JP2019521709A - 微細藻類を含む組成物及びこの組成物を製造し使用する方法 - Google Patents

微細藻類を含む組成物及びこの組成物を製造し使用する方法 Download PDF

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Abstract

偏性光独立栄養微細藻類及び浮遊要素を含む浮遊性組成物が提供される。また、少なくとも２つの区画を含む区画化済み組成物であって、少なくとも２つの区画のうち第１区画が偏性光独立栄養微細藻類を含み、少なくとも２つの区画のうち第２区画が偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類を含み、これらの区画が、偏性光独立栄養微細藻類と偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類との間の共生を確実にする構造及び／又は組成から設計される、区画化済み組成物も提供される。

Description

本発明は、その幾つかの実施形態において、微細藻類を含む組成物、及びこの組成物を製造し使用する方法に関する。
藻類とは、単細胞の属、例えばクロレラ（Chlorella）及び珪藻から多細胞型までを包含する多種多様な群の光合成生物を参照する。大部分は、水生かつ独立栄養性であり、例えば、気孔、木部、及び篩部のような明確な細胞及び組織の種類のうちの多くを欠く。気孔、木部、及び篩部は、陸上植物に見られるものである。
藻類は、何世紀にもわたって食品、飼料、及び肥料として使用されてきた。藻類は１９５０年代には世界人口の増加に対するタンパク質供給のための候補と見做された。藻類は、あらゆる種類の水中で迅速かつ多量に成長するのであり、再生可能燃料、動物の飼料、化粧品、肥料、薬物送達、機能性食品、浄水、バイオプラスチック、滑沢剤、並びに、健康に有益な化合物、例えば抗酸化物質、オメガ３オイル、炭水化物、糖タンパク質等を包含する、ヒト及び動物の食品に使用することのできる高レベルの様々な化合物を含有する。
微細藻類は、活性化合物の供給源であり、例えば、ドナリエラ・サリナ（Dunaliella salina）からのβカロチン、ヘマトコッカス藻（Haematococcus pluvialis）からのアスタキサンチン、カンタキサンチン、ルテイン、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）からのカンタキサンチン、アスタキサンチン、コエラストレラ・ストリオラータ変種ムルチストリアータ（Coelastrella striolata var. multistriata）からのカンタキサンチン、アスタキサンチン、βカロチン、セネデスムス・アルメリエンシス（Scenedesmus almeriensis）からのルテイン、βカロチン、クリプテコニディウム（Cryptheconidium）からのＤＨＡ、ＥＰＡオドンテラ（Odontella）、スピルリナ（Spirulina）からのビタミンＢ１２等がある。
微細藻類又は単細胞藻類は幅広い機能を果たす。例えば、藻類の成長、有機物の分解、抗菌水からの保護、重金属の解毒、及び環境回復の一環としての酸化防止である。
例えば、２０を超える異なるビタミン、アミノ酸、及びミネラルが豊富なことが知られている微細藻類、例えばクロレラ、ドナリエラ、及びスピルリナは、ベータカロチン及びクロロフィル、並びに成長因子に富んでいる。クロレラは、高質のタンパク質（全質量の５０〜６０％）、炭水化物（１５〜２０％）、脂肪（１０〜１５％）、ミネラル（６％）が豊富であり、４％が水分である。更に、クロレラは、ビタミンＢ１２、及び、組織修復を刺激し子供及び動物の成長を促進することが証明された成長因子をも含有する。クロレラは、免疫系を刺激することも報告されてきたのであり、抗酸化及び抗腫瘍活性を見せ、老化防止特性を呈するが、この他にもある。ドナリエラ藻類は、タンパク質、脂質、糖類、及びミネラル、並びにビタミン、そして様々な生理活性成分、特にβカロチンを含有する。微細藻類、例えばドナリエラの乾燥粉末は、他の材料と共に粒状にされ、商業的に利用可能な硬カプセルにカプセル化される。
ところが、クロレラ、ドナリエラ、又はスピルリナを包含する様々な微細藻類を、錠剤、粒剤、又は流エキス剤のいずれかへと準備し維持することにより、生理活性成分のほとんどが破壊され、従ってそれらの有益な効果が低下することがある。
最大かつ最適なレベルの受益微細藻類製品を維持するには、例えば生育可能なカプセル型微細藻類を製造することにより、生育可能な微細藻類がその天然の形態において利用可能であるべきである。このような製品は、異なる構造の様々な食用ポリマー内で、生育可能な異なる種の藻類を同時培養すること又は区画化することのいずれかにより１つ以上の種を閉じ込めたものを含有する菜食主義者用食糧として、役立てることができる。
飼料、化粧品、並びに、共培養される従属栄養細胞にとっての酸素産生者等の幾つかの目的のためのカプセル型微細藻類が記載されている（非特許文献１〜３）。
カプセル型微細藻類は、微細藻類の成長率を維持すること、並びに、細胞増殖及び微細藻類化合物産生を早めさえすることが証明されている（非特許文献４及び５）。このような可能性は、食品産業並びにその他の任意の藻類主体の産業システムにおいて決定的に有利である。
更に、特許文献１及び２も背景技術に含まれる。
U.S. Pat. No. 9,090,885 U.S. Pat. No. 8,012,500
Bloch K, Papismedov E, Yavriyants K, Vorobeychik M, Beer S, Vardi P. Photosynthetic oxygen generator for bioartificial pancreas. Tissue Eng. 2006 Feb;12(2):337-44 Kitcha S, Cheirsilp B. Enhanced lipid production by co-cultivation and co-encapsulation of oleaginous yeast Trichosporonoides spathulata with microalgae in alginate gel beads. Appl Biochem Biotechnol. 2014 May;173(2):522-34. doi:10.1007/s12010-014-0859-5 de-Bashan LE, Bashan Y. Joint immobilization of plant growth-promoting bacteria and green microalgae in alginate beads as an experimental model for studying plant-bacterium interactions. Appl Environ Microbiol. 2008 Nov;74(21):6797-802. doi:10.1128/AEM.00518-08 Joo DS, Cho MG, Lee JS, Park JH, Kwak JK, Han YH, Bucholz R. New strategy for the cultivation of microalgae using microencapsulation. J Microencapsul. 2001 Sep-Oct;18(5):567-76 de-Bashan LE, Bashan Y. Immobilized microalgae for removing pollutants: review of practical aspects. Bioresour Technol. 2010 Mar;101(6):1611-27. doi:10.1016/j.biortech.2009.09.043
本発明の幾つかの実施形態の一態様によれば、偏性光独立栄養微細藻類と浮遊要素とを含む浮遊性組成物が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の一態様によれば、提供されるのは少なくとも２つの区画を含む区画化済み組成物であって、前記少なくとも２つの区画のうち第１区画が偏性光独立栄養微細藻類を含み、前記少なくとも２つの区画のうち第２区画が偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類を含み、前記区画が、前記偏性光独立栄養微細藻類と前記偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類との間の共生を確実にする構造及び／又は組成から設計される、組成物である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記少なくとも２つの区画のうち前記第１区画は光に対して透過性であり、前記第２区画は混合栄養微細藻類を含む際に光に対して不透過性である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本明細書に記載する前記組成物は、前記少なくとも２つの区画間での小分子、ミネラル、及びガスの自由拡散を可能にする。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本明細書に記載する前記組成物はカプセルとして調剤される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記カプセルは繊維又は球体として成形される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記カプセル中の前記偏性光独立栄養微細藻類の濃度は１０６〜１０１０細胞／ｃｍ３カプセルである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記カプセル中の前記偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類の濃度は１０６〜１０１０細胞／ｃｍ３カプセルである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記微細藻類は生育可能である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記カプセルは直径が０．