JP2019521705A - 細胞内増殖のための改変糖タンパク質ｈを有するヘルペスウイルス - Google Patents

細胞内増殖のための改変糖タンパク質ｈを有するヘルペスウイルス Download PDF

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Abstract

【解決手段】本発明は、糖タンパク質Ｈに融合又は挿入されたＧＣＮ４酵母転写因子又はその一部を備え、ヘルペスウイルスの増殖及び産生のために、細胞上に存在する標的分子に結合可能な組み換えヘルペスウイルスに関する。ヘルペスウイルスは、ヘルペスウイルスを疾患細胞に再標的化するために、糖タンパク質Ｄ及び／又は糖タンパク質Ｂにおける追加的な改変を備えていてよい。本発明は、更に、ｇＨをコードする核酸及びベクター、ｇＨを備えるポリペプチド、並びにヘルペスウイルス、核酸、ベクター又はポリペプチドを備える細胞に関する。また、本発明は、細胞の表面上でアクセス可能な、ＧＣＮ４酵母転写因子又はその一部に対する標的分子を有する細胞、及び前記細胞においてヘルペスウイルスを産生する方法に関する。【選択図】図３

Description

本発明に至る研究は、欧州連合第７次フレームワーク計画（ＦＰ７／２００７‐２０１３）／ＥＲＣ助成契約第３４００６０号の下に欧州研究会議からの資金提供を受けたものである。
ヘルスケアの着実な発展にもかかわらず、治療することができない又は十分に治療することができない疾患及び病変の負担は依然として高まっている。これらの中でも種々の形態の腫瘍が抜きん出ているが、特に化学放射線療法や生物学的薬剤あるいはそれらの組み合わせで治療される転移性形態の腫瘍に対する成果は限定的である。
腫瘍治療への代替的なアプローチは腫瘍溶解性ウイルス療法(oncolytic virotherapy)であり、それによると、増殖型ウイルス(replication competent virus)が腫瘍細胞に感染し、腫瘍の細胞から細胞に広がり、それらを破壊する。
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、ヒトに対する病原体ウイルスである。培養においては、ＨＳＶは多数の哺乳動物細胞に感染する。ＨＳＶは、標的細胞の種類に応じて、原形質膜にて又はエンドサイトーシスを通してのいずれかで、膜融合によって細胞に侵入するエンベロープウイルスである。ＨＳＶの標的細胞への侵入は、ウイルス糖タンパク質ｇＤ、ｇＨ／ｇＬ、ｇＣ及びｇＢの複雑な相互作用及び立体構造変化を必要とする多段階プロセスである。これらの糖タンパク質は、ＨＳＶ粒子の最も外側の構造であり膜からなるウイルスエンベロープを構成する。細胞への侵入のために、ｇＣ及びｇＢが、細胞表面ヘパラン硫酸へのＨＳＶ粒子の最初の付着を媒介する。その後、ｇＤが、ネクチン１(Nectin-1)及びＨＶＥＭ又はＨＶＥＡである少なくとも２つの代替的細胞受容体(alternative cellular receptors)に結合し、ビリオン‐細胞膜融合を引き起こす事象の連鎖を開始するｇＤにおける立体構造変化をもたらす。これにより、中間タンパク質ｇＨ／ｇＬ（ヘテロ二量体）が活性化され、膜融合を触媒するようにｇＢをトリガーする。結果として、ｇＢは膜結合性であり、ウイルス融合因子(viral fusogen)として機能する。
腫瘍溶解性ＨＳＶｓ（ｏ‐ＨＳＶ）は、近年、腫瘍溶解剤として使用されてきている。野生型ＨＳＶウイルスは非常に毒性が高いので、ｏ‐ＨＳＶｓは弱毒化される必要がある。臨床試験に達したＴ‐ＶＥＣ／イムリジック及びそのウイルスは、１つ以上のＨＳＶ遺伝子の欠失を担持し、これらの遺伝子は、感染細胞におけるタンパク質合成の遮断を妨げる役割を果たすＩＣＰ３４．５タンパク質をコードするガンマγ１３４．５遺伝子と、リボヌクレオチド還元酵素の大サブユニットをコードするＵＬ３９遺伝子と、を含む。子孫ウイルスの高い収量を産生することができない等、これらのウイルスによって示される幾つかの欠点に加えて、それらは更に、それらの天然受容体を有する任意の細胞に結合してしまう保存された能力を有する。従って、腫瘍細胞死滅の治療効果は減少し、上記ウイルスは医療用途において限界を有する可能性がある。
これらの限界を克服する１つのアプローチは、腫瘍細胞に対して高い特異的親和性(specific tropism)を示し、そうでなければ弱毒化されないｏ‐ＨＳＶｓの遺伝子操作であった。このアプローチは、腫瘍特異的受容体に対するＨＳＶ親和性の再標的化として定義されてきた。
癌特異的受容体へのＨＳＶの再標的化は、特異的リガンドをコードする異種配列を有するようなｇＤの遺伝子改変を伴う。組み換えウイルスによる感染によって、エンベロープ内にキメラｇＤ‐リガンド糖タンパク質を担持する子孫ウイルスが、野生型ｇＤの代わりに形成される。リガンドは、選択された細胞上に特異的に発現した分子と相互作用し、選択された細胞内への組み換えｏ‐ＨＳＶの侵入を可能にする。ＨＳＶの再標的化に成功裏に使用されたリガンドの例は、ＩＬ１３α、ｕＰａＲ、ＨＥＲ２に対する一本鎖抗体、及びＥＧＦＲに対する一本鎖抗体である。
また、糖タンパク質の改変による再標的化もｇＣで試みられてきた。挿入されたリガンドは、ＥＰＯ及びＩＬ１３であった。ｇＣ‐ＥＰＯポリペプチドを担持しているウイルスは、ＥＰＯ受容体を発現する細胞に付着した。しかし、この付着は感染性の侵入にはつながらなかった。加えて、ｇＣ‐ＩＬ１３ポリペプチドは、ｇＤ遺伝子内にＩＬ１３の第２のコピーを担持するウイルス内に存在した。従って、これらの研究からは、ｇＣ‐ＩＬ１３がＩＬ１３アルファ２受容体への再標的化に寄与したのか否かは推論することはできない。
また、ｇＨの遺伝子改変による再標的化も達成されてきた。挿入されたリガンドは、ｇＨ遺伝子内の欠失を伴い又は伴わないＨＥＲ２に向けられた一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であった。ウイルスは、ＨＥＲ２受容体を担持している細胞に成功裏に再標的化された（Gatta et al., 2015）。加えて、ｇＨ内のＨＥＲ２に向けられたｓｃＦｖと成熟ｇＤタンパク質内のＥＧＦＲに向けられたｓｃＦｖとを含有する組み換えウイルスが構築された。その結果、受容体を担持している細胞への二重再標的化がもたらされた。更に、ｇＨ内のＨＥＲ２に向けられたｓｃＦｖと成熟ｇＤタンパク質内のＨＥＲ２に向けられたｓｃＦｖとを含有する組み換えウイルスが構築された。その結果、ＨＥＲ２受容体への二重再標的化がもたらされた(Abstract No. P-28, 9th International conference on Oncolytic virus Therapeutics, Boston 2015)。
当該分野においては、疾患特異的受容体へのＨＳＶの再標的化のための方法が知られているが、再標的化される能力を有するこれらのＨＳＶｓは、それらが大量に産生され得て疾患を治療するための医薬品として利用可能であるように、増殖される必要がある。安全上の理由から、ヒトにおける腫瘍細胞のような疾患細胞のＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質等の物質の導入を避けるために、ＨＳＶｓの増殖及び産生のための細胞は、疾患細胞であるべきではないという事実に鑑み、ＨＳＶｓは、ＨＳＶｓの増殖及び産生のためにヒトに有害である成分を産生することのない「安全な」細胞にＨＳＶｓが感染することを可能にする追加的な改変を備える必要がある。しかし、先行技術は、疾患特異的受容体に再標的化される能力を有するヘルペスウイルスの、安全な細胞における増殖及び産生を可能にする方法を今のところ開示していない。
このように、当該分野においては、疾患特異的な受容体に再標的化され且つヘルペスウイルスの増殖及び産生のために安全に使用され得る細胞に再標的化される能力を有するヘルペスウイルスを再標的化するための再標的化戦略を提供する必要がある。
本発明は、ヘルペスウイルスを安全に増殖及び産生することができる細胞の受容体にヘルペスウイルスを再標的化する改変ｇＨタンパク質を有する組み換えＨＳＶを表現する。
本発明者らは、ｇＨとの融合タンパク質としてのＧＣＮ４酵母転写因子の一部を備える組み換えＨＳＶを構築することが可能であり、これにより、ＧＣＮ４酵母転写因子の当該一部の存在に起因して、ＨＳＶが、ＧＣＮ４酵母転写因子の当該一部の受容体を担持している細胞に再標的化されることを示した。更に、ＨＳＶが感染性を維持し、結果として、受容体を担持している細胞への侵入とＨＳＶの増殖及び産生とをもたらすことが示された。
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の特徴は個々の段落で説明される。しかし、これは、ある段落で説明されるある特徴が、他の段落で説明される１つ以上の特徴から分離して存在することを意味するものではない。むしろ、ある段落で説明されるある特徴は、他の段落で説明される１つ以上の特徴と組み合わせることができる。
ここで用いられる「備える／備えている(comprise/es/ing)」の用語は、開示された特徴及び特に言及されていない更なる特徴を「含む又は包含する(include or encompass)」ことを意味する。また、「備える／備えている」の用語は、示された特徴「からなる(consist/s/ing of)」という意味、従って示された特徴以外の更なる特徴を含まないという意味であることも意図されている。従って、本発明の製品は、示された特徴に加えて追加的な特徴によって特徴付けられてもよい。
第１の側面においては、本発明は、ヘルペスウイルスのエンベロープ内に存在する糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）に融合又は挿入された、５〜２７４アミノ酸の長さを有するペプチドを備える組み換えヘルペスウイルスを提供する。
その実施形態においては、ペプチドは、５〜２００アミノ酸、好ましくは１１〜２９、３１〜３９、４１〜４９又は５１〜２００アミノ酸、より好ましくは１２〜２０アミノ酸の長さを有する。
その実施形態においては、ペプチドは、ＧＣＮ４酵母転写因子の一部、好ましくは配列ＩＤ番号１３により備えられるＧＣＮ４酵母転写因子の一部を備え、最も好ましくは、ペプチドは、配列ＩＤ番号１３により特定されるペプチドである。
その実施形態においては、ペプチドは、配列ＩＤ番号１に係るｇＨのアミノ酸１９〜２３のいずれかから始まりアミノ酸４８〜８８のいずれかで終わり若しくはアミノ酸１１６から始まりアミノ酸１３６で終わるＮ末端領域内又は相同ｇＨの対応領域内において挿入される。
その実施形態においては、ペプチドは、ｇＨのＨ１ＡドメインのＮ末端側に挿入される。
その実施形態においては、Ｎ末端領域の１つ以上のｇＨアミノ酸は欠失している。
その実施形態においては、ヘルペスウイルスは、標的分子を発現させ又は結合させている細胞にペプチドを介して結合する能力、好ましくは当該細胞膜と融合する能力、より好ましくはその細胞に侵入する能力、最も好ましくはその細胞内で増殖する能力を有する。
その実施形態においては、標的分子は、配列ＩＤ番号５により備えられるｓｃＦｖ、最も好ましくは配列ＩＤ番号７の配列により特定される分子である。
その実施形態においては、ヘルペスウイルスは、そのヘルペスウイルスを疾患細胞に再標的化するように改変されたｇＤ及び／又はそのヘルペスウイルスを疾患細胞に再標的化するように改変されたｇＢを備える。
その実施形態においては、ヘルペスウイルスは、細胞、好ましくは疾患細胞に対する宿主免疫応答を刺激する１つ以上の分子をコードする。
本発明の組み換えヘルペスウイルスは、ヒトの疾患細胞に感染して死滅させる目的に役立つ。これにはヘルペスウイルスの供給が必要であり、従ってその増殖及び産生が必要である。腫瘍細胞のような疾患細胞のＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質等の物質のヒトへの導入を避けるために、疾患細胞におけるヘルペスウイルスの増殖は回避されるべきであるので、組み換えヘルペスウイルスは、ヘルペスウイルスの産生に有用な細胞であってヒトに有害であることのある物質を産生しない細胞に感染可能なように操作される必要がある。そのような細胞は、ここでは「安全な」細胞と称される。これは、本発明の組み換えヘルペスウイルスを増殖及び産生のためのそのような細胞に再標的化することを必要とする。これを達成するために、組み換えヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｈは、ペプチドを含むように改変され、即ち、５〜２７４アミノ酸、好ましくは５〜２００アミノ酸、より好ましくは１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９アミノ酸等の１１〜２９、３１〜３９、４１〜４９又は５１〜２００アミノ酸、更に好ましくは１２〜２０アミノ酸のペプチド、更に好ましくはＧＣＮ４酵母転写因子の一部、更に好ましくは配列ＩＤ番号１３により備えられるＧＣＮ４酵母転写因子の一部、最も好ましくは、配列ＩＤ番号１３により特定されるペプチドを含むように改変され、それにより、ヘルペスウイルスの産生のために安全に使用され得る細胞の表面上でアクセス可能である標的分子への結合が可能になる。標的分子への結合のためのリガンドとしてのペプチドの使用は、組み換えヘルペスウイルスを増殖及び産生するために安全に使用され得る細胞上のそのような標的分子へのアクセス可能性を必要とする。これは次いで、ペプチドに結合可能な標的分子を備えるように本発明の組み換えヘルペスウイルスを安全に産生可能な細胞の改変を必要とする。好ましい標的分子は、配列ＩＤ番号５により備えられるｓｃＦｖのようなｓｃＦｖ等の、リガンドに適合する標的分子として特異的に生成される抗体又は抗体誘導体である。
