JP2019530470A - Ex vivo generation of γδ Foxp3 + regulatory T cells and their therapeutic use - Google Patents
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Abstract
本発明は、γδFoxp3+調節性T細胞をエクスビボで生成及び増殖させるための方法、ならびにその治療的使用に関する。本発明者らは、エクスビボでのヒト誘導性腫瘍抗原特異的CD4+TCRγδ非制限T細胞におけるFoxp3+発現の誘導及び腫瘍抗原特異的FOXP3発現CD4+TCRγδ非制限T細胞に対する自己CD8媒介性T細胞応答の誘導を実施した。本発明者らは、いずれの刺激の培養条件であっても、排他的に調節活性を発揮するようにコミットされた、エクスビボで生成及び増殖された抗原特異的Foxp3発現CD3+TCRγδ+非制限T細胞に対する方法を開発した。特に、本発明は、以下の表現型:CD3+TCRγδ+Foxp3+を有するエクスビボのγδFoxp3+調節性T細胞を生成するための方法に関する。The present invention relates to methods for generating and expanding γδFoxp3 + regulatory T cells ex vivo, and therapeutic uses thereof. We performed ex vivo induction of Foxp3 + expression in human inducible tumor antigen-specific CD4 + TCRγδ non-restricted T cells and induction of autologous CD8-mediated T cell responses to tumor antigen-specific FOXP3-expressing CD4 + TCRγδ non-restricted T cells did. We have developed a method for ex vivo generated and expanded antigen-specific Foxp3 expressing CD3 + TCRγδ + unrestricted T cells committed to exert regulatory activity exclusively under any stimulation culture conditions Developed. In particular, the present invention relates to a method for generating ex vivo γδ Foxp3 + regulatory T cells having the following phenotype: CD3 + TCRγδ + Foxp3 +.
Description
本発明は、γδFoxp3+調節性T細胞を生成及び増殖させるためのエクスビボ方法及びその治療的使用に関する。 The present invention relates to ex vivo methods for generating and expanding γδ Foxp3 + regulatory T cells and their therapeutic use.
発明の背景 Background of the Invention
γδT細胞は循環T細胞の約1〜5%を占め、自然免疫と適応免疫の間の境界面で作用する。これらの細胞は、先天的免疫細胞と適応的免疫細胞の性質を組み合わせて持ち、治療、特に癌免疫療法における利用のために魅力的なものとなっている。実際に、γδT細胞は炎症性サイトカインを産生し、感染細胞又は悪性細胞を直接溶解し、再曝露時に攻撃病原体への記憶応答を確立することができる。古典的なαβT細胞とは異なり、Vγ9Vδ2T細胞(循環γδT細胞プールの主要なサブセット)は未処理抗原(例えばホスホモノエステルなど)を認識する。この認識はTCRにより媒介され、MHC分子により制限されない。 γδ T cells make up about 1-5% of circulating T cells and act at the interface between innate and adaptive immunity. These cells combine the properties of innate and adaptive immune cells, making them attractive for use in therapy, particularly cancer immunotherapy. Indeed, γδ T cells produce inflammatory cytokines and can directly lyse infected or malignant cells and establish a memory response to the attacking pathogen upon re-exposure. Unlike classical αβ T cells, Vγ9 Vδ2 T cells (a major subset of the circulating γδ T cell pool) recognize untreated antigens such as phosphomonoesters. This recognition is mediated by TCR and is not limited by MHC molecules.
Foxp3を発現する調節性γδT細胞を、適切な抗原刺激及びサイトカインの下で誘導することができることが当技術分野において示されている(Casetti et al. JI 2009, 183:3574-3577)。これらのFoxp3+調節性γδT細胞は抑制活性が可能である。 It has been shown in the art that regulatory γδT cells expressing Foxp3 can be induced under appropriate antigenic stimulation and cytokines (Casetti et al. JI 2009, 183: 3574-3577). These Foxp3 + regulatory γδ T cells are capable of inhibitory activity.
今日の時点で、これらのFoxp3+調節性γδT細胞をそれらの治療的利用のためにエクスビボで増殖させる方法は、当技術分野において示唆されていない。 As of today, there is no suggestion in the art how to grow these Foxp3 + regulatory γδ T cells ex vivo for their therapeutic use.
本発明は、このように、Foxp3+γδ調節性T細胞をエクスビボで生成及び増殖させる方法、ならびに前記Foxp3+γδ調節性T細胞の治療的使用を提供する。
要約
The present invention thus provides a method for generating and expanding Foxp3 + γδ regulatory T cells ex vivo, and the therapeutic use of said Foxp3 + γδ regulatory T cells.
wrap up
本発明は、以下の表現型:CD3+TCRγδ+Foxp3+を有するγδFoxp3+調節性T細胞をエクスビボで生成するための方法に関し、以下を含む
−γδT細胞活性化剤及び以下の薬剤:i)cAMP(環状アデノシン一リン酸)活性化剤、ii)TGFβ(形質転換成長因子ベータ)経路活性化剤、iii)mTOR 阻害剤、場合によりiv)IL−2、IL−7、IL−15、及びTSLPの群において選択される少なくとも1つのサイトカイン、ならびに場合によりv)少なくとも1つのTET酵素活性化剤(好ましくはビタミンC及びNaHS硫化水素放出薬剤より選択される)及び/又は少なくとも1つのDNMT阻害剤(例えば、RG108、DAC、又は5ACなど)の存在において、少なくとも5日間CD3+TCRγδ+T細胞を培養すること。
The present invention relates to a method for generating ex vivo γδFoxp3 + regulatory T cells having the following phenotype: CD3 + TCRγδ + Foxp3 + , comprising: -γδT cell activator and the following agents: i) cAMP (Cyclic adenosine monophosphate) activator, ii) TGFβ (transforming growth factor beta) pathway activator, iii) mTOR inhibitor, optionally iv) IL-2, IL-7, IL-15, and TSLP At least one cytokine selected in the group, and optionally v) at least one TET enzyme activator (preferably selected from vitamin C and NaHS hydrogen sulfide releasing agents) and / or at least one DNMT inhibitor ( for example, RG108, DAC, or in the presence of 5AC etc.), at least 5 days CD3 + Culturing the CRγδ + T cells.
一実施形態において、γδT細胞活性化剤はポリクローナルγδT細胞活性化剤、好ましくは抗TCRγδ抗体又は非ペプチドリン酸化抗原である。 In one embodiment, the γδ T cell activator is a polyclonal γδ T cell activator, preferably an anti-TCRγδ antibody or a non-peptide phosphoantigen.
別の実施形態において、γδT細胞活性化剤は抗原特異的γδT細胞活性化剤、好ましくは寛容原性樹状細胞(DC)であり、少なくとも1つのビスホスホネート、好ましくは少なくとも1つのアミノビホスホネートを用いてパルスされる。 In another embodiment, the γδ T cell activator is an antigen-specific γδ T cell activator, preferably a tolerogenic dendritic cell (DC), using at least one bisphosphonate, preferably at least one aminobiphosphonate. Pulsed.
本発明の一実施形態において、cAMP活性化剤は、プロスタグランジンE2(PGE2)、EP2もしくはEP4アゴニスト、膜アデニンシクラーゼ活性化剤、又は代謝型グルタミン酸受容体アゴニストを含む群より選択される。 In one embodiment of the invention, the cAMP activator is selected from the group comprising a prostaglandin E2 (PGE2), an EP2 or EP4 agonist, a membrane adenine cyclase activator, or a metabotropic glutamate receptor agonist.
一実施形態において、TGFβ経路活性化剤は、TGFβ、骨形成タンパク質(BMP)、成長及び分化因子(GDF)、抗ミュラー管ホルモン(AMH)、アクチビン、ならびにノダールを含む群より選択される。 In one embodiment, the TGFβ pathway activator is selected from the group comprising TGFβ, bone morphogenetic protein (BMP), growth and differentiation factor (GDF), anti-Muellerian hormone (AMH), activin, and nodar.
一実施形態において、mTOR阻害剤は、ラパマイシン、ラパマイシン類似体、ウォルトマンニン;テオフィリン;カフェイン;エピガロカテキンガレート(EGCG)、クルクミン、レスベラトロール;ゲニステイン、3,3−ジインドリルメタン(DIM)、LY294002(2−(4−モルホリニル)−8−フェニル−4H−1−ベンゾピラン−4−オン)、PP242、PP30、Torin1、Ku−0063794、WAY−600、WYE−687、WYE−354、GNE477、NVP−BEZ235、PI−103、XL765、及びWJD008を含む群より選択される。 In one embodiment, the mTOR inhibitor is rapamycin, rapamycin analog, wortmannin; theophylline; caffeine; epigallocatechin gallate (EGCG), curcumin, resveratrol; genistein, 3,3-diindolylmethane (DIM) ), LY294002 (2- (4-morpholinyl) -8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one), PP242, PP30, Torin1, Ku-0063794, WAY-600, WYE-687, WYE-354, GNE477 , NVP-BEZ235, PI-103, XL765, and WJD008.
一実施形態において、本発明の方法は増殖工程をさらに含み、それにおいて、上に記載する生成方法により得られたγδFoxp3+調節性T細胞を、γδT細胞活性化剤及び以下の薬剤:i)cAMP(環状アデノシン一リン酸)活性化剤、ii)TGFβ(形質転換成長因子ベータ)経路活性化剤、iii)mTOR阻害剤、場合によりiv)IL−2、IL−7、IL−15、及びTSLPの群において選択される少なくとも1つのサイトカイン、ならびに場合によりv)少なくとも1つのTET酵素活性化剤(好ましくはビタミンC及びNaHS硫化水素放出剤より選択される)及び/又は少なくとも1つのDNMT阻害剤(例えばRG108、DAC、又は5ACなど)の存在において、少なくとも5日間培養する。 In one embodiment, the method of the invention further comprises a proliferation step, wherein the γδ Foxp3 + regulatory T cells obtained by the production method described above are transformed into a γδ T cell activator and the following agents: i) cAMP (Cyclic adenosine monophosphate) activator, ii) TGFβ (transforming growth factor beta) pathway activator, iii) mTOR inhibitor, optionally iv) IL-2, IL-7, IL-15, and TSLP At least one cytokine selected in the group, and optionally v) at least one TET enzyme activator (preferably selected from vitamin C and NaHS hydrogen sulfide releasing agent) and / or at least one DNMT inhibitor ( In the presence of RG108, DAC, or 5AC, for example, the cells are cultured for at least 5 days.
本発明の別の目的は、本明細書中の上で記載する方法により入手可能なエクスビボで生成されたγδFoxp3+調節性T細胞集団である。 Another object of the present invention is an ex vivo generated γδ Foxp3 + regulatory T cell population obtainable by the methods described hereinabove.
本発明のさらなる目的は、本発明に従った方法により入手可能な、エクスビボで生成及び増殖されたγδFoxp3+調節性T細胞集団に関する。 A further object of the present invention relates to an ex vivo generated and expanded γδ Foxp3 + regulatory T cell population obtainable by a method according to the present invention.
本発明はまた、炎症状態において機能的に安定なままである、エクスビボで生成されたγδFoxp3+調節性T細胞集団に関する。 The present invention also relates to an ex vivo generated γδ Foxp3 + regulatory T cell population that remains functionally stable in inflammatory conditions.
本発明はさらに、不活化γδFoxp3+調節性T細胞もしくはγδFoxp3+調節性T細胞のブレブ、又はγδFoxp3+調節性T細胞のブレブを負荷した免疫原性樹状細胞を含む免疫原性産物に関する。 The invention further relates to immunogenic products comprising immunogenic dendritic cells loaded with inactivated γδ Foxp3 + regulatory T cells or γδ Foxp3 + regulatory T cell blebs, or γδ Foxp3 + regulatory T cell blebs.
本発明はまた、不活化γδFoxp3+調節性T細胞及び少なくとも1つの医薬的に許容可能な賦形剤もしくはγδFoxp3+調節性T細胞のブレブ、又はγδFoxp3+調節性T細胞のブレブを負荷した免疫原性樹状細胞を含む医薬組成物を提供する。 The present invention also provides an immunogen loaded with inactivated γδ Foxp3 + regulatory T cells and at least one pharmaceutically acceptable excipient or γδ Foxp3 + regulatory T cell bleb, or γδ Foxp3 + regulatory T cell bleb. A pharmaceutical composition comprising a dendritic cell is provided.
本発明の別の目的は、不活化γδFoxp3+調節性T細胞及び少なくとも1つのアジュバントもしくはγδFoxp3+調節性T細胞のブレブ、又はγδFoxp3+調節性T細胞のブレブを負荷した免疫原性樹状細胞を含むワクチン組成物である。 Another object of the present invention is to provide immunogenic dendritic cells loaded with inactivated γδ Foxp3 + regulatory T cells and at least one adjuvant or γδ Foxp3 + regulatory T cell blebs, or γδ Foxp3 + regulatory T cell blebs. A vaccine composition comprising.
本発明のさらなる目的は、癌の処置における使用のための本発明に従った免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物に関する。 A further object of the present invention relates to an immunogenic product, pharmaceutical composition or vaccine composition according to the present invention for use in the treatment of cancer.
本発明はまた、γδFoxp3+調節性T細胞及び少なくとも1つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物に関する。 The present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising γδ Foxp3 + regulatory T cells and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
本発明はさらに、細胞療法における使用のための、本明細書において上に記載する医薬組成物に関する。 The present invention further relates to a pharmaceutical composition as described herein above for use in cell therapy.
本発明のさらなる目的は、炎症性疾患もしくは自己免疫疾患を処置する際での使用のための、又は移植拒絶反応もしくは移植片対宿主病(GVHD)を防止するための、本明細書において上に記載する医薬組成物である。 A further object of the present invention is as described herein above for use in treating inflammatory or autoimmune diseases or for preventing transplant rejection or graft-versus-host disease (GVHD). The pharmaceutical composition described.
定義 Definition
本明細書において使用するように、「調節性T細胞」又は「Treg」は、細胞−細胞接触又はMLR抑制(混合リンパ球反応)のいずれかにより抑制活性(即ち、従来型T細胞の増殖を阻害すること)が可能な細胞を指す。これらの細胞は、異なる亜集団(MHCII制限CD4+Foxp3+調節性T細胞、γδFoxp3+調節性T細胞、及びインバリアントFoxp3+調節性T細胞を含むが、これらに限定しない)を含む。 As used herein, “regulatory T cells” or “Tregs” inhibit inhibitory activity (ie, proliferation of conventional T cells) by either cell-cell contact or MLR inhibition (mixed lymphocyte reaction). Refers to a cell capable of inhibiting). These cells contain different subpopulations (MHCII restriction CD4 + Foxp3 + regulatory T cells, GanmaderutaFoxp3 + regulatory T cells, and including invariant Foxp3 + regulatory T cells, but not limited to).
本明細書において使用するように、「インバリアントFoxp3+調節性T細胞」は、以下の表現型:CD3+Vα24+Foxp3+を有する細胞を指す。これらの細胞は、CD1制限下で非ペプチド脂質抗原を認識する。 As used herein, “invariant Foxp3 + regulatory T cells” refers to cells having the following phenotype: CD3 + Vα24 + Foxp3 + . These cells recognize non-peptide lipid antigens under CD1 restriction.
本明細書において使用するように、「γδFoxp3+調節性T細胞」は、以下の表現型:γδTCR+Foxp3+を有する細胞を指す。これらの細胞は、MHC(主要組織適合遺伝子複合体)制限を伴わずに非ペプチドリン酸化抗原を認識する。 As used herein, “γδFoxp3 + regulatory T cells” refers to cells having the following phenotype: γδTCR + Foxp3 + . These cells recognize non-peptide phosphoantigens without MHC (major histocompatibility complex) restriction.
本明細書において使用するように、「MHCII制限CD4+Foxp3+調節性T細胞」は、以下の表現型:CD4+CD25+Foxp3+を有する細胞を指す。これらの細胞は、それらのαβTCR(T細胞受容体)により同定され、制限MHCクラスII(主要組織適合遺伝子複合体クラスII)分子により提示されるペプチド(外来又は自己ペプチドを含む)を認識する。 As used herein, “MHCII restricted CD4 + Foxp3 + regulatory T cells” refers to cells having the following phenotype: CD4 + CD25 + Foxp3 + . These cells recognize peptides (including foreign or self-peptides) identified by their αβTCR (T cell receptor) and presented by restricted MHC class II (major histocompatibility complex class II) molecules.
本明細書において使用するように、用語「処置」は、治療的処置ならびに予防的及び防止的手段を指し、それにおいて、その目的は、標的とされる病理学的障害又は状態を防止又は減速(減少、軽減)することである。処置を必要とする人は、既にその障害を伴っている人ならびにその障害に罹りやすい人、又はその障害を防止すべき人を含む。被験体又は哺乳動物は、本発明に従った治療量のγδFoxp3+調節性T細胞又は治療量の不活化γδFoxp3+調節性T細胞を受けた後、患者が以下の1つ以上における観察可能及び/又は測定可能な低下又は非存在を示す場合、疾患について成功裏に処置されている:病原性細胞の数における低下;病原性である全細胞のパーセントにおける低下;及び/又は特定の疾患又は状態に関連する1つ以上の症状のある程度の緩和;罹患率及び死亡率の低下、ならびに生活の質の問題における改善。疾患における成功裏の処置及び改善を評価するための上のパラメータは、医師が精通している日常的な手順により容易に測定可能である。 As used herein, the term “treatment” refers to therapeutic treatment and prophylactic and preventative measures, wherein the purpose is to prevent or slow down the targeted pathological disorder or condition ( Reduction, reduction). Persons in need of treatment include those already with the disorder as well as those who are susceptible to the disorder or who should be prevented from the disorder. After the subject or mammal has received a therapeutic amount of γδFoxp3 + regulatory T cells or a therapeutic amount of inactivated γδFoxp3 + regulatory T cells according to the present invention, the patient is observable in one or more of the following: Or has been successfully treated for a disease if it shows a measurable decrease or absence: a decrease in the number of pathogenic cells; a decrease in the percentage of total cells that are pathogenic; and / or a particular disease or condition Some relief of one or more related symptoms; reduced morbidity and mortality, and improvement in quality of life issues. The above parameters for assessing successful treatment and improvement in the disease can be readily measured by routine procedures familiar to physicians.
本明細書において使用するように、「治療的な効果的な量」は、標的に対して有意な負の又は有害な副作用を起こすことなく治療応答を誘導することを目的とするγδFoxp3+調節性T細胞又は不活化γδFoxp3+調節性T細胞の数を指す。治療的に効果的な量を、予防的又は防止的な作用のために、処置される疾患の発症に先立ち投与してもよい。あるいは又は加えて、治療的に効果的な量は、治療作用のために、処置される疾患の開始後に投与してもよい。 As used herein, a “therapeutically effective amount” is a γδ Foxp3 + modulatory property intended to induce a therapeutic response without causing significant negative or adverse side effects to the target. Refers to the number of T cells or inactivated γδ Foxp3 + regulatory T cells. A therapeutically effective amount may be administered prior to the onset of the disease being treated, for a prophylactic or preventative effect. Alternatively or in addition, a therapeutically effective amount may be administered after the onset of the disease being treated for therapeutic effect.
本明細書において使用するように、「治療応答」は、被験体におけるγδFoxp3+調節性T細胞治療又はγδFoxp3+調節性T細胞ワクチン接種により誘導される治療上の利益を指す。治療応答は、(1)処置される疾患の発症を遅延又は防止する;(2)処置される疾患の1つ以上の症状の進行、増悪、又は悪化を減速又は停止させる;(3)処置される疾患の症状の寛解をもたらす;(4)処置される疾患の重症度又は発生率を低下させる;あるいは(5)処置される疾患を治癒するという事実を含みうる。 As used herein, "therapeutic response" refers to therapeutic benefit induced by GanmaderutaFoxp3 + regulatory T cell therapy or GanmaderutaFoxp3 + regulatory T cell vaccination in a subject. The therapeutic response (1) delays or prevents the onset of the disease being treated; (2) slows or stops the progression, exacerbation, or worsening of one or more symptoms of the disease being treated; (3) treated May result in remission of the symptoms of the disease being treated; (4) reducing the severity or incidence of the disease being treated; or (5) the fact of curing the disease being treated.
本明細書において使用するように、数値の前の「約」は、その数値の値の10%より多いか又は少ないことを意味する。 As used herein, “about” before a number means more or less than 10% of the value of that number.
本明細書において使用するように、「被験体又は患者」は哺乳動物、好ましくはヒトを指す。本発明において、用語、被験体及び患者を同じ意味で使用することがある。非ヒト哺乳動物の例は、ペット(例えばイヌ、ネコ、家畜のブタ、ウサギ、フェレット、ハムスター、マウス、ラットなど);霊長類(例えばチンパンジー、サルなど);経済的に重要な動物(例えばウシ、ブタ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギなど)を含む。一実施形態において、被験体は、医療を受けるのを待っている、もしくは受けている、又は医学的手技の対象であった/である/になりうる、又は疾患の発症についてモニターされている。一実施形態において、被験体は成体である(例えば、18を上回る被験体)。別の実施形態において、被験体は子である(例えば、18歳未満の被験体)。一実施形態において、被験体は雄である。別の実施形態において、被験体は雌である。 As used herein, “subject or patient” refers to a mammal, preferably a human. In the present invention, the terms “subject” and “subject” may be used interchangeably. Examples of non-human mammals are pets (eg, dogs, cats, domestic pigs, rabbits, ferrets, hamsters, mice, rats, etc.); primates (eg, chimpanzees, monkeys, etc.); Pigs, rabbits, horses, sheep, goats, etc.). In one embodiment, the subject is waiting to receive medical treatment, or is / becomes / can be the subject of a medical procedure, or is monitored for the onset of disease. In one embodiment, the subject is an adult (eg, more than 18 subjects). In another embodiment, the subject is a child (eg, a subject under the age of 18). In one embodiment, the subject is male. In another embodiment, the subject is a female.
本明細書において使用するように、「同種異系細胞」は、1つの被験体(ドナー)から単離され、別の被験体(レシピエント又は宿主)に注入された細胞を指す。 As used herein, “allogeneic cell” refers to a cell that has been isolated from one subject (donor) and injected into another subject (recipient or host).
本明細書において使用するように、「自己細胞」は、単離され、同じ被験体(レシピエント又は宿主)に注入される細胞を指す。 As used herein, “autologous cell” refers to a cell that is isolated and injected into the same subject (recipient or host).
詳細な説明 Detailed description
本発明は、エクスビボでγδFoxp3+調節性T細胞を生成するための方法に関する。 The present invention relates to a method for generating γδ Foxp3 + regulatory T cells ex vivo.
一実施形態において、エクスビボでγδFoxp3+調節性T細胞を生成するための方法は以下を含む:
−γδT細胞活性化剤及び以下の薬剤:i)cAMP(環状アデノシン一リン酸)活性化剤、ii)TGFβ(形質転換成長因子ベータ)経路活性化剤、iii)mTOR阻害剤、場合によりiv)IL−2、IL−7、IL−15、及びTSLP(胸腺ストローマリンホポエチン)の群において選択される少なくとも1つのサイトカイン、ならびに、場合によりv)少なくとも1つのTET酵素活性化剤及び/又は少なくとも1つのDNMT阻害剤の存在においてCD3+TCRγδ+T細胞、好ましくはCD3+TCRγδ+CD45RA+T細胞を、少なくとも5日間培養すること、
−それにより、好ましくはγδナイーブ(CD45RA+)T細胞から、エクスビボで生成されたγδFoxp3+調節性T細胞の集団を得ること。
In one embodiment, a method for generating γδFoxp3 + regulatory T cells ex vivo comprises:
Γδ T cell activators and the following agents: i) cAMP (cyclic adenosine monophosphate) activator, ii) TGFβ (transforming growth factor beta) pathway activator, iii) mTOR inhibitor, optionally iv) At least one cytokine selected in the group of IL-2, IL-7, IL-15, and TSLP (thymic stromal lymphopoietin), and optionally v) at least one TET enzyme activator and / or Culturing CD3 + TCRγδ + T cells, preferably CD3 + TCRγδ + CD45RA + T cells in the presence of at least one DNMT inhibitor for at least 5 days;
-Thereby obtaining an ex vivo generated population of γδ Foxp3 + regulatory T cells, preferably from γδ naive (CD45RA + ) T cells.
一実施形態において、CD3+TCRγδ+T細胞、好ましくはCD3+TCRγδ+CD45RA+T細胞は、血液サンプルから当技術分野において周知の任意の技術により得る。一実施形態において、CD3+TCRγδ+T細胞、好ましくはCD3+TCRγδ+CD45RA+T細胞は、フローサイトメトリーによりPBMC(末梢血単核球)から単離する。一実施形態において、CD3+TCRγδ+T細胞、好ましくはCD3+TCRγδ+CD45RA+T細胞を凍結PBMCから単離してもよい。 In one embodiment, CD3 + TCRγδ + T cells, preferably CD3 + TCRγδ + CD45RA + T cells, are obtained from a blood sample by any technique well known in the art. In one embodiment, CD3 + TCRγδ + T cells, preferably CD3 + TCRγδ + CD45RA + T cells are isolated from PBMC (peripheral blood mononuclear cells) by flow cytometry. In one embodiment, CD3 + TCRγδ + T cells, preferably CD3 + TCRγδ + CD45RA + T cells, may be isolated from frozen PBMC.
一実施形態において、単離CD3+TCRγδ+T細胞、好ましくはCD3+TCRγδ+CD45RA+T細胞の取得は、任意の最初の精製工程により改善されうる。CD3+TCRγδ+T細胞、好ましくはCD3+TCRγδ+CD45RA+T細胞を、可溶性抗CD28及び抗CD40抗体の存在において抗原パルス寛容原性DC(例えば、オボアルブミンパルス寛容原性DC)を用いて刺激する。一実施形態において、刺激の時間は1時間〜24時間の間、好ましくは10時間〜20時間の間、より好ましくは約16時間の間の範囲である。刺激後、細胞を、例えばPBSを用いて洗浄し、選別のために抗CD154及び抗CD4抗体を用いて染色する。精製CD3+TCRγδ+CD154+T細胞を濃縮し、以下の活性化工程のために使用してもよい。 In one embodiment, obtaining isolated CD3 + TCRγδ + T cells, preferably CD3 + TCRγδ + CD45RA + T cells, can be improved by any initial purification step. CD3 + TCRγδ + T cells, preferably CD3 + TCRγδ + CD45RA + T cells, are stimulated with antigen pulse tolerogenic DCs (eg, ovalbumin pulse tolerogenic DCs) in the presence of soluble anti-CD28 and anti-CD40 antibodies. To do. In one embodiment, the duration of stimulation ranges between 1 hour and 24 hours, preferably between 10 hours and 20 hours, more preferably between about 16 hours. After stimulation, the cells are washed, for example with PBS, and stained with anti-CD154 and anti-CD4 antibodies for sorting. Purified CD3 + TCRγδ + CD154 + T cells may be enriched and used for the following activation steps.
一実施形態において、CD3+TCRγδ+T細胞をγδT細胞活性化剤の存在において活性化する。前記γδT細胞活性化剤は、ポリクローナルγδT細胞活性化剤又は抗原特異的γδT細胞活性化剤でありうる。 In one embodiment, CD3 + TCR γδ + T cells are activated in the presence of a γδ T cell activator. The γδ T cell activator can be a polyclonal γδ T cell activator or an antigen-specific γδ T cell activator.
本発明において、ポリクローナルγδT細胞活性化剤はTCRγδ活性化剤である。TCRγδ活性化剤の例は、抗TCRγδ抗体、例えば精製マウス抗ヒトTCRγδクローンB1(参照555715、BD Biosciences)、抗ヒトTCRγδ抗体(参照331209、Biolegend)、モノクローナルTCRγδ抗体(参照NBP2−22489又はNBP2−22510、Novus Biologicals)、抗マウスγδTCR抗体(参照12−5711−81、eBioscience)、TCRγδ抗体(参照MAB7297、R&D Systems)、抗T細胞受容体γδ抗体(参照ABIN2372990、抗体オンライン)、抗TCRガンマ+TCRデルタ抗体(参照ab25663、Abcam)、抗γδTCR抗体クローンIMMU510(Beckman Coulter);非ペプチドリン酸化抗原(リン酸化非ペプチド抗原とも呼ばれる)、イソプレニルピロリン酸(IPP)、(E)−4−ヒドロキシ−3−メチル−ブタ−2−エニル二リン酸(HMB−PP)及びそれらの類似体(例えばブロモヒドリン二リン酸(BrHPP)及び2−メチル−3−ブテニル−1−ピロリン酸(2M3B1PP)など)を含むが、これらに限定しない;F1−ATPアーゼ;アポリポタンパク質A−1;結核菌;UL16結合タンパク質4(ULBP4);CD1c;スルファチドを負荷したCD1d四量体;内皮プロテインC受容体(EPCR)、リポエキサペプチド;フィコエリトリン、ヒスチジルtRNAシンターゼ及びブチロフィリン3A1などを含むが、これらに限定しない。 In the present invention, the polyclonal γδ T cell activator is a TCR γδ activator. Examples of TCRγδ activators include anti-TCRγδ antibodies, such as purified mouse anti-human TCRγδ clone B1 (Ref. 555715, BD Biosciences), anti-human TCRγδ antibody (Ref. 331209, Biolegend), monoclonal TCRγδ antibody (Ref. NBP2-222489 or NBP2- 22510, Novus Biologicals), anti-mouse γδ TCR antibody (reference 12-5711-81, eBioscience), TCR γδ antibody (reference MAB7297, R & D Systems), anti-T cell receptor γδ antibody (reference ABIN 2372990, antibody online), anti-TCR gamma + TCR Delta antibody (reference ab25663, Abcam), anti-γδTCR antibody clone IMMU510 (Beckman Coulter); non-peptide phosphoantigen (also called phosphorylated non-peptide antigen), isoprenyl pyrophosphate (IPP), (E) -4-hydroxy -3-Methyl-but-2-enyl diphosphate (HMB-PP) and their analogs such as bromohydrin diphosphate (BrHPP) and 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP) F1-ATPase; Apolipoprotein A-1; Mycobacterium tuberculosis; UL16 binding protein 4 (ULBP4); CD1c; CD1d tetramer loaded with sulfatide; Endothelial protein C receptor (EPCR) , Lipoexapeptides; phycoerythrin, histidyl tRNA synthase, butyrophyllin 3A1, and the like.
別の実施形態において、ポリクローナルγδT細胞活性化剤は、MHCクラスI関連A(MICA)である。 In another embodiment, the polyclonal γδ T cell activator is MHC class I associated A (MICA).
別の実施形態において、ポリクローナルγδT細胞活性化剤は、癌細胞からの免疫原性アポトーシス小体又は癌細胞からの、もしくは組織溶解物から由来するブレブである。 In another embodiment, the polyclonal γδ T cell activator is an immunogenic apoptotic body from a cancer cell or a bleb from a cancer cell or from a tissue lysate.
癌細胞は、腫瘍生検から又は循環癌細胞の増殖から由来しうる。 Cancer cells can be derived from tumor biopsies or from the proliferation of circulating cancer cells.
癌細胞からの免疫原性アポトーシス小体は、例えばアントラサイクリン(ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、及びミトキサントロンを含む);オキサリプラチン、アポトーシス小体を放出するUVC又はγ線処理癌細胞を用いて得てもよい、あるいはアントラサイクリン(ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、及びミトキサントロンを含む);オキサリプラチン;UVC又はγ線処置癌から直接単離することができる。 Immunogenic apoptotic bodies from cancer cells are obtained using, for example, anthracyclines (including doxorubicin, daunorubicin, idarubicin, and mitoxantrone); oxaliplatin, UVC or gamma-treated cancer cells that release apoptotic bodies Or can be isolated directly from anthracyclines (including doxorubicin, daunorubicin, idarubicin, and mitoxantrone); oxaliplatin; UVC or gamma treated cancer.
