JP2019515651A - 活性化合物によって誘発される特定の効果を選択するための、ｒｎａ編集に基づくアルゴリズム及びインビトロの方法 - Google Patents

活性化合物によって誘発される特定の効果を選択するための、ｒｎａ編集に基づくアルゴリズム及びインビトロの方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、薬物又は化合物が患者において特定の効果を誘発する確率をインビトロで予測するためのアルゴリズム、及びＲＮＡのＡ−ｔｏ−Ｉ編集を示す少なくとも１つの標的を使用する、前記アルゴリズムの使用方法に関する。本発明は、この方法を実施するためのキットにも関する。

Description

本発明は、薬物又は化合物が患者において特定の効果を誘発する確率をインビトロで予測するためのアルゴリズム、及びＲＮＡのＡ−ｔｏ−Ｉ編集を示す少なくとも１つの標的を使用する、前記アルゴリズムの使用方法に関する。本発明は、この方法を実施するためのキットにも関する。
精神障害は世界中の医療制度においてますます多くを占めるようになっている（１）。それらは西洋社会における一般的な障害であり、５人のうち１人は生涯に少なくとも１回は罹患する。精神障害は、脳回路、神経伝達、及び神経可塑性に影響を与える、分子経路の撹乱によって引き起こされる。最近の研究は、メチル化、アセチル化、及び脱アミノ化等の、ＤＮＡ及びＲＮＡに対するエピジェネティック修飾の変化が、例えば大うつ病、双極性障害、及び統合失調症に関連することを示している（２、３）。最近の研究はまた、ＲＮＡ上のアデノシン脱アミノ化（ＲＮＡのＡ−ｔｏ−Ｉ編集）を触媒する編集酵素の重要性を明らかにした。この特異的機序は、高度に保存された神経伝達物質及びシナプス関連因子を本質的にコードする遺伝子の機能を直接調節することが示されている（４〜７）。重要なことに、このＲＮＡ編集機構及び同種のＡＤＡＲ酵素（ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ Ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ））の健康及び疾患における役割が、精神障害に罹患している患者の脳におけるその調節解除の証拠の蓄積により、更に明らかになってきた（８、９）。ＡＤＡＲは、二本鎖ｐｒｅ−ｍＲＮＡステムループに作用して、アデノシン残基を優先的、特異的に脱アミノ化する。コード配列中に存在する残基の脱アミノ化は、異なる薬理学的特性を有する受容体の変異体（例えば、セロトニン２ｃ受容体、グルタミン酸受容体）を産生するアミノ酸置換をもたらす（１０）。
脳におけるセロトニン生態学の異常は、うつ病及び／又は自殺行動の根底にある特徴的な形質であることが提唱されている（１１〜１３）。自殺犠牲者の死後脳組織を分析することにより、本発明者らは、５−ＨＴ２ＣＲの薬理学的特性を大きく損なうことが知られている、セロトニン受容体２Ｃ（５ＨＴ２ｃＲ）ｐｒｅ−ｍＲＮＡに対するＲＮＡ編集活性の明確な変化を観察した（１０、１４）。興味深いことに、自殺犠牲者のヒト皮質における５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡ編集プロファイルにおけるこれらの変化は、部分的に、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞で観察されるインターフェロン誘発性変化と重なる。本発明者らは、うつ病／自殺患者に関連する５−ＨＴ２ｃＲの「ＲＮＡ編集のサイン」を特徴づけるための特異的バイオマーカを正確に指摘した。
異なる治療クラスに属するいくつかの薬物が、重度の精神医学的有害作用、特にうつ病及び自殺念慮を誘発する可能性があると報告されている（１５〜１８）。今日では、このような分子を同定するための認可された試験はなく、食品医薬品局（ＦＤＡ）は全治療クラスに関する一般的なアラートのみを出すことができる。
このように、薬物又は候補薬物が有害な副作用を誘発するリスクを、高い正診率及び高い識別力で判定することができるインビトロ試験を提供する必要がある。
(WHO) WHO.Preventing suicide:A global imperative.2014. The Official Journal of the International Academy for Suicide Research.2010;14(4):291-310. The Official Journal of the Society for Neuroscience.2002 Dec 15;22(24):10529-32. Molecular psychiatry.2001 Jul;6(4):373-9. eLife.2015;4. Rna.2016 Feb;22(2):290-302. Nature communications.2014;5:4726. Brain research Brain research reviews.1998 May;26(2-3):217-29. Brain research Molecular brain research.2004 Apr 29;124(1):70-8. Molecular psychiatry.2008 Nov;13(11):1001-10. Official Publication of the American College of Neuropsychopharmacology.2001 May;24(5):467-77. European psychiatry:the journal of the Association of European Psychiatrists.2010 Jun;25(5):268-71. Archives of general psychiatry.2000 Aug;57(8):729-38. Translational psychiatry.2016; Minor revision. Lancet.2007 Nov 17;370(9600):1706-13. Psychiatria Danubina.2010 Mar;22(1):79-84. Revista brasileira de psiquiatria.2009 Jun;31(2):145-53. Bmj.2010;341:c5812.
本発明者らは、慎重に選択された細胞株（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）を用いて薬物誘発性精神医学的副作用を予測する、これまでに設計された革新的インビトロアッセイを検証した。本発明者らは、市場で承認された２６０種にわたる化合物をスクリーニングし、５−ＨＴ２ｃＲの編集の薬物誘発性変化を調べた。化合物は、自殺念慮を誘発する可能性が公知の、（ＦＤＡ警告ラベル及び／又は多数の症例報告を有する）広範囲の治療クラス（抗うつ薬、抗精神病薬、抗肥満薬、抗ウイルス薬、抗炎症薬、抗真菌薬、抗てんかん薬、気分安定薬など）又は誘発しない（精神医学的副作用が報告されていない）広範囲の治療クラスを選択した。このデータを用いて、高い特異度及び敏感度で「リスクあり」化合物を同定した。
第１の態様において、本発明は、患者において化合物、特に薬物が特定の効果を誘発する確率をインビトロで予測するためのアルゴリズムであって、
ａ）−ｐｒｅ−ｍＲＮＡがＡＤＡＲ酵素（ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ Ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ））の基質であるＲＮＡの、前記ＡＤＡＲの作用により異なるアイソフォーム／又は部位の生成がもたらされるＡ−ｔｏ−Ｉ編集を示す少なくとも１つの標的を選択する工程、
−前記少なくとも１つの標的及び少なくとも前記ＡＤＡＲ酵素を内因的に発現する少なくとも１つの細胞株を選択する工程、
−前記細胞株の細胞が処理された場合、前記（１又は複数の）標的アイソフォーム／又は（１又は複数の）編集部位の相対的割合を用量依存的に変化させることができる陽性対照化合物を選択する工程、
−前記特定の効果を誘発するリスクスコアを注釈付けされた、一定の薬物又は化合物比で構成された分子の集合を選択する工程、
ｂ）前記細胞株の細胞を、陰性対照及び前記陽性対照と併せて、前記分子の集合の個々の単一分子で処理する工程、
ｃ）前記標的のＲＮＡ編集レベルの割合を、その編集アイソフォーム／又は部位のそれぞれについて、及び前記集合の分子それぞれについて得るために、その集合の分子で処理された個々の試料の前記少なくとも１つの標的ＲＮＡ編集プロファイルを解析する工程、
ｄ）−ｉ）単変量解析統計法により、個々のアイソフォーム／又は編集部位について、分子が前記特定の効果を誘発するリスクを識別するその正診率及びその能力を評価する工程；及び／又は
−ｉｉ）多変量解析統計法により、アイソフォーム／又は編集部位の各組み合わせについて、分子が前記特定の効果を誘発するリスクを識別するその正診率及びその能力を評価する工程、及び
−ｉｉｉ）最良の識別能を示す組み合わせを選択する工程、
ｅ）アイソフォーム／又は編集部位の前記選択された組み合わせを用いてアルゴリズムを構築し、このようにして得られた前記アルゴリズムを、薬物、化合物、又は分子が患者において前記特定の効果を誘発する確率を予測するために使用する工程、
を含む方法によって得られるアルゴリズムに関する。
化合物とは、本明細書では、特にヒト若しくは動物患者、又は植物において活性であり得る鉱物、化学的、又は生物学的化合物を示すことが意図される。
本明細書において、用語「患者」には、植物も含まれる。
用語「アルゴリズム」には、統計モデル（Ｃａｒｔモデル等）も含まれる。
好ましい実施形態では、本発明による前記アルゴリズムにおいて、前記特定の１又は複数の効果は副作用であり、好ましくは有害な副作用又は所望の副作用から選択され、好ましくは有害な副作用である。
好ましい実施形態では、ＲＮＡのＡ−ｔｏ−Ｉ編集を示す前記標的は、５−ＨＴ２ｃＲ、ＰＤＥ８Ａ（ホスホジエステラーゼ８Ａ）、ＧＲＩＡ２（グルタミン酸受容体２）、ＧＲＩＡ３、ＧＲＩＡ４、ＧＲＩＫ１、ＧＲＩＫ２、ＧＲＩＮ２Ｃ、ＧＲＭ４、ＧＲＭ６、ＦＬＮＢ（フィラミンＢ）、５−ＨＴ２Ａ、ＧＡＢＲＡ３（ＧＡＢＡα３）、ＦＬＮＡ、ＣＹＦＩＰ２からなる群から選択される。
好ましい実施形態では、前記特定の効果、好ましくは副作用、より好ましくは所望又は有害な副作用は、心臓血管、アレルギー、ＣＮＳ、特に精神医学、皮膚病学、内分泌学、胃腸病学、血液学、感染症、代謝、神経筋、腫瘍学、炎症性、及び肥満の有害副作用を含む群から選択されている。
より好ましくは、精神医学的有害副作用である。
好ましい実施形態では、本発明のアルゴリズムによる前記細胞株の細胞は、前記標的及び（１又は複数の）ＡＤＡＲを内因的に発現する細胞株由来である。
より好ましくは、前記細胞株は、
−前記標的を内因的に発現し、ヒト皮質で観察されるものと同様のＡＤＡＲ酵素の発現を定常状態で示すことができるヒト又は動物の細胞株、
−神経芽細胞腫細胞株、好ましくはヒト細胞株、
−陰性対照またはビヒクル対照に対して正規化された場合に、陽性対照が少なくとも４、好ましくは少なくとも５又は６の誘発倍率でＡＤＡＲ１ａ発現を誘発した神経芽細胞腫細胞株、並びに
−ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株、
からなる群から選択される。
好ましい実施形態では、本発明のアルゴリズムの工程ｂ）において、前記細胞株の細胞は、１２時間〜７２時間、より好ましくは４８時間±４時間の間、被験の分子又は対照で処理され、４８時間が最も好ましい。
好ましい実施形態では、本発明によるアルゴリズムにおいて、前記陽性対照は、インターフェロンアルファ、又は１００ＩＵ／ｍｌでインターフェロンのＲＮＡ編集プロファイル曲線を再現することができる化合物である（例えば、図６に示される）。ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞株は、５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡを内因的に発現し、ヒト皮質インターフェロンアルファにおいて観察されるものと同様のＡＤＡＲ酵素発現を定常状態で示すため、これが使用された。