１〜２０ｍｍである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記偏性光独立栄養微細藻類は、前記組成物中で少なくとも９０％の純度において存在している。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記偏性光独立栄養微細藻類は、前記第１区画内で少なくとも９０％の純度において存在し、前記偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類は前記第２区画内で少なくとも９０％の純度において存在している。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記組成物は前記組成物を浮遊性にする浮遊要素を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本明細書に記載する前記組成物は、生物体により摂取可能である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記生物体は人間である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記生物体は非ヒト動物である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本明細書に記載する前記組成物は食用である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記第１区画は前記第２区画をカプセル化する。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記偏性光独立栄養微細藻類は、ドナリエラの種、ナンノクロロプシスの種（Nannochloropsis sp.）、シネココッカスの種（Synechococcus sp.）、及びスピルリナの種から成る群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記従属栄養微細藻類又は前記混合栄養微細藻類は、前記偏性光独立栄養微細藻類の成長率よりも速い成長率を特徴とする。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記偏性従属栄養微細藻類は、シゾキトリウムの種（Schizochytrium sp.）及びクリプテコディニウムの種（Crypthecodinium sp.）から成る群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記混合栄養微細藻類は、クロレラの種及びクラミドモナスの種（Chlamydomonas sp.）から成る群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記混合栄養微細藻類はクロレラの種の群からのものであり、前記偏性光独立栄養微細藻類はスピルリナの種の群からのものである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記微細藻類は遺伝子改変される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記第２区画は、濁度に影響を及ぼす添加剤を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記添加剤は、顔料、着色料、染料、及びタンパク質から成る群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記偏性光独立栄養微細藻類はポリマー材料によりカプセル化される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記第１区画及び前記第２区画はポリマー材料から構成される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記ポリマー材料は光透過性である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記ポリマー材料は、アルギン酸塩、アガロース、ゼラチン、及びキトサンから成る群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態の一態様によれば、提供されるのは、栄養組成物を製造する方法であって、
（ａ）偏性独立栄養微細藻類及び任意で偏性従属栄養微細藻類を、浮遊性要素を含む組成物へと調剤するステップであって、前記微細藻類の生育可能性を持続する条件下に行われるステップと、
（ｂ）前記組成物中で前記微細藻類を培養し、これによって前記栄養組成物を製造するステップと
を含む方法である。
本発明の幾つかの実施形態の一態様によれば、提供されるのは、栄養組成物を製造する方法であって、
（ａ）少なくとも２つの区画を含む区画化済み組成物を製造するステップであって、前記少なくとも２つの区画のうち第１区画が偏性光独立栄養微細藻類を含み、前記少なくとも２つの区画のうち第２区画が偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類を含み、前記区画が、前記偏性光独立栄養微細藻類と前記偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類との間の共生を確実にする構造及び／又は組成から設計される、ステップと、
（ｂ）粒子内で前記微細藻類を培養し、これによって前記栄養組成物を製造するステップと
を含む方法である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記少なくとも２つの区画のうち前記第１区画は光に対して透過性であり、前記第２区画は、混合栄養微細藻類を含む際に光に対して不透過性である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記区画化済み組成物は、前記少なくとも２つの区画間での小分子、ミネラル、及びガスの自由拡散を可能にする。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記組成物はカプセルとして調剤される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記カプセルは繊維又は球体として成形される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記カプセル中の前記偏性光独立栄養微細藻類の濃度は１０６〜１０１０細胞／ｃｍ３カプセルである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記微細藻類は前記組成物中で生育可能である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記カプセルの直径が０．１〜２０ｍｍである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記偏性光独立栄養微細藻類は、前記組成物中で少なくとも９０％の純度において存在している。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記偏性光独立栄養微細藻類は、前記第１区画内で少なくとも９０％の純度において存在し、前記偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類は前記第２区画内で少なくとも９０％の純度において存在している。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記組成物は、前記組成物を浮遊性にする浮遊要素を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記組成物は生物体により摂取可能である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記組成物は食用である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記第１区画は前記第２区画をカプセル化する。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記第１区画は第１ポリマーから構成され、前記第２区画は第２ポリマーから構成され、前記製造のステップは、前記第１ポリマー及び前記偏性光独立栄養微細藻類を含む第１ポリマー溶液と、前記第２ポリマー及び前記偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類を含む第２ポリマー溶液とをポリマー化溶液へと滴下又は電界紡糸することにより行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記第１ポリマー溶液及び前記第２ポリマー溶液の滴下又は電界紡糸は、同軸ノズル又は非同軸ノズルからのものである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記方法は、前記培養のステップに続いて前記微細藻類を単離するステップを更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記培養のステップは屋外を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記培養のステップは室内を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記培養のステップは開放状況を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記培養のステップは閉鎖状況を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記方法は、前記微細藻類の生育可能性を持続する条件下に前記微細藻類を１か月間、例えば３か月〜１２か月間、保存するステップを更に含む。
特に規定しない限り、本明細書において使用する全ての技術用語及び／又は科学用語は、本発明が関係する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。実務において又は本発明の実施形態のテストにおいて、本明細書に記載するものと同様の又は等価の方法及び材料を使用することができるが、以下では、例示的な方法及び／又は材料を記載する。矛盾がある場合は、定義を包含する特許明細書が優先するものとする。更に、前記材料、方法、及び実施例は、例証するだけのものであり、必ずしも限定を意図するものではない。