ブレブは重要な免疫原性粒子を構成する。それらはアポトーシス細胞の表面で形成された不均一な小胞である。一実施形態において、ブレブのサイズは0.05〜5μm、好ましくは0.1〜1μmの範囲である。種々の免疫原性細胞死(ICD)誘導物質が、アポトーシス細胞又は自食作用細胞からのブレブの放出を誘導することができ、例えば、5000radでの照射、ならびにいくつかの抗新生物剤(ドキソルビシン、オキサリプラチン、及びシスプラチンを含む)などである。免疫原性癌細胞ブレブは、特に、アポトーシス性癌細胞から、又は化学的もしくは物理的誘導物質による処理後の癌細胞オートファジーから得てもよい。 The bleb constitutes an important immunogenic particle. They are heterogeneous vesicles formed on the surface of apoptotic cells. In one embodiment, the size of the bleb is in the range of 0.05-5 μm, preferably 0.1-1 μm. Various immunogenic cell death (ICD) inducers can induce the release of blebs from apoptotic cells or autophagic cells, such as irradiation at 5000 rads, as well as some antineoplastic agents (doxorubicin) , Oxaliplatin, and cisplatin). Immunogenic cancer cell blebs may in particular be obtained from apoptotic cancer cells or from cancer cell autophagy after treatment with chemical or physical inducers.
一実施形態において、ポリクローナルγδT細胞活性化剤は、抗TCRγδ抗体又は非ペプチドリン酸化抗原、例えばイソプレニルピロリン酸(IPP)などである。 In one embodiment, the polyclonal γδ T cell activator is an anti-TCRγδ antibody or a non-peptide phosphoantigen, such as isoprenyl pyrophosphate (IPP).
一実施形態において、ポリクローナルγδT細胞活性化剤、好ましくは、抗TCRγδ抗体は、培養培地中に可溶性である。別の実施形態において、ポリクローナルγδT細胞活性化剤を培養プレートにコーティングする。 In one embodiment, the polyclonal γδ T cell activator, preferably the anti-TCRγδ antibody, is soluble in the culture medium. In another embodiment, a polyclonal γδ T cell activator is coated on the culture plate.
一実施形態において、ポリクローナルγδT細胞活性化剤、好ましくは、抗TCRγδ抗体は、フィーダー細胞、好ましくは自己フィーダー細胞の存在において使用する。 In one embodiment, a polyclonal γδ T cell activator, preferably an anti-TCRγδ antibody, is used in the presence of feeder cells, preferably autologous feeder cells.
フィーダー細胞は、ΔCD3細胞(T細胞枯渇アクセサリー細胞)、照射PBMC、照射DC、人工APC(抗原提示細胞)、Sf9細胞、昆虫細胞、異なる被験体からのPBMCのプール又はB細胞のプール、KCD40L細胞、EBV形質転換B細胞株、及びEBV形質転換リンパ芽球細胞(LCL)を含むが、これらに限定しない。 Feeder cells are: ΔCD3 cells (T cell depleted accessory cells), irradiated PBMC, irradiated DC, artificial APC (antigen presenting cells), Sf9 cells, insect cells, pools of PBMC or B cells from different subjects, KCD40L cells , EBV transformed B cell lines, and EBV transformed lymphoblast cells (LCL).
好ましくは、本発明において使用するフィーダー細胞は、抗CD3コーティングビーズとのインキュベーションによるPBMCからのネガティブ選択により単離され、次に3000radで照射されるΔCD3細胞である。 Preferably, the feeder cells used in the present invention are ΔCD3 cells isolated by negative selection from PBMC by incubation with anti-CD3 coated beads and then irradiated at 3000 rad.
一実施形態において、T細胞/支持細胞の比率は約1:100から約1:10000、好ましくは1:1000から1:5000の範囲である。本発明の範囲内では、表現「1:100から1:10000」は、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:1250、1:1500、1:1750、1:2000、1:2250、1:2500、1:2750、1:3000、1:3250、1:3500、1:3750、1:4000、1:4250、1:4500、1:4750、1:5000、1:5250、1:5500、1:5750、1:6000、1:6250、1:6500、1:6750、1:7000、1:7250、1:7500、1:7750、1:8000、1:8250、1:8500、1:8750、1:9000、1:9250、1:9500、1:9750、及び1:10000を含むが、これらに限定しない。 In one embodiment, the ratio of T cells / supporting cells ranges from about 1: 100 to about 1: 10000, preferably 1: 1000 to 1: 5000. Within the scope of the present invention, the expression “1: 100 to 1: 10000” is 1: 100, 1: 200, 1: 300, 1: 400, 1: 500, 1: 600, 1: 700, 1: 800. 1: 900, 1: 1000, 1: 1250, 1: 1500, 1: 1750, 1: 2000, 1: 2250, 1: 2500, 1: 2750, 1: 3000, 1: 3250, 1: 3500, 1, : 3750, 1: 4000, 1: 4250, 1: 4500, 1: 4750, 1: 5000, 1: 5250, 1: 5500, 1: 5750, 1: 6000, 1: 6250, 1: 6500, 1: 6750 1: 7000, 1: 7250, 1: 7500, 1: 7750, 1: 8000, 1: 8250, 1: 8500, 1: 8750, 1: 9000, 1: 9250, 1: 9500, 1:97 0, and 1: including the 10000, but are not limited to these.
本発明において、抗原特異的γδT細胞活性化剤は寛容原性樹状細胞(DC)である。 In the present invention, the antigen-specific γδ T cell activator is a tolerogenic dendritic cell (DC).
本明細書において使用するように、「寛容原性DC」は、寛容を誘導することが可能なDCを指す。一実施形態において、寛容原性DCは、前炎症誘発性サイトカイン(例えばIL−12、IL−23、又はTNFαなど)よりも抑制性のサイトカイン(例えばIL−10及びTGFβなど)を分泌することが可能である。一実施形態において、DCは、それらがIL−10:IL−12>1の比率においてIL−10及びIL−12を分泌する場合、寛容原性として定義する。 As used herein, “tolerogenic DC” refers to a DC capable of inducing tolerance. In one embodiment, the tolerogenic DC may secrete more inhibitory cytokines (such as IL-10 and TGFβ) than pro-inflammatory cytokines (such as IL-12, IL-23, or TNFα). Is possible. In one embodiment, DCs are defined as tolerogenic if they secrete IL-10 and IL-12 in a ratio of IL-10: IL-12> 1.
一実施形態において、寛容原性DCはそれらの表面上に主要組織適合性(MHC)クラスIa及び/又はMHCクラスIbを発現する。MHCクラスIaの提示は、HLA−A、HLA−B及び/又はHLA−C分子を通じた「古典的」提示を指すのに対し、MHCクラスIbの提示は、HLA−E、HLA−F、HLA−G、及び/又はHLA−H分子を通じた「非古典的」抗原提示を指す。 In one embodiment, tolerogenic DCs express major histocompatibility (MHC) class Ia and / or MHC class Ib on their surface. Presentation of MHC class Ia refers to “classical” presentation through HLA-A, HLA-B and / or HLA-C molecules, whereas presentation of MHC class Ib includes HLA-E, HLA-F, HLA -Refers to "non-classical" antigen presentation through G and / or HLA-H molecules.
一実施形態において、寛容原性DCは、それらの表面上に50%のMHCクラスIa分子及び50%のMHCクラスIb分子を発現する。一実施形態において、寛容原性DCは、それらの表面上に45%のMHCクラスIa分子及び55%のMHCクラスIb分子を発現する。一実施形態において、寛容原性DCは、それらの表面上に40%のMHCクラスIa分子及び60%のMHCクラスIb分子を発現する。一実施形態において、寛容原性DCは、それらの表面上に35%のMHCクラスIa分子及び65%のMHCクラスIb分子を発現する。一実施形態において、寛容原性DCは、それらの表面上に30%のMHCクラスIa分子及び70%のMHCクラスIb分子を発現する。一実施形態において、寛容原性DCは、それらの表面上に25%のMHCクラスIa分子及び75%のMHCクラスIb分子を発現する。一実施形態において、寛容原性DCは、それらの表面上に20%のMHCクラスIa分子及び80%のMHCクラスIb分子を発現する。一実施形態において、寛容原性DCは、それらの表面上に15%のMHCクラスIa分子及び85%のMHCクラスIb分子を発現する。一実施形態において、寛容原性DCは、それらの表面上に10%のMHCクラスIa分子及び90%のMHCクラスIb分子を発現する。一実施形態において、寛容原性DCは、それらの表面上に5%のMHCクラスIa分子及び95%のMHCクラスIb分子を発現する。一実施形態において、寛容原性DCは、それらの表面上にMHCクラスIb分子だけを発現する。 In one embodiment, tolerogenic DCs express 50% MHC class Ia molecules and 50% MHC class Ib molecules on their surface. In one embodiment, tolerogenic DCs express 45% MHC class Ia molecules and 55% MHC class Ib molecules on their surface. In one embodiment, tolerogenic DCs express 40% MHC class Ia molecules and 60% MHC class Ib molecules on their surface. In one embodiment, tolerogenic DCs express 35% MHC class Ia molecules and 65% MHC class Ib molecules on their surface. In one embodiment, tolerogenic DCs express 30% MHC class Ia molecules and 70% MHC class Ib molecules on their surface. In one embodiment, tolerogenic DCs express 25% MHC class Ia molecules and 75% MHC class Ib molecules on their surface. In one embodiment, tolerogenic DCs express 20% MHC class Ia molecules and 80% MHC class Ib molecules on their surface. In one embodiment, tolerogenic DCs express 15% MHC class Ia molecules and 85% MHC class Ib molecules on their surface. In one embodiment, tolerogenic DCs express 10% MHC class Ia molecules and 90% MHC class Ib molecules on their surface. In one embodiment, tolerogenic DCs express 5% MHC class Ia molecules and 95% MHC class Ib molecules on their surface. In one embodiment, tolerogenic DCs express only MHC class Ib molecules on their surface.
一実施形態において、寛容原性DCは、それらの表面上に50%のHLA−A、HLA−B、及び/又はHLA−C分子ならびに50%のHLA−E分子を発現する。一実施形態において、寛容原性DCは、それらの表面上に45%のHLA−A、HLA−B、及び/又はHLA−C分子ならびに55%のHLA−E分子を発現する。一実施形態において、寛容原性DCは、それらの表面上に40%のHLA−A、HLA−B、及び/又はHLA−C分子ならびに60%のHLA−E分子を発現する。一実施形態において、寛容原性DCは、それらの表面上に35%のHLA−A、HLA−B、及び/又はHLA−C分子ならびに65%のHLA−E分子を発現する。一実施形態において、寛容原性DCは、それらの表面上に30%のHLA−A、HLA−B、及び/又はHLA−C分子ならびに70%のHLA−E分子を発現する。一実施形態において、寛容原性DCは、それらの表面上に25%のHLA−A、HLA−B、及び/又はHLA−C分子ならびに75%のHLA−E分子を発現する。一実施形態において、寛容原性DCは、それらの表面上に20%のHLA−A、HLA−B、及び/又はHLA−C分子ならびに80%のHLA−E分子を発現する。一実施形態において、寛容原性DCは、それらの表面上に15%のHLA−A、HLA−B、及び/又はHLA−C分子ならびに85%のHLA−E分子を発現する。一実施形態において、寛容原性DCは、それらの表面上に10%のHLA−A、HLA−B、及び/又はHLA−C分子ならびに90%のHLA−E分子を発現する。一実施形態において、寛容原性DCは、それらの表面上に5%のHLA−A、HLA−B、及び/又はHLA−C分子ならびに95%のHLA−E分子を発現する。一実施形態において、寛容原性DCは、それらの表面上にHLA−E分子だけを発現する。 In one embodiment, tolerogenic DCs express 50% HLA-A, HLA-B, and / or HLA-C molecules and 50% HLA-E molecules on their surface. In one embodiment, tolerogenic DCs express 45% HLA-A, HLA-B, and / or HLA-C molecules and 55% HLA-E molecules on their surface. In one embodiment, tolerogenic DCs express 40% HLA-A, HLA-B, and / or HLA-C molecules and 60% HLA-E molecules on their surface. In one embodiment, tolerogenic DCs express 35% HLA-A, HLA-B, and / or HLA-C molecules and 65% HLA-E molecules on their surface. In one embodiment, tolerogenic DCs express 30% HLA-A, HLA-B, and / or HLA-C molecules and 70% HLA-E molecules on their surface. In one embodiment, tolerogenic DCs express 25% HLA-A, HLA-B, and / or HLA-C molecules and 75% HLA-E molecules on their surface. In one embodiment, tolerogenic DCs express 20% HLA-A, HLA-B, and / or HLA-C molecules and 80% HLA-E molecules on their surface. In one embodiment, tolerogenic DCs express 15% HLA-A, HLA-B, and / or HLA-C molecules and 85% HLA-E molecules on their surface. In one embodiment, tolerogenic DCs express 10% HLA-A, HLA-B, and / or HLA-C molecules and 90% HLA-E molecules on their surface. In one embodiment, tolerogenic DCs express 5% HLA-A, HLA-B, and / or HLA-C molecules and 95% HLA-E molecules on their surface. In one embodiment, tolerogenic DCs express only HLA-E molecules on their surface.
寛容原性DCを得るための方法は当技術分野において周知である。例示的な方法は、CD14+単球からの免疫寛容原性DCの生成である。例えば、CD14+単球を、未成熟DCの生成のために、GM−CSF及びIL−4の存在において、又はGM−CSF及びIFNαの存在において培養する。 Methods for obtaining tolerogenic DC are well known in the art. An exemplary method is the generation of immunotolerogenic DC from CD14 + monocytes. For example, CD14 + monocytes are cultured in the presence of GM-CSF and IL-4 or in the presence of GM-CSF and IFNα for the generation of immature DC.
寛容原性DCの表面上のMHCクラスIa分子発現を阻害する又はHLA−E分子の発現を誘導するための方法は周知である。 Methods for inhibiting MHC class Ia molecule expression on the surface of tolerogenic DCs or inducing expression of HLA-E molecules are well known.
TAPトランスポーター(抗原プロセシングに関連するトランスポーター)の阻害は、MHCクラスIa分子の発現の減少に導き、それにより寛容原性DCの表面上でのHLA−E分子発現が促進される。 Inhibition of the TAP transporter (transporter associated with antigen processing) leads to decreased expression of MHC class Ia molecules, which promotes HLA-E molecule expression on the surface of tolerogenic DCs.
小胞体におけるTAPトランスポーターを阻害するための例示的な方法は、CRISPR−CAS−9技術、サイレンシングRNA、CMV(サイトメガロウイルス)からのUL−10ウイルスタンパク質を用いたトランスフェクトDC、又はウイルスタンパク質の使用を含むが、これらに限定しない。 Exemplary methods for inhibiting the TAP transporter in the endoplasmic reticulum include CRISPR-CAS-9 technology, silencing RNA, transfected DC using UL-10 viral protein from CMV (cytomegalovirus), or virus Including but not limited to the use of proteins.
TAPトランスポーターを阻害することができるウイルスタンパク質の例は、HSV−11CP47タンパク質、水痘ウイルスUL49.5タンパク質、サイトメガロウイルスUS6タンパク質、又はガンマヘルペスウイルスEBV BNLF2aタンパク質を含むが、これらに限定しない。 Examples of viral proteins that can inhibit the TAP transporter include, but are not limited to, HSV-11CP47 protein, varicella virus UL49.5 protein, cytomegalovirus US6 protein, or gammaherpesvirus EBV BNLF2a protein.
別の方法は、寛容原性DCの表面上のHLA−E発現を変化させることなくMHCクラスIa分子の発現を阻害するための化学製品の使用である。化学製品の例は、5’−メチル−5’−チオアデノシン又はレプトマイシンBを含むが、これらに限定しない。 Another method is the use of chemical products to inhibit the expression of MHC class Ia molecules without altering HLA-E expression on the surface of tolerogenic DCs. Examples of chemical products include but are not limited to 5'-methyl-5'-thioadenosine or leptomycin B.
寛容原性DCを、少なくとも1つのビスホスホネート、好ましくはアミノビスホスホネート(aminobiphosphonate)の存在において約24時間パルスする。ビスホスホネート(biphosphonate)の例は、ゾレドロン酸(又はゾレドロネート)、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、チルドロン酸、それらの組み合わせ、それらの塩、及びそれらの水和物を含むが、これらに限定しない。好ましくは、ビスホスホネート(biphosphonate)はゾレドロン酸又はゾレドロネートである。 Tolerogenic DCs are pulsed for about 24 hours in the presence of at least one bisphosphonate, preferably aminobiphosphonate. Examples of biphosphonates include zoledronic acid (or zoledronic acid), pamidronic acid, alendronic acid, risedronic acid, ibandronic acid, incadronic acid, etidronic acid, tiludronic acid, combinations thereof, their salts, and their hydration Including, but not limited to. Preferably, the bisphosphonate is zoledronic acid or zoledronate.
一実施形態において、ビスホスホネート、特にゾレドロン酸を10nMから50μMの濃度で使用する。本発明の範囲内において、表現「10nMから50μM」は、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM、1μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μMを含むが、これらに限定しない。 In one embodiment, bisphosphonates, in particular zoledronic acid, are used at a concentration of 10 nM to 50 μM. Within the scope of the present invention, the expression “10 nM to 50 μM” includes but is not limited to 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM, 750 nM, 1 μM, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM, 50 μM.
一実施形態において、培養物中に加えられたcAMP活性化剤によって、cAMP経路の活性化が可能になる。cAMP活性化剤の例は、PGE2(プロスタグランジンE2)、EP2又はEP4アゴニスト、膜アデニンシクラーゼ活性化剤(例えばフォルスコリンなど)、又は代謝型グルタミン酸受容体アゴニストを含むが、これらに限定しない。PGE2の例は、参照P5640又はP0409のPGE2(Sigma-Aldrich)、参照2296のPGE2(R&D Systems)、参照2268のPGE2(BioVision)、参照72192のPGE2(Stemcell)、参照ab144539のPGE2(Abcam)、及び参照14010のPGE2(Cayman Chemical)を含むが、これらに限定しない。 In one embodiment, a cAMP activator added to the culture allows activation of the cAMP pathway. Examples of cAMP activators include, but are not limited to, PGE2 (prostaglandin E2), EP2 or EP4 agonists, membrane adenine cyclase activators (such as forskolin), or metabotropic glutamate receptor agonists. Examples of PGE2 include reference P5640 or P0409 PGE2 (Sigma-Aldrich), reference 2296 PGE2 (R & D Systems), reference 2268 PGE2 (BioVision), reference 72192 PGE2 (Stemcell), reference ab144539 PGE2 (Abcam), And reference 14010 PGE2 (Cayman Chemical), but is not limited thereto.
一実施形態において、cAMP活性化剤、好ましくはPGE2を0.01μMから10μMの範囲の濃度で使用する。本発明の範囲内において、表現「0.01μMから10μM」は、0.02μM、0.03μM、0.04μM、0.05μM、0.06μM、0.07μM、0.08μM、0.09μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μMを含むが、これらに限定しない。特定の実施形態において、PGE2は0.03μMから1.5μMの範囲の濃度である。 In one embodiment, a cAMP activator, preferably PGE2, is used at a concentration ranging from 0.01 μM to 10 μM. Within the scope of the present invention, the expression “0.01 μM to 10 μM” means 0.02 μM, 0.03 μM, 0.04 μM, 0.05 μM, 0.06 μM, 0.07 μM, 0.08 μM, 0.09 μM, 0 1 μM, 0.2 μM, 0.3 μM, 0.4 μM, 0.5 μM, 0.6 μM, 0.7 μM, 0.8 μM, 0.9 μM, 1 μM, 1.5 μM, 2 μM, 2.5 μM, 3 μM, 3 Including, but not limited to, 5 μM, 4 μM, 4.5 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM. In certain embodiments, PGE2 is at a concentration in the range of 0.03 μM to 1.5 μM.
一実施形態において、培養物中に加えたTGFβ経路活性化剤によって、TGFβ経路の活性化が可能になる。TGFβ経路活性化剤の例は、TGFβファミリー(TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3)、骨形成タンパク質(BMP)、成長及び分化因子(GDF)、抗ミュラー管ホルモン(AMH)、アクチビン、及びノダールを含むが、これらに限定しない。TGFβの例は、参照T7039のTGFβ1(Sigma-Aldrich)、参照T2815のTGFβ2(Sigma-Aldrich)、参照T5425のTGFβ3(Sigma-Aldrich)、参照P01137のヒトTGFβ1(R&D systems)、参照580702のヒトTGFβ1(Biolegend)、参照HZ−1011のTGFβ1(HumanZyme)、参照14−8348−62のTGFβ1(Affymetrix eBioscience)を含むが、これらに限定しない。 In one embodiment, the TGFβ pathway activator added in the culture allows activation of the TGFβ pathway. Examples of TGFβ pathway activators include the TGFβ family (TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3), bone morphogenetic protein (BMP), growth and differentiation factor (GDF), anti-Muellerian hormone (AMH), activin, and nodal, It is not limited to these. Examples of TGFβ include TGFβ1 (Sigma-Aldrich) of reference T7039, TGFβ2 of reference T2815 (Sigma-Aldrich), TGFβ3 of reference T5425 (Sigma-Aldrich), human TGFβ1 of reference P01137 (R & D systems), human TGFβ1 of reference 580702 (Biolegend), including, but not limited to, TGFβ1 (HumanZyme) of reference HZ-1011, TGFβ1 (Affymetrix eBioscience) of reference 14-8348-62.
一実施形態において、経路活性化因子を1ng/mlから20ng/mlの範囲の濃度で使用する。本発明の範囲内において、表現「1ng/mlから20ng/ml」は、2ng/ml、2.5ng/ml、3ng/ml、3.5ng/ml、4ng/ml、4.5ng/ml、5ng/ml、5.5ng/ml、6ng/ml、6.5ng/ml、7ng/ml、7.5ng/ml、8ng/ml、8.5ng/ml、9ng/ml、9.5ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/mlを含むが、これらに限定しない。特定の実施形態において、TGFβは2.5ng/mlから7.5ng/mlの範囲の濃度である。 In one embodiment, pathway activators are used at concentrations ranging from 1 ng / ml to 20 ng / ml. Within the scope of the present invention, the expression “1 ng / ml to 20 ng / ml” means 2 ng / ml, 2.5 ng / ml, 3 ng / ml, 3.5 ng / ml, 4 ng / ml, 4.5 ng / ml, 5 ng / ml, 5.5 ng / ml, 6 ng / ml, 6.5 ng / ml, 7 ng / ml, 7.5 ng / ml, 8 ng / ml, 8.5 ng / ml, 9 ng / ml, 9.5 ng / ml, 10 ng including, but not limited to, / ml, 11 ng / ml, 12 ng / ml, 13 ng / ml, 14 ng / ml, 15 ng / ml, 16 ng / ml, 17 ng / ml, 18 ng / ml, 19 ng / ml. In certain embodiments, TGFβ is at a concentration in the range of 2.5 ng / ml to 7.5 ng / ml.
一実施形態において、培養物中に加えられたmTOR阻害剤によって、mTOR経路の阻害が可能になる。mTOR阻害剤の例は、ラパマイシン(シロリムスとも呼ばれる)及びその類似体(ラパログとも呼ばれる);ウォルトマンニン;テオフィリン;カフェイン;エピガロカテキンガレート(EGCG);クルクミン;レスベラトロール;ゲニステイン;3,3−ジインドリルメタン(DIM);LY294002(2−(4−モルホリニル)−8−フェニル−4H−1−ベンゾピラン−4−オン);PP242;PP30;Torin1;Ku−0063794;WAY−600;WYE−687;WYE−354;ならびにmTOR及びPI3K二重特異性阻害剤(例えばGNE477、NVP−BEZ235、PI−103、XL765、及びWJD008など)を含むが、これらに限定しない。ラパマイシンの例は、参照R0395のラパマイシン(Sigma-Aldrich)、参照S1039のラパマイシン(Selleckchem)、参照1292のラパマイシン(Tocris)、参照R− 5000のラパマイシン(LC Laboratories)、参照Tlrl−rapのラパマイシン(InvivoGen)、参照ab120224のラパマイシン(Abcam)、参照R0395のラパマイシン(Sigma−Aldrich)を含むが、これらに限定しない。 In one embodiment, an mTOR inhibitor added to the culture allows inhibition of the mTOR pathway. Examples of mTOR inhibitors are rapamycin (also called sirolimus) and its analogs (also called rapalog); wortmannin; theophylline; caffeine; epigallocatechin gallate (EGCG); curcumin; resveratrol; 3-diindolylmethane (DIM); LY294002 (2- (4-morpholinyl) -8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one); PP242; PP30; Torin1; Ku-0063794; WAY-600; 687; WYE-354; and mTOR and PI3K bispecific inhibitors (such as, but not limited to, GNE477, NVP-BEZ235, PI-103, XL765, and WJD008). Examples of rapamycin include rapamycin (Sigma-Aldrich) with reference R0395, Rapamycin (Selleckchem) with reference S1039, rapamycin (Tocris) with reference 1292, rapamycin with reference R-5000 (LC Laboratories), rapamycin with reference Tlrl-rap (InvivoGen) ), Reference ab120224 rapamycin (Abcam), reference R0395 rapamycin (Sigma-Aldrich).
臨床的に使用されるラパマイシンと同じ化学クラスの化合物の例は、エベロリムス(コード名RAD001)、テムシロリムス(コード名CCI−779、NSC 683864)、ゾタロリムス(コード名ABT−578)を含むが、これらに限定しない。 Examples of compounds of the same chemical class as rapamycin used clinically include everolimus (code name RAD001), temsirolimus (code name CCI-779, NSC 683864), zotarolimus (code name ABT-578). Not limited.
一実施形態において、mTOR阻害剤、好ましくは、ラパマイシンを0.1nMから50nMの範囲の濃度で使用する。本発明の範囲内において、表現「0.1nMから50nM」は、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM、1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM、11nM、12nM、13nM、14nM、15nM、16nM、17nM、18nM、19nM、20nM、21nM、22nM、23nM、24nM、25nM、26nM、27nM、28nM、29nM、30nM、31nM、32nM、33nM、34nM、35nM、36nM、37nM、38nM、39nM、40nM、41nM、42nM、43nM、44nM、45nM、46nM、47nM、48nM、49nMを含むが、これらに限定しない。 In one embodiment, an mTOR inhibitor, preferably rapamycin, is used at a concentration ranging from 0.1 nM to 50 nM. Within the scope of the present invention, the expression “0.1 nM to 50 nM” means 0.2 nM, 0.3 nM, 0.4 nM, 0.5 nM, 0.6 nM, 0.7 nM, 0.8 nM, 0.9 nM, 1 nM. 2 nM, 3 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, 9 nM, 10 nM, 11 nM, 12 nM, 13 nM, 14 nM, 15 nM, 16 nM, 17 nM, 18 nM, 19 nM, 20 nM, 21 nM, 22 nM, 23 nM, 24 nM, 25 nM, 26 nM 27 nM, 28 nM, 29 nM, 30 nM, 31 nM, 32 nM, 33 nM, 34 nM, 35 nM, 36 nM, 37 nM, 38 nM, 39 nM, 40 nM, 41 nM, 42 nM, 43 nM, 44 nM, 45 nM, 46 nM, 47 nM, 48 nM, 49 nM It is not limited to these.
一実施形態において、IL−2、IL−7、IL−15、及びTSLPより選択される少なくとも1つのサイトカインを培養物中に加えることができる。 In one embodiment, at least one cytokine selected from IL-2, IL-7, IL-15, and TSLP can be added to the culture.
一実施形態において、IL−2を10IU/mlから1000IU/mlの範囲の濃度で使用する。本発明の範囲内において、表現「10IU/mlから1000IU/ml」は、15IU/ml、20IU/ml、25IU/ml、30IU/ml、35IU/ml、40IU/ml、45IU/ml、50IU/ml、55IU/ml、60IU/ml、65IU/ml、70IU/ml、75IU/ml、80IU/ml、85IU/ml、90IU/ml、95IU/ml、100IU/ml、150IU/ml、200IU/ml、250IU/ml、300IU/ml、350IU/ml、400IU/ml、450IU/ml、500IU/ml、550IU/ml、600IU/ml、650IU/ml、700IU/ml、750IU/ml、800IU/ml、850IU/ml、900IU/ml、950IU/mlを含むが、これらに限定しない。特定の実施形態において、IL−2を50IU/mlから250IU/mlの範囲の濃度で使用する。 In one embodiment, IL-2 is used at a concentration ranging from 10 IU / ml to 1000 IU / ml. Within the scope of the present invention, the expression “10 IU / ml to 1000 IU / ml” means 15 IU / ml, 20 IU / ml, 25 IU / ml, 30 IU / ml, 35 IU / ml, 40 IU / ml, 45 IU / ml, 50 IU / ml. 55 IU / ml, 60 IU / ml, 65 IU / ml, 70 IU / ml, 75 IU / ml, 80 IU / ml, 85 IU / ml, 90 IU / ml, 95 IU / ml, 100 IU / ml, 150 IU / ml, 200 IU / ml, 250 IU / ml, 300 IU / ml, 350 IU / ml, 400 IU / ml, 450 IU / ml, 500 IU / ml, 550 IU / ml, 600 IU / ml, 650 IU / ml, 700 IU / ml, 750 IU / ml, 800 IU / ml, 850 IU / ml , 900 IU / ml, 950 IU / ml, but not limited thereto. In certain embodiments, IL-2 is used at concentrations ranging from 50 IU / ml to 250 IU / ml.
一実施形態において、IL−7を1ng/mlから100ng/mlの範囲の濃度で使用する。本発明の範囲内において、表現「1ng/mlから100ng/ml」は、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、55ng/ml、60ng/ml、65ng/ml、70ng/ml、75ng/ml、80ng/ml、85ng/ml、90ng/ml、95ng/ml、100ng/mlを含むが、これらに限定しない。 In one embodiment, IL-7 is used at a concentration ranging from 1 ng / ml to 100 ng / ml. Within the scope of the present invention, the expression “1 ng / ml to 100 ng / ml” means 1 ng / ml, 5 ng / ml, 10 ng / ml, 15 ng / ml, 20 ng / ml, 25 ng / ml, 30 ng / ml, 35 ng / ml. 40 ng / ml, 45 ng / ml, 50 ng / ml, 55 ng / ml, 60 ng / ml, 65 ng / ml, 70 ng / ml, 75 ng / ml, 80 ng / ml, 85 ng / ml, 90 ng / ml, 95 ng / ml, 100 ng Including / ml, but not limited to.
一実施形態において、IL−15を1ng/mlから50ng/mlの範囲の濃度で使用する。本発明の範囲内において、表現「1ng/mlから50ng/ml」は、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/mlを含むが、これらに限定しない。特定の実施形態において、IL−15を10ng/mlから30ng/mlの範囲の濃度で使用する。 In one embodiment, IL-15 is used at a concentration ranging from 1 ng / ml to 50 ng / ml. Within the scope of the present invention, the expression “1 ng / ml to 50 ng / ml” means 2 ng / ml, 3 ng / ml, 4 ng / ml, 5 ng / ml, 6 ng / ml, 7 ng / ml, 8 ng / ml, 9 ng / ml. Including, but not limited to, 10 ng / ml, 15 ng / ml, 20 ng / ml, 25 ng / ml, 30 ng / ml, 35 ng / ml, 40 ng / ml, 45 ng / ml. In certain embodiments, IL-15 is used at concentrations ranging from 10 ng / ml to 30 ng / ml.
一実施形態において、TSLPを1ng/mlから100ng/mlの範囲の濃度で使用する。本発明の範囲内において、表現「1ng/mlから100ng/ml」は、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、55ng/ml、60ng/ml、65ng/ml、70ng/ml、75ng/ml、80ng/ml、85ng/ml、90ng/ml、95ng/ml、100ng/mlを含むが、これらに限定しない。 In one embodiment, TSLP is used at a concentration ranging from 1 ng / ml to 100 ng / ml. Within the scope of the present invention, the expression “1 ng / ml to 100 ng / ml” means 1 ng / ml, 5 ng / ml, 10 ng / ml, 15 ng / ml, 20 ng / ml, 25 ng / ml, 30 ng / ml, 35 ng / ml. 40 ng / ml, 45 ng / ml, 50 ng / ml, 55 ng / ml, 60 ng / ml, 65 ng / ml, 70 ng / ml, 75 ng / ml, 80 ng / ml, 85 ng / ml, 90 ng / ml, 95 ng / ml, 100 ng Including / ml, but not limited to.
TET活性化剤の例は、ビタミンC及びNaHS硫化水素放出剤(H2S供与体としても公知である)を含むが、これらに限定しない。 Examples of TET activators include, but are not limited to, vitamin C and NaHS hydrogen sulfide release agents (also known as H2S donors).