好ましい実施形態では、本発明によるアルゴリズム又はモデルにおいて、工程ｃ）は、個々の分子及び個々の編集アイソフォーム又は編集部位について、前記標的のＲＮＡ編集レベルの平均／中央値の相対的割合を得るために、ビヒクル処理対照細胞と比較した、前記細胞株中の個々のアイソフォーム又は部位についてのＲＮＡ編集の基底レベルを決定する工程を含む。
好ましくは、前記ビヒクル処理対照細胞はＤＭＳＯ処理対照細胞である。
好ましい実施形態では、本発明によるアルゴリズム又はモデルにおいて、前記方法は、化合物、特に薬物が前記特定の１又は複数の効果、好ましくは副作用、好ましくは有害又は所望の副作用から選択される副作用、好ましくは有害副作用を誘発する確率を、リスクなし若しくは低リスク、又は高リスク、好ましくはリスクなし又は高リスクによりインビトロで予測する方法である。
特定の好ましい実施形態では、本発明によるアルゴリズム又はモデルにおいて、前記分子の集合は、副作用、好ましくは有害又は所望の副作用から選択される副作用、好ましくは有害副作用である前記特定の１又は複数の効果の誘発に対して高リスク及び非常に低リスク、好ましくはリスクなしのスコアを注釈付けされた、平衡化された分子比で構成される。
「平衡化された分子比」とは、前記有害な副作用を誘発するリスクなし若しくは低リスク、又は高リスクであることが公知であり、特に、心臓血管、アレルギー、ＣＮＳ、特に精神医学、皮膚病学、内分泌学、胃腸病学、血液学、感染症、代謝、神経筋、腫瘍学、炎症性、及び肥満の治療のクラスの群から選択される、少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ又は５つの異なる治療クラスを提示する、前記所望の有害な副作用について十分に注釈付けされた分子の集合を示すことが意図される。
好ましくは、前記少なくとも３、４、５、６、７、又は８つの異なる治療クラスのそれぞれに含まれる分子の数は、前記集合の分子の合計の少なくとも１０％に相当する。
より好ましい実施形態では、所望の特定の１又は複数の効果、好ましくは副作用、好ましくは有害又は所望の副作用から選択される副作用、好ましくは有害な副作用のクラスを提示する治療クラスは、集合の全分子の２０％超、好ましくは２５％、３０％、又は３５％を含む。
好ましい実施形態では、本発明によるアルゴリズムの工程ｃ）において、前記分子の集合は、好ましくは前記集合の個々の分子について異なる濃度で同時に解析される。
好ましい実施形態では、本発明によるアルゴリズムにおいて、工程１）ｄ）ｉ）は、個々のアイソフォームもしくは部位、またはそれらの組み合わせについて、：
−前記特定の１又は複数の効果、好ましくは副作用、好ましくは有害又は所望の副作用から選択される副作用、好ましくは１又は複数の有害副作用について、少なくとも６０％、好ましくは７０％、好ましくは８０％以上の敏感度（Ｓｅ％）、並びに少なくとも６０％、好ましくは７０％、好ましくは８０％以上の特異度（Ｓｐ％）、の最適閾値；
−真の存在［真陽性／（真陽性＋偽陽性）］及び真の不在［真陰性／（真陰性＋偽陰性）］の割合を評価するための陽性的中率（ＰＰＶ、％）及び陰性的中率（ＮＰＶ、％）；
を計算する工程を含み、前記方法は、前記（１又は複数の）アイソフォーム／若しくは（１又は複数の）部位又はそれらの組み合わせの選択の全体性能の決定を可能にする。
好ましい実施形態では、本発明によるアルゴリズムまたはモデルにおいて、工程ｃ）において、ＲＮＡ編集プロファイルは、以下の工程：
−好ましくは２ステップＰＣＲ法を用いて（１又は複数の）標的の（（１又は複数の）編集部位を含む）目的の配列断片を選択的にシーケンシングする、ＮＧＳライブラリーの調製を含むＮＧＳ法（次世代シーケンシング）；
−得られた全てのＮＧＳライブラリーのシーケンシング；
並びに任意選択で、
−前記シーケンシングデータのバイオインフォマティクス解析
を含み、
前記バイオインフォマティクス解析が、好ましくは以下の工程：
−配列のプリアライメント処理と品質管理
−参照配列に対するアライメント；及び
−編集レベルのコーリング、
を含む方法によって実行され、標的の編集プロファイルを得る。
好ましい実施形態では、本発明によるアルゴリズムにおいて、工程ｄ）ｉ）及びｄ）ｉｉ）並びに工程ｅ）において、前記アルゴリズムの取得を可能にする前記統計的方法は、
−ｍＲＯＣプログラム、特に、ＡＵＣ（曲線下面積）ＲＯＣを最大化し、それぞれの組み合わせについての方程式が新しい仮想マーカＺとして以下：
Ｚ＝ａ１（アイソフォーム１）＋ａ２（アイソフォーム２）＋．．．ａｉ（アイソフォームｉ）＋．．．ａｎ（アイソフォームｎ）
（式中、ａ１は計算された係数であり、（アイソフォームｉ）はアイソフォームの標的の個々のＲＮＡ編集レベルの相対的割合である）
のように提供され、使用され得る、線形結合を特定するためのプログラム；
及び／又は、
−単変量及び多変量解析に適用され、異なる（１又は複数の）アイソフォーム／若しくは（１又は複数の）編集部位の値で分子の相対的リスクを推定するロジスティック回帰モデル；
及び／又は、
−（１又は複数の）アイソフォーム／若しくは（１又は複数の）編集部位の組み合わせを評価するために適用されるＣＡＲＴ（分類ツリー及び回帰ツリー（Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｒｅｅｓ））アプローチ；
及び／又は、
−アイソフォーム／若しくは編集部位の組み合わせを評価し、特に、編集アイソフォーム／若しくは部位の重要度をランク付けし、最良のアイソフォーム／若しくは編集部位を組み合わせて、分子の「相対的リスク」を分類するために適用されるランダムフォレスト（ＲＦ）アプローチ、
及び／又は任意選択で、
−以下の群：
−サポートベクターマシン（ＳＶＭ）アプローチ；
−人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）アプローチ；
−ベイジアンネットワークアプローチ；
−ｗＫＮＮ（重み付けｋ近傍）アプローチ；
−部分最小二乗法−判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）；並びに、
−線形及び二次判別分析（ＬＤＡ／ＱＤＡ）；
から選択する、分子の「相対的リスク」についてアイソフォーム／若しくは編集部位の組み合わせを評価するために適用される多変量解析
を含む方法によって実行される。
好ましい実施形態では、本発明によるアルゴリズムにおいて、
−前記少なくとも１つの標的は５−ＨＴ２ｃＲであり、
−前記有害副作用は精神医学的有害副作用であり、
−細胞株はヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞株であり、
−陽性対照はインターフェロンアルファであり、
並びに、
−試験薬物による前記精神医学的有害副作用の誘発が低リスクであるか、または高リスクであるかを識別することができる部位の組み合わせは、以下の５−ＨＴ２ｃＲの部位：
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ、
好ましくは前記部位の少なくとも３、４、又は５つの組み合わせ、
で構成される群から選択される少なくとも２、３、４、又は５つの単一部位の少なくとも１つの組み合わせを含むか、
−あるいは試験薬物による前記精神医学的有害副作用の誘発が低リスクであるか、又は高リスクであるかを識別することができるアイソフォームの組み合わせは、以下の５−ＨＴ２ｃＲのアイソフォーム：
Ａ、Ｂ、ＡＢ、ＡＢＣ、ＡＣ、Ｃ、Ｄ、ＡＤ、ＡＥ、ＡＣＤ、ＡＥＣ、ＡＢＣＤ、及びＮＥ
好ましくは前記アイソフォームの少なくとも５、６、又は７つの組み合わせ、
で構成される群から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３の、単一アイソフォームの少なくとも１つの組み合わせを含み、
並びに任意選択で、
前記アルゴリズム又はモデルの取得を可能にする前記統計的方法は、
−ｍＲＯＣプログラム、ランダムフォレストアプローチ及び／又はＣａｒｔアルゴリズム
を含む方法により実行される。
第２の態様では、本発明は、薬物、化合物、又は分子が、患者において特定の効果、好ましくは副作用、より好ましくは有害又は所望の副作用を誘発する確率又はリスクを予測するインビトロの方法であって、ｐｒｅ−ｍＲＮＡがＡＤＡＲ酵素の基質であるＲＮＡの、前記ＡＤＡＲの作用により異なるアイソフォームまたは編集部位の生成がもたらされるＡ−ｔｏ−Ｉ編集を示す標的を使用し、
Ａ）前記標的のＲＮＡ編集レベルの割合を、その編集アイソフォームのそれぞれについて得るために、前記薬物又は化合物又は分子で処理された試料の標的ＲＮＡ編集プロファイルを解析し、
前記標的ＲＮＡ編集プロファイルが、前記特定の効果について得られた、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のアルゴリズム又はモデルにおける分子集合の分子について得られたものとして得られる工程、
Ｂ）請求項１〜１５のいずれか１項に記載の、前記標的及び前記特定の効果について得られたアルゴリズム又はモデルを用いて、前記薬物若しくは化合物について得られた最終値又は適用されたアルゴリズム若しくはモデルを計算する工程；並びに、
Ｃ）工程Ｂ）で得られた結果を考慮して、前記薬物又は化合物が、患者において前記特定の効果を誘発するリスクがあるかどうかを、特に低リスク対高リスクで判定する工程、
を含む方法に関する。
別の実施形態では、薬物、化合物、又は分子が、患者において特定の効果を誘発する確率又はリスクを予測する、本発明による前記インビトロの方法は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡがＡＤＡＲ酵素の基質であるＲＮＡの、前記ＡＤＡＲの作用により異なるアイソフォーム又は部位の生成がもたらされるＡ−ｔｏ−Ｉ編集を示す少なくとも２、３、又は４つの標的の組み合わせを使用し、
Ａ）前記標的のそれぞれについてＲＮＡ編集レベルの割合を、その編集アイソフォーム又は部位のそれぞれについて得るために、前記薬物又は化合物または分子で処理された試料の前記標的組み合わせの個々の標的ＲＮＡ編集プロファイルを解析し、
前記標的ＲＮＡ編集プロファイルの前記それぞれが、前記特定の効果について得られた、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のアルゴリズム又はモデルにおける分子集合の分子について得られたものとして得られる工程、
Ｂ）請求項１〜１５のいずれか１項に記載の、前記標的及び前記特定の効果について得られたアルゴリズム又はモデルを用いて、前記薬物若しくは化合物について得られた最終値又は適用されたアルゴリズム若しくはモデルを計算する工程；並びに、
Ｃ）工程Ｂ）で得られた結果を考慮して、前記薬物又は化合物が、患者において前記特定の効果を誘発するリスクがあるかどうかを、特にリスクなし、若しくは低リスク対高リスクで判定する工程；
を含む。
別の好ましい実施形態では、ｐｒｅ−ｍＲＮＡがＡＤＡＲ酵素の基質であるＲＮＡのＡ−ｔｏ−Ｉ編集を示す少なくとも２、３、又は４つの標的の前記組み合わせ、ＲＮＡのＡ−ｔｏ−Ｉ編集を示す標的は、５−ＨＴ２ｃＲ、ＰＤＥ８Ａ（ホスホジエステラーゼ８Ａ）、ＧＲＩＡ２（グルタミン酸受容体２）、ＧＲＩＡ３、ＧＲＩＡ４、ＧＲＩＫ１、ＧＲＩＫ２、ＧＲＩＮ２Ｃ、ＧＲＭ４、ＧＲＭ６、ＦＬＮＢ（フィラミンＢ）、５−ＨＴ２Ａ、ＧＡＢＲＡ３（ＧＡＢＡα３）、ＦＬＮＡ、ＣＹＦＩＰ２からなる群から選択される標的の組み合わせから選択される。
第３の態様では、本発明は、化合物、好ましくは薬物が、患者において前記特定の１又は複数の効果、好ましくは副作用、好ましくは有害又は所望の副作用から選択される副作用、好ましくは１又は複数の有害副作用を誘発するリスクがあるか、特に低リスク対高リスクで判定するためのキットであって、