本明細書に、本発明の幾つかの実施形態を、ほんの例として添付の画像を参照して記載する。ここで図面を具体的に詳細に参照するにあたって図示する事項は、例としてのものであり、本発明を例証的に検討する目的のためのものであることを強調しておく。この点について、図面を用いて記載することにより、本発明の実施形態を実践できるやり方が当業者にとって明らかになる。
本発明の幾つかの実施形態による区画化済み組成物の略図。 偏性光独立栄養微細藻類（スピルリナ）用の透過性周辺区画と、混合栄養／従属栄養微細藻類（クロレラ）用の不透過性中央区画とから構成されるカプセルの写真。 スピルリナ細胞とクロレラ細胞とから構成されるアルギン酸塩ビーズ（３Ａ）、並びに、スピルリナ細胞単独から構成されるアルギン酸塩ビーズ（３Ｂ）を示す、暗所にて室温で約１か月置いた後の画像。
本発明は、その幾つかの実施形態において、微細藻類を含む組成物及びこの組成物を製造し使用する方法に関する。
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明がその用途において、以下の記載において述べる又は実施例により例示する詳細に必ずしも限定されるものでないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施形態も可能であり又は様々な仕方で実践又は実行することができる。
微細藻類は、ヒト及び動物の栄養におけるタンパク質、ミネラル、ビタミン、及び抗酸化物質の重要な供給源である。微細藻類の商業的培養において直面する多くの課題の中で、水及び栄養分の利用可能性を低コストにすることは非常に重要である。
本発明者らは、本発明を実践しつつ、微細藻類を共培養するための新規の手法を考案したのであり、この手法により、高栄養価である複合体組成物を低コストにて、微細藻類の種の１つを失う危険を冒さずに得ることができる。この手法は、共培養される微細藻類の種間で二酸化炭素及び酸素の効率的な移動を可能にする共培養藻類間の相互共生に起因した、生きている高質の藻類バイオマスの製造を向上させるカプセル型微細藻類の区画化、共培養される藻類の種の１つの選択的排除の防止、及び、多様な望ましい微細藻類由来製品の同じ製品（例えばカプセル、図１を参照のこと）中での製造、に依拠する。
従って本発明の態様によれば、少なくとも２つの区画を含む区画化済み組成物であって、少なくとも２つの区画のうち第１区画が偏性光独立栄養微細藻類を含み、少なくとも２つの区画のうち第２区画が偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類を含み、少なくとも２つの区画が、偏性光独立栄養微細藻類と偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類との間の共生を確実にする構造及び／又は組成から設計される、区画化済み組成物が提供される。
本発明の別の態様によれば、偏性光独立栄養微細藻類と浮遊要素とを含む浮遊性組成物が提供される。
組成物は、区画化又は非区画化することができる。
本明細書において使用する「微細藻類」とは、通常は淡水系及び海洋系において見られる、海中及び堆積物中の両方において生きている微細な藻類を参照する。微細藻類は、個別に、鎖状に、又は群をなして存在する単細胞の種である。
本明細書において使用する「偏性光独立栄養微細藻類」又は「偏性光栄養微細藻類」とは、化学エネルギー産生用の光エネルギーを必要とするが、外来栄養で供給された実施済み有機分子を、その唯一の炭素源又はエネルギー源として使用することができない微細藻類の種のことである。
本明細書において使用する「従属栄養生物」とは、光が不在の場合に、事前に形成された有機化合物を炭素源及びエネルギー源として使用することのできる微細藻類の種のことである。従って、従属栄養生物は照明と無関係に成長することができる。例えば、従属栄養生物は、暗闇で、光の中で、及び部分光の中で成長することができる。同様に、「従属栄養成長」とは、光の発生を必要としない成長、従って、照明のレベル又は欠如と無関係に発生し得る成長を参照する。
従属栄養生物は、偏性従属栄養微細藻類又は混合栄養微細藻類とすることができる。
本明細書において使用する「偏性従属栄養微細藻類」とは、事前に形成された有機化合物を使用する微細藻類の種を参照するのであり、炭素源及びエネルギー源として光を使用するもののことではない。従って、偏性従属栄養生物は照明と無関係に成長する。例えば、従属栄養生物は、暗闇で、光の中で、及び部分光の中で成長することができる。同様に、「従属栄養成長」とは、光の発生を必要としない成長、従って、照明のレベル又は欠如と無関係に発生し得る成長を参照する。
本明細書において使用する「混合栄養微細藻類」とは、異なるエネルギー源と炭素源とが混合したもの、例えば光栄養生物と化学栄養生物とを使用することのできる微細藻類の種を参照する。
特定の実施形態によれば、従属栄養微細藻類又は混合栄養微細藻類は、各々の種にとって最適な成長条件下に、成長率が偏性光独立栄養微細藻類の成長率よりも速いことを特徴とする（Yu-Ru Li, Wen-Tien Tsai, Yi-Chyun Hsu, Meng-Zhi Xie, Jen-Jeng Chen. Comparison of autotrophic and mixotrophic cultivation of green microalgal for biodiesel production. Energy Procedia, 2014, 52, 371 - 376、Perez-Garcia O, Escalante F.M.E, de-Bashan L.E, Bashan Y. Heterotrophic cultures of microalgae: Metabolism and potential products. Water research, 2011, 45, 11-3 6）。
藻類分子生物学の進歩により、独立栄養生物を従属栄養生物に遺伝子改変することが可能になった。これらの改変を実施する方法がU.S. Pat. No. 7939710に記載される。これによって、この文献を全体として参照により援用する。
本教示は、全体として未処理の又は遺伝子改変された微細藻類に関する。
実施形態によれば、偏性独立栄養微細藻類、偏性従属栄養微細藻類又は混合栄養微細藻類のうちの少なくとも１つが遺伝子改変される。
遺伝子改変は、微細藻類の培養（例えば、生育、非生物的／生物的ストレスに対する耐性、バイオマス）を改良するために行うことができる。
別法として又は追加として、遺伝子改変は、製品の品質（例えば、栄養価、治療価値、エネルギー値、消化率）を改良するために行うことができる。
Droopによるレビューに、偏性光独立栄養微細藻類のリストを見ることができる（Droop M R "Heterotrophy of Carbon." In Algal Physiology and Biochemistry, Botanical Monographs, 10: 530-559, ed. Stewart W D P, University of California Press, Berkeley (1974)）。そして、潜在的な又は既知の商業的価値をもつ偏性光独立栄養微細藻類の代表的な非排他的リストを、門レベルで分類して以下に提供する（表１）。「一般名」が括弧内にある。
表１
Figure 2019521709
特定の実施形態によれば、偏性光栄養微細藻類は、ドナリエラの種、ナンノクロロプシスの種、シネココッカスの種、及びスピルリナの種から成る群から選択される。
偏性従属栄養微細藻類の非限定的な例が、シゾキトリウムの種及びクリプテコディニウムの種から成る群から選択される。
混合栄養微細藻類の非限定的な例が、クロレラの種及びクラミドモナスの種から成る群から選択される。
（区画化済み組成物の場合）共培養要件の順守に応じて、組成物が、偏性従属栄養微細藻類、混合栄養微細藻類、及び偏性光栄養微細藻類の各々から複数の種を含むことができることが認識されるであろう。
特定の実施形態によれば、偏性光栄養微細藻類はスピルリナの種であり、混合栄養微細藻類はクロレラの種である。
本明細書において使用する、この事例における「共生」とは、偏性独立栄養生物が偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類に酸素を提供する一方、偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類が偏性独立栄養生物に二酸化炭素を提供する相利共生を参照する。
本明細書において使用する「区画化済み組成物」とは、少なくとも２つ以上の区画を含む組成物を参照する。
区画とは、個別の区切り又は区分を参照するのであり、様々な形態、幾何学形状、及び形状をとることができる。例えば、区画は、ウェル、チャンバ、チャネル、小滴、ビーズ、プラグ等とすることができる。
特定の実施形態によれば、少なくとも２つの区画のうち第１区画は光に対して透過性であり、第２区画は混合栄養微細藻類を含む際に光に対して不透過性であり、第２区画の光合成に対する依存性は低減する。
別法として又は追加として、第１区画は、第２区画への光浸透を防止する膜又は殻である一方、前記第２区画が核であるように、第２区画をカプセル化する。
別法として又は追加として、少なくとも２つの区画のうち第１区画は光に対して透過性であり、第２区画は、混合栄養微細藻類を含む際に光に対して不透過性であり、これらの区画は、（共生を可能にしつつ）ミネラル及び又はガスの通過を可能にするよう、互いに並置して配向されるが、第２区画は依然として光に曝露することができる。
一方、偏性光独立栄養生物による最大限の光合成を及び従属栄養生物による最小限の光合成を確実にするために、組成物は、構造（核及び殻）と組成（例えば透過性の第１区画、及び不透過性の第２区画、及び／又は、濁度に影響を及ぼす添加剤を含む前記第２区画）の両方がこの目的に適うものから設計される。
特定の実施形態によれば、組成物（区画化済みの及び／又は浮遊性の）は、カプセル、粒剤、粒子、気泡、又は小滴として調剤される。
特定の実施形態によれば、組成物は球体として成形される。
特定の実施形態によれば、組成物は楕円形に成形される。
特定の実施形態によれば、組成物は繊維として成形される。