一実施形態において、ビタミンCを1から100μg/mlの範囲の濃度で使用する。 In one embodiment, vitamin C is used at a concentration ranging from 1 to 100 μg / ml.
一実施形態において、NaHS硫化水素放出剤を0.25から8mMの範囲の濃度で使用する。 In one embodiment, NaHS hydrogen sulfide releasing agent is used at a concentration in the range of 0.25 to 8 mM.
DNMT阻害剤の例は、2−(1,3−ジオキソ−1,2−ジヒドロ−2H−イソインドール−2−イル)−3−(1H−インドール−3−イル)プロパン酸(RG108)、5−アザ−2’−デオキシシチジン(デシタビン又はDAC)、及び5−アザシチジン(5AC)を含むが、これらに限定しない。 Examples of DNMT inhibitors are 2- (1,3-dioxo-1,2-dihydro-2H-isoindol-2-yl) -3- (1H-indol-3-yl) propanoic acid (RG108), 5 -Including but not limited to aza-2'-deoxycytidine (decitabine or DAC) and 5-azacytidine (5AC).
一実施形態において、RG108を20から500μMの範囲の濃度で使用する。 In one embodiment, RG108 is used at a concentration in the range of 20 to 500 μM.
一実施形態において、DACを0.1から2μMの範囲の濃度で使用する。 In one embodiment, the DAC is used at a concentration in the range of 0.1 to 2 μM.
一実施形態において、5ACを0.1から10μMの範囲の濃度で使用する。 In one embodiment, 5AC is used at a concentration in the range of 0.1 to 10 μM.
一実施形態において、中和抗体を培養物に加え、調節性T細胞の他の集団の生成を防止することができる。 In one embodiment, neutralizing antibodies can be added to the culture to prevent the generation of other populations of regulatory T cells.
中和抗体の例は、抗IFNγ抗体、抗IL−4抗体、及び/又は抗IL12抗体を含むが、これらに限定しない。 Examples of neutralizing antibodies include, but are not limited to, anti-IFNγ antibodies, anti-IL-4 antibodies, and / or anti-IL12 antibodies.
抗IFNγ抗体の例は、Affymetrix eBioscience(参照14−7318)、R&D systems(参照MAB285)、Novus Biologicals(参照AF−485−NA)を含むが、これらに限定しない。 Examples of anti-IFNγ antibodies include, but are not limited to, Affymetrix eBioscience (reference 14-7318), R & D systems (reference MAB285), Novus Biologicals (reference AF-485-NA).
抗IL−4抗体の例は、R&D Systems(参照MAB304、MAB204、又はMAB204)、Affymetrix eBioscience(参照14−7048)、GeneTex(参照GTX10755)を含むが、これらに限定しない。 Examples of anti-IL-4 antibodies include, but are not limited to, R & D Systems (reference MAB304, MAB204, or MAB204), Affymetrix eBioscience (reference 14-7048), GeneTex (reference GTX10755).
抗IL−12抗体の例は、Affymetrix eBioscience(参照16−7129又は16−8126)、Biolegend(参照508803)、R&D Systems(参照MAB219、AF−219、又はAB−219)を含むが、これらに限定しない。 Examples of anti-IL-12 antibodies include, but are not limited to, Affymetrix eBioscience (reference 16-7129 or 16-8126), Biolegend (reference 508803), R & D Systems (reference MAB219, AF-219, or AB-219). do not do.
一実施形態において、本発明の培養物中に使用される培養培地は、(i)1つ以上のpH緩衝系;(ii)無機塩;(iii)微量元素;(iv)遊離アミノ酸;(v)ビタミン;(vi)ホルモン;(vii)炭素/エネルギー源を含む。 In one embodiment, the culture medium used in the cultures of the invention comprises (i) one or more pH buffer systems; (ii) inorganic salts; (iii) trace elements; (iv) free amino acids; Vitamins; (vi) hormones; (vii) carbon / energy sources.
無機塩の例は、臭化カルシウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、硝酸カルシウム、亜硝酸カルシウム、硫酸カルシウム、臭化マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、重炭酸カリウム、臭化カリウム、塩化カリウム、二水素化リン酸カリウム、二硫酸カリウム、リン酸水素二カリウム、硝酸カリウム、亜硝酸カリウム、亜硫酸カリウム、硫酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、二硫酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸ナトリウム及びそれらの混合物を含むが、これらに限定しない。 Examples of inorganic salts are calcium bromide, calcium chloride, calcium phosphate, calcium nitrate, calcium nitrite, calcium sulfate, magnesium bromide, magnesium chloride, magnesium sulfate, potassium bicarbonate, potassium bromide, potassium chloride, phosphorus dihydride Potassium acid, potassium disulfate, dipotassium hydrogen phosphate, potassium nitrate, potassium nitrite, potassium sulfite, potassium sulfate, sodium hydrogen carbonate, sodium bromide, sodium chloride, sodium disulfate, sodium hydrogen carbonate, sodium dihydrogen phosphate, phosphorus Including but not limited to disodium oxyhydrogen, sodium sulfate and mixtures thereof.
微量元素の例は、コバルト(Co)、銅(Cu)、鉄(Fe)、マグネシウム(Mg)、マンガン(Mn)、モリブデン(Mo)、ニッケル(Ni)、セレン(Se)、亜鉛(Zn)及びそれらの塩を含むが、これらに限定しない。 Examples of trace elements are cobalt (Co), copper (Cu), iron (Fe), magnesium (Mg), manganese (Mn), molybdenum (Mo), nickel (Ni), selenium (Se), zinc (Zn) And salts thereof, but are not limited thereto.
遊離アミノ酸の例は、L−アラニン、L−アルギニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−システイン、L−シスチン、L−グルタミン、L−グルタミン酸、グリシン、L− ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リジン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−プロリン、L−セリン、タウリン、L−スレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン及びそれらの混合物を含むが、これらに限定しない。 Examples of free amino acids are L-alanine, L-arginine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-cysteine, L-cystine, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L Including leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, taurine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine and mixtures thereof. Not limited.
ビタミンの例は、ビオチン(ビタミンH);D−パントテン酸カルシウム;塩化コリン;葉酸(ビタミンB9);ミオイノシトール;ニコチンアミド;ピリドキサール(ビタミンB6);リボフラビン(ビタミンB2);チアミン(ビタミンB1);コバラミン(ビタミンB12);アスコルビン酸;α−トコフェロール(ビタミンE)及びそれらの混合物を含むが、これらに限定しない。 Examples of vitamins are biotin (vitamin H); calcium D-pantothenate; choline chloride; folic acid (vitamin B9); myo-inositol; nicotinamide; pyridoxal (vitamin B6); riboflavin (vitamin B2); thiamine (vitamin B1); Including but not limited to cobalamin (vitamin B12); ascorbic acid; α-tocopherol (vitamin E) and mixtures thereof.
炭素/エネルギー源の例は、D−グルコース;ピルビン酸;乳酸;ATP;クレアチン;クレアチンホスファート及びそれらの混合物を含むが、これらに限定しない。 Examples of carbon / energy sources include, but are not limited to, D-glucose; pyruvic acid; lactic acid; ATP; creatine; creatine phosphate and mixtures thereof.
一実施形態において、培養培地は市販の細胞培養培地であり、特にGIBCO(登録商標)からのIMDM(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)又はGIBCO(登録商標)からのRPMI1640培地を含む群において選択される。 In one embodiment, the culture medium is a commercially available cell culture medium, particularly selected in the group comprising RPMI 1640 medium from IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium) from GIBCO® or GIBCO®. Is done.
他の実施形態において、培養培地は、無血清培養培地、例えばGIBCO(登録商標)からのAIM−V培地、LONZAからのX−VIVO 10、15、及び20培地などである。 In other embodiments, the culture medium is a serum-free culture medium, such as AIM-V medium from GIBCO®, X-VIVO 10, 15, and 20 medium from LONZA.
別の実施形態において、培養培地に、特にウシ胎児血清、プールされたヒトAB血清、サイトカイン、及び成長因子を含む群において選択される追加の化合物;特にペニシリン、ストレプトマイシン、及びそれらの混合物を含む群において選択される抗生物質をさらに添加することができる。 In another embodiment, the culture medium comprises an additional compound selected in the group comprising in particular fetal calf serum, pooled human AB serum, cytokines, and growth factors; in particular the group comprising penicillin, streptomycin, and mixtures thereof Further antibiotics selected in can be added.
一実施形態において、培養培地はIMDMである。 In one embodiment, the culture medium is IMDM.
一部の特定の実施形態において、培養培地はIMDM細胞培養培地;1%(w/w)から5%(w/w)のウシ胎児血清;10IU/mlから200IU/mlのペニシリン;10IU/mlから200IU/mlのストレプトマイシン;非必須アミノ酸、特にアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、及びチロシンを含む群において選択されるアミノ酸の0.1mMから10mMの混合物;0.5mMから10mMのグルタミン、10mMから25mMのHEPES(pH7.6〜7.8)を含む。 In some specific embodiments, the culture medium is IMDM cell culture medium; 1% (w / w) to 5% (w / w) fetal calf serum; 10 IU / ml to 200 IU / ml penicillin; 10 IU / ml. From 100 mM to 200 IU / ml streptomycin; 0.1 mM to 10 mM mixture of amino acids selected in the group comprising non-essential amino acids, in particular alanine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, proline, serine and tyrosine; Contains 0.5 mM to 10 mM glutamine, 10 mM to 25 mM HEPES (pH 7.6-7.8).
一実施形態において、培地はnTreg極性化培地である。本発明者らは、「nTreg極性化培地」を、本明細書の上に記載する少なくとも1つのcAMP活性化剤、本明細書の上に記載する少なくとも1つのTGFβ経路活性化剤、及び本明細書の上に記載する少なくとも1つのmTor阻害剤を含むRPMI培地などの培地として定義する。好ましい実施形態において、「nTreg極性化培地」は、TGFβ、ラパマイシン、及びPGE2を含むRPMI培地を指す。 In one embodiment, the medium is nTreg polarized medium. We have identified “nTreg Polarized Medium” as at least one cAMP activator as described hereinabove, at least one TGFβ pathway activator as described hereinabove, and Defined as a medium such as RPMI medium containing at least one mTor inhibitor as described above. In a preferred embodiment, “nTreg polarization medium” refers to RPMI medium containing TGFβ, rapamycin, and PGE2.
他の実施形態において、培地は炎症性培地である。本発明者らは、「炎症性培地」を、炎症性サイトカイン、例えばIL−1β(10ng/ml)、IL−6(30ng/ml)、IL−21(50ng/ml)、IL−23(30ng/ml)、IL−2(100UI/ml)などを含む培地(例えばIMDMなど)として定義する。 In other embodiments, the medium is an inflammatory medium. We have defined “inflammatory media” as inflammatory cytokines such as IL-1β (10 ng / ml), IL-6 (30 ng / ml), IL-21 (50 ng / ml), IL-23 (30 ng / ml), IL-2 (100 UI / ml) and the like (for example, IMDM).
一実施形態において、本発明のγδFoxp3+調節性T細胞を生成するための培養は、少なくとも5日、少なくとも6日、少なくとも7日、少なくとも8日の間実施する。本発明の範囲内において、表現「少なくとも5日」は、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日を含むが、これらに限定しない。 In one embodiment, the culture to generate γδ Foxp3 + regulatory T cells of the invention is performed for at least 5 days, at least 6 days, at least 7 days, at least 8 days. Within the scope of the present invention, the expression “at least 5 days” includes 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days. However, it is not limited to these.
一実施形態において、培養培地の一部を生成培地の時間経過の間に1回、2回、3回、4回、又は5回捨て、同容量の新鮮培養培地と交換する。本発明の範囲内において、用語「一部」は、培養培地の容量の少なくとも20%(v/v)、少なくとも25%(v/v)、少なくとも30%(v/v)、少なくとも35%(v/v)、少なくとも40%(v/v)、少なくとも45%(v/v)、少なくとも50%(v/v)、少なくとも55%(v/v)、少なくとも60%(v/v) 少なくとも65%(v/v)、少なくとも70%(v/v)、少なくとも75%(v/v)を意味することを意図する。特定の実施形態において、工程a)の培養培地の容量の40%(v/v)から60%(v/v)を捨てる。特定の実施形態において、捨てる容量を、同容量の新鮮培養培地と交換する。本発明の範囲内において、表現「新鮮培養培地」は、任意のCD3+T細胞と接触していない培養培地を指す。 In one embodiment, a portion of the culture medium is discarded once, twice, three times, four times, or five times during the time course of the production medium and replaced with the same volume of fresh culture medium. Within the scope of the present invention, the term “portion” means at least 20% (v / v), at least 25% (v / v), at least 30% (v / v), at least 35% of the volume of the culture medium ( v / v), at least 40% (v / v), at least 45% (v / v), at least 50% (v / v), at least 55% (v / v), at least 60% (v / v) at least It is intended to mean 65% (v / v), at least 70% (v / v), at least 75% (v / v). In certain embodiments, 40% (v / v) to 60% (v / v) of the volume of culture medium from step a) is discarded. In certain embodiments, the discarded volume is replaced with the same volume of fresh culture medium. Within the scope of the present invention, the expression “fresh culture medium” refers to a culture medium that is not in contact with any CD3 + T cells.
一実施形態において、エクスビボでγδFoxp3+調節性T細胞を生成するための方法は以下を含む:
−CD3+TCRγδ+T細胞、好ましくはCD3+TCRγδ+CD45RA+T細胞を、自己ΔCD3フィーダー細胞及びコーティングされた抗TCRγδ抗体の存在において、ならびに以下の薬剤:i)PGE2、ii)TGFβ、iii)ラパマイシン、場合によりiv)IL−2及びIL−15の群において選択される少なくとも1つのサイトカイン、ならびに場合によりv)ビタミンCの存在において、少なくとも5日間培養すること、
−それにより、好ましくはγδナイーブ(CD45RA+)T細胞から、エクスビボで生成されたγδFoxp3+調節性T細胞の集団を得る。
In one embodiment, a method for generating γδFoxp3 + regulatory T cells ex vivo comprises:
-CD3 + TCRγδ + T cells, preferably CD3 + TCRγδ + CD45RA + T cells, in the presence of autologous ΔCD3 feeder cells and coated anti-TCRγδ antibodies, and the following agents: i) PGE2, ii) TGFβ, iii) Culturing for at least 5 days in the presence of rapamycin, optionally iv) at least one cytokine selected in the group of IL-2 and IL-15, and optionally v) vitamin C;
Thereby obtaining an ex vivo generated population of γδ Foxp3 + regulatory T cells, preferably from γδ naive (CD45RA + ) T cells.
一実施形態において、エクスビボでγδFoxp3+調節性T細胞を生成するための方法は以下を含む:
−約24時間ゾレドロネートを用いてパルスされた寛容原性DCの存在において及びΔCD3フィーダー細胞の存在において及び以下の薬剤:i)PGE2、ii)TGFβ、iii)ラパマイシン、場合によりiv)IL−2及びIL−15の群において選択される少なくとも1つのサイトカイン、及び場合によりv)ビタミンCの存在においてCD3+TCRγδ+T細胞、好ましくはCD3+TCRγδ+CD45RA+T細胞を、少なくとも5日間培養すること、
−それにより、好ましくはγδナイーブ(CD45RA+)T細胞から、エクスビボで生成されたγδFoxp3+調節性T細胞の集団を得ること。
In one embodiment, a method for generating γδFoxp3 + regulatory T cells ex vivo comprises:
In the presence of tolerogenic DC pulsed with zoledronate for about 24 hours and in the presence of ΔCD3 feeder cells and the following agents: i) PGE2, ii) TGFβ, iii) rapamycin, optionally iv) IL-2 and At least one cytokine selected in the group of IL-15, and optionally v) culturing CD3 + TCRγδ + T cells, preferably CD3 + TCRγδ + CD45RA + T cells in the presence of vitamin C for at least 5 days;
-Thereby obtaining an ex vivo generated population of γδ Foxp3 + regulatory T cells, preferably from γδ naive (CD45RA + ) T cells.
本発明はまた、γδFoxp3+調節性T細胞の生成及び増殖のエクスビボでの方法に関し、以下を含む:
−本明細書において上に記載するようにγδFoxp3+調節性T細胞を生成すること、
−それらを、γδT細胞活性化剤(好ましくは自己△CD3フィーダー細胞及びコーティングされた抗TCRγδ抗体又は約24時間ゾレドロネートを用いてパルスされた寛容原性DCのいずれか、及び△CD3フィーダー細胞の存在において)及び以下の薬剤:i)cAMP(環状アデノシン一リン酸)活性化剤(好ましくはPGE2)、ii)TGFβ(形質転換成長因子ベータ)経路活性化剤(好ましくはTGFβ)、iii)mTOR阻害剤(好ましくはラパマイシン)、場合によりiv)IL−2、IL−7、IL−15、及びTSLP(好ましくはIL−2及び/又はIL−15)の群において選択される少なくとも1つのサイトカイン、ならびに場合によりv)少なくとも1つのTET酵素活性化剤(好ましくはビタミンC及びNaHS硫化水素放出剤より選択される)及び/又は少なくとも1つのDNMT阻害剤(例えばRG108、DAC、又は5ACなど)の存在において接触させることにより生成されたγδFoxp3+調節性T細胞を、少なくとも5日間増殖させること。
−それにより、γδFoxp3+調節性T細胞の増殖集団を得ること。
The present invention also relates to an ex vivo method of generating and expanding γδ Foxp3 + regulatory T cells, including:
-Generating γδ Foxp3 + regulatory T cells as described herein above,
The presence of γδ T cell activators (preferably autologous ΔCD3 feeder cells and tolerogenic DC pulsed with coated anti-TCRγδ antibody or zoledronate for about 24 hours, and ΔCD3 feeder cells. And) the following agents: i) cAMP (cyclic adenosine monophosphate) activator (preferably PGE2), ii) TGFβ (transforming growth factor beta) pathway activator (preferably TGFβ), iii) mTOR inhibition An agent (preferably rapamycin), optionally iv) at least one cytokine selected in the group of IL-2, IL-7, IL-15, and TSLP (preferably IL-2 and / or IL-15), and Optionally v) at least one TET enzyme activator (preferably vitamins C and N) HS is selected from hydrogen sulfide release agent) and / or at least one DNMT inhibitors (e.g. RG108, DAC, or GanmaderutaFoxp3 + regulatory T cells generated by contacting in the presence of such) 5AC, at least 5 days To proliferate.
Thereby obtaining a proliferating population of γδ Foxp3 + regulatory T cells.
一実施形態において、エクスビボで生成されたγδFoxp3+調節性T細胞集団を、以下の表現型:CD3+TCRγδ+CD45RO+Foxp3+に基づくフローサイトメトリーにより単離する。 In one embodiment, an ex vivo generated γδ Foxp3 + regulatory T cell population is isolated by flow cytometry based on the following phenotype: CD3 + TCR γδ + CD45RO + Foxp3 + .
一実施形態において、このようにして得られた単離γδFoxp3+調節性T細胞集団を、ポリクローナルγδT細胞活性化剤の存在においてこれらの細胞を培養することによりエクスビボで増殖させる。ポリクローナルγδT細胞活性化剤の例は本明細書において上に列挙する。あるいは、増殖の間に使用されうるポリクローナルT細胞活性化剤の他の例は、マイトジェン(例えばPMA/イオノマイシンなど)、スーパー抗原、抗CD3抗体・・・を含むが、これらに限定しない。好ましくは、抗CD3モノクローナル抗体をコーティングする。一実施形態において、ポリクローナルγδT細胞活性化剤を、本明細書において上に記載するようにフィーダー細胞の存在において使用することができる。 In one embodiment, the isolated γδ Foxp3 + regulatory T cell population thus obtained is expanded ex vivo by culturing these cells in the presence of a polyclonal γδ T cell activator. Examples of polyclonal γδ T cell activators are listed herein above. Alternatively, other examples of polyclonal T cell activators that can be used during proliferation include, but are not limited to, mitogens (eg PMA / ionomycin etc.), superantigens, anti-CD3 antibodies. Preferably, an anti-CD3 monoclonal antibody is coated. In one embodiment, a polyclonal γδ T cell activator can be used in the presence of feeder cells as described herein above.
別の実施形態において、このようにして得られた単離γδFoxp3+調節性T細胞集団を次に、本明細書において上に記載するように抗原特異的γδT細胞活性化剤の存在においてこれらの細胞を培養することによりエクスビボで増殖させる。一実施形態において、抗原特異的γδT細胞活性化剤を、本明細書において上に記載するようにフィーダー細胞の存在において使用することができる。 In another embodiment, the isolated γδ Foxp3 + regulatory T cell population thus obtained is then transferred to these cells in the presence of an antigen-specific γδ T cell activator as described herein above. Is grown ex vivo by culturing. In one embodiment, an antigen-specific γδ T cell activator can be used in the presence of feeder cells as described herein above.
一実施形態において、本発明のエクスビボで生成されたγδFoxp3+調節性T細胞を増殖させるための培養は、少なくとも5日、少なくとも6日、少なくとも7日、少なくとも8日の間実施する。本発明の範囲内において、表現「少なくとも5日」は、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日、29日、30日又はそれ以上を含むが、これらに限定しない。 In one embodiment, culturing to expand γδ Foxp3 + regulatory T cells generated ex vivo of the invention is performed for at least 5 days, at least 6 days, at least 7 days, at least 8 days. Within the scope of the present invention, the expression “at least 5 days” means 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days, 16 days. 17th, 18th, 19th, 20th, 21st, 22nd, 23rd, 24th, 25th, 26th, 27th, 28th, 29th, 30th or more, including these It is not limited to.
一実施形態において、培養培地の一部を生成培地の時間経過の間に1回、2回、3回、4回、又は5回捨て、同容量の新鮮培養培地と交換する。本発明の範囲内において、用語「一部」は、培養培地の容量の少なくとも20%(v/v)、少なくとも25%(v/v)、少なくとも30%(v/v)、少なくとも35%(v/v)、少なくとも40%(v/v)、少なくとも45%(v/v)、少なくとも50%(v/v)、少なくとも55%(v/v)、少なくとも60%(v/v) 少なくとも65%(v/v)、少なくとも70%(v/v)、少なくとも75%(v/v)を意味することを意図する。特定の実施形態において、工程a)の培養培地の容量の40%(v/v)から60%(v/v)を捨てる。特定の実施形態において、捨てる容量を、同容量の新鮮培養培地と交換する。本発明の範囲内において、表現「新鮮培養培地」は、任意のCD3+T細胞と接触していない培養培地を指す。 In one embodiment, a portion of the culture medium is discarded once, twice, three times, four times, or five times during the time course of the production medium and replaced with the same volume of fresh culture medium. Within the scope of the present invention, the term “portion” means at least 20% (v / v), at least 25% (v / v), at least 30% (v / v), at least 35% of the volume of the culture medium ( v / v), at least 40% (v / v), at least 45% (v / v), at least 50% (v / v), at least 55% (v / v), at least 60% (v / v) at least It is intended to mean 65% (v / v), at least 70% (v / v), at least 75% (v / v). In certain embodiments, 40% (v / v) to 60% (v / v) of the volume of culture medium from step a) is discarded. In certain embodiments, the discarded volume is replaced with the same volume of fresh culture medium. Within the scope of the present invention, the expression “fresh culture medium” refers to a culture medium that is not in contact with any CD3 + T cells.
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞は、IMDM−5中のPGE2(1μM)、TGFβ(5ng/ml)、ラパマイシン(10nM)、及びIL−2(100UI/ml)の存在における自己ΔCD3フィーダー細胞(125 105細胞/ml)及びコーティングされた抗TCRγδ抗体(2μg/ml)の存在において、PBMCからフローサイトメトリーにより得られたCD3+TCRγδ+CD45RA+T細胞(5. 103細胞/ml)を培養することによりエクスビボで生成する。1日目に、IL−2(100UI/ml)及びIL−15(10ng/ml)を培養物に加える。3日毎に、培地容量の半分を捨て、PGE2(50nM)、TGFβ(5ng/ml)、ラパマイシン(1nM)、IL−2(100μl/ml)、及びIL−15(10ng/ml)を含む新鮮培地により交換する。細胞が増殖し始めたら、2〜3日毎に細胞を分割し、PGE2(1μM)、TGFβ(5ng/ml)、ラパマイシン(10nM)、及びIL−2(100UI/ml)を含む培地中で9日毎にΔCD3フィーダー細胞及びコーティングされた抗TCRγδ抗体の存在において培養することができる。 In one embodiment, γδ Foxp3 + regulatory T cells are autologous ΔCD3 feeders in the presence of PGE2 (1 μM), TGFβ (5 ng / ml), rapamycin (10 nM), and IL-2 (100 UI / ml) in IMDM-5. cells (125 105 cells / ml) and coated anti TCRganmaderuta in the presence of the antibody (2 [mu] g / ml), were obtained by flow cytometry from PBMC CD3 + TCRγδ + CD45RA + T cells (5.10 103 cells / ml ) Is cultured ex vivo. On day 1, IL-2 (100 UI / ml) and IL-15 (10 ng / ml) are added to the culture. Every 3 days, half of the medium volume is discarded and fresh medium containing PGE2 (50 nM), TGFβ (5 ng / ml), rapamycin (1 nM), IL-2 (100 μl / ml), and IL-15 (10 ng / ml). Replace with When cells begin to grow, they are split every 2-3 days and every 9 days in medium containing PGE2 (1 μM), TGFβ (5 ng / ml), rapamycin (10 nM), and IL-2 (100 UI / ml). Can be cultured in the presence of ΔCD3 feeder cells and coated anti-TCRγδ antibody.
別の実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞は、約24時間ゾレドロネートを用いてパルスされた寛容原性DCの存在において、ならびにIMDM−5中のΔCD3フィーダー細胞(125 105細胞/ml)、PGE2(1μM)、TGFβ(5ng/ml)、ラパマイシン(10nM)、及びIL−2(100UI/ml)の存在において、フローサイトメトリーによりPBMCから得られた(5. 103細胞/ml)CD3+TCRγδ+CD45RA+T細胞(5. 103細胞/ml)を培養することによりエクスビボで生成する。1日目に、IL−2(100UI/ml)、IL−15(10ng/ml)、及びTGFβ(5ng/ml)を培養物に加える。3日毎に、培地容量の半分を捨て、PGE2(50nM)、TGFβ(5ng/ml)、ラパマイシン(1nM)、IL−2(100UI/ml)、及びIL−15(10ng/ml)を含む新鮮培地により交換する。細胞が増殖し始めたら、それらを2又は3日毎に分割し、ΔCD3フィーダー細胞及びPGE2(1μM)、TGFβ(5ng/ml)、ラパマイシン(10nM)、及びIL−2(100UI/ml)の存在において、寛容原性DCを用いて9日毎に再刺激することができる。 In another embodiment, γδ Foxp3 + regulatory T cells are in the presence of tolerogenic DC pulsed with zoledronate for about 24 hours, as well as ΔCD3 feeder cells (125 10 5 cells / ml) in IMDM-5, PGE2 (1μM), TGFβ (5ng / ml), in the presence of rapamycin (10 nM), and IL-2 (100UI / ml) , obtained from PBMC by flow cytometry (5.10 103 cells / ml) CD3 + generating ex vivo by culturing TCRγδ + CD45RA + T cells (5.10 103 cells / ml). On day 1, IL-2 (100 UI / ml), IL-15 (10 ng / ml), and TGFβ (5 ng / ml) are added to the culture. Every 3 days, half of the medium volume is discarded and fresh medium containing PGE2 (50 nM), TGFβ (5 ng / ml), rapamycin (1 nM), IL-2 (100 UI / ml), and IL-15 (10 ng / ml) Replace with When cells began to grow, they were split every 2 or 3 days in the presence of ΔCD3 feeder cells and PGE2 (1 μM), TGFβ (5 ng / ml), rapamycin (10 nM), and IL-2 (100 UI / ml). Can be restimulated every 9 days with tolerogenic DCs.
この実施形態において、寛容原性DCは、GMCSF(100ng/ml)及びIL−4(10ng/ml)を添加したAIMVの存在においてPBMCから単離されたCD14+単球を培養することにより得た。3日目及び6日目に、培地を捨て、GM−CSF及びIL−4を含む新鮮培地により交換する。6日目に、寛容原性DCをゾレドロネート(100nM)の存在において24時間にわたりパルスする。 In this embodiment, tolerogenic DCs were obtained by culturing CD14 + monocytes isolated from PBMC in the presence of AIMV supplemented with GMCSF (100 ng / ml) and IL-4 (10 ng / ml). . On days 3 and 6, the medium is discarded and replaced with fresh medium containing GM-CSF and IL-4. On day 6, tolerogenic DCs are pulsed for 24 hours in the presence of zoledronate (100 nM).
本発明はまた、本明細書において上に記載するエクスビボでの生成方法により入手可能なγδFoxp3+調節性T細胞に関する。 The present invention also relates to γδ Foxp3 + regulatory T cells obtainable by the ex vivo generation method described herein above.
本発明はまた、本明細書において上に記載するエクスビボでの生成及び増殖方法により入手可能なγδFoxp3+調節性T細胞に関する。 The invention also relates to γδ Foxp3 + regulatory T cells obtainable by the ex vivo production and expansion methods described herein above.
一実施形態において、本発明の生成及び増殖方法により得られたγδFoxp3+調節性T細胞の集団は、少なくとも106、107、108、109、1010個の細胞を含む。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells obtained by the production and expansion methods of the present invention comprises at least 10 6 , 10 7 , 10 8 , 10 9 , 10 10 cells.
一実施形態において、本発明の生成及び増殖方法により得られたγδFoxp3+調節性T細胞の集団は以下の表現型:CD3+TCRγδ+Foxp3+を有する。 In one embodiment, the population of GanmaderutaFoxp3 + regulatory T cells obtained by the method for generating and proliferation of the present invention the following phenotypes: with a CD3 + TCRγδ + Foxp3 +.
一実施形態において、本発明の方法により取得可能な又は得られたγδFoxp3+調節性T細胞は、Vδ2アイソタイプを発現する。一実施形態において、本発明のγδFoxp3+調節性T細胞は、Vδ2アイソタイプを発現しない。 In one embodiment, the γδFoxp3 + regulatory T cells obtainable or obtained by the method of the invention express the Vδ2 isotype. In one embodiment, the γδ Foxp3 + regulatory T cells of the invention do not express the Vδ2 isotype.
別の実施形態において、本発明の方法により取得可能な又は得られたγδFoxp3+調節性T細胞はVγ9アイソタイプを発現する。一実施形態において、本発明のγδFoxp3+調節性T細胞は、Vγ9アイソタイプを発現しない。 In another embodiment, the γδ Foxp3 + regulatory T cells obtainable or obtained by the methods of the present invention express the Vγ9 isotype. In one embodiment, the γδ Foxp3 + regulatory T cells of the invention do not express the Vγ9 isotype.
一実施形態において、本発明の方法により取得可能な又は得られたγδFoxp3+調節性T細胞は、Vγ9Vδ2アイソタイプを発現する。一実施形態において、本発明のγδFoxp3+調節性T細胞は、Vγ9Vδ2アイソタイプを発現しない。 In one embodiment, the γδFoxp3 + regulatory T cells obtainable or obtained by the method of the present invention express the Vγ9Vδ2 isotype. In one embodiment, the γδFoxp3 + regulatory T cells of the invention do not express the Vγ9Vδ2 isotype.
一実施形態において、本発明のγδFoxp3+調節性T細胞はVδ3アイソタイプを発現する。一実施形態において、本発明のγδFoxp3+調節性T細胞はVδ4アイソタイプを発現する。一実施形態において、本発明のγδFoxp3+調節性T細胞はVδ5アイソタイプを発現する。一実施形態において、本発明のγδFoxp3+調節性T細胞はVδ6アイソタイプを発現する。 In one embodiment, the γδFoxp3 + regulatory T cells of the invention express the Vδ3 isotype. In one embodiment, the γδ Foxp3 + regulatory T cells of the invention express the Vδ4 isotype. In one embodiment, the γδ Foxp3 + regulatory T cells of the invention express the Vδ5 isotype. In one embodiment, the γδ Foxp3 + regulatory T cells of the invention express the Vδ6 isotype.