本発明の組み換えヘルペスウイルスは、追加的に、疾患細胞等の望ましくない細胞内に存在する標的分子にヘルペスウイルスを再標的化するために、細胞内へのヘルペスウイルス侵入に関与するｇＤ及び／又はｇＢ等の他の糖タンパク質における異種ペプチドリガンドを備えていてよい。このように、ｇＨの改変は、ヘルペスウイルスをその産生のための細胞に再標的化する目的に役立つ一方で、他の糖タンパク質の更なる改変は、ヘルペスウイルスを望ましくない細胞上の標的分子に再標的化してそれらの細胞を死滅させる目的に役立つ。
糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）は、ヘルペスウイルス感染性において役割を果たす１１０ｋＤａのビリオンエンベロープ糖タンパク質である。ｇＨは、ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｌと共にヘテロ二量体を形成する。ヘルペスウイルスが細胞内に侵入すると、ヘテロ二量体ｇＨ／ｇＬは、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）のプロフュージョンドメイン(profusion domain)と相互作用し、このプロフュージョンドメインは、ｇＤとその受容体の１つであるネクチン１、ＨＶＥＭ、及び改変ヘパラン硫酸との相互作用に際して細胞侵入中に除去される。ヘルペスウイルスがｇＤ分子を備えていない場合、ｇＨ／ｇＬは、エプスタインバーウイルス(Epstein Barr virus)によりコードされたｇｐ４２等の、ｇＤと同様の機能を有する類似タンパク質と相互作用する。この相互作用は、細胞内へのヘルペスウイルス侵入に関与する４つの糖タンパク質ｇＤ、ｇＨ、ｇＬ、及びｇＢの活性化カスケードにおいて重要な事象である。活性化カスケードは、ｇＤがその受容体の１つであるネクチン１、ＨＶＥＭ、及び改変ヘパラン硫酸に結合することで始まり、結果として、ｇＢにより媒介されたヘルペスウイルスと標的細胞膜の融合がもたらされる。少なくともヒト及びサルヘルペスウイルスにおいては、ｇＨは保存される。３つのｇＨタンパク質の細胞外部分の結晶構造が知られており、１つはアルファヘルペスウイルスＨＳＶ‐２ｇＨ由来(Chowdary et al., 2010)であり、１つは同様にアルファヘルペスウイルスであるブタＰｒＶ由来(Backovic et al., 2012)であり、そして１つはガンマヘルペスウイルスであるエプスタインバーウイルス由来(Matsuura et al., 2010)である。それらは実質的に類似しており、例えば、構造的に類似のドメインにおける構成(organization)は全ての結晶構造に存在する。異なるヘルペスウイルスの種々のｇＨのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列が当該分野において知られている。例示のみの目的で、これに限定されないが、配列ＩＤ番号１としてここに開示されるヒトヘルペスウイルス１のｇＨのアミノ酸配列を参照する。対応するヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、アセッション番号「ゲノム(Genome)」、ＧＵ７３４７７１．１、座標４３７４１〜４６４９８の下でＮＣＢＩ(National Centre for Biotechnology Information; National Library of Medicine, Bethesda, MD20894, USA; www.ncbi.nlm.nih.gov)から利用可能である。
1 MGNGLWFVGV IILGVAWGQV HDWTEQTDPW FLDGLGMDRM YWRDTNTGRL WLPNTPDPQK
61 PPRGFLAPPD ELNLTTASLP LLRWYEERFC FVLVTTAEFP RDPGQLLYIP KTYLLGRPPN
121 ASLPAPTTVE PTAQPPPSVA PLKGLLYNPV ASVLLRSRAW VTFSAVPDPE ALTFPRGDNV
181 ATASHPSGPR DTPPPRPPVG ARRHPTTELD ITHLHNASTT WLATRGLLRS PGRYVYFSPS
241 ASTWPVGIWT TGELVLGCDA ALVRARYGRE FMGLVISMHD SPPVEVMVVP AGQTLDRVGD
301 PADENPPGAL PGPPGGPRYR VFVLGSLTRA DNGSALDALR RVGGYPEEGT NYAQFLSRAY
361 AEFFSGDAGA EQGPRPPLFW RLTGLLATSG FAFVNAAHAN GAVCLSDLLG FLAHSRALAG
421 LAARGAAGCA ADSVFFNVSV LDPTARLQLE ARLQHLVAEI LEREQSLALH ALGYQLAFVL
481 DSPSAYDAVA PSAAHLIDAL YAEFLGGRVL TTPVVHRALF YASAVLRQPF LAGVPSAVQR
541 ERARRSLLIA SALCTSDVAA ATNADLRTAL ARADHQKTLF WLPDHFSPCA ASLRFDLDES
601 VFILDALAQA TRSETPVEVL AQQTHGLAST LTRWAHYNAL IRAFVPEASH RCGGQSANVE
661 PRILVPITHN ASYVVTHSPL PRGIGYKLTG VDVRRPLFLT YLTATCEGST RDIESKRLVR
721 TQNQRDLGLV GAVFMRYTPA GEVMSVLLVD TDNTQQQIAA GPTEGAPSVF SSDVPSTALL
781 LFPNGTVIHL LAFDTQPVAA IAPGFLAASA LGVVMITAAL AGILKVLRTS VPFFWRRE*
配列ＩＤ番号１
ｇＨ相同体(gH homolog)は、ヘルペスウイルス科の全メンバーにおいて見出される。従って、ここで参照される「糖タンパク質Ｈ」の用語は、ヘルペスウイルス科において見出される任意のｇＨ相同体を参照する。あるいは、ここで参照されるｇＨは、配列ＩＤ番号１の配列の少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％に対してアミノ酸同一性を有する任意のｇＨを参照する。あるいは、ここで参照されるｇＨは、配列ＩＤ番号１の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％に対してアミノ酸相同性を有する任意のｇＨを参照する。ここで参照されるｇＨはまた、ｇＨの断片(fragment)を含む。好ましくは、ここで参照されるｇＨは、ヘルペスウイルス科において見出される任意のｇＨと、上記で定義された配列ＩＤ番号１の配列に対してアミノ酸同一性を有する任意のｇＨと、ｇＨの任意の断片と、を含み、配列ＩＤ番号１に係るｇＨと同じ活性を有する。より好ましくは、ｇＨ相同体は、細胞へのヘルペスウイルス侵入において重要な役割を果たす。即ち、細胞へのウイルスの侵入プロセスの間、ヘテロ二量体ｇＨ／ｇＬは、ｇＤ又は類似タンパク質、例えばエプスタインバーウイルスによりコードされたｇｐ４２、のプロフュージョンドメインと相互作用し、あるいはインテグリンを含むがこれに限定されないｇＨ／ｇＬに対する細胞受容体と相互作用する。これらの事象は、ヘルペスウイルス侵入に関与する４つの糖タンパク質であるｇＤ又は類似タンパク質、ｇＨ、ｇＬ、及びｇＢの活性化カスケードをもたらす。
ここで用いられる「配列同一性」のパーセンテージは、２つの最適に整列された配列における対応する位置において同一であるアミノ酸残基のパーセンテージを参照する。このパーセンテージは、２つの最適に整列された配列を比較ウインドウにおいて比較することによって決定され、比較ウインドウ内のアミノ酸配列の断片は、２つの配列の最適な整列のための参照配列、配列ＩＤ番号１（付加又は欠失を備えていない）との対比において、付加又は欠失（例えば、ギャップ又はオーバーハング）を備えていてよい。パーセンテージは、一致位置を生じさせる同一のアミノ酸残基が両方の配列において存在する位置の数を決定し、一致位置の数を比較のウインドウ内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを求めることによって計算される。比較のための配列の最適な整列は、スミス及びウォーターマン(Smith and Waterman)、１９８１の局所的相同性アルゴリズムによって、ニードルマン及びブンシュ(Needleman and Wunsch)、１９７０の相同性整列アルゴリズムによって、ピアソン及びリップマン(Pearson and Lipman)、１９８８の類似性検索法（search for similarity method）によって、カーリン及びアルツシュール(Karlin and Altschul)、１９９３により修正されたカーリン及びアルツシュール、１９９０のアルゴリズムによって、若しくはこれらのアルゴリズムのコンピュータ実装（GAP, BESTFIT, BLAST, PASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI）によって、又は検査によって、実施されてよい。最適な整列を決定するためにギャップ(GAP)及びベストフィット(BESTFIT)が好ましく採用される。典型的には、ギャップウェイトに対しては５．００、ギャップウェイト長に対しては０．３０のデフォルト値が用いられる。
ここで用いられる「相同性のパーセンテージ」は、２つの最適に整列された配列における対応する位置において相同であるアミノ酸残基のパーセンテージを参照する。２つの配列の間の「相同性のパーセンテージ」は、計算において同一位置だけでなく相同位置も考慮されているという事実を除き、「同一性のパーセンテージ」の決定を参照して上述したものと実質的に同一の方法で確立される。２つの相同アミノ酸は、２つの同一又は相同のアミノ酸を有する。相同アミノ酸残基は類似した化学物理的特性を有しており、例えば、アミノ酸は、同じグループ、即ち芳香族（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）、酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、極性（Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、塩基性（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、脂肪族（Ａｌａ、Ｌｅｕ、ｌｉｅ、ＶａＩ）、水酸基含有（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、又は短側鎖含有（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）、に属する。そのような相同アミノ酸の間での置換はタンパク質表現型(protein phenotype)を変化させないことが期待されている（同類置換(conservative substitutions)）。
ｇＨは、配列ＩＤ番号１の少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％に対して同一性を有する場合、配列ＩＤ番号１の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは１００％に対してアミノ酸相同性を有する場合、又は配列ＩＤ番号１に係るｇＨと同じ活性を有する場合、「相同(homologous)」又は「相同体(homolog)」である。好ましくは、「同じ活性」は、ヘテロ二量体ｇＨ／ｇＬが、ｇＤ又は類似タンパク質のプロフュージョンドメインと相互作用し、ヘルペスウイルス侵入に関与する４つの糖タンパク質であるｇＤ又は類似タンパク質、ｇＨ、ｇＬ、及びｇＢの活性化カスケードに重要な役割を果たすという意味で理解されてよい。相同体は、上述した活性を有する完全長ｇＨの断片であってもよい。
本発明のキメラｇＨ（配列ＩＤ番号３によって例示される）は、ペプチドを担持し、これにより、ｇＨ部分が野生型（ｗｔ）ウイルスに対して達成する活性に加え、ウイルスに対し新たな活性をもたらす。キメラｇＨは、一旦組み換えウイルスのエンベロープの一部になると、ペプチドにより結合され得る標的分子への組み換えヘルペスウイルスの結合を可能にし、標的分子を担持している細胞に組み換えウイルスの親和性を再標的化する。好ましくは、ヘテロ二量体ｇＨ／ｇＬは、ｇＤ又は類似タンパク質のプロフュージョンドメインと相互作用し、これは、ヘルペスウイルス侵入に関与する４つの糖タンパク質であるｇＤ又は類似タンパク質、ｇＨ、ｇＬ、及びｇＢの活性化カスケードにおける重要な事象である。ペプチドの標的分子を担持している細胞との融合の後、組み換えヘルペスウイルスは細胞に侵入し、組み換えヘルペスウイルスが感染した細胞は、ペプチドを有するキメラｇＨを含む、ウイルスゲノムによってコードされたタンパク質を産生する。感染細胞は、細胞の溶解により細胞から放出される子孫ウイルスを産生する。こうして産生されたヘルペスウイルスは、分離して意図された用途、例えば医薬品として使用することができる。
ここで用いられる場合、ｇＨの特定のアミノ酸番号又は領域の表示は、最初の１８アミノ酸を備えるＮ末端シグナル配列を含む配列ＩＤ番号１において例示されるようなｇＨの「前駆体(precursor)」形態を参照する。ｇＨの「成熟(mature)」形態は、配列ＩＤ番号１のアミノ酸１９から始まりアミノ酸８３８まで伸びる。配列ＩＤ番号１とは異なるアミノ酸配列を有するｇＨ糖タンパク質も本発明に含まれるので、配列ＩＤ番号１に関連する特定のアミノ酸番号又は特定のアミノ酸領域の表示はまた、相同ｇＨのアミノ酸番号又は領域を意味し、これは配列ＩＤ番号１のそれぞれのアミノ酸番号又は領域に対応する。