特定の実施形態によれば、各区画は、特定の種類の微細藻類を異なる種類の微生物（例えば、その存在が所望されない細菌、菌類、又は別の種類の微細藻類）と混ざることなく培養できる限られた領域を提供する。
従って区画化済み組成物は、異なる区画間に、ガス、グルコース、及びミネラルの流れを提供するのであり、例えば偏性独立栄養生物から偏性従属栄養生物又は混合栄養生物に酸素を又は偏性従属栄養生物又は混合栄養生物から偏性独立栄養生物に二酸化炭素を提供する。区画化済み組成物は、一方で区画間を細胞が通過できないように設計される。例示的な実施形態を図１に描く。
本発明の幾つかの実施形態の組成物は、異なる区画に住む異なる種類の藻類間の共生を実体化できるように設計される。
特定の実施形態によれば、区画化済み組成物には障壁及び／又はチャネル（各区画を組成する材料の部分品）が全くない。
その他の実施形態において、区画は小分子（例えばグルコース、ＣＯ２、Ｏ２、ミネラル）が依然として自由通過できるようにする障壁の存在により、互いに分離される。ただし細胞は、区画間を自由通過することができない。
従って複数の（２つ以上の）区画が、２つ以上の異なる種の微細藻類（例えば偏性独立栄養生物及び偏性従属栄養生物）の培養空間を、互いとの又は「第三」者（汚染物質、例えば細菌）による任意の交差汚染なしに提供する。本発明の幾つかの実施形態の組成物の限られた培養方法にとって、所定の藻類の種類（例えば株、種）の単一区画における局所成長は重要である。
本発明の実施形態によれば、組成物は偏性光独立栄養微細藻類と浮遊要素とを含む浮遊性組成物を含む。
このような組成物は、区画化することができる。
代わりの実施形態によれば、浮遊性組成物は非区画化される。
本明細書において使用する「浮遊要素」とは、微細藻類（区画化済みの又は非区画化済みの）を含む組成物に微細藻類培地中で浮力を付与する要素を参照する。浮遊要素は、藻類が成長できるよう粒子が依然として覆い隠されるように設計される（例えば同心円状の浮遊要素）。浮遊要素は組成物の一部を形成し、これによって浮遊要素は、細胞固定化に使用されるポリマーと混合することができる。浮遊要素の選択は、微細藻類の培養に使用される培地の種類（例えば淡水、廃水、塩水、海水等）に大きく依存する。というのも、塩濃度が組成物の浮力に影響を及ぼすからである。例えば浮遊要素は、天然の又は人工の食用軽ポリマー、例えば天然又は人工の食用ポリマー、ワックス、気泡、油滴、芳香油等で作られた粒子とすることができる。バイオポリマーから作られている浮遊カプセルの現在の医学的応用を、これらのレビュー、Lopes CM, Bettencourt C, Rossi A, Buttini F, Barata P. Overview on gastroretentive drug delivery systems for improving drug bioavailability. Int J Pharm. 2016 May 9. pii: S0378-5173(16)30386-6. doi:10.1016/j.ijpharm.2016.05.016. [Epub ahead of print] Review、Kaushik AY, Tiwari AK, Gaur A. Role of excipients and polymeric advancements in preparation of floating drug delivery systems. Int J Pharm Investig. 2015 Jan-Mar;5(1):1-12. doi: 10.4103/2230-973X.147219. Reviewに見ることができる。これらのレビューの各々を、全体として参照により援用する。
組成物は、任意の化学組成、寸法、又は構造から設計することができる。
一方、特定の実施形態によれば、組成物は、ヒト又は非ヒト動物により摂取可能であるように設計される。
従って組成物は、意図される用途に応じて、摂取可能であることにとって適切である化学（例えばポリマー）組成物及び／又は大きさから設計される。
本明細書において使用する「摂取可能」とは、食品として生物体、例えば人間により摂られることを参照する。ただし獣医学的用途も考えられる。
従って特定の実施形態によれば、組成物は摂取可能な寸法又は食感である。
特定の実施形態によれば、カプセルは直径が０．１〜２０ｍｍである。例えばヒトの消費用では、組成物（例えばカプセル又は本明細書に記載するその他の製剤）は直径が１〜５ｍｍである。
特定の実施形態によれば、組成物は食用である（例えば人間により食されることに適する）。特定の実施形態によれば、組成物は最終被験者（例えば人間）により消費されるように、規制当局、例えばＦＤＡにより承認される材料から構成される。
特定の実施形態によれば、少なくとも２つの区画のうち第１区画は、光に対して透過性であり、第２区画は、混合栄養微細藻類を含む際に光に対して不透過性である。
本明細書において使用する「光に対して透過性」とは、散乱することなしに可視光の通過を可能にすることである。従って光に対して透過性である区画というのは、透過度レベルを参照し、この透過度レベルは、光が光合成にとって限定要因でないことを確実にする。
本明細書において使用する「光に対して不透過性」は、前記第２区画内の混合栄養微細藻類にとって光が限定要因であることを確実にする。
可視光（４００〜７００ｎｍ）に対して透過性である様々な材料が知られている。これらの材料は、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、及び／又はアガロースを包含するが、これらに限定されるものではない。
可視光に対して不透過性である様々な材料が知られている。これらの材料は、天然の又は合成の顔料、食品着色料、及び活性炭を包含するが、これらに限定されるものではない。
第２区画は、この第２区画に存在している培地の濁度に影響を及ぼす添加剤を添加することにより、可視光に対する透過性を低めにできるということが認識されるであろう。
これらは、顔料、染料、着色料、及びタンパク質を包含するが、これらに限定されるものではない。当技術分野では、多くのこのような光吸収添加剤が知られている（Aberoumand A. A Review Article on Edible Pigments Properties and Sources as Natural Biocolorants in Foodstuff and Food Industry. World Journal of Dairy & Food Sciences, 2011, 6 (1): 71-78、この文献をここに全体として参照により援用する）。このような添加剤の各々は、この区画における微細藻類の成長を妨げないようなものが選択される。
組成物における微細藻類の成長を確実にするために、組成物（浮遊性の及び／又は区画化済みの）は、培地又は培養成分を含む。区画化に使用される材料は全て、微細藻類の成長に必要となる小分子（グルコース、ミネラル、ガス）を通すことができる。
当技術分野では、藻類培養の方法が良く知られている。
本明細書において使用する「培地」とは、微細藻類に生育の媒介となる十分な栄養補助を提供し（発育させずに生育可能性を持続する）又は成長（発育／増殖）さえ提供する、固体、液体、又はゲル培地（ゲル及び固体は培養時に液体になり得る）を参照する。特定の実施形態によれば、培地は、１つの微細藻類の種の成長及び組成物中に存在する別の種の生育（例えば飢餓培地）を促進するよう設計される。別法として、組成物中の全ての微細藻類の種の成長を促進する培地を選択することができる。別法として、２つの種の生育を促進する培地を選択することができる。
使用される培地の選択肢は、幾つかの要因に依存することになる。つまり、微細藻類の成長要件、培地の成分が最終的製品の質にどのように影響を及ぼすか、及び費用である。本発明の幾つかの実施形態によれば、この製品は食品産業用であることから、食品向けの化学物質が使用される。動物の市場では、非飼料向け材料を使用することができるが、一方で、様々な汚染物質、例えば重金属を包含しないよう注意を払うべきである。
異なる種類の微細藻類が培養される際、培地の組成を相違させることができる。培地は、任意で改変することができる（例えば、微細藻類を飢えさせたい場合又は選択圧をかけたい場合は、幾つかの化合物を培地から省略することができる）。
本発明の幾つかの実施形態によれば、第１区画及び第２区画は同一の培地を含む。
本発明の組成物は、生育可能な微細藻類を含む。
従って特定の実施形態によれば、組成物（区画化済みの又は非区画化済みの）中に存在している各集団の藻類のうち少なくとも９０％は、続く３か月間、培養物中で生育可能である。
特定の実施形態によれば、少なくとも６か月間、４〜８℃で培養し保存した後でも、これらの藻類について生育可能性は持続される。
微細藻類の生育可能性を判定する方法は、メチル‐チアゾリル‐テトラゾリウム（ＭＴＴ）、エバンスブルー、及びニュートラルレッドを用いて染色するステップを含む（Da Luz et al. Efficiency of Neutral Red, Evans Blue and MTT to assess viability of the freshwater microalgae Desmodesmus communis and Pediastrum boryanum. Phycological Research, 2016; 64: 56-60 doi: 10.1111/pre.12114、これによって、この文献を全体として参照により援用する）。
最終製品内の微細藻類の生育可能性により、広範囲の新鮮な天然化合物でもって、極度に有益な健康価値が食用製品に提供されることが確実になる。最終的製品は、例えば、独立栄養性及び従属栄養性の科の両方の純粋な又は混合の微細藻類群集のいずれかである、閉じ込められた生育可能な藻類を含有する。微細藻類のこのような最終製品により、独立栄養起源と従属栄養起源の両方の、種々の純粋な又は混合の微細藻類供給源に由来する健康に有益な製品の数が著しく増加する。
組成物中の各集団の純度は変動させることができる。一方、特定の実施形態によれば、偏性光独立栄養微細藻類は、組成物中で、少なくとも９０％、９５％、９７％の純度において、又は１００％の純度においてさえ、存在している。
別の実施形態によれば偏性光独立栄養微細藻類は、第１区画内で少なくとも９０％、９５％、９７％の純度において、又は１００％の純度において存在しているのであり、偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類は、第２区画内で、少なくとも９０％、９５％、９７％の純度において、又は１００％の純度において存在している。