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CTLA4+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CTLA4 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD45RO+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD45RO + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD127+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD127 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+IL−1R1−。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + IL-1R1 − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+IL−6R−。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + IL-6R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+IL−23R−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + IL-23R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+IL−33R−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + IL-33R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+CTLA4+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + CTLA4 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+CD45RO+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + CD45RO + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+CD127+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + CD127 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CTLA4+CD45RO+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CTLA4 + CD45RO + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CTLA4+CD127+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CTLA4 + CD127 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD45RO+CD127+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD45RO + CD127 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+IL−1R1−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + IL-1R1 − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+IL−6R−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + IL-6R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+IL−23R−。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + IL-23R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+IL−33R−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + IL-33R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+CTLA4+CD45RO+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + CTLA4 + CD45RO + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+CTLA4+CD127+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + CTLA4 + CD127 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+CD45RO+CD127+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + CD45RO + CD127 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CTLA4+CD45RO+CD127+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CTLA4 + CD45RO + CD127 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+IL−1R1−CTLA4+。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + IL-1R1 − CTLA4 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+IL−6R−CTLA4+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + IL-6R − CTLA4 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+IL−23R−CTLA4+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + IL-23R − CTLA4 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+IL−33R−CTLA4+。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + IL-33R − CTLA4 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+IL−1R1−CD127+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + IL-1R1 − CD127 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+IL−6R−CD127+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + IL-6R − CD127 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+IL−23R−CD127+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + IL-23R − CD127 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+IL−33R−CD127+。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + IL-33R − CD127 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+IL−1R1−CD45RO+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + IL-1R1 − CD45RO + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+IL−6R−CD45RO+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + IL-6R − CD45RO + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+IL−23R−CD45RO+。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + IL-23R − CD45RO + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+IL−33R−CD45RO+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + IL-33R − CD45RO + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+IL−1R1−IL−6R−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + IL-1R1 − IL-6R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+IL−1R1−IL−23R−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + IL-1R1 − IL-23R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+IL−1R1−IL−33R−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + IL-1R1 − IL-33R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+IL−6R−IL−23R−。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + IL-6R − IL-23R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+IL−6R−IL−33R−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + IL-6R − IL-33R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+IL−23R−IL−33R−。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + IL-23R − IL-33R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+CTLA4+CD45RO+CD127+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + CTLA4 + CD45RO + CD127 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+IL−1R1−CTLA4+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + IL-1R1 − CTLA4 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+IL−6R−CTLA4+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + IL-6R − CTLA4 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+IL−23R−CTLA4+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + IL-23R − CTLA4 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+IL−33R−CTLA4+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + IL-33R − CTLA4 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+IL−1R1−CD127+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + IL-1R1 − CD127 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+IL−6R−CD127+。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + IL-6R − CD127 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+IL−23R−CD127+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + IL-23R − CD127 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+IL−33R−CD127+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + IL-33R − CD127 + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+IL−1R1−CD45RO+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + IL-1R1 − CD45RO + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+IL−6R−CD45RO+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + IL-6R − CD45RO + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+IL−23R−CD45RO+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + IL-23R − CD45RO + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+IL−33R−CD45RO+。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + IL-33R − CD45RO + .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+IL−1R1−IL−6R−。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + IL-1R1 - IL-6R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+IL−1R1−IL−23R−。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + IL-1R1 − IL-23R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+IL−1R1−IL−33R−。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + IL-1R1 - IL-33R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+IL−6R−IL−23R−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + IL-6R − IL-23R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+IL−6R−IL−33R−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + IL-6R − IL-33R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+IL−23R−IL−33R−。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + IL-23R − IL-33R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−1R1−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-1R1 − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−6R−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-6R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−23R−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-23R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−33R−。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-33R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−1R1−IL−6R−。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-1R1 − IL-6R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−1R1−IL−23R−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-1R1 − IL-23R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−1R1−IL−33R−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-1R1 - IL-33R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−6R−IL−23R−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-6R − IL-23R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−6R−IL−33R−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-6R − IL-33R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−23R−IL−33R−。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-23R − IL-33R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−6R−IL−23R−IL−33R−。 In one embodiment, said population of GanmaderutaFoxp3 + regulatory T cells have the following phenotypes: CD4 + Foxp3 + TCRγδ + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-6R - IL-23R - IL-33R -.
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−1R1−IL−23R−IL−33R−。 In one embodiment, said population of GanmaderutaFoxp3 + regulatory T cells have the following phenotypes: CD4 + Foxp3 + TCRγδ + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-1R1 - IL-23R - IL-33R -.
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−1R1−IL−6R−IL−33R−。 In one embodiment, said population of GanmaderutaFoxp3 + regulatory T cells have the following phenotypes: CD4 + Foxp3 + TCRγδ + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-1R1 - IL-6R - IL-33R -.
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−1R1−IL−6R−IL−23R−。 In one embodiment, said population of GanmaderutaFoxp3 + regulatory T cells have the following phenotypes: CD4 + Foxp3 + TCRγδ + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-1R1 - IL-6R - IL-23R -.
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−1R1−IL−6R−IL−23R−IL−33R−。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-1R1 - IL-6R - IL-23R - IL-33R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−1R1−。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-1R1 − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−6R−。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-6R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−23R−。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-23R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−33R−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-33R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−1R1−IL−6R−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-1R1 − IL-6R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−1R1−IL−23R−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-1R1 − IL-23R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−1R1−IL−33R−。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-1R1 − IL-33R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−6R−IL−23R−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-6R − IL-23R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は次の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−6R−IL−33R−。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-6R − IL-33R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+CTLA4+CD125RO+CD127+IL−23R−IL−33R−。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + CTLA4 + CD125RO + CD127 + IL-23R − IL-33R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+CTLA4+CD125RO+CD127+IL−6R−IL−23R−IL−33R−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + CTLA4 + CD125RO + CD127 + IL-6R − IL-23R − IL-33R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+CTLA4+CD125RO+CD127+IL−1R1−IL−23R−IL−33R−。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + CTLA4 + CD125RO + CD127 + IL-1R1 − IL-23R − IL-33R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−1R1−IL−6R−IL−33R−。 In one embodiment, said population of GanmaderutaFoxp3 + regulatory T cells have the following phenotypes: CD4 + Foxp3 + TCRγδ + CD25 + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-1R1 - IL-6R - IL-33R -.
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+CTLA4+CD45RO+CD127+IL−1R1−IL−6R−IL−23R−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + CTLA4 + CD45RO + CD127 + IL-1R1 − IL-6R − IL-23R − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、以下の表現型を有する:CD4+Foxp3+TCRγδ+CD25+CTLA4+CD125R+CD127+IL−1R1−IL−6R−IL−23R−IL−33R−。 In one embodiment, said population of γδ Foxp3 + regulatory T cells has the following phenotype: CD4 + Foxp3 + TCR γδ + CD25 + CTLA4 + CD125R + CD127 + IL-1R1 − IL-6R − IL-23R − IL -33R -.
一実施形態において、本発明のγδFoxp3+調節性T細胞は、遺伝子Foxp3の調節性T細胞特異的な脱メチル化領域(TSDR)を提示しない。別の実施形態において、本発明のγδFoxp3+調節性T細胞は、遺伝子Foxp3の調節性T細胞特異的な脱メチル化領域(TSDR)を提示する。一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞は、少なくとも30%、40%、50%を超える、遺伝子FOXP3のTSDRの脱メチル化のパーセンテージを提示する。プロモーター脱メチル化パーセンテージを測定するためのプロトコールを、実施例の材料及び方法のパートに示す。 In one embodiment, the γδ Foxp3 + regulatory T cells of the present invention do not present a regulatory T cell specific demethylation region (TSDR) of the gene Foxp3. In another embodiment, the γδ Foxp3 + regulatory T cells of the present invention present a regulatory T cell specific demethylation region (TSDR) of the gene Foxp3. In one embodiment, γδ Foxp3 + regulatory T cells present a percentage of TSDR demethylation of gene FOXP3 that is at least 30%, 40%, greater than 50%. A protocol for measuring the percentage of promoter demethylation is given in the materials and methods part of the examples.
別の実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞は、少なくとも10%、20%、30%、40%、又は50%を超える、Foxp3プロモーター領域におけるアセチル化ヒストンの濃縮パーセンテージを提示する。アセチル化ヒストンの濃縮をパーセンテージで測定するためのプロトコールを、実施例の材料及び方法のパートに示す。 In another embodiment, γδ Foxp3 + regulatory T cells present an enriched percentage of acetylated histone in the Foxp3 promoter region that is at least greater than 10%, 20%, 30%, 40%, or 50%. A protocol for measuring the concentration of acetylated histones in percentage is given in the materials and methods part of the examples.
本発明のγδFoxp3+調節性T細胞の集団の表現型の特徴の例を図1に示す。 An example of the phenotypic characteristics of a population of γδ Foxp3 + regulatory T cells of the present invention is shown in FIG.
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞の前記集団は、ナイーブ調節性T細胞において測定されたFoxp3 MFIと少なくとも等価の蛍光強度の中央値(MFI)でFoxp3を発現する。本明細書において使用するように、「ナイーブ調節性T細胞」は、表現型Foxp3+CD45RA+CD4+CD25+CD127−を有するT細胞を指す。 In one embodiment, the population of γδ Foxp3 + regulatory T cells express Foxp3 with a median fluorescence intensity (MFI) at least equivalent to Foxp3 MFI measured in naive regulatory T cells. As used herein, “naïve regulatory T cells” refers to T cells having the phenotype Foxp3 + CD45RA + CD4 + CD25 + CD127 − .
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞は、少なくとも2000の蛍光強度の中央値(MFI)でFoxp3を発現する。 In one embodiment, γδ Foxp3 + regulatory T cells express Foxp3 with a median fluorescence intensity (MFI) of at least 2000.
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞は、ナイーブ調節性T細胞において測定されるFoxp3 MFIの少なくとも2又は3倍の蛍光強度の中央値(MFI)でFoxp3を発現する。 In one embodiment, γδ Foxp3 + regulatory T cells express Foxp3 with a median fluorescence intensity (MFI) of at least 2 or 3 times the Foxp3 MFI measured in naive regulatory T cells.
一実施形態において、γδ調節性T細胞は、少なくとも2000、3000、4000、5000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000の蛍光強度の中央値(MFI)でFoxp3を発現する。 In one embodiment, γδ regulatory T cells express Foxp3 with a median fluorescence intensity (MFI) of at least 2000, 3000, 4000, 5000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000.
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞集団は、少なくとも65%のFoxp3を発現するCD3+CD4+細胞を含む。表現「少なくとも65%」は、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、752%、76%、77%、78%、79%、80%、81% 、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、82%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、及び100%を含むが、これらに限定しない。 In one embodiment, the γδ Foxp3 + regulatory T cell population comprises CD3 + CD4 + cells that express at least 65% Foxp3. The expression “at least 65%” means 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 752%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 82%, 93%, 94%, 95% , 96%, 97%, 98%, 99%, and 100%.
本明細書において使用するように、用語「発現」は、あるいは、分子の転写(即ち、mRNAの発現)又は分子の翻訳(即ち、タンパク質の発現)を指しうる。一実施形態において、発現を検出することは、細胞内検出に対応しうる。別の実施形態において、発現を検出することは、表面検出、即ち、細胞表面で発現される分子の検出に対応しうる。別の実施形態において、発現を検出することは、細胞外検出、即ち、分泌の検出に対応しうる。別の実施形態において、発現を検出することは、細胞内検出、表面検出、及び/又は細胞外検出に対応しうる。発現レベルを決定するための方法は当業者に周知であり、細胞のトランスクリプトーム(発現が分子の転写に関連する実施形態において)又はプロテオーム(発現が細胞傷害性分子の翻訳に関連する実施形態において)の決定を含むが、これらに限定しない。 As used herein, the term “expression” can alternatively refer to transcription of a molecule (ie, expression of mRNA) or translation of a molecule (ie, expression of a protein). In one embodiment, detecting expression may correspond to intracellular detection. In another embodiment, detecting expression may correspond to surface detection, ie, detection of molecules expressed on the cell surface. In another embodiment, detecting expression may correspond to extracellular detection, ie, detection of secretion. In another embodiment, detecting expression may correspond to intracellular detection, surface detection, and / or extracellular detection. Methods for determining expression levels are well known to those of skill in the art, and include cellular transcriptomes (in embodiments where expression is related to transcription of the molecule) or proteome (expression is related to translation of the cytotoxic molecule). But not limited to).
本発明の一実施形態において、分子の発現をmRNAレベルで評価する。分子の転写レベルを評価するための方法は先行技術において周知である。そのような方法の例は、RT−PCR、RT−qPCR、ノーザンブロット、ハイブリダイゼーション技術(例えばマイクロアレイの使用など)、及びそれらの組み合わせ(RT−PCRにより得られたアンプリコンのハイブリダイゼーション、シークエンシング、例えば次世代DNAシークエンシング(NGS)又はRNA−seq(「全トランスクリプトームショットガンシークエンシング」としても公知)などを含むが、これらに限定しない)を含むが、これらに限定しない。本発明の別の実施形態において、分子の発現をタンパク質レベルで評価する。サンプル中のタンパク質レベルを決定するための方法は当技術分野において周知である。そのような方法の例は、免疫組織化学、マルチプレックス方法(Luminex)、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、サンドイッチELISA、蛍光結合免疫吸着検定法(FLISA)、酵素免疫検定法(EIA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、フローサイトメトリー(FACS)などを含む。 In one embodiment of the invention, the expression of the molecule is assessed at the mRNA level. Methods for assessing the transcription level of a molecule are well known in the prior art. Examples of such methods are RT-PCR, RT-qPCR, Northern blots, hybridization techniques (such as using microarrays), and combinations thereof (hybridization, sequencing of amplicons obtained by RT-PCR). Examples include, but are not limited to, next generation DNA sequencing (NGS) or RNA-seq (also known as “all transcriptome shotgun sequencing”). In another embodiment of the invention, the expression of the molecule is assessed at the protein level. Methods for determining protein levels in a sample are well known in the art. Examples of such methods are immunohistochemistry, multiplex method (Luminex), Western blot, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), sandwich ELISA, fluorescence-linked immunosorbent assay (FLISA), enzyme immunoassay ( EIA), radioimmunoassay (RIA), flow cytometry (FACS) and the like.
別の実施形態において、少なくとも1つの分子の発現レベルを決定することは、分子へのリガンドの結合を検出及び/又は定量化することに対応する。一実施形態において、前記リガンドは前記分子に特異的な抗体であり、本発明の方法は前記抗体と前記分子の間に形成された複合体を検出及び/又は定量化することを含む。リガンドが、例えば、検出可能な分子、例えば抗体定常フラグメント(Fc)又は蛍光化合物(例、シアニン色素、Alexa色素、Quantum色素など)などと共有結合されている場合、複合体を検出することができる。リガンドが当業者に周知の異なる手段でタグ付けされている場合も複合体を検出することができる。例えば、本発明と使用されるタグは、ヘマグルチニンタグ、ポリアルギニンタグ、ポリヒスチジンタグ、Mycタグ、Strepタグ、Sタグ、HATタグ、3×フラグタグ、カルモジュリン結合ペプチドタグ、SBPタグ、キチン結合ドメインタグ、GSTタグ、マルトース結合タンパク質タグ、蛍光タンパク質タグ、T7タグ、V5タグ、及びXpressタグを含むか又はそれらからなる群より選択されるタグでありうる。リガンドの使用によって、従って、一方では使用されるリガンドに依存して分子の同定及び検出が、他方では形成された複合体の定量化が可能になる。 In another embodiment, determining the expression level of at least one molecule corresponds to detecting and / or quantifying the binding of the ligand to the molecule. In one embodiment, the ligand is an antibody specific for the molecule, and the method of the invention comprises detecting and / or quantifying a complex formed between the antibody and the molecule. Complexes can be detected when the ligand is covalently bound, for example, to a detectable molecule, such as an antibody constant fragment (Fc) or a fluorescent compound (eg, a cyanine dye, Alexa dye, Quantum dye, etc.). . Complexes can also be detected when the ligand is tagged by different means well known to those skilled in the art. For example, tags used with the present invention include hemagglutinin tag, polyarginine tag, polyhistidine tag, Myc tag, Strep tag, S tag, HAT tag, 3 × flag tag, calmodulin-binding peptide tag, SBP tag, chitin binding domain tag , GST tag, maltose binding protein tag, fluorescent protein tag, T7 tag, V5 tag, and Xpress tag, or a tag selected from the group consisting of them. The use of ligands thus allows on the one hand the identification and detection of molecules depending on the ligand used and on the other hand the quantification of the complexes formed.
一実施形態において、分子の発現レベルを決定することは、フローサイトメトリー、免疫蛍光法、又は画像分析、例えばハイコンテント分析により行う。好ましくは、分子の発現レベルの決定はフローサイトメトリーにより行う。一実施形態において、フローサイトメトリー分析を行う前に、細胞を固定して透過処理し、それにより細胞内タンパク質の検出を可能にする。 In one embodiment, determining the expression level of the molecule is performed by flow cytometry, immunofluorescence, or image analysis, such as high content analysis. Preferably, the expression level of the molecule is determined by flow cytometry. In one embodiment, cells are fixed and permeabilized prior to performing flow cytometric analysis, thereby allowing detection of intracellular proteins.
一実施形態において、細胞集団中の分子の発現レベルを決定することは、その分子を発現する細胞集団での細胞のパーセンテージ(即ち、その分子についての細胞「+」)を決定することを含む。好ましくは、その分子を発現する細胞の前記パーセンテージをFACSにより測定する。 In one embodiment, determining the expression level of a molecule in a cell population includes determining the percentage of cells in the cell population that express the molecule (ie, cell “+” for the molecule). Preferably, the percentage of cells expressing the molecule is measured by FACS.
用語「発現している(又は+)」及び「発現していない(又は−)」は当技術分野において周知であり、目的の細胞マーカーの発現レベルを指し、それにおいて、「+」に対応する細胞マーカーの発現レベルは高又は中程度であり、「+/−」としても言及する。「−」に対応する細胞マーカーは、細胞マーカーのヌル発現レベルである、又は前記細胞マーカーを発現する細胞集団の10%未満も指す。 The terms “expressed (or +)” and “not expressed (or −)” are well known in the art and refer to the expression level of a cell marker of interest, corresponding to “+” Cell marker expression levels are high or moderate, also referred to as “+/−”. A cell marker corresponding to “-” refers to the null expression level of the cell marker or less than 10% of the cell population expressing the cell marker.
目的の細胞マーカーの発現レベルは、このマーカーについて特異的な蛍光標識抗体を用いて染色された細胞集団からの細胞の蛍光強度中央値(MFI)を、無関係な特異性を伴うが、同じアイソタイプ、同じ蛍光プローブを伴い、同じ種に由来する(アイソタイプ対照として言及する)蛍光標識抗体を用いて染色された同じ細胞集団からの細胞の蛍光強度(FI)と比較することにより決定する。このマーカーについて特異的な蛍光標識抗体を用いて染色され、アイソタイプ対照を用いて染色された細胞と等価のMFI又はより低いMFIを示す集団からの細胞は、このマーカーを発現しておらず、従って(−)又は陰性と指定する。このマーカーについて特異的であり、アイソタイプ対照を用いて染色された細胞を超えるMFI値を示す集団からの細胞は、このマーカーを発現しており、従って(+)又は陽性と指定する。 The expression level of the cell marker of interest is the median fluorescence intensity (MFI) of cells from a cell population stained with a fluorescently labeled antibody specific for this marker, but with the irrelevant specificity but the same isotype, It is determined by comparing the fluorescence intensity (FI) of cells from the same cell population with the same fluorescent probe and stained with a fluorescently labeled antibody from the same species (referred to as isotype control). Cells from a population that is stained with a fluorescent-labeled antibody specific for this marker and that shows an equivalent or lower MFI than cells stained with an isotype control do not express this marker and thus Specify (-) or negative. Cells from a population that are specific for this marker and show MFI values that exceed those stained with the isotype control are expressing this marker and are therefore designated (+) or positive.
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞は、ナイーブCD4+CD25+CD45RA+CD127−調節性T細胞の抑制活性と同様の抑制活性が可能である。細胞集団の抑制活性の決定は当技術分野において周知であり、従来のアッセイ、例えば標準的なポリクローナル細胞−細胞接触Treg抑制アッセイ又は実施例に記載するような自己MLR抑制アッセイなどにより実施することができる。 In one embodiment, the γδ Foxp3 + regulatory T cells are capable of inhibitory activity similar to that of naive CD4 + CD25 + CD45RA + CD127 − regulatory T cells. Determination of the suppressive activity of a cell population is well known in the art and can be performed by conventional assays such as standard polyclonal cell-cell contact Treg suppression assays or autologous MLR suppression assays as described in the Examples. it can.
本発明の別の目的は、炎症状態に置かれた場合に機能的に安定なままであるγδFoxp3+調節性T細胞の集団である。 Another object of the present invention is a population of γδ Foxp3 + regulatory T cells that remain functionally stable when placed in an inflammatory condition.
一実施形態において、本発明のエクスビボでの生成及び増殖方法により取得可能な又は得られたγδFoxp3+調節性T細胞の集団は、炎症状態に置かれた場合に機能的に安定なままであるという特性を有する。 In one embodiment, a population of γδ Foxp3 + regulatory T cells obtainable or obtained by the ex vivo generation and expansion methods of the present invention remains functionally stable when placed in an inflammatory condition. Has characteristics.
本明細書において使用するように、「機能的に安定」は、IL−17の無分泌又は低分泌、即ち、200ng/ml、100ng/ml、50ng/mlより劣り、依然として抑制能力、即ち、実施例において示すように従来型T細胞の増殖を阻害することが可能であることを指す。 As used herein, “functionally stable” is non-secreted or hyposecreted of IL-17, ie, less than 200 ng / ml, 100 ng / ml, 50 ng / ml, and still has the ability to suppress, ie, perform. It refers to being able to inhibit the proliferation of conventional T cells as shown in the examples.
本明細書において使用するように、「炎症状態」は、炎症性サイトカイン、例えばIL−1β(10ng/ml)、IL−6(30ng/ml)、IL−21(50ng/ml)、IL−23(30ng/ml)、IL−2(100UI/ml)などを含む、芳香族酸、好ましくはトリプトファン、例えばIMDMなどに富む培地を指す。調節性T細胞の集団が炎症状態において機能的に安定なままであるか否かを決定するための方法は、好ましくはコーティングされた抗CD3(4μg/ml)、好ましくは可溶型の抗CD28(4μg/ml)の存在において、本明細書において上に記載するように調節性T細胞を炎症状態培地中で培養することを含む。36〜72時間の培養後、培養上清中のIL−17の存在を測定する。培養上清中でのIL−17の認識は、当技術分野において公知の従来の方法、例えばサンドイッチELISA抗IL−17などにより行うことができる。簡単には、プレートを捕捉抗IL−17抗体でコーティングした後、培養上清を、希釈系列を伴う各々のウェルに加える。インキュベーション後、検出抗IL−17抗体を各々のウェルに加える。ELISAは、当技術分野において公知の任意の比色的手段、例えば、ビオチンを用いて標識された検出抗体、ポリストレプトアビジンHRP増幅システム、及びo−フェニレンジアミン二塩酸塩基質溶液を使用するなどにより開発する。200ng/ml、100ng/ml、50ng/mlより劣るIL−17レベルは、IL−17の無分泌又は低分泌に対応する。 As used herein, an “inflammatory condition” is an inflammatory cytokine such as IL-1β (10 ng / ml), IL-6 (30 ng / ml), IL-21 (50 ng / ml), IL-23. (30 ng / ml), IL-2 (100 UI / ml) and the like, a medium rich in aromatic acids, preferably tryptophan, such as IMDM. A method for determining whether a population of regulatory T cells remains functionally stable in an inflammatory condition is preferably coated anti-CD3 (4 μg / ml), preferably soluble anti-CD28. In the presence of (4 μg / ml), culturing regulatory T cells in inflammatory medium as described herein above. After incubation for 36-72 hours, the presence of IL-17 in the culture supernatant is measured. Recognition of IL-17 in the culture supernatant can be performed by a conventional method known in the art, for example, a sandwich ELISA anti-IL-17. Briefly, after the plate is coated with capture anti-IL-17 antibody, the culture supernatant is added to each well with a dilution series. After incubation, detection anti-IL-17 antibody is added to each well. The ELISA may be performed by any colorimetric means known in the art, such as using a detection antibody labeled with biotin, a polystreptavidin HRP amplification system, and o-phenylenediamine dihydrochloride base solution. Develop. IL-17 levels inferior to 200 ng / ml, 100 ng / ml, 50 ng / ml correspond to no secretion or low secretion of IL-17.
理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、悪性腫瘍細胞の間質が、調節性T細胞が高度に豊富であり、特にNK細胞に対して免疫抑制活性(局所癌の免疫逃避を説明する可能性が高い)を発揮するTIL(腫瘍浸潤リンパ球)を含むと述べている。不活化γδFoxp3+調節性T細胞は、TIL中に存在するγδFoxp3+調節性T細胞に対して免疫応答を誘導する抗原性標的を表し、それにより、それらの免疫抑制活性を防止し、腫瘍細胞に対するエフェクター細胞(例えばNK細胞など)の細胞傷害活性を可能にする。本発明者らは、このように、不活化γδFoxp3+調節性T細胞を含むワクチン組成物を有効成分として使用することを示唆する。 Without wishing to be bound by theory, the present inventors found that the stroma of malignant tumor cells is highly abundant in regulatory T cells, particularly immunosuppressive activity against NK cells (immunity of local cancers). It includes TIL (tumor infiltrating lymphocytes) that exert a high probability of explaining escape. Inactivated γδ Foxp3 + regulatory T cells represent an antigenic target that induces an immune response against γδ Foxp3 + regulatory T cells present in TIL, thereby preventing their immunosuppressive activity and against tumor cells Enables cytotoxic activity of effector cells (eg, NK cells). The inventors thus suggest the use of a vaccine composition comprising inactivated γδFoxp3 + regulatory T cells as an active ingredient.
本発明の1つの目的は、本明細書において上に記載するように、不活化γδFoxp3+調節性T細胞を含む、それから本質的になる、又はそれからなる免疫原性産物である。 One object of the present invention is an immunogenic product comprising, consisting essentially of or consisting of inactivated γδ Foxp3 + regulatory T cells, as described herein above.
一実施形態において、免疫原性産物は、本明細書において上に記載するように、以下の表現型CD3+TCRγδ+Foxp3+を有する不活化γδFoxp3+調節性T細胞を含む、それから本質的になる、又はそれからなる。 In one embodiment, the immunogenic product comprises essentially inactivated γδFoxp3 + regulatory T cells having the following phenotype CD3 + TCRγδ + Foxp3 + as described hereinabove : Or consist of.
本明細書において使用するように、用語「から本質的になる」は、免疫原性産物、医薬組成物、ワクチン、又は医薬に関して、本発明の少なくとも1つのγδFoxp3+調節性T細胞集団又は抗体が、前記免疫原性産物、医薬組成物、ワクチン、もしくは医薬内に生物学的活性を伴う唯一の治療薬剤又は薬剤であることを意味する。 As used herein, the term “consisting essentially of” refers to an immunogenic product, pharmaceutical composition, vaccine, or medicament wherein at least one γδFoxp3 + regulatory T cell population or antibody of the invention is Means the only therapeutic agent or drug with biological activity within said immunogenic product, pharmaceutical composition, vaccine or medicament.
一実施形態において、免疫原性産物は、本明細書において上に記載するように生成され、場合によりエクスビボで増殖される、以下の表現型CD3+TCRγδ+Foxp3+を有する不活化γδFoxp3+調節性T細胞を含む、それから本質的になる、又はそれからなる。 In one embodiment, an immunogenic product is generated as described herein above and optionally ex vivo propagated, inactivated γδFoxp3 + regulatory with the following phenotype CD3 + TCRγδ + Foxp3 + Contain, consist essentially of, or consist of T cells.
本発明の1つの目的は、本明細書において上に記載するようにγδFoxp3+調節性T細胞からのブレブを含む免疫原性産物である。 One object of the present invention is an immunogenic product comprising blebs from γδ Foxp3 + regulatory T cells as described herein above.
本発明の1つの目的は、本明細書において上に記載するようにγδFoxp3+調節性T細胞からのブレブを負荷した免疫原性樹状細胞(免疫原性DC)を含む免疫原性産物である。 One object of the present invention is an immunogenic product comprising immunogenic dendritic cells (immunogenic DC) loaded with blebs from γδ Foxp3 + regulatory T cells as described hereinabove. .
本明細書において使用するように、「免疫原性DC」は、免疫原性応答を誘導することが可能なDCを指す。一実施態様において、免疫原性DCは以下の表現型:CD80highCD83highCD86highHLAクラスIhigh及びHLAクラスIIhighを有し、IL−12/IL−10>1の比率でIL−10及びIL−12を分泌する。 As used herein, “immunogenic DC” refers to a DC capable of inducing an immunogenic response. In one embodiment, the immunogenic DC has the following phenotype: CD80 high CD83 high CD86 high HLA class I high and HLA class II high , with IL-10 at a ratio of IL-12 / IL-10> 1 Secretes IL-12.
免疫原性DCを得るための方法は当技術分野において周知である。例示的な方法はCD14+単球からの免疫原性DCの生成である。例えば、CD14+単球は、MoDCを得るためにGM−CSF(約20ng/mL)及びIFNα(約10ng/mL)の存在において培養する。MoDCの成熟は、IL−1β(約10ng/ml)、IL−6(約10ng/ml)TNFα(約200U/ml)、及びPGE2(約10ng/ml)からなるサイトカインカクテルにより誘導されうる。 Methods for obtaining immunogenic DC are well known in the art. An exemplary method is the generation of immunogenic DC from CD14 + monocytes. For example, CD14 + monocytes are cultured in the presence of GM-CSF (about 20 ng / mL) and IFNα (about 10 ng / mL) to obtain MoDC. MoDC maturation can be induced by a cytokine cocktail consisting of IL-1β (about 10 ng / ml), IL-6 (about 10 ng / ml) TNFα (about 200 U / ml), and PGE2 (about 10 ng / ml).
本発明の別の目的は、本明細書において上に記載するように免疫原性産物及び少なくとも1つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む、それから本質的になる、又はそれからなる医薬組成物である。 Another object of the present invention is a pharmaceutical composition comprising, consisting essentially of, or consisting of an immunogenic product and at least one pharmaceutically acceptable excipient as described herein above. It is.
本発明の別の目的は、以下の表現型CD3+TCRγδ+Foxp3+を有する不活化γδFoxp3+調節性T細胞及び少なくとも1つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む、それから本質的になる、又はそれからなる医薬組成物である。 Another object of the invention consists essentially of, comprising inactivated γδ Foxp3 + regulatory T cells with the following phenotype CD3 + TCRγδ + Foxp3 + and at least one pharmaceutically acceptable excipient, Or a pharmaceutical composition comprising the same.
本発明の別の目的は、本明細書において上に記載する方法によりエクスビボで生成及び増殖させた、以下の表現型CD3+TCRγδ+Foxp3+を有する不活化γδFoxp3+調節性T細胞及び少なくとも1つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む、それから本質的になる、又はそれからなる医薬組成物である。 Another object of the present invention is to provide inactivated γδ Foxp3 + regulatory T cells and at least one of the following phenotypes CD3 + TCRγδ + Foxp3 + generated and expanded ex vivo by the methods described herein above: A pharmaceutical composition comprising, consisting essentially of, or consisting of a pharmaceutically acceptable excipient.
本発明の別の目的は、本明細書において上に記載するように以下の表現型CD3+TCRγδ+Foxp3+を有するγδFoxp3+調節性T細胞のブレブ及び少なくとも1つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む、それから本質的になる、又はそれからなる医薬組成物である。 Another object of the present invention is to bleb and at least one pharmaceutically acceptable shaping of γδFoxp3 + regulatory T cells having the following phenotype CD3 + TCRγδ + Foxp3 + as described herein above: A pharmaceutical composition comprising, consisting essentially of, or consisting of an agent.