ここで用いられる「キメラ糖タンパク質Ｈ」又は「キメラｇＨ」の用語は、ペプチドをｇＨに融合又は挿入したｇＨを意味する。キメラｇＨは、組み換えウイルスによってコードされ、組み換えウイルスを産生する細胞で合成され、ビリオンのエンベロープ内に組み込まれる。遺伝子工学によって組み換えウイルスを産生する方法は、当該分野において知られている。キメラ糖タンパク質Ｈを産生する方法は、当該分野において知られている。
ここで用いられる「再標的化」の用語は、本発明の組み換えヘルペスウイルスが、ヘルペスウイルス内に導入されたリガンドにより結合される標的分子に標的化されることを意味する。しかし、組み換えヘルペスウイルスは、依然として非改変ヘルペスウイルス(unmodified herpesvirus)の天然受容体に標的化されることが可能である。再標的化は「脱標的化(detargeting)」とは異なり、脱標的化は、組み換えヘルペスウイルスがもはや非改変ヘルペスウイルスの天然受容体に標的化されることができないことを意味する。「脱標的化」は、組み換えウイルスがリガンドの標的分子にのみ標的化されることを意味する。
ＧＣＮ４酵母転写因子は先端技術である（例えば、Arndt and Fin, 1986; Hope and Struhl, 1987参照）。例示的なＧＣＮ４酵母転写因子は、配列ＩＤ番号１９（ジェンバンクアセッション番号ＡＪ５８５６８７．１）において特定される遺伝子によりコードされた配列ＩＤ番号２０（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ-Ｐ０３０６９）によって特定されるものである。ここで参照される「ＧＣＮ４酵母転写因子」の用語は、天然に存在する任意のＧＣＮ４酵母転写因子を参照する。あるいは、ここで参照されるＧＣＮ４酵母転写因子は、配列ＩＤ番号２０の配列の少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％に対してアミノ酸同一性を有する任意のＧＣＮ４酵母転写因子を参照する。あるいは、ここで参照されるＧＣＮ４酵母転写因子は、配列ＩＤ番号２０の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％に対してアミノ酸相同性を有する任意のＧＣＮ４酵母転写因子を参照する。ＧＣＮ４酵母転写因子は、配列ＩＤ番号１の少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％に対して同一性を有する場合、配列ＩＤ番号１の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは１００％に対してアミノ酸相同性を有する場合、又は配列ＩＤ番号２０に係るＧＣＮ４酵母転写因子と同じ活性を有する場合、「相同」又は「相同体」である。好ましくは、「同じ活性」は、ＧＣＮ４酵母転写因子が配列ＩＤ番号２０に係るＧＣＮ４酵母転写因子と同じように転写因子として働くという意味で理解されてよい。ここで用いられる用語「その一部」は、「その一部」が結合可能な標的分子がＧＣＮ４酵母転写因子の任意の部分に対して生成され得る場合のその部分を含む。好ましくは、「その一部」の長さは、５〜２７４アミノ酸、好ましくは５〜２００アミノ酸、より好ましくは１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９アミノ酸等の１１〜２９、３１〜３９、４１〜４９又は５１〜２００アミノ酸、更に好ましくは１２〜２０アミノ酸のペプチド長がもたらされるような長さであり、それにより、ペプチドは、リンカー配列等の追加的なアミノ酸を含んでいてよい。最も好ましくは、「その一部」の長さは１２アミノ酸である。最も好ましい「その一部」は、ＧＣＮ４酵母転写因子のエピトープYHLENEVARLKK（配列ＩＤ番号１４）である。ｇＨへの融合又は挿入のために、エピトープYHLENEVARLKKは、各側上の２つの隣接(flanking)ｗｔ（野生型）ＧＣＮ４残基と、２つのＧＳリンカーと、を更に備えていてよい。この構築物は、ここではＧＣＮ４ペプチドと命名される。この２０アミノ酸ペプチドは、ヘルペスウイルスに対して、「その一部」が結合する標的分子を有する細胞株に感染してそこで複製する能力を付与する。
本発明は、ヘルペスウイルスのエンベロープ内に存在する糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）に融合又は挿入されたＧＣＮ４酵母転写因子を備える組み換えヘルペスウイルスを開示する。
ここで用いられる「組み換え」ヘルペスウイルスの用語は、ペプチドをコードする追加の核酸配列を含むように遺伝子組み換えによって遺伝子操作されたヘルペスウイルスを参照する。組み換えヘルペスウイルスを産生する方法は、当該分野において周知である（例えばSandri-Goldin et al., 2006を参照）。しかし、本発明は遺伝子工学的方法に限定されない。他の方法を用いて、ペプチドをｇＨに融合又は挿入したヘルペスウイルスを産生してもよい。
ここで参照される「ヘルペスウイルス」の用語は、潜伏感染又は溶解感染を引き起こす二本鎖ＤＮＡウイルスのヘルペスウイルス科ファミリーのメンバーを参照する。全てのヘルペスウイルスは共通構造を共有し、それらのゲノムは、カプシド(capside)と呼ばれる二十面体タンパク質ケージ内に包み込まれた８０〜２００遺伝子をコードする比較的大きな（約１００，０００〜２００，０００塩基対）二本鎖の直線状ＤＮＡからなり、カプシドそれ自体は、ウイルスタンパク質及びウイルスｍＲＮＡｓの両方を含むテグメント(tegument)と呼ばれるタンパク質層とエンベロープと呼ばれる脂質二重層膜とによって包まれている。この全体粒子はビリオンとしても知られる。「ヘルペスウイルス」の用語はまた、例えば実験室で改変されたヘルペスウイルス等の１つ以上の変異遺伝子を備える変異させられたヘルペスウイルス科ファミリーのメンバーを参照する。
好ましい実施形態において、ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ‐１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ‐２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ヒトヘルペスウイルス３（ＨＨＶ‐３））、ブタアルファヘルペスウイルス亜科仮性狂犬病ウイルス(swine alphaherpesvirus Pseudorabiesvirus)（ＰＲＶ）、チンパンジーアルファ１ヘルペスウイルス（ＣｈＨＶ）、ヒヒヘルペスウイルス２(Papiine herpesvirus 2)（ＨＶＰ２）、オナガザルヘルペスウイルス２(Cercopithecine herpesvirus 2)（ＣｅＨＶ２）、マカシンヘルペスウイルス１(Macacine herpesvirus 1)（ＭＨＶ１）、リスザルヘルペスウイルス１(Saimiriine herpesvirus 1)（ＨＶＳ１）、カリトリシンヘルペスウイルス３(Callitrichine herpesvirus 3)（ＣａｌＨＶ３）、リスザルヘルペスウイルス２(Saimiriine herpesvirus 2)（ＨＶＳ２）、ウシヘルペスウイルス１（ＢｏＨＶ‐１）、ウシヘルペスウイルス５（ＢｏＨＶ‐５）、ウマヘルペスウイルス１（ＥＨＶ‐１）、ウマヘルペスウイルス２（ＥＨＶ‐２）、ウマヘルペスウイルス５（ＥＨＶ‐５）、イヌヘルペスウイルス１（ＣＨＶ）、ネコヘルペスウイルス１（ＦＨＶ‐１）、ダック腸炎ウイルス（ＤＥＶ）、オオコウモリアルファヘルペスウイルス１（ＦＢＡＨＶ１）、ウシヘルペスウイルス２（ＢｏＨＶ‐２）、ウサギヘルペスウイルス４（ＬＨＶ‐４）、ウマヘルペスウイルス３（ＥＨＶ‐３）、ウマヘルペスウイルス４（ＥＨＶ‐４）、ウマヘルペスウイルス８（ＥＨＶ‐８）、ウマヘルペスウイルス９（ＥＨＶ‐９）、オナガザルヘルペスウイルス９（ＣｅＨＶ９）、ブタヘルペスウイルス１(Suid herpesvirus 1)（ＳｕＨＶ‐１）、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、マレック病ウイルス血清型２（ＭＤＶ２）、ハヤブサヘルペスウイルス１型(Falconid herpesvirus type 1)（ＦａＨＶ‐１）、トリヘルペスウイルス３(Gallid herpesvirus 3)（ＧａＨＶ‐３）、トリヘルペスウイルス２（ＧａＨＶ‐２）、肺‐眼‐気管疾患関連ヘルペスウイルス(Lung-eye-trachea disease-associated herpesvirus)（ＬＥＴＶ）、トリヘルペスウイルス１（ＧａＨＶ‐１）、オウムヘルペスウイルス１（ＰｓＨＶ‐１）、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ‐８）、ヒトヘルペスウイルス４（ＨＨＶ‐４）、ウミガメヘルペスウイルス５（ＣｈＨＶ５）、クモザルヘルペスウイルス３（ＡｔＨＶ３）又はシチメンチョウヘルペスウイルス１（ＭｅＨＶ‐１）からなる群から選択される。より好ましい実施形態においては、ヘルペスウイルスはＨＳＶ‐１又はＨＳＶ‐２であり、最も好ましくはＨＳＶ‐１である。
ここで用いられる「ペプチド」の用語は、ペプチド結合によって連結された複数のアミノ酸からなる連続的で非分岐のペプチド鎖である。ペプチド鎖の長さは、５〜２７４アミノ酸、好ましくは５〜２００アミノ酸、より好ましくは１１〜２９、３１〜３９、４１〜４９又は５１〜２００アミノ酸、更に好ましくは１２〜２０アミノ酸であり、更に好ましくは、ペプチドは、ＧＣＮ４酵母転写因子の一部、更に好ましくは配列ＩＤ番号１３により備えられるＧＣＮ４酵母転写因子の一部を備え、最も好ましくは、ペプチドは配列ＩＤ番号１３により特定されるペプチドである。本発明においては、ペプチドは、ｇＨへの融合物又は挿入物として用いられる。特に定義されていない場合、ペプチドは、標的細胞上に存在する標的分子が結合することが可能な任意のペプチドであってよい。このように、ペプチドは天然ポリペプチドの一部であってよい。天然ポリペプチドは、任意の生体に由来してよく、好ましくはヒトに有害でない生体に由来してよい。例えば、天然ポリペプチドは、サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス（Saccharomyces）属からのポリペプチドのような真菌性又は細菌性のポリペプチドである。ペプチドは細胞上に存在する標的分子に結合可能であるので、ペプチドはリガンドを代表する。「リガンド」の用語は、細胞の表面上でアクセス可能な標的分子に結合し又は結合可能であるものとしてここで一般的に用いられる。
ここで用いられる「ポリペプチド」の用語は、ペプチド結合によって連結された複数のアミノ酸からなる連続的で非分岐のペプチド鎖である。ポリペプチド鎖の長さは無制限であり、５アミノ酸等の幾つかのアミノ酸から数百又は数千アミノ酸の範囲にあってよい。２つ以上のポリペプチド鎖が抗体等の複合体に会合してよい。ここで用いられる「ポリペプチド」の用語はまた、ポリペプチド鎖の会合体を含む。「ペプチド」の用語はｇＨに挿入又は融合されたリガンドに対してここで用いられる一方で、「ポリペプチド」の用語は、疾患細胞を標的化する役割を果たすｇＤ若しくはｇＢに挿入されたリガンドに対して、ペプチドを融合若しくは挿入したｇＨポリペプチドに対して、又は示された特異的ポリペプチドに対してここで用いられる。
「相同ｇＨの対応領域」の用語は、スミス‐ウォーターマン(Smith-Waterman)アルゴリズム及び整列パラメータＭＡＴＲＩＸ：ＢＬＯＳＵＭ６２、ＧＡＰ ＯＰＥＮ：１０、ＧＡＰ ＥＸＴＥＮＤ：０．５を用いた場合に、配列ＩＤ番号１に係るｇＨの所与の領域と整列するｇＨの領域を参照する。このアルゴリズムは、ペアワイズ配列比較(pairwise sequence comparisons)を行う場合に当該分野において知られ用いられており、当業者はそれをどのように適用するのかを知っている。配列ＩＤ番号１の所与の領域の単一又は複数の部分のみが上記のアルゴリズム及びパラメータを用いて相同ｇＨの配列と整列する場合、「対応領域」の用語は、配列ＩＤ番号１の所与の領域の単一又は複数の部分と整列する領域を参照する。この場合、ペプチドが挿入されている相同ｇＨ内の領域は、配列ＩＤ番号１の所与の領域の単一又は複数の部分と整列するアミノ酸のみを備える。「対応領域」の用語はまた、対応する隣接配列(flanking sequences)が隣接する領域を参照し、隣接配列は、上記のアルゴリズム及びパラメータを用いて、配列ＩＤ番号１の領域に隣接する配列と整列する。これらの隣接配列は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０又は５０アミノ酸長である。用いられてよい他のアルゴリズムは、ニードルマン及びブンシュ(Needleman and Wunsch)、１９７０のアルゴリズム、ピアソン及びリップマン(Pearson and Lipman)、１９８８の類似法、若しくはカーリン及びアルツシュール(Karlin and Altschul)、１９９３により修正されたカーリン及びアルツシュール、１９９０のアルゴリズム、又はこれらのアルゴリズムのコンピュータ実装である。
「対応アミノ酸」の用語は、対応領域内にあるアミノ酸であって、整列内において配列ＩＤ番号１の所与のアミノ酸のカウンターパートであるアミノ酸を参照する。対応アミノ酸は、対応領域内にある限り、整列において配列ＩＤ番号１のカウンターパートと同一であってはならない。
