JP2019218265A - Method for enhancing blood retentivity of peptide - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ペプチドの血中滞留性を増強させる技術に関する。 The present invention relates to a technique for enhancing the retention of a peptide in blood.
グリコサミノグリカンは糖鎖の１種であり、アミノ糖を含む二糖が繰り返し重合した構造を骨格として有する直鎖状の多糖である。コンドロイチンとヘパロサンは、どちらもグリコサミノグリカンの１種である。コンドロイチンは、グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）とＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）からなる二糖が繰り返し重合した構造［→４）−β−ＧｌｃＵＡ−（１→３）−β−ＧａｌＮＡｃ−（１→］を骨格とする多糖である。ヘパロサンは、グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）とＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からなる二糖が繰り返し重合した構造［→４）−β−ＧｌｃＵＡ−（１→４）−α−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］を骨格とする多糖である。 Glycosaminoglycan is a kind of sugar chain, and is a linear polysaccharide having a structure in which a disaccharide containing an amino sugar is repeatedly polymerized as a skeleton. Chondroitin and heparosan are both glycosaminoglycans. Chondroitin has a structure in which a disaccharide composed of glucuronic acid (GlcUA) and N-acetylgalactosamine (GalNAc) is repeatedly polymerized [→ 4] -β-GlcUA- (1 → 3) -β-GalNAc- (1 →). Heparosan has a structure in which a disaccharide composed of glucuronic acid (GlcUA) and N-acetylglucosamine (GlcNAc) is repeatedly polymerized [→ 4) -β-GlcUA- (1 → 4) -α-GlcNAc-. (1 →) is a polysaccharide having a skeleton.
特許文献１には、「コンドロイチン生産能を有する微生物によって生産されたコンドロイチンおよび／またはコンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンをタンパク質に結合させて複合体を形成させることにより、当該タンパク質の血中滞留性を著しく増強できること」が記載されている。
特許文献２には、「ヘパロサンと薬剤の複合体」が記載されている。当該文献は、「薬剤の薬物動態（血中半減期等）を改善する技術を提供すること」を課題としている。ここで当該文献には、「ヘパロサンと薬剤は、リンカーを介して結合していてもよい」と記載されている。また当該文献においては、「リンカーは任意の鎖長であってよい」と記載されている。 Patent Literature 2 describes “complex of heparosan and a drug”. The document aims to provide a technique for improving the pharmacokinetics (half-life in blood, etc.) of a drug. Here, the document states that "heparosan and a drug may be bound via a linker". In addition, the document describes that "the linker may have an arbitrary chain length".
特許文献３には、「少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド」が記載されている。当該文献は、「ＧＬＰ−１と比べて、血中安定性が増大しており、さらに好ましくは、高い血糖値抑制活性を示す、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを提供すること」を課題としている。ここで当該文献には、「糖鎖とアミノ酸とは、リンカーを介して結合していてもよい」と記載されている。また当該文献においては、「リンカーを介さない場合とリンカーを介する場合とで、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの血糖値上昇抑制活性に大きな違いはみられない」と記載されている。 Patent Document 3 describes “a glycosylated GLP-1 peptide in which at least one amino acid is substituted with a glycosylated amino acid”. The subject of the literature is to provide a glycosylated GLP-1 peptide which has increased blood stability compared to GLP-1, and more preferably exhibits high blood sugar level suppressing activity. . Here, the document states that "a sugar chain and an amino acid may be bound via a linker". In addition, the document states that "there is no significant difference in the blood glucose level-inhibiting activity of the glycosylated GLP-1 peptide between the case without a linker and the case with a linker".
特許文献１には、コンドロイチンとタンパク質を結合させるための手段としてリンカーを用いることについての開示や示唆がない。また、特許文献２にはヘパロサンと薬剤を、特許文献３には糖鎖とＧＬＰ−１ペプチドを、それぞれ結合させるための手段としてリンカーを用いる態様が開示されているが、リンカーの構造によって血中滞留性が変化し得ることについての開示も示唆もない。
本発明は、ペプチドの血中滞留性を増強させる技術を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a technique for enhancing the blood retention of a peptide.
特許文献１〜３より明らかなように、当技術分野においてリンカーは、糖鎖と薬剤（ペプチド等）を結合させるための手段の一つとして使用可能であると認識されるにとどまっていた。すなわち、当業者はグリコサミノグリカンを用いてペプチドの血中滞留性を増強させるためにはリンカーを用いることが好ましいとの着想を有しておらず、当技術分野においては、糖鎖とペプチドを結合するために用いるリンカーの構造がペプチドの血中滞留性に影響するとは認識されていなかった。
As is clear from
本発明者らは、ペプチドの血中滞留性を増強させる手段についての検討を鋭意行った。その結果、本発明者らは、リンカーを介してコンドロイチンやヘパロサン等のグリコサミノグリカンとペプチドを結合させることにより、ペプチドの血中滞留性を増強できることを見出した。また、本発明者らは、特に、特定の構造を有するリンカーを採用することにより、ペプチドの血中滞留性を顕著に増強できることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。 The present inventors diligently studied means for enhancing the retention of peptides in blood. As a result, the present inventors have found that binding of a peptide to glycosaminoglycans such as chondroitin and heparosan via a linker can enhance the retention of the peptide in blood. In addition, the present inventors have found that the use of a linker having a specific structure can significantly enhance the retention of a peptide in blood. The present inventors have completed the present invention based on these findings.
前記課題は、以下の態様を包含する本発明によって解決される。
［Ａ１］
リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させる工程を含む、ペプチドの血中滞留性を増強させる方法。
［Ａ２］
リンカーが、下記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ５）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ａ１］に記載の方法。
−Ａ１− （Ｌ１）
（式中、Ａ１は炭素数１以上のアルキレン基を表す。）
−Ａ１−Ｙ１−Ａ２− （Ｌ２）
（式中、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１は任意の結合を表す。）
−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｙ２−Ａ３− （Ｌ３）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立して任意の結合を表す。）
−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｐｈ−Ａ３− （Ｌ４）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｐｈはフェニレン基を表す。）
−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−ｃＨｅｘ−Ａ３− （Ｌ５）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、ｃＨｅｘはシクロヘキシレン基を表す。）
［Ａ３］
リンカーが、下記一般式（Ｌ６）〜（Ｌ１０）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ａ１］に記載の方法。
Ｚ１−Ａ１− （Ｌ６）
（式中、Ａ１は炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｚ１は任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２− （Ｌ７）
（式中、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｙ２−Ａ３− （Ｌ８）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、
Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立して任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｐｈ−Ａ３− （Ｌ９）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表し、Ｐｈはフェニレン基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−ｃＨｅｘ−Ａ３− （Ｌ１０）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表し、ｃＨｅｘはシクロヘキシレン基を表す。）
［Ａ４］
リンカーが、下記一般式（Ｌ１１）〜（Ｌ１５）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ａ１］に記載の方法。
Ｚ１−Ａ１−Ｚ２ （Ｌ１１）
（式中、Ａ１は炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立して任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｚ２ （Ｌ１２）
（式中、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立して任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｙ２−Ａ３−Ｚ２ （Ｌ１３）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立して任意の結合を表し、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立して任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｐｈ−Ａ３−Ｚ２ （Ｌ１４）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立して任意の官能基を表し、Ｐｈはフェニレン基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−ｃＨｅｘ−Ａ３−Ｚ２ （Ｌ１５）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立して任意の官能基を表し、ｃＨｅｘはシクロヘキシレン基を表す。）
［Ａ５］
Ｙ１及びＹ２が、それぞれ独立して下記一般式（Ｙ１）〜（Ｙ１２）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ａ２］〜［Ａ４］のいずれかに記載の方法。
−Ｎ＝ＣＨ− （Ｙ１）
−ＣＨ＝Ｎ− （Ｙ２）
−ＮＨ−ＣＨ２− （Ｙ３）
―ＣＨ２−ＮＨ− （Ｙ４）
−ＮＨ−ＣＯ− （Ｙ５）
−ＣＯ−ＮＨ− （Ｙ６）
−Ｓ− （Ｙ７）
−Ｓ−Ｓ− （Ｙ８）
−ＣＯ−ＣＨ２−Ｓ− （Ｙ９）
−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ− （Ｙ１０）
−Ｓｕｃ−Ｓ− （Ｙ１１）
（式中、Ｓｕｃは１，３−ピロリジン−２，５−ジオン基を表す。）
−Ｓ−Ｓｕｃ− （Ｙ１２）
（式中、Ｓｕｃは１，３−ピロリジン−２，５−ジオン基を表す。）
［Ａ６］
Ｚ１及びＺ２が、それぞれ独立して下記一般式（Ｚ１）〜（Ｚ７）のいずれかに示され
る構造を有する、前記［Ａ３］〜［Ａ５］のいずれかに記載の方法。
−ＮＨ２ （Ｚ１）
−ＳＨ （Ｚ２）
−ＣＨＯ （Ｚ３）
−ＣＯ−ＣＨ２−Ｘ （Ｚ４）
（式中、Ｘは任意のハロゲン原子を表す。）
−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ （Ｚ５）
−Ｍａｌ （Ｚ６）
（式中、ＭａｌはＮ−マレイミド基を表す。）
−ＣＯ−Ｏ−Ｓｕ （Ｚ７）
（式中、ＳｕはＮ−スクシンイミジル基又は３−スルホ−Ｎ−スクシンイミジル基を表す。）
［Ａ７］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーとペプチドのアミノ酸残基との結合である、前記［Ａ１］〜［Ａ６］のいずれかに記載の方法。
［Ａ８］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーとペプチドのリジン残基、システイン残基、Ｎ末端のアミノ酸残基、及び／又はＣ末端のアミノ酸残基との結合である、前記［Ａ１］〜［Ａ６］のいずれかに記載の方法。
［Ａ９］
リンカーとペプチドのリジン残基との結合が、リンカーとペプチドのリジン残基のε−アミノ基との結合である、前記［Ａ８］に記載の方法。
［Ａ１０］
リンカーとペプチドのシステイン残基との結合が、リンカーとペプチドのシステイン残基のチオール基との結合である、前記［Ａ８］に記載の方法。
［Ａ１１］
リンカーとペプチドのＮ末端のアミノ酸残基との結合が、リンカーとペプチドのＮ末端のアミノ酸残基のα−アミノ基との結合である、前記［Ａ８］に記載の方法。
［Ａ１２］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーの官能基Ｚ１とペプチドの官能基の反応により形成される結合である、前記［Ａ３］〜［Ａ１１］のいずれかに記載の方法。
［Ａ１３］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの糖残基との結合である、前記［Ａ１］〜［Ａ１２］のいずれかに記載の方法。
［Ａ１４］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの還元末端の糖残基との結合である、前記［Ａ１］〜［Ａ１２］のいずれかに記載の方法。
［Ａ１５］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの還元末端の糖残基の１位の炭素原子との結合である、前記［Ａ１］〜［Ａ１２］のいずれかに記載の方法。
［Ａ１６］
糖残基が、グルコサミン残基、ガラクトサミン残基、又はグルクロン酸残基である、前記［Ａ１３］〜［Ａ１５］のいずれかに記載の方法。
［Ａ１７］
グルコサミン残基が、Ｎ−アセチルグルコサミン残基である、前記［Ａ１６］に記載の方法。
［Ａ１８］
ガラクトサミン残基が、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基である、前記［Ａ１６］に記載の方法。
［Ａ１９］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーの官能基Ｚ２とグリコサミノグリカンの官能基の反応により形成される結合である、前記［Ａ４］〜［Ａ１８］のいずれかに記載の方法。
［Ａ２０］
グリコサミノグリカンが、コンドロイチン及び／又はヘパロサンである、前記［Ａ１］〜［Ａ１９］のいずれかに記載の方法。
［Ａ２１］
リンカーとペプチドの結合およびリンカーとグリコサミノグリカンの結合が、共有結合である、前記［Ａ１］〜［Ａ２０］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ１］
ペプチドが、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択されるペプチドである、前記［Ａ１］〜［Ａ２１］のいずれかに記載の方法。
（Ａ）下記（ａ）に示されるＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸配列を含むペプチド。
（ａ）ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（ＧＬＰ−１（７−３７））
（Ｂ）下記（ｂ１）〜（ｂ３）からなる群より選択されるＧＬＰ−１（７−３７）のアナログのアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ１）ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＣ（ＧＬＰ−１Ｃ）
（ｂ２）ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＲＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（ＧＬＰ−１ＲＫ）
（ｂ３）ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＣ（ＧＬＰ−１ｏｒｉＣ）
（Ｃ）前記（ａ）および（ｂ１）〜（ｂ３）のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、血糖抑制作用を有する、ペプチド。
（Ｄ）前記（ａ）および（ｂ１）〜（ｂ３）のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、血糖抑制作用を有する、ペプチド。
［Ｂ２］
リンカーが、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ１５）のいずれかに示される構造を有するリンカーであり、式中、Ａ１が炭素数８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４のアルキレン基である、前記［Ｂ１］に記載の方法。
［Ｂ３］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーと前記［Ｂ１］における（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに示されるペプチドの２６位のリジン残基、３４位のリジン残基、３７位のシステイン残基、及び／又はＣ末端のアミノ酸残基との結合である、前記［Ｂ１］又は［Ｂ２］に記載の方法。
［Ｃ１］
ペプチドが、下記（Ａ）に示されるペプチド及び下記（Ｂ）に示されるペプチドを含むペプチド多量体であって、血糖抑制作用を有するペプチド多量体である、前記［Ａ１］〜［Ａ２１］のいずれかに記載の方法。
（Ａ）下記（ａ１）に示されるインスリンＡ鎖のアミノ酸配列を含むペプチド、又は下記（ａ２）若しくは（ａ３）に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（ａ１）ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ
（ａ２）前記（ａ１）に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
（ａ３）前記（ａ１）に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
（Ｂ）下記（ｂ１）に示されるインスリンＢ鎖のアミノ酸配列を含むペプチド、又は下記
（ｂ２）若しくは（ｂ３）に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ１）ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ
（ｂ２）前記（ｂ１）に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
（ｂ３）前記（ｂ１）に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
［Ｃ２］
リンカーが、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ１５）のいずれかに示される構造を有するリンカーであり、式中、Ａ１が炭素数１、２、３、４、５、又は６のアルキレン基である、前記［Ｃ１］に記載の方法。
［Ｃ３］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーと前記［Ｃ１］における（Ｂ）に示されるペプチドの２９位のリジン残基、及び／又は前記［Ｃ１］における（Ａ）に示されるペプチドのＮ末端のアミノ酸残基である、前記［Ｃ１］又は［Ｃ２］に記載の方法。
［Ｃ４］
ペプチド多量体が、前記［Ｃ１］における（Ａ）に示されるペプチド及び前記［Ｃ１］における（Ｂ）に示されるペプチドからなるペプチド二量体であって、血糖抑制作用を有するペプチド二量体である、前記［Ｃ１］〜［Ｃ３］のいずれかに記載の方法。
［Ｄ１］
前記［Ａ１］〜［Ａ２１］、［Ｂ１］〜［Ｂ３］、又は［Ｃ１］〜［Ｃ４］のいずれかに記載の方法を行う工程を含む、血中滞留性が増強されたペプチドの製造方法。
［Ｄ２］
前記［Ｂ１］〜［Ｂ３］のいずれかに記載の方法を行う工程を含む、血中滞留性が増強されたＧＬＰ−１誘導体の製造方法。
［Ｄ３］
前記［Ｃ１］〜［Ｃ４］のいずれかに記載の方法を行う工程を含む、血中滞留性が増強されたインスリン誘導体の製造方法。
［Ｅ１］
Ｚ１−Ｌ−Ｇで示される構造を有する、グリコサミノグリカンの誘導体。
（式中、Ｚ１は任意の官能基を表し、Ｌはリンカーを表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
［Ｅ２］
Ｌが、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ５）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ｅ１］に記載の誘導体。
［Ｅ３］
Ｚ１−Ｌが、前記一般式（Ｌ６）〜（Ｌ１０）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ｅ１］に記載の誘導体。
［Ｅ４］
Ｚ１−Ｌ−Ｇが、下記一般式（Ｌ１６）〜（Ｌ２０）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ｅ１］に記載の誘導体。
Ｚ１−Ａ１−Ｇ （Ｌ１６）
（式中、Ａ１は炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｚ１は任意の官能基を表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｇ （Ｌ１７）
（式中、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｙ２−Ａ３−Ｇ （Ｌ１８）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立して任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｐｈ−Ａ３−Ｇ （Ｌ１９）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表し、Ｐｈはフェニレン基を表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−ｃＨｅｘ−Ａ３−Ｇ （Ｌ２０）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表し、ｃＨｅｘはシクロヘキシレン基を表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
［Ｅ５］
Ｙ１及びＹ２が、それぞれ独立して前記一般式（Ｙ１）〜（Ｙ１２）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ｅ２］〜［Ｅ４］のいずれかに記載の誘導体。
［Ｅ６］
Ｚ１が、前記一般式（Ｚ１）〜（Ｚ７）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ｅ１］〜［Ｅ５］のいずれかに記載の誘導体。
［Ｅ７］
リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させ、グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させて、ペプチドの血中滞留性を増強させるために用いられる、前記［Ｅ１］〜［Ｅ６］のいずれかに記載の誘導体。
［Ｅ８］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーとペプチドのアミノ酸残基との結合である、前記［Ｅ７］に記載の誘導体。
［Ｅ９］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーとペプチドのリジン残基、システイン残基、Ｎ末端のアミノ酸残基、及び／又はＣ末端のアミノ酸残基との結合である、前記［Ｅ７］に記載の誘導体。
［Ｅ１０］
リンカーとペプチドのリジン残基との結合が、リンカーとペプチドのリジン残基のε−アミノ基との結合である、前記［Ｅ９］に記載の誘導体。
［Ｅ１１］
リンカーとペプチドのシステイン残基との結合が、リンカーとペプチドのシステイン残基のチオール基との結合である、前記［Ｅ９］に記載の誘導体。