１）解析により、患者において前記有害副作用を誘発するリスクが判定される最終値を前記試験薬物について得るために、本発明によるアルゴリズムを使用するための説明書、又は化合物若しくは好ましくは薬物が、患者において前記特定の１又は複数の効果、好ましくは副作用、好ましくは有害若しくは所望の副作用から選択される副作用、好ましくは有害副作用を誘発する確率またはリスクを予測する、本発明による方法を適用するための説明書であり、任意選択でＲＯＣ曲線又はＣａｒｔ決定木を含む説明書；並びに、
２）１）の前記説明書の前記アルゴリズム又は前記モデルを判定するために使用される分子集合の個々の分子について編集ＲＮＡプロファイルを得るために必要な試薬に準じた、前記試験薬物について得られる編集ＲＮＡプロファイルを判定するための試薬；
を含むキットに関する。
好ましい実施形態において、前記試薬は、本発明のアルゴリズム又はモデルに２ステップＰＣＲを使用する場合、ＮＧＳライブラリー調製のためのこの方法に必要なプライマーのセットを含む。
より好ましい態様において、前記試薬は、前記標的の少なくとも１つについて、又は少なくとも２、３、若しくは４つの標的の組み合わせについて、請求項１から１７に記載のＲＮＡ編集プロファイルを得るために使用されるオリゴヌクレオチド配列を含む。
より好ましい実施形態では、前記試薬は、ＮＧＳライブラリー調製のための２ステップＰＣＲに必要なプライマーセットの１つ又は組み合わせを含み、前記少なくとも１つの標的又は前記標的の組み合わせは、５−ＨＴ２ｃＲ、ＰＤＥ８Ａ（ホスホジエステラーゼ８Ａ）、ＧＲＩＡ２（グルタミン酸受容体２）、ＧＲＩＡ３、ＧＲＩＡ４、ＧＲＩＫ１、ＧＲＩＫ２、ＧＲＩＮ２Ｃ、ＧＲＭ４、ＧＲＭ６、ＦＬＮＢ（フィラミンＢ）、５−ＨＴ２Ａ、ＧＡＢＲＡ３（ＧＡＢＡα３）、ＦＬＮＡ、ＣＹＦＩＰ２からなる群から選択される標的から選択される。
別のより好ましい実施形態では、前記試薬は、以下からなる群から選択されるプライマーセットの１つ又は組み合わせを含む：
Figure 2019515651
以下の実施例、図面、及び凡例は、本発明を実施及び使用することができるようにするために、当業者に完全な説明を提供するために選択された。これらの実施例は、本発明者がその発明として考える範囲を限定する意図のものではなく、これ以下の実験のみが実施されたことを示す意図のものでもない。
本発明の他の特徴及び利点は、本明細書の以下に凡例が示される、実施例及び図面の説明の残りの部分において明らかになると思われる。
インターフェロンアルファ誘発性ＲＮＡ編集（用量応答）の図である。ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞株における（ＩＦＮα）５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡ編集「プロファイル」を示す。ＦＮαによる４８時間の処理後の、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）の効果の用量応答解析である。５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡの相対的割合を、ＮＧＳベースのシーケンシングによって解析した。プロファイルは、ビヒクル処理対照細胞における５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡ編集の相対的割合を、ＩＦＮα処理細胞において測定した５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡ編集の相対的割合から差し引くことによって得た。 インビトロアッセイで試験した全２６０の化合物の治療クラス分類の円グラフである。中枢神経系（ＣＮＳ）作用化合物の更なるサブクラス分類を、図のＢ部分に示す。 選択された分子の試験中に適用された実験構成及びアプローチの概略図である。全２６０の化合物は、５つの独立した生物学的反復実験において試験している。それぞれの個々の細胞培養プレートを１０分子、ビヒクル対照（ＤＭＳＯ）及び１００ＩＵ／ｍｌのインターフェロンアルファで処理した。５つの独立した生物学的反復実験を試験し、ＮＧＳベースのＲＮＡ編集定量法によって同一の方法で処理された正確に１６２０個の試料を作製した。 個々のウェルにおけるＡＤＡＲ１ａ ｍＲＮＡの発現の図である。分子で４８時間処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＡＤＡＲ１ａ発現の定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析。ＡＤＡＲ１ａ ｍＲＮＡの発現レベルは、分子、ビヒクル（ＤＭＳＯ）又はＩＦＮαで４８時間処理した後、各試料において定量した。単一の生物学的反復実験（ｎ＝１）を示す。予想通り、ＩＦＮαで処理した各ウェルは、ＡＤＡＲ１ａ発現の増加を示した（Ａ〜Ｊ）。注目すべきことに、分子１６５もまた、この分子への曝露後にＡＤＡＲ１ａ ｍＲＮＡ発現レベルの強い増加を示した。 全てのビヒクル対照及びＩＦＮα処理（１００ＵＩ／ｍｌ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の生データ（Ａ）である。全１５０のビヒクル対照（ＤＭＳＯ）及びＩＦＮ処理ウェルの全体解析。（Ａ）この表は、全ての５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡ編集アイソフォームの全基本的統計的特徴を表示している。全実験中に得られたビヒクル及びＩＦＮα処理条件（ｎ＝１５０）を解析にプールし、５−ＨＴ２ｃＲに対するＩＦＮ誘発性ＲＮＡ編集変化の標準測定値を生成した。（Ｂ）ヒストグラムは、ＩＦＮ処理によって最も有意に影響を受けた５ＨＴ２ｃＲ編集アイソフォームを示す。ビヒクル処理（ＤＭＳＯ）及びＩＦＮα処理ウェルについての、全ての５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡ編集アイソフォームについて平均、中央値、標準偏差、及び変動係数（ＣＶ、パーセンテージとして表される）を示す。 プロファイル曲線−ＲＮＡ編集曲線ＩＦＮ１００である。５ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡ編集プロファイルは、ビヒクル処理対照細胞における５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡ編集の相対的割合を、ＩＦＮα処理細胞において測定した５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡ編集の相対的割合から差し引くことによって得た。平均及び中央値を示し、エラーバーは平均の標準誤差（ｓｅｍ、ｎ＝１５０）を表す。 個々の分子による４８時間の処理後に得られた５ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡ編集プロファイルの実例である。例は、４種の「リスクあり」化合物（アリピプラゾール（Ａｒｉｒｉｐｒａｚｏｌｅ）、セルトラリン、イソトレチノイン、及びタラナバント）（Ａ）並びに４種の「低リスク」分子（リチウム、ケタミン、オンダンセトロン、及びリバビリン）（Ｂ）のセットについて示している。参照のＩＦＮ（黒色）を各グラフに示す。平均値を示し、エラーバーは平均の標準誤差（ｓｅｍ、ｎ＝５）を表す。 低リスク分子と高リスク分子とを識別するための最も代表的な５ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡ編集アイソフォームの診断可能性の実例である。箱ひげ図は、５数要約（最小値（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ）、下側四分位（Ｑ１）、中央値（Ｑ２）、上側四分位（Ｑ３）、および最大値（ｌａｒｇｅｓｔ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ））を用いて数値データのグループを図式的に示す便利な方法である。箱ひげ図は、基礎となる統計分布を前提とせずに集団間の差異を表示するのに有用である。ｐ値にはウィルコクソン順位和検定を用いた。記号＊はｐ値≦０．０５を示し、＊＊はｐ値≦０．０１を示し、＊＊＊はｐ値≦０，００１を示す。 図１５の１３のアイソフォームの群から選択された２つのアイソフォームの組み合わせを分子データセット（ｎ＝１４３、低リスク対高リスク分子）に対して使用した、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の実例である。決定則：Ｚ＝０．１２１×ＡＣＤ−０．１４２×ＮＥ。 図１５の１３個のアイソフォームの群から選択された３つのアイソフォームの組み合わせを分子データセット（ｎ＝１４３、低リスク対高リスク分子）に対して使用した、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の実例である。決定則：Ｚ＝−０．１４４９×Ｃ＋０．５６９×ＡＥ−０．１５４８×ＮＥ。 図１５の１３個のアイソフォームの群から選択された４つのアイソフォームの組み合わせを分子データセット（ｎ＝１４３、低リスク対高リスク分子）に対して使用した、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の実例である。決定則：Ｚ＝０．０２３５ｘＡＢ＋０．１５６７×ＡＣＤ＋０．３８８０×ＡＥＣ−０．１３５５×ＮＥ。 図１５の１３個のアイソフォームの群から選択された５つのアイソフォームの組み合わせを分子データセット（ｎ＝１４３、低リスク対高リスク分子）に対して使用した、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の実例である。決定則：Ｚ＝０．０１６ｘＡＢ−０．０５６３×ＡＢＣ＋０．１８３×ＡＣＤ＋０．３８６ｘＡＥＣ−０．１４２８×ＮＥ。 図１５の１３個のアイソフォームの群から選択された６つのアイソフォームの組み合わせを分子データセット（ｎ＝１４３、低リスク対高リスク分子）に対して使用した、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の実例である。決定則：Ｚ＝０．０１５７×ＡＢ−０．０５５７×ＡＢＣ＋０．０１８７×Ｄ＋０．１８１７×ＡＣＤ＋０．３８８３×ＡＥＣ−０．１４２６×ＮＥ。 図１５の１３個のアイソフォームの群から選択された７つのアイソフォームの組み合わせを分子データセット（ｎ＝１４３、低リスク対高リスク分子）に対して使用した、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の実例である。決定則：Ｚ＝−０．０５０５×Ｂ＋０．０２２４×ＡＢ＋０．００１×Ｄ＋０．１６３×ＡＣＤ＋０．３８９×ＡＥＣ−０．１４０２×ＡＢＣＤ−０．１３８５×ＮＥ。 １３個のアイソフォームの組み合わせを分子データセット（ｎ＝１４３、低リスク対高リスク分子）に対して使用した、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の実例である。決定則：０．２０３５×Ａ＋０．１２８３×Ｂ＋０．１９７９×ＡＢ＋０．１１４７×ＡＢＣ＋０．１８６０×ＡＣ＋０．０４３３１×Ｃ＋０．１８８４×Ｄ＋０．１２５９×ＡＤ＋０．７７３９×ＡＥ＋０．４２９５×ＡＣＤ＋０．４７７５×ＡＥＣ−０．０４１５×ＡＢＣＤ＋０．０２４５×ＮＥ。 図１４の７つのアイソフォームの組み合わせを分子データセット（ｎ＝１４３、低リスク対高リスク分子）に対して使用した、ランダムフォレスト（ＲＦ）アルゴリズムの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の実例である。