本発明の別の目的は、本明細書において上に記載するように以下の表現型CD3+TCRγδ+Foxp3+を有するγδFoxp3+調節性T細胞のブレブを負荷した免疫原性DC及び少なくとも1つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む、それから本質的になる、又はそれからなる医薬組成物である。 Another object of the present invention is to provide an immunogenic DC loaded with a bleb of γδ Foxp3 + regulatory T cells and at least one medicament having the following phenotype CD3 + TCR γδ + Foxp3 + as described hereinabove : A pharmaceutical composition comprising, consisting essentially of, or consisting of a pharmaceutically acceptable excipient.
本明細書において使用するように、用語「賦形剤」は、任意の及び全ての溶媒、分散媒質、充填剤、固体担体、水溶液、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを指す。ヒトへの投与のためには、調製物は、規制当局(例えばFDA Office又はEMAなど)により要求されるように、無菌性、発熱性、一般的な安全性、及び純度基準を満たすべきである。 As used herein, the term “excipient” refers to any and all solvents, dispersion media, fillers, solid carriers, aqueous solutions, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying. It refers to agents. For human administration, preparations should meet sterility, pyrogenicity, general safety, and purity standards as required by regulatory authorities (eg, FDA Office or EMA) .
「医薬的に許容可能な」により、医薬組成物の成分が互いに親和性があり、それが投与される被験体に有害ではないことを意味する。医薬的に許容可能な賦形剤の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定しない。 By “pharmaceutically acceptable” is meant that the components of the pharmaceutical composition are compatible with each other and not deleterious to the subject to whom it is administered. Examples of pharmaceutically acceptable excipients include, but are not limited to, water, saline, phosphate buffered saline, dextrose, glycerol, ethanol, and the like, or combinations thereof.
本発明の別の目的は、本明細書において上に記載する免疫原性産物を含む、それから本質的になる、又はそれからなるワクチン組成物である。 Another object of the present invention is a vaccine composition comprising, consisting essentially of or consisting of the immunogenic products described herein above.
本発明の別の目的は、以下の表現型CD3+TCRγδ+Foxp3+を有する不活化γδFoxp3+調節性T細胞を含む、それから本質的になる、又はそれからなるワクチン組成物である。 Another object of the present invention is a vaccine composition comprising, consisting essentially of or consisting of inactivated γδ Foxp3 + regulatory T cells having the following phenotype CD3 + TCRγδ + Foxp3 + .
本発明の別の目的は、本明細書において上に記載する方法によりエクスビボで生成及び増殖された、以下の表現型CD3+TCRγδ+Foxp3+を有する不活化γδFoxp3+調節性T細胞を含む、それから本質的になる、又はそれからなるワクチン組成物である。 Another object of the invention includes inactivated γδFoxp3 + regulatory T cells generated and expanded ex vivo by the methods described hereinabove and having the following phenotype CD3 + TCRγδ + Foxp3 + A vaccine composition consisting essentially of or consisting of.
本発明の別の目的は、本明細書において上に記載するように以下の表現型CD3+TCRγδ+Foxp3+を有するγδFoxp3+調節性T細胞のブレブを含む、それから本質的になる、又はそれからなるワクチン組成物である。 Another object of the invention includes, consists essentially of or consists of a bleb of γδFoxp3 + regulatory T cells having the following phenotype CD3 + TCRγδ + Foxp3 + as described herein above It is a vaccine composition.
本発明の別の目的は、本明細書において上に記載するように以下の表現型CD3+TCRγδ+Foxp3+を有するγδFoxp3+調節性T細胞のブレブを負荷した免疫原性DCを含む、それから本質的になる、又はそれからなるワクチン組成物である。 Another object of the invention includes immunogenic DC loaded with blebs of γδ Foxp3 + regulatory T cells having the following phenotype CD3 + TCR γδ + Foxp3 + as described hereinabove, and then essentially A vaccine composition consisting of or consisting of.
本明細書において使用するように、「不活化」T細胞は、生存可能であるがエフェクター機能が低下しているか又は全くない、即ち、病原性の潜在力を喪失したT細胞を指す。不活化T細胞の細胞表面マーカーの例は、7−アミノアクチノマイシンD(7−AAD)、カルレティキュリン及び熱ショックタンパク質90(HSP−90)を含むが、これらに限定しない。従って、不活化T細胞は7−AAD及び/又はカルレティキュリン及び/又はHSP−90を発現する。本発明の不活化γδFoxp3+調節性T細胞はそれらの抑制活性を喪失しているが、依然として免疫原性である。T細胞エフェクター機能アッセイの例は、T細胞増殖アッセイであるが、これに限定しない。T細胞増殖は、固定T細胞対非固定T細胞で評価してもよい。簡単には、T細胞増殖アッセイは、フローサイトメトリーにより、固定T細胞対非固定T細胞中の生存増殖細胞のパーセンテージを決定することを目的とする。T細胞をCFSE、抗CD3抗体、及び7−AADで染色した後、生増殖細胞を、ゲートCD3+7−AAD−細胞中のCFSE低画分として定義する。 As used herein, “inactivated” T cells refer to T cells that are viable but have reduced or no effector function, ie, have lost their pathogenic potential. Examples of cell surface markers for inactivated T cells include, but are not limited to, 7-aminoactinomycin D (7-AAD), calreticulin and heat shock protein 90 (HSP-90). Thus, inactivated T cells express 7-AAD and / or calreticulin and / or HSP-90. Inactivated γδFoxp3 + regulatory T cells of the present invention have lost their suppressive activity but are still immunogenic. An example of a T cell effector function assay is, but is not limited to, a T cell proliferation assay. T cell proliferation may be assessed in fixed versus non-fixed T cells. Briefly, the T cell proliferation assay is aimed at determining the percentage of viable proliferating cells in fixed versus non-fixed T cells by flow cytometry. After staining T cells with CFSE, anti-CD3 antibody, and 7-AAD, live proliferating cells are defined as the CFSE low fraction in gated CD3 + 7-AAD- cells.
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞は、当技術分野において周知の任意の方法により不活化する。細胞を不活化するための方法の例は、好ましくは約2500〜3000ラドでの照射及び/又は化学的不活化、例えばシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、マイトマイシンC、又はアントラサイクリンへの曝露などを含むが、これらに限定しない。 In one embodiment, the γδ Foxp3 + regulatory T cells are inactivated by any method known in the art. Examples of methods for inactivating cells preferably include irradiation with about 2500-3000 rads and / or chemical inactivation, such as exposure to cisplatin, carboplatin, oxaliplatin, mitomycin C, or anthracyclines. However, it is not limited to these.
一実施形態において、本発明のワクチン組成物は、少なくとも1つのアジュバントをさらに含む。ワクチン組成物中に使用することができるアジュバントの例は、ISA51;乳剤、例えばCFA、MF59、モンタニド、AS03、及びAF03など;無機塩、例えばミョウバン、リン酸カルシウム、鉄塩、ジルコニウム塩、及びAS04など;TLRリガンド、例えばTLR2リガンド(例えば外表面タンパク質A又はOspAなど)、TLR3リガンド(例えばポリI:Cなど)、TLR4リガンド(例えばMPL及びGLAなど)、TLR5リガンド、TLR7/8リガンド(例えばイミキモドなど)、TLR9リガンド(例えばCpG ODNなど);多糖類、例えばキチン、キトサン、α−グルカン、β−グルカン、フルクタン、マンナン、デキストラン、レンチナン、イヌリンベースのアジュバント(例えばガンマイヌリンなど)など;TLR9及びSTINGリガンド、例えばK3 CpG及びcGAMPなどを含むが、これらに限定しない。本明細書において使用するように、「アジュバント」は、抗原への免疫応答を増強する、及び/又はそれを所望の免疫応答に向かって調節する薬剤を指す。 In one embodiment, the vaccine composition of the present invention further comprises at least one adjuvant. Examples of adjuvants that can be used in vaccine compositions are ISA51; emulsions such as CFA, MF59, montanide, AS03, and AF03; inorganic salts such as alum, calcium phosphate, iron salt, zirconium salt, and AS04; TLR ligands such as TLR2 ligands (such as outer surface protein A or OspA), TLR3 ligands (such as poly I: C), TLR4 ligands (such as MPL and GLA), TLR5 ligands, TLR7 / 8 ligands (such as imiquimod) Polysaccharides such as chitin, chitosan, α-glucan, β-glucan, fructan, mannan, dextran, lentinan, inulin based adjuvants (eg gamma inulin), TLR9 ligands (eg CpG ODN) ) Such as; TLR9 and STING ligands, for example including K3 CpG and CGAMP, without limitation. As used herein, “adjuvant” refers to an agent that enhances an immune response to an antigen and / or modulates it toward a desired immune response.
一実施形態において、不活化γδFoxp3+調節性T細胞は、本明細書において上に記載するように少なくとも1つの非ペプチドリン酸化抗原に特異的である。 In one embodiment, the inactivated γδ Foxp3 + regulatory T cells are specific for at least one non-peptide phosphoantigen as described herein above.
別の実施形態において、不活化γδFoxp3+調節性T細胞は、癌細胞のアポトーシス小体上に存在した少なくとも1つの非ペプチドリン酸化抗原に特異的である。 In another embodiment, the inactivated γδFoxp3 + regulatory T cells are specific for at least one non-peptide phosphoantigen present on the apoptotic body of the cancer cell.
別の実施形態において、不活化γδFoxp3+調節性T細胞は、癌細胞のブレブ上に存在した少なくとも1つの非ペプチドリン酸化抗原に特異的である。 In another embodiment, the inactivated γδFoxp3 + regulatory T cells are specific for at least one non-peptide phosphoantigen present on the bleb of the cancer cell.
一実施形態において、本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物中に存在する不活化γδFoxp3+調節性T細胞は、ヒトγδFoxp3+調節性T細胞である。 In one embodiment, the inactivated γδFoxp3 + regulatory T cells present in the immunogenic product, pharmaceutical composition, or vaccine composition of the invention are human γδFoxp3 + regulatory T cells.
一実施形態において、本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物中に存在する不活化γδFoxp3+調節性T細胞は、自己γδFoxp3+調節性T細胞である。 In one embodiment, the inactivated γδFoxp3 + regulatory T cells present in the immunogenic product, pharmaceutical composition or vaccine composition of the invention are autologous γδFoxp3 + regulatory T cells.
一実施形態において、本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物中に存在する不活化γδFoxp3+調節性T細胞は、同種γδFoxp3+調節性T細胞である。 In one embodiment, the inactivated γδFoxp3 + regulatory T cells present in the immunogenic product, pharmaceutical composition, or vaccine composition of the invention are allogeneic γδFoxp3 + regulatory T cells.
別の実施形態において、本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物は、患者のために個別化してもよい。本明細書において使用するように、「個別化された」免疫原性産物又はワクチン組成物は、少なくとも1つの患者特異的なエピトープを用いてエクスビボで生成及び増殖させたγδFoxp3+調節性T細胞の使用を指す。この実施形態において、免疫原性産物として又はワクチン組成物中で使用されるγδFoxp3+調節性T細胞は、患者から得られた癌細胞のアポトーシス小体の存在において又は癌細胞のブレブの存在においてエクスビボで生成及び増殖され、それにより、少なくとも1つの患者特異的なエピトープを提供する。 In another embodiment, the immunogenic product, pharmaceutical composition, or vaccine composition of the invention may be individualized for the patient. As used herein, an “individualized” immunogenic product or vaccine composition consists of γδ Foxp3 + regulatory T cells generated and expanded ex vivo using at least one patient-specific epitope. Refers to use. In this embodiment, γδ Foxp3 + regulatory T cells used as immunogenic products or in vaccine compositions are ex vivo in the presence of apoptotic bodies of cancer cells obtained from patients or in the presence of blebs of cancer cells. Generated and propagated thereby providing at least one patient-specific epitope.
一実施形態において、本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物は、活性成分として不活化γδFoxp3+調節性T細胞を含む、それから本質的になる、又はそれからなる。 In one embodiment, an immunogenic product, pharmaceutical composition, or vaccine composition of the invention comprises, consists essentially of or consists of inactivated γδ Foxp3 + regulatory T cells as an active ingredient.
一実施形態において、本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物は、活性成分として少なくとも104、105、106、107、108、109、1010個の不活化γδFoxp3+調節性T細胞を含む、それから本質的になる、又はそれからなる。 In one embodiment, the immunogenic product, pharmaceutical composition or vaccine composition of the present invention has at least 10 4 , 10 5 , 10 6 , 10 7 , 10 8 , 10 9 , 10 10 non-active ingredients as active ingredients. Contains, consists essentially of or consists of activated γδ Foxp3 + regulatory T cells.
一実施形態において、本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物は、活性成分として約104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、109、5×109、1010個の不活化γδFoxp3+調節性T細胞を含む、それから本質的になる、又はそれらからなる。 In one embodiment, the immunogenic product, pharmaceutical composition or vaccine composition of the present invention has about 10 4 , 5 × 10 4 , 10 5 , 5 × 10 5 , 10 6 , 5 × 10 6 as the active ingredient. , including 10 7, 5 × 10 7, 10 8, 5 × 10 8, 10 9, 5 × 10 9, 10 10 or inactivated GanmaderutaFoxp3 + regulatory T cells, it consists essentially of or consisting .
一実施形態において、本発明のγδFoxp3+調節性T細胞、不活化γδFoxp3+調節性T細胞、免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物は凍結されている。 In one embodiment, the γδ Foxp3 + regulatory T cells, inactivated γδ Foxp3 + regulatory T cells, immunogenic products, pharmaceutical compositions, or vaccine compositions of the invention are frozen.
一実施形態において、本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物は、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、又は静脈内注射により、又は直接腫瘍中に投与してもよい。 In one embodiment, the immunogenic product, pharmaceutical composition, or vaccine composition of the invention may be administered by subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, or intravenous injection, or directly into the tumor. .
一実施形態において、本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物は、被験体に1年に少なくとも1回、2回、3回、4回、5回投与してもよい。投与計画の例は、0日目、0日の4週間後、0日の8週間後、0日の12週間後、及び0日の24週間後の免疫原性産物又はワクチン組成物の投与を含むが、これらに限定しない。 In one embodiment, an immunogenic product, pharmaceutical composition, or vaccine composition of the invention may be administered to a subject at least once, twice, three times, four times, five times per year. Examples of dosing schedules include administration of immunogenic products or vaccine compositions on day 0, 4 weeks after 0 day, 8 weeks after 0 day, 12 weeks after 0 day, and 24 weeks after 0 day. Including but not limited to.
本発明の別の目的は、治療的に効果的な量の不活化γδFoxp3+調節性T細胞、又は本発明の免疫原性産物、医薬組成物、もしくはワクチン組成物を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体において癌を処置するための方法である。 Another object of the invention is to administer to a subject a therapeutically effective amount of inactivated γδ Foxp3 + regulatory T cells, or an immunogenic product, pharmaceutical composition or vaccine composition of the invention. A method for treating cancer in a subject in need thereof.
本発明の別の目的は、癌に罹患している被験体のTIL中に存在するγδFoxp3+調節性T細胞に対して免疫応答を誘発するための方法であって、治療的に効果的な量の不活化γδFoxp3+調節性T細胞又は 本明細書において上に記載する本発明の免疫原性産物、医薬組成物、もしくはワクチン組成物を被験体に投与することを含む。 Another object of the present invention is a method for eliciting an immune response against γδ Foxp3 + regulatory T cells present in the TIL of a subject suffering from cancer, comprising a therapeutically effective amount Administration of an inactivated γδ Foxp3 + regulatory T cell or an immunogenic product, pharmaceutical composition, or vaccine composition of the invention as described herein above to a subject.
本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物を用いて処置することができる癌の例は、副腎皮質癌、肛門癌、膀胱癌、上衣腫、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉、松果体腫瘍、視床下部神経膠腫、乳癌、カルチノイド腫瘍、癌腫、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、肝外胆管癌、ユーイング家族性腫瘍(pnet)、頭蓋外胚細胞腫瘍、眼癌、眼球内黒色腫、胆嚢癌、胃癌、生殖細胞腫瘍、性腺外腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、頭頸部癌、下咽頭癌、膵島細胞癌、喉頭癌、白血病、急性リンパ芽球性白血病、口腔癌、肝臓癌、肺癌、小細胞リンパ腫、AIDS関連、リンパ腫、中枢神経系(原発性)リンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、悪性中皮腫、黒色腫、メルケル細胞癌、転移性扁平上皮癌、多発性骨髄腫、形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、外分泌性、膵臓癌、副鼻腔癌及び鼻腔癌、副甲状腺癌、褐色細胞腫癌、下垂体癌、形質細胞新生物、横紋筋肉腫、直腸癌、腎細胞癌、唾液腺癌、セザリー症候群、カポジ肉腫、小腸癌、軟部組織肉腫、胸腺腫、悪性甲状腺癌、尿道癌、子宮癌 、肉腫、小児の異常癌、膣癌、外陰癌又はウィルムス腫瘍、化学療法の処置に関連する良性状態(例えばループス、関節リウマチ、及び皮膚疾患など)を含むが、これらに限定しない。 Examples of cancers that can be treated using the immunogenic products, pharmaceutical compositions, or vaccine compositions of the present invention include adrenal cortex cancer, anal cancer, bladder cancer, ependymoma, medulloblastoma, supratent primordial Neuroectodermal, pineal tumor, hypothalamic glioma, breast cancer, carcinoid tumor, carcinoma, cervical cancer, colon cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, extrahepatic bile duct cancer, Ewing familial tumor (pnet), Extracranial germ cell tumor, eye cancer, intraocular melanoma, gallbladder cancer, gastric cancer, germ cell tumor, extragonadal tumor, gestational choriocarcinoma, head and neck cancer, hypopharyngeal cancer, islet cell cancer, laryngeal cancer, leukemia, Acute lymphoblastic leukemia, oral cancer, liver cancer, lung cancer, small cell lymphoma, AIDS-related, lymphoma, central nervous system (primary) lymphoma, cutaneous T-cell lymphoma, Hodgkin's disease, non-Hodgkin's disease, malignant mesothelioma, Melanoma, Merkel cell carcinoma, metastatic squamous cell carcinoma, Multiple myeloma, plasma cell neoplasm, mycosis fungoides, myelodysplastic syndrome, myeloproliferative disease, nasopharyngeal cancer, neuroblastoma, oropharyngeal cancer, osteosarcoma, ovarian epithelial cancer, ovarian germ cell tumor, Low-grade ovarian tumor, pancreatic cancer, exocrine, pancreatic cancer, paranasal and nasal cavity cancer, parathyroid cancer, pheochromocytoma cancer, pituitary cancer, plasma cell neoplasm, rhabdomyosarcoma, rectal cancer, renal cell Cancer, salivary gland cancer, Sezary syndrome, Kaposi sarcoma, small intestine cancer, soft tissue sarcoma, thymoma, malignant thyroid cancer, urethral cancer, uterine cancer, sarcoma, childhood abnormal cancer, vaginal cancer, vulvar cancer or Wilms tumor, chemotherapy This includes, but is not limited to, benign conditions associated with treatment, such as lupus, rheumatoid arthritis, and skin diseases.
一実施形態において、本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物を用いて処置することができる癌は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、及び神経膠芽腫を含むが、これらに限定しない。 In one embodiment, cancers that can be treated using the immunogenic products, pharmaceutical compositions, or vaccine compositions of the present invention include breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, and glioblastoma, It is not limited to.
本発明の別の目的は、本発明の免疫原性産物を調製するための方法であって、以下を含む:
−処置される被験体からの生物学的サンプル、好ましくは血液サンプル、及び場合により処置される被験体からの腫瘍サンプルを提供すること、
−生物学的サンプルから単離されたCD3+TCRγδ+T細胞、好ましくはCD3+TCRγδ+CD45RA+T細胞からのγδFoxp3+調節性T細胞を本明細書において上に記載するようにエクスビボで生成及び増殖させること、
−以前の工程において得られたγδFoxp3+調節性T細胞を不活化すること、
−それにより本発明の免疫原性産物を得ること。
Another object of the present invention is a method for preparing the immunogenic product of the present invention comprising:
Providing a biological sample from the subject to be treated, preferably a blood sample, and optionally a tumor sample from the subject to be treated;
Generation of CD3 + TCRγδ + T cells isolated from biological samples, preferably γδFoxp3 + regulatory T cells from CD3 + TCRγδ + CD45RA + T cells as described herein above and Growing,
Inactivating the γδ Foxp3 + regulatory T cells obtained in the previous step,
Thereby obtaining an immunogenic product of the invention.
好ましい実施形態において、生成及び増殖工程は、寛容原性樹状細胞(DC)の存在において行い、被験体の腫瘍サンプルから得られたアポトーシス性腫瘍体又はブレブを用いてパルスする。 In a preferred embodiment, the generation and expansion steps are performed in the presence of tolerogenic dendritic cells (DCs) and pulsed with an apoptotic tumor body or bleb obtained from a subject tumor sample.
本発明の別の目的は、それを必要とする被験体において癌を処置するための方法であって、本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物を被験体に投与することを含む。 Another object of the invention is a method for treating cancer in a subject in need thereof, comprising administering to the subject an immunogenic product, pharmaceutical composition or vaccine composition of the invention. including.
本発明の別の目的は、それを必要とする被験体において癌を処置するための方法であって、以下を含む:
−本明細書において上に記載する免疫原性産物を調製すること、
−場合により、免疫原性産物を含む医薬組成物又はワクチン組成物を調製すること、
−場合により、被験体を血漿交換療法に供すること、
−本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物を被験体に投与すること。
Another object of the invention is a method for treating cancer in a subject in need thereof, comprising:
-Preparing an immunogenic product as described herein above,
-Optionally preparing a pharmaceutical or vaccine composition comprising an immunogenic product;
-Optionally subjecting the subject to plasma exchange therapy;
-Administering the immunogenic product, pharmaceutical composition or vaccine composition of the invention to a subject.
理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、本発明のγδFoxp3+調節性T細胞は、免疫抑制機能を発揮するようにコミットしており、自己反応性病原性免疫エフェクター細胞(CD4+細胞、CD8+細胞、B細胞又は自然NK細胞を含む)を阻害することが可能でありうるが、それらは次に、自己細胞に対して細胞傷害特性を発揮できないことを示唆する。 Without wishing to be bound by theory, the inventors have committed that the γδFoxp3 + regulatory T cells of the present invention exert an immunosuppressive function and are self-reactive pathogenic immune effector cells ( CD4 + cells, CD8 + cells, including B cells or natural NK cells) may be possible, but they then suggest that they are unable to exert cytotoxic properties against autologous cells.
本発明の1つの目的は、本明細書において上に記載するγδFoxp3+調節性T細胞又はγδFoxp3+調節性T細胞集団及び少なくとも1つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む、それらから本質的になる、又はそれらからなる医薬組成物である。 One object of the present invention consists essentially of a γδFoxp3 + regulatory T cell or γδFoxp3 + regulatory T cell population as described herein above and comprising at least one pharmaceutically acceptable excipient. Or a pharmaceutical composition consisting of them.
本発明の別の目的は、以下の表現型CD3+TCRγδ+Foxp3+を有するγδFoxp3+調節性T細胞及び少なくとも1つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む、それらから本質的になる、又はそれらからなる医薬組成物である。 Another object of the present invention comprises, consists essentially of γδFoxp3 + regulatory T cells with the following phenotype CD3 + TCRγδ + Foxp3 + and at least one pharmaceutically acceptable excipient, or It is a pharmaceutical composition comprising them.
本発明の別の目的は、本明細書において上に記載する方法によりエクスビボで生成及び増殖させた以下の表現型CD3+TCRγδ+Foxp3+を有するγδFoxp3+調節性T細胞及び少なくとも1つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む、それらから本質的になる、又はそれらからなる医薬組成物である。 Another object of the present invention is to provide γδFoxp3 + regulatory T cells having the following phenotype CD3 + TCRγδ + Foxp3 + produced and expanded ex vivo by the methods described hereinabove and at least one pharmaceutically A pharmaceutical composition comprising, consisting essentially of or consisting of acceptable excipients.
本発明の1つの目的は、養子療法における使用のための、本明細書において上に記載するγδFoxp3+調節性T細胞もしくはγδFoxp3+調節性T細胞集団又は医薬組成物である。 One object of the present invention is a γδ Foxp3 + regulatory T cell or γδ Foxp3 + regulatory T cell population or pharmaceutical composition as described herein above for use in adoptive therapy.
本発明の別の目的は、炎症性疾患又は自己免疫疾患を処置する際での使用のための、本明細書において上に記載するγδFoxp3+調節性T細胞もしくはγδFoxp3+調節性T細胞集団又は医薬組成物である。 Another object of the present invention is to provide a γδ Foxp3 + regulatory T cell or γδ Foxp3 + regulatory T cell population or medicament as described herein above for use in treating inflammatory or autoimmune diseases. It is a composition.
炎症性疾患又は自己免疫疾患の例は、急性播種性脳脊髄炎、急性壊死性出血性白質脳炎、アディソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗GBM/抗TBM腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索及び神経性神経障害、バロ病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、慢性再発性多巣性骨髄炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡/良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、CREST病、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性ニューロパチー、疱疹性皮膚炎、皮膚筋炎、デヴィック病、円盤状狼瘡、ドスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エヴァンス症候群、線維筋痛、線維性肺胞炎、巨大細胞性動脈炎、巨大細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発性血管炎を伴う肉芽腫症(ウェゲナー症候群)、バセドウ病、ギラン・バレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠ヘルペス、低ガンマグロブリン血症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、IgA腎症、IgG4関連硬化性疾患、免疫調節リポタンパク質、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病(1型糖尿病)、若年性筋炎、川崎症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線形IgA病、狼瘡、ライム慢性病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、連鎖球菌に関連する小児自己免疫性神経精神障害、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間血色素尿症、パリーロンバーグ症候群、パーソネイジ・ターナー症候群、扁平部炎 (末梢ブドウ膜炎)、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、POEMS 症候群、結節性多発動脈炎、I、II、及びIII型多腺性自己免疫症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心外膜剥離術症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スザック症候群、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、1型糖尿病、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病、ブドウ膜炎、血管炎、小水疱性皮膚病、及び白斑症を含むが、これらに限定しない。 Examples of inflammatory or autoimmune diseases are acute disseminated encephalomyelitis, acute necrotizing hemorrhagic leukoencephalitis, Addison's disease, agammaglobulinemia, alopecia areata, amyloidosis, ankylosing spondylitis, anti-GBM / anti-antibody TBM nephritis, antiphospholipid syndrome, autoimmune angioedema, autoimmune aplastic anemia, autoimmune autonomic neuropathy, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune hepatitis, autoimmune hyperlipidemia, Autoimmune immunodeficiency, autoimmune inner ear disease, autoimmune myocarditis, autoimmune ovitis, autoimmune pancreatitis, autoimmune retinopathy, autoimmune thrombocytopenic purpura, autoimmune thyroid disease, Autoimmune urticaria, axon and neuropathy, Baro's disease, Behcet's disease, bullous pemphigoid, cardiomyopathy, Castleman's disease, celiac disease, Chagas disease, chronic fatigue syndrome, chronic inflammatory demyelinating multiple Neuritis, Chronic recurrent multifocal osteomyelitis, Churg-Strauss syndrome, Scarous pemphigoid / benign mucocele pemphigoid, Crohn's disease, Kogan syndrome, Cold agglutinin disease, Congenital heart block, Coxsackie myocarditis, CREST Disease, essential mixed cryoglobulinemia, demyelinating neuropathy, herpetic dermatitis, dermatomyositis, Devic disease, discoid lupus, Dosler syndrome, endometriosis, eosinophilic esophagitis, eosinophilic Fasciitis, erythema nodosum, experimental allergic encephalomyelitis, Evans syndrome, fibromyalgia, fibromyalgia, giant cell arteritis, giant cell myocarditis, glomerulonephritis, Goodpasture syndrome, multiple occurrences Granulomatosis with vasculitis (Wegener syndrome), Graves' disease, Guillain-Barre syndrome, Hashimoto encephalitis, Hashimoto thyroiditis, hemolytic anemia, Henoch-Schönlein purpura, pregnancy Pes, hypogammaglobulinemia, idiopathic pulmonary fibrosis, idiopathic thrombocytopenic purpura, IgA nephropathy, IgG4-related sclerosis, immunomodulating lipoprotein, inclusion body myositis, interstitial cystitis, juvenile arthritis , Juvenile diabetes (type 1 diabetes), juvenile myositis, Kawasaki syndrome, Lambert Eaton syndrome, leukoclastic vasculitis, lichen planus, sclerosis lichen, woody conjunctivitis, linear IgA disease, lupus, chronic Lyme disease, Meniere Disease, microscopic polyangiitis, mixed connective tissue disease, Mohren's ulcer, Mucha-Habermann disease, multiple sclerosis, myasthenia gravis, myositis, narcolepsy, optic neuromyelitis, neutropenia, ocular scarring Pemphigoid, optic neuritis, recurrent rheumatism, childhood autoimmune neuropsychiatric disorders related to streptococci, paraneoplastic cerebellar degeneration, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, Parry-Lomberg syndrome, pa -Sonage-Turner syndrome, flatitis (peripheral uveitis), pemphigus, peripheral neuropathy, perivenous encephalomyelitis, pernicious anemia, POEMS syndrome, polyarteritis nodosa, type I, II, and type III polyglandular Autoimmune syndrome, rheumatic polymyalgia, polymyositis, post-myocardial infarction syndrome, epicardial detachment syndrome, progesterone dermatitis, primary biliary cirrhosis, primary sclerosing cholangitis, psoriasis, psoriatic arthritis, Pyoderma gangrenosum, erythroblastosis, Raynaud's phenomenon, reactive arthritis, reflex sympathetic dystrophy, Reiter syndrome, relapsing polychondritis, restless leg syndrome, retroperitoneal fibrosis, rheumatic fever, rheumatoid arthritis , Sarcoidosis, Schmidt syndrome, scleritis, scleroderma, Sjogren's syndrome, sperm and testicular autoimmunity, stiff person syndrome, subacute bacterial endocarditis, Zac syndrome, sympathetic ophthalmitis, systemic lupus erythematosus, Takayasu arteritis, temporal arteritis / giant cell arteritis, thrombocytopenic purpura, Tolosa Hunt syndrome, transverse myelitis, type 1 diabetes, ulcerative colon Including, but not limited to, inflammation, undifferentiated connective tissue disease, uveitis, vasculitis, vesicular skin disease, and leukoplakia.
炎症性疾患又は自己免疫疾患の例は、関節リウマチ、1型糖尿病、及び多発性硬化症を含むが、これらに限定しない。 Examples of inflammatory or autoimmune diseases include, but are not limited to, rheumatoid arthritis, type 1 diabetes, and multiple sclerosis.
本発明の別の目的は、移植拒絶、又は移植片対宿主病(GVHD)を防止する際での使用のための、本明細書において上に記載するγδFoxp3+調節性T細胞もしくはγδFoxp3+調節性T細胞集団又は医薬組成物である。 Another object of the present invention, transplant rejection, or graft-versus-host disease for use in in preventing (GVHD), described herein above GanmaderutaFoxp3 + regulatory T cells or GanmaderutaFoxp3 + regulatory A T cell population or a pharmaceutical composition.
一実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞は、本明細書において上に記載する少なくとも1つの非ペプチドリン酸化抗原に特異的である。 In one embodiment, the γδ Foxp3 + regulatory T cells are specific for at least one non-peptide phosphoantigen described hereinabove.
別の実施形態において、γδFoxp3+調節性T細胞は、組織溶解物中に存在していた少なくとも1つの非ペプチドリン酸化抗原に特異的である。 In another embodiment, the γδ Foxp3 + regulatory T cells are specific for at least one non-peptide phosphoantigen that was present in the tissue lysate.
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、有効成分として少なくとも104、105、106、107、108、109、1010個のγδFoxp3+調節性T細胞を含む、それから本質的になる、又はそれからなる。 In one embodiment, the pharmaceutical composition of the invention comprises at least 10 4 , 10 5 , 10 6 , 10 7 , 10 8 , 10 9 , 10 10 γδ Foxp3 + regulatory T cells as active ingredients, then essentially Become or consist of.