［Ｅ１２］
リンカーとペプチドのＮ末端のアミノ酸残基との結合が、リンカーとペプチドのＮ末端のアミノ酸残基のα−アミノ基との結合である、前記［Ｅ９］に記載の誘導体。
［Ｅ１３］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーの官能基Ｚ１とペプチドの官能基の反応により形成される結合である、前記［Ｅ７］〜［Ｅ１２］のいずれかに記載の誘導体。
［Ｅ１４］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの糖残基との結合である、前記［Ｅ１］〜［Ｅ１３］のいずれかに記載の誘導体。
［Ｅ１５］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの還元末端の糖残基との結合である、前記［Ｅ１］〜［Ｅ１３］のいずれかに記載の誘導体。
［Ｅ１６］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの還元末端の糖残基の１位の炭素原子との結合である、前記［Ｅ１］〜［Ｅ１３］のいずれかに記載の誘導体。
［Ｅ１７］
糖残基が、グルコサミン残基、ガラクトサミン残基、又はグルクロン酸残基である、前記［Ｅ１４］〜［Ｅ１６］のいずれかに記載の誘導体。
［Ｅ１８］
グルコサミン残基が、Ｎ−アセチルグルコサミン残基である、前記［Ｅ１７］に記載の誘導体。
［Ｅ１９］
ガラクトサミン残基が、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基である、前記［Ｅ１７］に記載の誘導体。
［Ｅ２０］
グリコサミノグリカンが、コンドロイチン及び／又はヘパロサンである、前記［Ｅ１］〜［Ｅ１９］のいずれかに記載の誘導体。
［Ｅ２１］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、共有結合である、前記［Ｅ１］〜［Ｅ２０］のいずれかに記載のグリコサミノグリカンの誘導体。
［Ｅ２２］
リンカーとペプチドの結合が、共有結合である、前記［Ｅ７］〜［Ｅ２１］のいずれかに記載のグリコサミノグリカンの誘導体。
［Ｅ２３］
前記［Ａ１］〜［Ａ２１］、［Ｂ１］〜［Ｂ３］、［Ｃ１］〜［Ｃ４］、又は［Ｄ１］〜［Ｄ３］のいずれかに記載の方法を行うために用いられる、前記［Ｅ１］〜［Ｅ２２］のいずれかに記載の誘導体。
［Ｅ２４］
前記［Ｅ１］〜［Ｅ２３］のいずれかに記載の誘導体を含有する、ペプチドの血中滞留性を増強するための増強剤。
［Ｆ１］
Ｐ−Ｌ−Ｇで示される構造を有する、グリコサミノグリカンとペプチドの複合体。
（式中、Ｐはペプチドを表し、Ｌはリンカーを表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
［Ｆ２］
Ｌが、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ５）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ｆ１］に記載の複合体。
［Ｆ３］
Ｐ−Ｌが、下記一般式（Ｌ２１）〜（Ｌ２５）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ｆ１］に記載の複合体。
Ｐ−Ａ１− （Ｌ２１）
（式中、Ａ１は炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｐはペプチドを表す。）
Ｐ−Ａ１−Ｙ１−Ａ２− （Ｌ２２）
（式中、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｐはペプチドを表す。）
Ｐ−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｙ２−Ａ３− （Ｌ２３）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立して任意の結合を表し、Ｐはペプチドを表す。）
Ｐ−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｐｈ−Ａ３− （Ｌ２４）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｐｈはフェニレン基を表し、Ｐはペプチドを表す。）
Ｐ−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−ｃＨｅｘ−Ａ３− （Ｌ２５）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、ｃＨｅｘはシクロヘキシレン基を表し、Ｐはペプチドを表す。）
［Ｆ４］
Ｐ−Ｌ−Ｇが、下記一般式（Ｌ２６）〜（Ｌ３０）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ｆ１］に記載の複合体。
Ｐ−Ａ１−Ｇ （Ｌ２６）
（式中、Ａ１は炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｐはペプチドを表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
Ｐ−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｇ （Ｌ２７）
（式中、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｐはペプチドを表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
Ｐ−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｙ２−Ａ３−Ｇ （Ｌ２８）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立して任意の結合を表し、Ｐはペプチドを表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
Ｐ−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｐｈ−Ａ３−Ｇ （Ｌ２９）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｐはペプチドを表し、Ｐｈはフェニレン基を表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
Ｐ−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−ｃＨｅｘ−Ａ３−Ｇ （Ｌ３０）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｐはペプチドを表し、ｃＨｅｘはシクロヘキシレン基を表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
［Ｆ５］
Ｙ１及びＹ２が、それぞれ独立して前記一般式（Ｙ１）〜（Ｙ１２）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ｆ２］〜［Ｆ４］のいずれかに記載の複合体。
［Ｆ６］
ペプチドそのものと比較して血中滞留性が増強されている、前記［Ｆ１］〜［Ｆ５］のいずれかに記載の複合体。
［Ｆ７］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーとペプチドのアミノ酸残基との結合である、前記［Ｆ１］〜［Ｆ６］
のいずれかに記載の複合体。
［Ｆ８］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーとペプチドのリジン残基、システイン残基、Ｎ末端のアミノ酸残基、及び／又はＣ末端のアミノ酸残基との結合である、前記［Ｆ１］〜［Ｆ６］のいずれかに記載の複合体。
［Ｆ９］
リンカーとペプチドのリジン残基との結合が、リンカーとペプチドのリジン残基のε−アミノ基との結合である、前記［Ｆ８］に記載の複合体。
［Ｆ１０］
リンカーとペプチドのシステイン残基との結合が、リンカーとペプチドのシステイン残基のチオール基との結合である、前記［Ｆ８］に記載の複合体。
［Ｆ１１］
リンカーとペプチドのＮ末端のアミノ酸残基との結合が、リンカーとペプチドのＮ末端のアミノ酸残基のα−アミノ基との結合である、前記［Ｆ８］に記載の複合体。
［Ｆ１２］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの糖残基との結合である、前記［Ｆ１］〜［Ｆ１１］のいずれかに記載の複合体。
［Ｆ１３］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの還元末
端の糖残基との結合である、前記［Ｆ１］〜［Ｆ１１］のいずれかに記載の複合体。
［Ｆ１４］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの還元末端の糖残基の１位の炭素原子との結合である、前記［Ｆ１］〜［Ｆ１１］のいずれかに記載の複合体。
［Ｆ１５］
糖残基が、グルコサミン残基、ガラクトサミン残基、又はグルクロン酸残基である、前記［Ｆ１２］〜［Ｆ１４］のいずれかに記載の複合体。
［Ｆ１６］
グルコサミン残基が、Ｎ−アセチルグルコサミン残基である、前記［Ｆ１５］に記載の複合体。
［Ｆ１７］
ガラクトサミン残基が、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基である、前記［Ｆ１５］に記載の複合体。
［Ｆ１８］
グリコサミノグリカンが、コンドロイチン及び／又はヘパロサンである、前記［Ｆ１］〜［Ｆ１７］のいずれかに記載の複合体。
［Ｆ１９］
リンカーとペプチドの結合およびリンカーとグリコサミノグリカンの結合が、共有結合である、前記［Ｆ１］〜［Ｆ１８］のいずれかに記載の複合体。
［Ｆ２０］
グリコサミノグリカンとペプチドの複合体が、前記［Ｄ１］〜［Ｄ３］のいずれかに記載の方法を行うことにより得られる複合体である、前記［Ｆ１］〜［Ｆ１９］のいずれかに記載の複合体。
［Ｆ２１］
前記［Ｆ１］〜［Ｆ２０］のいずれかに記載の複合体を含有する、医薬組成物。
［Ｆ２２］
前記［Ｆ１］〜［Ｆ２０］のいずれかに記載の複合体を含有する、ペプチド製剤。
［Ｇ１］
ペプチドが、前記［Ｂ１］における（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択されるペプチドである、前記［Ｆ１］〜［Ｆ２０］のいずれかに記載の複合体。
［Ｇ２］
前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ５）または（Ｌ２１）〜（Ｌ３０）のいずれかに示される構造において、Ａ１が炭素数８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４のアルキレン基である、前記［Ｇ１］に記載の複合体。
［Ｇ３］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーと前記［Ｂ１］における（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに示されるペプチドの２６位のリジン残基、３４位のリジン残基、３７位のシステイン残基、及び／又はＣ末端のアミノ酸残基との結合である、前記［Ｇ１］又は［Ｇ２］に記載の複合体。
［Ｇ４］
前記［Ｇ１］〜［Ｇ３］のいずれかに記載の複合体を含有する、医薬組成物。
［Ｇ５］
前記［Ｇ１］〜［Ｇ３］のいずれかに記載の複合体を含有する、ペプチド製剤。
［Ｇ６］
前記［Ｇ１］〜［Ｇ３］のいずれかに記載の複合体を含有する、ＧＬＰ−１製剤。
［Ｈ１］
ペプチドが、前記［Ｃ１］における（Ａ）に示されるペプチド及び前記［Ｃ１］における（Ｂ）に示されるペプチドを含むペプチド多量体であって、血糖抑制作用を有するペプチド多量体である、前記［Ｆ１］〜［Ｆ２０］のいずれかに記載の複合体。
［Ｈ２］
リンカーが、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ５）または（Ｌ２１）〜（Ｌ３０）のいずれかに示される構造を有するリンカーであり、式中、Ａ１が炭素数１、２、３、４、５、又は６のアルキレン基である、前記［Ｈ１］に記載の複合体。
［Ｈ３］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーと前記［Ｃ１］における（Ｂ）に示されるペプチドの２９位のリジン残基、及び／又は前記［Ｃ１］における（Ａ）に示されるペプチドのＮ末端のアミノ酸残基との結合である、前記［Ｈ１］又は［Ｈ２］に記載の複合体。
［Ｈ４］
ペプチド多量体が、前記［Ｃ１］における（Ａ）に示されるペプチド及び前記［Ｃ１］における（Ｂ）に示されるペプチドからなるペプチド二量体であって、血糖抑制作用を有するペプチド二量体である、前記［Ｈ１］〜［Ｈ３］のいずれかに記載の複合体。
［Ｈ５］
前記［Ｈ１］〜［Ｈ４］のいずれかに記載の複合体を含有する、医薬組成物。
［Ｈ６］
前記［Ｈ１］〜［Ｈ４］のいずれかに記載の複合体を含有する、ペプチド製剤。
［Ｈ７］
前記［Ｈ１］〜［Ｈ４］のいずれかに記載の複合体を含有する、インスリン製剤。
［Ｉ１］
炭素数が１以上のアルキレン基を含む構造を有するリンカーであって、これを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させてペプチドの血中滞留性を増強するために用いられるリンカー。
［Ｉ２］
リンカーが、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ１５）のいずれかに示される構造を有するリンカーである、前記［Ｉ１］に記載のリンカー。
［Ｉ３］
Ｙ１及びＹ２が、それぞれ独立して前記一般式（Ｙ１）〜（Ｙ１２）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ｉ２］に記載のリンカー。
［Ｉ４］
Ｚ１が、前記一般式（Ｚ１）〜（Ｚ７）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ｉ２］又は［Ｉ３］に記載のリンカー。
［Ｉ５］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーとペプチドのアミノ酸残基との結合である、前記［Ｉ１］〜［Ｉ４］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ６］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーとペプチドのリジン残基、システイン残基、Ｎ末端のアミノ酸残基、及び／又はＣ末端のアミノ酸残基との結合である、前記［Ｉ１］〜［Ｉ５］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ７］
リンカーとペプチドのリジン残基との結合が、リンカーとペプチドのリジン残基のε−アミノ基との結合である、前記［Ｉ１］〜［Ｉ６］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ８］
リンカーとペプチドのシステイン残基との結合が、リンカーとペプチドのシステイン残基のチオール基との結合である、前記［Ｉ１］〜［Ｉ７］のいずれかに記載のリンカー。［Ｉ９］
リンカーとペプチドのＮ末端のアミノ酸残基との結合が、リンカーとペプチドのＮ末端のアミノ酸残基のα−アミノ基との結合である、前記［Ｉ１］〜［Ｉ８］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ１０］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーの官能基Ｚ１とペプチドの官能基の反応により
形成される結合である、前記［Ｉ２］〜［Ｉ９］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ１１］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの糖残基との結合である、前記［Ｉ１］〜［Ｉ１０］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ１２］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの還元末端の糖残基との結合である、前記［Ｉ１］〜［Ｉ１１］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ１３］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの還元末端の糖残基の１位の炭素原子との結合である、前記［Ｉ１］〜［Ｉ１２］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ１４］
糖残基が、グルコサミン残基、ガラクトサミン残基、又はグルクロン酸残基である、前記［Ｉ１１］〜［Ｉ１３］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ１５］
グルコサミン残基が、Ｎ−アセチルグルコサミン残基である、前記［Ｉ１４］に記載のリンカー。
［Ｉ１６］
ガラクトサミン残基が、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基である、前記［Ｉ１４］に記載のリンカー。
［Ｉ１７］
グリコサミノグリカンが、コンドロイチン及び／又はヘパロサンである、前記［Ｉ１］〜［Ｉ１６］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ１８］
リンカーとペプチドの結合およびリンカーとグリコサミノグリカンの結合が、共有結合である、前記［Ｉ１］〜［Ｉ１７］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ１９］
前記［Ａ１］〜［Ａ２１］、［Ｂ１］〜［Ｂ３］、［Ｃ１］〜［Ｃ４］、又は［Ｄ１］〜［Ｄ３］のいずれかに記載の方法を行うために用いられる、前記［Ｉ１］〜［Ｉ１８］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ２０］
前記［Ｅ１］〜［Ｅ２３］のいずれかに記載の誘導体を製造するために用いられる、前記［Ｉ１］〜［Ｉ１８］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ２１］
前記［Ｆ１］〜［Ｆ２０］、［Ｇ１］〜［Ｇ３］、又は［Ｈ１］〜［Ｈ４］のいずれかに記載の複合体を製造するために用いられる、前記［Ｉ１］〜［Ｉ１８］のいずれかに記載のリンカー。
The above object is achieved by the present invention including the following aspects.
[A1]
A method for enhancing the blood retention of a peptide, comprising the step of binding glycosaminoglycan to a peptide via a linker to form a complex containing glycosaminoglycan and the peptide.
[A2]
The method according to [A1], wherein the linker has a structure represented by any of the following formulas (L1) to (L5).
-A 1 -(L1)
(Where A 1 Represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms. )
-A 1 -Y 1 -A 2 -(L2)
(Where A 1 And A 2 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 1 Represents an arbitrary bond. )
-A 1 -Y 1 -A 2 -Y 2 -A 3 -(L3)
(Where A 1 , A 2 And A 3 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 1 And Y 2 Each independently represents an arbitrary bond. )
-A 1 -Y 1 -A 2 -Ph-A 3 -(L4)
(Where A 1 , A 2 And A 3 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 2 And A 3 May or may not be present independently, and Y 1 Represents an arbitrary bond, and Ph represents a phenylene group. )
-A 1 -Y 1 -A 2 -CHex-A 3 -(L5)
(Where A 1 , A 2 And A 3 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 2 And A 3 May or may not be present independently, and Y 1 Represents an arbitrary bond, and cHex represents a cyclohexylene group. )
[A3]
The method according to [A1], wherein the linker has a structure represented by any of the following formulas (L6) to (L10).
Z 1 -A 1 -(L6)
(Where A 1 Represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 1 Represents an arbitrary functional group. )
Z 1 -A 1 -Y 1 -A 2 -(L7)
(Where A 1 And A 2 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 1 Represents any bond, Z 1 Represents an arbitrary functional group. )
Z 1 -A 1 -Y 1 -A 2 -Y 2 -A 3 -(L8)
(Where A 1 , A 2 And A 3 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms,
Y 1 And Y 2 Each independently represents an arbitrary bond; 1 Represents an arbitrary functional group. )
Z 1 -A 1 -Y 1 -A 2 -Ph-A 3 -(L9)
(Where A 1 , A 2 And A 3 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 2 And A 3 May or may not be present independently, and Y 1 Represents any bond, Z 1 Represents an arbitrary functional group, and Ph represents a phenylene group. )
Z 1 -A 1 -Y 1 -A 2 -CHex-A 3 -(L10)
(Where A 1 , A 2 And A 3 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 2 And A 3 May or may not be present independently, and Y 1 Represents any bond, Z 1 Represents an arbitrary functional group, and cHex represents a cyclohexylene group. )
[A4]
The method according to [A1], wherein the linker has a structure represented by any of the following formulas (L11) to (L15).
Z 1 -A 1 -Z 2 (L11)
(Where A 1 Represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 1 And Z 2 Each independently represents an arbitrary functional group. )
Z 1 -A 1 -Y 1 -A 2 -Z 2 (L12)
(Where A 1 And A 2 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 1 Represents any bond, Z 1 And Z 2 Each independently represents an arbitrary functional group. )
Z 1 -A 1 -Y 1 -A 2 -Y 2 -A 3 -Z 2 (L13)
(Where A 1 , A 2 And A 3 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 1 And Y 2 Each independently represents an arbitrary bond; 1 And Z 2 Each independently represents an arbitrary functional group. )
Z 1 -A 1 -Y 1 -A 2 -Ph-A 3 -Z 2 (L14)
(Where A 1 , A 2 And A 3 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 2 And A 3 May or may not be present independently, and Y 1 Represents any bond, Z 1 And Z 2 Each independently represents an arbitrary functional group, and Ph represents a phenylene group. )
Z 1 -A 1 -Y 1 -A 2 -CHex-A 3 -Z 2 (L15)
(Where A 1 , A 2 And A 3 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 2 And A 3 May or may not be present independently, and Y 1 Represents any bond, Z 1 And Z 2 Each independently represents an arbitrary functional group, and cHex represents a cyclohexylene group. )
[A5]
Y 1 And Y 2 Has the structure shown by any one of the following general formulas (Y1) to (Y12), respectively, The method according to any one of the above [A2] to [A4].
-N = CH- (Y1)
-CH = N- (Y2)
-NH-CH 2 -(Y3)
―CH 2 -NH- (Y4)
-NH-CO- (Y5)
-CO-NH- (Y6)
-S- (Y7)
-SS- (Y8)
-CO-CH 2 -S- (Y9)
-S-CH 2 -CO- (Y10)
-Suc-S- (Y11)
(In the formula, Suc represents a 1,3-pyrrolidine-2,5-dione group.)
-S-Suc- (Y12)
(In the formula, Suc represents a 1,3-pyrrolidine-2,5-dione group.)
[A6]
Z 1 And Z 2 Are independently represented by any of the following general formulas (Z1) to (Z7).
The method according to any one of the above [A3] to [A5], having a structure as described above.
-NH 2 (Z1)
-SH (Z2)
-CHO (Z3)
-CO-CH 2 -X (Z4)
(In the formula, X represents any halogen atom.)