すべてのデータセットのＲＯＣ曲線を黒線で表し、試験データセットのＲＯＣ曲線を点線で表す（Ａ）。ＲＦモデルにおけるアイソフォームの重要度（重み）（Ｂ）（Ｃ）。 ＲＦアプローチによる診断能の例である。図１５の１３のアイソフォームの組み合わせを分子データセット（ｎ＝１４３、低リスク対高リスク分子）に対して使用した、ランダムフォレスト（ＲＦ）アルゴリズムの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の実例である。全てのデータセットのＲＯＣ曲線を黒線で表し、試験データセットのＲＯＣ曲線を点線で表す（Ａ）。ＲＦモデルにおけるアイソフォームの重要度（重み）（Ｂ）（Ｃ）。 更なる標的：ＧＲＩＡ２（Ａ）、ＦＬＮＢ（Ｂ）、及びＰＤＥ８Ａ（Ｃ）によって測定されたＲＮＡ編集活性の定量を示す図である。全ての場合において、ＩＦＮ処理は、未編集（ＮＥ）ｍＲＮＡの減少によって示されるように、編集されたアイソフォームの相対的割合の増加を誘発した。 ＬＮ１８（Ａ）及びＬＮ２２９（Ｂ）神経芽細胞腫細胞株（ＨＴＲ２Ｃ）の図である。ＬＮ１８細胞（Ａ）及びＬＮ２２９細胞（Ｂ）において、５ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡ編集プロファイルを、ビヒクル処理対照細胞における５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡ編集の相対的割合を、ＩＦＮα処理細胞において測定した５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡ編集の相対的割合から差し引くことによって得た。５ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡの平均ｍＲＮＡ編集プロファイルを示している。 予測ｙ ＣＡＲＴアルゴリズムを示す図である。６つのアイソフォームを分子データセット（ｎ＝１４３、低リスク対高リスク分子）に対して使用するＣＡＲＴアルゴリズムの代表的な決定ツリー及び診断能の実例である。 患者における特定の効果の誘発が低リスク、またはリスクなしである２つの化合物について得られたＲＮＡ編集プロファイルを示す図である。例として、ビヒクル対照処理細胞と比較した、リドカイン（Ａ）及びオンダンセトロン（Ｂ）で得られたＲＮＡ編集プロファイルを提供する。患者における特定の効果の誘発が高リスクである、レセルピン（Ｃ）及びフルオキセチン（Ｄ）など２つの化合物についてＲＮＡ編集プロファイルを得た。 アリピプラゾール（Ａ）、インターフェロン（ＩＦＮ）（Ｂ）、及びレセルピン（Ｃ）によって観察された、ＨＴＲ２Ｃに対するＲＮＡ編集変化の経時的解析を示す図である。 ３つの異なる化合物：クロザピン（Ａ）、セルトラリン（Ｂ）、及びケタミン（Ｃ）によるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の処理後のＲＮＡ編集プロファイルの用量依存的変化を示す図である。
実施例１：材料及び方法
薬物誘発性精神医学的有害副作用に関するデータベースの作成
正確に１０ｍＭでＤＭＳＯに溶解した１２８０種の小分子の集合を含む化学ライブラリーをＰｒｅｓｔｗｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。ライブラリーに含まれる全ての小分子は、１００％認可された薬物（ＦＤＡ、ＥＭＡ、及び他の機関）であり、最大の薬物類似性を示し、それらの高い化学的及び薬理学的多様性並びにヒトにおけるそれらの公知のバイオアベイラビリティに関して選択されている。化学ライブラリー（Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の購入時に、各単一分子の標的、治療クラス／効果、特許及びＡＤＭＥＴに関する詳細な情報を含む、高度に注釈を付けられたデータベースが提供された。本発明者らは、安全情報や症例報告（ＦＤＡ Ｍｅｄｗａｔｃｈ、ＥＭＥＡなど）を、定期的に更新するデータベースに問い合わせることで、ヒトに処方された場合のこれらの薬物の自殺及びうつ病に関連した有害副作用について出された報告書を検索した。次に、質問の結果をまとめ、化学物質ライブラリーに含まれる各薬物にリスクスコアを帰属させた。自殺及び／又はうつ病に関連する有害副作用が報告された症例の数、薬物の処方の程度、ＷＨＯによる必須医薬品のリストに掲載されている、等の様々なパラメータを考慮に入れて、薬物による有害な精神医学的副作用（うつ病及び／又は自殺関連有害副作用）の誘発可能性のリスクを定量化するために、スコア付けシステムを確立した。本発明者らは、有害な精神医学的副作用を誘発するリスクに関する特定の情報を含む包括的なデータベースを取得した。
細胞培養
ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞株は、５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡを内因的に発現し、ヒト皮質で観察されるものと同様のＡＤＡＲ１酵素発現の定常状態を示すため、これを使用した（Ｃａｖａｒｅｃ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２０１６ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ， Ｐａｔｅｎｔ ＴＯＸＡＤＡＲ）。ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞株は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。細胞を、標準的な条件で、３７℃において５％ＣＯ２の加湿雰囲気（ｈｕｍｉｆｉｅｄ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ）中で通常通りに培養した。血清中にしばしば存在するセロトニンによる５−ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡ発現の脱感作及び下方制御のために、透析胎児ウシ血清（ＦＢＳ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｅｃｈ 参照番号ＦＢ−１２８０Ｄ／５００）が非透析より好ましかった（Ｓａｕｃｉｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９８）。実験の経過中、細胞を継代数Ｐ８からＰ２２までの間培養した。細胞を１２ウェル細胞培養プレートに播種する前に、トリプシン処理された細胞懸濁液をＫｏｖａｓｌｉｄｅ（Ｋｏｖａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（透明なプラスチックで作られた、血球計数グリッドの付いた使い捨て顕微鏡用スライド）のチャンバーに２つの独立した添加を行うことによって細胞数を推定した。両方のチャンバーを２人の実験技術者によって計数し、４つの独立した計数結果の平均を、更に１２ウェル細胞培養プレートの細胞数およびプレーティングの計算に使用した。
薬理学的処理及び細胞溶解
受領後、Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ化学ライブラリー全体を個別のチューブに移し、コード化し、アリコートに分け、その後の使用まで−８０℃で保存した。社内で生成された薬物誘発性の精神医学的有害副作用データベースから、高リスクおよび非常に低リスクのスコアを注釈付けされた、平衡化された薬物比で構成された２６０の分子を選択した。薬物をコード化し、実験構成全体を通して分子をランダムに処理するよう注意を払った。陰性対照（ビヒクルＤＭＳＯ）及び陽性対照（インターフェロンアルファ）と共に、各実験において２６０分子全てを同時に解析した。各１２ウェル細胞培養プレートにおいて、試験分子のための１０個の空の位置を残して、陰性対照及び陽性対照を添加した。順に、単一の反復実験はそれぞれ、２７個の１２ウェル培養プレート（参照）で構成された。各被験分子について５つの独立した生物学的反復実験（ｎ＝５）を作製するように、実験を全く同じように５回繰り返した。実験の過程にわたって、合計１６２０個、即ち２７（ウェルプレートの数）×１２（プレート当たりのウェル数）×５（反復実験数）の試料が作製された。予備実験により、１０μＭでＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対して致死的であった７分子を同定することができた。これらの分子については、毒性の低下が検出されるまで濃度を適応させ、低下させた。実験前に、分子及び対照の全ての希釈物を調製し、ラックに配置した。３２４ウェル（２７×１２ウェル）全ての細胞密度、形態、生存率、及び汚染は、処理前に顕微鏡によって制御した。更に、各ウェルの画像をＣａｎｏｎ ＥＯＳ７００デジタルカメラを用いて撮影した。細胞を分子で処理してから正確に４８時間後、各ウェルの画像を、規定されたパラメータを用いてデジタルカメラで撮影した。増殖培地を慎重に除去した後、１％β−メルカプトエタノールを含有するＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）３５０μｌを、細胞の完全な化学的溶解のために添加した。１２ウェルプレートを積み重ね、ＲＮＡ抽出まで冷凍庫に保存した。
全ＲＮＡ抽出、品質管理、及び逆転写
全ＲＮＡ抽出は、製造業者のガイドライン（Ｑｉａｇｅｎ）に従って行った。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔは、シリカメンブレンＲＮｅａｓｙスピンカラムを用いて細胞から高品質のＲＮＡを迅速に精製する。全ての細胞溶解物を、完全自動化試料調製ＱＩＡｃｕｂｅを用いて抽出した。抽出は、適切なプロトコルを用いて、１回の操作につき１２の試料のバッチ（１つの完全な１２ウェルプレート）において標準的な手順を用いて処理した。試料調製及びＲＮＡ抽出中、ＲＮＡｓｅによるＲＮＡ分解を避けるための標準的な注意を払った。全ての抽出ＲＮＡ試料をｌａｂＣｈｉｐＧｘ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により解析して、全ＲＮＡを定量及び定性した。更にＱｕｂｉｔによる蛍光ベースの定量化を、ＬａｂＣｈｉｐＧｘデータを検証するために実施した。各個別の試料について、ＲＮＡ品質スコア（ＲＱＳスコア）を決定した（１６２０試料の平均ＲＱＳスコア＝９．６／１０）。次に、試料を正規化し、精製ＲＮＡの逆転写を、最終反応容積２０μｌ中１μｇのＲＮＡ材料から開始して、Ｔａｋａｒａキット（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｔａｋａｒａ 参照番号ＲＲ０３７Ａ）を用いて行った。ｃＤＮＡ合成をＰｅｑｓｔａｒ ９６ｘサーモサイクラーで４２℃において１５分間行い、反応混合物を更なる使用まで４℃において保存した。
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による相対的ｍＲＮＡ発現
ｃＤＮＡ合成後、試料を４℃において保存し、その後、ＬＣ４８０システム（Ｒｏｃｈｅ）においてｑＰＣＲによりＡＤＡＲ１ａ ｍＲＮＡ発現の解析を行った。標準曲線法を用いて、ｑＰＣＲデータを定量した。ＡＤＡＲ１ａのｍＲＮＡ発現は、インターフェロンアルファ処理（ＩＦＮα）によって誘発されることが公知である。想定されたように、ＩＦＮαで４８時間処理された全ての試料は、ＡＤＡＲ１ａ発現の増加を示し、６〜７の間の遺伝子発現の誘発倍率を示した。更に、レセルピン処理はまた、ＡＤＡＲ１ａ ｍＲＮＡレベルを一貫して増加させた。
ＮＧＳライブラリーの調製