本発明の組み換えヘルペスウイルスにおいて、ペプチドはｇＨに融合又は挿入されていてよい。この文脈において、ここで用いられる「融合された」又は「融合」の用語は、直接的に又はペプチドリンカーを介して間接的に、ペプチド結合によるｇＨのＮ末端アミノ酸へのペプチドの付加を参照する。「融合された」又は「融合」がｇＨの末端への付加を意味する限りにおいて、Ｎ末端領域に対する「融合された」又は「融合」は「挿入」とは異なる一方で、「挿入」はｇＨへの組み込みを意味する。
ここで参照されるペプチドリンカーは、異なる供給源に由来するアミノ酸配列を連結するように機能する。このようなリンカーは、連結するように機能すると共にペプチドの、糖タンパク質Ｈ配列との適切な折り畳みを可能にするように機能する。リンカーはまた、ペプチド配列をｇＨ以外の糖タンパク質配列と連結するように機能してよい。リンカーは、典型的には１及び３０アミノ酸の間の長さ、好ましくは２〜２５アミノ酸の長さ、より好ましくは２〜１０アミノ酸の長さ、最も好ましくは２アミノ酸の長さを有し、任意のアミノ酸を備えていてよい。好ましくは、リンカーは、１つ以上のアミノ酸Ｇｌｙ及び／又はＳｅｒ及び／又はＴｈｒを含み、より好ましくは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ及び/又はＴｈｒからなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０アミノ酸を備える。更に好ましくは、リンカーは、アミノ酸Ｇｌｙ及び／又はＳｅｒからなる。Ｇｌｙ及び／又はＳｅｒに基づくリンカーは、柔軟性、良好な溶解性及びタンパク質分解に対する耐性を提供する。あるいは、リンカーは、グリシン、セリン及び／又はトレオニンを主に備えていなくてもよいが、グリシン、セリン及び／又はトレオニンは存在しなくてもよく又は僅かしか存在しなくてもよい。ペプチドをｇＨ配列に連結する最も好ましいリンカーは、リンカーＧＳである。挿入の場合、このリンカーはペプチドの両側上に存在する。
本発明の組み換えヘルペスウイルスにおいては、ペプチドは、ｇＨ糖タンパク質に融合又は挿入される。好ましくは、ペプチドは、配列ＩＤ番号１に係るｇＨのアミノ酸１９〜２３のいずれか（好ましくは１９）から始まりアミノ酸４８〜８８のいずれか（好ましくは８８）で終わり、好ましくはアミノ酸１９から始まりアミノ酸８８で終わり、アミノ酸６１から始まりアミノ酸６５で終わり、アミノ酸６９から始まりアミノ酸７２で終わり、若しくはアミノ酸７４から始まりアミノ酸８０で終わるｇＨのＮ末端領域内において挿入され、若しくはアミノ酸１１６から始まりアミノ酸１３６で終わる領域内において挿入され、又は相同ｇＨの対応領域内において挿入される。範囲６１〜６５、６９〜７２及び７４〜８０は、それらがｇＨのＨ１Ａドメインの露出ループ領域を代表し、従ってｇＨのＨ１Ａドメインの構造的完全性を保持する挿入点を代表することから、特に有用であると考えられる。より好ましい実施形態においては、ペプチドは、配列ＩＤ番号１に係るｇＨのアミノ酸１９から始まりアミノ酸５０で終わるｇＨのＮ末端領域内若しくは相同ｇＨの対応領域内において挿入される。更に好ましい実施形態においては、ペプチドは、配列ＩＤ番号１に係るｇＨのアミノ酸１９から始まりアミノ酸４８で終わるｇＨのＮ末端領域内若しくは相同ｇＨの対応領域内において挿入される。他のより好ましい実施形態においては、ペプチドは、配列ＩＤ番号１に係るｇＨのアミノ酸２３から始まりアミノ酸４８で終わるｇＨのＮ末端領域内若しくは相同ｇＨの対応領域内において挿入される。これら全ての実施形態において、ある領域の開始及び終わりを定義しているアミノ酸は、その領域に含まれ、即ち、挿入は、開始又は終わりのアミノ酸のＮ末端又はＣ末端のそばにある。最も好ましい実施形態においては、ペプチドは、配列ＩＤ番号１に係るｇＨのアミノ酸２３とアミノ酸２４の間に挿入され、又は相同ｇＨの対応領域（この場合には、上記アミノ酸２３及び２４に対応する）に挿入される。特定の実施形態においては、上述したようなＮ末端領域の１つ以上のｇＨアミノ酸が欠失している。関連する実施形態においては、ｇＨは切断されている。
他の実施形態においては、ペプチドは、ｇＨのＨ１ＡドメインのＮ末端側に挿入される。この点において、「Ｎ末端側に挿入される」というのは、Ｎ末端側のＨ１Ａドメインに隣接していることを意味するのではなく、Ｈ１ＡドメインのＮ末端側のどこかであることを意味する。ｇＨのＨ１Ａドメインは、ｇＨのＨ１ドメインのサブドメインである。Ｈ１ドメインは、配列ＩＤ番号１に係るｇＨタンパク質のアミノ酸４９からアミノ酸３２７まで伸び、Ｈ１Ａドメインは、配列ＩＤ番号１に係るｇＨタンパク質のアミノ酸４９からアミノ酸１１５まで伸びる(Chowdary et al., 2010)。多くのｇＨタンパク質はＨ１Ａドメインを有しており、Ｈ１Ａドメインは、水痘帯状疱疹ウイルス（ヒトヘルペスウイルス３）由来のｇＨの場合と同様に、配列ＩＤ番号１との配列アライメントにより又はＨ１ドメインとの構造的類似性により特定することができる。全てのヘルペスウイルスが配列ＩＤ番号１に係るｇＨタンパク質のアミノ酸１〜４８に対応する領域を有するｇＨを有しているとは限らない可能性がある。しかし、全ての成熟ｇＨは、Ｈ１ＡドメインのＮ末端側に少なくとも幾つかの、例えば１、２又は３つのアミノ酸を有している。一例はＥＢＶであり、この場合、１つの残基のみが成熟ペプチドにおけるＨ１Ａドメインに先行する（Ｈ１Ａドメインが、Ｘ線構造において現れる最初の残基、即ちｇＨ前駆体のＥＢＶ位置１９から始まると仮定して）。この先行する領域が極めて短い、例えば１０以下、５以下又は３以下のアミノ酸であるｇＨの場合、挿入はこれら残基の後（即ちＣ末端側）であると予想され、随意的には、これら残基は挿入の後で、即ち挿入とＨ１Ａドメインの間で繰り返されていると予想される。
ペプチドがｇＨに挿入されるという意味でここで参照される「挿入された」又は「挿入」という用語は、ｇＨ内への組み込みを参照し、組み込まれたペプチドは、直接的に、又は１つ以上のペプチドリンカー、より具体的には挿入部分に関して上流側及び／又は下流側に位置するペプチドリンカーを介して間接的に、ペプチド結合によって、ｇＨの２つのアミノ酸の間に導入される。リンカーはペプチドに直接連結される。ｇＨへのペプチドの融合はまた、配列ＩＤ番号１又は相同ｇＨによって例示されるｇＨ前駆体の、ｇＨのアミノ酸１の直前へのペプチド配列の挿入としても見ることができ、このような挿入をここでは融合と称する。融合又は挿入されたペプチドを担持しているｇＨは、ここではキメラｇＨと称される。キメラｇＨは、ビリオンエンベロープの一部である。「リンカー」の定義は上述したとおりである。
挿入及び融合は、好ましくは、ＨＳＶのゲノムにおけるｇＨ遺伝子の遺伝子操作によって実施される。ＨＳＶゲノムの遺伝子操作は当該分野において既知であり、限定はされないが、ＢＡＣ技術が例示される。
本発明の組み換えヘルペスウイルスのエンベロープ内に存在するペプチドは、ペプチドが結合可能な標的分子を発現し又は結合する任意の細胞に組み換えヘルペスウイルスが侵入することを可能にする。従って、ここで用いられる場合、標的分子は、細胞の表面上でアクセス可能であってペプチドによって結合され得る任意の細胞であってよい。好ましくは、標的分子は、組み換えヘルペスウイルスの増殖及び産生に用いられる標的細胞によって天然に産生されない人工分子であってよい。このように、ここで参照される「人工標的分子」の用語は、抗体等の、標的細胞によって天然に産生されない天然分子、又は天然には存在しない分子、即ち抗体誘導体等の非天然アミノ酸配列を有する分子であってよい。このような人工分子は、例えばダグラスら、１９９９及びナカムラら、２００５(Douglas et al., 1999; and Nakamura et al., 2005)に記載されているように、その表面上の細胞によって発現するように構築されてよく、あるいは細胞表面によって結合されてよい。人工標的分子は、ペプチドによって結合され得るように特異的に設計される。ペプチドによって結合される人工標的分子の例は、抗体又は抗体誘導体である。好ましい人工標的分子は、ｓｃＦｖ、より好ましくはＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖ、更に好ましくは配列ＩＤ番号１３により備えられるＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖ、更に好ましくは配列ＩＤ番号５により備えられるｓｃＦｖ(Zahnd et al., 2004)、最も好ましくは配列ＩＤ番号７の配列により特定される分子である。抗体又はその誘導体を産生するための方法は当該分野において知られており、ペプチドにより結合される標的分子を生成するためにこの方法を用いることができる。
本発明の最も好ましいペプチド‐標的分子対は、配列ＩＤ番号１３により特定されるペプチドと配列ＩＤ番号７の配列により特定される標的分子とである。
本発明の組み換えヘルペスウイルスは、キメラｇＨに加えて、参照によりここに組み込まれるＷＯ２００９／１４４７５５に開示されるような改変ｇＤ糖タンパク質を備えていてよいが、改変の種類には限定されない。改変ｇＤは、腫瘍細胞のような疾患細胞等の望ましくない細胞の排除のために、そのような細胞に組み換えヘルペスウイルスを再標的化するための改変を担持する。従って、ｇＤは、選択された最適な受容体、例えばＨＥＲ２受容体等の疾患細胞上の受容体にヘルペスウイルスの親和性を再アドレスする追加的なポリペプチド配列を備えていてよい。加えて、改変ｇＤは、ヘルペスウイルス親和性を天然受容体ネクチン１及びＨＶＥＭから脱標的化するアミノ酸部分６〜３８の欠失を担持してよい。あるいは、改変ｇＤは、脱標的化のための他の改変を担持してよい。ｇＤの改変は、排除されるべき疾患細胞上に天然に存在する標的分子に結合可能な異種ポリペプチドリガンドをｇＤに融合させ又は挿入することによって生じる。好ましいリガンドは、ＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞を排除するためにＨＥＲ２に向けられたｓｃＦｖである。本発明の組み換えヘルペスウイルスは、キメラｇＨに加えて、異種ポリペプチドリガンドを備えるように且つ腫瘍細胞のような疾患細胞等の望ましくない細胞の排除のためにそのような細胞に組み換えヘルペスウイルスを再標的化するように改変された改変ｇＢ糖タンパク質を備えていてよい。本発明の組み換えヘルペスウイルスは、キメラｇＨに加えて、改変ｇＤ及び／又は改変ｇＢ糖タンパク質を備えていてよい。ｇＨの改変は、細胞培養物中の細胞上にある標的分子への組み換えヘルペスウイルスの結合を介した細胞培養物中におけるインビトロな組み換えヘルペスウイルスの増殖及び産生に役立ち、一方、ｇＤ及び／又はｇＢの改変は、腫瘍細胞のような疾患細胞等の望ましくない細胞上に存在する標的分子への組み換えヘルペスウイルスの結合を介したそのような望ましくない細胞の死滅に役立つ。
ここで用いられる「疾患細胞」の用語は、生体に悪影響を及ぼし、従って望ましくない細胞を参照する。このような細胞を死滅させることは、生命を守ることができ、あるいは生体の健康を増強するので、そのような細胞の根絶が望まれている。好ましい実施形態においては、疾患細胞は異常増殖を特徴とし、より好ましくは細胞は腫瘍細胞である。代替的な実施形態においては、細胞は、慢性感染細胞等の感染細胞、変性疾患関連細胞又は老化細胞である。
腫瘍細胞の場合、基礎疾患は腫瘍であり、好ましくは副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳癌、未知の一次治療の癌、キャッスルマン疾患、子宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイングファミリーの腫瘍、眼癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン疾患、カポジ肉腫、腎臓癌、咽頭及び下咽頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔及び口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体部腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋腫、唾液腺癌、成人の軟組織肉腫癌、皮膚癌、小腸癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍からなる群から選択される腫瘍である。好ましい腫瘍疾患は、ＨＥＲ２陽性癌（乳癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、頭頸部癌、骨肉腫及び多形性膠芽腫など）、ＥＧＦＲ陽性癌（頭頸部癌、多形性膠芽腫、非小細胞肺癌、乳癌、結腸直腸及び膵臓癌など）、ＥＧＦＲ‐ｖＩＩＩ陽性癌（多形性膠芽腫など）、ＰＳＭＡ陽性癌（前立腺癌など）、ＣＤ２０＋陽性リンパ腫、並びにバーキットリンパ腫等のＢ細胞リンパ増殖障害、古典的ホジキンリンパ腫、及び免疫障害を持つ個体に生じるリンパ腫（移植後及びＨＩＶ関連リンパ増殖性障害）のようなＥＢＶ関連腫瘍、Ｔ細胞リンパ増殖性障害、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、鼻型節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫である。