偏性光独立栄養微細藻類が、単一の種又は株の偏性光独立栄養微細藻類を、又は複数の（即ち２つ以上の）種又は株の偏性光独立栄養微細藻類を含むことができることが認識されるであろう。
同じことが、偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類についても当てはまる。
従って、本発明の態様によれば、提供されるのは栄養組成物を製造する方法であって、
（ａ）偏性独立栄養微細藻類及び任意で偏性従属栄養微細藻類を、浮遊性要素を含む組成物へと調剤するステップであって、微細藻類の生育可能性を持続する条件下に行われるステップと、
（ｂ）粒子内で微細藻類を培養し、これによって栄養組成物を製造するステップと
を含む方法である。
代わりの態様によれば、提供されるのは栄養組成物を製造する方法であって、
（ａ）少なくとも２つの区画を含む区画化済み組成物を製造するステップであって、少なくとも２つの区画のうち第１区画が偏性光独立栄養微細藻類を含み、少なくとも２つの区画のうち第２区画が偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類を含み、これらの区画が、偏性光独立栄養微細藻類と偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類との間の共生を確実にする構造及び／又は組成から設計される、ステップと、
（ｂ）粒子内で微細藻類を培養し、これによって栄養組成物を製造するステップと
を含む方法である。
多くの微細藻類株（例えばクロレラ、ドナリエラ、スピルリナ）は、栄養価に加えて解毒特性を表し、食用微細藻類を使用して人体から重金属を除去することができる（Kaplan, D. Absorption and Adsorption of Heavy Metals by Microalgae, in Handbook of Microalgal Culture: Applied Phycology and Biotechnology, 2013, Second Edition (eds A. Richmond and Q. Hu), John Wiley & Sons, Ltd, Oxford, UK. doi: 10.1002/9781118567166.ch32、Bobrov Z., Tracton I., Taunton K., Mathews M. Effectiveness of whole dried Dunaliella salina marine microalgae in the chelating and detoxification of toxic minerals and heavy metals）。故に、本明細書に記載する栄養組成物は、治療又は予防特性をも有する。
組成物に関して本明細書に記載する任意の実施形態又は複数の実施形態の組み合わせが、製作方法にも適用されることが認識されるであろう。
一実施形態によれば、この方法は培養のステップに続いて微細藻類を単離するステップを更に含む。
特定の実施形態によれば、単離のステップは、濾過、遠心分離、磁場、化学凝固／凝集、自動凝集及び生物凝集、重力沈降によるものである（Barros et al. Harvesting techniques applied to microalgae: A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 2015, 41, 1489-1500、この文献をここに全体として参照により援用する）。
区画化の方法を以下に提供する。このような方法を、非区画化済み組成物、例えば非区画化済みカプセルを準備することにも使用することができる。以下に続く実施例の項目において、非区画化済み組成物（ステップ１）及び区画化済み組成物（ステップ２）を準備するための特定の実施形態を提供する。この記載は、試薬に関して、使用される藻類の種を限定しようとすることを目的とするものでは決してないのであり、本明細書の一部と見做される。
従って、例えば、区画化済み組成物は滴下により作ることができる。
これに応じて、第１区画は第１ポリマーから構成され、第２区画は第２ポリマーから構成され、製造のステップは、第１ポリマー及び偏性光独立栄養微細藻類を含む第１ポリマー溶液と、第２ポリマー及び偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類を含む第２ポリマー溶液とをポリマー化溶液へと滴下することにより行われる。
特定の実施形態によれば、前記第１ポリマー溶液及び前記第２ポリマー溶液の滴下は、同軸ノズル又は非同軸ノズルからのものである。
本教示により使用することのできる、（例えば障壁のない、チャネルのない）区画化済み組成物を形成する別の方法として、電界紡糸することを含むものがある。
これによって参照により援用するWO 2009/104174に記載されるこの方法の例示的な実施形態が、核及び殻を含む区画化済み管状構造を説明する。この構造は、生育可能な細胞を含むことができる。
別の実施形態によれば、組成物は小滴、ゲルマイクロドロップ（ＧＭＤ）、ビーズ、又はプラグとして調剤することができる。
概して、「小滴」とは、比較的少量の材料を参照する。本発明による小滴は、ポリマー粒子又は固体粒子、ゲルマイクロドロップ、ビーズ、又はプラグとすることができる。
適切な小滴が、異なる形状及び寸法を有することができる。小滴は、異なる寸法及び幾何学形状を有することができるのであり、対称又は非対称であるものとすることができる。例えば、小滴とは単一の球体又は楕円を参照することができ、核‐殻配置、（例えばブドウ様の構造を形成するように）共に結び付いた小さめの粒子群、その幾つかが互いに接触している一連の粒子、等を参照することができる。
小滴は、２つ以上の、所望する場合には多数の微細藻類の種類又は微細藻類の群体を含有することができる。各種類の微細藻類を、小滴中又は小滴上の任意の場所に位置決めすることができる（少なくとも１種類が他の少なくとも１種類から限られている限りにおいて）。別法として、微細藻類は小滴中でカプセル化することができる。
ゲルマイクロドロップ
「ゲルマイクロドロップ」（ＧＭＤ）（本明細書ではゲルビーズ又はゲル粒子とも称される）は、ゲル（そして任意で液体）材料に含まれる非常に僅かな小滴、即ち非常に少量の存在物を参照するのであり、この存在物は、０個、１個、又は多数の生物学的存在物を含有することができる。例えば、アガロースＧＭＤ内に２種類以上の微細藻類の種をカプセル化することができる。特に、微細藻類と成長培地と液体アガロースとを含有する水滴をフッ素化オイル中で形成することができる。任意でＧＭＤは、無機及び／又は有機化合物を含有することができる。これらの化合物は、任意で溶液中に存在させることができる。ＧＭＤは、別の液体、例えば非水液体に含まれる境界によって又は透水障壁、例えば膜によって規定することのできる容積を有する。膜は、対象である生物学的存在物（例えば微細藻類）をＧＭＤ内部に留めておくことができ、その他の生物学的存在物、例えば分子（微細藻類よりも小さいもの）を通過させることもできる。例えば、２つ以上の異なる微細藻類株の２つ以上の流れを生成し、その後、これらの流れを組み合わせて単一の小滴にし、その後、この小滴を重合してＧＭＤ（例えばアガロースＧＭＤ）にすることが可能であろう。この場合微細藻類株は区画化され、空間的に分離される。ＧＭＤは任意の形状とすることができるが、しばしばほぼ球形である。というのも、ＧＭＤの境界に関連する力が、変形可能なＧＭＤをまとめようとする傾向をもつからである。その他の力として、例えば、ＧＭＤ浮遊液の攪拌に関連する流体力学的剪断力、表面への付着力、又は重力に、球形状からの逸脱を引き起こす傾向がある。更に、その容積がＧＭＤ容積の比較的大部分である存在物をＧＭＤが含有する又はＧＭＤをこの存在物が占めることにより、ＧＭＤを非球形にすることができる。従って、例えば薄ゲル被膜により（任意で水溶液と共に）包囲される細胞又は細胞の集団がＧＭＤであり、この薄ゲル被膜は非水液体により包囲される。同様に、薄ゲル被膜により（任意で水溶液と共に）包囲される非生物学的粒子もＧＭＤであり、この薄ゲル被膜は非水液体により包囲される。
本発明の実務において、様々な種類のゲルを使用することができる。これらのゲルは以下を包含する。微細藻類の混合の成長及び潜在力が遅い又は問題でない際の標準的なゲル、微細藻類を通さず、微細藻類が通り抜けないようにするゲル、及び、微細藻類を通さないが所望の化学物質を通す膜をゲル間の界面が有するところの随意のゲルである。ゲルビーズを生成する際このような膜は、ビーズが作られているときに、例えばビーズの表面上で２つのポリマーを反応させて又はそれらの２つのポリマーを個々のゲルに組み込んで、ゲルの界面に膜を形成させることにより、化学的に形成することができよう。プラグ内のゲル又はポリマー物質の成立は、外部からの光、温度変化、小分子の追加のもの、ｐＨ変化、圧力変化、キャリア流体との接触、又はチャネル壁との接触により開始することもできよう。
ビーズ
別の実施形態において、小滴は２つ以上のビーズを含有する。各ビーズは、同じ又は異なる種類、形状、及び寸法とすることができる。ビーズは接続することができる。ビーズはゲルビーズとすることができ、例えばアガロースビーズとすることができる。例えば、層状ビーズを生成することができ、その場合、各層は別々の種類の微細藻類を有することになる。幾つかの例において、ビーズは磁性にすることにより所望の領域に、例えば環境に分布させることができ、その後、ビーズがもはや不要である際には所望すれば、例えば電磁石又は永久磁石を使用することにより、容易に回収することができる。
プラグ
小滴は、二相系（例えば有機相／水相、フルオラス相／水相）中、又は乳化剤／界面活性剤をもつ単相（例えば水性バルク溶液により包囲される水滴）中のいずれかに存在する液体（普通は水性液体）とすることができる。「プラグ」とは特定の種類の小滴のことである（Song et al., 2006, Angew. Chem. Int. Ed. 45: 7336-7356、Chen et al., 2006, Curr. Opin. Chem. Bio. 10: 226-231）。
以前、本発明者によりU.S. Pat. No. 7,129,091において液体プラグの成立を記載した。本発明では、異なるプラグ流体に異なる種類の微細藻類を導入する。