-N = C = S (Z5)
-Mal (Z6)
(In the formula, Mal represents an N-maleimide group.)
-CO-O-Su (Z7)
(In the formula, Su represents an N-succinimidyl group or a 3-sulfo-N-succinimidyl group.)
[A7]
The method according to any one of [A1] to [A6], wherein the bond between the linker and the peptide is a bond between an amino acid residue of the linker and the peptide.
[A8]
The aforementioned [A1] to [A6], wherein the bond between the linker and the peptide is a bond between a lysine residue, a cysteine residue, an N-terminal amino acid residue, and / or a C-terminal amino acid residue of the peptide. The method according to any of the above.
[A9]
The method according to [A8], wherein the bond between the linker and the lysine residue of the peptide is a bond between the linker and the ε-amino group of the lysine residue of the peptide.
[A10]
The method according to [A8], wherein the bond between the linker and the cysteine residue of the peptide is a bond between the linker and a thiol group of the cysteine residue of the peptide.
[A11]
The method according to [A8], wherein the bond between the linker and the N-terminal amino acid residue of the peptide is a bond between the linker and the α-amino group of the N-terminal amino acid residue of the peptide.
[A12]
The bond between the linker and the peptide forms a functional group Z on the linker. 1 The method according to any one of the above [A3] to [A11], wherein the bond is a bond formed by a reaction between a peptide and a functional group of a peptide.
[A13]
The method according to any one of [A1] to [A12], wherein the bond between the linker and the glycosaminoglycan is a bond between the linker and a sugar residue of the glycosaminoglycan.
[A14]
The method according to any one of [A1] to [A12], wherein the bond between the linker and the glycosaminoglycan is a bond between the linker and a sugar residue at the reducing end of the glycosaminoglycan.
[A15]
The method according to any one of the above [A1] to [A12], wherein the bond between the linker and the glycosaminoglycan is a bond between the linker and the carbon atom at
[A16]
The method according to any of [A13] to [A15], wherein the sugar residue is a glucosamine residue, a galactosamine residue, or a glucuronic acid residue.
[A17]
The method according to [A16], wherein the glucosamine residue is an N-acetylglucosamine residue.
[A18]
The method according to [A16], wherein the galactosamine residue is an N-acetylgalactosamine residue.
[A19]
The bond between the linker and the glycosaminoglycan forms the functional group Z of the linker. 2 The method according to any one of the above [A4] to [A18], wherein the bond is a bond formed by the reaction of a glycosaminoglycan with a functional group of
[A20]
The method according to any one of [A1] to [A19], wherein the glycosaminoglycan is chondroitin and / or heparosan.
[A21]
The method according to any one of [A1] to [A20], wherein the bond between the linker and the peptide and the bond between the linker and the glycosaminoglycan are covalent bonds.
[B1]
The method according to any one of [A1] to [A21], wherein the peptide is a peptide selected from the group consisting of the following (A) to (D).
(A) A peptide comprising the amino acid sequence of GLP-1 (7-37) shown in (a) below.
(A) HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (GLP-1 (7-37))
(B) a peptide comprising an amino acid sequence of an analog of GLP-1 (7-37) selected from the group consisting of (b1) to (b3) below.
(B1) HGEGFTFTSDVSYLEGQAAKEFIAWLVKGRC (GLP-1C)
(B2) HGGETFTSDVSSYLEGQAAREFIAWLVKGRG (GLP-1RK)
(B3) HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRC (GLP-1oriC)
(C) An amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence shown in any one of (a) and (b1) to (b3). A peptide comprising a blood sugar inhibitory action.
(D) A peptide comprising an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence shown in any one of (a) and (b1) to (b3), and having a blood glucose-suppressing action.
[B2]
The linker is a linker having a structure represented by any one of formulas (L1) to (L15), wherein A 1 Is the alkylene group having 8, 9, 10, 11, 12, 13, or 14 carbon atoms, [B1].
[B3]
The bond between the linker and the peptide is the lysine residue at position 26, the lysine residue at position 34, the cysteine residue at position 37 of the peptide shown in any of (A) to (D) in [B1], And / or the method of the above [B1] or [B2], wherein the method is a bond with a C-terminal amino acid residue.
[C1]
Any of the above [A1] to [A21], wherein the peptide is a peptide multimer containing the peptide shown in the following (A) and the peptide shown in the following (B), and is a peptide multimer having a blood sugar suppressing action. Crab method.
(A) A peptide containing the amino acid sequence of the insulin A chain shown in (a1) below, or a peptide containing the amino acid sequence shown in (a2) or (a3) below.
(A1) GIVEQCCCTSICLYLYQLENYCN
(A2) an amino acid sequence in which one or several amino acid residues have been substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence shown in the above (a1).
(A3) an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence shown in (a1).
(B) a peptide comprising the amino acid sequence of the insulin B chain shown in (b1) below, or
A peptide comprising the amino acid sequence shown in (b2) or (b3).
(B1) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT
(B2) an amino acid sequence in which one or several amino acid residues have been substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence shown in (b1).
(B3) an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence shown in (b1).
[C2]
The linker is a linker having a structure represented by any one of formulas (L1) to (L15), wherein A 1 Is the alkylene group having 1, 2, 3, 4, 5, or 6 carbon atoms, [C1].
[C3]
The bond between the linker and the peptide is determined by the linker and the lysine residue at position 29 of the peptide shown in (B) in [C1] and / or the N-terminal amino acid residue of the peptide shown in (A) in [C1]. The method according to the above [C1] or [C2], which is a group.
[C4]
The peptide multimer is a peptide dimer consisting of the peptide shown in (A) in [C1] and the peptide shown in (B) in [C1], and is a peptide dimer having a blood glucose-suppressing action. The method according to any one of [C1] to [C3].
[D1]
A method for producing a peptide having enhanced blood retention, comprising a step of performing the method according to any one of [A1] to [A21], [B1] to [B3], or [C1] to [C4]. .
[D2]
A method for producing a GLP-1 derivative having enhanced blood retention, comprising a step of performing the method according to any of [B1] to [B3].
[D3]
A method for producing an insulin derivative having enhanced blood retention, comprising a step of performing the method according to any one of [C1] to [C4].
[E1]
Z 1 -A derivative of glycosaminoglycan having a structure represented by LG.
(Where Z 1 Represents an arbitrary functional group, L represents a linker, and G represents glycosaminoglycan. )
[E2]
The derivative according to [E1], wherein L has a structure represented by any one of formulas (L1) to (L5).
[E3]
Z 1 The derivative according to [E1], wherein -L has a structure represented by any one of formulas (L6) to (L10).
[E4]
Z 1 The derivative according to [E1], wherein -LG has a structure represented by any of the following formulas (L16) to (L20).
Z 1 -A 1 -G (L16)
(Where A 1 Represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 1 Represents an arbitrary functional group, and G represents glycosaminoglycan. )
Z 1 -A 1 -Y 1 -A 2 -G (L17)
(Where A 1 And A 2 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 1 Represents any bond, Z 1 Represents an arbitrary functional group, and G represents glycosaminoglycan. )
Z 1 -A 1 -Y 1 -A 2 -Y 2 -A 3 -G (L18)
(Where A 1 , A 2 And A 3 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 1 And Y 2 Each independently represents an arbitrary bond; 1 Represents an arbitrary functional group, and G represents glycosaminoglycan. )
Z 1 -A 1 -Y 1 -A 2 -Ph-A 3 -G (L19)
(Where A 1 , A 2 And A 3 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 2 And A 3 May or may not be present independently, and Y 1 Represents any bond, Z 1 Represents an arbitrary functional group, Ph represents a phenylene group, and G represents glycosaminoglycan. )
Z 1 -A 1 -Y 1 -A 2 -CHex-A 3 -G (L20)
(Where A 1 , A 2 And A 3 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 2 And A 3 May or may not be present independently, and Y 1 Represents any bond, Z 1 Represents an arbitrary functional group, cHex represents a cyclohexylene group, and G represents glycosaminoglycan. )
[E5]
Y 1 And Y 2 Has the structure shown in any one of the above general formulas (Y1) to (Y12), wherein the derivative is any one of the above [E2] to [E4].
[E6]
Z 1 Has the structure represented by any one of the general formulas (Z1) to (Z7), wherein the derivative is any one of the above [E1] to [E5].
[E7]
The above-mentioned [E1] to [E6], which are used to bind glycosaminoglycan and peptide via a linker to form a complex containing glycosaminoglycan and peptide to enhance the retention of the peptide in blood. ] The derivative according to any one of the above.
[E8]
The derivative according to [E7], wherein the bond between the linker and the peptide is a bond between an amino acid residue of the linker and the peptide.
[E9]
The derivative according to [E7], wherein the bond between the linker and the peptide is a bond between a lysine residue, a cysteine residue, an N-terminal amino acid residue, and / or a C-terminal amino acid residue of the peptide.
[E10]
The derivative according to [E9], wherein the bond between the linker and the lysine residue of the peptide is a bond between the linker and the ε-amino group of the lysine residue of the peptide.
[E11]
The derivative according to [E9], wherein the bond between the linker and the cysteine residue of the peptide is a bond between the linker and the thiol group of the cysteine residue of the peptide.
[E12]
The derivative according to [E9], wherein the bond between the linker and the N-terminal amino acid residue of the peptide is a bond between the linker and the α-amino group of the N-terminal amino acid residue of the peptide.
[E13]
The bond between the linker and the peptide forms a functional group Z on the linker. 1 The derivative according to any one of the above [E7] to [E12], which is a bond formed by a reaction of a peptide with a functional group of a peptide.
[E14]
The derivative according to any of [E1] to [E13], wherein the bond between the linker and the glycosaminoglycan is a bond between the linker and a sugar residue of the glycosaminoglycan.
[E15]
The derivative according to any of [E1] to [E13], wherein the bond between the linker and the glycosaminoglycan is a bond between the linker and a sugar residue at the reducing end of the glycosaminoglycan.
[E16]
The derivative according to any of [E1] to [E13], wherein the bond between the linker and the glycosaminoglycan is a bond between the linker and the carbon atom at
[E17]
The derivative according to any of [E14] to [E16], wherein the sugar residue is a glucosamine residue, a galactosamine residue, or a glucuronic acid residue.
[E18]
The derivative according to [E17], wherein the glucosamine residue is an N-acetylglucosamine residue.
[E19]
The derivative according to [E17], wherein the galactosamine residue is an N-acetylgalactosamine residue.
[E20]
The derivative according to any of [E1] to [E19], wherein the glycosaminoglycan is chondroitin and / or heparosan.
[E21]
The derivative of glycosaminoglycan according to any of [E1] to [E20], wherein the bond between the linker and the glycosaminoglycan is a covalent bond.
[E22]
The derivative of glycosaminoglycan according to any of [E7] to [E21], wherein the bond between the linker and the peptide is a covalent bond.
[E23]
[E1] used for performing the method according to any one of [A1] to [A21], [B1] to [B3], [C1] to [C4], or [D1] to [D3]. ] The derivative according to any one of [E22].
[E24]
An enhancer containing the derivative according to any one of [E1] to [E23], for enhancing the blood retention of the peptide.
[F1]
A complex of a glycosaminoglycan and a peptide having a structure represented by PLG.
(Wherein, P represents a peptide, L represents a linker, and G represents glycosaminoglycan.)
[F2]
The complex according to [F1], wherein L has a structure represented by any one of formulas (L1) to (L5).
[F3]
The complex according to [F1], wherein PL has a structure represented by any of the following formulas (L21) to (L25).
PA 1 -(L21)
(Where A 1 Represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms, and P represents a peptide. )
PA 1 -Y 1 -A 2 -(L22)
(Where A 1 And A 2 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 1 Represents an arbitrary bond, and P represents a peptide. )
PA 1 -Y 1 -A 2 -Y 2 -A 3 -(L23)
(Where A 1 , A 2 And A 3 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 1 And Y 2 Each independently represents an arbitrary bond, and P represents a peptide. )
PA 1 -Y 1 -A 2 -Ph-A 3 -(L24)
(Where A 1 , A 2 And A 3 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 2 And A 3 May or may not be present independently, and Y 1 Represents an arbitrary bond, Ph represents a phenylene group, and P represents a peptide. )
PA 1 -Y 1 -A 2 -CHex-A 3 − (L25)
(Where A 1 , A 2 And A 3 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 2 And A 3 May or may not be present independently, and Y 1 Represents an arbitrary bond, cHex represents a cyclohexylene group, and P represents a peptide. )
[F4]
The complex according to [F1], wherein PLG has a structure represented by any of the following formulas (L26) to (L30).
PA 1 -G (L26)
(Where A 1 Represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms, P represents a peptide, and G represents glycosaminoglycan. )
PA 1 -Y 1 -A 2 -G (L27)
(Where A 1 And A 2 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 1 Represents an arbitrary bond, P represents a peptide, and G represents glycosaminoglycan. )
PA 1 -Y 1 -A 2 -Y 2 -A 3 -G (L28)
(Where A 1 , A 2 And A 3 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 1 And Y 2 Each independently represents an arbitrary bond, P represents a peptide, and G represents glycosaminoglycan. )
PA 1 -Y 1 -A 2 -Ph-A 3 -G (L29)
(Where A 1 , A 2 And A 3 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 2 And A 3 May or may not be present independently, and Y 1 Represents an arbitrary bond, P represents a peptide, Ph represents a phenylene group, and G represents glycosaminoglycan. )
PA 1 -Y 1 -A 2 -CHex-A 3 -G (L30)
(Where A 1 , A 2 And A 3 Each independently represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms; 2 And A 3 May or may not be present independently, and Y 1 Represents an arbitrary bond, P represents a peptide, cHex represents a cyclohexylene group, and G represents glycosaminoglycan. )
[F5]
Y 1 And Y 2 Has the structure represented by any one of the general formulas (Y1) to (Y12), respectively. The composite according to any one of the above [F2] to [F4].
[F6]
The complex according to any one of [F1] to [F5], wherein the retention in blood is enhanced as compared to the peptide itself.
[F7]
[F1] to [F6], wherein the bond between the linker and the peptide is a bond between the linker and an amino acid residue of the peptide.
The composite according to any one of the above.
[F8]
The aforementioned [F1] to [F6], wherein the bond between the linker and the peptide is a bond between a lysine residue, a cysteine residue, an N-terminal amino acid residue, and / or a C-terminal amino acid residue of the linker. The complex according to any one of the above.
[F9]
The complex according to [F8], wherein the bond between the linker and the lysine residue of the peptide is a bond between the linker and the ε-amino group of the lysine residue of the peptide.
[F10]
The complex according to [F8], wherein the bond between the linker and the cysteine residue of the peptide is a bond between the linker and the thiol group of the cysteine residue of the peptide.
[F11]
The complex according to [F8], wherein the bond between the linker and the N-terminal amino acid residue of the peptide is a bond between the linker and the α-amino group of the N-terminal amino acid residue of the peptide.
[F12]
The complex according to any one of [F1] to [F11], wherein the bond between the linker and the glycosaminoglycan is a bond between the linker and a sugar residue of the glycosaminoglycan.
[F13]
The bond between the linker and the glycosaminoglycan forms the reduced end of the linker and the glycosaminoglycan.
The complex according to any one of [F1] to [F11], wherein the complex is a bond to a terminal sugar residue.
[F14]
The complex according to any of [F1] to [F11], wherein the bond between the linker and the glycosaminoglycan is a bond between the linker and the carbon atom at
[F15]
The complex according to any of [F12] to [F14], wherein the sugar residue is a glucosamine residue, a galactosamine residue, or a glucuronic acid residue.
[F16]
The complex according to [F15], wherein the glucosamine residue is an N-acetylglucosamine residue.
[F17]
The complex according to [F15], wherein the galactosamine residue is an N-acetylgalactosamine residue.
[F18]
The complex according to any of [F1] to [F17], wherein the glycosaminoglycan is chondroitin and / or heparosan.
[F19]
The complex according to any one of [F1] to [F18], wherein the bond between the linker and the peptide and the bond between the linker and the glycosaminoglycan are covalent bonds.
[F20]
The complex according to any of [F1] to [F19], wherein the complex of glycosaminoglycan and the peptide is a complex obtained by performing the method according to any one of [D1] to [D3]. Complex.
[F21]
A pharmaceutical composition comprising the complex according to any one of [F1] to [F20].
[F22]
A peptide preparation comprising the complex according to any one of [F1] to [F20].
[G1]
The complex according to any of [F1] to [F20], wherein the peptide is a peptide selected from the group consisting of (A) to (D) in [B1].
[G2]
In the structure represented by any of the general formulas (L1) to (L5) or (L21) to (L30), 1 Is the alkylene group having 8, 9, 10, 11, 12, 13, or 14 carbon atoms, [G1].
[G3]
The bond between the linker and the peptide is the lysine residue at position 26, the lysine residue at position 34, the cysteine residue at position 37 of the peptide shown in any of (A) to (D) in [B1], And / or the conjugate of the above [G1] or [G2], which is a bond to a C-terminal amino acid residue.
[G4]
A pharmaceutical composition comprising the complex according to any one of [G1] to [G3].
[G5]
A peptide preparation comprising the complex according to any one of [G1] to [G3].
[G6]
A GLP-1 preparation comprising the complex according to any one of [G1] to [G3].
[H1]
Wherein the peptide is a peptide multimer containing the peptide shown in (A) in [C1] and the peptide shown in (B) in [C1], and is a peptide multimer having a blood glucose-suppressing action. The complex according to any one of [F1] to [F20].
[H2]
The linker is a linker having a structure represented by any of the general formulas (L1) to (L5) or (L21) to (L30), wherein A 1 Is the alkylene group having 1, 2, 3, 4, 5, or 6 carbon atoms.
[H3]
The bond between the linker and the peptide is determined by the linker and the lysine residue at position 29 of the peptide shown in (B) in [C1] and / or the N-terminal amino acid residue of the peptide shown in (A) in [C1]. The complex according to the above [H1] or [H2], which is a bond to a group.
[H4]
The peptide multimer is a peptide dimer consisting of the peptide shown in (A) in [C1] and the peptide shown in (B) in [C1], and is a peptide dimer having a blood glucose-suppressing action. The complex according to any one of [H1] to [H3].
[H5]
A pharmaceutical composition comprising the complex according to any one of [H1] to [H4].
[H6]
A peptide preparation comprising the complex according to any one of [H1] to [H4].