感染細胞の場合、基礎疾患は慢性感染性疾患等の感染性疾患であり、感染因子はウイルス、バクテリア又はパラサイトであってよい。例は、結核、マラリア、慢性ウイルス性肝炎（ＨＢＶ、Ｄ型肝炎ウイルス及びＨＣＶ）、後天性免疫不全症候群（ＨＩＶ、ヒト免疫不全ウイルスによって引き起こされるＡＩＤＳ）、ＥＢＶ関連障害、又はＨＣＭＶ関連障害である。
変性疾患関連細胞の場合、基礎疾患は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ルーゲーリック病、変形性関節症、アテローム性動脈硬化症、シャルコーマリーツース病（ＣＭＴ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性脳症、糖尿病、エーラーダンロス症候群、本態性振戦(essential tremor)、フリードライヒ失調症、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、円錐角膜、球状角膜、黄斑変性症、マルファン症候群、多発性硬化症、多系統萎縮症、筋ジストロフィー、ニーマンピック病、骨粗しょう症、パーキンソン病、進行性核上麻痺、前立腺炎、網膜色素変性症、関節リウマチ、又はテイサックス病であってよい。「変性疾患関連細胞」の用語は、疾患と関連する細胞を参照し、細胞の変化が疾患の進行に寄与するか、あるいは疾患の結果として細胞が変化することを意味する。その細胞を破壊すると、その疾患の治療がもたらされる。
老化細胞の場合、基礎疾患は、（ｉ）早期老化を特徴とする早老症候群と呼ばれる希少遺伝的疾患：ウェルナー症候群（ＷＳ）、ブルーム症候群（ＢＳ）、ロスムンドトムソン症候群（ＲＴＳ）、コケーン症候群（ＣＳ）、色素性乾皮症（ＸＰ）、硫黄欠乏性毛髪発育異常症(trichothiodystrophy)若しくはハッチンソンギルフォードプロジェリア症候群（ＨＧＰＳ）又は（ｉｉ）肥満、２型糖尿病、サルコペニア、変形性関節症、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、白内障、神経変性疾患、全身性自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、又はシェーグレン症候群）、若しくは多発性硬化症等の共通年齢関連疾患、等の老化関連疾患である。
本発明の組み換えヘルペスウイルスは、例えば、ウイルス遺伝子ｙ１３４．５、ＵＬ３９、及び／又はＩＣＰ４７等の、ウイルス毒性を弱毒化するものとして知られている遺伝子の欠失又は変化によって弱毒化されてよい。「弱毒化された」という用語は、弱められた又は毒性がより小さくされたヘルペスウイルスを参照する。条件付き弱毒化が好ましく、弱毒化は非疾患細胞のみに影響する。より好ましくは、腫瘍細胞等の疾患細胞のみが、ヘルペスウイルスの完全な毒性によって影響を受ける。条件付き弱毒化は、例えば、ｙ１３４．５、ＵＬ３９及び／又はＩＣＰ４７遺伝子のプロモーター領域を疾患細胞においてのみ発現されるヒト遺伝子のプロモーター（例えば、腫瘍細胞中のサバイビンプロモーター）で置換することによって達成される。条件付き弱毒化のための更なる改変は、ＩＣＰ‐４プロモーター領域のようなＩＥ遺伝子（前初期遺伝子）の転写に関与する制御領域を疾患細胞においてのみ発現される遺伝子のプロモーター領域（例えばサバイビンプロモーター）で置換することを含んでいてよい。この変更の結果、条件的複製型ＨＳＶ(replication conditional HSV)がもたらされ、これは疾患細胞内では複製し得るが、正常細胞内では複製し得ない。ウイルスの追加的な改変は、正常細胞内では豊富であるが腫瘍細胞内では豊富ではないマイクロＲＮＡｓ（ｍｉＲｓ）に応答する配列要素をＩＣＰ４のような必須ＨＳＶ遺伝子の３´非翻訳領域(3´ untranslated region)内に挿入することを含んでいてよい。その結果も、正常細胞内でのみ複製能力のないウイルスとなる。
本発明の組み換えヘルペスウイルスは、更に、上記で定義した細胞、好ましくは疾患細胞に対する宿主免疫応答を刺激する１つ以上の分子をコードしてよい。宿主免疫応答を刺激する分子は、「免疫療法分子(immunotherapy molecule)」とも称される。従って、本発明の組み換えヘルペスウイルスは、組合わされた腫瘍溶解性及び免疫療法ウイルス(combined oncolytic and immunotherapeutic virus)であってよい。免疫療法ウイルスは、細胞に対する宿主免疫応答を増強する分子をコードするウイルス、即ち細胞に対して向けられるように宿主免疫応答を刺激する分子をコードするウイルスである。そのようなウイルスの例は、Ｔ‐ＶＥＣである（Liu et al., 2003）。
免疫療法分子は、組み換えウイルスが、疾患細胞を死滅させるためにヘルペスウイルスを疾患細胞に再標的化するための糖タンパク質の改変に加えて、特異的又は非特異的な様式で被験体の免疫系を刺激することを可能にする。被験体における組み換えウイルスによる免疫療法分子の発現は、最終的に疾患細胞の死滅をもたらす免疫応答を引き起こすことができる。免疫療法は特異的に作用してよく、免疫療法分子は、１つ以上の細胞上に存在する１つ又は幾つかの特異抗原に対する被験体の免疫系を刺激する。例えば、免疫療法分子は、特異的細胞表面受容体、例えばＣＤ２０、ＣＤ２７４、及びＣＤ２７９に対して向けられる抗体であってよい。一旦抗原に結合すると、抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)を引き起こすことができ、補体系を活性化することができ、あるいは受容体がそのリガンドと相互作用するのを防ぐことができる。その全てが細胞死をもたらすことができる。好ましい細胞は腫瘍細胞である。この技術は当該分野において既知であり認められている。アレムツズマブ(Alemtuzumab)、イピリムマブ(Ipilimumab)、ニボルマブ(Nivolumab)、オファツムマブ(Ofatumumab)、及びリツキシマブ(Rituximab)を含む、癌を治療するために認められた複数の抗体がある。あるいは、免疫療法分子は、被験体の免疫系を刺激することによって非特異的に作用することができる。免疫療法分子の例は、なかでもサイトカイン、ケモカイン又は免疫チェックポイント制御因子である。例えば、幾つかのサイトカインは、抗腫瘍活性を増強する能力を有し、受動的癌治療として使用することができる。サイトカインの免疫療法分子としての使用は、当該分野において既知である。サイトカインの例は、ＧＭ‐ＣＳＦ、インターロイキン２(interleukin-2)、インターロイキン１２、又はインターフェロンαである。ＧＭ‐ＣＳＦは、例えば、ホルモン抵抗性前立腺癌(hormone-refractory prostate cancer)又は白血病の治療に使用される。インターロイキン２は、例えば、悪性黒色腫及び腎細胞癌の治療に使用される。ＩＬ‐１２は、膠芽細胞腫の実験的治療に使用される。インターフェロンαは、例えば、有毛細胞白血病、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫、濾胞性リンパ腫、慢性骨髄性白血病及び悪性黒色腫の治療に使用される。
第２の側面においては、本発明は、本発明のヘルペスウイルスと薬学的に許容可能な担体とを備える医薬組成物を提供し、この医薬組成物は、随意的には、細胞、好ましくは上述したような疾患細胞に対する宿主免疫応答を刺激する１つ以上の分子を追加的に備える。本発明の組み換えヘルペスウイルスは、薬剤として使用することができる。薬剤の製造のために、ヘルペスウイルスは、本発明の組み換えヘルペスウイルスと、所望の特性を提供する薬学的に許容可能な担体等の含有物(ingredients)の混合物と、を備える薬学的投薬形態(pharmaceutical dosage form)である必要がある。医薬組成物は、当業者に知られている１つ以上の適切な薬学的に許容可能な担体を備える。医薬組成物は、細胞に対する宿主免疫応答を刺激する１つ以上の分子を追加的に備えていてよい。細胞に対する宿主免疫応答を刺激する分子の定義は、本発明の第１の側面において上記で参照されている。
医薬組成物は、全身、鼻、非経口、膣、局所(topic)、膣、腫瘍内投与のために製造することができる。非経口投与(parental administration)は、皮下、皮内、筋肉内、静脈内又は腹腔内投与を含む。
医薬組成物は、カプセル、タブレット、ピル、粉末及び顆粒等の経口投与のための固形投与形態、医薬的に許容可能なエマルジョン、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシル剤等の経口投与のための液体投与形態、注射用製剤、例えば無菌注射剤又は油性懸濁液、直腸又は膣投与のための組成物、好ましくは座薬、並びに軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入又はパッチ等の局所又は経皮投与のための投薬形態を含む種々の投薬形態として処方することができる。
任意の特定の被験体に対する特異的な治療上有効な用量レベルは、本発明の組み換えヘルペスウイルスの活性、投与形態、被験体の年齢、体重及び性別、医学分野において周知の治療期間及び同様の要因を含む種々の要因に依存する。
単回又は複数回の用量で被験体に投与される本発明の化合物の総用量は、例えば１０３〜１０１０の量であってよい。単回用量組成物は、１日用量を準備するような量又はその約数を含有していてよい。組み換えヘルペスウイルスの投与量は、プラーク形成単位（ｐｆｕ）の数として定義されてよい。投与量の例は、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、又は１０１０を含む。
本発明の組み換えヘルペスウイルスは、疾患細胞がそれらの表面上に特異的な標的分子を発現する疾患を治療するのに役立つであろうし、それらの標的分子は、細胞の外側からアクセス可能であり、正常細胞によっては産生されることがなく、あるいは正常細胞によって産生されたとしてもより低い程度である。正常細胞は、それぞれの正常細胞であってもよい。「それぞれの」は、疾患細胞と正常細胞が同じ起源であることを意味するが、疾患発生の影響により疾患細胞内には細胞が発現する一方で、同じ起源の他の細胞は健康なままである。
第３の側面においては、本発明は、腫瘍、感染、変性疾患又は老化関連疾患の治療における使用のための本発明の組み換えヘルペスウイルスを提供し、この組み換えヘルペスウイルスは、随意的に、細胞、好ましくは疾患細胞に対する宿主免疫応答を刺激する１つ以上の分子と組み合わされる。本発明の組み換えヘルペスウイルス、及び細胞に対する宿主免疫応答を刺激する分子は、同じ医薬組成物内又は異なる医薬組成物内に存在することができる。それらが異なる医薬組成物内に存在する場合には、それらは、同時に投与されてよく、あるいはその分子の前にヘルペスウイルス又はヘルペスウイルスの前にその分子というように続けて投与されてもよい。ヘルペスウイルス又はその分子は、異なる頻度及び／又は時点で投与されてよい。しかし、併用治療は、ヘルペスウイルス及びその分子が、疾患の同時治療を可能にする時間間隔及び／又は時点で投与されることを備える。
また、本発明は、本発明の組み換えヘルペスウイルスの薬学的に効果的な量を投与することによって、腫瘍、感染、変性疾患又は老化関連疾患を有する被験体を治療する方法を開示する。
本発明の組み換えヘルペスウイルスは、細胞、好ましくは疾患細胞に対する宿主免疫応答を刺激する更なる治療及び／又は被験体の特異的疾患を治療するために役立つ更なる治療と組み合わせて被験体に投与されてよい。このような更なる治療は、他の薬物、化学療法、放射線療法、免疫療法、併用ウイルス療法等を含んでいてよい。
また、本発明は、腫瘍、感染、変性疾患又は老化関連疾患の治療用の医薬組成物の調製のための本発明の組み換えヘルペスウイルスの使用を開示し、この組み換えヘルペスウイルス又はその使用は、随意的に、細胞、好ましくは疾患細胞に対する宿主免疫応答を刺激する１つ以上の分子と組み合わされる。
本発明の組み換えヘルペスウイルスによって治療される被験体は、好ましくはヒトである。
第４の側面においては、本発明は、ペプチド、好ましくは配列ＩＤ番号１３により備えられるＧＣＮ４酵母転写因子の一部、より好ましくは配列ＩＤ番号１３の配列、を融合又は挿入した本発明のキメラｇＨをコードする核酸を備える核酸分子を提供する。核酸分子は、本発明の組み換えヘルペスウイルスのゲノム又はその一部であってよい。好ましくは、核酸分子は、ｇＨ糖タンパク質のシグナル配列を含むキメラｇＨの前駆体形態をコードする。キメラｇＨがそのＮ末端アミノ酸にペプチドを保持するように操作された場合、対応する核酸は、シグナル配列の最後のアミノ酸と成熟タンパク質の最初のアミノ酸との間に挿入されたペプチドの核酸配列を有する。
第５の側面においては、本発明は、核酸分子を備えるベクターを提供する。適切なベクターは当該分野で既知であり、プラスミド、コスミド、人工染色体（例えばバクテリア、酵母又はヒト）、バクテリオファージ、ウイルスベクター（レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス）、特にバキュロウイルスベクター、又はナノ操作物質(nano-engineered substances)（例えば、オルモシル(ormosils)）を含む。一実施形態においては、ベクターは、特に１以上の核酸塩基の欠失、挿入及び／又は変異によって、その毒性が好ましくはウイルスベクターの場合に弱毒化されるように、又はベクターが疾患細胞内では条件的に複製するが、非疾患細胞内では複製しないように、改変される。例えば、γ１３４．５遺伝子、ＵＬ３９遺伝子、ＩＣＰ４７遺伝子の１つ又は両方のコピーの欠失は、ウイルスの弱毒化をもたらす。「弱毒化」又は「弱毒化された」は、弱められた又は毒性がより小さくされた毒性ウイルスを参照する。