空間的に構造化されたプラグに多数の異なる微細藻類を組み込む方法が、微細藻類を含有する流体と、ゲル又はポリマー又は固体マトリックスの形成に必要な成分を含有する流体とを組み合わせるステップを包含する。プラグを形成すると、異なる種類の微細藻類はプラグ中で不均一な空間分布を有するであろう。そしてこの最初の空間分布を、マイクロ流体力学の技術、例えば多数の流れの層流を使用して制御することができる。これらの成分は、微細藻類が実質的に混ざり合うことができるようになる前にゲル又はポリマー又は固体マトリックスを形成し、微細藻類が更に著しく混ざることを防止するであろう。このようにして、プラグ内での微細藻類の不均一な分布が維持されるであろう。ゲル又はポリマー又は固体マトリックスの成立は、過冷却ゲル又は固体が液体状態からゲル状態に又は固体状態に転移する際に行われるような自然発生的な成立、及び、圧力、温度、又は、ＵＶ又は可視光又は別の形態の放射線が適用される際又は化学試薬が添加される際に行われるような刺激の成立を包含する多くの仕方で達成することができよう。化学試薬は、架橋剤、ｐＨの変化、イオン組成の変化、又は、小分子、イオン、又は高分子の追加のものを包含する。化学試薬は、プラグ流体に予め加えることができ又はプラグの成立後に付加することができる。
更に、空間的に構造化されたプラグに多数の異なる微細藻類を組み込む方法が、微細藻類を含有する層を連続して形成するステップを包含する。
成立の仕方に関わらず、微細藻類を当技術分野で良く知られている方法を使用して培養する。
特定の微細藻類必須条件によれば、培養温度は、約４℃から、約４０℃にさえ到達する温度まで変動させることができる。培養期間は、微細藻類の種類及びその最終用途に依存させることができる。培養の終了は藻類株に依存するのであるが、当業者の技術の範囲内である。培養は、開放状況（例えば開放池）又は閉鎖状況（例えば発酵槽）において、光合成用に自然光又は人工光を使用して行うことができる。以下は、このような培養状況の簡単な記載である。
ほとんどの商業的な製造技術は、太陽光を利用する大きな開放池を使用する。太陽光は無料である。これらの系は、対応する細胞密度の低い、比較的低い表面積対容積比を有する。故にこのような系では、通常光合成深さ部分全体又は海中に利益をもたらすために、羽根車が使用される。通常開放池において汚染生物体を除外する必要のため、開放池の有用性が、ほとんどの生物体の成長に適さない条件で育つ限られた数の藻類に制限される。例えば、ドナリエラ・サリナは、非常に高い塩分濃度にて成長することができる。Apt K E et al, "Commercial Developments in Microalgal Biotechnology" J Phycol. 35:215-226 (1999)。当然ながら、組成物中で使用されるその他の種の塩分条件を遵守するための対策が講じられる。
封入型フォトバイオリアクタ、例えば管状フォトバイオリアクタというものは、汚染を最小限にしつつ培養物を封入する透明管を活用する、代わりとなる屋外閉鎖型培養技術である。これらのフォトバイオリアクタは、非常に高い表面積対容積比を提供するのであり、細胞密度は、しばしば池で成就できるものよりもはるかに高い。
照明として電灯を使用する室内での藻類の閉鎖型培養にも、数多くの設計が構築されてきた。Ratchford and Fallowfield (1992) "Performance of a flat plate, air lift reactor for the growth of high biomass algal cultures" J Appl. Phycol. 4: 1-9、Wohlgeschaffen, G D et al. (1992) "Vat incubator with immersion core illumination-a new, inexpensive set up for mass phytoplankton culture" J Appl. Phycol. 4:25-9、Iqbal, M et al. (1993) "A flat sided photobioreactor for culturing microalgae" Aquacult. Eng. 12:183-90、Lee and Palsson (1994) "High-density algal photobioreactors; using light-emitting diodes" Biotechnol. Bioeng. 44:1161-7
培養が一旦終了したら（例えば活性的に）、藻類は培養物から単離される。
このことは、濾過、磁石の使用（磁性ビーズを使用する際）及び同等のものにより、行うことができる。
本明細書において使用する「単離する」とは、微細藻類を含む組成物を培地から単離することを参照する。
本明細書において使用する「採取する」とは、微細藻類を組成物から単離する、即ち、区画化済み構造を崩壊することを参照する。
培養物は特異的に採取及び処理することができ、これによって、例えば様々な溶媒中での周辺区画及び中央区画（例えば、アルギン酸塩対キトサン）の溶解度が異なることに依拠して、微細藻類の異なる区画からの別々の採取／単離が実施されることが、認識されるであろう。
以下に、例示的な実施形態を提供する。
アルギン酸カルシウムは、中性ｐＨであるポリリン酸ナトリウム及び炭酸ナトリウムの溶液に可溶であるが、キトサンは酸性溶液（ｐＨ＜６）に可溶である。
この事例において、区画化済みカプセルを、中性ｐＨである塩溶液へ曝露することにより、アルギン酸塩から作られた周辺区画のみが溶解することになる。微細藻類（例えばスピルリナ）が溶液中に放出されることになるため、この微細藻類を、遠心分離を利用して採取することができる。クロレラは、酸性溶液への曝露後にアルギン酸塩／キトサンカプセルから放出されることになる。
特定の実施形態によれば、カプセル中の偏性光独立栄養微細藻類の濃度は１０６〜１０１０細胞／ｃｍ３カプセルである。
特定の実施形態によれば、カプセル中の偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類の濃度は１０６〜１０１０細胞／ｃｍ３カプセルである。
微細藻類は新鮮な状態で使用することができ、又は例えば少なくとも３か月間の、ただしこれに限定されない可変時間の間又は少なくとも１か月間に暗闇で４℃にて、そして、少なくとも１年超の、ただしこれに限定されない長期間、好みに応じて約３か月間光の条件下に保存することができる。偏性光独立栄養藻類は暗所の条件下では繁殖しないが、光への曝露により光合成し繁殖する。
微細藻類を閉じ込める方法により藻類の色としての天然成分を維持できる一方で、単離しているカプセルは、異なる材料、異なる形状、寸法、及び色から形成することができる。更に添加剤、例えば食品香料、香り、食品着色料、及び保存料を任意で添加することができる。
結果として生じた製品は、通常、使われる微細藻類の種類に応じて、食品、化粧品、又は治療産業において使用される。
例えばスピルリナは、その高いタンパク質含有量の観点から、子供のタンパク質エネルギー栄養障害（ＰＥＭ）の予防及び処置において有用な補助手段とすることができる。スピルリナはカロテノイドが豊富であり、約５０％が、主なプロビタミンＡカロテノイドであるβカロチンとして発生する。スピルリナ中のβカロチンは、高等植物におけると同様に葉緑体中で含有され、カロテノイド結合タンパク質に関連する。スピルリナは、一方でそのマトリックスが単純であること（単細胞）に起因して、緑色の葉もの野菜、例えばホウレンソウよりも消化しやすいと考えられる。スピルリナを食事に付加することは、血糖管理及び脂質パターンに対して好ましい効果をもたらし、従ってＩＩ型糖尿病の治療及び心血管危険要因の管理において潜在的な有用性があると報告された。スピルリナはまた、ヒト黄斑にも見られる成分であるゼアキサンチンを提供する有効な供給源としても明らかになった。
クロレラは、大量の葉酸、ビタミンＢ‐１２、及び鉄を含有するのであり、貧血や高血圧障害の改善に役立てることができる。クロレラは、免疫力を強化して癌病変を予防又は破壊することのできるクロレラ成長因子をも含有する。クロレラ食品サプリメント製品は、生物体からの有毒な重金属の排除を向上することができる。
ドナリエラは、硬い細胞壁を欠くポリブレファリデス（Polyblepharidaceae）科に属する単細胞藻類属である。ドナリエラは海水藻類であり、高レベルのタンパク質をもつスピルリナ及びクロレラとは異なり、混合カロチン及びキサントフィル（ゼアキサンチン、ルテイン、クリプトキサンチン、ビオラキサンチン、及びエキネノン）が非常に豊富である。ドナリエラ（紅藻植物門）は、あらゆる植物及び藻類のうちで最高密度の天然カロテノイドを提供する。従って、ドナリエラプロビタミンＡカロチン（葉緑体にあるもの）は鮮やかな赤色を呈する。ドナリエラのプロビタミンＡカロテノイドは３つの藻類のうちで最高であるが（β‐カロチンとなるものが乾燥重量で１３．８％に達する）［３４］、ドナリエラの応用は、その薬理学的機能（降圧薬、気管支拡張薬等）、及び天然食品着色料としての又は化粧品への添加剤としてのその使用に重点が置かれてきた。ドナリエラカロチンは、酸化剤及び光損傷から細胞を保護することができる。
故に本発明の微細藻類は、それ自体本明細書に記載する組成物中に提供し、その他の成分（治療用成分又はこれらの成分が、その他の栄養物、香料、香り及び同等のものと混合されるところの食品／飼料）と混合し又は本明細書に記載する方法に従って採取することができる。
次に続く実施例の項目の実施例１は、本発明の幾つかの実施形態の方法の記載を提供する。実施例１は、本明細書の一部と認められるべきである。
本明細書において使用する用語「約」とは、±１０％を参照する。
用語「含む」、「含むこと」、「包含する」、「包含すること」、「有する」、及びそれらの同根語は、「包含するがそれに限定されないこと」を意味する。
用語「から成ること」は、「包含し、それに限定されること」を意味する。
用語「基本的に〜から成ること」は、組成、方法、又は構造が、付加的な成分、ステップ、及び／又は部品を包含できることを意味する。ただし、これらの付加的な成分、ステップ、及び／又は部品が、請求される組成、方法、又は構造の基本的特徴及び新規の特徴を著しく改変しない場合に限る。