[H7]
An insulin preparation comprising the complex according to any one of [H1] to [H4].
[I1]
A linker having a structure containing an alkylene group having one or more carbon atoms, wherein the linker is used to bind glycosaminoglycan to the peptide via the linker to enhance the blood retention of the peptide.
[I2]
The linker according to [I1], wherein the linker is a linker having a structure represented by any one of Formulas (L1) to (L15).
[I3]
Y 1 And Y 2 Has a structure represented by any one of the general formulas (Y1) to (Y12), respectively.
[I4]
Z 1 Has the structure represented by any one of the general formulas (Z1) to (Z7), wherein the linker is [I2] or [I3].
[I5]
The linker according to any one of [I1] to [I4], wherein the bond between the linker and the peptide is a bond between the linker and an amino acid residue of the peptide.
[I6]
The aforementioned [I1] to [I5], wherein the bond between the linker and the peptide is a bond between a lysine residue, a cysteine residue, an N-terminal amino acid residue, and / or a C-terminal amino acid residue of the peptide. The linker according to any of the above.
[I7]
The linker according to any of [I1] to [I6], wherein the bond between the linker and the lysine residue of the peptide is a bond between the linker and the ε-amino group of the lysine residue of the peptide.
[I8]
The linker according to any of [I1] to [I7], wherein the bond between the linker and the cysteine residue of the peptide is a bond between the linker and a thiol group of the cysteine residue of the peptide. [I9]
The above-mentioned [I1] to [I8], wherein the bond between the linker and the N-terminal amino acid residue of the peptide is a bond between the linker and the α-amino group of the N-terminal amino acid residue of the peptide. Linker.
[I10]
The bond between the linker and the peptide forms a functional group Z on the linker. 1 And the functional group of the peptide
The linker according to any one of [I2] to [I9], which is a bond to be formed.
[I11]
The linker according to any one of [I1] to [I10], wherein the bond between the linker and glycosaminoglycan is a bond between the linker and a sugar residue of glycosaminoglycan.
[I12]
The linker according to any of [I1] to [I11], wherein the bond between the linker and the glycosaminoglycan is a bond between the linker and a sugar residue at the reducing end of glycosaminoglycan.
[I13]
The linker according to any of [I1] to [I12], wherein the bond between the linker and the glycosaminoglycan is a bond between the linker and the carbon atom at
[I14]
The linker according to any of [I11] to [I13], wherein the sugar residue is a glucosamine residue, a galactosamine residue, or a glucuronic acid residue.
[I15]
The linker according to [I14], wherein the glucosamine residue is an N-acetylglucosamine residue.
[I16]
The linker according to [I14], wherein the galactosamine residue is an N-acetylgalactosamine residue.
[I17]
The linker according to any of [I1] to [I16], wherein the glycosaminoglycan is chondroitin and / or heparosan.
[I18]
The linker according to any of [I1] to [I17], wherein the bond between the linker and the peptide and the bond between the linker and the glycosaminoglycan are covalent bonds.
[I19]
The above-mentioned [I1] used for performing the method according to any one of the above [A1] to [A21], [B1] to [B3], [C1] to [C4], or [D1] to [D3]. ] The linker according to any one of [I18].
[I20]
The linker according to any one of the above [I1] to [I18], which is used for producing the derivative according to any one of the above [E1] to [E23].
[I21]
The above [F1] to [F20], [G1] to [G3], or [H1] to [H4], which is used for producing the composite according to any one of [I1] to [I18]. The linker according to any of the above.
本発明によれば、ペプチドの血中滞留性を増強することができる。 According to the present invention, the retention of a peptide in blood can be enhanced.
本発明において「或る対象物（例えば、複合体、誘導体、リンカー、官能基、および結合）が或る構成要素（例えば、構造、官能基、および結合）を有する」という表現は、特記しない限り、当該対象物が当該構成要素を含むことを意味し、当該対象物が当該構成要素からなる場合も包含する。 In the present invention, the expression “an object (eg, complex, derivative, linker, functional group, and bond) has a component (eg, structure, functional group, and bond)” is used unless otherwise specified. Means that the object includes the component, and includes the case where the object is formed of the component.
本発明においては、リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させることにより、ペプチドの血中滞留性を増強することができる。本発明においては、具体的には、リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させることにより、ペプチドの血中滞留性を増強することができる。すなわち、本発明においては、当該複合体を形成させることにより、ペプチドそのもの（当該複合体を形成していないペプチド）と比較して、ペプチドの血中滞留性を増強することができる。言い換えると、当該複合体においては、ペプチドそのもの（当該複合体を形成していないペプチド）と比較して、増強されたペプチドの血中滞留性が得られる。 In the present invention, the retention of the peptide in blood can be enhanced by binding the glycosaminoglycan to the peptide via a linker. In the present invention, specifically, the glycosaminoglycan is bound to the peptide via a linker to form a complex containing the glycosaminoglycan and the peptide, thereby enhancing the blood retention of the peptide. Can be. That is, in the present invention, by forming the complex, the retention of the peptide in blood can be enhanced as compared with the peptide itself (a peptide not forming the complex). In other words, in the complex, enhanced blood retention of the peptide is obtained as compared to the peptide itself (a peptide not forming the complex).
本発明において「グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体」は、グリコサミノグリカンと、当該グリコサミノグリカンに結合したリンカーと、当該リンカーに結合したペプチドとを含む複合体を意味する。言い換えると、本発明において「グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体」は、リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドが結合した構造を有する複合体を意味する。グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体は、一態様において、グリコサミノグリカンと、当該グリコサミノグリカンに結合したリンカーと、当該リンカーに結合したペプチドからなる複合体であってよく、言い換えると、リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドが結合した構造からなる複合体であってよい。また、グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体は、ペプチドそのもの（当該複合体を形成していないペプチド）と比較して血中滞留性が増強されたペプチドの複合体でもある。グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体は、具体的には、後述する「
本発明の複合体」であってよい。
In the present invention, the “complex containing glycosaminoglycan and peptide” means a complex containing glycosaminoglycan, a linker bound to the glycosaminoglycan, and a peptide bound to the linker. In other words, in the present invention, the “complex containing glycosaminoglycan and peptide” means a complex having a structure in which glycosaminoglycan and peptide are bound via a linker. In one embodiment, the complex containing the glycosaminoglycan and the peptide may be a complex consisting of glycosaminoglycan, a linker bound to the glycosaminoglycan, and a peptide bound to the linker, in other words And a complex having a structure in which glycosaminoglycan and a peptide are bonded via a linker. Further, the complex containing glycosaminoglycan and the peptide is also a complex of the peptide whose retention in blood is enhanced as compared with the peptide itself (a peptide not forming the complex). The complex containing the glycosaminoglycan and the peptide is specifically described in “
The composite of the present invention "may be used.
本発明において「血中滞留性」は、血中持続性または血中安定性に言い換えることができる。また、本発明において「増強」は、付与、改善、または向上に言い換えることができる。よって、本発明において「血中滞留性の増強」は、血中滞留性の付与、血中滞留性の改善、血中滞留性の向上、血中持続性の増強、血中安定性の増強等に言い換えることができる。また、本発明において「ペプチドの血中滞留性の増強」は、血中におけるペプチドの活性維持等に言い換えることができる。さらに、本発明において「血中滞留性」は、「薬効持続性」または「血中滞留性および薬効持続性」に言い換えることができる。 In the present invention, “retention in blood” can be translated into persistence in blood or stability in blood. In the present invention, “enhancement” can be paraphrased as giving, improving, or improving. Therefore, in the present invention, "enhancement in blood retention" refers to imparting blood retention, improving blood retention, improving blood retention, enhancing blood persistence, enhancing blood stability, and the like. Can be paraphrased. Further, in the present invention, “enhancement of peptide retention in blood” can be paraphrased as maintaining peptide activity in blood. Furthermore, in the present invention, “retention in blood” can be paraphrased as “durability of drug effect” or “retention in blood and durable drug effect”.
血中滞留性は、例えば、血中半減期として測定することができる。本発明において「ペプチドの血中滞留性の増強」は、好ましくは、例えば、ペプチドの血中半減期（すなわちグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体の血中半減期）が１時間以上、３時間以上、６時間以上、９時間以上、１２時間以上、１５時間以上、１８時間以上、２４時間以上、または３０時間以上となることを意味してよい。本発明において「ペプチドの血中滞留性の増強」は、ペプチドの血中半減期（すなわちグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体の血中半減期）が、好ましくは１５時間以上、１８時間以上、２４時間以上、または３０時間以上、より好ましくは２４時間以上または３０時間以上、さらに好ましくは３０時間以上となることを意味してよい。 Blood retention can be measured, for example, as a half-life in blood. In the present invention, “enhancement of the peptide's retention in blood” preferably means, for example, that the peptide's blood half-life (that is, the blood half-life of a complex containing glycosaminoglycan and peptide) is 1 hour or more and 3 hours or more. It may mean hours or more, 6 hours or more, 9 hours or more, 12 hours or more, 15 hours or more, 18 hours or more, 24 hours or more, or 30 hours or more. In the present invention, “enhancement of peptide retention in blood” means that the blood half-life of the peptide (that is, the half-life of the complex containing glycosaminoglycan and peptide) is preferably 15 hours or more, and 18 hours or more. , 24 hours or more, or 30 hours or more, more preferably 24 hours or more, or 30 hours or more, and still more preferably 30 hours or more.
本発明において「ペプチドの薬効持続性の増強」は、好ましくは、例えば、ヒト等の動物においてペプチドが薬効を示す期間が１２時間以上、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、または７日以上となることを意味してよい。 In the present invention, the term “enhancement of the efficacy of a peptide” preferably means, for example, that the peptide exhibits a drug effect in an animal such as a human for 12 hours or more, 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more. 5 days or more, 6 days or more, or 7 days or more.
本発明においてリンカーを介したグリコサミノグリカンとペプチドの結合は、ペプチドの血中滞留性を増強させるために行われてもよいし、ペプチドの薬効持続性を増強させるために行われてもよいし、ペプチドの血中滞留性および薬効持続性を増強させるために行われてもよい。 In the present invention, the binding of glycosaminoglycan to the peptide via the linker may be performed to enhance the blood retention of the peptide, or may be performed to enhance the duration of drug efficacy of the peptide. However, it may be carried out in order to enhance the retention of the peptide in blood and the duration of the drug effect.
＜１＞本発明の増強方法
本発明の増強方法は、リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させる工程を含む、ペプチドの血中滞留性を増強させる方法である。当該工程を「結合工程」ともいう。本発明の増強方法は、具体的には、リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させる工程を含む、ペプチドの血中滞留性を増強させる方法である。すなわち、結合工程は、具体的には、リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させる工程である。
<1> Enhancing method of the present invention The enhancing method of the present invention is a method for enhancing the blood retention of a peptide, which comprises a step of binding glycosaminoglycan to the peptide via a linker. This step is also referred to as a “binding step”. Specifically, the enhancing method of the present invention comprises the step of binding glycosaminoglycan and peptide via a linker to form a complex containing glycosaminoglycan and peptide, and to improve the blood retention of the peptide. It is a method of enhancing. That is, the binding step is, specifically, a step of binding glycosaminoglycan and peptide via a linker to form a complex containing glycosaminoglycan and peptide.
結合工程の実施態様は、上記複合体の構成要素（例えば、グリコサミノグリカン、リンカー、およびペプチド）の構成等の諸条件に応じて適宜設定できる。結合工程においては、１つの結合（１箇所の結合）のみを形成させてもよく、複数の結合（複数箇所の結合）を形成させてもよい。結合工程において複数の結合を形成させる場合、それら複数の結合の形成は、同時に行われてもよいし、別々に行われてもよい。例えば、結合工程において、グリコサミノグリカン、リンカー、およびペプチドの結合を形成させる場合、それらの結合の形成は同時に行われてもよいし、別々に行われてもよい。これらの構成要素は、予め一部が結合していてもよい。例えば、結合工程に供されるグリコサミノグリカンおよびペプチドは、いずれも、リンカーを有していてもよく、有していなくてもよい。リンカーを有するグリコサミノグリカンおよびリンカーを有するペプチドとしては、それぞれ、予めリンカーを結合させたグリコサミノグリカンおよび予めリンカーを結合させたペプチドが挙げられる。例えば、リンカーを有するグリコサミノグリカンとして、具体的には、後
述する「本発明のグリコサミノグリカン誘導体」が挙げられる。すなわち、例えば、結合工程においては、（Ａ）リンカーを有するグリコサミノグリカンとペプチドを結合させる工程が行われてもよいし、（Ｂ）リンカーを有するペプチドとグリコサミノグリカンを結合させる工程が行われてもよい。また、例えば、結合工程においては、（Ｃ）リンカーを有するグリコサミノグリカンとリンカーを有するペプチドを結合させる工程が行われてもよい。（Ｃ）の場合、リンカー同士の結合（すなわち、グリコサミノグリカンが有するリンカーとペプチドが有するリンカーとの結合）により、完全長のリンカーが形成され得る。よって、（Ｃ）の場合、特に、グリコサミノグリカンおよびペプチドがそれぞれ有するリンカーを「リンカーの一部」ともいう。結合工程は、予めグリコサミノグリカンとリンカーを結合させる工程、予めペプチドとリンカーを結合させる工程、またはそれらの工程の両方を含んでいてもよい。すなわち、例えば、結合工程においては、（Ａ１）グリコサミノグリカンとリンカーを結合させる工程が行われた後にペプチドを結合させる工程が行われてもよいし、（Ｂ１）リンカーとペプチドを結合させる工程が行われた後にグリコサミノグリカンを結合させる工程が行われてもよい。また、例えば、結合工程においては、（Ｃ１）グリコサミノグリカンとペプチドにそれぞれリンカーの一部を結合させる工程が行われた後に、結果物を結合させる（リンカーの一部を結合させたグリコサミノグリカンとリンカーの一部を結合させたペプチドとを結合させる）工程が行われてもよい。
The embodiment of the binding step can be appropriately set according to various conditions such as the configuration of the components (for example, glycosaminoglycan, linker, and peptide) of the complex. In the bonding step, only one bond (a single bond) may be formed, or a plurality of bonds (a plurality of bonds) may be formed. When a plurality of bonds are formed in the bonding step, the formation of the plurality of bonds may be performed simultaneously or separately. For example, when forming a bond between glycosaminoglycan, a linker, and a peptide in the bonding step, the formation of the bond may be performed simultaneously or separately. These components may be partially combined in advance. For example, the glycosaminoglycan and the peptide to be subjected to the binding step may or may not have a linker. Examples of the glycosaminoglycan having a linker and the peptide having a linker include a glycosaminoglycan to which a linker is previously bound and a peptide to which a linker is previously bound, respectively. For example, specific examples of the glycosaminoglycan having a linker include the “glycosaminoglycan derivative of the present invention” described later. That is, for example, in the binding step, (A) a step of binding a glycosaminoglycan having a linker to a peptide may be performed, and (B) a step of binding a peptide having a linker and glycosaminoglycan may be performed. May be performed. Further, for example, in the binding step, (C) a step of binding a glycosaminoglycan having a linker to a peptide having a linker may be performed. In the case of (C), a full-length linker can be formed by a bond between linkers (that is, a bond between a linker included in glycosaminoglycan and a linker included in a peptide). Therefore, in the case of (C), particularly, the linkers of the glycosaminoglycan and the peptide are also referred to as “part of the linker”. The binding step may include a step of previously binding the glycosaminoglycan to the linker, a step of previously binding the peptide to the linker, or both of these steps. That is, for example, in the binding step, (A1) the step of binding the peptide after the step of binding the glycosaminoglycan to the linker may be performed, or (B1) the step of binding the linker to the peptide After the step (a) is performed, a step of binding glycosaminoglycan may be performed. In addition, for example, in the binding step, (C1) a step of binding a part of a linker to each of the glycosaminoglycan and the peptide is performed, and then the resultant is bound (the glycosaminoglycan having a part of the linker bound thereto). Noglycan and a peptide to which a part of a linker is bonded).
これらの構成要素間の結合は、例えば、これらの構成要素を適当な反応系において共存させることにより形成できる。反応条件は、これらの構成要素間の結合の形成が可能な条件である限り、特に制限されない。反応条件は、これら構成要素の構成やこれら構成要素間の結合様式等の諸条件に応じて適宜設定できる。なお、後述するグリコサミノグリカンまたはペプチドとリンカーとの結合様式についての記載は、リンカーを有するグリコサミノグリカンとリンカーを有するペプチドを結合させる場合のリンカー同士の結合様式にも準用できる。反応条件としては、例えば、結合に用いられる官能基間の公知の反応条件が挙げられる。反応条件として、具体的には、例えば、実施例の反応条件が挙げられる。 The bond between these components can be formed, for example, by allowing these components to coexist in an appropriate reaction system. The reaction conditions are not particularly limited as long as the conditions permit formation of a bond between these components. The reaction conditions can be appropriately set according to various conditions such as the configuration of these components and the mode of bonding between these components. The description of the bonding mode between glycosaminoglycan or peptide and the linker described below can be applied mutatis mutandis to the bonding mode between linkers when glycosaminoglycan having a linker and a peptide having a linker are bonded. The reaction conditions include, for example, known reaction conditions between functional groups used for bonding. Specifically, the reaction conditions include, for example, the reaction conditions of Examples.
形成された複合体は、適宜、回収することができる。すなわち、本発明の増強方法は、さらに、形成された複合体を回収する工程を含んでいてもよい。当該工程を「回収工程」ともいう。複合体の回収は、例えば、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により実施することができる。 The formed complex can be appropriately collected. That is, the enhancing method of the present invention may further include a step of collecting the formed complex. This step is also called a “recovery step”. The recovery of the complex can be performed, for example, by a known method used for separation and purification of a compound.
本発明の増強方法によれば、ペプチドの血中滞留性を増強することができる。 According to the enhancing method of the present invention, the retention of peptides in blood can be enhanced.