また、疾患細胞、例えば腫瘍細胞においてのみ発現されるヒト遺伝子のプロモーター（例えば、腫瘍細胞中のサバイビンプロモーター）によるγ１３４．５遺伝子のプロモーター領域の置換も含まれ、これにより、非疾患細胞における弱毒化表現型(attenuated phenotype)及び疾患細胞における非弱毒化表現型がもたらされる。更なる改変は、ＩＣＰ‐４プロモーター領域のようなＩＥ遺伝子の転写に関与する制御領域を疾患細胞においてのみ発現される遺伝子のプロモーター（例えばサバイビンプロモーター）で置換することを含んでいてよい。この変更により、疾患細胞内では複製し得るが、正常細胞内では複製し得ない条件的複製型ヘルペスウイルス(replication conditional herpesvirus)が産生される。ウイルス子孫の増殖のための細胞培養細胞は、高レベルの特異的プロモーター活性化タンパク質(specific promoter activating proteins)をもたらし、高いウイルス収量の産生を可能にする。
第６の側面においては、本発明は、ペプチド、好ましくは配列ＩＤ番号１３により備えられるＧＣＮ４酵母転写因子の一部、より好ましくは配列ＩＤ番号１３の配列、を融合又は挿入したキメラｇＨを備えるポリペプチドを提供する。
第７の側面においては、本発明は、本発明の組み換えヘルペスウイルス、本発明の核酸分子、本発明のベクター、又は本発明のポリペプチドを備える細胞を提供する。
その実施形態においては、細胞は、ヘルペスウイルスの増殖に適した培養細胞、より好ましくはヘルペスウイルスの増殖のために認められた細胞株、更に好ましくはＶｅｒｏ、２９３、２９３Ｔ、ＨＥｐ‐２、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、又はＲＳ細胞、最も好ましくはＶｅｒｏ細胞である。
本発明の第８の側面又は第７の側面の実施形態においては、本発明は細胞を提供し、その細胞は、本発明の組み換えヘルペスウイルスにより備えられるペプチド、好ましくはＧＣＮ４酵母転写因子の一部、最も好ましくはその細胞の表面上でアクセス可能な、配列ＩＤ番号１３により備えられるＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能な人工分子を備え、好ましくは、人工分子は、抗体、より好ましくは抗体誘導体、更に好ましくはｓｃＦｖ、更に好ましくはＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖ、更に好ましくは配列ＩＤ番号１３により備えられるＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖ、更に好ましくは配列ＩＤ番号５により備えられるｓｃＦｖ、最も好ましくは配列ＩＤ番号７の配列により特定される分子である。
ここで用いられる「細胞」の用語は、標的分子を担持し、本発明の組み換えヘルペスウイルスが感染することができ、ヘルペスウイルスを産生することができる任意の細胞である。ヒトにおける腫瘍細胞のような疾患細胞のＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質等の物質の導入を避けるために、疾患細胞におけるヘルペスウイルスの増殖は回避されるべきであるので、ヘルペスウイルスを産生するための細胞は、ヒトに存在する場合に有害である可能性のある物質を産生しない安全な細胞、例えば非疾患細胞である。その細胞は細胞株として存在してもよい。好ましくは、その細胞はヘルペスウイルスの増殖に適した培養細胞であり、更に好ましくは、その細胞はヘルペスウイルス増殖のために認められた細胞株であり、更に好ましくは、その細胞はＶｅｒｏ、２９３、２９３Ｔ、ＨＥｐ‐２、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、又はＲＳ細胞であり、それによりＶｅｒｏ細胞が特に好ましい。その細胞は、人工標的分子を発現し又は人工標的分子に結合するように改変されてよい。より好ましくは、その細胞は、標的分子として抗体誘導体、更に好ましくはｓｃＦｖ、更に好ましくはＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖ、更に好ましくは配列ＩＤ番号１３により備えられるＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖ、更に好ましくは配列ＩＤ番号５により備えられるｓｃＦｖ、最も好ましくは配列ＩＤ番号７の配列により特定される分子を備える。
「培養」細胞は、当該分野で知られているように、維持及び増殖されたインビトロ細胞培養物中に存在する細胞である。培養細胞は、一般にそれらの自然環境の外で、制御された条件下で増殖する。通常、培養細胞は、多細胞真核生物、特に動物細胞に由来する。「ヘルペスウイルスの増殖のために認められた細胞株」は、ヘルペスウイルスが感染することが既に示されている、即ちウイルスが細胞に侵入し増殖してウイルスを産生できることが既に示されている任意の細胞株を含むことを意味する。細胞株は、単一の細胞に由来し、同じ遺伝子組成を含む細胞の集団である。組み換えヘルペスウイルスの増殖及び産生のための好ましい細胞は、Ｖｅｒｏ、２９３、２９３Ｔ、ＨＥｐ‐２、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、又はＲＳ細胞である。
第９の側面においては、本発明は、本発明のヘルペスウイルスを用いて細胞において組み換えヘルペスウイルスを産生するためのインビトロな方法を提供し、その細胞は、本発明の組み換えヘルペスウイルスにより備えられるペプチド、好ましくはＧＣＮ４酵母転写因子の一部、最も好ましくはその細胞の表面上でアクセス可能な、配列ＩＤ番号１３により備えられるＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能な人工分子を備え、好ましくは、人工分子は、抗体、より好ましくは抗体誘導体、更に好ましくはｓｃＦｖ、更に好ましくはＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖ、更に好ましくは配列ＩＤ番号１３により備えられるＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖ、更に好ましくは配列ＩＤ番号５により備えられるｓｃＦｖ、最も好ましくは配列ＩＤ番号７の配列により特定される分子である。
本発明の最も好ましい細胞は、配列ＩＤ番号１３により特定されるＧＣＮ４ペプチドに結合可能なｓｃＦｖを備える配列ＩＤ番号７の配列を有する分子を標的分子として発現するＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞株である。Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞株は、とりわけＨＥＲ２陽性細胞に再標的化され且つ天然ヘルペスウイルス受容体からは脱標的化されたヘルペスウイルス組み換え体の培養を可能にする目的に役立つ。ＨＥＲ２は腫瘍遺伝子であり、ＨＥＲ２陽性細胞は癌細胞であるので、ヒトにおける腫瘍由来物質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質）の偶発的な導入の可能性を避けるために、ヒトの使用に供される腫瘍溶解性ヘルペスウイルス組み換え体の癌細胞内増殖は避けることが望ましい。Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞株及び随伴ＨＥＲ２再標的化ヘルペスウイルスの構築の根拠は次の通りであった。Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞は、ネクチン１の細胞外ドメイン２及び３、膜貫通部(transmembrane)（ＴＭ）並びにＣ尾部に融合したペプチドＧＣＮ４に対するｓｃＦｖから作られた人工受容体を発現する。逆に、ＨＥＲ２再標的化ヘルペスウイルスは、エンベロープ糖タンパク質の１つにおいてＧＣＮ４ペプチドを発現する。この点を考慮すると、組み換えウイルスは、（癌細胞に感染するための）ＨＥＲ２に、及び（ウイルスの増殖及び産生を目的としてＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞株に感染するための）ＧＣＮ４ペプチドに、同時に再標的化される。以下に説明する例示的なシステムにおいては、Ｒ‐ＶＧ２１３と命名された組み換えＨＳＶは、ＡＡ６〜３８（これらは最終的なウイルスから欠失している）の代わりにｇＤに融合されたＨＥＲ２に対するｓｃＦｖを担持し、またｇＨのＡＡ２３及び２４の間に融合されたＧＣＮ４ペプチドを担持する。
細胞内でヘルペスウイルスを増殖させるための適切な技術及び条件は、当該分野において既知であり(Florence et al., 1992; Peterson and Goyal, 1988)、ヘルペスウイルスを細胞と共に培養することと感染した細胞培養物の培地からヘルペスウイルスを回収することとを含む。
ＧＣＮ４に対するｓｃＦｖ‐ネクチン受容体のキメラの概略図。受容体は、Ｎ末端リーダーペプチド及びＨＡタグ配列(N-terminal leader peptide and HA tag sequence)を提示し、２つの短いリンカー、即ちＧＡ及びＧＳＧＡリンカーの間に位置する、ＧＣＮ４に対するｓｃＦｖがそれに続く。分子の第２の部分は、ネクチン１細胞外ドメイン２及び３とＴＭセグメントと細胞内細胞質尾部(intracellular cytoplasmic tail)とを備えるヒトネクチン１（ＰＶＲＬ１）残基Ｍｅｔ１４３〜Ｖａｌ５１７に対応する。 Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４陽性細胞の安定性。ｓｃＦｖＧＣＮ４‐ネクチン受容体の発現をＨＡタグに対するＭＡｂによるＦＡＣＳによって分析した。これらの図は、１０、１５、３０、４０継代でのＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４クローン１１．２細胞からの陽性細胞のパーセンテージを示す。結果：人工受容体の発現が連続４０継代後も安定したままであった。 Ｒ‐ＶＧ２１３のゲノム構成。ＨＳＶ‐１ゲノムの配列配置は、逆向き反復ＩＲ配列(inverted repeat IR sequences)を長方形の箱として示す。ｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２配列（ＶＬ‐リンカー‐ＶＨ）は、上流及び下流Ｇｌｙ‐Ｓｅｒリンカーによって挟まれた(bracketed)ｇＤの位置Δ６〜３８に挿入される。ＬＯＸ‐Ｐブラケットｐ‐Ｂｅｌｏ‐ＢＡＣ及びＥＧＦＰ配列(LOX-P-bracketed p-Belo-BAC and EGFP sequences)は、ＵＬ３〜ＵＬ４領域の間に挿入される。ＧＣＮ４ペプチドをコードする配列は、ｇＨのＡＡ位置２３〜２４で操作される。 Ｒ‐ＶＧ２１３及びＲ‐ＬＭ１１３の親和性。Ｊ細胞はｗｔ‐ＨＳＶに対する受容体を発現しない。Ｊ‐ＨＥＲ２、Ｊ‐ネクチン１、Ｊ‐ＨＶＥＭは示された受容体のみを発現する。示された細胞をＲ‐ＶＧ２１３（パネルａ〜ｋ）又はＲ‐ＬＭ１１３（パネルｌ〜ｖ）により感染させ、蛍光顕微鏡によりＥＧＦＰについてモニタリングした。パネルｂ、ｄ、ｆ、ｈ及びｍ、ｏ、ｑ、ｓの細胞を、中和用量（２８μｇ／ｍｌ）でハーセプチン／トラスツズマブ(Herceptin/Trastuzumab)の存在下で感染させた。Ｒ‐ＶＧ２１３は、Ｊ‐ＨＥＲ２細胞（ｇ）に加えて、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞（ｃ）及びＨＥＲ２陽性癌細胞株ＳＫ‐ＯＶ‐３（ｅ）の両方に感染する。Ｒ‐ＶＧ２１３は、ｗｔ‐Ｖｅｒｏ細胞にも感染し、これはＨＥＲ２のサルオルソログ(simian ortholog)を発現する（ａ）。ハーセプチンは、ｗｔ‐Ｖｅｒｏ、ＳＫ‐ＯＶ‐３及びＪ‐ＨＥＲ２細胞（ｂ、ｆ、ｈ）のＲ‐ＶＧ２１３感染を阻害するが、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞（ｄ）のＲ‐ＶＧ２１３感染は阻害しない。Ｒ‐ＶＧ２１３は、Ｊ‐ネクチン１、Ｊ‐ＨＶＥＭ及びｗｔ‐Ｊ細胞（ｉ、ｊ、ｋ）には感染しない。ＨＥＲ２に再標的化されているがＧＣＮ４ペプチドには再標的化されていない親世代のＲ‐ＬＭ１１３は、ＨＥＲ２陽性細胞に感染し（ｌ、ｎ、ｐ、ｒ）、ハーセプチンで処理したＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞には感染しない（ｏ）。 Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞におけるＲ‐ＶＧ２１３及びＲ‐ＬＭ５の収量。Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞におけるＲ‐ＶＧ２１３複製の程度をＲ‐ＬＭ５ウイルスの複製の程度と比較した。Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞をＲ‐ＶＧ２１３又はＲ‐ＬＭ５によりＭＯＩ０．１ＰＦＵ／細胞で感染させた（Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４において接種物を滴定）。感染後０、２４及び４８時間にサンプルを採取し、子孫ウイルスをＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞において滴定した。 ＳＫ‐ＯＶ‐３細胞におけるＲ‐ＶＧ２１３、Ｒ‐ＬＭ１１３、Ｒ‐ＬＭ５の収量、及びＳＫ‐ＯＶ‐３細胞の細胞外培地における子孫Ｒ‐ＶＧ２１３放出の程度。（Ａ、Ｂ）ＳＫ‐ＯＶ‐３細胞におけるＲ‐ＶＧ２１３複製の程度をＲ‐ＬＭ１１３及びＲ‐ＬＭ５ウイルスの複製の程度と比較した。ＳＫ‐ＯＶ‐３細胞をＭＯＩ０．１ＰＦＵ／細胞（パネルＡ）又はＭＯＩ０．０１ＰＦＵ／細胞（パネルＢ）で感染させた（ＳＫ‐ＯＶ‐３細胞において接種物を滴定）。感染後０、２４及び４８時間にサンプルを採取し、子孫ウイルスをＳＫ‐ＯＶ‐３細胞において滴定した。（Ｃ）ＳＫ‐ＯＶ‐３細胞をパネルＡにおけるのと同様にＲ‐ＶＧ２１３又はＲ‐ＬＭ１１３によりＭＯＩ０．１ＰＦＵ／細胞で感染させた（ＳＫ‐ＯＶ‐３細胞において接種物を滴定）。感染後４８時間にサンプルを採取し、感染後４８時間にサンプルを採取し、細胞外培地に放出された子孫ビリオン、細胞結合画分(cell-associated fraction)内に存在する子孫ビリオン、又は細胞結合プラス培地の子孫ビリオンを滴定した。 異なる細胞株におけるＲ‐ＶＧ２１３のコロニー形成率(plating efficiency)。（Ａ）Ｒ‐ＶＧ２１３の複製分量(replicate aliquots)をＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４、ｗｔ‐Ｖｅｒｏ、ＳＫ‐ＯＶ‐３及びＪ‐ＨＥＲ２細胞に播種し、３日後にプラークを数えた。（Ｂ）異なる細胞株におけるＲ‐ＶＧ２１３の相対的プラークサイズ。Ｒ‐ＶＧ２１３、Ｒ‐ＬＭ１１３及びＲ‐ＬＭ５の複製分量をＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４、Ｗｔ‐Ｖｅｒｏ及びＳＫ‐ＯＶ‐３に播種した。感染後３日にプラークを蛍光顕微鏡で分析した。