ＮＧＳライブラリー調製のために、２ステップＰＣＲ法を使用して、前述の、本発明者らなどによってＲＮＡ編集に供されたことが確認された５−ＨＴ２ｃＲのエキソンＶを選択的にシーケンシングした。検証されたＰＣＲプライマーを使用して、目的の領域をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅のために、Ｑ５Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を製造業者のガイドライン（参照番号Ｍ０４９４Ｓ）に従って使用した。最適化されたＰＣＲプロトコルを用いて、Ｐｅｑｓｔａｒ ９６ｘサーモサイクラーでＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ後、全ての試料をＬａｂＣｈｉｐＧｘ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により解析し、ＰＣＲ産物の量及び質の両方を評価した。アンプリコンの純度を決定し、蛍光ベースのＱｕｂｉｔ法を用いて定量を行った。品質管理後、磁気ビーズ（Ｍｏｋａｓｃｉｅｎｃｅ製のＨｉｇｈ Ｐｒｅｐ ＰＣＲ ＭＡＧｂｉｏシステム）を用いて９６種類のＰＣＲ反応物（マイクロプレート）を精製した。精製後、Ｑｕｂｉｔシステムを用いてＤＮＡを定量し、精製収率を計算した。次に、Ｑ５ Ｈｏｔ ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＩｌｌｕｍｉｎａ ９６ Ｉｎｄｅｘｅｓキット（Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴインデックスキット；Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いたＰＣＲ増幅により、試料を個別にインデックス付けした。ＰＣＲ後、試料をライブラリーにプールし、Ｍａｇｂｉｏ ＰＣＲクリーンアップシステムを用いて精製した。ライブラリーを変性させ、ＭｉＳｅｑプラットフォームでＦＡＳＴＱのみをシーケンシングするためのＩｌｌｕｍｉｎａのガイドラインに従ってシーケンシングカートリッジに負荷した。決定された量の５ＨＴ２ｃＲアイソフォームを含むプラスミドのプールを各ライブラリーに含めて、各シーケンシング操作におけるシーケンシングの質及びエラーを制御した。更に、標準ＲＮＡプールをライブラリーに組み込んで、実験の過程で異なるシーケンシングフローセル間の可変性を決定した。全１６２０の試料をシーケンシングするためには、１８個のＭｉＳｅｑ ＲｅａｇｅｎｔキットＶ３が必要であった（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）。全てのＮＧＳライブラリーを１４ｐＭでシーケンシングし、１０％Ｐｈｉｘ（ＰｈｉＸ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｖ３）をスパイクして、ライブラリーの多様性を導入した。
実施例２：シーケンシングデータのバイオインフォマティクス解析
１．Ｆａｓｔｑ配列のプリアライメント処理および品質管理
シーケンシングデータを、Ｍｉｓｅｑシーケンサ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）からｆａｓｔｑファイルとしてダウンロードした。シーケンシング品質を評価するために、ＦａｓｔＱＣソフトウェアバージョン０．１１．５を使用して、各生のｆａｓｔｑファイルの初期品質調査を実行した。アダプター配列の除去、それらのサイズ及び品質スコアによる配列のフィルタリング（全ての短いリード（＜５０ｎｔ）及び平均ＱＣ＜３０のリードを除去）からなる予備処理ステップを行った。次に、配列のアライメントの質を向上させ、改善するために、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮＧＳデータ用のフレキシブルリードトリミングツールを使用した（トリムモマティック・プログラム バージョン０．３５）。予備処理ステップを実行後、クリーニングした各ｆａｓｔｑファイルの更なる品質管理を実施し、その後、更なる配列処理を実行した。
２．参照配列に対するアライメント
処理されたリードのアライメントを、ｂｏｗｔｉｅ２バージョン２．２．５をエンドツーエンドのｓｅｎｓｉｔｉｖｅモードで使用して実行した。アライメントはヒトゲノム配列（ＵＣＳＣ ｈｇ３８）の最新の注釈に対して行われ、多重アライメント領域のリード、アライメント品質の低いリード（Ｑ＜４０）又は挿入／欠失（ＩＮＤＥＬ）を含むリードを更なる解析から取り除いた。ファイルアライメントのフィルタリングはＳＡＭｔｏｏｌｓソフトウェアバージョン１．２を使用して実行した。ＳＡＭｔｏｏｌｓソフトウェアバージョン１．２は、ソート、マージ、インデックス作成、及び位置ごとのフォーマットでのアライメント生成を含む、ＳＡＭフォーマットでアライメントを扱うための様々なユーティリティを提供する。
３．編集レベルのコーリング
次に、ＳＡＭｔｏｏｌｓ ｍｐｉｌｅｕｐを使用して、複数の試料から同時に得られたアライメント結果のデータをパイルアップした。各ゲノム位置における異なるＡＴＧＣヌクレオチドの数（「塩基数」）を数えるために社内スクリプトを実行した。従って、各ゲノム位置について、自家製スクリプトは「Ｇ」を有するリードのパーセンテージを計算する、［「Ｇ」リードの数／（「Ｇ」リードの数＋「Ａ」リードの数）×１００］。「Ｇ」リードのパーセンテージ＞０．５のゲノム位置「Ａ」参照は、このスクリプトによって自動的に検出され、「Ａ−ｔｏ−Ｉ編集部位」とみなされる。最後の段階は、前述の「Ａ−ｔｏ−Ｉ編集部位」の全ての可能な組み合わせのパーセンテージを計算し、標的の編集プロファイルを得ることであった。
４．標的のベースラインと分子編集プロファイルとの比較
本発明者らは、広範囲の分子セット（ｎ＝２６０）の５ＨＴ２ｃＲ ＲＮＡ編集プロファイルを解析した。分子を一緒に比較するために、本発明者らは、最初の工程において、ビヒクル処理（ＤＭＳＯ）対照細胞と比較して、ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞株の各アイソフォーム／又は部位について本発明者らの標的のＲＮＡ編集の基底レベルを決定した。このために、本発明者らは、実施例により示された１５０にわたるビヒクル独立実験（反復実験）からの５ＨＴ２ｃＲのＲＮＡ編集レベルの平均を計算した。第２に、社内のスクリプトは、基準対照（ＣＴＲＬ）に対する分子の各反復実験（ｎ＝５）の偏差を自動的に計算した。
最後に、個々の分子及び個々の編集アイソフォーム／又は部位について、標的のＲＮＡ編集レベルの平均／中央値の相対的割合を得た。
実施例３：統計解析
全ての統計と数値は、統計オープンソースソフトウェア「Ｒ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ」（１９、２０）を使用して計算した。ＲＮＡ編集の値は、通常平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表される。非パラメトリックウィルコクソン順位和検定とウェルチのｔ検定を用いて差異解析を行った。複数の試験方法では、個々の編集アイソフォーム（例として：５つの編集部位（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｄ）からの５ＨＴ２ｃＲの未編集アイソフォーム（Ｎｅ）を含む３２のＲＮＡ編集アイソフォーム））のｐ値を調整して、偽発見率（ＦＤＲ）を制御することが重要である。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ及びＨｏｃｈｂｅｒｇ（ＢＨ）手順（２１）を「ｍｕｌｔｔｅｓｔ ｐａｃｋａｇｅ」を用いて全ての統計的検定に適用し、調整した０．０５未満のｐ値を統計学的に有意とみなした。編集レベルの相対的割合は正規分布していたため、正規化を適用しなかった。全てのデータ分布は、個々の有意なアイソフォームについての中央値及び棒グラフ（ｂａｒｐｌｏｔ）又は箱ひげ図として示す。有意なアイソフォームによる、ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞株における５ＨＴ２ｃＲのＲＮＡ編集レベルを提示する編集プロファイル曲線も各分子について示す。全ての分子群についてアイソフォーム相関を同定するためにピアソン相関検定を適用した。
５ＨＴ２ｃＲ編集アイソフォーム診断能は、「高リスク分子」群を検出する能力を表す敏感度及び「リスクなし分子又は低リスク分子」群を検出する能力を表す特異度を特徴とすることができる。診断テストの評価結果は、これらの２つの十分に定義された群を比較する２×２の分割表に要約することができる。カットオフを固定することにより、試験の結果に従って２つの群を陽性又は陰性のいずれかに分類することができた。特定のアイソフォームが与えられた場合、ａ「高リスク」群の中で陽性の試験結果を有する多数の分子（「真陽性」：ＴＰ）、及びｂ「低リスク」群の中で分子の間で、陽性の試験結果を有する分子（「真陰性」：ＴＮ）を同定することができる。同じように、ｃ「高リスク」群の中で陰性の試験結果を有する分子（「偽陽性」：ＦＰ）、及びｄ「低リスク」群の中で陰性の試験結果を有する分子（「偽陰性」：ＦＮ）が観察される。敏感度はＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）と定義され、これを本明細書では「真陽性率」と呼ぶ。特異度は、ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＰ）として定義され、これを本明細書では「真陰性率」と呼ぶ。
各５ＨＴ２ｃＲ編集アイソフォームの正診率及びその識別力を、受信者動作特性（ＲＯＣ）解析を用いて評価した。ＲＯＣ曲線は、様々な値に対する試験の敏感度（Ｓｅ）と特異度（Ｓｐ）との間の相反関係をグラフで視覚化したものである。
更に、全ての５ＨＴ２ｃＲ編集アイソフォームを互いに組み合わせて、ｍＲＯＣプログラム［Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｂｉｏｍｅｄ．２００１； ６６：１９９−２０７］、ロジスティック回帰（２２）、並びに２つの教師付き学習アルゴリズム、ＣＡＲＴ（２３）、及びランダムフォレスト（２４）のいくつかのアプローチを用いて、敏感度（ｓｅｎｓｉｂｉｌｉｔｙ）及び特異度の増加可能性を評価した。
ｍＲＯＣはＡＵＣ（曲線下面積）ＲＯＣ（２７）を最大にする線形結合（２５、２６）を特定するための専用プログラムである。それぞれの組み合わせのための方程式が提供され、以下のように新しい仮想マーカＺとして使用できる：
Ｚ＝ａ×アイソフォーム１＋ｂ×アイソフォーム２＋ｃ×アイソフォーム３
（式中、ａ、ｂ、ｃは計算された係数であり、アイソフォーム１、２、３はアイソフォームの標的の個々のＲＮＡ編集レベルの相対的割合である）。
２、３、又は４つの標的の組み合わせを互いに組み合わせて、例えばｍＲＯＣプログラム又はロジスティック回帰のような多変量アプローチを用いて敏感度（ｓｅｎｓｉｂｉｌｉｔｙ）及び特異度の増加可能性を評価することができる。個々の組み合わせのための方程式を計算することができ、次のように新しい仮想マーカＺｎとして使用することができる：
Ｚｎ＝ｎ１×標的１＋ｎ２×標的２＋ｎ３×標的３、
（式中、ｎ１、ｎ２、ｎ３．．．は、計算された係数であり、標的１、２、３は、例えば、標的のレベルと相関する値である）。
異なるアイソフォーム又は部位の値における分子の相対的リスクを推定するために、単変量及び多変量解析にロジスティック回帰モデルを適用した。本発明者らは、アイソフォームを連続変数（データ非掲載）及びカテゴリー変数（三分位値をカットポイントとして使用する）の両方として解析した。最後のケースでは、オッズ比（ＯＲ）及びその９５％信頼区間を計算する。罰則付きロジスティック回帰（ＬＡＳＳＯ、リッジ又はＥｌａｓｔｉｃ−Ｎｅｔアプローチ）も連続変数に適用した。これらの方法の場合、パッケージ：Ｒソフトウェアバージョン３．２．３のｇｌｍｎｅｔバージョン２．０−３を使用する。