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、有効成分として約104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、109、5×109、1010個のγδFoxp3+調節性T細胞を含む、それから本質的になる、又はそれからなる。 In one embodiment, the pharmaceutical composition of the present invention comprises about 10 4 , 5 × 10 4 , 10 5 , 5 × 10 5 , 10 6 , 5 × 10 6 , 10 7 , 5 × 10 7 , 10 as the active ingredient. 8 , 5 × 10 8 , 10 9 , 5 × 10 9 , 10 10 γδFoxp3 + regulatory T cells comprising, consisting essentially of or consisting of.
一実施形態において、本発明のγδFoxp3+調節性T細胞、γδ調節性T細胞集団、又は医薬は凍結されている。 In one embodiment, a γδ Foxp3 + regulatory T cell, γδ regulatory T cell population, or medicament of the invention is frozen.
一実施形態において、本発明の医薬組成物中に存在するγδFoxp3+調節性T細胞はヒトγδ調節性T細胞である。 In one embodiment, the γδ Foxp3 + regulatory T cells present in the pharmaceutical composition of the invention are human γδ regulatory T cells.
一実施形態において、本発明の医薬組成物中に存在するγδFoxp3+調節性T細胞は自己γδFoxp3+調節性T細胞である。 In one embodiment, the γδFoxp3 + regulatory T cells present in the pharmaceutical composition of the invention are autologous γδFoxp3 + regulatory T cells.
一実施形態において、本発明の医薬組成物中に存在するγδFoxp3+調節性T細胞は同種γδFoxp3+調節性T細胞である。 In one embodiment, the γδFoxp3 + regulatory T cells present in the pharmaceutical composition of the invention are allogeneic γδFoxp3 + regulatory T cells.
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、又は静脈内注射により被験体に投与してもよい。 In one embodiment, the pharmaceutical composition of the invention may be administered to a subject by subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, or intravenous injection.
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、週に少なくとも1回、2回、3回、4回、5回、被験体に投与してもよい。 In one embodiment, the pharmaceutical composition of the invention may be administered to a subject at least once, twice, three times, four times, five times a week.
別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、月に少なくとも1回、2回、3回、4回、5回、被験体に投与してもよい。 In another embodiment, the pharmaceutical composition of the invention may be administered to a subject at least once, twice, three times, four times, five times a month.
別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、3ヶ月間に少なくとも1回、2回、3回、4回、5回、被験体に投与してもよい。 In another embodiment, the pharmaceutical composition of the invention may be administered to a subject at least once, twice, three times, four times, five times over a three month period.
本発明の別の目的は、それを必要とする被験体において炎症性疾患又は自己免疫疾患を処置するための方法であって、本明細書において上に記載する、治療的に効果的な量のγδFoxp3+調節性T細胞もしくはγδFoxp3+調節性T細胞集団又はその医薬組成物を被験体に投与することを含む。 Another object of the present invention is a method for treating an inflammatory or autoimmune disease in a subject in need thereof, comprising a therapeutically effective amount as described herein above. administering to a subject a γδFoxp3 + regulatory T cell or γδFoxp3 + regulatory T cell population or a pharmaceutical composition thereof.
T細胞ワクチン接種は、クローン型特異的決定基について特異的なT細胞を活性化することにより免疫原性T細胞を特異的に抑制する調節ネットワークを誘導する(抗イディオタイプ応答)ことが当技術分野において示されている。また、活性化マーカー(エルゴトープに対応する)に向けられた抗エルゴタイプ応答もまた、標的とされる調節性T細胞集団の抑制を部分的に説明しうる。 T-cell vaccination induces regulatory networks that specifically suppress immunogenic T cells by activating specific T cells for clonal type specific determinants (anti-idiotypic response). Shown in the field. Also, anti-ergotypic responses directed at activation markers (corresponding to ergotopes) may also partially explain the suppression of targeted regulatory T cell populations.
本発明の別の目的は、本発明のγδFoxp3+調節性T細胞のTCR(T細胞受容体)を認識する抗体である。 Another object of the present invention is an antibody that recognizes the TCR (T cell receptor) of γδ Foxp3 + regulatory T cells of the present invention.
一実施形態において、本発明のγδFoxp3+調節性T細胞のTCRを認識する抗体は、TCRのCDR1、CDR2、及びCDR3(相補性決定領域1、2、及び3)の少なくとも1つを認識する。 In one embodiment, an antibody that recognizes a TCR of a γδ Foxp3 + regulatory T cell of the invention recognizes at least one of CDR1, CDR2, and CDR3 (complementarity determining regions 1, 2, and 3) of the TCR.
別の実施形態において、本発明のγδFoxp3+調節性T細胞のTCRを認識する抗体は、TCRのCDR3を認識する。 In another embodiment, an antibody that recognizes a TCR of a γδ Foxp3 + regulatory T cell of the invention recognizes CDR3 of the TCR.
本発明の別の目的は、前記抗体及び少なくとも1つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む、それらから本質的になる、又はそれらからなる医薬組成物である。 Another object of the present invention is a pharmaceutical composition comprising, consisting essentially of or consisting of said antibody and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
本発明の別の目的は、それを必要とする被験体において癌を処置するための前記抗体の使用である。 Another object of the present invention is the use of said antibody for treating cancer in a subject in need thereof.
一実施形態において、本発明のγδFoxp3+調節性T細胞に対する抗体は、本明細書において上に記載する免疫原性組成物を用いた哺乳動物(ヒトを含む)の免疫化後に産生される抗体からなる。 In one embodiment, antibodies against γδ Foxp3 + regulatory T cells of the invention are derived from antibodies produced after immunization of mammals (including humans) with the immunogenic compositions described herein above. Become.
別の実施形態において、抗体はまた、それらをコードする関連DNA材料を、例えば前記哺乳動物から(前記ヒトからを含む)得られるB細胞から出発してクローニングすることにより得てもよい。 In another embodiment, the antibodies may also be obtained by cloning relevant DNA material encoding them starting from B cells obtained, for example, from said mammal (including from said human).
別の実施形態において、抗体はまた、本発明のγδFoxp3+調節性T細胞に対する関連する組換え抗体を産生するために、前記哺乳動物から(前記ヒトからを含む)収集した抗体のアミノ酸配列をシークエンシングし、次に抗体をコードするDNA分子又はそのCDRを含むその一部を合成することにより得てもよい。 In another embodiment, the antibodies also sequence the amino acid sequences of antibodies collected from said mammal (including from said human) to produce related recombinant antibodies against γδ Foxp3 + regulatory T cells of the invention. May be obtained by synthesizing and then synthesizing the antibody-encoding DNA molecule or a portion thereof including its CDRs.
本発明の免疫原性組成物を用いた免疫化により本発明のγδFoxp3+調節性T細胞に対する抗体を調製することは、当技術分野からの一般的な技術的知識を使用し、当業者により簡単に実施されうる。 Preparation of antibodies to γδ Foxp3 + regulatory T cells of the present invention by immunization with an immunogenic composition of the present invention is simple for those skilled in the art using general technical knowledge from the art. Can be implemented.
あるいは、本発明のγδFoxp3+調節性T細胞に対する抗体は、それらを産生するヒトBリンパ球の不死化後に得てもよい;それらのcDNAはまた、クローン化し、組換えDNA技術を通じてそれら又はそれらの誘導体を産生するためにさらに使用することができる。 Alternatively, antibodies against γδ Foxp3 + regulatory T cells of the present invention may be obtained after immortalization of the human B lymphocytes that produce them; their cDNAs can also be cloned, and their or their It can be further used to produce derivatives.
本明細書における用語「抗体」は、有用な抗原結合特異性を有する分子を指すために使用する。当業者は、この用語が、抗体のフラグメント又は誘導体であるが、その上、同じ又は密接に類似した機能性を示しうるポリペプチドもカバーしうることを容易に理解するであろう。そのような抗体フラグメント又は誘導体は、本明細書において使用するように、用語「抗体」により包含されることを意図している。受動免疫療法の目的のための「抗体」又は「抗体分子」により、本明細書において全免疫グロブリン分子だけでなく、そのフラグメント、例えばFab、F(ab’)2、Fv、及びγδFoxp3+調節性T細胞を結合し、不活化する能力を保持するそれらの他のフラグメントも意図する。同様に、用語「抗体」は、抗体の遺伝子操作された誘導体、例えば一本鎖Fv分子(scFv)及びドメイン抗体(dAb)などを含む。 As used herein, the term “antibody” is used to refer to molecules having useful antigen binding specificity. One skilled in the art will readily appreciate that the term is a fragment or derivative of an antibody, but may also cover polypeptides that may exhibit the same or closely similar functionality. Such antibody fragments or derivatives are intended to be encompassed by the term “antibody” as used herein. By “antibody” or “antibody molecule” for the purpose of passive immunotherapy, not only whole immunoglobulin molecules but also fragments thereof, such as Fab, F (ab ′) 2, Fv, and γδFoxp3 + regulatory, are used herein. Those other fragments that retain the ability to bind and inactivate T cells are also contemplated. Similarly, the term “antibody” includes genetically engineered derivatives of antibodies, such as single chain Fv molecules (scFv) and domain antibodies (dAbs).
一部の実施形態において、本発明のγδFoxp3+調節性T細胞に対する抗体はポリクローナル抗体からなる。 In some embodiments, the antibody against γδ Foxp3 + regulatory T cells of the present invention comprises a polyclonal antibody.
一部の実施形態において、本発明のγδFoxp3+調節性T細胞に対する抗体はモノクローナル抗体からなる。 In some embodiments, the antibodies against γδ Foxp3 + regulatory T cells of the present invention comprise monoclonal antibodies.
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書において、任意の単離Ab、例えば従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマなどを包含するが、任意の細胞により産生された単離された単一特異性抗体、例えば哺乳動物細胞株において発現された同一のヒト免疫グロブリンのサンプルなども包含する。 The term “monoclonal antibody” as used herein includes any isolated Ab, such as a conventional monoclonal antibody hybridoma, but isolated monospecific antibody produced by any cell, such as a mammal. Also included are samples of the same human immunoglobulin expressed in cell lines.
抗体の可変重鎖(V H)及び可変軽鎖(V L)ドメインは抗原認識において含まれ、初期のプロテアーゼ消化実験により最初に認識された事実である。さらなる確認が、げっ歯類抗体の「ヒト化」により見出された。げっ歯類由来の可変ドメインを、結果として得られた抗体がげっ歯類親抗体の抗原特異性を保持するようにヒト由来の定常ドメインに融合させてもよい(Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855)。抗原特異性は可変ドメインにより付与され、定常ドメインに非依存的であることは、抗体フラグメント(全てが1つ以上の可変ドメインを含む)の細菌発現を含む実験から公知である。これらの分子は、Fab様分子(Better et al (1988) Science 240, 1041);Fv分子(Skerra et al (1988) Science 240, 1038);V.sub.H及びV.sub.Lパートナードメインが柔軟なオリゴペプチドを介して連結されている一本鎖Fv(ScFv)分子(Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879)及び単離Vドメインを含む単一ドメイン抗体(dab)(Ward et al (1989) Nature 341, 544)を含む。それらの特異的結合部位を保持する抗体フラグメントの合成において含まれる技術の一般的な総説が、Winter & Milstein(1991, Nature 349, 293-299)に見出される。 The variable heavy chain (V H) and variable light chain (V L) domains of antibodies are included in antigen recognition, a fact that was first recognized by early protease digestion experiments. Further confirmation was found by “humanization” of rodent antibodies. A rodent-derived variable domain may be fused to a human-derived constant domain such that the resulting antibody retains the antigen specificity of the rodent parent antibody (Morrison et al. (1984) Proc Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855). It is known from experiments involving bacterial expression of antibody fragments (all containing one or more variable domains) that antigen specificity is conferred by variable domains and is independent of constant domains. These molecules are Fab-like molecules (Better et al (1988) Science 240, 1041); Fv molecules (Skerra et al (1988) Science 240, 1038); sub. H and V. sub. Single-chain Fv (ScFv) molecules in which L partner domains are linked via a flexible oligopeptide (Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879) and single domain antibodies (dabs) containing isolated V domains (Ward et al (1989) Nature 341, 544). A general review of the techniques involved in the synthesis of antibody fragments that retain their specific binding sites is found in Winter & Milstein (1991, Nature 349, 293-299).
用語「ScFv分子」は、V H及びV Lパートナードメインが柔軟なオリゴペプチドを介して連結された分子を包含する。操作された抗体(例えばScFv抗体など)は、J. Huston et al, (1988) "Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single chain Fv analogue produced in E. coli", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 5879-5883において、及びA. Pluckthun, (1991) "Antibody engineering; Advances from use of E. coli expression systems", Bio/technology 9 (6): 545-51(本明細書において参照により組み入れられる)において記載されている技術及び手法を使用して作製することができる。 The term “ScFv molecule” encompasses a molecule in which the V H and V L partner domains are linked via a flexible oligopeptide. Engineered antibodies (eg, ScFv antibodies) are described in J. Huston et al, (1988) "Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single chain Fv analogue produced in E. coli", Proc Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 5879-5883, and A. Pluckthun, (1991) "Antibody engineering; Advances from use of E. coli expression systems", Bio / technology 9 (6): 545. -51 (incorporated herein by reference) can be used to make.
本明細書において記載するように反応性である適切なモノクローナル抗体は、公知の技術、例えば、"Monoclonal Antibodies; A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988)において、及び "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Application", S G R Hurrell (CRC Press, 1982)において開示されている技術により調製してもよい。 Suitable monoclonal antibodies that are reactive as described herein are known in the art, eg, “Monoclonal Antibodies; A manual of techniques”, H Zola (CRC Press, 1988), and “Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications ", SGR Hurrell (CRC Press, 1982).
さらなる実施形態は、抗原と接触したマウス抗体の領域である相補性決定領域(CDR)がヒト抗体フレームワークに移されたヒト化抗体を包含する。そのような抗体はほぼ完全にヒト型であり、患者に投与した場合に有害な抗体反応を起こすことはほとんどない。いくつかのキメラ抗体又はヒト化抗体が治療用薬物として登録されており、現在では種々の適応症において広く使用されている(Borrebaeck & Carlsson, 2001, Curr. Opin. Pharmacol. 1: 404-408)。 Further embodiments include humanized antibodies in which complementarity determining regions (CDRs), regions of mouse antibodies that have been contacted with antigens, have been transferred to a human antibody framework. Such antibodies are almost completely human and rarely cause adverse antibody responses when administered to patients. Several chimeric or humanized antibodies have been registered as therapeutic drugs and are now widely used in various indications (Borrebaeck & Carlsson, 2001, Curr. Opin. Pharmacol. 1: 404-408) .
抗体はヒト化抗体である場合が好ましい。適切に調製された非ヒト抗体は、公知の方法で、例えばマウス抗体のCDR領域をヒト抗体のフレームワーク中に挿入することにより「ヒト化」することができる。ヒト化抗体は、Verhoeyen et al (1988) Science, 239, 1534-1536において、及びKettleborough et al, (1991) Protein Engineering, 14 (7), 773-783において記載されている技術及び手法を使用して作製することができる。 The antibody is preferably a humanized antibody. Appropriately prepared non-human antibodies can be “humanized” by known methods, eg, by inserting the CDR regions of a murine antibody into the framework of a human antibody. Humanized antibodies use techniques and techniques described in Verhoeyen et al (1988) Science, 239, 1534-1536 and in Kettleborough et al, (1991) Protein Engineering, 14 (7), 773-783. Can be produced.
別の実施形態において、抗体はまた、完全なヒト抗体を包含し、それは組換え技術を使用して産生しうる。典型的には、数十億の異なる抗体を含む大きなライブラリーを使用する。例えばマウス抗体のキメラ化又はヒト化を用いた過去の技術とは対照的に、この技術は、特異的抗体を生成するために動物の免疫化に頼らない。代わりに、組換えライブラリーは膨大な数の予め作製された抗体変異体を含み、それにおいて、ライブラリーは任意の抗原について特異的な少なくとも1つの抗体を有する可能性が高い。 In another embodiment, the antibody also encompasses a fully human antibody, which can be produced using recombinant techniques. Typically, large libraries containing billions of different antibodies are used. In contrast to past techniques, for example using mouse antibody chimerization or humanization, this technique does not rely on immunization of animals to produce specific antibodies. Instead, the recombinant library contains a vast number of pre-made antibody variants, in which the library is likely to have at least one antibody specific for any antigen.
投与の頻度は、経時的に患者の血清中での抗体価の低下を追跡することにより臨床的に決定してもよいが、任意の事象において、年に1〜52回、最も好ましくは年に1〜12回の頻度でありうる。抗体の量は、疾患の重症度、又は血清中での抗体の半減期に従って変動しうるが、好ましくは、1〜10mg/kg患者の範囲内、好ましくは1〜5mg/kg患者の範囲内、最も好ましくは1〜2mg/kg患者である。 The frequency of administration may be determined clinically by following the decrease in antibody titer in the patient's serum over time, but in any event, 1 to 52 times a year, most preferably the year There can be a frequency of 1-12 times. The amount of antibody may vary according to the severity of the disease or the half-life of the antibody in the serum, but is preferably in the range of 1-10 mg / kg patient, preferably in the range of 1-5 mg / kg patient, Most preferred is a 1-2 mg / kg patient.
実施例 Example
本発明を以下の実施例によりさらに例証する。 The invention is further illustrated by the following examples.
材料及び方法 Materials and methods
ヒト血液サンプル。健常な個人からの血液サンプルは、Etablissement Francais du Sang(EFS、パリ)から由来した。血球を標準的な手順を使用して収集する。 Human blood sample. Blood samples from healthy individuals were derived from Etablissement Francais du Sang (EFS, Paris). Blood cells are collected using standard procedures.
ヒト腫瘍サンプル。腫瘍組織サンプルは、管腔A及び管腔Bの乳癌を伴う患者に由来した(Institut Jean Godinot、ランス)。 Human tumor sample. Tumor tissue samples were derived from patients with lumen A and lumen B breast cancer (Institut Jean Godinot, Lance).
細胞の精製及び培養 Cell purification and culture
末梢血単核細胞(PBMC)を、Ficoll-Hypaque(Pharmacia)での密度勾配遠心分離により単離する。PBMCは、新鮮な細胞として使用するか、又は液体窒素中で凍結保存する。T細胞サブセット及びT細胞枯渇アクセサリー細胞(ΔCD3細胞)を新鮮又は凍結PBMCから単離する。T細胞枯渇アクセサリー細胞(ΔCD3細胞)を、抗CD3コーティングDynabeads(Dynal Biotech)とのインキュベーションによるPBMCからのネガティブ選択により単離し、3000ラドで照射する(ΔCD3フィーダーとして言及する)。 Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) are isolated by density gradient centrifugation on Ficoll-Hypaque (Pharmacia). PBMC are used as fresh cells or stored frozen in liquid nitrogen. T cell subsets and T cell depleted accessory cells (ΔCD3 cells) are isolated from fresh or frozen PBMC. T cell depleted accessory cells (ΔCD3 cells) are isolated by negative selection from PBMC by incubation with anti-CD3 coated Dynabeads (Dynal Biotech) and irradiated with 3000 rads (referred to as ΔCD3 feeder).
CD4+T細胞を、CD4+T細胞単離キット(Miltenyi Biotec、純度96〜99%のCD4+T細胞集団を生じる)を用いてネガティブ選択する。その後に、選択されたCD4+T細胞を、FACSAria III Cell Sorter(Becton Dickinson)を使用してCD4+CD127−/loCD25high(pTregs)及びCD4+CD127+CD25neg/dim[従来型ヘルパーCD4 T細胞(Tconv)]亜集団に分類する前に、抗CD4(13B8.2)−FITC(Beckman Coulter)、抗CD25(4E3)−APC(Miltenyi Biotec)、及び抗CD127(R34.34)−PE(Beckman Coulter)を用いて標識する。 CD4 + T cells are negatively selected using a CD4 + T cell isolation kit (Miltenyi Biotec, yielding a CD4 + T cell population of 96-99% purity). Subsequently, selected CD4 + T cells were analyzed using a FACSAria III Cell Sorter (Becton Dickinson) for CD4 + CD127 − / lo CD25 high (pTregs) and CD4 + CD127 + CD25 neg / dim [conventional helper CD4 T Cells (Tconv)] Prior to sorting into subpopulations, anti-CD4 (13B8.2) -FITC (Beckman Coulter), anti-CD25 (4E3) -APC (Miltenyi Biotec), and anti-CD127 (R34.34) -PE ( Beckman Coulter).
CD14+単球を、MACSシステムを使用したポジティブセレクションによりPBMCから単離する。 CD14 + monocytes are isolated from PBMC by positive selection using the MACS system.
CD3+CD4+CD127+CD45RA+CD25−TCRαβ+MHCII制限(ナイーブ従来型CD4+T細胞)を、磁気濃縮(MACSシステム:CD4マイクロビーズ)及びFAC選別後にPBMCから単離する。選別工程前に、濃縮されたCD3+CD4+T細胞を、抗CD4(13B8.2)−FITC(Beckman Coulter)、抗CD25(4E3)−APC(Miltenyi Biotec)、及び抗CD127(R34.34)−PE(Beckman Coulter)、抗TCRαβ−BV421(IP26)(Biolegend)を用いて染色する。 CD3 + CD4 + CD127 + CD45RA + CD25 − TCRαβ + MHCII restriction (naïve conventional CD4 + T cells) is isolated from PBMC after magnetic enrichment (MACS system: CD4 microbeads) and FAC sorting. Prior to the sorting step, the enriched CD3 + CD4 + T cells were treated with anti-CD4 (13B8.2) -FITC (Beckman Coulter), anti-CD25 (4E3) -APC (Miltenyi Biotec), and anti-CD127 (R34.34). -Stain with PE (Beckman Coulter), anti-TCRαβ-BV421 (IP26) (Biolegend).
CD3+CD45RA+invTCR Vα24+CD1制限T細胞を、磁気濃縮(MACSシステム:抗iNKTマイクロビーズ及びFACS選別)後にPBMCから単離する。選別工程前に、濃縮されたCD3+invTCR Vα24+T細胞を、抗CD3(UCHT−1)V450抗不バリアントTCR Vα24−JαQ(6B11)−PE(inv TCR)Vα24−JαQ(Becton Dickinson)、及び抗CD45RA(T6D11)−FITC(Miltenyi Biotec)を用いて染色する 。 CD3 + CD45RA + invTCR Vα24 + CD1 restricted T cells are isolated from PBMC after magnetic enrichment (MACS system: anti-iNKT microbeads and FACS sorting). Prior to the sorting step, enriched CD3 + invTCR Vα24 + T cells were treated with anti-CD3 (UCHT-1) V450 anti-invariant TCR Vα24-JαQ (6B11) -PE (inv TCR) Vα24-JαQ (Becton Dickinson), and Stain with anti-CD45RA (T6D11) -FITC (Miltenyi Biotec).
CD3+CD45RA+CD27+TCRγδ+非制限T細胞を、磁気濃縮(MACSシステム:TCRγδ+T細胞単離キット)及びFACS選別後にPBMCから単離する。選別工程前に、濃縮されたCD3+TCRγδ+T細胞を、抗CD3(UCHT−1)V450、抗TCR汎γδ+PE(IMMU510)(Beckman Coulter)、抗CD27−APC efluor 780(O323)(ebioscience)、及び抗CD45RA(T6D11)−FITC(Miltenyi Biotec)を用いて染色する。 CD3 + CD45RA + CD27 + TCRγδ + unrestricted T cells are isolated from PBMC after magnetic enrichment (MACS system: TCRγδ + T cell isolation kit) and FACS sorting. Prior to the sorting step, the enriched CD3 + TCRγδ + T cells were transformed into anti-CD3 (UCHT-1) V450, anti-TCR pan γδ + PE (IMMU510) (Beckman Coulter), anti-CD27-APC fluor 780 (O323) (ebioscience) ), And anti-CD45RA (T6D11) -FITC (Miltenyi Biotec).
T細胞サブセットを、5%SVF、100IU/mlペニシリン/ストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM非必須アミノ酸、グルタマックス、及び10mM HEPES(IMDM−5培地)を添加したIMDM中で2%低酸素において培養する。 T cell subsets are cultured in 2% hypoxia in IMDM supplemented with 5% SVF, 100 IU / ml penicillin / streptomycin, 1 mM sodium pyruvate, 1 mM non-essential amino acids, glutamax, and 10 mM HEPES (IMDM-5 medium). To do.
乳癌細胞株及び培養。ヒト乳癌細胞株MCF−7をAmerican Type Culture Collection(USA)から入手した。細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM;Invitrogen、USA)中で維持する。MCF−7細胞を、5μg/mlのドキソルビシンで24時間又はγ線照射(20Gy)により処理する。アポトーシスの程度はフローサイトメトリー分析(FACS)によりモニターする。細胞を、DCを供給する前に徹底的に洗浄する。 Breast cancer cell lines and cultures. Human breast cancer cell line MCF-7 was obtained from American Type Culture Collection (USA). Cells are maintained in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Invitrogen, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). MCF-7 cells are treated with 5 μg / ml doxorubicin for 24 hours or by gamma irradiation (20 Gy). The degree of apoptosis is monitored by flow cytometric analysis (FACS). Cells are washed thoroughly before supplying DC.
TIL単離。腫瘍組織をメスで細かく刻み、2mMグルタミン(Gibco)、50mg/mLゲンタマイシン、及び0.25%ヒト血清アルブミンを添加したDMEM高グルコース培地中のコラゲナーゼタイプIV(2mg/mL、Roche Diagnostic GmbH)中で、37℃のロータリーシェーカー上での一晩のインキュベーションにより酵素消化した。 TIL isolation. The tumor tissue is minced with a scalpel in collagenase type IV (2 mg / mL, Roche Diagnostic GmbH) in DMEM high glucose medium supplemented with 2 mM glutamine (Gibco), 50 mg / mL gentamicin, and 0.25% human serum albumin. Enzymatic digestion by overnight incubation on a 37 ° C. rotary shaker.
ポリクローナルの機能的にコミットされたFOXP3発現調節性T細胞のエクスビボでの生成。 Generation of polyclonal, functionally committed FOXP3 expression regulatory T cells ex vivo.
ポリクローナルの機能的にコミットされたFOXP3発現CD3+TCRαβ+MHCII制限T細胞のエクスビボでの生成:0日目に、T細胞を48ウェルプレート中に2.5×105個/ウェルで播種し、ΔCD3フィーダー(1M)の存在においてプレート結合抗CD3 mAb(4μg/ml)で刺激する。細胞を、PGE2 1μM、TGFβ 5ng/ml、Rapa 10nMを伴うIMDM−5培地(5%SVF、100IU/mlペニシリン/ストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM非必須アミノ酸、グルタマックス、及び10mM HEPESを添加したIMDM)中で培養する。2日目に、IL−2(100IU/ml)を培養物に加える。3日毎に、上清容量の半分を捨て、IL−2(100UI/ml)を伴う新鮮なIMDM−5と交換する。11日目に、これらのCD4+T細胞株を、プレート結合抗CD3 Ab(4μg/ml)を用いた再刺激によりさらに増殖させた。この再刺激は、ΔCD3フィーダー、PGE2 1μM、TGFβ 5ng/ml、Rapa 10nM、及びIL−2(100UI/ml)の存在において実施した。次に、3日毎に、上清容量の半分を捨て、IL−2を伴う新鮮なIMDM−5(100UI/ml)と交換する。20日目に、増殖したCD4+T細胞の表現型をフローサイトメトリーにより評価した。CD45RO+になった、刺激されたナイーブ従来型T細胞の75%がFoxp3+を発現する。 Ex vivo generation of polyclonal functionally committed FOXP3-expressing CD3 + TCRαβ + MHCII restricted T cells: On day 0, T cells are seeded at 2.5 × 10 5 cells / well in a 48-well plate, Stimulate with plate-bound anti-CD3 mAb (4 μg / ml) in the presence of ΔCD3 feeder (1M). Cells were supplemented with IMDM-5 medium (5% SVF, 100 IU / ml penicillin / streptomycin, 1 mM sodium pyruvate, 1 mM non-essential amino acids, glutamax, and 10 mM HEPES with 1 μM PGE2, 5 ng / ml TGFβ, and 10 nM Rapa. IMDM). On day 2, IL-2 (100 IU / ml) is added to the culture. Every 3 days, half of the supernatant volume is discarded and replaced with fresh IMDM-5 with IL-2 (100 UI / ml). On day 11, these CD4 + T cell lines were further expanded by restimulation with plate-bound anti-CD3 Ab (4 μg / ml). This restimulation was performed in the presence of ΔCD3 feeder, PGE2 1 μM, TGFβ 5 ng / ml, Rapa 10 nM, and IL-2 (100 UI / ml). Next, every 3 days, half of the supernatant volume is discarded and replaced with fresh IMDM-5 with IL-2 (100 UI / ml). On day 20, the phenotype of expanded CD4 + T cells was assessed by flow cytometry. 75% of stimulated naïve conventional T cells that became CD45RO + express Foxp3 + .
ポリクローナルの機能的にコミットされたFOXP3発現インバリアントT細胞のエクスビボでの生成:0日目に、T細胞を96ウェルプレート中に1×103個/ウェルで播種し、ΔCD3フィーダー(2.5×105個)の存在においてプレート結合抗inv TCR Vα24−JαQ(6B11)mAb(2μg/ml)で刺激する。細胞を、PGE2 1μM、TGFβ 5ng/ml、Rapa 10nM、IL−2(100UI/ml)、及びIL−15(10ng/ml)を伴うIMDM−5培地中で培養する。3日毎に、IL−2(100IU/ml)及びIL−15(10ng/ml)を培養物に加える。12日目に、T細胞を、ΔCD3フィーダー、PGE2 1μM、TGFβ 5ng/ml、Rapa 10nM、IL−2(100UI/ml)、及びIL−15(10ng/ml)の存在において、プレート結合抗inv TCR Vα24−JαQ(6B11)mAb(2μg/ml)を用いた再刺激によりさらに増殖させた。次に、3日毎に、上清容量の半分を捨て、IL−2(100UI/ml)及びIL−15(10ng/ml)を伴う新鮮なIMDM−5と交換する。21日目に、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。CD45RO+になった、刺激されたCD3+ invTCR Vα24+RA+T細胞の70%がFoxp3+を発現する。 Ex vivo generation of polyclonal functionally committed FOXP3-expressing invariant T cells: On day 0, T cells were seeded at 1 × 10 3 cells / well in a 96-well plate and the ΔCD3 feeder (2.5 Stimulate with plate-bound anti-inv TCR Vα24-JαQ (6B11) mAb (2 μg / ml) in the presence of × 10 5 ). Cells are cultured in IMDM-5 media with 1 μM PGE2, 5 ng / ml TGFβ, 10 nM Rapa, IL-2 (100 UI / ml), and IL-15 (10 ng / ml). Every 3 days, IL-2 (100 IU / ml) and IL-15 (10 ng / ml) are added to the culture. On day 12, T cells were plated in anti-inv TCR plate-bound in the presence of ΔCD3 feeder, PGE2 1 μM, TGFβ 5 ng / ml, Rapa 10 nM, IL-2 (100 UI / ml), and IL-15 (10 ng / ml). Further growth was achieved by restimulation with Vα24-JαQ (6B11) mAb (2 μg / ml). Next, every 3 days, half of the supernatant volume is discarded and replaced with fresh IMDM-5 with IL-2 (100 UI / ml) and IL-15 (10 ng / ml). On day 21, the cells were analyzed by flow cytometry. 70% of stimulated CD3 + invTCR Vα24 + RA + T cells that became CD45RO + express Foxp3 + .