配列
配列ＩＤ番号１：ｇＨ野生型、ＨＳＶ‐１由来の前駆体（ヒトヘルペスウイルス１ Ｆ株、ジェンバンク(GenBank)アセッション番号：ＧＵ７３４７７１．１；位置４３７４１〜４６４９８によりコードされたｇＨ）のアミノ酸配列。
配列ＩＤ番号２：キメラｇＨ‐ＧＣＮ４のヌクレオチド配列。
配列ＩＤ番号３：構築物Ｒ‐ＶＧ２１３によりコードされた、アミノ酸２３及び２４の間にＧＣＮ４ペプチドを挿入したｇＨ前駆体（配列ＩＤ番号１）のアミノ酸配列。ＧＣＮ４ペプチドにはＧｌｙ‐Ｓｅｒリンカーが隣接している。
配列ＩＤ番号４：ヒトコドン使用(human codon usage)に最適化され、シグナル配列及びＨＡタグを形成する９６ヌクレオチドに先行される、ＧＣＮ４ペプチドに対するｓｃＦｖのヌクレオチド配列。
配列ＩＤ番号５：シグナル配列及びＨＡタグを構成する３３ＡＡに先行される、ＧＣＮ４ペプチドに対するｓｃＦｖ（ジェンバンク１Ｐ４Ｂ）のアミノ酸配列。ＧＣＮ４ペプチドに対するｓｃＦｖの配列はアミノ酸３３から始まる。
配列ＩＤ番号６：ｓｃＦｖ‐ＧＣＮ４ネクチン１キメラのヌクレオチド配列。
配列ＩＤ番号７：ｓｃＦｖ‐ＧＣＮ４ネクチン１キメラのアミノ酸配列。
配列ＩＤ番号８：プライマーｇＨ５＿ｇａｌＫ＿ｒ
配列ＩＤ番号９：プライマーｇＨ６＿ｇａｌＫ＿ｆ
配列ＩＤ番号１０：プライマーｇａｌＫ＿１２９＿ｆ
配列ＩＤ番号１１：プライマーｇａｌＫ＿４１７＿ｒ
配列ＩＤ番号１２：ＧＣＮ４ペプチドカセット‐上流及び下流ＧＳリンカーにより挟まれたＧＣＮ４ペプチドのヌクレオチド配列。
配列ＩＤ番号１３：ＧＣＮ４ペプチド‐上流及び下流ＧＳリンカーにより挟まれたＧＣＮ４ペプチドのアミノ酸配列。
配列ＩＤ番号１４：サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＧＣＮ４ｍＲＮＡ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/15811626/)に由来するＧＣＮ４エピトープ。
配列ＩＤ番号１５：オリゴヌクレオチドＧＣＮ４ｇＨ＿２３＿４２＿ｆＢ
配列ＩＤ番号１６：オリゴヌクレオチドＧＣＮ４ｇＨ＿２３＿２４＿ｒＢ
配列ＩＤ番号１７：プライマーｇＨ＿ｅｘｔ＿ｒパリーノ(pallino)
配列ＩＤ番号１８：プライマーｇＨ＿２１７６＿２２００＿ｆ
配列ＩＤ番号１９：ジェンバンクアセッション番号ＡＪ５８５６８７．１（ＧＣＮ４酵母転写因子をコードする遺伝子）
配列ＩＤ番号２０：ＧＣＮ４酵母転写因子ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ‐Ｐ０３０６９（ＧＣＮ４＿ＹＥＡＳＴ）のアミノ酸配列
実施例１：Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞株の生成
ＶｅｒｏＧＣＮ４細胞株は、ネクチン１に融合した、ＧＣＮ４ペプチドに対するｓｃＦｖ(Zahnd et al., 2004)から作られる人工キメラ受容体を発現する。より詳細には、ｐＤＩＳＰＬＡＹ（インビトロジェン）(pDISPLAY (Invitrogen))ベクターにおけるのと同様に、Ｎ末端シグナルペプチド及びＨＡタグ配列が存在する。これは、リーダーペプチドの効率的で適切なプロセシングを確実にするはずである。ＨＡタグの後に、短いＧＡリンカーがｓｃＦｖの上流に存在する。ヒトコドン使用(human codon usage)に最適化された配列を有する、ＧＣＮ４に対するｓｃＦｖのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号４及び５において報告されており、これらの配列には、ｓｃＦｖの配列に先行するシグナルペプチド配列及びＨＡタグの配列が含まれる。ｓｃＦｖのＣ末端に短いＧＳＧＡリンカーが存在する。残りの分子は、ネクチン１細胞外ドメイン２及び３とＴＭセグメントと細胞内細胞質尾部(intracellular cytoplasmic tail)とを備えるヒトネクチン１（ＰＶＲＬ１）残基Ｍｅｔ１４３〜Ｖａｌ５１７に対応する（図１）。キメラを遺伝子技術(Gene Art)によりインビトロで合成し、ｐｃＤＮＡ３．１‐Ｈｙｇｒｏ（＋）へとクローン化させた結果、プラスミドｓｃＦｖ＿ＧＣＮ４＿ネクチン１キメラがもたらされ、その挿入部分(insert)は、配列ＩＤ番号６として報告されたヌクレオチド配列と配列ＩＤ番号７として特定されたアミノ酸配列とを有する。
プラスミドｓｃＦｖ＿ＧＣＮ４＿ネクチン１キメラからのＤＮＡをリポフェクタミン２０００によりＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ‐８１（商標））にトランスフェクトした。ＧＣＮ４ペプチドに対する人工受容体を発現するＶｅｒｏ細胞をハイグロマイシン（２００μｇ／ｍｌ）により選択し、次いでＨＡタグに対するＭＡｂと組み合わされた磁気ビーズ（ミルテニー（Miltenyi））によりソートした。ソートした細胞を９６ウェル（０．５細胞／ウェル）で単一細胞クローニングに付した。
ＨＡタグに対するＭＡｂによるＧＣＮ４ペプチドに対するｓｃＦｖの発現の検出のためのＦＡＣＳにより単一クローンを分析した。選択されたクローンは１１．２であった。
実施例２：Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞の安定性
本発明者らは、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞株の連続継代中に人工受容体の発現が連続４０継代後も安定したままであることを確認した（図２）。
実施例３：ＧＣＮ４ペプチドを担持している遺伝子操作ｇＨと、ＨＥＲ２に向けられた一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）（ｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２）を担持しているｇＤと、レポーター遺伝子(reporter gene)としてのｅＧＦＰと、を発現するＲ‐ＶＧ２１３と命名されたＨＳＶ組み換え体（図３）の説明。
以下は、ＨＳＶｇＨのＡＡ２３及び２４の間への、ＧＣＮ４ペプチドをコードする配列の挿入の説明である。挿入は、欠失配列ＡＡ６〜３８の代わりにｇＤにおいてｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２を発現するＲ‐ＬＭ１１３と命名されたＨＳＶ組み換え体において行われた。具体的には、ＧＣＮ４ペプチドをコードする配列は、ＡＡ１〜１８を包含するシグナル配列の切断(cleavage)後の成熟ｇＨにおけるＡＡ５及び６に対応する非成熟ｇＨのＡＡ２３及び２４の間に挿入された。開始ゲノムは、ｇＤのＡＡ６〜３８の代わりのｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２と、ＨＳＶ‐１ゲノムのＵＬ３及びＵＬ４の間に挿入されたＬＯＸ‐ＰブラケットｐＢｅｌｏＢＡＣ１１及びｅＧＦＰ配列と、を担持するＢＡＣＬＭ１１３であった(Menotti et al., 2008)。組み換えは、ｇａｌＫ組み換え技術(galK recombineering)により行った。ＧＣＮ４ペプチドをｇＨに挿入するために、ｐＧａｌＫをテンプレートとして用い、プライマーｇＨ５＿ｇａｌＫ＿ｒ TCGTGGGGGTTATTATTTTGGGCGTTGCGTGGGGTCAGGTCCACGACTGGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT（配列ＩＤ番号８）及びｇＨ６＿ｇａｌＫ＿ｆ ATGCGGTCCATGCCCAGGCCATCCAAAAACCATGGGTCTGTCTGCTCAGTCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA（配列ＩＤ番号９）により、ｇＨへの相同アームを有するｇａｌＫカセットを増幅した。このカセットを、ＢＡＣＬＭ１１３を担持しているＳＷ１０２バクテリア内で電気穿孔した。ｇａｌＫカセットを担持している組み換えクローンを、１ｍｇ／ＬのＤビオチン、０．２％ガラクトース、４５ｍｇ／ＬのＬロイシン、１ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び１２μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補給したＭ６３培地（１５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．８μｇのＦｅＳＯ４・Ｈ２Ｏ、ｐＨ７に調整）を含むプレート上で選択した。ｇａｌＫ偽陽性バクテリアコロニーを除外するために、１％ガラクトース及び１２μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補給したマッコンキー(MacConkey)寒天ベースプレートにもストリークし、プライマーｇａｌＫ＿１２９＿ｆ ACAATCTCTGTTTGCCAACGCATTTGG（配列ＩＤ番号１０）及びｇａｌＫ＿４１７＿ｒ CATTGCCGCTGATCACCATGTCCACGC（配列ＩＤ番号１１）を用いたコロニーＰＣＲによりチェックした。次いで、制限分析によるコロニーのスクリーニングに有用なＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼのためのサイレント制限部位(silent restriction site)を導入する合成オリゴヌクレオチドＧＣＮ４ｇＨ＿２３＿４２＿ｆＢ TCGTGGGGGTTATTATTTTGGGCGTTGCGTGGGGTCAGGTCCACGACTGGGGATCCAAGAACTACCACCTGGAGAACGAGGTGGCCAGACTGAAGAAGCTGGTGGGCAGC（配列ＩＤ番号１５）及びＧＣＮ４ｇＨ＿２３＿２４＿ｒＢ ATGCGGTCCATGCCCAGGCCATCCAAAAACCATGGGTCTGTCTGCTCAGTGCTGCCCACCAGCTTCTTCAGTCTGGCCACCTCGTTCTCCAGGTGGTAGTTCTTGGATCC（配列ＩＤ番号１６）のアニーリング及び伸長を介して、配列ＩＤ番号１２として特定されるヌクレオチド配列を有するＧＣＮ４ペプチドカセットをコードするＤＮＡ断片であって、上流及び下流Ｇｌｙ‐Ｓｅｒリンカーにより挟まれ、またｇＨへの相同アームにより挟まれた、配列ＩＤ番号１３として特定されるＡＡ配列を有するＧＣＮ４ペプチドをコードするＤＮＡ断片を生成した。組み換え体ＢＡＣＲ‐ＶＧ‐２１３は、そのヌクレオチド配列が配列ＩＤ番号２として特定されそのアミノ酸配列が配列ＩＤ番号３として特定されるキメラｇＨをコードする。組み換え体ＢＡＣＲ‐ＶＧ２１３バクテリアクローンを、１ｍｇ／ＬのＤビオチン、０．２％デオキシ‐２‐ガラクトース、０．２％グリセロール、４５ｍｇ／ＬのＬロイシン、１ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び１２μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補給したＭ６３培地（上記参照）を含むプレート上で選択した。プライマーｇＨ＿ｅｘｔ＿ｒパリーノ GTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCACCCC（配列ＩＤ番号１７）及びｇＨ＿２１７６＿２２００＿ｆ CAGGTAGGTCTTCGGGATGTAAAGC（配列ＩＤ番号１８）を用いたコロニーＰＣＲにより、好ましい配列の存在についてバクテリアコロニーをチェックした。