本明細書において使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、そうでないことを文脈がはっきりと指図しない限り、複数の参照を包含する。例えば、用語「化合物」又は「少なくとも１つの化合物」は、それらの混合物を包含する複数の化合物を包含することができる。
本願を通して、本発明の様々な実施形態を範囲形式で提示することができる。範囲形式での記載は、単に便宜上及び簡潔のためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。これに応じて、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲並びにその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見做されるべきである。例えば、範囲の記載、例えば１から６までというのは、部分的範囲、例えば１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６まで等、並びに、その範囲内の個々の数、例えば１、２、３、４、５、及び６を具体的に開示したと見做されるべきである。このことは、範囲の幅に関係なく適用される。
本明細書において数値範囲を示す際には必ず、この数値範囲が示された範囲内に、任意の引用数字（小数又は整数）を包含することになっている。第１指示数と第２指示数との「間に及ぶこと／及ぶ」という語句、並びに、第１指示数「から」第２指示数「に及ぶこと／及ぶ」という語句は、本明細書において互換的に使用され、これらの語句が、第１及び第２指示数、並びに、それらの間にある全ての小数及び整数を包含することになっている。
本明細書において使用する用語「方法」とは、化学、薬理学、生物学、生化学、及び医学の分野の当業者に知られているやり方、手段、技術、及び手順、又は、これらの当業者により、知られているやり方、手段、技術、及び手順から容易に発展される、やり方、手段、技術、及び手順を包含するがこれに限定されない所与の課題を達成するためのやり方、手段、技術、及び手順を参照する。
本明細書において使用する用語「処置すること」は、状態の進行を無効にし、実質的に阻害し、遅らせる又は後退させること、状態の臨床的又は審美的症状を実質的に緩和すること、又は、状態の臨床的又は審美的症状の出現を実質的に防止することを包含する。
単一の実施形態において、本発明の幾つかの特長を組み合わせて提供することもできるということが認識される。本発明の幾つかの特長は、明確にするために、個別の実施形態の文脈で記載する。逆に本発明の様々な特長を、個別に又は任意の適切な部分組み合わせにおいて又は本発明の記載したその他の任意の実施形態において適切なものとして、提供することもできる。本発明の様々な特長は、簡略のために単一の実施形態の文脈で記載する。様々な実施形態の文脈で記載する幾つかの特長を、それらの要素なしでは実施形態が動作不能であるというのでない限り、その実施形態の基本的な特長と見做すべきではない。
本明細書において上で叙述し、下の請求項の項目において請求する本発明の様々な実施形態及び態様は、以下の実施例において実験に基づく裏付けを得る。
ここで、以下の実施例の参照を行う。これらの実施例は、上の記載と共に本発明の幾つかの実施形態を非限定的なやり方で例証する。
生きている単細胞の混合栄養クロレラ藻類、及び偏性光独立栄養スピルリナ藻類の共カプセル化及び培養
第１ステップ―クロレラ藻類の従属栄養成長のための内側区画の製造
生きている単細胞の混合栄養クロレラ藻類を、アルギン酸の負に帯電した塩（約１／２、ｗ／ｖ）、例えば０．５〜１０％アルギン酸ナトリウム中で浮遊させる。この混合物の液滴を、淡水（約９８％）及び食用の水溶性カルシウム塩（約２％）、例えば塩化カルシウム又は乳酸カルシウムを含有する硬化浴中に約２〜３０ｃｍから滴下する。液滴（約０．１ｍｍ〜３ｍｍ）を約１〜３０分の間浴中で放置すると、その後カプセルは硬くなり、破損することなく容易に取り扱われる。次に、カプセルを濾過により浴から除去して水で洗う。
幾つかの実施形態において、洗ったカプセルを正に帯電した食用０．５％キトサン溶液（ｐＨ約６．０）中で室温にて又は１〜１０分インキュベートし、水で洗うことができる。クロレラのキトサン被覆アルギン酸塩カプセルの薄層は、増殖クロレラ細胞がアルギン酸塩カプセルから漏出しないようにするが、小さな可溶性分子（例えばグルコース、Ｏ２、ＣＯ２）は拡散できるようにする。
幾つかの実施形態において、アルギン酸塩及び／又はキトサンは、不透過性食用成分、例えば着色粒子、インク等と混合することができる。このような不透過性マトリックスは、クロレラ藻類の従属栄養成長を刺激する。
幾つかの実施形態において、アルギン酸塩及び／又はキトサンは、食用油、又は天然又は人工の食用ポリマー、ワックス、気泡、芳香油等で作られた浮遊粒子と混合することができる。
第２ステップ―異なる区画内で固定化された従属栄養及び光独立栄養藻類を含有する区画化済みカプセルの製造
生きている単細胞の偏性光独立栄養スピルリナ藻類を、アルギン酸の透過性塩（約１／２、ｗ／ｖ）、例えば０．５〜１０％アルギン酸ナトリウム中で浮遊させる。クロレラ藻類の入ったアルギン酸塩カプセル（第１ステップ）をスピルリナ藻類のアルギン酸塩浮遊液中に移す。アルギン酸塩中にクロレラのアルギン酸塩／キトサンカプセル及びスピルリナ藻類浮遊液を含有するこの混合物の液滴を、水（約９８％）及び食用の水溶性カルシウム塩（約２％）、例えば塩化カルシウム又は乳酸カルシウムを含有する硬化浴に約２〜３０ｃｍから滴下する。液滴（約０．５ｍｍ〜２０ｍｍ）を約１〜３０分の間浴中で放置すると、その後カプセルは硬くなり、破損することなく容易に取り扱われる。次に、カプセルを浴から除去して洗う。
幾つかの実施形態において、アルギン酸塩中のスピルリナ浮遊液を、食用油、又は天然の又は人工の食用ポリマー、ワックス、気泡、芳香油等で作った浮遊粒子と混合することができる。浮遊粒子は藻類含有カプセルを開放池にて培養する場合、藻類含有カプセルを水面に浮揚させ、より良好に自然光に曝露する。
図２に、本教示により生成されたカプセルの画像を示す。
第３ステップ―藻類含有カプセルの培養
従属栄養及び光独立栄養藻類を含有する区画化済みカプセルを、様々な塩及び固定炭素源（例えばグルコース）を含有する培地中、例えば水中で培養する。培地は、クロレラ藻類株に依存して、ＮＨ４．ＮＯ３（０．１２５ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ（０．０２５ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（０．０７５ｇ／Ｌ）、ＫＱＨＰＯ４（０．０７５ｇ／Ｌ）、ＫＨＺＰＯ４（０．１７５ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（０．０２５ｇ／Ｌ）、及びグルコース（０．１ｇ／Ｌ〜２ｇ／Ｌ）を含有する。
培養中、固定化微細藻類を可視光又は人工光で照明する。照明は、従属栄養成長のためクロレラにより使用される酸素を放出する偏性光独立栄養藻類（例えばスピルリナ）の光合成を活性化する。クロレラ藻類は、同時に光合成成長のためスピルリナにより消費されるべきＣＯ２を放出する（従属栄養藻類と光独立栄養藻類との間の相互共生。
第４ステップ―採取
１．網等を使用する単純な方法により、浮遊カプセルを全部採取することができる。
２．微細藻類の異なる区画からの個別採取／単離は、様々な溶媒中での周辺区画及び中央区画（例えば、アルギン酸塩対キトサン）の溶解度が異なることに依拠する。
例えば：
アルギン酸カルシウムは、中性ｐＨであるポリリン酸ナトリウム及び炭酸ナトリウムの溶液中に可溶であるが、キトサンは酸性溶液（ｐＨ約５）のみに可溶である。
この事例において、区画化済みカプセルを中性ｐＨである塩溶液へ曝露することにより、アルギン酸塩から作られた周辺区画のみが溶解することになる。微細藻類（例えばスピルリナ）が溶液中に放出されることになるため、この微細藻類を、遠心分離を利用して採取することができる。クロレラは、酸性溶液への曝露後にアルギン酸塩／キトサンカプセルから放出されることになる
。
細胞生育可能性に対する共カプセル化の効果
区画化済みアルギン酸塩ビーズ中の光独立栄養及び混合栄養微細藻類の共カプセル化（実施例１に記載したようなもの）により、恐らくは固定化した微細藻類の種の抗酸化特性と抗菌特性との相乗効果に起因する、共培養した微細藻類の種の一方又は両方の保護も与えられる。図３Ａ、図３Ｂに示す画像は、区画化済みアルギン酸塩ビーズ中の光独立栄養スピルリナ及び混合栄養クロレラ微細藻類の共カプセル化が、貯蔵寿命を延ばし、暗所にて室温での保存中、開発された製品の市場性のある特徴を数週間の間維持できることを明示する。図３Ａは、クロレラ藻類と共カプセル化されたスピルリナ細胞の暗所にて室温での良好に維持された構造を示す。対照的に、同じ条件で保存されたスピルリナ微細藻類単独のものは脱色し崩壊した（図３Ｂ）。
本発明をその特定の実施形態と合わせて記載したが、当業者にとって多くの代案、変更態様、及び変形物が明らかであろうことは明白である。これに応じて、添付の請求項の精神及び広い範囲内に属するこのような代案、変更態様、及び変形物全てを受容することが意図される。
個々の各刊行物、特許、又は特許出願を参照により本明細書において援用することを具体的かつ個別に示した場合と同じ程度に、本明細書において言及した全ての刊行物、特許、及び特許出願を、参照により全体として本明細書において援用する。更に、本願における任意の参考文献の引用又は確認は、このような参考文献が本発明にとって先行技術として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。項目の見出しが使用されている範囲では、これらの見出しが必ずしも限定的であるものと解釈されるべきではない。

Claims (53)

  1. 偏性光独立栄養微細藻類と浮遊要素とを含む浮遊性組成物。
  2. 少なくとも２つの区画を含む区画化済み組成物であって、
    前記少なくとも２つの区画のうち第１区画が、偏性光独立栄養微細藻類を含み、
    前記少なくとも２つの区画のうち第２区画が、偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類を含み、
    前記区画が、前記偏性光独立栄養微細藻類と前記偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類との間の共生を確実にする構造及び／又は組成から設計される