ポリクローナルの機能的にコミットされたFOXP3発現TCRγδ+T 細胞のエクスビボでの生成:0日目に、T細胞を96ウェルプレート中に1×103個/ウェルで播種し、ΔCD3フィーダー(2.5×105個)の存在においてプレート結合抗TCRγδ mAb(2μg/ml)で刺激する。細胞を、PGE2 1μM、TGFβ 5ng/ml、Rapa 10nM、IL−2(100UI/ml)、及びIL−15(10ng/ml)を伴うIMDM−5培地(5%SVF、100IU/mlペニシリン/ストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM非必須アミノ酸、グルタマックス、及び10mM HEPESを添加したIMDM)中で培養する。3日毎に、上清容量の半分を捨て、IL−2(100UI/ml)及びIL−15(10ng/ml)を伴う新鮮なIMDM−5と交換する。11日目に、T細胞を、プレート結合抗汎TCRγδ Ab(2μg/ml)を用いた再刺激によりさらに増殖させた。この再刺激は、ΔCD3フィーダー、PGE2 1μM、TGFβ 5ng/ml、Rapa 10nM、ならびにIL−2(100UI/ml)及びIL−15(10ng/ml)の存在において実施した。次に、3日毎に、上清容量の半分を捨て、IL−2(100UI/ml)及びIL−15(10ng/ml)を伴う新鮮なIMDM−5と交換する。21日目に、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。CD45RO+になった、刺激されたCD3+CD45RA+CD27+TCRγδ+T細胞の65%がFoxp3+を発現する。 Ex vivo generation of polyclonal functionally committed FOXP3-expressing TCRγδ + T cells: On day 0, T cells were seeded at 1 × 10 3 cells / well in a 96-well plate and the ΔCD3 feeder (2.5 Stimulate with plate-bound anti-TCRγδ mAb (2 μg / ml) in the presence of × 10 5 ). Cells were treated with IMDM-5 medium (5% SVF, 100 IU / ml penicillin / streptomycin, with PGE2 1 μM, TGFβ 5 ng / ml, Rapa 10 nM, IL-2 (100 UI / ml), and IL-15 (10 ng / ml), IMDM supplemented with 1 mM sodium pyruvate, 1 mM non-essential amino acids, glutamax, and 10 mM HEPES). Every 3 days, half of the supernatant volume is discarded and replaced with fresh IMDM-5 with IL-2 (100 UI / ml) and IL-15 (10 ng / ml). On day 11, T cells were further expanded by restimulation with plate-bound anti-pan TCRγδ Ab (2 μg / ml). This restimulation was performed in the presence of ΔCD3 feeder, PGE2 1 μM, TGFβ 5 ng / ml, Rapa 10 nM, and IL-2 (100 UI / ml) and IL-15 (10 ng / ml). Next, every 3 days, half of the supernatant volume is discarded and replaced with fresh IMDM-5 with IL-2 (100 UI / ml) and IL-15 (10 ng / ml). On day 21, the cells were analyzed by flow cytometry. 65% of stimulated CD3 + CD45RA + CD27 + TCRγδ + T cells that became CD45RO + express Foxp3 + .
抗原特異的に機能的にコミットされたFOXP3発現T細胞のエクスビボでの生成。 Generation of antigen-specific functionally committed FOXP3-expressing T cells ex vivo.
抗原(オボアルブミン)特異的に機能的にコミットされたFoxp3発現CD3+TCRαβ+MHCII制限T細胞のエクスビボでの生成:
a)CD14+単球からのオボアルブミン負荷寛容原性DC(寛容原性単球由来DC(Tol−Mo−DC)と呼ぶ)のインビトロでの生成:単球を、未成熟DCの生成のために100ng/mlの組換えヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)及び10ng/mlのヒト組換えIL−4を添加した1ウェル当たり0.5mlのAIMVを含む48ウェル平底プレート中で培養する。3日目に、サイトカインを含む500μlの培地を加えた。6日目に、Tol−Mo−DCを、1)ウェルから取り出し、IMDM−5(5%SVF、100IU/mlペニシリン/ストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM非必須アミノ酸、glutamax、及び10mM HEPESを添加したIMDM)で2回洗浄し、2)IMDM−5中の3×105個/mlの濃度で48ウェルプレートのウェルに加え、3)特異的Ag(OVA)を用いてIMDM−5中でパルスした。
b)特定の機能的にコミットされたFOXP3発現CD3+TCRαβ+MHCII制限T細胞のエクスビボでの生成及び増殖:0日目に、オボアルブミンパルスtDCを、1)IMDM−5で2回洗浄し、2)IMDM−5中の3×105個/mlの濃度で、2×105個の照射自己フィーダー、PGE2 1μM、及びRapa 10nMの存在において48ウェルプレートのウェルに加える。精製されたナイーブ従来型CD4+T細胞(FACSにより以前に凍結されたPBMCから単離)をパルスtDCに加える。1日目に、IL−2(100IU/ml)及びTGFβ(5ng/ml)を共培養物に加える。3日毎に、上清容量の半分を捨て、IL−2を伴う新鮮なIMDM−5(100UI/ml(T細胞クローニング培地))と交換する。12日目に、これらのT細胞を、ΔCD3−フィーダー、PGE2 1μM、TGFβ 5ng/ml、Rapa 10nM、IL−2(100UI/ml)の存在においてovaパルスtDCを用いた再刺激によりさらに増殖させる。一度、T細胞が増殖し始めたら、それらをT細胞クローニング培地及び照射フィーダーを用いて2〜3日毎に分割することができる。21日目に、細胞をフローサイトメトリーにより分析する。CD45RO+になった刺激されたナイーブ従来型CD4+T細胞の85%がFoxp3+を発現する。Ova特異的記憶CD3+TCRαβ+MHCII制限T細胞が、刺激のいかなる培養条件においても、nTreg極性化培地中での21日間の増殖後に、排他的に調節活性を発揮するようにコミットされていることを確認するために、Ova特異的pTregを、nTreg極性化培地(IL−2、TGFβ、PGE2、及びラパマイシンの組み合わせを含む)又はTH−17極性化培地(IL−2、IL−1、IL−6、IL−21、IL−23サイトカインを含むIMDM培地)のいずれかにおいてさらに3週間にわたり培養する。21日増殖させたFoxp3発現CD3+CD4+TCRαβ+MHCII制限T細胞を、48ウェルプレート中で、ΔCD3フィーダー(1M)の存在においてプレート結合抗CD3mAb(4μg/ml)で3日毎に刺激し、上清容量の半分を捨て、新鮮なT細胞クローニング培地又はTH−17極性化培地と21日間にわたり交換する。
Antigen production in ex vivo (ovalbumin) -specific manner functionally Foxp3 expression CD3 + TCRαβ + MHCII-restricted T cells that have been committed:
a) In vitro generation of ovalbumin-tolerant DC (referred to as tolerogenic monocyte-derived DC (Tol-Mo-DC)) from CD14 + monocytes: monocytes are used to generate immature DCs In 48 well flat bottom plates containing 0.5 ml AIMV per well supplemented with 100 ng / ml recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and 10 ng / ml human recombinant IL-4 Incubate. On the third day, 500 μl of medium containing cytokines was added. On day 6, Tol-Mo-DC is removed from 1) wells and IMDM-5 (5% SVF, 100 IU / ml penicillin / streptomycin, 1 mM sodium pyruvate, 1 mM non-essential amino acids, glutamax, and 10 mM HEPES is added. 2) and added to wells of a 48-well plate at a concentration of 3 × 10 5 cells / ml in IMDM-5, 3) in IMDM-5 using specific Ag (OVA) Pulsed.
b) Ex vivo generation and proliferation of certain functionally committed FOXP3-expressing CD3 + TCRαβ + MHCII restricted T cells: On day 0, ovalbumin pulsed tDC was washed 1) twice with IMDM-5, 2) Add to wells of a 48-well plate in the presence of 2 × 10 5 irradiated self-feeders, PGE2 1 μM, and Rapa 10 nM at a concentration of 3 × 10 5 cells / ml in IMDM-5. Purified naïve conventional CD4 + T cells (isolated from PBMC previously frozen by FACS) are added to pulsed tDC. On day 1, IL-2 (100 IU / ml) and TGFβ (5 ng / ml) are added to the co-culture. Every 3 days, half of the supernatant volume is discarded and replaced with fresh IMDM-5 with IL-2 (100 UI / ml (T cell cloning medium)). On day 12, these T cells are further expanded by restimulation with ova-pulsed tDC in the presence of ΔCD3-feeder, PGE2 1 μM, TGFβ 5 ng / ml, Rapa 10 nM, IL-2 (100 UI / ml). Once T cells begin to grow, they can be split every 2-3 days using T cell cloning media and irradiation feeders. On day 21, cells are analyzed by flow cytometry. 85% of stimulated naive conventional CD4 + T cells that became CD45RO + express Foxp3 + . Ova-specific memory CD3 + TCRαβ + MHCII restricted T cells are committed to exert exclusively regulatory activity after 21 days of growth in nTreg polarized medium in any culture condition of stimulation To confirm the Ova-specific pTreg was obtained using nTreg polarization medium (containing a combination of IL-2, TGFβ, PGE2, and rapamycin) or TH-17 polarization medium (IL-2, IL-1, IL- 6 and IMDM medium containing IL-21 and IL-23 cytokine). Foxp3-expressing CD3 + CD4 + TCRαβ + MHCII restricted T cells grown for 21 days were stimulated every 3 days with plate-bound anti-CD3 mAb (4 μg / ml) in the presence of ΔCD3 feeder (1 M) in a 48-well plate Discard half of the clear volume and replace with fresh T cell cloning medium or TH-17 polarization medium for 21 days.
機能的にコミットされたFOXP3発現CD3+TCRγδ+非制限T細胞のエクスビボでの生成: Generation of functionally committed FOXP3-expressing CD3 + TCRγδ + unrestricted T cells ex vivo:
CD14+単球からの腫瘍負荷寛容原性DC(寛容原性単球由来DC(tDC)と呼ぶ)のインビトロでの生成:単球を、100ng/ml組換えヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)及び10ng/mlヒト組換えIL−4を添加した1ウェル当たり0.5mlのAIMVを含む48ウェル平底プレート中で培養する。3日目に、サイトカインを含む500μlの培地を加える。5日目に、tDCの一部を、GM−CSF(100ng/mL)、IL−4(10ng/mL)を伴うAIMV中で、DC/腫瘍細胞比1:2で24時間にわたりアポトーシスMCF−7細胞と共培養する。tDCの別の一部を90%FBS−10%DMSO中の2×106個/バイアルで凍結する。 In vitro generation of tumor-bearing tolerogenic DC (referred to as tolerogenic monocyte-derived DC (tDC)) from CD14 + monocytes: monocytes were transformed into 100 ng / ml recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor ( Incubate in 48 well flat bottom plates containing 0.5 ml AIMV per well supplemented with GM-CSF) and 10 ng / ml human recombinant IL-4. On day 3, 500 μl medium containing cytokines is added. On day 5, a portion of tDC was apoptotic MCF-7 over 24 hours at a DC / tumor cell ratio of 1: 2 in AIMV with GM-CSF (100 ng / mL), IL-4 (10 ng / mL). Co-culture with cells. Another portion of tDC is frozen at 2 × 10 6 cells / vial in 90% FBS-10% DMSO.
腫瘍リン酸化抗原特異的に機能的にコミットされたFoxp3発現CD3+TCRγδ+非制限T細胞のエクスビボでの生成及び増殖。 Ex vivo generation and proliferation of tumor phosphoantigen specific functionally committed Foxp3 expressing CD3 + TCRγδ + non-restricted T cells.
0日目に、腫瘍抗原パルスtDCを、1)IMDM−5で2回洗浄し、2)2×105個の照射自己フィーダー、PGE2 1μM、及びRapa 10nMの存在においてIMDM−5中の3×105個/mlの濃度で48ウェルプレートのウェルに加える。精製CD3+CD45RA+TCRγδ+非制限T細胞(FACSにより以前に凍結したPBMCから単離)をパルスtDCに加える。1日目に、IL−2(100IU/ml)及びTGFβ(5ng/ml)を共培養物に加える。3日毎に、上清容量の半分を捨て、IL−2を伴う新鮮なIMDM−5(100UI/ml)(T細胞クローニング培地)と交換する。12日目に、これらのT細胞を、ΔCD3フィーダー、PGE2 1μM、TGFβ 5ng/ml、Rapa 10nM、及びIL−2(100UI/ml)の存在において腫瘍AgパルスtDCを用いた再刺激によりさらに増殖させる。一度、T細胞が増殖し始めたら、それらをT細胞クローニング培地及び照射フィーダーで2〜3日毎に分割することができる。21日目に、細胞をフローサイトメトリーにより分析する。CD45RO+になった刺激されたナイーブCD3+CD45RA+TCRγδ+T細胞の75%がFoxp3+を発現する。 On day 0, tumor antigen pulse tDC was washed 1 × with IMDM-5 twice, 2) 3 × in IMDM-5 in the presence of 2 × 10 5 irradiated self-feeders, PGE2 1 μM, and Rapa 10 nM. Add to wells of a 48-well plate at a concentration of 10 5 cells / ml. Purified CD3 + CD45RA + TCRγδ + non-restricted T cells (isolated from PBMC previously frozen by FACS) are added to pulsed tDC. On day 1, IL-2 (100 IU / ml) and TGFβ (5 ng / ml) are added to the co-culture. Every 3 days, half of the supernatant volume is discarded and replaced with fresh IMDM-5 (100 UI / ml) with IL-2 (T cell cloning medium). On day 12, these T cells are further expanded by restimulation with tumor Ag pulse tDC in the presence of ΔCD3 feeder, PGE2 1 μM, TGFβ 5 ng / ml, Rapa 10 nM, and IL-2 (100 UI / ml). . Once T cells begin to grow, they can be split every 2-3 days with T cell cloning media and irradiation feeders. On day 21, cells are analyzed by flow cytometry. 75% of stimulated naive CD3 + CD45RA + TCRγδ + T cells that became CD45RO + express Foxp3 + .
腫瘍抗原特異的に機能的にコミットされたFOXP3発現CD3+invTCR Vα24+CD1d制限T細胞のエクスビボでの生成。
a)CD14+単球からの腫瘍負荷寛容原性DC(寛容原性単球由来DC(tDC)と呼ぶ)のインビトロでの生成:単球を、CD1dを発現する未成熟DCの生成のために100ng/ml組換えヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)ならびに10ng/mlヒト組換えIL−4及びAM580(100nM)を添加した1ウェル当たり0.5mlのAIMVを含む48ウェル平底プレート中で培養する。3日目に、サイトカインを含む500μlの培地を加える。5日目に、tDCの一部を、GM−CSF(100 ng/mL)、IL−4(10ng/mL)を伴うAIMV中で、DC/腫瘍細胞比率1:2で24時間にわたりアポトーシスMCF−7細胞と共培養する。tDCの他の一部を、2×106個/バイアルで90%FBS−10%DMSO中に凍結する。
b)腫瘍抗原特異的に機能的にコミットされたFoxp3発現CD3+invTCR Vα24+CD1d制限T細胞のエクスビボでの生成及び増殖:0日目に、腫瘍抗原パルスtDCを、1)IMDM−5で2回洗浄し、2)2×105個の照射自己フィーダー、PGE2 1μM、及びRapa 10nMの存在においてIMDM−5中の3×105個/mlの濃度で48ウェルプレートのウェルに加える。精製CD3+CD45RA+invTCR Vα24+CD1制限T細胞(FACSにより以前に凍結したPBMCから単離)をパルスtDCに加える。1日目に、IL−2(100IU/ml)、IL−15(10ng/ml)、及びTGFβ(5ng/ml)を共培養物に加える。3日毎に、上清容量の半分を捨て、IL−2(100UI/ml)及びIL−15(10ng/ml)を伴う新鮮なIMDM−5(T細胞クローニング培地)と交換する。12日目に、これらのT細胞を、ΔCD3フィーダー、PGE2 1μM、TGFβ 5ng/ml、Rapa 10nM、IL−2(100UI/ml)、及びIL−15(10ng/ml)の存在における腫瘍AgパルスtDCを用いた再刺激によりさらに増殖させる。T細胞が増殖し始めたら、それらをT細胞クローニング培地及び照射フィーダーを用いて2〜3日毎に分割することができる。21日目に、細胞をフローサイトメトリーにより分析する。CD45RO+になった刺激CD3+CD45RA+invTCR Vα24+細胞の75%がFoxp3+を発現する。
Generation of tumor antigen-specific functionally committed FOXP3-expressing CD3 + invTCR Vα24 + CD1d restricted T cells ex vivo.
a) In vitro generation of tumor-bearing tolerogenic DC from CD14 + monocytes (referred to as tolerogenic monocyte-derived DC (tDC)): for the generation of immature DC expressing CD1d 48-well flat bottom plate containing 0.5 ml AIMV per well supplemented with 100 ng / ml recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and 10 ng / ml human recombinant IL-4 and AM580 (100 nM) Incubate in. On day 3, 500 μl medium containing cytokines is added. On day 5, a portion of tDC was transferred to apoptotic MCF- for 24 hours at a DC / tumor cell ratio of 1: 2 in AIMV with GM-CSF (100 ng / mL), IL-4 (10 ng / mL). Co-culture with 7 cells. Other portions of tDC are frozen in 90% FBS-10% DMSO at 2 × 10 6 / vial.
b) Ex vivo generation and proliferation of tumor antigen-specifically functionally committed Foxp3-expressing CD3 + invTCR Vα24 + CD1d restricted T cells on day 0: 1) Tumor antigen pulse tDC 2) with IMDM-5 Wash 2 times and add to wells of a 48-well plate at a concentration of 3 × 10 5 cells / ml in IMDM-5 in the presence of 2 × 10 5 irradiation self-feeders, PGE2 1 μM, and Rapa 10 nM. Purified CD3 + CD45RA + invTCR Vα24 + CD1 restricted T cells (isolated from PBMC previously frozen by FACS) are added to pulsed tDC. On day 1, IL-2 (100 IU / ml), IL-15 (10 ng / ml), and TGFβ (5 ng / ml) are added to the co-culture. Every 3 days, half of the supernatant volume is discarded and replaced with fresh IMDM-5 (T cell cloning medium) with IL-2 (100 UI / ml) and IL-15 (10 ng / ml). On day 12, these T cells were transformed into tumor Ag pulse tDC in the presence of ΔCD3 feeder, PGE2 1 μM, TGFβ 5 ng / ml, Rapa 10 nM, IL-2 (100 UI / ml), and IL-15 (10 ng / ml). Further growth by restimulation with Once T cells begin to grow, they can be split every 2-3 days using T cell cloning media and irradiation feeders. On day 21, cells are analyzed by flow cytometry. 75% of stimulated CD3 + CD45RA + invTCR Vα24 + cells that became CD45RO + express Foxp3 + .
リン酸化抗原特異的な機能的にコミットされたFOXP3発現CD3+TCRγδ+非制限T細胞のエクスビボでの生成。
a)CD14+単球からの寛容原性DCのインビトロでの生成(寛容原性単球由来DC(Tol−Mo−DC)と呼ぶ):単球を、未成熟DCの生成のための100ng/ml組換えヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)及び10ng/mlヒト組換えIL−4を添加した1ウェル当たり0.5mlのAIMVを含む48ウェル平底プレート中で培養する。3日目に、サイトカインを含む500μlの培地を加えた。6日目に、生成したTol−Mo−DCをウェルから取り出し、IMDM−5(5%SVF、100IU/mlペニシリン/ストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM非必須アミノ酸、グルタマックス、及び10mM HEPESを添加したIMDM)で2回洗浄し、凍結するか、又はリン酸化抗原特異的な機能的にコミットされたFOXP3発現CD3+TCRγδ+非制限T細胞の生成及び増殖のために使用する。
b)リン酸化抗原特異的な機能的にコミットされたFOXP3発現CD3+TCRγδ+非制限T細胞のエクスビボでの生成及び増殖:0日目に、tDMを、2×105個照射自己フィーダー、PGE2 1μM、ならびにRapa 10nM及びゾレドロン酸(100nM)の存在において、IMDM中の3×105個/mlの濃度で48ウェルプレートのウェルに加える。精製されたCD3+CD45RA+TCRγδ+非制限T細胞(FACSにより以前に凍結したPBMCから単離)をパルスtDCに加える。1日目に、IL−2(100IU/ml)、IL−15(10ng/ml)、及びTGFβ(5ng/ml)を共培養物に加える。3日毎に、上清容量の半分を捨て、IL−2(100UI/ml)及びIL−15(10ng/ml)を伴う新鮮なIMDM−5(T細胞クローニング培地)と交換する。12日目に、これらのT細胞を、ΔCD3フィーダー、PGE2 1μM、TGFβ 5ng/ml、Rapa10nM、IL−2(100UI/ml)、IL−15(10ng/ml)、及びゾレドロン酸(100nM)の存在においてtDCでの再刺激によりさらに増殖させる。一度、T細胞が増殖し始めたら、それらをT細胞クローニング培地及び照射フィーダーを用いて2〜3日毎に分割することができる。21日目に、細胞をフローサイトメトリーにより分析する。CD45RO+になった刺激されたCD3+CD45RA+TCRγδ+T細胞の75%がFoxp3+を発現する。
Ex vivo generation of phosphoantigen-specific functionally committed FOXP3-expressing CD3 + TCRγδ + unrestricted T cells.
a) In vitro generation of tolerogenic DC from CD14 + monocytes (referred to as tolerogenic monocyte-derived DC (Tol-Mo-DC)): monocytes are 100 ng / for generation of immature DC Culture in 48-well flat bottom plates containing 0.5 ml AIMV per well supplemented with ml recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and 10 ng / ml human recombinant IL-4. On the third day, 500 μl of medium containing cytokines was added. On day 6, the produced Tol-Mo-DC was removed from the well and IMDM-5 (5% SVF, 100 IU / ml penicillin / streptomycin, 1 mM sodium pyruvate, 1 mM non-essential amino acids, glutamax, and 10 mM HEPES added. Washed twice with IMDM) and frozen, or used for the generation and expansion of functionally committed FOXP3-expressing CD3 + TCRγδ + non-restricted T cells specific for phosphoantigen.
b) Phosphoantigen-specific functionally committed FOXP3-expressing CD3 + TCRγδ + ex vivo generation and proliferation: on day 0, 2 × 10 5 irradiated self-feeders, PGE2 Add to wells of a 48-well plate at a concentration of 3 × 10 5 / ml in IMDM in the presence of 1 μM and Rapa 10 nM and zoledronic acid (100 nM). Purified CD3 + CD45RA + TCRγδ + unrestricted T cells (isolated from PBMC previously frozen by FACS) are added to pulsed tDC. On day 1, IL-2 (100 IU / ml), IL-15 (10 ng / ml), and TGFβ (5 ng / ml) are added to the co-culture. Every 3 days, half of the supernatant volume is discarded and replaced with fresh IMDM-5 (T cell cloning medium) with IL-2 (100 UI / ml) and IL-15 (10 ng / ml). On day 12, these T cells were removed in the presence of ΔCD3 feeder, PGE2 1 μM, TGFβ 5 ng / ml, Rapa 10 nM, IL-2 (100 UI / ml), IL-15 (10 ng / ml), and zoledronic acid (100 nM). Further growth by restimulation with tDC. Once T cells begin to grow, they can be split every 2-3 days using T cell cloning media and irradiation feeders. On day 21, cells are analyzed by flow cytometry. 75% of stimulated CD3 + CD45RA + TCRγδ + T cells that became CD45RO + express Foxp3 + .
MLRアッセイ用の刺激細胞のインビトロでの生成:単球を、未成熟DC(iDC)の生成のために、20ng/ml組換えヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)及び20ng/mlヒト組換えIL−4を添加した1ウェル当たり0.5mlのRPMI−5を含む48ウェル平底プレート中で培養する。3日目に、サイトカインを含む500μlの培地を加える。5日目に、iMDCの一部を、GM−CSF(20ng/mL)、IL−4(20ng/mL)、及び5%FBSを添加したRPMI1640中で24時間にわたりDC/腫瘍細胞比率1:2でアポトーシスMCF−7細胞と共培養する。iDCの別の一部を2×106個/バイアル(90%FBS−10%DMSO中)で凍結する。指示された場合、パルスDCを腫瘍壊死因子α(TNF−α;最終20ng/mL)及びPGE 2(1μM)を用いて2日間にわたり成熟させる(mDC)。一部の実験において、TNF及びPGE2(同じ濃度で)、又はリポ多糖(LPS;10〜1000ng/mL;Sigma)をMLRに直接加える。抗原負荷DC刺激装置を30Gyで照射する。 In vitro generation of stimulator cells for MLR assay: Monocytes were transformed into 20 ng / ml recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and 20 ng / ml for generation of immature DC (iDC). Incubate in 48 well flat bottom plates containing 0.5 ml RPMI-5 per well supplemented with human recombinant IL-4. On day 3, 500 μl medium containing cytokines is added. On day 5, a portion of iMDC was transferred to RPMI 1640 supplemented with GM-CSF (20 ng / mL), IL-4 (20 ng / mL), and 5% FBS for a DC / tumor cell ratio of 1: 2 Co-culture with apoptotic MCF-7 cells. Another portion of iDC is frozen at 2 × 10 6 cells / vial (in 90% FBS-10% DMSO). When indicated, pulsed DCs are matured (mDC) for 2 days with tumor necrosis factor α (TNF-α; final 20 ng / mL) and PGE 2 (1 μM). In some experiments, TNF and PGE2 (at the same concentration), or lipopolysaccharide (LPS; 10-1000 ng / mL; Sigma) is added directly to the MLR. Irradiate the antigen-loaded DC stimulator at 30 Gy.
MLRアッセイ用のTAP阻害刺激細胞のインビトロでの生成:上に記載するように得られた成熟DCを、BHV−1からのUL49.5遺伝子を含むpGem4Zベクターから合成された20μgのRNAを用いてエレクトロポレーションする(参考文献:Lampen MH, Verweij MC, Querido B, van der Burg SH, Wiertz EJ, van Hall T)。TAP阻害細胞に対するCD8+T細胞応答は、ヒト集団において容易に検出される(J Immunol. 2010 Dec 1;185(11):6508-17.)。 In vitro generation of TAP inhibitory stimulator cells for MLR assays: Mature DCs obtained as described above were used with 20 μg RNA synthesized from the pGem4Z vector containing the UL49.5 gene from BHV-1. Electroporation (reference: Lampen MH, Verweij MC, Querido B, van der Burg SH, Wiertz EJ, van Hall T). CD8 + T cell responses to TAP-inhibiting cells are readily detected in the human population (J Immunol. 2010 Dec 1; 185 (11): 6508-17.).
アポトーシスT細胞−DC共培養:未成熟DCを単独で又はアポトーシス細胞(3のアポトーシス細胞:1のiDC)と16時間にわたり培養した。DCを次に、抗CD3コーティングマイクロビーズ(Miltenyi Biotec)を使用したアポトーシスT細胞の免疫磁気枯渇により精製し、20μgの合成RNAを用いてエレクトロポレーションし、又はすることなく、20ng/ml GM−CSF、20ng/mlヒト組換えIL−4、及び成熟化カクテル(TNF−α20ng/ml及びPGE2 1μM)を添加したRPMI−5中で24時間にわたりインキュベートした。 Apoptotic T-cell-DC co-culture: immature DCs were cultured for 16 hours alone or with apoptotic cells (3 apoptotic cells: 1 iDC). DCs were then purified by immunomagnetic depletion of apoptotic T cells using anti-CD3 coated microbeads (Miltenyi Biotec) and electroporated with or without 20 μg synthetic RNA, 20 ng / ml GM- Incubated for 24 hours in RPMI-5 supplemented with CSF, 20 ng / ml human recombinant IL-4, and maturation cocktail (TNF-α 20 ng / ml and PGE2 1 μM).
フローサイトメトリー分析 Flow cytometry analysis
mAb標識。以下のコンジュゲートmAbを使用する。a)CD3+T細胞について:抗CD4(SK3)−PerCP−eFluor 710、抗TCRαβ(IP26)−APC(ebioscience)、抗CD25(B1.49.9)−PeCy55、抗CD127(R34.34)−APC−AF700(Beckman Coulter)、抗CD3(UCHT1)−BB515抗インバリアントTCR Vα24−JaQ(6B11)−PE、抗Foxp3(259D/C7)−PE−CF594及び抗CD152(BNI3)−BV421、抗CD161(DX12)BV605及び抗CD56(NCAM 16.2)BU395(Becton Dickinson)、抗TCRαβ−BV421(IP26)(Biolegend)、抗TCR汎γδ+PE(IMMU510)(Beckman Coulter)及び抗CD27−APC efluor 780(O323)(ebioscience)。細胞を、BSA/NaN3(0.5%BSA、0.01%NaN3)を含むPBS(FACS緩衝液)中で希釈したAbの混合物を使用して表面マーカーについて染色する(暗所で、4℃で30分間)。Foxp3及びCTLA−4の細胞内染色を、ebioscienceから得られたFOXP3染色キットを製造者の指示に従って用いて実施する。適当なアイソタイプ対照Abを各々の染色の組み合わせについて使用する。サンプルは、BD FACSDIVA 8.0.1ソフトウェア(Becton Dickinson)を使用してBD LSR FORTESSAフローサイトメーターで取得する。結果をパーセンテージ(%)又は平均蛍光強度(MFI)で表す。
b) 誘導性の特異的Tregについて:誘導性TregでのIL−1R1の存在を、モノクローナル抗Foxp3(259D/C7)−PE−CF594Ab及びポリクローナル抗IL1R1−PE(R&D Systems、FAB269P)を用いて評価した。
mAb labeling. The following conjugated mAb is used. a) For CD3 + T cells: anti-CD4 (SK3) -PerCP-eFluor 710, anti-TCRαβ (IP26) -APC (ebioscience), anti-CD25 (B1.49.9) -PeCy55, anti-CD127 (R34.34)- APC-AF700 (Beckman Coulter), anti-CD3 (UCHT1) -BB515 anti-invariant TCR Vα24-JaQ (6B11) -PE, anti-Foxp3 (259D / C7) -PE-CF594 and anti-CD152 (BNI3) -BV421, anti-CD161 (DX12) BV605 and anti-CD56 (NCAM 16.2) BU395 (Becton Dickinson), anti-TCRαβ-BV421 (IP26) (Biolegend), anti-TCR pan-γδ + PE (IMMU510) (Beckman Coulter) and anti-CD27-APC fluor 780 (O323) (eb ioscience). Cells are stained for surface markers using a mixture of Ab diluted in PBS (FACS buffer) containing BSA / NaN 3 (0.5% BSA, 0.01% NaN 3 ) (in the dark, 30 minutes at 4 ° C). Intracellular staining of Foxp3 and CTLA-4 is performed using the FOXP3 staining kit obtained from ebioscience according to the manufacturer's instructions. An appropriate isotype control Ab is used for each staining combination. Samples are acquired on a BD LSR FORTESSA flow cytometer using BD FACSDIVA 8.0.1 software (Becton Dickinson). Results are expressed as percentage (%) or mean fluorescence intensity (MFI).
b) For inducible specific Treg: The presence of IL-1R1 in the inducible Treg is assessed using monoclonal anti-Foxp3 (259D / C7) -PE-CF594 Ab and polyclonal anti-IL1R1-PE (R & D Systems, FAB269P) did.
CFSE染色。Tconvを、PBS中の1μMカルボキシ−フルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)(CellTrace細胞増殖キット;Molecular Probes/Invitrogen)を用いて、37℃で1×107細胞/mLの濃度で8分間にわたり染色する。標識化を、10%FBSを含むRPMI1640培養培地を用いて2回細胞を洗浄することにより停止する。細胞を次に、所望の濃度で再懸濁し、その後に増殖アッセイのために使用する。 CFSE staining. Tconv is stained with 1 μM carboxy-fluorescein succinimidyl ester (CFSE) (CellTrace Cell Proliferation Kit; Molecular Probes / Invitrogen) in PBS for 8 minutes at a concentration of 1 × 10 7 cells / mL at 37 ° C. . Labeling is stopped by washing the cells twice with RPMI 1640 culture medium containing 10% FBS. The cells are then resuspended at the desired concentration and then used for proliferation assays.
7−AAD(7−アミノ−アクチノマイシンD)染色。刺激されたCFSE標識又は非標識nTreg及びTconvのアポトーシスを、7−AADアッセイを使用して決定した。簡単には、培養細胞を20μg/mLの核色素7−AAD(Sigma-Aldrich)を用いて4℃で30分間にわたり染色する。FSC/7−AADドットプロットによって、アポトーシス(FSChigh/7−AAD+)細胞及びアポトーシス小体(FSClow/7−AAD+)ならびに細片((FSClow/7−AAD−)から生存(FSChigh/7−AAD−)を区別する。生細胞をCD3+7−AAD−FSC+細胞として同定する。 7-AAD (7-amino-actinomycin D) staining. Apoptosis of stimulated CFSE-labeled or unlabeled nTreg and Tconv was determined using a 7-AAD assay. Briefly, cultured cells are stained with 20 μg / mL nuclear dye 7-AAD (Sigma-Aldrich) for 30 minutes at 4 ° C. The FSC / 7-AAD dot plot, apoptosis (FSC high / 7-AAD + ) cells and apoptotic bodies (FSC low / 7-AAD + ) and strips ((FSC low / 7-AAD - survive) (FSC high / 7-AAD − ), and live cells are identified as CD3 + 7-AAD − FSC + cells.