組み換えウイルスＲ‐ＶＧ２１３を再構成するために、５００ｎｇの組み換えＢＡＣＤＮＡをリポフェクタミン２０００（ライフテクノロジーズ(Life Technologies)）によりＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞株にトランスフェクトし、次いでこれらの細胞内で増殖させた。ウイルス増殖は緑色の蛍光によってモニタリングした。組み換え体の信ぴょう性(authenticity)は、全ｇＨ及びｇＤＯＲＦｓを配列決定することにより検証した。ウイルスストックをＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞内で生成し、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４及びＳＫ‐ＯＶ‐３細胞において滴定した。
実施例４： Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４並びにＨＥＲ２陽性Ｊ‐ＨＥＲ２及びＳＫ‐ＯＶ‐３細胞に対するＲ‐ＶＧ２１３の二重親和性。
既に示したように、ｇＤにおけるｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２の挿入は、組み換えウイルスＲ‐ＬＭ１１３に、ＨＥＲ２受容体を介して細胞に侵入する能力を付与し、また、Ｒ‐ＬＭ１１３は、ＡＡ６〜３８の間のｇＤ領域の欠失により、天然ｇＤ受容体ネクチン１及びＨＶＥＭから脱標的化される。ＧＣＮ４ペプチドの挿入によりＲ‐ＶＧ２１３がＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞に感染することが可能になるかどうかを検証するために、本発明者らは、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞株及びそのｗｔ対応物であるｗｔＶｅｒｏを使用した。Ｒ‐ＶＧ２１３がＨＥＲ２受容体を介して感染可能なままであることを検証するために、本発明者らは、唯一の受容体としてＨＥＲ２を発現するＪ‐ＨＥＲ２細胞、及びＨＥＲ２陽性癌細胞であるＳＫ‐ＯＶ‐３細胞を使用した。加えて、Ｒ‐ＶＧ２１３がネクチン１及びＨＶＥＭからの脱標的化を維持していることを検証するために、本発明者らは、示された受容体のみを発現するＪ-ネクチン１及びＪ‐ＨＶＥＭを使用した。Ｒ‐ＬＭ２１３（図４パネルＡ）及びＲ‐ＬＭ１１３（図４パネルＢ）により細胞を感染させた。示されている場合には、ハーセプチンと命名されたＨＥＲ２に対するＭＡｂの存在下で、２８μｇ／ｍｌの濃度で感染を行った。感染は１ＰＦＵ／細胞で行われ、２４時間後に蛍光顕微鏡によりモニタリングされた。図４Ａに示すように、Ｒ‐ＶＧ２１３はＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４に感染し、この感染はハーセプチンによって阻害されなかったので、これは感染がＧＣＮ４受容体を介して生じたことを示している。ｗｔ‐Ｖｅｒｏにおいて見られた感染はハーセプチンによって阻害されたので、これは感染がＨＥＲ２のサルオルソログを介して生じたことを示している。Ｒ‐ＶＧ２１３はＳＫ‐ＯＶ‐３及びＪ‐ＨＥＲ２細胞に感染し、これはハーセプチンにより阻害されたので、即ちＨＥＲ２依存である。予想された通り、Ｒ‐ＶＧ２１３はＪ‐ネクチン１、Ｊ‐ＨＶＥＭ、及びｗｔ‐Ｊ細胞に感染しなかったので、これはＲ‐ＶＧ２１３が脱標的化された表現型(phenotype)を保存していることを示している。Ｒ‐ＶＧ２１３によるＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞の感染は、ＨＥＲ２を介してのみ細胞に感染するＲ‐ＬＭ１１３（図４Ｂ）による感染と著しく対照的である。
実施例５：Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞におけるＲ‐ＶＧ２１３複製の程度をｗｔウイルスＲ‐ＬＭ５の複製の程度と比較。
本発明者らは、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞におけるＲ‐ＶＧ２１３の複製の程度を、ｗｔ‐ｇＨ及びｗｔ‐ｇＤを担持しているウイルスであるＲ‐ＬＭ５の複製の程度と比較した。Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞を３７℃で９０分間、Ｒ‐ＶＧ２１３又はＲ‐ＬＭ５によりＭＯＩ０．１ＰＦＵ／細胞で感染させた（ＶＥＲＯ‐ＧＣＮ４細胞において接種物を滴定）。未吸着ウイルスを酸性洗浄（４０ｍＭのクエン酸、１０ｍＭのＫＣｌ、１３５ｍＭのＮａＣｌ［ｐＨ３］）によって不活性化した。複製培養物を感染後の指定時間（０、２４及び４８時間）に凍結させ、その子孫をＶＥＲＯ‐ＧＣＮ４細胞において滴定した。図５から、Ｒ‐ＶＧ２１３は、２４時間でＲ‐ＬＭ５より約１桁少なく増殖したことが分かる。４８時間では、複製の程度は区別できなかった。
実施例６：Ｒ‐ＬＭ１１３及びＲ‐ＬＭ５と比較したＳＫ‐ＯＶ‐３細胞におけるＲ‐ＶＧ２１３の複製、及びＳＫ‐ＯＶ‐３細胞の細胞外培地における子孫Ｒ‐ＶＧ２１３放出の程度。
（Ａ、Ｂ）本発明者らは、Ｒ‐ＶＧ２１３の複製の程度を、同様にｇＤにおけるｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２の挿入を介してＨＥＲ２に再標的化されている組み換えＲ‐ＬＭ１１３、及びｗｔＲ‐ＬＭ５の複製の程度と比較した。ＨＥＲ２及び受容体としてのネクチン１／ＨＶＥＭを発現するＳＫ‐ＯＶ‐３細胞において複製を測定した。０．１（パネルＡ）又は０．０１（パネルＢ）ＰＦＵ／細胞の入力ＭＯＩで複製を行った。未吸着ウイルスを酸性洗浄（４０ｍＭのクエン酸、１０ｍＭのＫＣｌ、１３５ｍＭのＮａＣｌ［ｐＨ３］）によって不活性化した。複製培養物を感染後の指定時間（０、２４及び４８時間）に凍結させ、その子孫をＳＫ‐ＯＶ‐３細胞において滴定した。図６Ａ及びＢから、Ｒ‐ＶＧ２１３複製は、その親であるＲ‐ＬＭ１１３の複製とは区別できず、ｗｔＲ‐ＬＭ５よりも約半桁少なかったことが分かる。（Ｃ）本発明者らは、０．１ＰＦＵ／細胞で感染させたＳＫ‐ＯＶ‐３細胞（パネルＡに示される実験）の細胞外培地への子孫ウイルス放出の程度に関して、Ｒ‐ＶＧ２１３とＲ‐ＬＭ１１３を比較した。感染後４８時間に、複製培養物を全溶解物プラス培地（細胞結合＋培地）として凍結させ、あるいは培地と細胞結合画分(cell-associated fractions)とを分離して凍結した。子孫ウイルスをＳＫ‐ＯＶ‐３細胞において滴定した。細胞外培地における子孫放出の効率は極めて類似していたことが分かる。
実施例７：異なる細胞株におけるＲ‐ＶＧ２１３のコロニー形成率
本発明者らは、異なる細胞株においてＲ‐ＶＧ２１３がプラークを形成する能力を、プラークの数（Ａ）及びプラークサイズ（Ｂ）に関して比較した。（Ａ）Ｒ‐ＶＧ２１３の複製分量(replicate aliquots)をＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４、Ｗｔ‐Ｖｅｒｏ、ＳＫ‐ＯＶ‐３及びＪ‐ＨＥＲ２細胞に播種し、３日後にプラークの数を数えた。最も高いコロニー形成率がＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞において達成されていることが分かる。（Ｂ）異なる細胞におけるＲ‐ＶＧ２１３の相対的プレークサイズの典型例。このパラメータによっても、Ｒ‐ＶＧ２１３は、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞において大きなプレーク表現型を示す。
Chowdary et al., 2010)であり、１つは同様にアルファヘルペスウイルスであるブタＰｒＶ由来(Backovic et al., 2012)であり、そして１つはガンマヘルペスウイルスであるエプスタインバーウイルス由来(Matsuura et al., 2010
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Claims (19)

  1. ヘルペスウイルスのエンベロープ内に存在する糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）に融合又は挿入された、５〜２７４アミノ酸の長さを有するペプチドを備える組み換えヘルペスウイルス。
  2. 前記ペプチドが、５〜２００アミノ酸、好ましくは１１〜２９、３１〜３９、４１〜４９又は５１〜２００アミノ酸、より好ましくは１２〜２０アミノ酸の長さを有する請求項１に記載のヘルペスウイルス。
  3. 前記ペプチドが、ＧＣＮ４酵母転写因子の一部、好ましくは配列ＩＤ番号１３により備えられるＧＣＮ４酵母転写因子の一部を備え、最も好ましくは前記ペプチドが配列ＩＤ番号１３により特定されるペプチドである請求項１又は２に記載のヘルペスウイルス。
  4. 前記ペプチドが、配列ＩＤ番号１に係る前記ｇＨのアミノ酸１９〜２３のいずれかから始まりアミノ酸４８〜８８のいずれかで終わり若しくはアミノ酸１１６から始まりアミノ酸１３６で終わるＮ末端領域内又は相同ｇＨの対応領域内において挿入される請求項１〜３のいずれかに記載のヘルペスウイルス。
  5. 前記ペプチドが、ｇＨのＨ１ＡドメインのＮ末端側に挿入される請求項１〜４のいずれかに記載のヘルペスウイルス。
  6. Ｎ末端領域の１つ以上のｇＨアミノ酸が欠失している請求項１〜５のいずれかに記載のヘルペスウイルス。
  7. 前記ヘルペスウイルスが、標的分子を発現させ又は結合させている細胞に前記ペプチドを介して結合する能力、好ましくは当該細胞膜と融合する能力、より好ましくは前記細胞に侵入する能力、最も好ましくは前記細胞内で増殖する能力を有する請求項１〜６のいずれかに記載のヘルペスウイルス。
  8. 前記標的分子が、配列ＩＤ番号５により備えられるｓｃＦｖ、最も好ましくは配列ＩＤ番号７の配列により特定される分子である請求項７に記載のヘルペスウイルス。
  9. 前記ヘルペスウイルスが、前記ヘルペスウイルスを疾患細胞に再標的化するように改変されたｇＤ及び／又は前記ヘルペスウイルスを疾患細胞に再標的化するように改変されたｇＢを備える請求項１〜８のいずれかに記載のヘルペスウイルス。
  10. 前記ヘルペスウイルスが、細胞、好ましくは疾患細胞に対する宿主免疫応答を刺激する１つ以上の分子をコードする請求項１〜９のいずれかに記載のヘルペスウイルス。
  11. 請求項１〜１０のいずれかに記載のヘルペスウイルスと薬学的に許容可能な担体とを備える医薬組成物であって、随意的に、細胞、好ましくは疾患細胞に対する宿主免疫応答を刺激する１つ以上の分子を追加的に備える医薬組成物。
  12. 腫瘍、感染、変性疾患又は老化関連疾患の治療における使用のために、随意的に、細胞、好ましくは疾患細胞に対する宿主免疫応答を刺激する１つ以上の分子と組み合わされる請求項１〜１０のいずれかに記載のヘルペスウイルス。
  13. 前記ペプチドを融合又は挿入した請求項１〜８のいずれかに記載のｇＨをコードする核酸を備える核酸分子。
  14. 請求項１３に記載の核酸分子を備えるベクター。
  15. 前記ペプチドを融合又は挿入した請求項１〜８のいずれかに記載のｇＨを備えるポリペプチド。
  16. 請求項１〜１０のいずれかに記載のヘルペスウイルス、請求項１３に記載の核酸分子、請求項１４に記載のベクター、又は請求項１５に記載のポリペプチドを備える細胞。
  17. 前記細胞が、ヘルペスウイルスの増殖に適した培養細胞、より好ましくはヘルペスウイルスの増殖のために認められた細胞株、更に好ましくはＶｅｒｏ、２９３、２９３Ｔ、ＨＥｐ‐２、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、又はＲＳ細胞、最も好ましくはＶｅｒｏ細胞である請求項１６に記載の細胞。
  18. 細胞又は請求項１６若しくは１７に記載の細胞であって、前記細胞が、請求項１〜１０のいずれかに記載の組み換えヘルペスウイルスにより備えられる前記ペプチド、好ましくはＧＣＮ４酵母転写因子の一部、最も好ましくは前記細胞の表面上でアクセス可能な、配列ＩＤ番号１３により備えられるＧＣＮ４酵母転写因子の一部、に結合可能な人工分子を備え、好ましくは、前記人工分子が、抗体、より好ましくは抗体誘導体、更に好ましくはｓｃＦｖ、更に好ましくはＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖ、更に好ましくは配列ＩＤ番号１３により備えられるＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖ、更に好ましくは配列ＩＤ番号５により備えられるｓｃＦｖ、最も好ましくは配列ＩＤ番号７の配列により特定される分子である、細胞。
  19. 請求項１〜１０のいずれかに記載のヘルペスウイルスを用いて細胞において組み換えヘルペスウイルスを産生するためのインビトロな方法であって、前記細胞が、請求項１〜９のいずれかに記載の組み換えヘルペスウイルスにより備えられる前記ペプチド、好ましくはＧＣＮ４酵母転写因子の一部、最も好ましくは前記細胞の表面上でアクセス可能な、配列ＩＤ番号１３により備えられるＧＣＮ４酵母転写因子の一部、に結合可能な人工分子を備え、好ましくは、前記人工分子が、抗体、より好ましくは抗体誘導体、更に好ましくはｓｃＦｖ、更に好ましくはＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖ、更に好ましくは配列ＩＤ番号１３により備えられるＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖ、更に好ましくは配列ＩＤ番号５により備えられるｓｃＦｖ、最も好ましくは配列ＩＤ番号７の配列により特定される分子である、インビトロな方法。
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