ＣＡＲＴ（分類ツリー及び回帰ツリー（Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｒｅｅｓ））アプローチも、アイソフォームの組み合わせを評価するために適用した。この決定ツリーアプローチは、ユーザにとって容易に理解できる階層グラフによって表される、分類則のセットを生成することを可能にする。ツリーの各ノードで決定が行われる。慣例により、左側の枝は、対象の質問に対する肯定的な応答に対応し、右側の枝は、対象の質問に対する否定的な応答に対応する。次に、分類手順は、「ＩＦ−ＴＨＥＮ」則のセットとして翻訳することができる（例については図２０を参照）。
以前と同様にランダムフォレスト（ＲＦ）アプローチを適用し、アイソフォームの組み合わせを評価した。この方法は、分散が制御された決定ツリーの集合を構築するために、Ｂｒｅｉｍａｎの「バギング」アイデアと機能のランダムな選択を組み合わせる。従って、ランダムフォレストは、編集アイソフォームの重要度をランク付けし、最良のアイソフォームを組み合わせて分子の「相対的リスク」を分類するために使用することができる（図１６及び図１７を参照）。
ＣＡＲＴとランダムフォレストは教師付き学習方法である。これらの方法は、モデルを構築するために使用されるトレーニングセットと、それを検証するためのテストセットの使用を必要とする。本発明者らのデータセットを分割し、データセットの２／３を学習フェーズに使用し、１／３を検証フェーズに使用する。この分割はランダム化されており、各試料の様々な規制（ｓｔａｔｕｔｅｓ）の初期割合を尊重している。これらの分類器の予測誤差を推定するために、１０倍交差検定法を使用して、オーバーフィット問題を回避するために１０回繰り返した。これらのアプローチでは、Ｒソフトウェアバージョン３．２．３の「ｒｐａｒｔパッケージ４．１−１０」と「ランダムフォレストパッケージ４．６−１２」を使用した。
別の多変量解析を使用して、分子の「相対的リスク」について５ＨＴ２ｃＲ編集アイソフォームの組み合わせを評価することができる：
−サポートベクターマシン（ＳＶＭ）アプローチ（２８）；
−人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）アプローチ（２９）；
−ベイジアンネットワークアプローチ（３０）；
−ｗＫＮＮ（重み付けｋ近傍）アプローチ（３１）；
−部分最小二乗法−判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）（３２）；
−線形および二次判別分析（ＬＤＡ／ＱＤＡ）（３３）；等。
実施例４：結果
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株の検証
実験の前に、ヒト神経芽細胞腫細胞株（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）を漸増用量のインターフェロンで処理し、５ＨＴ２ｃＲのＲＮＡ編集をＮＧＳベースのアプローチを用いて測定した。予想通り、５ＨＴ２ｃＲアイソフォームの相対的割合は変化しており、特に用量依存的に増加可能であり（図１）、この特定の培養細胞株における前述のＩＦＮ誘発性応答が確認される。ＩＦＮプロファイルは、全く異なる解析法を用いて以前に得られたデータと厳密に一致した（３４、３５）。
実験手順
一旦細胞株が安定した増殖特性を示し、それに応じてＩＦＮ処理に応答した時点で、２６０分子のスクリーニングを調製した。社内で定められた基準に基づいて、リスクスコアは、化学ライブラリー中の個々の１２８０分子に帰属させた。実用上の理由から、２６０分子を選択して、独自のインビトロアッセイで更に試験した。分子の選択手順の間、化学ライブラリー（図２）に含まれる図２で同定された主要な治療クラスのすべて、好ましくは少なくとも３、４、５、６、又は７つの部分を含むように注意を払った。２６０分子のうち１１２は抗けいれん剤、抗うつ剤等の中枢神経系障害のための処方薬である（図２Ｂ）。全ての分子を移し、処理前に適切な管にアリコートに分けた。２６０分子のスクリーニングのために選択された実験構成は、１０種の分子、ビヒクル対照（ＤＭＳＯ）及び１００ＩＵ／ｍｌインターフェロンアルファで個別に処理された２６個のウェルプレート（１２ウェルのプレート）からなり、各細胞培養プレートについて陽性対照及び陰性対照を設けた。追加の細胞培養プレートを使用して、追加の対照ウェルを加えた。各分子を、３週間の間隔で５回の生物学的反復実験において試験した（図３）。厳密に４８時間の処理後、細胞を適切な溶解緩衝液で溶解し、更なる処理まで−２０℃で保存した。全てのＲＮＡ抽出はＱｉａｃｕｂｅ自動ＲＮＡ抽出を用いて行い、プレートは個別に処理した（１回の抽出につき１２試料のバッチ）。
相対的ＡＤＡＲ１ａ ｍＲＮＡ発現
ＲＮＡ抽出後、ｃＤＮＡを合成し、３８４ウェルマイクロプレート中でＬＣ４８０ライトサイクラー（Ｒｏｃｈｅ）においてＡＤＡＲ１ａ発現を評価した。このようにして、同じバッチの全ての試料を単一のｑＰＣＲ操作で分析することが可能であった。応答の堅牢性を反映して、１２ウェルプレートそれぞれの全てのＩＦＮ処理細胞について、ＡＤＡＲ１ａのインターフェロン依存性誘発が観察された。興味深いことに、分子１６５もＡＤＡＲ１ａ ｍＲＮＡ発現を誘発した（図４Ａ〜４Ｉ、プレート１７）。この応答は、全ての生物学的反復実験（ｎ＝５）で見ることができた。以前にＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞で観察されたように、ＩＦＮは、ビヒクル対照に対して正規化した場合、６．６の誘発倍率でＡＤＡＲ１ａ発現を誘発した（表１）。９．３１％の変動係数は、生物学的現象の再現性をはっきりと示している。
表１：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＩＦＮ処理後のＡＤＡＲ１ａ ｍＲＮＡ発現の基本統計学的特徴。平均誘発倍率（ＤＭＳＯ処理対照細胞と比較）標準偏差、中央値、及びＣＶ（パーセンテージとして表される）。
Figure 2019515651
Ａ）５ＨＴ２ｃＲ編集アイソフォームの単変量解析
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＩＦＮ ＲＮＡ編集アイソフォームと対照との比較
ｃＤＮＡ合成工程の後、５ＨＴ２ｃＲのエキソンＶを標的とする２ステップＰＣＲアプローチを適用してＮＧＳライブラリーを構築し、全ての試料中の個々の５ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡの相対的割合を正確に定量した。全てのビヒクル対照及びＩＦＮ処理ウェル（ｎ＝１５０）の平均値を図５Ａに示し、ヒストグラムとして表す。ビヒクル対照とＩＦＮ処理条件との間で、アイソフォームの相対的割合に明確な差異を観察することができる（図５Ｂ）。これらのデータは、前述のＲＮＡ編集プロファイル（図７Ａ〜７Ｂ）を生成するＲＮＡ編集プロファイルとして表わされ、前述のプロファイル（図１及びＣａｖａｒｅｃらを参照されたい）と非常によく一致していた。
例として、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株における、ＩＦＮの存在下での５−ＨＴ２ｃＲ ＲＮＡ編集アイソフォーム（ｎ＝１５０）のレベルと、ビヒクル対照（ビヒクル、ｎ＝１５０）のレベルとを比較した場合、５−ＨＴ２ｃＲのＡＣ、ＡＢＣ、ＡＢ、Ａ、ＡＥ、ＡＣＥ、Ｄ、ＡＢＣＤ、ＡＢＥ、Ｃ、Ｂ、ＢＣ、及びＡＢＣＥのＲＮＡ編集レベルが有意に変化した（図５Ａ〜５Ｂ及び図６）。５−ＨＴ２ｃＲの未編集アイソフォーム（Ｎｅ）のレベルは、ＩＦＮ分子とビヒクル対照（基底０）との比較のために最も有意である。更に、本発明者らは、ＡＣ、ＡＢＣ、ＡＢ、Ａ、ＡＥ、ＡＥＣ、ＡＢＣＤ、ＡＢＥ、Ｃ、Ｂ、ＢＣ、及びＡＢＥＣの５−ＨＴ２ｃＲ ＲＮＡ編集のレベルの増加、並びに５−ＨＴ２ｃＲ ＲＮＡ編集のＤ及び未編集（Ｎｅ）アイソフォームのレベルの減少を観察した。これらの結果は、全体として、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においてＩＦＮの存在下で５−ＨＴ２ｃＲに対するＲＮＡ編集活性が増加することを示唆している。
表２：ＩＦＮ分子（ｎ＝１５０）と対照（ｎ＝１５０）とを比較した場合の５−ＨＴ２ｃＲ ＲＮＡ編集レベルの差異解析
Figure 2019515651
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における高リスク分子対低リスク分子のＲＮＡ編集アイソフォームレベルの比較
例えば、低リスク分子（ｎ＝８２）と高リスク分子（ｎ＝６１）とを比較すると、５−ＨＴ２ｃＲアイソフォームの単一編集又は未編集（Ｎｅ）レベルを有意に変化させることができる（図７Ａ〜７Ｂ）。５−ＨＴ２ｃＲアイソフォームのＲＮＡ編集レベル、個々のアイソフォームの曲線下面積（ＡＵＣ）の受信者動作特性（ＲＯＣ）解析に基づいて、低リスク又は高リスクの分子の識別が可能であった（表３）。
表３：低リスク分子（ｎ＝８２）と高リスク分子（ｎ＝６１）とを比較した場合の、単一編集アイソフォームの識別能
Figure 2019515651
各アイソフォームの正診率及びその識別力を、受信者動作特性（ＲＯＣ）解析を用いて評価した。ＲＯＣ曲線は、様々な値に対する試験の敏感度（Ｓｅ）と特異度（Ｓｐ）との間の相反関係をグラフで視覚化したものである。ＡＵＣは、その信頼区間（ＣＩ）を有する曲線下面積を意味する。ＲＯＣ曲線は、単一マーカの敏感度（Ｓｅ％）及び特異度（Ｓｐ％）の最適閾値を計算することによる、分子の相対リスクの予測モデルに基づく。単一ＲＮＡ編集アイソフォームの陽性的中率（ＰＰＶ、％）及び陰性的中率（ＮＰＶ、％）を計算して、「自殺副作用群」における高リスク分子の真の存在の割合［真陽性／（真陽性＋偽陽性）及び真の不在の割合［真陰性／（真陰性＋偽陰性）］を評価した。
Ｂ）５−ＨＴ２ｃＲ編集アイソフォームの多変量解析
低リスク分子と高リスク分子とを比較する場合、ｍＲＯＣ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ−Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ−Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）アプローチによる複数マーカ解析が有意にＡＵＣを改善した。以下の組み合わせの１３のアイソフォームの群から選択される、例えば２、３、４、５、６、７、又は１３のアイソフォームに関連するアイソフォームの組み合わせ：Ａ＋Ｂ＋ＡＢ＋ＡＢＣ＋ＡＣ＋Ｃ＋Ｄ＋ＡＤ＋ＡＥ＋ＡＣＤ＋ＡＥＣ＋ＡＢＣＤ＋ＮＥ（本発明の方法によって得られた組み合わせ）は、Ｃａｖａｒｅｃら（２０１３）で得られたものより高い敏感度及び特異度によって報告されるように、高リスク分子において自殺の副作用の高いリスク予測値を有する。本発明の組み合わせで特定された２、３、４、５、６、７、８、９、０、１１、１２、及び１３のアイソフォームを組み合わせた統計解析により、一連の決定則を生成し、図９〜図１５及び以下の対応する表４〜９（低リスク分子対高リスク分子）に示すように、各組み合わせについて新しい仮想マーカ（Ｚ）を計算した。
マルチアイソフォームパネルの正診率及びその識別力を、受信者動作特性（ＲＯＣ）解析を使用して評価した。ＲＯＣ曲線は、様々な値に対する試験の敏感度（Ｓｅ）と特異度（Ｓｐ）との間の相反関係をグラフで視覚化したものである。ＡＵＣは、その信頼区間（ＣＩ）を有する曲線下面積を意味する。ＲＯＣ曲線は、マルチアイソフォームパネルの敏感度（Ｓｅ％）及び特異度（Ｓｐ％）の最適閾値を計算することによる、毒性の高リスクの予測モデルに基づく。組み合わせマーカの陽性的中率（ＰＰＶ、％）及び陰性的中率（ＮＰＶ、％）を計算して、自殺／うつ病誘導有害副作用の高リスク分子の真の存在の割合［真陽性／（真陽性＋偽陽性）及び真の不在の割合［真陰性／（真陰性＋偽陰性）］を評価した。
表４：２つのアイソフォーム（低リスク対高リスク分子）による多変量解析を用いた５−ＨＴ２ｃＲ編集アイソフォームの性能