BC生検から単離されたFoxp3発現CD3+CD4+γδT細胞非制限T細胞の表現型の特徴:TCRγδT細胞サブセットの同定をフローサイトメトリーにより実施した。パネルには、CD3(クローンSK7)、CD4(クローンSK3)、CD8(クローンSK1)、汎γδT(クローンIMMU510)、TCR Vδ1(REA173)、TCR Vδ2(REA771)、及びFoxp3+(クローン259D)に対する抗体が含まれた。 Phenotypic characteristics of Foxp3-expressing CD3 + CD4 + γδ T cell non-restricted T cells isolated from BC biopsy: Identification of TCR γδ T cell subsets was performed by flow cytometry. Panels show antibodies against CD3 (clone SK7), CD4 (clone SK3), CD8 (clone SK1), pan-γδT (clone IMMU510), TCR Vδ1 (REA173), TCR Vδ2 (REA771), and Foxp3 + (clone 259D) Was included.
機能アッセイ Functional assay
T細胞増殖。T細胞増殖を、5%FBS、100IU/mlペニシリン/ストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM非必須アミノ酸、グルタマックス、及び10mM HEPES(RPMI−5培地)を添加したRPMI中で酸素正常状態において評価する。共培養の完了時、刺激されたCFSE標識Tconvを収集し、抗CD3mAb及び7−AADで共染色し、ゲートCD3+7−AAD−細胞中の生増殖細胞のパーセンテージ(CFSE低画分として定義)をフローサイトメトリーにより決定する。 T cell proliferation. T cell proliferation is assessed in normoxia in RPMI supplemented with 5% FBS, 100 IU / ml penicillin / streptomycin, 1 mM sodium pyruvate, 1 mM non-essential amino acids, glutamax, and 10 mM HEPES (RPMI-5 medium). . At the completion of co-culture, stimulated CFSE-labeled Tconv is collected, co-stained with anti-CD3 mAb and 7-AAD, and percentage of viable proliferating cells in gated CD3 + 7-AAD− cells (defined as CFSE low fraction) Is determined by flow cytometry.
T細胞アポトーシス誘導:腫瘍抗原特異的な機能的にコミットされたFOXP3発現CD3+TCRγδ+非制限T細胞を、上に記載するようにエクスビボで生成する。次に、腫瘍抗原特異的な刺激T細胞を254nm(UV−C)で照射し(240mJ/cm2)、未成熟DCとの共培養の前に6時間にわたり培養した。アポトーシスを7−AAD染色により確認した。平均して、細胞の75%が7−AAD+である。 Induction of T cell apoptosis: Tumor antigen-specific functionally committed FOXP3-expressing CD3 + TCRγδ + unrestricted T cells are generated ex vivo as described above. Tumor antigen specific stimulated T cells were then irradiated at 254 nm (UV-C) (240 mJ / cm 2 ) and cultured for 6 hours prior to co-culture with immature DCs. Apoptosis was confirmed by 7-AAD staining. On average, 75% of the cells are 7-AAD + .
標準的なポリクローナル細胞−細胞接触Treg抑制アッセイ:レスポンダー細胞として使用されるCFSE標識Tconv(4×104個/ウェル)を、規定量のFoxp3T細胞(血液Treg又はエクスビボで生成されたT細胞)の存在又は非存在においてΔCD3−フィーダー(4×104個/ウェル)と4〜5日間にわたり培養する。培養は、200μLの完全RPMI培地中の0.2μg/mLの抗CD3 mAbでコーティングされた丸底プレート中で実施する。結果を、増殖CFSE低 T細胞のパーセンテージとして、又は以下のように算出される抑制のパーセンテージとして表す:(100×[(Tconv CFSE低細胞のパーセンテージ−nTregsとの共培養中のTconv CFSEのパーセンテージ)/Tconv CSFE低細胞のパーセンテージ]。 Standard polyclonal cell-cell contact Treg suppression assay: CFSE-labeled Tconv (4 × 10 4 cells / well) used as responder cells and a defined amount of Foxp3 T cells (blood Treg or ex vivo generated T cells) Incubate with ΔCD3-feeders (4 × 10 4 cells / well) in the presence or absence for 4-5 days. Culturing is performed in round bottom plates coated with 0.2 μg / mL anti-CD3 mAb in 200 μL complete RPMI medium. Results are expressed as a percentage of proliferating CFSE low T cells or as a percentage of suppression calculated as follows: (100 × [(percent Tconv CFSE low cells−percent Tconv CFSE in co-culture with nTregs)) / Tconv CSFE low cell percentage].
自己MLR抑制アッセイ:CFSE標識Tconv CD4+CD25−T細胞(5×104個)を、RPMI−5培地中の1×104個のパルスiDCを用いて、又はIL−2(20IU/ml)IL−1b(10ng/ml)、IL−6(30ng/ml)、IL−21(50ng/ml)、及びIL−23(30ng/ml)を添加したIMDM−5培地中の5×103個のパルス−mDCを用いて、規定量のFoxp3 T細胞(血液Treg又はエクスビボで生成されたT細胞)の存在又は非存在において5〜6日間にわたり刺激する。指示がある場合、培養を、IL−2(20IU/ml)、IL−1β(10ng/ml)、IL−6(30ng /ml)、IL−21(50ng/ml)、及びIL−23(30ng/ml)を添加したIMDM−5培地中で実施する。結果を、増殖CFSE低 T細胞のパーセンテージとして、又は以下のように算出された抑制のパーセンテージとして表す:(100×[(Tconv CFSE低細胞のパーセンテージ−nTregsとの共培養におけるTconv CFSEのパーセンテージ)/Tconv CSFE低細胞のパーセンテージ)。 Autologous MLR inhibition assay: CFSE-labeled Tconv CD4 + CD25 − T cells (5 × 10 4 ) using 1 × 10 4 pulsed iDC in RPMI-5 medium or IL-2 (20 IU / ml) 5 × 10 3 in IMDM-5 medium supplemented with IL-1b (10 ng / ml), IL-6 (30 ng / ml), IL-21 (50 ng / ml), and IL-23 (30 ng / ml) Stimulation for 5-6 days in the presence or absence of a defined amount of Foxp3 T cells (blood Tregs or ex vivo generated T cells). Where indicated, cultures were IL-2 (20 IU / ml), IL-1β (10 ng / ml), IL-6 (30 ng / ml), IL-21 (50 ng / ml), and IL-23 (30 ng). / ml) in IMDM-5 medium. Results are expressed as a percentage of proliferating CFSE low T cells or as a percentage of suppression calculated as follows: (100 × [(percent Tconv CFSE low cells−percent Tconv CFSE in co-culture with nTregs) / Tconv CSFE low cell percentage).
古典的7−AAD/CFSE細胞媒介性の細胞傷害性アッセイ:標的細胞を上に記載するようにCFSEで標識し、96ウェルU底プレートに3通りに3×104個/ウェルで配置した。CD8+エフェクターT細胞(5:1のE:T比率)を加え、インキュベーションを37℃で6時間にわたり行った。実験の終了時に、死細胞を7−AADで標識して溶解細胞を検出した。標的細胞に対する細胞溶解活性を、FACSCalibur機器を使用し、二重陽性染色CFSE及び7−AADを示す領域に基づいて分析した。CD8+T細胞クローンの細胞溶解活性(%)を、陰性対照における自然溶解(%)を差し引いた後、CFSE及び7−AADの両方について陽性の細胞/全CFSE陽性細胞として算出した。細胞溶解活性のパーセンテージを次に、以下の式を使用して算出した:細胞溶解活性(%)[死んだ標的細胞(%)−自然死(%)]×100/[100−自然死(%)]。 Classical 7-AAD / CFSE cell-mediated cytotoxicity assay: Target cells were labeled with CFSE as described above and placed in triplicate at 3 × 10 4 cells / well in a 96-well U-bottom plate. CD8 + effector T cells (5: 1 E: T ratio) were added and incubation was carried out at 37 ° C. for 6 hours. At the end of the experiment, dead cells were labeled with 7-AAD to detect lysed cells. Cytolytic activity against target cells was analyzed using a FACSCalibur instrument based on areas showing double positive staining CFSE and 7-AAD. The cytolytic activity (%) of CD8 + T cell clones was calculated as positive cells / total CFSE positive cells for both CFSE and 7-AAD after subtracting spontaneous lysis (%) in the negative control. The percentage of cytolytic activity was then calculated using the following formula: cytolytic activity (%) [dead target cells (%) − natural death (%)] × 100 / [100−natural death (%) ]].
DNAメチル化の測定:古典的には、安定したTreg遺伝子シグネチャーは、Treg特異的脱メチル化領域(TSDR)の保存された非コード配列2(CNS2)内の高度に脱メチル化されたCpGアイランドからなった。遺伝子FOXP3のTSDR領域のDNAメチル化分析を、Christopher Fuhrman(Fuhrman et al, Divergent Phenotypes of Human Regulatory T Cells Expressing the Receptors TIGIT and CD226, 2015, Journal of immunology)により以前に記載されているように、ゲノムDNAの亜硫酸水素塩処理後の定量的PCRにより評価した。簡単には、ヌクレオチドを、AllPrep DNA/RNA Mini Kit(Qiagen)又はDNeasy組織キット(Qiagen)を適宜用いて単離した。ゲノムDNAの亜硫酸水素塩処理は、EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research)を用いて500ngのDNAで実施した。DNA標準は、非メチル化亜硫酸水素塩変換ヒトEpiTect対照DNA(Qiagen)又は汎用メチル化亜硫酸水素塩変換ヒト対照DNA(Zymo Research)から由来する。多量の標準を得るために、TSDRを、以下の反応を使用してPCR増幅した:25μlのZymoTaq PreMix緩衝液(Zymo Research)ならびに各々0.5μMのプライマーFOXP3_TSDRfwd(5’−ATATTTTTAGATAGGGATATGGAGATGATTTGTTTGG−3’−配列番号1)及びFOXP3_TSDRrev(5’−AATAAACATCACCTACCACATCCACCAACAC−3’−配列番号2)を含む50μMの反応容量。95℃で10分間にわたるインキュベーション後、増幅を以下の通りに実施した:95℃で30秒間、55℃で30秒間、及び72℃で1分間の50サイクル。増幅されたPCR産物を、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)を用いて精製した。精製された対照TSDR DNAの濃度を、GE NanoVue分光光度計(GE Healthcare Life Sciences)を用いて決定した。TSDRリアルタイムPCRを、メチル化又は脱メチル化標的配列を標的とするプローブを用いて実施した。反応は、Roche LightCycler 480システム(Roche Diagnostics)を用いて96ウェル白色トレイ中で実施した。各々の反応液は、10μlのLightCycler 480 Probes Master Mix(Roche)、10ngの亜硫酸水素塩変換DNAサンプル又は標準、1μMの各々のプライマー、及び150nMの各々のプローブを含み、最終反応値は20μlであった。増幅のために使用したプローブは、TSDR−フォワード5’−GGTTTGTATTTGGGTTTTGTTGTTATAGT−3’(配列番号3)及びTSDR−リバース5’−CTATAAAATAAAATATCTACCCTCTTCTCTTCCT−3’(配列番号4)であった。標的配列検出用のプローブは、FAM標識メチル化プローブ、FAM−CGGTCGGATGCGTC−MGB−NFQ(配列番号5)、又はVIC標識非メチル化プローブ、VIC−TGGTGGTTGGATGTGTTG−MGB−NFQ(配列番号6)であった。全てのサンプルを三通りに試験した。リアルタイム増幅用のプロトコールは以下の通りである:95℃で10分間の初期変性後、サンプルを95℃で15秒間及び61℃で1分間の50サイクルに供した。14の異なる比率の完全メチル化及び脱メチル化鋳型をリアルタイム標準として使用した。6次多項式を使用して、各々のサンプルについて、TSDRで脱メチル化された細胞のパーセンテージを推定した。 DNA methylation measurement: Classically, a stable Treg gene signature is a highly demethylated CpG island within the conserved non-coding sequence 2 (CNS2) of the Treg-specific demethylation region (TSDR) Made up of. DNA methylation analysis of the TSDR region of gene FOXP3 was performed as described previously by Christopher Fuhrman (Fuhrman et al, Divergent Phenotypes of Human Regulatory T Cells Expressing the Receptors TIGIT and CD226, 2015, Journal of immunology). DNA was evaluated by quantitative PCR after bisulfite treatment. Briefly, nucleotides were isolated using the AllPrep DNA / RNA Mini Kit (Qiagen) or DNeasy tissue kit (Qiagen) as appropriate. Bisulfite treatment of genomic DNA was performed on 500 ng of DNA using EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research). DNA standards are derived from unmethylated bisulfite converted human EpiTect control DNA (Qiagen) or universal methylated bisulfite converted human control DNA (Zymo Research). To obtain abundant standards, TSDR was PCR amplified using the following reaction: 25 μl of ZymoTaq PreMix buffer (Zymo Research) and 0.5 μM each of primer FOXP3_TSDRfwd (5′-ATATTTTTAGATAGGGATATGGAGATGATTTGTTTG-3′-sequence Reaction volume of 50 μM containing No. 1) and FOXP3_TSDRrev (5′-AATAAACATCACCTACCACATCCACCCAACAC-3′-SEQ ID No. 2). After incubation at 95 ° C for 10 minutes, amplification was performed as follows: 50 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute. The amplified PCR product was purified using the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). The concentration of purified control TSDR DNA was determined using a GE NanoVue spectrophotometer (GE Healthcare Life Sciences). TSDR real-time PCR was performed with probes targeting methylated or demethylated target sequences. The reaction was performed in a 96 well white tray using the Roche LightCycler 480 system (Roche Diagnostics). Each reaction contained 10 μl of LightCycler 480 Probes Master Mix (Roche), 10 ng of bisulfite converted DNA sample or standard, 1 μM of each primer, and 150 nM of each probe, with a final reaction value of 20 μl. It was. The probes used for amplification were TSDR-forward 5'-GGTTTGTATTTGGGTTTTGTTTTATAGT-3 '(SEQ ID NO: 3) and TSDR-reverse 5'-CATAAAATAAAATATCTCACCCTCTTCCTTCCTCT-3' (SEQ ID NO: 4). The probe for detecting the target sequence was a FAM-labeled methylated probe, FAM-CGGTCGGATGCGTC-MGB-NFQ (SEQ ID NO: 5), or a VIC-labeled unmethylated probe, VIC-TGGTGGTTGGATGTGTTG-MGB-NFQ (SEQ ID NO: 6). . All samples were tested in triplicate. The protocol for real-time amplification is as follows: After initial denaturation at 95 ° C for 10 minutes, the samples were subjected to 50 cycles of 95 ° C for 15 seconds and 61 ° C for 1 minute. Fourteen different ratios of fully methylated and demethylated templates were used as real time standards. A 6th order polynomial was used to estimate the percentage of cells demethylated with TSDR for each sample.
ヒストンアセチル化の測定:FOXP3遺伝子の4つの異なる部位のヒストンアセチル化分析を、以前にLing Lu(Ling Lu et al, PNAS 2014)により記載されているように、ChIPアッセイにより評価した。簡単には、各々の処理nTreg細胞サンプルの50,000個の細胞を収集し、1%ホルムアルデヒドで架橋し、次に120μLの溶解緩衝液[50mM Tris・HCl、pH8.0、10mM EDTA、1%(wt/vol)SDS、プロテアーゼ阻害剤混合物(1:100希釈;Sigma)、1mM PMSF、20mM酪酸Na]を用いて溶解した。溶解物中のクロマチンを500〜800bpのフラグメントに超音波処理し、次に800μLのRIPA ChIP緩衝液[10mM Tris・HCl、pH 7.5、140mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM EGTA、1%(vol/1)Triton X−100、0.1%(wt/vol)SDS、0.1%(wt/vol)Na−デオキシコール酸、プロテアーゼ阻害剤混合物(1:100希釈;Sigma)、1mM PMSF、及び20mM酪酸Na]を用いて希釈した。DynabeadsプロテインG(10μL;Invitrogen)を1μgのH3K4me3(Abcam)もしくはH3K9ac(Cell Signaling)又は正常ウサギIgG陰性対照ChIPグレード抗体と別々に2時間にわたりインキュベートした。次に、100μLの剪断されたクロマチンを、全インプットDNA抽出のために、前処理された抗体−ビーズ複合体及び別の100μLの断片化されたクロマチンと別々に免疫沈降させた。免疫沈降したDNAを、以下のプライマーを用いたリアルタイムPCRにより定量化した:プロモーター、5’−ACC GTA CAG CGT GGT TTT TC−3’(配列番号7)及び5’−CTA CCT CCC TGC CAT CTC CT−3’( 配列番号8);CNS1、5’−CCC AAG CCC TAT GTG TGATT−3’(配列番号9)及び5’−GTG TGT CAG GCC TTG TGC TA−3’(配列番号10);CNS2、5’−GTC CTC TCC ACAACC CAA GA−3’(配列番号11)及び5’−GAC ACC ACG GAG GAA GAG AA−3’(配列番号12);CNS3、5’−AGG TGC CGA CCT TTA CTG TG−3’(配列番号13)及び5’−ACA ATA CGG CCT CCT CCT CT−3’(配列番号14)。 Measurement of histone acetylation: Histone acetylation analysis of four different sites of the FOXP3 gene was evaluated by the ChIP assay as previously described by Ling Lu (Ling Lu et al, PNAS 2014). Briefly, 50,000 cells of each treated nTreg cell sample were collected and cross-linked with 1% formaldehyde, then 120 μL lysis buffer [50 mM Tris.HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% (Wt / vol) SDS, protease inhibitor mixture (1: 100 dilution; Sigma), 1 mM PMSF, 20 mM Na butyrate]. The chromatin in the lysate was sonicated to a 500-800 bp fragment and then 800 μL of RIPA ChIP buffer [10 mM Tris.HCl, pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 1% ( vol / 1) Triton X-100, 0.1% (wt / vol) SDS, 0.1% (wt / vol) Na-deoxycholic acid, protease inhibitor mixture (1: 100 dilution; Sigma), 1 mM PMSF And 20 mM Na butyrate]. Dynabeads Protein G (10 μL; Invitrogen) was incubated separately for 2 hours with 1 μg H3K4me3 (Abcam) or H3K9ac (Cell Signaling) or normal rabbit IgG negative control ChIP grade antibody. Next, 100 μL of sheared chromatin was immunoprecipitated separately from the pretreated antibody-bead complex and another 100 μL of fragmented chromatin for total input DNA extraction. The immunoprecipitated DNA was quantified by real-time PCR using the following primers: promoter, 5′-ACC GTA CAG CGT GGT TTT TC-3 ′ (SEQ ID NO: 7) and 5′-CTA CCT CCC TGC CATC CCT CT 3 '(SEQ ID NO: 8); CNS1, 5'-CCC AAG CCC TAT GTG TGATT-3' (SEQ ID NO: 9) and 5'-GTG TGT CAG GCC TTG TGC TA-3 '(SEQ ID NO: 10); CNS2, 5′-GTC CTC TCC ACAACC CAA GA-3 ′ (SEQ ID NO: 11) and 5′-GAC ACC ACG GAG GAA GAG AA-3 ′ (SEQ ID NO: 12); CNS3, 5′-AGG TGC CGA CCT TTA CTG TG- 3 ′ (SEQ ID NO: 13 ) And 5'-ACA ATA CGG CCT CCT CCT CT-3 '(SEQ ID NO: 14).
結果 result
a)エクスビボのヒト誘導性腫瘍抗原特異的CD4+TCRγδ非制限T細胞におけるFoxp3+発現の誘導。 a) Induction of Foxp3 + expression in ex vivo human-induced tumor antigen-specific CD4 + TCRγδ non-restricted T cells.
最適条件を、前に記載したように、腫瘍抗原特異的Foxp3+発現CD4+TCRγδ非制限T細胞を誘導するために設定する。図2は、IL−2ならびにTGFβ、PGE2、及びラパマイシンで構成されるnTreg極性化培地の存在におけるアポトーシス性腫瘍抗原パルスされた免疫寛容原性DC(「腫瘍Ag負荷tDC」)が、抗原特異的な刺激ナイーブ従来型CD4+T細胞(「ナイーブTreg」)において高レベルのFoxp3+発現を誘導することができ(図2A中の頻度及び図2B中のMFI)、非パルスtDC(「無負荷tDC」)は、同じ極性化培地の存在において、ナイーブ従来型CD4+T細胞においてFoxp3+発現を誘導することができないことを示す。 Optimal conditions are set up to induce tumor antigen-specific Foxp3 + expressing CD4 + TCRγδ non-restricted T cells, as previously described. FIG. 2 shows that apoptotic tumor antigen pulsed immunotolerogenic DC (“Tumor Ag-loaded tDC”) in the presence of IL-2 and nTreg polarized medium composed of TGFβ, PGE2, and rapamycin is antigen specific. High levels of Foxp3 + expression can be induced in non-stimulated naïve conventional CD4 + T cells (“naive Treg”) (frequency in FIG. 2A and MFI in FIG. 2B), unpulsed tDC (“unloaded tDC ")" Indicates that Foxp3 + expression cannot be induced in naive conventional CD4 + T cells in the presence of the same polarized medium.
b)ヒト乳癌におけるFoxp3を発現する病原性CD4+γδT細胞の特異的な動員。 b) Specific mobilization of pathogenic CD4 + γδ T cells expressing Foxp3 in human breast cancer.
CD4及びFoxp3の発現を示す新規γδT細胞のサブセットが、乳癌(BC)生検から単離されたTILにおいて同定されている。実際に、Foxp3を発現するγδT細胞は正常個体からのPBMCにおいては稀であるが(<1%)、それらは、図3に示すように、BC生検から精製されたTILにおいて強く濃縮されている(約10倍)。 A novel subset of γδ T cells showing expression of CD4 and Foxp3 has been identified in TIL isolated from breast cancer (BC) biopsies. Indeed, although γδ T cells expressing Foxp3 are rare in PBMCs from normal individuals (<1%), they are strongly enriched in TIL purified from BC biopsies as shown in FIG. Yes (about 10 times).
一般的にヒトγδT細胞は、それらのTCRδ鎖の用途に従って2つの主要な構造サブセット:Vδ1及びVδ2T細胞(Vδ1は優勢な組織内在細胞であるのに対し、Vδ2は末梢血における主要なサブセットである)に分けられるため、本発明者らは、この新たなCD4+Foxp3+γδTサブセットにおけるTCR Vδ鎖をフローサイトメトリーにより検討してきた。図4は、Foxp3を発現する病原性CD4+γδT細胞の大半(>85%)が、Vδ1negVδ2negであることを示す。 In general, human γδ T cells are divided into two major structural subsets according to their TCRδ chain usage: Vδ1 and Vδ2 T cells (Vδ1 is the dominant tissue resident cell, whereas Vδ2 is the major subset in peripheral blood. The present inventors have examined the TCR Vδ chain in this new CD4 + Foxp3 + γδT subset by flow cytometry. FIG. 4 shows that the majority (> 85%) of pathogenic CD4 + γδT cells expressing Foxp3 are Vδ1 neg Vδ2 neg.
本発明者らは次に、BC生検から単離されたFoxp3発現CD3+CD4+γδT細胞非制限T細胞の機能抑制能力を評価した。図5は、新鮮なTregと同様に、Foxp3+を発現するこれらのCD4+γδT細胞が、標準的なポリクローナル細胞−細胞接触Treg抑制アッセイを使用した場合に抑制活性を呈することを示す。 We next evaluated the ability of Foxp3-expressing CD3 + CD4 + γδ T cells unrestricted T cells isolated from BC biopsies to suppress function. FIG. 5 shows that, like fresh Tregs, these CD4 + γδ T cells expressing Foxp3 + exhibit inhibitory activity when using a standard polyclonal cell-cell contact Treg inhibition assay.
c)腫瘍抗原特異的FOXP3発現CD4+TCRγδ非制限T細胞に対する自己CD8媒介性T細胞応答の誘導。 c) Induction of autologous CD8-mediated T cell response to tumor antigen-specific FOXP3-expressing CD4 + TCRγδ unrestricted T cells.
培養系を確立し、それにおいて、自己CD3+ナイーブT細胞と共培養したアポトーシス性病原性CD4+T細胞を負荷した炎症性DC(inf DC)によって、樹状細胞を負荷するために使用した病原性CD4+T細胞に対するCD8+T細胞株の生成を誘導することができる。図6は、それぞれ−inf DC(「mDC」)又は−TAP阻害DCを負荷したアポトーシス性病原性CD4+T細胞を用いて誘導された2つのCD8+クローンによって、それらの特異的標的、それらの誘導性病原性CD4+T細胞クローンを溶解できることを示す。しかし、両方のCD8+クローンを自己EBV細胞株に対して試験する場合、それらはこの標的を溶解することはできない(図6)。 Pathogen used to load dendritic cells by establishing a culture system in which inflammatory DC loaded with apoptotic pathogenic CD4 + T cells co-cultured with autologous CD3 + naive T cells (inf DC) Generation of a CD8 + T cell line against sex CD4 + T cells can be induced. FIG. 6 shows their specific targets, their two targets by two CD8 + clones induced with apoptotic pathogenic CD4 + T cells loaded with -inf DC ("mDC") or -TAP-inhibited DC, respectively. FIG. 5 shows that inducible pathogenic CD4 + T cell clones can be lysed. However, when both CD8 + clones are tested against the autologous EBV cell line, they cannot lyse this target (FIG. 6).
d)内腔B乳癌から分離された腫瘍浸潤リンパ球(TIL)におけるFoxp3+発現T細胞の存在。 d) Presence of Foxp3 + expressing T cells in tumor infiltrating lymphocytes (TIL) isolated from lumen B breast cancer.
内腔A及びBサブタイプは両方ともエストロゲン受容体陽性(ER+)及び低悪性度であり、内腔A腫瘍は非常にゆっくり成長し、内腔B腫瘍はより急速に成長する。内腔A腫瘍は最良の予後を有する。内腔B腫瘍は不良な臨床転帰と関連付けられる。本発明者らは、両方の内腔サブタイプの乳癌から単離されたTIL中のリンパ球の表現型をフローサイトメトリーにより検証し、CD3+CD4+TCRαβ+MHCII制限及びCD3+CD4+TCRγδ+非制限T細胞におけるFoxp3発現の存在を見出した。Foxp3は内腔A乳房腫瘍から抽出されたTILにおいて検出されなかった(図7)。さらに、正の相関が、CD3+CD4+TCRγδ+非制限T細胞における高いパーセンテージのFoxp3発現と乳癌における不良な臨床転帰の間で観察される(図8)。 Lumen A and B subtypes are both estrogen receptor positive (ER +) and low grade, lumen A tumors grow very slowly, and lumen B tumors grow more rapidly. Lumen A tumors have the best prognosis. Lumen B tumors are associated with poor clinical outcomes. The present inventors, the phenotype of lymphocytes in TIL isolated from both lumens subtypes of breast cancer was verified by flow cytometry, CD3 + CD4 + TCRαβ + MHCII restriction and CD3 + CD4 + TCRγδ + The presence of Foxp3 expression in non-restricted T cells was found. Foxp3 was not detected in TIL extracted from luminal A breast tumors (FIG. 7). Furthermore, a positive correlation is observed between a high percentage of Foxp3 expression in CD3 + CD4 + TCRγδ + non-restricted T cells and poor clinical outcome in breast cancer (FIG. 8).
Foxp3発現CD3+CD4+TCRαβ+MHCII制限T細胞及びFoxp3発現CD3+TCRαβ+非制限T細胞はそれぞれ、試験サンプル中のCD3+TCRαβ+T細胞の約20%及びCD3+TCRγδ+の23%に相当する。Foxp3発現CD3+TCRγδ+T細胞は、Foxp3+CD3+TCRαβ+T細胞と同じ表現型プロファイルを提示する。これらのFoxp3+TCRγδ+T細胞集団は、Foxp3+CD3+TCRαβ+T細胞のレベルと同様のレベルのFoxp3、CD25、及びCTLA4を発現する(図9)。 Foxp3 expression CD3 + CD4 + TCRαβ + MHCII-restricted T cells and Foxp3 expression CD3 + TCRαβ + unrestricted T cells, respectively, equivalent to approximately 20% and CD3 + TCRγδ + 23% of the CD3 + TCRαβ + T cells in the test sample To do. Foxp3 expression CD3 + TCRγδ + T cells, present the same phenotype profile and Foxp3 + CD3 + TCRαβ + T cells. These Foxp3 + TCRγδ + T cell population, Foxp3 + CD3 + TCRαβ + T cell levels and similar levels Foxp3, CD25, and express CTLA4 (Figure 9).
d)排他的に調節活性を発揮するようにコミットされた、Foxp3を発現する特異的CD3+TCRγδ+のエクスビボでの生成及び増殖。 d) Ex vivo production and expansion of specific CD3 + TCRγδ + expressing Foxp3 committed exclusively to exert regulatory activity.
抗原特異的Tregの抑制能力が、ポリクローナルTregのそれよりもはるかに大きいことが試験によって示唆されたため、本発明者らは、いずれの刺激の培養条件であっても、排他的に調節活性を発揮するようにコミットされた、エクスビボで生成及び増殖された抗原特異的Foxp3発現CD3+TCRγδ+非制限T細胞に対する方法を設定した。 Tests have shown that the ability of antigen-specific Tregs to suppress is much greater than that of polyclonal Tregs, and so we have exclusively regulated activity under any stimulus culture conditions. A method was set up for antigen-specific Foxp3 expressing CD3 + TCRγδ + non-restricted T cells committed and ex vivo.
図10は、IL−15、IL−2、TGFβ、PGE2、及びラパマイシンの組み合わせを含むnTreg極性化培地の存在において、ゾレドロン酸処理自己tDCで刺激されたナイーブCD3+TCRγδ+T細胞(CD3+CD45RA+CD27+TCRγδ+T細胞)が、21日間の増殖後にFoxp3を発現し、標準的なポリクローナル細胞−細胞接触Treg抑制アッセイにより評価されるように、有意な機能的抑制活性を示すことを示す。興味深いことに、21日間増殖させたFOXP3発現CD3+TCRγδ+T細胞は、nTreg極性化培地中でのさらに21日間の培養後、それらのFoxp3レベル及びそれらの抑制活性を維持している。 FIG. 10 shows naive CD3 + TCRγδ + T cells (CD3 + CD45RA) stimulated with zoledronic acid-treated auto-tDC in the presence of nTreg polarized medium containing a combination of IL-15, IL-2, TGFβ, PGE2, and rapamycin. (+ CD27 + TCRγδ + T cells) express Foxp3 after 21 days of growth and show significant functional inhibitory activity as assessed by standard polyclonal cell-cell contact Treg inhibition assay. Interestingly, FOXP3-expressing CD3 + TCRγδ + T cells grown for 21 days maintain their Foxp3 levels and their suppressive activity after an additional 21 days of culture in nTreg polarization medium.
Claims (18)
γδT細胞活性化剤及び以下の薬剤:i)cAMP(環状アデノシン一リン酸)活性化剤、ii)TGFβ(形質転換成長因子ベータ)経路活性化剤、iii)mTOR 阻害剤、場合によりiv)IL−2、IL−7、IL−15、及びTSLPの群において選択される少なくとも1つのサイトカイン、ならびに場合によりv)少なくとも1つのTET酵素活性化剤及び/又は少なくとも1つのDNMT阻害剤の存在においてCD3+TCRγδ+T細胞を、少なくとも5日間培養すること。 A method for ex vivo generation of γδFoxp3 + regulatory T cells having the following phenotype: CD3 + TCRγδ + Foxp3 + , comprising: γδT cell activator and the following agents: i) cAMP (cyclic) Adenosine monophosphate) activator, ii) TGFβ (transforming growth factor beta) pathway activator, iii) mTOR inhibitor, optionally iv) group of IL-2, IL-7, IL-15, and TSLP Culturing CD3 + TCRγδ + T cells for at least 5 days in the presence of at least one cytokine selected in and optionally v) at least one TET enzyme activator and / or at least one DNMT inhibitor.
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