＜２＞本発明の製造方法
本発明の製造方法は、本発明の増強方法を行う工程を含む（すなわち、本発明の増強方法において行われる工程を含む）、グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体の製造方法であり、血中滞留性が増強されたペプチドの製造方法である。すなわち、本発明の製造方法は、上述した結合工程を含む。また、本発明の製造方法は、さらに、上述した回収工程を含んでいてもよい。本発明の製造方法によれば、ペプチドそのもの（当該複合体を形成していないペプチド）と比較して血中滞留性が増強されたペプチドを提供することができる。
<2> Production method of the present invention The production method of the present invention includes a step of performing the enhancing method of the present invention (that is, including a step performed in the enhancing method of the present invention), and a complex containing glycosaminoglycan and a peptide. This is a method for producing a body, and is a method for producing a peptide having enhanced blood retention. That is, the manufacturing method of the present invention includes the above-described bonding step. Further, the production method of the present invention may further include the above-mentioned recovery step. According to the production method of the present invention, it is possible to provide a peptide whose retention in blood is enhanced as compared with a peptide itself (a peptide not forming the complex).
＜３＞本発明のグリコサミノグリカン誘導体
本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、グリコサミノグリカンと、当該グリコサミノグリカンに結合したリンカーとを含む、グリコサミノグリカンの誘導体である。言い換えると、本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、グリコサミノグリカンとリンカーが結合した構造を有する、グリコサミノグリカンの誘導体である。具体的には、本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、Ｚ１−Ｌ−Ｇ（Ｚ１は任意の官能基を表し、Ｌはリンカーを表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）で示される構造を有する、グリコサミノグリカ
ンの誘導体であってよい。本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、一態様において、グリコサミノグリカンとリンカーが結合した構造からなる（例えば、Ｚ１−Ｌ−Ｇで示される構造からなる）グリコサミノグリカンの誘導体であってよい。
<3> Glycosaminoglycan derivative of the present invention The glycosaminoglycan derivative of the present invention is a glycosaminoglycan derivative containing glycosaminoglycan and a linker bonded to the glycosaminoglycan. In other words, the glycosaminoglycan derivative of the present invention is a glycosaminoglycan derivative having a structure in which a glycosaminoglycan and a linker are bonded. Specifically, the glycosaminoglycan derivative of the present invention is represented by Z 1 -LG (Z 1 represents an arbitrary functional group, L represents a linker, and G represents a glycosaminoglycan). May be a derivative of glycosaminoglycan having the following structure. In one embodiment, the glycosaminoglycan derivative of the present invention is a glycosaminoglycan derivative having a structure in which a glycosaminoglycan and a linker are bonded (for example, having a structure represented by Z 1 -LG). May be.
本発明のグリコサミノグリカン誘導体において、リンカー（例えば、上記一般式におけるＬ）としては、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ５）のいずれかに示される構造を有するものが例示される。また、本発明のグリコサミノグリカン誘導体において、上記一般式におけるＺ１−Ｌとしては、前記一般式（Ｌ６）〜（Ｌ１０）のいずれかに示される構造を有するものが例示される。本発明のグリコサミノグリカン誘導体（例えば、上記一般式におけるＺ１−Ｌ−Ｇ）としては、具体的には、前記一般式（Ｌ１６）〜（Ｌ２０）のいずれかに示される構造を有するものが例示される。前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ１０）および（Ｌ１６）〜（Ｌ２０）において、Ｙ１およびＹ２は、例えば、それぞれ独立して、前記一般式（Ｙ１）〜（Ｙ１２）のいずれかに示される構造（すなわち結合）を有するものであってよい。また、前記一般式（Ｌ６）〜（Ｌ１０）および（Ｌ１６）〜（Ｌ２０）において、Ｚ１は、例えば、前記一般式（Ｚ１）〜（Ｚ７）のいずれかに示される構造（すなわち官能基）を有するものであってよい。 In the glycosaminoglycan derivative of the present invention, as the linker (for example, L in the above general formula), those having a structure represented by any of the above general formulas (L1) to (L5) are exemplified. In the glycosaminoglycan derivative of the present invention, examples of Z 1 -L in the above general formula include those having a structure represented by any one of the above general formulas (L6) to (L10). As the glycosaminoglycan derivative of the present invention (for example, Z 1 -LG in the above general formula), specifically, those having a structure represented by any of the above general formulas (L16) to (L20) Is exemplified. In the general formulas (L1) to (L10) and (L16) to (L20), Y 1 and Y 2 are, for example, each independently represented by any of the general formulas (Y1) to (Y12). It may have a structure (ie, a bond). In the general formulas (L6) to (L10) and (L16) to (L20), Z 1 is, for example, a structure (that is, a functional group) represented by any of the general formulas (Z1) to (Z7). May be provided.
本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、例えば、グリコサミノグリカンとリンカーを結合することにより製造することができる。グリコサミノグリカンとリンカーを結合することは、本発明の増強方法において記載したように行うことができる。 The glycosaminoglycan derivative of the present invention can be produced, for example, by bonding a glycosaminoglycan to a linker. Linking the glycosaminoglycan to the linker can be performed as described in the enhancement method of the invention.
本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、例えば、グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を製造するために用いることができる。具体的には、本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、例えば、本発明の増強方法または本発明の製造方法を実施するために用いることができる。より具体的には、本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、例えば、本発明のグリコサミノグリカン誘導体が有するリンカーの官能基（例えば、前記Ｚ１−Ｌ−Ｇで示される一般式においてＺ１で示される官能基）とペプチドが有する官能基を結合させてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させるために用いることができる。本発明のグリコサミノグリカン誘導体との結合に用いられるペプチドは、リンカーを有していてもよい。ペプチドがリンカーを有する場合、本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、例えば、本発明のグリコサミノグリカン誘導体が有するリンカーの官能基とペプチドが有するリンカーの官能基を結合させてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させるために用いることができる。本発明のグリコサミノグリカン誘導体を用いてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させることにより、当該ペプチドの血中滞留性を増強することができる。 The glycosaminoglycan derivative of the present invention can be used, for example, for producing a complex containing glycosaminoglycan and a peptide. Specifically, the glycosaminoglycan derivative of the present invention can be used, for example, for performing the enhancing method of the present invention or the production method of the present invention. More specifically, glycosaminoglycan derivatives of the present invention, for example, the functional group of the linker with the glycosaminoglycan derivatives of the present invention (e.g., Z 1 in the general formula represented by Z 1 -L-G Can be used to form a complex containing glycosaminoglycan and the peptide by bonding the functional group of the peptide to the functional group of the peptide. The peptide used for binding to the glycosaminoglycan derivative of the present invention may have a linker. When the peptide has a linker, the glycosaminoglycan derivative of the present invention may be, for example, a glycosaminoglycan by binding the functional group of the linker of the glycosaminoglycan derivative of the present invention to the functional group of the linker of the peptide. It can be used to form a complex containing the peptide. By forming a complex containing glycosaminoglycan and a peptide using the glycosaminoglycan derivative of the present invention, the blood retention of the peptide can be enhanced.
＜４＞本発明の増強剤
本発明の増強剤は、本発明のグリコサミノグリカン誘導体を有効成分として含有する、ペプチドの血中滞留性の増強剤（ペプチドの血中滞留性を増強するための増強剤）である。本発明の増強剤は、本発明のグリコサミノグリカン誘導体からなるものであってもよく、その他の成分をさらに含有するものであってもよい。「その他の成分」は、本発明の増強剤の利用態様に応じて許容可能なものであれば特に制限されない。「その他の成分」としては、例えば、本発明の効果を損なわず、かつ保存安定性を向上させる成分が挙げられる。また、本発明の増強剤は、任意の剤形で製剤化されていてよい。本発明の増強剤の剤形は、本発明の増強剤の利用態様等の諸条件に応じて適宜選択できる。本発明の増強剤の製剤化は、例えば、公知の手法により行われてよい。
<4> Enhancer of the present invention The enhancer of the present invention is an enhancer of peptide retention in blood containing the glycosaminoglycan derivative of the present invention as an active ingredient (for enhancing the peptide retention in blood). Enhancer). The enhancer of the present invention may be composed of the glycosaminoglycan derivative of the present invention, or may further contain other components. The “other components” are not particularly limited as long as they are acceptable according to the use mode of the enhancer of the present invention. Examples of “other components” include components that do not impair the effects of the present invention and that improve storage stability. Further, the enhancer of the present invention may be formulated in any dosage form. The dosage form of the enhancer of the present invention can be appropriately selected according to various conditions such as the mode of use of the enhancer of the present invention. Formulation of the enhancer of the present invention may be performed, for example, by a known method.
本発明の増強剤における本発明のグリコサミノグリカン誘導体の濃度は、本発明の増強剤を用いてペプチドの血中滞留性を増強することが可能である限り、特に制限されない。本発明の増強剤における本発明のグリコサミノグリカン誘導体の濃度は、本発明の増強剤
の剤型、ペプチドの種類、所望する血中滞留性等の諸条件に応じて適宜設定できる。本発明の増強剤における本発明のグリコサミノグリカン誘導体の濃度は、例えば、０．００１〜１００％（ｗ／ｗ）であってよい。本発明の増強剤は、例えば、そのまま、あるいは適宜、水、生理食塩水、緩衝液、有機溶媒等の溶媒を用いて希釈、分散、または溶解し、用いられてよい。
The concentration of the glycosaminoglycan derivative of the present invention in the enhancer of the present invention is not particularly limited as long as the peptide can enhance the blood retention of the peptide using the enhancer of the present invention. The concentration of the glycosaminoglycan derivative of the present invention in the enhancer of the present invention can be appropriately set according to various conditions such as the dosage form of the enhancer of the present invention, the type of peptide, and the desired blood retention. The concentration of the glycosaminoglycan derivative of the present invention in the enhancer of the present invention may be, for example, 0.001 to 100% (w / w). The enhancer of the present invention may be used, for example, as it is or appropriately, by diluting, dispersing, or dissolving it with a solvent such as water, physiological saline, a buffer, or an organic solvent.
本発明の増強剤は、例えば、ペプチドの血中滞留性を増強するために用いることができる。具体的には、本発明の増強剤は、例えば、本発明の増強方法または本発明の製造方法を実施するために用いることができる。より具体的には、本発明の増強剤は、例えば、これに含有される本発明のグリコサミノグリカン誘導体が有するリンカーの官能基（例えば、前記Ｚ１−Ｌ−Ｇで示される一般式においてＺ１で示される官能基）とペプチドが有する官能基を結合させてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させるために用いることができる。本発明のグリコサミノグリカン誘導体との結合に用いられるペプチドは、リンカーを有していてもよい。ペプチドがリンカーを有する場合、本発明の増強剤は、例えば、これに含有される本発明のグリコサミノグリカン誘導体が有するリンカーの官能基とペプチドが有するリンカーの官能基を結合させてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させるために用いることができる。本発明の増強剤を用いてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させることにより、当該ペプチドの血中滞留性を増強することができる。 The enhancer of the present invention can be used, for example, to enhance the retention of peptides in blood. Specifically, the enhancer of the present invention can be used, for example, to carry out the enhancer method of the present invention or the production method of the present invention. More specifically, the enhancer of the present invention includes, for example, a functional group of a linker contained in the glycosaminoglycan derivative of the present invention contained therein (for example, in the general formula represented by Z 1 -LG, by binding a functional group) and a functional group peptide has represented by Z 1 may be used to form a complex comprising a glycosaminoglycan and peptides. The peptide used for binding to the glycosaminoglycan derivative of the present invention may have a linker. When the peptide has a linker, the enhancer of the present invention may be, for example, glycosamino by linking the functional group of the linker contained in the glycosaminoglycan derivative of the present invention to the functional group of the linker contained in the peptide. It can be used to form a complex containing glycans and peptides. By forming a complex containing glycosaminoglycan and a peptide using the enhancer of the present invention, the retention of the peptide in blood can be enhanced.
＜５＞本発明の複合体
本発明の複合体は、グリコサミノグリカンと、当該グリコサミノグリカンに結合したリンカーと、当該リンカーに結合したペプチドとを含む複合体である。言い換えると、本発明の複合体は、リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドが結合した構造を有する、グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体である。具体的には、本発明の複合体は、Ｐ−Ｌ−Ｇ（Ｐはペプチドを表し、Ｌはリンカーを表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）で示される構造を有する、グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体であってよい。本発明の複合体は、一態様において、リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドが結合した構造からなる（例えば、Ｐ−Ｌ−Ｇで示される構造からなる）グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体であってよい。本発明の複合体は、ペプチドそのもの（当該複合体を形成していないペプチド）と比較して血中滞留性が増強されたペプチドの複合体でもある。
<5> Complex of the Present Invention The complex of the present invention is a complex containing glycosaminoglycan, a linker bound to the glycosaminoglycan, and a peptide bound to the linker. In other words, the complex of the present invention is a complex containing glycosaminoglycan and peptide, having a structure in which glycosaminoglycan and peptide are bonded via a linker. Specifically, the complex of the present invention has a structure represented by PLG (P represents a peptide, L represents a linker, and G represents a glycosaminoglycan). It may be a complex containing a glycan and a peptide. In one embodiment, the complex of the present invention comprises a glycosaminoglycan and a peptide having a structure in which glycosaminoglycan and a peptide are bound via a linker (for example, having a structure represented by PLG) and a peptide. It may be a complex. The conjugate of the present invention is also a conjugate of a peptide whose retention in blood is enhanced as compared with the peptide itself (a peptide not forming the conjugate).
本発明の複合体において、上記一般式におけるＬとしては、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ５）のいずれかに示される構造が例示される。また、本発明の複合体において、上記一般式におけるＰ−Ｌとしては、前記一般式（Ｌ２１）〜（Ｌ２５）のいずれかに示される構造が例示される。 In the composite of the present invention, as L in the above general formula, a structure represented by any of the above general formulas (L1) to (L5) is exemplified. In the composite of the present invention, examples of PL in the above general formula include structures represented by any of the above general formulas (L21) to (L25).
本発明の複合体としては、具体的には、前記一般式（Ｌ２６）〜（Ｌ３０）のいずれかに示される構造が例示される。前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ５）および（Ｌ２１）〜（Ｌ３０）において、Ｙ１およびＹ２は、例えば、それぞれ独立して前記一般式（Ｙ１）〜（Ｙ１２）のいずれかに示される構造（すなわち結合）を有するものであってよい。 Specific examples of the complex of the present invention include the structures represented by any one of formulas (L26) to (L30). In the general formulas (L1) to (L5) and (L21) to (L30), Y 1 and Y 2 each independently represent, for example, a structure represented by any of the general formulas (Y1) to (Y12). (Ie, a bond).
本発明の複合体は、例えば、リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合することにより製造することができる。リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合することは、本発明の増強方法において記載したように行うことができる。本発明の複合体は、具体的には、例えば、本発明の増強方法または本発明の製造方法により製造することができる。 The complex of the present invention can be produced, for example, by binding glycosaminoglycan to a peptide via a linker. Binding of the peptide to the glycosaminoglycan via a linker can be performed as described in the enhancement method of the present invention. The complex of the present invention can be specifically produced by, for example, the enhancing method of the present invention or the production method of the present invention.
本発明の複合体は、本発明の複合体そのものとして提供されてもよいし、その他の成分
を含有する態様で提供されてもよい。「その他の成分」は、本発明の複合体の利用態様に応じて許容可能なものであれば特に制限されない。「その他の成分」としては、例えば、本発明の効果を損なわず、かつ薬理学的に許容される成分が挙げられる。また、本発明の複合体は、任意の剤形で製剤化されていてよい。本発明の複合体の剤形は、本発明の複合体の利用態様等の諸条件に応じて適宜選択できる。本発明の複合体の製剤化は、例えば、公知の手法により行われてよい。
The complex of the present invention may be provided as the complex of the present invention itself, or may be provided in a form containing other components. The “other components” are not particularly limited as long as they are permissible according to the use mode of the composite of the present invention. Examples of the “other components” include pharmacologically acceptable components that do not impair the effects of the present invention. Further, the complex of the present invention may be formulated in any dosage form. The dosage form of the complex of the present invention can be appropriately selected according to various conditions such as the mode of use of the complex of the present invention. Formulation of the complex of the present invention may be performed, for example, by a known method.
本発明の複合体は、例えば、これを含有する医薬組成物（以下、「本発明の医薬」ともいう。）またはペプチド製剤（以下、「本発明の製剤」ともいう。）として提供されてもよい。本発明の医薬または本発明の製剤は、例えば、ヒト等の動物における疾患の治療用であってよい。疾患としては、ペプチドの投与対象となる疾患が挙げられる。疾患としては、生活習慣病が挙げられる。生活習慣病としては、脂質異常症、高血圧、糖尿病、肥満が挙げられる。生活習慣病としては、特に、糖尿病が挙げられる。本発明の医薬または本発明の製剤における本発明の複合体の濃度は、ヒト等の動物の治療等の用途に応じた有効な量を含有している限り、特に制限されない。本発明の医薬または本発明の製剤における本発明の複合体の濃度は、それらの剤型、ペプチドの種類、治療の対象となる疾患の種類、所望する血中滞留性等の諸条件に応じて適宜設定できる。本発明の医薬または本発明の製剤における本発明の複合体の濃度は、例えば、０．００１〜１００％（ｗ／ｗ）であってよい。本発明の医薬または本発明の製剤は、例えば、そのまま経口剤や注射剤として用いられてもよいし、輸液に混合して用いられてもよい。 The complex of the present invention may be provided, for example, as a pharmaceutical composition containing the same (hereinafter, also referred to as “the pharmaceutical of the present invention”) or a peptide preparation (hereinafter, also referred to as “the pharmaceutical of the present invention”). Good. The medicament of the present invention or the preparation of the present invention may be used, for example, for treating diseases in animals such as humans. The disease includes a disease to which the peptide is to be administered. Diseases include lifestyle-related diseases. Lifestyle-related diseases include dyslipidemia, hypertension, diabetes, and obesity. Lifestyle-related diseases include, in particular, diabetes. The concentration of the complex of the present invention in the medicament of the present invention or the preparation of the present invention is not particularly limited as long as it contains an effective amount according to uses such as treatment of animals such as humans. The concentration of the complex of the present invention in the medicament of the present invention or the preparation of the present invention depends on various conditions such as their dosage form, type of peptide, type of disease to be treated, and desired blood retention. It can be set appropriately. The concentration of the complex of the present invention in the medicament of the present invention or the preparation of the present invention may be, for example, 0.001 to 100% (w / w). The medicament of the present invention or the preparation of the present invention may be used, for example, as an oral preparation or an injection as it is, or may be used as a mixture with an infusion.