    区画化済み組成物。
  3. 請求項２に記載の区画化済み組成物であって、
    前記少なくとも２つの区画のうち前記第１区画が、光に対して透過性であり、
    前記第２区画が、混合栄養微細藻類を含む場合に光に対して不透過性である
    区画化済み組成物。
  4. 請求項２又は３に記載の組成物であって、前記少なくとも２つの区画間での小分子、ミネラル、及びガスの自由拡散を可能にする組成物。
  5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物であって、カプセルとして調剤される組成物。
  6. 請求項５に記載の組成物であって、前記カプセルが、繊維又は球体として成形される組成物。
  7. 請求項５〜６のいずれか１項に記載の組成物であって、前記カプセル中の前記偏性光独立栄養微細藻類の濃度が、１０６〜１０１０細胞／ｃｍ３カプセルである組成物。
  8. 請求項５〜６のいずれか１項に記載の組成物であって、前記カプセル中の前記偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類の濃度が、１０６〜１０１０細胞／ｃｍ３カプセルである組成物。
  9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物であって、前記微細藻類が、生育可能である組成物。
  10. 請求項５〜９のいずれか１項に記載の組成物であって、前記カプセルの直径が、０．１〜２０ｍｍである組成物。
  11. 請求項１に記載の組成物であって、前記偏性光独立栄養微細藻類が、前記組成物中で少なくとも９０％の純度において存在している組成物。
  12. 請求項２〜１１のいずれか１項に記載の組成物であって、
    前記偏性光独立栄養微細藻類が、前記第１区画内で少なくとも９０％の純度において存在し、
    前記偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類が、前記第２区画内で少なくとも９０％の純度において存在している
    組成物。
  13. 請求項２〜１２のいずれか１項に記載の組成物であって、前記組成物を浮遊性にする浮遊要素を更に含む組成物。
  14. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物であって、生物体により摂取可能である組成物。
  15. 請求項１４に記載の組成物であって、前記生物体が、人間である組成物。
  16. 請求項１４に記載の組成物であって、前記生物体が、非ヒト動物である組成物。
  17. 請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物であって、食用である組成物。
  18. 請求項２〜１７のいずれか１項に記載の組成物であって、前記第１区画が、前記第２区画をカプセル化する組成物。
  19. 請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物であって、前記偏性光独立栄養微細藻類が、ドナリエラの種、ナンノクロロプシスの種、シネココッカスの種、及びスピルリナの種から成る群から選択される組成物。
  20. 請求項２〜１９のいずれか１項に記載の組成物であって、前記従属栄養微細藻類又は前記混合栄養微細藻類が、前記偏性光独立栄養微細藻類の成長率よりも速い成長率を特徴とする組成物。
  21. 請求項３〜２０のいずれか１項に記載の組成物であって、前記偏性従属栄養微細藻類が、シゾキトリウムの種及びクリプテコディニウムの種から成る群から選択される組成物。
  22. 請求項３〜２１のいずれか１項に記載の組成物であって、前記混合栄養微細藻類が、クロレラの種及びクラミドモナスの種から成る群から選択される組成物。
  23. 請求項２〜２１のいずれか１項に記載の組成物であって、
    前記混合栄養微細藻類が、クロレラの種の群からのものであり、
    前記偏性光独立栄養微細藻類が、スピルリナの種の群からのものである
    組成物。
  24. 請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物であって、前記微細藻類が、遺伝子改変される組成物。
  25. 請求項２〜２４のいずれか１項に記載の組成物であって、前記第２区画が、濁度に影響を及ぼす添加剤を含む組成物。
  26. 請求項２５に記載の組成物であって、前記添加剤が、顔料、着色料、染料、及びタンパク質から成る群から選択される組成物。
  27. 請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物であって、前記偏性光独立栄養微細藻類が、ポリマー材料によりカプセル化される組成物。
  28. 請求項２〜２７のいずれか１項に記載の組成物であって、前記第１区画及び前記第２区画が、ポリマー材料から構成される組成物。
  29. 請求項２７に記載の組成物であって、前記ポリマー材料が、光透過性である組成物。
  30. 請求項２９に記載の組成物であって、前記ポリマー材料が、アルギン酸塩、アガロース、ゼラチン、及びキトサンから成る群から選択される組成物。
  31. 栄養組成物を製造する方法であって、
    （ａ）偏性独立栄養微細藻類、及び任意で偏性従属栄養微細藻類を、浮遊性要素を含む組成物へと調剤するステップであって、前記微細藻類の生育可能性を持続する条件下に行われるステップと、
    （ｂ）前記組成物中で前記微細藻類を培養し、これによって前記栄養組成物を製造するステップと
    を含む方法。
  32. 栄養組成物を製造する方法であって、
    （ａ）少なくとも２つの区画を含む区画化済み組成物を製造するステップであって、前記少なくとも２つの区画のうち第１区画が、偏性光独立栄養微細藻類を含み、前記少なくとも２つの区画のうち第２区画が、偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類を含み、前記区画が、前記偏性光独立栄養微細藻類と前記偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類との間の共生を確実にする構造及び／又は組成から設計されるステップと、
    （ｂ）粒子内で前記微細藻類を培養し、これによって前記栄養組成物を製造するステップと
    を含む方法。
  33. 請求項３２に記載の方法であって、
    前記少なくとも２つの区画のうち前記第１区画が、光に対して透過性であり、
    前記第２区画が、混合栄養微細藻類を含む際に光に対して不透過性である
    方法。
  34. 請求項３２に記載の方法であって、前記区画化済み組成物が、前記少なくとも２つの区画間での小分子、ミネラル、及びガスの自由拡散を可能にする方法。
  35. 請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の方法であって、前記組成物が、カプセルとして調剤される方法。
  36. 請求項３５に記載の方法であって、前記カプセルが、繊維又は球体として成形される方法。
  37. 請求項３５〜３６のいずれか１項に記載の方法であって、前記カプセル中の前記偏性光独立栄養微細藻類の濃度が、１０６〜１０１０細胞／ｃｍ３カプセルである方法。
  38. 請求項３１〜３７のいずれか１項に記載の方法であって、前記微細藻類が、前記組成物中で生育可能である方法。
  39. 請求項３５、３６のいずれか１項に記載の方法であって、前記カプセルは、直径が０．１〜２０ｍｍである方法。
  40. 請求項３１〜３９のいずれか１項に記載の方法であって、前記偏性光独立栄養微細藻類が、前記組成物中で少なくとも９０％の純度において存在している方法。
  41. 請求項３２〜４０のいずれか１項に記載の方法であって、
    前記偏性光独立栄養微細藻類が、前記第１区画内で少なくとも９０％の純度において存在し、
    前記偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類が、前記第２区画内で少なくとも９０％の純度において存在している
    方法。
  42. 請求項３１〜４１のいずれか１項に記載の方法であって、前記組成物が、前記組成物を浮遊性にする浮遊要素を更に含む方法。
  43. 請求項３１〜４２のいずれか１項に記載の方法であって、前記組成物が、生物体により摂取可能である方法。
  44. 請求項３１〜４３のいずれか１項に記載の方法であって、前記組成物が、食用である方法。
  45. 請求項３２〜４３のいずれか１項に記載の方法であって、前記第１区画が、前記第２区画をカプセル化する方法。
  46. 請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法であって、
    前記第１区画が、第１ポリマーから構成され、
    前記第２区画が、第２ポリマーから構成され、
    前記製造するステップが、前記第１ポリマー及び前記偏性光独立栄養微細藻類を含む第１ポリマー溶液と、前記第２ポリマー及び前記偏性従属栄養又は混合栄養微細藻類を含む第２ポリマー溶液とをポリマー化溶液へと滴下又は電界紡糸することにより行われる
    方法。
  47. 請求項４６に記載の方法であって、前記第１ポリマー溶液及び前記第２ポリマー溶液の前記滴下又は電界紡糸が、同軸ノズル又は非同軸ノズルからのものである方法。
  48. 請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の方法であって、前記培養のステップに続いて、前記微細藻類を単離するステップを更に含む方法。
  49. 請求項３１〜４８のいずれか１項に記載の方法であって、前記培養のステップが、屋外を含む方法。
  50. 請求項３１〜４９のいずれか１項に記載の方法であって、前記培養のステップが、室内を含む方法。
  51. 請求項３１〜５０のいずれか１項に記載の方法であって、前記培養のステップが、開放状況を含む方法。
  52. 請求項３１〜５０のいずれか１項に記載の方法であって、前記培養のステップが、閉鎖状況を含む方法。
  53. 請求項３１〜５０のいずれか１項に記載の方法であって、前記微細藻類の生育可能性を持続する条件下に、前記微細藻類を３か月〜１２か月間保存するステップを更に含む方法。
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