Figure 2019515651
決定則：
ＲＤ１：Ｚ＝０．１２１×ＡＣＤ−０．１４２×ＮＥ
表５：３つのアイソフォーム（低リスク対高リスク分子）による多変量解析を用いた５−ＨＴ２ｃＲ編集アイソフォームの性能
Figure 2019515651
決定則：
ＲＤ１：Ｚ＝−０．１４４９×Ｃ＋０．５６９×ＡＥ−０．１５４８×ＮＥ
表６：４つのアイソフォーム（低リスク対高リスク分子）による多変量解析を用いた５−ＨＴ２ｃＲ編集アイソフォームの性能
Figure 2019515651
決定則：
ＲＤ１：Ｚ＝０．０２３５×ＡＢ＋０．１５６７×ＡＣＤ＋０．３８８０×ＡＥＣ−０．１３５５×ＮＥ
表７：５つのアイソフォーム（低リスク対高リスク分子）による多変量解析を用いた５−ＨＴ２ｃＲ編集アイソフォームの性能
Figure 2019515651
決定則：
ＲＤ１：Ｚ＝０．０１６×ＡＢ−０．０５６３×ＡＢＣ＋０．１８３×ＡＣＤ＋０．３８６×ＡＥＣ−０．１４２８×ＮＥ
表８：６つのアイソフォーム（低リスク対高リスク分子）による多変量解析を用いた５−ＨＴ２ｃＲ編集アイソフォームの性能
Figure 2019515651
決定則：
ＲＤ１：Ｚ＝０．０１５７×ＡＢ−０．０５５７×ＡＢＣ＋０．０１８７×Ｄ＋０．１８１７×ＡＣＤ＋０．３８８３×ＡＥＣ−０．１４２６×ＮＥ
表９：７つのアイソフォーム（低リスク対高リスク分子）による多変量解析を用いた５−ＨＴ２ｃＲ編集アイソフォームの性能
Figure 2019515651
決定則：
ＲＤ１：Ｚ＝−０．０５０５×Ｂ＋０．０２２４×ＡＢ＋０．００１×Ｄ＋０．１６３×ＡＣＤ＋０．３８９×ＡＥＣ−０．１４０２×ＡＢＣＤ−０．１３８５×ＮＥ
表１０：１３のアイソフォーム（低リスク対高リスク分子）による多変量解析を用いた５−ＨＴ２ｃＲ編集アイソフォームの性能
Figure 2019515651
Ｚ＝０．２０３５×Ａ＋０．１２８３×Ｂ＋０．１９７９×ＡＢ＋０．１１４７×ＡＢＣ＋０．１８６０×ＡＣ＋０．０４３３１×Ｃ＋０．１８８４×Ｄ＋０．１２５９×ＡＤ＋０．７７３９×ＡＥ＋０．４２９５×ＡＣＤ＋０．４７７５×ＡＥＣ−０．０４１５×ＡＢＣＤ＋０．０２４５×ＮＥ。
Ｃ）決定ツリーアプローチ：多変量解析
「分類ツリー及び回帰ツリー（Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｒｅｅｓ）」を表すＣＡＲＴアルゴリズムは、決定ツリーアプローチである。これらのツリーは、ユーザにとって容易に理解できる階層グラフとして表される、分類則のセットを構築するのに役立つ。ツリーは、内部ノード（決定ノード）、エッジ、及び末端リーフからなる。これらのノードは、テスト及びこのノードからのエッジのラベルと一致する、該テストに対する応答候補によってラベル付けされる。決定ツリーがバイナリである場合、慣例により、左エッジはテストに対する肯定応答に対応し、右エッジは否定応答に対応する。得られた分類の手順は、決定則に関して即座に翻訳される。
決定ツリーは、教師付き分類の一般的で効率的な方法である。この方法は、モデルを構築するためのトレーニングセットと、それを検証するためのテストセットの使用を必要とする。データセットを構築するにあたっては、「曖昧でない」分子（ｎ＝１４３）のリストを分割し、データセットの９０％を学習フェーズ（ｎ＝９３の薬物）に使用し、１０％をテストフェーズ（５０の薬物）に使用する。この分割はランダム化されており、各分子の様々な規制（ｓｔａｔｕｔｅｓ）の初期割合を尊重している。更に、
例として、６個のＲＮＡ編集アイソフォームを「ＩＦＮプロファイル」に組み合わせ、ＣＡＲＴ法を使用して意思決定モデルを構築した（図２０）。
表１１：いくつかのアイソフォーム又はＣ１３の組み合わせから選択された５個のアイソフォーム、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、及びＸ５の組み合わせによる、分子のデータセット（低リスク対高リスク分子）に対する、ＣＡＲＴアルゴリズムを用いた５−ＨＴ２ｃＲ編集アイソフォーム診断能
Figure 2019515651
データテストにおける５−ＨＴ２ｃＲの５つのＲＮＡ編集アイソフォームを用いたＣＡＲＴモデルの診断能は、低リスク分子対高リスク分子の識別に関しても非常に興味深いと思われる。
Ｄ）ランダムフォレストアプローチ：多変量解析
ランダムフォレストは、教師付き分類の一般的且つ効率的な方法である。この方法は、モデルを構築するためのトレーニングセットと、それを検証するためのテストセットの使用を必要とする。データセットを構築するにあたっては、「曖昧でない」分子（ｎ＝１４３）のリストを分割し、データセットの６５％を学習フェーズ（ｎ＝９３の薬物）に使用し、３５％をテストフェーズ（５０の薬物）に使用する。この分割はランダム化されており、各分子の様々な規制（ｓｔａｔｕｔｅｓ）の初期割合を尊重している。更に、ＩＦＮによる学習データセットの重み付けを行い、「ＩＦＮプロファイル」を有する薬物及び「基底０プロファイル」を有する薬物の分離力を改善した。従って、本発明者らはランダムに採取された１２のＩＦＮ分子と８個の対照（基底０）を学習セット（ｎ＝１１３）に加えた。
例として、本発明者らは、意思決定のモデルを構築するためのランダムフォレスト（ＲＦ）アルゴリズムを用いて、「ＩＦＮプロファイル」の７及び１３の代表的ＲＮＡ編集アイソフォーム（Ｃ７のＲＤ１、表９、及びＣ１３のＲＤ１、表１０を参照）を組み合わせた（ＲＦモデルのパラメータ：ｍｔｒｙＳｔａｒｔ＝１、ｓｔｅｐＦａｃｔｏｒ＝２、ｎｔｒｅｅ＝５００、ｉｍｐｒｏｖｅ＝０．０１；ＲＦモデルのＯｕｔ Ｏｆ Ｂａｇ（ＯＯＢ）推定値＝０．２１）（図１６Ａ〜Ｃ及び１７Ａ〜Ｃ））。
表１２：分子データセット（低リスク分子対高リスク分子）に対して７個のアイソフォームを用いた、ランダムフォレストアルゴリズムを使用した分割表
Figure 2019515651
表１３：分子データセット（低リスク対高リスク分子）に対して１３個のアイソフォームを用いた、ランダムフォレストアルゴリズムを使用した５−ＨＴ２ｃＲ編集アイソフォーム診断能
Figure 2019515651
５−ＨＴ２ｃＲの７又は１３のＲＮＡ編集アイソフォームを用いたＲＦモデルの診断能は、低リスク分子対高リスク分子の識別に関して非常に興味深く、敏感度、特異度、及び正診率は９０％（Ｃ７の場合）及び９５％（Ｃ１３の場合）より高く、Ｃａｖａｒｅｃら（２０１３）に開示されたものよりも有意に高い。
実施例５：標的多様化
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における５ＨＴ２ｃＲ ｍＲＮＡ編集を更に補うために、本発明者らは更なるＡＤＡＲ基質（ＧＲＩＡ２、ＦＬＮＢ、ＰＤＥ８Ａ、ＧＲＩＫ２、及びＧＡＢＲＡ３）を解析した。興味深いことに、ＩＦＮ処理は、研究した３つの標的全てについて、ＲＮＡ編集アイソフォームの相対的割合を変化させた（図１１）。従って、バイオマーカを追加することにより、試験の診断能が更に高まることが予見可能である。
実施例６：様々な標的のＮＧＳベースの解析によって得られた、化合物特異的ＲＮＡ編集プロファイル
化合物特異的ＲＮＡ編集プロファイルを、標的ＧＡＢＲＡ３、ＧＲＩＡ２、ＧＲＩＫ２、及びＨＴＲ２ＣのＮＧＳベースの解析によって得た（図２１Ａ〜２１Ｂ参照）。図２１Ａ及び２１Ｂにおいて、ヒストグラムは、ビヒクル対照処理細胞と比較した、表示の化合物で処理したヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞株の各特異的部位において定量されたＲＮＡ編集レベルの相対的割合を示す。
正の値（％）は、ビヒクル処理細胞と比較した、化合物によって誘発される特異的部位におけるＲＮＡ編集の増加を示す。反対に、負の値（％）は、ビヒクル処理細胞と比較した、化合物による処理の結果としての特異的部位におけるＲＮＡ編集の減少を示す。
患者における特定の効果の誘発が低リスク又はリスクなしである２つの化合物について、ＲＮＡ編集プロファイルを得た（図２１Ａ、２１Ｂ参照）。例として、ビヒクル対照処理細胞と比較した、リドカイン（Ａ）及びオンダンセトロン（Ｂ）で得られたＲＮＡ編集プロファイルを提供する。
レセルピン（図２１Ｃ参照）及びフルオキセチン（図２１Ｄ参照）のような、患者における特定の効果の誘発が高リスクである２つの化合物について、ＲＮＡ編集プロファイルを得た。
実施例７：ＲＮＡ編集の経時的解析
ＨＴＲ２Ｃに対するアリピプラゾール、インターフェロン（ＩＦＮ）、及びレセルピンによるＲＮＡ編集の変化の経時的解析を観察した（図２２Ａ〜２２Ｃ参照）。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を３個全ての化合物で処理すると、ＲＮＡ編集プロファイルの時間依存的変化が生じた。これは、未編集ＨＴＲ２Ｃのそれぞれの相対的割合が経時的な減少を示すことによって、明確に示されている。興味深いことに、処理によって誘発された変化の特異度は、アリピプラゾール（図２２Ａ参照）及びインターフェロン（図２２Ｂ参照）又はレセルピン（図２２Ｃ参照）の間で得られたプロファイルの違いによって示される。最も好ましいアルゴリズムを適用して、各化合物のリスクスコアを、研究の各時点において決定した（ｐｒｏｂ（アルゴリズム））。インターフェロンとレセルピンのリスクスコアは全ての時点で高かったが、アリピプラゾール処理は２４時間以降にリスクがあることが確実に特定された（下記表１４参照）。
表１４：アリピプラゾール、インターフェロン、及びレセルピン処理後の、いくつかの時点におけるリスクスコアのレベル
Figure 2019515651
実施例８：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を異なる化合物で処理した後の、ＲＮＡ編集プロファイルの用量依存的変化
クロザピン、セルトラリン、及びケタミンの３種の異なる化合物でＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を処理した後、ＲＮＡ編集プロファイルの用量依存的変化が得られた（図２３Ａ〜２３Ｃ参照）。
ＲＮＡ編集プロファイルは、ビヒクル処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞と比較した、ＨＴＲ２Ｃ ＲＮＡ編集のそれぞれの相対的割合を表す。
参考文献
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Claims (16)

  1. 患者において化合物が特定の効果を誘発する確率をインビトロで予測するためのアルゴリズムであって、前記アルゴリズム又はモデルが、
    ａ）−ｐｒｅ−ｍＲＮＡがＡＤＡＲ酵素（ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ Ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ））の基質であるＲＮＡの、少なくとも１つの編集部位に対する前記ＡＤＡＲの作用により異なるアイソフォーム又は部位の生成がもたらされるＡ−ｔｏ−Ｉ編集を示す少なくとも１つの標的を選択する工程、
    −前記少なくとも１つの標的及び少なくとも前記ＡＤＡＲ酵素を内因的に発現する少なくとも１つの細胞株を選択する工程、
    −前記細胞株の細胞が処理された場合、前記標的アイソフォーム又は編集部位の相対的割合を用量依存的に変化させることができる陽性対照化合物を選択する工程、
    −前記特定の効果を誘発するリスクスコアを注釈付けされた、一定の化合物比で構成された分子の集合を選択する工程、
    ｂ）前記細胞株の細胞を、陰性対照及び前記陽性対照と併せて、前記分子の集合の個々の単一分子で処理する工程、
    ｃ）前記標的のＲＮＡ編集レベルの割合を、その編集アイソフォーム及び／又は部位のそれぞれについて、前記集合の分子それぞれについて得るために、その集合の分子で処理された個々の試料の前記少なくとも１つの標的ＲＮＡ編集プロファイルを解析する工程、