＜６＞本発明におけるリンカー
本発明において「リンカー」は、２つまたはそれ以上の官能基を有する分子（クロスリンカー）であって、これを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させるために用いることが可能な分子を意味する単語として使用される。本発明においてリンカーは、これを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させることにより、当該ペプチドの血中滞留性を増強させることが可能な分子である限り、特に制限されない。本発明においてリンカーの構造は、これを介してグリコサミノグリカンと結合させるペプチドの種類等の諸条件に応じて適宜設定することができる。
<6> Linker in the Present Invention In the present invention, the “linker” is a molecule having two or more functional groups (crosslinker), and is used for bonding glycosaminoglycan to a peptide via the molecule. Used as a word to mean a possible molecule. In the present invention, the linker can enhance the blood retention of the peptide by binding the glycosaminoglycan to the peptide via the linker to form a complex containing the glycosaminoglycan and the peptide. There is no particular limitation as long as it is a molecule. In the present invention, the structure of the linker can be appropriately set according to various conditions such as the type of the peptide to be bound to glycosaminoglycan via the linker.
本発明においてリンカーは、例えば、アルキレン基を有するリンカーであってよく、言い換えると、アルキレン基を含む構造を有するリンカーであってよい。本発明においてリンカーは、具体的には、例えば、炭素数が１以上のアルキレン基を含む構造を有するリンカーであって、これを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させてペプチドの血中滞留性を増強するために用いられるリンカーであってよい。本発明においてリンカーは、アルキレン基を１つのみ有するリンカーであってもよく、２つまたはそれ以上有するリンカーであってもよい。 In the present invention, the linker may be, for example, a linker having an alkylene group, in other words, a linker having a structure containing an alkylene group. In the present invention, specifically, the linker is, for example, a linker having a structure containing an alkylene group having 1 or more carbon atoms. The peptide is retained in the blood by binding glycosaminoglycan to the peptide via the linker. It may be a linker used to enhance the properties. In the present invention, the linker may be a linker having only one alkylene group or a linker having two or more alkylene groups.
本発明においてアルキレン基は、特に制限されない。本発明においてアルキレン基は、側鎖を有しない直鎖アルキレン基であってもよく、側鎖を有する直鎖アルキレン基であってもよく、側鎖を有しないシクロアルキレン基であってもよく、側鎖を有するシクロアルキレン基であってもよい。本発明においてアルキレン基は、側鎖を有しない直鎖アルキレン基または側鎖を有しないシクロアルキレン基であることが好ましく、側鎖を有しない直鎖アルキレン基であることがより好ましい。本発明においてアルキレン基は、飽和アルキレン基であってもよく、不飽和アルキレン基であってもよい。本発明においてアルキレン基は、飽和アルキレン基であることが好ましい。 In the present invention, the alkylene group is not particularly limited. In the present invention, the alkylene group may be a linear alkylene group having no side chain, a linear alkylene group having a side chain, or a cycloalkylene group having no side chain, It may be a cycloalkylene group having a side chain. In the present invention, the alkylene group is preferably a linear alkylene group having no side chain or a cycloalkylene group having no side chain, and more preferably a linear alkylene group having no side chain. In the present invention, the alkylene group may be a saturated alkylene group or an unsaturated alkylene group. In the present invention, the alkylene group is preferably a saturated alkylene group.
本発明においてアルキレン基は、鎖中にヘテロ原子を有しないアルキレン基であってもよく、鎖中にヘテロ原子を有するアルキレン基であってもよい。本発明において「ヘテロ
原子」は、水素及び炭素以外の原子を意味する。ヘテロ原子としては、窒素、酸素、硫黄が例示される。「鎖中にヘテロ原子を有するアルキレン基」とは、アルキレン基を構成する炭素原子の少なくとも１つがヘテロ原子で置換された構造からなるアルキレン基を意味する。アルキレン基に含まれるヘテロ原子は、１つであってもよく、２つまたはそれ以上であってもよい。アルキレン基に含まれるヘテロ原子の種類は、１種であってもよく、２種またはそれ以上であってもよい。本発明においてアルキレン基は、鎖中にヘテロ原子を有しないアルキレン基であることが好ましい。
In the present invention, the alkylene group may be an alkylene group having no hetero atom in the chain, or may be an alkylene group having a hetero atom in the chain. In the present invention, “hetero atom” means an atom other than hydrogen and carbon. Examples of the hetero atom include nitrogen, oxygen, and sulfur. The “alkylene group having a hetero atom in the chain” means an alkylene group having a structure in which at least one of carbon atoms constituting the alkylene group is substituted with a hetero atom. The alkylene group may contain one hetero atom, two or more hetero atoms. The kind of the hetero atom contained in the alkylene group may be one, or two or more. In the present invention, the alkylene group is preferably an alkylene group having no hetero atom in the chain.
本発明においてアルキレン基は、置換基を有しないアルキレン基であってもよく、置換基を有するアルキレン基であってもよい。本発明において「置換基」は、水素及び炭素以外の原子または原子団を意味する。「置換基を有するアルキレン基」とは、アルキレン基を構成する水素原子の少なくとも１つが置換基で置換された構造からなるアルキレン基を意味する。アルキレン基に含まれる置換基は、１つであってもよく、２つまたはそれ以上であってもよい。アルキレン基に含まれる置換基の種類は、１種であってもよく、２種またはそれ以上であってもよい。本発明においてアルキレン基は、置換基を有しないアルキレン基であることが好ましい。 In the present invention, the alkylene group may be an unsubstituted alkylene group or a substituted alkylene group. In the present invention, “substituent” means an atom or an atomic group other than hydrogen and carbon. The “alkylene group having a substituent” means an alkylene group having a structure in which at least one of the hydrogen atoms constituting the alkylene group is substituted with a substituent. The alkylene group may have one substituent, or may have two or more substituents. The kind of the substituent contained in the alkylene group may be one kind, or two or more kinds. In the present invention, the alkylene group is preferably an unsubstituted alkylene group.
本発明においてアルキレン基が有する炭素原子の数は、特に制限されない。当該炭素原子の数は、例えば、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、または１２以上であってよい。当該炭素原子の数は、例えば、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、または３以下であってよい。当該炭素原子の数は、例えば、それらの矛盾しない組み合わせの範囲であってよい。当該炭素原子の数は、例えば、１〜１６、１〜１２、１〜８、１〜４、１〜３、１〜２、２〜３、２〜４、４〜１４、８〜１４、８〜１３、８〜１２、９〜１３、９〜１２、９〜１１、１０〜１２、または１０〜１１であってよい。当該炭素原子の数は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６であってよい。当該アルキレン基が鎖中にヘテロ原子を有するアルキレン基である場合、上記例示した炭素原子の数は、炭素原子とヘテロ原子の総数を意味する。 In the present invention, the number of carbon atoms in the alkylene group is not particularly limited. The number of the carbon atoms may be, for example, 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, 11 or more, or 12 or more. The number of the carbon atoms is, for example, 16 or less, 15 or less, 14 or less, 13 or less, 12 or less, 11 or less, 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, 5 or less, 4 or less, or 3 It may be: The number of such carbon atoms may be, for example, in the range of their compatible combinations. The number of the carbon atoms is, for example, 1-16, 1-12, 1-8, 1-4, 1-3, 1-2, 2-3, 2-4, 4-14, 8-14, 8 -13, 8-12, 9-13, 9-12, 9-11, 10-12, or 10-11. The number of such carbon atoms may be, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, or 16. When the alkylene group is an alkylene group having a hetero atom in the chain, the number of carbon atoms exemplified above means the total number of carbon atoms and hetero atoms.
本発明においてリンカーは、具体的には、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ５）のいずれかに示される構造を有するリンカーであってよい。本発明においてリンカーは、より具体的には、前記一般式（Ｌ６）〜（Ｌ１０）のいずれかに示される構造を有するリンカーであってよい。本発明におけるリンカーは、さらに具体的には、前記一般式（Ｌ１１）〜（Ｌ１５）のいずれかに示される構造を有するリンカーであってよい。本発明においてリンカーは、一態様において、前記一般式（Ｌ１１）〜（Ｌ１５）のいずれかに示される構造からなるリンカーであってもよい。 In the present invention, specifically, the linker may be a linker having a structure represented by any of the general formulas (L1) to (L5). In the present invention, more specifically, the linker may be a linker having a structure represented by any one of the general formulas (L6) to (L10). More specifically, the linker in the present invention may be a linker having a structure represented by any one of formulas (L11) to (L15). In one aspect of the present invention, the linker may be a linker having a structure represented by any one of formulas (L11) to (L15).
前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ１５）においてＡ１、Ａ２、及びＡ３は、それぞれ独立して、上記のようなアルキレン基であってよい。 In the general formulas (L1) to (L15), A 1 , A 2 and A 3 may each independently be an alkylene group as described above.
なお、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ１５）における各構成要素についての記載は、他の一般式（例えば、前記一般式（Ｌ１６）〜（Ｌ３０））におけるそれらに該当する構成要素にも準用できる。以下、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ１５）に加えて、他の一般式における各構成要素についてもまとめて記載する場合がある。 The description of each component in the general formulas (L1) to (L15) can be applied mutatis mutandis to components corresponding to those in other general formulas (for example, the general formulas (L16) to (L30)). . Hereinafter, in addition to the general formulas (L1) to (L15), each component in another general formula may be collectively described.
前記一般式（Ｌ４）、（Ｌ９）、（Ｌ１４）、（Ｌ１９）、（Ｌ２４）、または（Ｌ２９）においてフェニレン基は、１，２−フェニレン基、１，３−フェニレン基、１，４−フェニレン基のいずれであってもよいが、１，３−フェニレン基または１，４−フェニレン基であることが好ましく、１，４−フェニレン基であることがより好ましい。 In the general formulas (L4), (L9), (L14), (L19), (L24), and (L29), the phenylene group is a 1,2-phenylene group, a 1,3-phenylene group, a 1,4-phenylene group. Although it may be any of phenylene groups, it is preferably a 1,3-phenylene group or a 1,4-phenylene group, and more preferably a 1,4-phenylene group.
前記一般式（Ｌ５）、（Ｌ１０）、（Ｌ１５）、（Ｌ２０）、（Ｌ２５）、または（Ｌ３０）においてシクロヘキシレン基は、１，２−シクロヘキシレン基、１，３−シクロヘキシレン基、１，４−シクロヘキシレン基のいずれであってもよいが、１，３−シクロヘキシレン基または１，４−シクロヘキシレン基であることが好ましく、１，４−シクロヘキシレン基であることがより好ましい。当該ヘキシレン基は、シス体であってもよく、トランス体であってもよい。 In the general formulas (L5), (L10), (L15), (L20), (L25), or (L30), the cyclohexylene group is a 1,2-cyclohexylene group, a 1,3-cyclohexylene group, Or a 4-cyclohexylene group, but is preferably a 1,3-cyclohexylene group or a 1,4-cyclohexylene group, more preferably a 1,4-cyclohexylene group. The hexylene group may be in a cis form or a trans form.
前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ３０）において、Ｙ１およびＹ２は、例えば、それぞれ独立して、前記一般式（Ｙ１）〜（Ｙ１２）のいずれかに示される構造（すなわち結合）を有するものであってよい。 In the formulas (L1) to (L30), Y 1 and Y 2 each independently have, for example, a structure (ie, a bond) represented by any of the formulas (Y1) to (Y12). It may be.
前記一般式（Ｙ１１）に示される結合は、具体的には、下記構造式（Ｙ１３）に示される結合である。 The bond represented by the general formula (Y11) is specifically a bond represented by the following structural formula (Y13).
前記一般式（Ｙ１２）に示される結合は、具体的には、下記構造式（Ｙ１４）に示される結合である。 The bond represented by the general formula (Y12) is specifically a bond represented by the following structural formula (Y14).
前記一般式（Ｌ６）〜（Ｌ２０）において、Ｚ１及びＺ２は、例えば、それぞれ独立して、前記一般式（Ｚ１）〜（Ｚ７）のいずれかに示される構造（すなわち官能基）を有するものであってよい。 In the general formulas (L6) to (L20), Z 1 and Z 2 each independently have, for example, a structure (ie, a functional group) represented by any of the general formulas (Z1) to (Z7). May be something.
前記一般式（Ｚ４）において、Ｘとしては、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）が例示される。前記一般式（Ｚ４）において、Ｘは臭素（Ｂｒ）またはヨウ素（Ｉ）であることが好ましく、臭素（Ｂｒ）であることがより好ましい。 In the general formula (Z4), examples of X include fluorine (F), chlorine (Cl), bromine (Br), and iodine (I). In the general formula (Z4), X is preferably bromine (Br) or iodine (I), and more preferably bromine (Br).
前記一般式（Ｚ６）に示される官能基は、具体的には、下記構造式（Ｚ８）に示される官能基である。 The functional group represented by the general formula (Z6) is specifically a functional group represented by the following structural formula (Z8).
前記一般式（Ｚ７）に示される官能基は、具体的には、下記構造式（Ｚ９）に示される官能基である。 The functional group represented by the general formula (Z7) is specifically a functional group represented by the following structural formula (Z9).
上記構造式（Ｚ９）において、アルカリ金属原子としては、リチウム（Ｌｉ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）が例示される。上記構造式（Ｚ９）において、アルカリ金属原子は、ナトリウム（Ｎａ）であることが好ましい。 In the structural formula (Z9), examples of the alkali metal atom include lithium (Li), sodium (Na), and potassium (K). In the structural formula (Z9), the alkali metal atom is preferably sodium (Na).
本発明においてリンカーは、例えば、下記構造式（Ｘ１）〜（Ｘ２６）のいずれかに示されるリンカーあってよい。また、本発明においてリンカーは、例えば、下記構造式（Ｘ１）〜（Ｘ２６）に示される構造の組み合わせからなるリンカーであってもよい。組み合わせは、下記構造式（Ｘ１）〜（Ｘ２６）から選択される単一の構造の２つまたはそれ以上の組み合わせであってもよく、下記構造式（Ｘ１）〜（Ｘ２６）から選択される２種またはそれ以上の構造の組み合わせであってもよく、それらのさらなる組み合わせであってもよい。組み合わせとして、具体的には、例えば、実施例に記載の組み合わせが挙げられる。 In the present invention, the linker may be, for example, a linker represented by any of the following structural formulas (X1) to (X26). In the present invention, the linker may be, for example, a linker having a combination of structures represented by the following structural formulas (X1) to (X26). The combination may be a combination of two or more of a single structure selected from the following structural formulas (X1) to (X26), and 2 may be a combination selected from the following structural formulas (X1) to (X26). It may be a combination of species or more, or a further combination thereof. Specific examples of the combination include the combinations described in Examples.
本発明においてリンカーは、３つまたはそれ以上の官能基を有していてもよい。本発明において３つまたはそれ以上の官能基を有するリンカーを用いた場合、例えば、２つまたはそれ以上および／または２種またはそれ以上のグリコサミノグリカンを含む複合体を得ることができる。また、本発明において３つまたはそれ以上の官能基を有するリンカーを用いた場合、例えば、２つまたはそれ以上および／または２種またはそれ以上のペプチドを含む複合体を得ることができる。 In the present invention, the linker may have three or more functional groups. When a linker having three or more functional groups is used in the present invention, for example, a complex containing two or more and / or two or more glycosaminoglycans can be obtained. When a linker having three or more functional groups is used in the present invention, for example, a complex containing two or more and / or two or more peptides can be obtained.
上述したリンカーにおける官能基（例えば、Ｚ１、Ｚ２、（Ｚ１）〜（Ｚ９）、およびリンカーの構造式中のそれらに該当する部位）は、グリコサミノグリカンまたはペプチドとの結合（例えば、グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体の形成）前のリンカーにおける官能基を示す。当該官能基は、グリコサミノグリカンまたはペプチドとの結合に用いられ得る。よって、当該官能基は、グリコサミノグリカンまたはペプチドとの結合後には存在しなくてもよい。すなわち、用いられる構成要素間の結合様式に応じて、当該末端官能基の一部または全部が、形成された結合により置換され得る。 The functional group (for example, Z 1 , Z 2 , (Z1) to (Z9), and the corresponding site in the linker structural formula) in the linker described above is bonded to a glycosaminoglycan or a peptide (for example, (Formation of a complex containing glycosaminoglycan and peptide) The functional groups in the linker before are shown. Such functional groups can be used for binding to glycosaminoglycans or peptides. Thus, the functional group may not be present after binding to glycosaminoglycan or peptide. That is, some or all of the terminal functional groups can be replaced by the formed bond, depending on the mode of bonding between the components used.
本発明においてリンカーは、完全長のリンカーとして提供され用いられてもよく、そうでなくてもよい。例えば、グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体の形成の際に、完全長のリンカーが形成されてもよい。具体的には、例えば、リンカーを有するグリコサミノグリカンとリンカーを有するペプチドを結合させる場合、リンカー同士の結合（すなわち、グリコサミノグリカンが有するリンカーとペプチドが有するリンカーとの結合）により、完全長のリンカーが形成され得る。また、例えば、グリコサミノグリカンまたはペプチドが有するリンカーに別のリンカーを逐次結合させる（リンカーを伸長させる）ことにより、完全長のリンカーが形成されてもよい。具体的には、例えば、グリコサミノグリカンまたはペプチドにリンカーの一部を導入し、さらにリンカーの残部が導入されることにより、完全長のリンカーが形成され得る。すなわち、例えば、上述したリンカーにおける結合（例えば、Ｙ１、Ｙ２、（Ｙ１）〜（Ｙ１４）、およびリンカーの構造式中のそれらに該当する部位）は、いずれも、グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体の形成前からリンカー中に存在していてもよく、グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体の形成の際に形成されてもよい。 In the present invention, the linker may or may not be provided and used as a full-length linker. For example, a full-length linker may be formed during the formation of a complex containing glycosaminoglycan and a peptide. Specifically, for example, when a glycosaminoglycan having a linker is bonded to a peptide having a linker, complete binding is achieved by bonding between the linkers (that is, bonding between the linker of the glycosaminoglycan and the linker of the peptide). Long linkers can be formed. Further, for example, a full-length linker may be formed by sequentially linking another linker to the linker of the glycosaminoglycan or the peptide (extending the linker). Specifically, for example, a full-length linker can be formed by introducing a part of a linker into a glycosaminoglycan or a peptide, and further introducing the rest of the linker. That is, for example, the bonds (for example, Y 1 , Y 2 , (Y1) to (Y14), and the corresponding sites in the structural formula of the linker) in the linker described above are all glycosaminoglycan and peptide May be present in the linker before the formation of the complex containing, or may be formed during the formation of the complex containing glycosaminoglycan and the peptide.
