを被検試料存在下で電気泳動する工程、
（ｂ）電気泳動後のゲルをインキュベーションする工程、及び
（ｃ）インキュベーション後のゲルを染色剤で処理する工程
を含む方法。 A method for detecting a glycosaminoglycan degrading enzyme or an inhibitor of the enzyme in a test sample, comprising the following steps:
(A) electrophoresing an electrophoresis gel containing a glycosaminoglycan complex as a substrate in the presence of a test sample,
(B) a step of incubating the gel after electrophoresis, and (c) treating the gel after incubation with a stain.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018157686A JP2020028277A (en) | 2018-08-24 | 2018-08-24 | Method for detecting glycosaminoglycan degrading enzyme, or inhibitory substance of the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018157686A JP2020028277A (en) | 2018-08-24 | 2018-08-24 | Method for detecting glycosaminoglycan degrading enzyme, or inhibitory substance of the same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2020028277A true JP2020028277A (en) | 2020-02-27 |
Family
ID=69622324
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2018157686A Pending JP2020028277A (en) | 2018-08-24 | 2018-08-24 | Method for detecting glycosaminoglycan degrading enzyme, or inhibitory substance of the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2020028277A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112147092A (en) * | 2020-05-29 | 2020-12-29 | 江西师范大学 | Method for detecting acidic polysaccharide in water body |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060153827A1 (en) * | 2002-08-15 | 2006-07-13 | Gruskin Elliott A | Chimeric protein |
| JP2007532094A (en) * | 2003-05-16 | 2007-11-15 | アコーダ セラピューティクス、インク． | Proteoglycan-degrading mutant for CNS treatment |
-
2018
- 2018-08-24 JP JP2018157686A patent/JP2020028277A/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060153827A1 (en) * | 2002-08-15 | 2006-07-13 | Gruskin Elliott A | Chimeric protein |
| JP2007532094A (en) * | 2003-05-16 | 2007-11-15 | アコーダ セラピューティクス、インク． | Proteoglycan-degrading mutant for CNS treatment |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS REPORTS, vol. 9, JPN6022026348, 2017, pages 72 - 78, ISSN: 0004958120 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112147092A (en) * | 2020-05-29 | 2020-12-29 | 江西师范大学 | Method for detecting acidic polysaccharide in water body |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Fransson et al. | Structure of dermatan sulfate: I. Degradation by testicular hyaluronidase | |
| Hughes | Membrane glycoproteins: a review of structure and function | |
| Damle et al. | Proteodermatan sulfate isolated from pig skin. | |
| US9689010B2 (en) | Microbial-derived chondroitin sulfate | |
| Gregory et al. | Proteoglycans of rabbit corneal stroma. Isolation and partial characterization. | |
| Staprans et al. | Isolation and characterization of glycosaminoglycans in human plasma. | |
| Cai et al. | Biodegradation of composite resin with ester linkages: identifying human salivary enzyme activity with a potential role in the esterolytic process | |
| Thonar et al. | Maturation-related changes in proteoglycans of fetal articular cartilage | |
| JP2020531627A (en) | Chinese giant salamander salamander cartilage preparation | |
| Wang et al. | Chicken leg bone as a source of chondroitin sulfate | |
| JP2020028277A (en) | Method for detecting glycosaminoglycan degrading enzyme, or inhibitory substance of the same | |
| Fragner et al. | Optimized protocol for the 2‐DE of extracellular proteins from higher basidiomycetes inhabiting lignocellulose | |
| Mutoh et al. | Isolation and characterization of proteoheparan sulfate from plasma membranes of an ascites hepatoma, AH 66 | |
| CZ20023469A3 (en) | Lipopolysaccharides | |
| Rowe et al. | Arterial dermatan sulfate proteoglycan structure in pigeons susceptible to atherosclerosis. | |
| Alves et al. | Interaction of high molecular weight chondroitin sulfate from human aorta with plasma low density lipoproteins | |
| Compère et al. | Glycoproteins from the cuticle of the Atlantic shore crab Carcinus maenas: I. Electrophoresis and Western-blot analysis by use of lectins | |
| EP3653721B1 (en) | Method and composition for hydrolyzing eggshell membrane | |
| Kramerov et al. | Glycoproteins containing sulfated chitin-like carbohydrate moiety are synthesized in an established Drosophila melanogaster cell line | |
| JP3271008B2 (en) | Method for producing chondroitin sulfates | |
| Kremkau et al. | Biomolecular absorption of ultrasound. I: Molecular weight | |
| Koyama et al. | Blood appearance of rat alkaline phosphatase originating from the duodenum in vitro | |
| JP4273998B2 (en) | Sample preparation method for proteome analysis | |
| White et al. | Characterization of a chondroitin sulphate proteoglycan from ovine brain | |
| Horst | Concurrent protein synthesis is required for in vivo chitin synthesis in postmolt blue crabs |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20210820 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210823 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20210821 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211126 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20211126 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211124 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20211223 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20220215 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20220624 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220628 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20230110 |