    ｄ）−ｉ）単変量解析統計法により、個々のアイソフォーム／又は編集部位について、分子が前記特定の効果を誘発するリスクを識別するその正診率及びその能力を評価する工程；及び／又は
    −ｉｉ）多変量解析統計法により、アイソフォーム／又は編集部位の各組み合わせについて、分子が前記特定の効果を誘発するリスクを識別するその正診率及びその能力を評価する工程、及び
    −ｉｉｉ）最良の識別能を示す組み合わせを選択する工程、
    ｅ）アイソフォーム／又は編集部位の前記選択された組み合わせを用いてアルゴリズムを構築し、このようにして得られた前記アルゴリズムを、前記化合物が患者において前記特定の効果を誘発する確率を予測するために使用する工程、
    を含む方法によって得られる、アルゴリズム。
  2. 前記効果が、有害な副作用又は所望の副作用、好ましくは有害な副作用から選択される副作用である、請求項１に記載のアルゴリズム。
  3. ＲＮＡのＡ−ｔｏ−Ｉ編集を示す前記標的が、５−ＨＴ２ｃＲ、ＰＤＥ８Ａ（ホスホジエステラーゼ８Ａ）、ＧＲＩＡ２（グルタミン酸受容体２）、ＧＲＩＡ３、ＧＲＩＡ４、ＧＲＩＫ１、ＧＲＩＫ２、ＧＲＩＮ２Ｃ、ＧＲＭ４、ＧＲＭ６、ＦＬＮＢ（フィラミンＢ）、５−ＨＴ２Ａ、ＧＡＢＲＡ３、ＦＬＮＡ、ＣＹＦＩＰ２からなる群から選択される、請求項１又は２に記載のアルゴリズム。
  4. 前記特定の効果が有害な精神医学的副作用である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアルゴリズム。
  5. 前記細胞株が、
    −前記標的及び（１又は複数の）ＡＤＡＲを内因的に発現し、
    −神経芽細胞腫細胞株、好ましくはヒト細胞株、
    −陰性対照又はビヒクル対照に対して正規化された場合に、陽性対照が少なくとも４、５、又は６の誘発倍率でＡＤＡＲ１ａ発現を誘発した神経芽腫細胞株、並びに
    −ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株、
    からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアルゴリズム。
  6. 工程ｂ）において、前記細胞株の細胞が、１２時間〜７２時間、好ましくは４８時間±４時間の間、被験分子又は対照で処理される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアルゴリズム。
  7. 前記陽性対照がインターフェロンアルファである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアルゴリズム。
  8. 工程ｃ）が、個々の分子及び個々の編集アイソフォーム／又は編集部位について、前記標的のＲＮＡ編集レベルの平均／中央値の相対的割合を得るために、ビヒクル処理対照細胞と比較した、前記細胞株中の個々のアイソフォーム／又は部位についてのＲＮＡ編集の基底レベルを決定する工程を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアルゴリズム。
  9. 前記方法が、薬物又は化合物が特定の効果を誘発する確率を、リスクなし、若しくは低リスク、又は高リスクによりインビトロで予測する方法である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアルゴリズム。
  10. 前記分子の集合が、それぞれが前記特定の効果の誘発に対して高リスク及び低リスクのスコアを注釈付けされた、平衡化された治療クラスの分子比で構成される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアルゴリズム。
  11. 工程１）ｄ）ｉ）が、個々のアイソフォーム又はそれらの組み合わせについて：
    −前記特定の効果について、少なくとも６０の敏感度（Ｓｅ％）及び少なくとも６０％の特異度（Ｓｐ％）の最適閾値；
    −真の存在［真陽性／（真陽性＋偽陽性）］及び真の不在［真陰性／（真陰性＋偽陰性）］の割合を評価するための陽性的中率（ＰＰＶ、％）及び陰性的中率（ＮＰＶ、％）
    を計算する工程を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアルゴリズム。
  12. 工程ｃ）において、ＲＮＡ編集プロファイルが、
    −好ましくは２ステップＰＣＲ法を用いて標的の（編集部位を含む）目的の配列断片を選択的にシーケンシングする、ＮＧＳライブラリーの調製を含むＮＧＳ法（次世代シーケンシング）；
    −得られた全てのＮＧＳライブラリーのシーケンシング；
    並びに任意選択で
    −前記シーケンシングデータのバイオインフォマティクス解析
    を含み、
    前記バイオインフォマティクス解析が、好ましくは以下の工程：
    −配列のプリアライメント処理と品質管理
    −参照配列に対するアライメント；及び
    −編集レベルのコーリング
    を含む方法によって実行され、標的の編集プロファイルを得る、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアルゴリズム又はモデル。
  13. 工程１）ｄ）ｉ）及び１）ｄ）ｉｉ）並びに工程１）ｅ）において、前記アルゴリズム又はモデルの取得を可能にする前記統計的方法が：
    −ｍＲＯＣプログラム、特に、ＡＵＣ（曲線下面積）ＲＯＣを最大化し、それぞれの組み合わせについての方程式が新しい仮想マーカＺとして以下：
    Ｚ＝ａ１（アイソフォーム１）＋ａ２（アイソフォーム２）＋．．．ａｉ（アイソフォームｉ）＋．．．ａｎ（アイソフォームｎ）
    （式中、ａ１は計算された係数であり、（アイソフォームｉ）はアイソフォームの標的の個々のＲＮＡ編集レベルの相対的割合である）
    のように提供され、使用され得る、線形結合を特定するためのプログラム；及び／又は
    −単変量及び多変量解析に適用され、異なるアイソフォームの値で分子の相対的リスクを推定するロジスティック回帰モデル；及び／又は
    −アイソフォームの組み合わせを評価するために適用されるＣＡＲＴ（分類ツリー及び回帰ツリー（Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｒｅｅｓ））アプローチ；及び／又は
    −アイソフォームの組み合わせを評価し、特に、編集アイソフォームの重要度をランク付けし、最良のアイソフォームを組み合わせて、分子の「相対的リスク」を分類するために適用されるランダムフォレスト（ＲＦ）アプローチ、及び／又は任意選択で、
    −以下の群：
    −サポートベクターマシン（ＳＶＭ）アプローチ；
    −人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）アプローチ；
    −ベイジアンネットワークアプローチ；
    −ｗＫＮＮ（重み付けｋ近傍）アプローチ；
    −部分最小二乗法−判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）；並びに
    −線形及び二次判別分析（ＬＤＡ／ＱＤＡ）
    からなる群から選択する、分子の「相対的リスク」についてアイソフォームの組み合わせを評価するために適用される多変量解析、
    を含む方法によって実行される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のアルゴリズム。
  14. −前記１つの標的が５−ＨＴ２ｃＲであり、
    −前記特定の効果が精神医学的有害副作用であり、
    −細胞株がヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞株であり、
    −陽性対照がインターフェロンアルファであり、
    並びに、
    −試験薬物による前記精神医学的有害副作用の誘発が低リスクであるか、又は高リスクであるかを識別することができる部位の組み合わせが、以下の５−ＨＴ２ｃＲの部位：
    Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ、
    好ましくは前記部位の少なくとも３、４、又は５つの組み合わせ、
    で構成される群から選択される少なくとも２、３、４、又は５つの単一部位の少なくとも１つの組み合わせを含むか、
    −又は試験薬物による前記精神医学的有害副作用の誘発が低リスクであるか、又は高リスクであるかを識別することができるアイソフォームの組み合わせが、以下の５−ＨＴ２ｃＲのアイソフォーム：
    Ａ、Ｂ、ＡＢ、ＡＢＣ、ＡＣ、Ｃ、Ｄ、ＡＤ、ＡＥ、ＡＣＤ、ＡＥＣ、ＡＢＣＤ、及びＮＥ、
    好ましくは前記アイソフォームの少なくとも５、６、又は７つの組み合わせ
    で構成される群から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３の、単一アイソフォームの少なくとも１つの組み合わせを含み、並びに任意選択で、
    前記アルゴリズムまたはモデルの取得を可能にする前記統計的方法が、
    −ｍＲＯＣプログラム、ランダムフォレストアプローチ、及び／又はＣａｒｔアルゴリズム
    を含む方法により実行される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のアルゴリズム。
  15. 薬物、化合物、又は分子が、患者において特定の効果、好ましくは副作用、より好ましくは有害又は所望の副作用を誘発する確率又はリスクを予測するインビトロの方法であって、ｐｒｅ−ｍＲＮＡがＡＤＡＲ酵素の基質であるＲＮＡの、前記ＡＤＡＲの作用により異なるアイソフォームまたは部位の生成がもたらされるＡ−ｔｏ−Ｉ編集を示す標的を使用し、
    Ａ）前記標的のＲＮＡ編集レベルの割合を、その編集アイソフォームのそれぞれについて得るために、前記薬物又は化合物または分子で処理された試料の標的ＲＮＡ編集プロファイルを解析し、
    前記標的ＲＮＡ編集プロファイルが、前記特定の効果について得られた、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のアルゴリズム又はモデルにおける分子集合の分子について得られたものとして得られる工程、
    Ｂ）請求項１〜１４のいずれか１項に記載の、前記標的及び前記特定の効果について得られたアルゴリズム又はモデルを用いて、前記薬物若しくは化合物について得られた最終値又は適用されたアルゴリズム若しくはモデルを計算する工程；並びに、
    Ｃ）工程Ｂ）で得られた結果を考慮して、前記薬物又は化合物が、患者において前記特定の効果を誘発するリスクがあるかどうかを、特に低リスク対高リスクで判定する工程：
    を含む、方法。
  16. 薬物が、患者において有害副作用を誘発するリスクがあるか、特に低リスク又はリスクなし対高リスクであるかどうかを判定するためのキットであって、
    １）解析により、患者において前記有害副作用を誘発するリスクが判定される最終値を前記試験薬物について得るために、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のアルゴリズム又はモデルを使用するための説明書、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法を適用するための説明書であり、任意選択でＲＯＣ曲線又はＣａｒｔ決定木を含む説明書；並びに、
    ２）１）の前記説明書の前記アルゴリズム又は前記モデルを判定するために使用される分子集合の個々の分子について編集ＲＮＡプロファイルを得るために必要な試薬に準じた、前記試験薬物について得られる編集ＲＮＡプロファイルを判定するための試薬；
    を含む、キット。
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