本発明におけるリンカーとしては、１種のリンカーのみが用いられてもよく、２種またはそれ以上のリンカーが用いられてもよい。 As the linker in the present invention, only one kind of linker may be used, or two or more kinds of linkers may be used.
本発明において用いられるリンカーは、例えば、化学合成により製造することができる。化学合成による製造は、公知の方法により行うことができる。また、本発明において用いられるリンカーは、例えば、各種試薬メーカー（Thermo scientific社、東京化成工業
社、同仁化学社等）から市販品として、または合成を委託して入手することができる。
The linker used in the present invention can be produced, for example, by chemical synthesis. Production by chemical synthesis can be performed by a known method. The linker used in the present invention can be obtained as a commercial product from various reagent manufacturers (Thermo scientific, Tokyo Chemical Industry, Dojin Chemical, etc.) or by outsourcing synthesis.
本発明におけるリンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させることにより、ペプチドの血中滞留性を増強することができる。特に、特定の構造を有するリンカーを採用することにより、当該ペプチドの血中滞留性を顕著に増強することができる。 By binding glycosaminoglycan to the peptide via the linker in the present invention, the retention of the peptide in blood can be enhanced. In particular, by employing a linker having a specific structure, the blood retention of the peptide can be significantly enhanced.
＜７＞本発明におけるグリコサミノグリカン
本発明において用いられるグリコサミノグリカンは、ペプチドの血中滞留性を増強させる作用を有するグリコサミノグリカンである限り、特に制限されない。本発明において用いられるグリコサミノグリカンは、具体的には、リンカーを介してペプチドと複合体を形成することによりペプチドの血中滞留性を増強させることが可能なグリコサミノグリカンである限り、特に制限されない。
<7> Glycosaminoglycan in the present invention The glycosaminoglycan used in the present invention is not particularly limited as long as it is a glycosaminoglycan having an action of enhancing the retention of a peptide in blood. The glycosaminoglycan used in the present invention is specifically a glycosaminoglycan capable of enhancing the blood retention of a peptide by forming a complex with the peptide via a linker, There is no particular limitation.
本発明においてグリコサミノグリカンは、硫酸基を実質的に有しないグリコサミノグリカンであることが好ましく、硫酸基を有しないグリコサミノグリカンであることがより好ましい。また、本発明においてグリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸を除くグリコサミノグリカンであることが好ましい。特に、本発明においてグリコサミノグリカンは、コンドロイチンまたはヘパロサンであることが好ましく、コンドロイチンであることがより好ましい。 In the present invention, the glycosaminoglycan is preferably a glycosaminoglycan having substantially no sulfate group, and more preferably a glycosaminoglycan having no sulfate group. Further, in the present invention, the glycosaminoglycan is preferably a glycosaminoglycan excluding hyaluronic acid. Particularly, in the present invention, the glycosaminoglycan is preferably chondroitin or heparosan, and more preferably chondroitin.
本発明においてグリコサミノグリカンは、側鎖を有していてもよく、有していなくても
よい。側鎖を有するグリコサミノグリカンは、側鎖（アルキル基等）を導入したグリコサミノグリカンであってよい。側鎖を有しないグリコサミノグリカンは、本来的に側鎖を有しないグリコサミノグリカン（側鎖を有しない形態で生産されたグリコサミノグリカン）であってもよく、側鎖を除去して得られたグリコサミノグリカンであってもよい。側鎖の除去は、例えば、公知の方法により行うことができる。側鎖の除去は、例えば、酸加水分解反応により行うことができる（Lidholt K, Fjelstad M., J Biol Chem. 1997 Jan 31; 272(5): 2682-7.）。本発明においてグリコサミノグリカンは、側鎖を実質的に有しない
グリコサミノグリカンであることが好ましく、側鎖を有しないグリコサミノグリカンであることがより好ましく、本来的に側鎖を有しないグリコサミノグリカンであることがさらに好ましい。
In the present invention, glycosaminoglycan may or may not have a side chain. The glycosaminoglycan having a side chain may be a glycosaminoglycan into which a side chain (such as an alkyl group) is introduced. The glycosaminoglycan having no side chain may be a glycosaminoglycan originally having no side chain (glycosaminoglycan produced in a form having no side chain). The glycosaminoglycan obtained by the above method may be used. The removal of the side chain can be performed, for example, by a known method. The removal of the side chain can be performed, for example, by an acid hydrolysis reaction (Lidholt K, Fjelstad M., J Biol Chem. 1997 Jan 31; 272 (5): 2682-7.). In the present invention, the glycosaminoglycan is preferably a glycosaminoglycan having substantially no side chain, more preferably a glycosaminoglycan having no side chain, and originally having a side chain. It is further preferred that the glycosaminoglycan is not used.
「硫酸基を実質的に有しないグリコサミノグリカン」とは、ペプチドの血中滞留性を増強させる程度が、比較対象を用いた場合と比較して全くあるいはほとんど変化（増加または低下）しない程度の硫酸基しか有しないグリコサミノグリカンを意味し、硫酸基を全く有しないグリコサミノグリカンも包含する。硫酸基を実質的に有しないグリコサミノグリカンについての「比較対象」とは、硫酸基を有しないグリコサミノグリカンであって、硫酸基の有無を除き、当該「硫酸基を実質的に有しないグリコサミノグリカン」と同一の構造からなるグリコサミノグリカンを意味する。また、「側鎖を実質的に有しないグリコサミノグリカン」とは、ペプチドの血中滞留性を増強させる程度が、比較対象を用いた場合と比較して全くあるいはほとんど変化（増加または低下）しない程度の側鎖しか有しないグリコサミノグリカンを意味し、側鎖を全く有しないグリコサミノグリカンも包含する。側鎖を実質的に有しないグリコサミノグリカンについての「比較対象」とは、側鎖を有しないグリコサミノグリカンであって、側鎖の有無を除き、当該「側鎖を実質的に有しないグリコサミノグリカン」と同一の構造からなるグリコサミノグリカンを意味する。 "Glycosaminoglycan having substantially no sulfate group" means that the degree of enhancing the retention of the peptide in blood is not or hardly changed (increased or decreased) as compared with the case of using the control. Means glycosaminoglycans having only a sulfate group, and also includes glycosaminoglycans having no sulfate group. The “comparison object” for glycosaminoglycan having substantially no sulfate group is a glycosaminoglycan having no sulfate group, except for the presence or absence of a sulfate group. Glycosaminoglycan having the same structure as "glycosaminoglycan not used". The term “glycosaminoglycan having substantially no side chain” means that the degree of enhancing the retention of a peptide in blood is completely or almost changed (increase or decrease) as compared with the case of using a comparative subject. Glycosaminoglycans having no side chains are included, and glycosaminoglycans having no side chains are included. The “comparative object” for glycosaminoglycan having substantially no side chain is a glycosaminoglycan having no side chain and excluding the presence or absence of a side chain. Glycosaminoglycan having the same structure as "glycosaminoglycan not used".
「ペプチドの血中滞留性を増強させる程度がほとんど変化しない」とは、具体的には、同一のリンカーを介して同一のペプチドと複合体を形成した際のペプチドの血中半減期または薬効時間（すなわち当該複合体の血中半減期または薬効時間）で比較した場合に、例えば、２０％以下、１０％以下、５％以下、２％以下、または１％以下の変化しか起こらないことを意味してよく、全く変化が認められない場合も包含する。すなわち、例えば、硫酸基を実質的に有しないグリコサミノグリカンについての「ペプチドの血中滞留性を増強させる程度がほとんど変化しない」とは、リンカーを介してペプチドと比較対象を結合させて複合体を形成した場合のペプチドの血中半減期または薬効時間がｎ時間である場合に、同リンカーを介して同ペプチドと硫酸基を実質的に有しないグリコサミノグリカンを結合させて複合体を形成した場合のペプチドの血中半減期または薬効時間が、０．８ｎ時間〜１．２ｎ時間、０．９ｎ時間〜１．１ｎ時間、０．９５ｎ時間〜１．０５ｎ時間、０．９８ｎ時間〜１．０２ｎ時間、または０．９９ｎ時間〜１．０１ｎ時間であることを意味してよい。 "The degree of enhancing the retention of the peptide in blood hardly changes" is specifically defined as the half-life in blood or the pharmacodynamic time of the peptide when a complex is formed with the same peptide via the same linker. (I.e., when compared with the complex half-life or drug duration) means that only a change of, for example, 20% or less, 10% or less, 5% or less, 2% or less, or 1% or less occurs. And the case where no change is observed is also included. That is, for example, for glycosaminoglycan having substantially no sulfate group, "the degree of enhancing the retention of the peptide in blood hardly changes" means that the peptide is bound to the comparative object via a linker to form a complex. When the peptide has a blood half-life or drug effect time of n hours when formed into a body, the peptide is bound to glycosaminoglycan having substantially no sulfate group via the linker to form a complex. When formed, the blood half-life or efficacy time of the peptide is 0.8 nh to 1.2 nh, 0.9 nh to 1.1 nh, 0.95 nh to 1.05 nh, 0.98 nh to 1.02 n hours, or 0.99 n hours to 1.01 n hours.
「硫酸基を実質的に有しないグリコサミノグリカン」とは、具体的には、硫黄含量が０％〜１％、０％〜０．５％、または０％〜０．１％であるグリコサミノグリカンを意味してよい。硫黄含量は、グリコサミノグリカンが有する硫黄原子の量（グリコサミノグリカンが有する硫黄原子の数と硫黄の原子量を乗じた値）をグリコサミノグリカンの分子量で除して算出される値を百分率換算した値（グリコサミノグリカンを構成する原子の総重量に対する硫黄原子の総重量を重量パーセント濃度（ｗ／ｗ）で示した値）として定義される。硫黄含量は、例えば、公知の手法により測定することができる。硫黄含量は、例えば、酸素フラスコ燃焼法により測定することができる。 "Glycosaminoglycan having substantially no sulfate group" specifically refers to a glycosaminoglycan having a sulfur content of 0% to 1%, 0% to 0.5%, or 0% to 0.1%. It may mean Saminoglycan. The sulfur content is a value calculated by dividing the amount of sulfur atoms in glycosaminoglycan (a value obtained by multiplying the number of sulfur atoms in glycosaminoglycan by the atomic weight of sulfur) by the molecular weight of glycosaminoglycan. It is defined as a percentage-converted value (the total weight of sulfur atoms with respect to the total weight of atoms constituting glycosaminoglycan expressed as a weight percent concentration (w / w)). The sulfur content can be measured, for example, by a known technique. The sulfur content can be measured, for example, by an oxygen flask combustion method.
「側鎖を実質的に有しないグリコサミノグリカン」とは、具体的には、グリコサミノグリカンの骨格を構成する糖残基の総数に対する側鎖を有する糖残基の総数の比率が０％〜
２０％、０％〜１０％、０％〜５％、０％〜２％、０％〜１％、０％〜０．５％、または０％〜０．１％であるグリコサミノグリカンを意味してよい。糖残基の総数は、例えば、公知の手法により測定することができる。糖残基の総数は、例えば、グリコサミノグリカンを酸加水分解して得られる単糖やオリゴ糖をゲルろ過等のクロマトグラフィーに供して測定することができる。
"Glycosaminoglycan having substantially no side chain" specifically means that the ratio of the total number of sugar residues having a side chain to the total number of sugar residues constituting the skeleton of glycosaminoglycan is 0. % ~
20%, 0% to 10%, 0% to 5%, 0% to 2%, 0% to 1%, 0% to 0.5%, or 0% to 0.1% glycosaminoglycan It may mean. The total number of sugar residues can be measured, for example, by a known technique. The total number of sugar residues can be measured, for example, by subjecting monosaccharides or oligosaccharides obtained by acid hydrolysis of glycosaminoglycans to chromatography such as gel filtration.
本発明においてグリコサミノグリカンの分子量は、リンカーを介してペプチドと複合体を形成することによりペプチドの血中滞留性を増強させることが可能である限り、特に制限されない。本発明においてグリコサミノグリカンの分子量は、重量平均分子量として、１０ｋＤａ（１×１０４）超であることが好ましい。本発明においてグリコサミノグリカンの分子量は、重量平均分子量として、例えば、１×１０４超、２×１０４以上、または３×１０４以上であってもよく、５×１０６以下、１×１０６以下、５×１０５以下、２×１０５以下、または１×１０５以下であってもよく、それらの組み合わせの範囲であってもよい。本発明においてグリコサミノグリカンの分子量は、重量平均分子量として、例えば、１×１０４超５×１０６以下、１×１０４超１×１０６以下、１×１０４超５×１０５以下、１×１０４超２×１０５以下、２×１０４以上２×１０５以下、３×１０４以上２×１０５以下、１×１０４超１×１０５以下、２×１０４以上１×１０５以下、３×１０４以上１×１０５以下であってよい。ここにいう重量平均分子量は、ゲルろ過クロマトグラフィーにより測定される重量平均分子量を意味する。グリコサミノグリカンの分子量は、例えば、参考例２に記載の方法により測定することができる。 In the present invention, the molecular weight of glycosaminoglycan is not particularly limited as long as it can enhance the blood retention of the peptide by forming a complex with the peptide via a linker. In the present invention, the molecular weight of glycosaminoglycan is preferably more than 10 kDa (1 × 10 4 ) as a weight average molecular weight. In the present invention, the molecular weight of glycosaminoglycan may be, for example, a weight average molecular weight of more than 1 × 10 4 , 2 × 10 4 or more, or 3 × 10 4 or more, and 5 × 10 6 or less, 1 × It may be 10 6 or less, 5 × 10 5 or less, 2 × 10 5 or less, or 1 × 10 5 or less, or a range of a combination thereof. In the present invention, the molecular weight of glycosaminoglycan is, for example, more than 1 × 10 4 and 5 × 10 6 or less, more than 1 × 10 4 and 1 × 10 6 or less and more than 1 × 10 4 and 5 × 10 5 or less as a weight average molecular weight. More than 1 × 10 4 2 × 10 5 or less, 2 × 10 4 or more and 2 × 10 5 or less, 3 × 10 4 or more and 2 × 10 5 or less, more than 1 × 10 4 1 × 10 5 or less, 2 × 10 4 or more It may be 1 × 10 5 or less, 3 × 10 4 or more and 1 × 10 5 or less. The weight average molecular weight as referred to herein means a weight average molecular weight measured by gel filtration chromatography. The molecular weight of glycosaminoglycan can be measured, for example, by the method described in Reference Example 2.
本発明においてグリコサミノグリカンは、微生物によって生産されたグリコサミノグリカン（以下、「微生物由来グリコサミノグリカン」ともいう。）または酵素によって合成されたグリコサミノグリカン（以下、「酵素合成グリコサミノグリカン」ともいう。）であることが好ましい。「微生物由来グリコサミノグリカン」は、具体的には、グリコサミノグリカンを生産する能力を有する微生物により生産されたグリコサミノグリカンである。また、「酵素合成グリコサミノグリカン」は、具体的には、in vitroまたは無細胞系でグリコサミノグリカンの合成酵素によって合成されたグリコサミノグリカンである。グリコサミノグリカンの合成酵素としては、コンドロイチン合成酵素やヘパロサン合成酵素が挙げられる。グリコサミノグリカンの合成酵素としては、１種の酵素のみが用いられてもよく、２種またはそれ以上の酵素が用いられてもよい。 In the present invention, glycosaminoglycan is glycosaminoglycan produced by a microorganism (hereinafter, also referred to as “microbial glycosaminoglycan”) or glycosaminoglycan synthesized by an enzyme (hereinafter, “enzymatically synthesized glycosylglycan”). Saminoglycan "). “Microbial glycosaminoglycans” are specifically glycosaminoglycans produced by microorganisms having the ability to produce glycosaminoglycans. The “enzymatically synthesized glycosaminoglycan” is specifically a glycosaminoglycan synthesized by a glycosaminoglycan synthase in vitro or in a cell-free system. Examples of glycosaminoglycan synthase include chondroitin synthase and heparosan synthase. As the glycosaminoglycan synthase, only one enzyme may be used, or two or more enzymes may be used.
＜微生物由来グリコサミノグリカンの製造＞
「グリコサミノグリカンを生産する能力」とは、例えば、グリコサミノグリカンそのもの（側鎖を有しないグリコサミノグリカン）を生産する能力であってもよく、側鎖を有するグリコサミノグリカンを生産する能力であってもよい。側鎖としては、フルクトース等の糖残基が挙げられる。側鎖を有するグリコサミノグリカンとしては、具体的には、フルクトース残基を側鎖として有するコンドロイチンであるＫ４多糖（フルクトシル化コンドロイチン）が挙げられる。Ｋ４多糖としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ４株が生産するＫ４多糖が挙げられる。本発明においては、Ｋ４多糖をそのままグリコサミノグリカンとして用いてもよいし、フルクトース残基を脱離（脱フルクトシル化）して得られる脱フルクトシル化Ｋ４多糖をグリコサミノグリカンとして用いてもよい。
<Production of microorganism-derived glycosaminoglycan>
The “ability to produce glycosaminoglycan” may be, for example, the ability to produce glycosaminoglycan itself (glycosaminoglycan having no side chain). Ability to produce. Examples of the side chain include sugar residues such as fructose. Specific examples of glycosaminoglycans having a side chain include K4 polysaccharide (fructosylated chondroitin) which is a chondroitin having a fructose residue as a side chain. Examples of the K4 polysaccharide include a K4 polysaccharide produced by an Escherichia coli K4 strain. In the present invention, the K4 polysaccharide may be used as it is as a glycosaminoglycan, or a defructosylated K4 polysaccharide obtained by elimination (defructosylation) of a fructose residue may be used as a glycosaminoglycan. .
「グリコサミノグリカンを生産する能力を有する微生物」は、例えば、細胞内にグリコサミノグリカンを生産する微生物であってもよく、培地中にグリコサミノグリカンを生産する微生物であってもよく、菌体表層（例えば、細胞膜上や細胞壁上）にグリコサミノグリカンを生産する微生物であってもよい。菌体表層にグリコサミノグリカンを生産する微生物としては、莢膜多糖としてグリコサミノグリカンを生産する微生物が挙げられる。 The "microorganism having the ability to produce glycosaminoglycan" may be, for example, a microorganism that produces glycosaminoglycan in a cell or a microorganism that produces glycosaminoglycan in a medium. Alternatively, a microorganism that produces glycosaminoglycan on the cell surface (for example, on a cell membrane or a cell wall) may be used. Microorganisms that produce glycosaminoglycans on the cell surface include microorganisms that produce glycosaminoglycans as capsular polysaccharides.
「グリコサミノグリカンを生産する能力を有する微生物」において、微生物の種類は特
に制限されない。微生物としては、例えば、細菌や酵母が挙げられる。微生物としては、グリコサミノグリカンの生産性や取扱いの容易性などの点から、細菌が好ましい。
In the “microorganism capable of producing glycosaminoglycan”, the type of the microorganism is not particularly limited. Examples of the microorganism include bacteria and yeast. The microorganism is preferably a bacterium from the viewpoint of productivity of glycosaminoglycan and easy handling.
細菌の種類は特に限定されない。細菌としては、文献（特表２０１０−５２４４３１号公報）に開示されているグルコノアセトバクター・ハンセニー（Gluconacetobacter hansenii）やグルコノアセトバクター・キシリナス（Gluconacetobacter xylinus）等のグル
コノアセトバクター属細菌、リゾビウム・メフロティ（Rhizobium meffloti）等のリゾビウム属細菌、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）等のアセトバクター
属細菌、エルヴィニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）等のエルヴィニア属細菌、
チオバチルス・フェロキシダンス（Thiobacillus ferrooxidans）等のチオバチルス属細
菌、ザイレラ・ファスチジオーサ（Xylella fastidiosa）等のザイレラ属細菌、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）等のシノリゾビウム属細菌、ロドコッカス・ロドクラス（Rhodococcus rhodochrous）等のロドコッカス属細菌、クレブシエラ・
アエロゲネス（Klebsiella aerogenes）等のクレブシエラ属細菌、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等のエンテロバクター属細菌、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属細菌が例示される。また、細菌としては、文献（特表２０１３−５２０９９５号公報）に開示されているシュードモナス（Pseudomonas）属細菌、キサントモナス（Xanthomonas）属細菌、メチロモナス（Methylomonas）属細菌、アシネトバクター（Acinetobacter）属細菌、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属
細菌などの非病原性生物も例示できる。また、細菌としては、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）も挙げられる。
The type of bacteria is not particularly limited. Examples of the bacteria include bacteria of the genus Gluconoacetobacterium, such as Gluconacetobacter hansenii and Gluconacetobacter xylinus, disclosed in the literature (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2010-524431), and rhizobium. -Rhizobium bacterium such as Mefloti (Rhizobium meffloti), Acetobacter bacterium such as Acetobacter xylinum, Ervinia bacterium such as Erwinia amylovora,
Bacteria belonging to the genus Thiobacillus such as Thiobacillus ferrooxidans, bacteria belonging to the genus Xylella such as Xylella fastidiosa, bacteria belonging to the genus Sinorrhizobium such as Sinorhizobium meliloti, Rhodococcus rhococcus doc such as Rhodococcus oc Rhodococcus bacteria, Klebsiella
Examples include bacteria of the genus Klebsiella such as Klebsiella aerogenes, bacteria of the genus Enterobacter such as Enterobacter aerogenes, and bacteria of the genus Escherichia such as Escherichia coli. Examples of the bacteria include bacteria of the genus Pseudomonas, bacteria of the genus Xanthomonas, bacteria of the genus Methylomonas, bacteria of the genus Acinetobacter; Non-pathogenic organisms such as bacteria of the genus Sphingomonas can also be exemplified. Bacteria also include Pasteurella multocida.
細菌としては、グリコサミノグリカンの生産性や、汎用性、取扱いの容易性などの点で、エシェリヒア（Escherichia）属に属する細菌が好ましい。なかでも、特に汎用されて
おり取扱いが容易な、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が好ましい。エシェリヒア・コリとしては、例えば、W3110株（ATCC 27325）やMG1655株（ATCC 47076）等のエシ
ェリヒア・コリK-12株；NCDC U1-41株（ATCC 23502）等のエシェリヒア・コリＫ４株；NCDC Bi 8337-41株（ATCC 23506）等のエシェリヒア・コリＫ５株；BL21株等のエシェリヒ
ア・コリＢ株；およびそれらの派生株が挙げられる。これらの株は、例えば、American Type Culture Collection（ATCC）（P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108 United States of America）やThe International Escherichia and Klebsiella Centre (WHO), Statens Serum Institut（Building 37K, Room 125c Artillerivej 5 DK-2300 Copenhagen S Denmark）のカタログ又はホームページから入手可能である。
As the bacterium, a bacterium belonging to the genus Escherichia is preferable in terms of productivity of glycosaminoglycan, versatility, and easy handling. Among them, Escherichia coli, which is widely used and easy to handle, is preferred. Examples of Escherichia coli include, for example, Escherichia coli K-12 strains such as W3110 strain (ATCC 27325) and MG1655 strain (ATCC 47076); Escherichia coli K4 strain such as NCDC U1-41 strain (ATCC 23502); Escherichia coli K5 strain such as 8337-41 strain (ATCC 23506); Escherichia coli B strain such as BL21 strain; and derivatives thereof. These strains are, for example, American Type Culture Collection (ATCC) (PO Box 1549 Manassas, VA 20108 United States of America), The International Escherichia and Klebsiella Center (WHO), Statens Serum Institut (Building 37K, Room 125c Artillerivej 5 DK) -2300 Copenhagen S Denmark) catalog or website.
「グリコサミノグリカンを生産する能力を有する微生物」は、本来的にグリコサミノグリカンを生産する能力を有する微生物であってもよく、グリコサミノグリカンを生産する能力を有するように改変された微生物であってもよい。 The "microorganism having the ability to produce glycosaminoglycan" may be a microorganism having the ability to naturally produce glycosaminoglycan, and has been modified to have the ability to produce glycosaminoglycan. It may be a microorganism.
「本来的にグリコサミノグリカンを生産する能力を有する微生物」としては、例えば、コンドロイチンを生産する微生物であるエシェリヒア・コリＫ４株やパスツレラ・ムルトシダ タイプＦが挙げられる。エシェリヒア・コリＫ４株は、フルクトース残基を側鎖として有するコンドロイチン（Ｋ４多糖）を生産する。本発明においては、エシェリヒア・コリＫ４株がそのまま「グリコサミノグリカン（コンドロイチン）を生産する能力を有する微生物」として用いられてもよいし、生産するコンドロイチン（Ｋ４多糖）がフルクトース残基を側鎖として有しないように改変されたエシェリヒア・コリＫ４株が「グリコサミノグリカン（コンドロイチン）を生産する能力を有する微生物」として用いられてもよい。そのようなエシェリヒア・コリＫ４株の改変株は、例えば、エシェリヒア・コリＫ４株のkfoE遺伝子を不活性化して得ることができる。エシェリヒア・コリＫ４株のkfoE遺伝子の不活性化は、例えば、公知の文献（特表２０１３−５３１９９５号公報）に記載された方法を参照して行うことができる。また、「本来的にグリコサミノグリカンを生産する
能力を有する微生物」としては、例えば、ヘパロサンを生産する微生物であるエシェリヒア・コリＫ５株、エシェリヒア・コリＮｉｓｓｌｅ１９１７株、パスツレラ・ムルトシダ
タイプＤも挙げられる。
Examples of the "microorganism having the ability to naturally produce glycosaminoglycan" include, for example, Escherichia coli K4 strain and Pasteurella multocida type F, which are chondroitin-producing microorganisms. Escherichia coli K4 strain produces chondroitin (K4 polysaccharide) having a fructose residue as a side chain. In the present invention, the Escherichia coli K4 strain may be used as it is as a “microorganism having the ability to produce glycosaminoglycan (chondroitin)”, or the produced chondroitin (K4 polysaccharide) has a fructose residue in the side chain. The Escherichia coli K4 strain which has been modified so as not to have it may be used as "a microorganism having an ability to produce glycosaminoglycan (chondroitin)". Such a modified Escherichia coli K4 strain can be obtained, for example, by inactivating the kfoE gene of the Escherichia coli K4 strain. The inactivation of the kfoE gene of the Escherichia coli K4 strain can be performed, for example, by referring to a method described in a known document (JP-A-2013-531995). Examples of the "microorganism having the ability to naturally produce glycosaminoglycan" also include heparosan-producing microorganisms such as Escherichia coli K5 strain, Escherichia coli Nissle 1917 strain, and Pasteurella multocida type D. .
「グリコサミノグリカンを生産する能力を有するように改変された微生物」は、例えば、上述した細菌等の微生物にグリコサミノグリカンを生産する能力を付与することにより取得できる。「グリコサミノグリカンを生産する能力の付与」は、例えば、グリコサミノグリカンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を微生物に発現可能に導入することにより行うことができる。 The “microorganism modified to have the ability to produce glycosaminoglycan” can be obtained by, for example, imparting the ability to produce glycosaminoglycan to a microorganism such as the aforementioned bacteria. “Granting the ability to produce glycosaminoglycan” can be performed, for example, by introducing a gene encoding a protein involved in the production of glycosaminoglycan into a microorganism in an expressible manner.
グリコサミノグリカンが側鎖を有するグリコサミノグリカンである場合、グリコサミノグリカンを生産する能力の付与は、例えば、グリコサミノグリカンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を、グリコサミノグリカンに側鎖を付加する能力を有する微生物に発現可能に導入することにより行うことができる。「グリコサミノグリカンに側鎖を付加する能力を有する微生物」は、例えば、グリコサミノグリカンへの側鎖の付加に関与するタンパク質をコードする遺伝子を有する微生物である。「グリコサミノグリカンに側鎖を付加する能力を有する微生物」は、当該遺伝子を本来的に有する微生物であってもよく、当該遺伝子を発現可能に導入した微生物であってもよい。 When the glycosaminoglycan is a glycosaminoglycan having a side chain, conferring the ability to produce glycosaminoglycan, for example, a gene encoding a protein involved in the production of glycosaminoglycan, a glycosaminoglycan It can be carried out by expression-introduced introduction into a microorganism having the ability to add a side chain to glycan. The “microorganism having the ability to add a side chain to glycosaminoglycan” is, for example, a microorganism having a gene encoding a protein involved in adding a side chain to glycosaminoglycan. The "microorganism having the ability to add a side chain to glycosaminoglycan" may be a microorganism originally having the gene or a microorganism into which the gene has been introduced so that it can be expressed.
グリコサミノグリカンが側鎖を有しないグリコサミノグリカンである場合、グリコサミノグリカンを生産する能力の付与は、例えば、グリコサミノグリカンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を、グリコサミノグリカンに側鎖を付加する能力を有しない微生物に発現可能に導入することにより行うことができる。「グリコサミノグリカンに側鎖を付加する能力を有しない微生物」は、例えば、グリコサミノグリカンへの側鎖の付加に関与するタンパク質をコードする遺伝子を有しない微生物である。「グリコサミノグリカンに側鎖を付加する能力を有しない微生物」は、当該遺伝子を本来的に有しない微生物であってもよく、当該遺伝子を欠失または不活性化させた微生物であってもよい。 When the glycosaminoglycan is a glycosaminoglycan having no side chain, conferring the ability to produce glycosaminoglycan can be achieved, for example, by modifying a gene encoding a protein involved in glycosaminoglycan production by glycosaminoglycan. It can be carried out by expression-introduced introduction into a microorganism having no ability to add a side chain to noglycan. A "microorganism having no ability to add a side chain to glycosaminoglycan" is, for example, a microorganism having no gene encoding a protein involved in adding a side chain to glycosaminoglycan. A "microorganism having no ability to add a side chain to glycosaminoglycan" may be a microorganism that does not naturally have the gene or a microorganism that has the gene deleted or inactivated. Good.
「グリコサミノグリカンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子」としては、例えば、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子としてkfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT, pmCS遺伝子が挙げられる。kfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子が挙げられる。pmCS遺伝子としては、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）由来のpmCS遺伝子が挙
げられる。
As the `` gene encoding a protein involved in glycosaminoglycan production '', for example, kfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU as a gene encoding a protein involved in chondroitin production , kpsC, kpsS, kpsM, kpsT, and pmCS genes. The kfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT genes include kfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, derived from Escherichia coli K4 strain. kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT genes. Examples of the pmCS gene include a pmCS gene derived from Pasteurella multocida.
また、「グリコサミノグリカンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子」としては、例えば、ヘパロサンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子としてkfiA, kfiB, kfiC, kfiD, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT, pmHS遺伝子が挙げられる。kfiA, kfiB, kfiC, kfiD, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ５株由来のkfiA, kfiB, kfiC, kfiD, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子が挙げられる。pmHS遺伝子としては、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）由来のpmHS遺伝子が挙げられる。 As the `` gene encoding a protein involved in glycosaminoglycan production '', for example, as a gene encoding a protein involved in heparosan production, kfiA, kfiB, kfiC, kfiD, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU , kpsC, kpsS, kpsM, kpsT, and pmHS genes. The kfiA, kfiB, kfiC, kfiD, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT genes include kfiA, kfiB, kfiC, kfiD, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, derived from Escherichia coli K5 strain. kpsC, kpsS, kpsM and kpsT genes. Examples of the pmHS gene include a pmHS gene derived from Pasteurella multocida.
「グリコサミノグリカンへの側鎖の付加に関与するタンパク質をコードする遺伝子」としては、kfoD, orf3(kfoI), kfoE, orf1(kfoH)遺伝子が挙げられる。kfoD, orf3(kfoI), kfoE, orf1(kfoH)遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoD, orf3(kfoI), kfoE, orf1(kfoH)遺伝子が挙げられる。 Examples of the "gene encoding a protein involved in the addition of a side chain to glycosaminoglycan" include kfoD, orf3 (kfoI), kfoE, and orf1 (kfoH) genes. Examples of the kfoD, orf3 (kfoI), kfoE, orf1 (kfoH) genes include kfoD, orf3 (kfoI), kfoE, orf1 (kfoH) genes derived from Escherichia coli K4 strain.
上述した遺伝子の塩基配列、及びこれらの遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等の公用データベースから取得できる。遺伝子の導入は、例えば、同遺伝子を搭載したベクターを微生物に導入することや、同遺伝子を微生物の染色体上に導入することにより達成できる。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。本発明においては、１種の遺伝子を導入してもよく、２種またはそれ以上の遺伝子を導入してもよい。 The nucleotide sequences of the above-mentioned genes and the amino acid sequences of the proteins encoded by these genes can be obtained from public databases such as NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Introduction of a gene can be achieved by, for example, introducing a vector carrying the gene into a microorganism, or introducing the gene into a chromosome of the microorganism. Only one copy of the gene may be introduced, or two or more copies may be introduced. In the present invention, one type of gene may be introduced, or two or more types of genes may be introduced.
導入する遺伝子は、用いる微生物の種類等に応じて適宜選択できる。例えば、エシェリヒア・コリＫ５株は、ヘパロサンを生産する能力を有し、コンドロイチンを生産する能力を有しないが、kfoAおよびkfoC遺伝子を導入することにより、エシェリヒア・コリＫ５株にコンドロイチンを生産する能力を付与することができる。また、例えば、エシェリヒア・コリK-12株は、コンドロイチンを生産する能力を有しないが、kfo遺伝子群（kfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG）およびkps遺伝子群（kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT）を導入することにより、エシェリヒア・コリK-12株にコンドロイチンを生産する能力を付与することができる。さらに、例えば、エシェリヒア・コリK-12株は、ヘパロサンを生産する能力を有しないが、kfi遺伝子群（kfiA, kfiB, kfiC, kfiD）およびkps遺伝子群（kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT）を導入することにより、エシェリヒア・コリK-12株にヘパロサンを生産する能力を付与することができる。 The gene to be introduced can be appropriately selected depending on the type of microorganism to be used and the like. For example, Escherichia coli K5 strain has the ability to produce heparosan and does not have the ability to produce chondroitin, but has the ability to produce chondroitin in Escherichia coli K5 strain by introducing the kfoA and kfoC genes. Can be granted. Also, for example, Escherichia coli K-12 strain does not have the ability to produce chondroitin, but has a kfo gene group (kfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG) and a kps gene group (kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, By introducing kpsC, kpsS, kpsM, and kpsT), the ability to produce chondroitin can be imparted to the Escherichia coli K-12 strain. Furthermore, for example, the Escherichia coli K-12 strain does not have the ability to produce heparosan, but has a kfi gene group (kfiA, kfiB, kfiC, kfiD) and a kps gene group (kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT) can impart the ability to produce heparosan to Escherichia coli K-12 strain.
これらのグリコサミノグリカンを生産する能力を付与された株により、例えば、グリコサミノグリカンを莢膜多糖として生産させることができる。本発明において使用されるグリコサミノグリカンは、莢膜多糖として生産されたグリコサミノグリカンそのものであってもよく、水酸化ナトリウム等の塩基または塩酸等の酸と接触させて処理した後のグリコサミノグリカンであってもよい。 For example, glycosaminoglycans can be produced as capsular polysaccharides by these strains that have been given the ability to produce glycosaminoglycans. The glycosaminoglycan used in the present invention may be glycosaminoglycan itself produced as a capsular polysaccharide, or glycosaminoglycan after being treated with a base such as sodium hydroxide or an acid such as hydrochloric acid. It may be a Saminoglycan.
また、グリコサミノグリカンを生産する能力を有する微生物は、グリコサミノグリカンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子の内、その微生物が本来的に有するタンパク質をコードする遺伝子の発現が増強されるように改変されていてもよい。例えば、エシェリヒア・コリＫ４株に、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を導入してもよい。また、例えば、エシェリヒア・コリＫ５株に、kfoAおよびkfoC遺伝子に加えて、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードする他の遺伝子をさらに導入してもよい。さらに、例えば、エシェリヒア・コリＫ５株に、ヘパロサンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を導入してもよい。 In addition, in a microorganism having the ability to produce glycosaminoglycan, expression of a gene encoding a protein inherent in the microorganism among genes encoding proteins involved in glycosaminoglycan production is enhanced. It may be modified as follows. For example, a gene encoding a protein involved in the production of chondroitin may be introduced into Escherichia coli K4 strain. Further, for example, in addition to the kfoA and kfoC genes, another gene encoding a protein involved in the production of chondroitin may be further introduced into the Escherichia coli K5 strain. Further, for example, a gene encoding a protein involved in heparosan production may be introduced into Escherichia coli K5 strain.
なお、「微生物が本来的に有するタンパク質をコードする遺伝子」は、当該微生物由来の遺伝子であってもよく、当該微生物以外の生物由来の遺伝子であってもよい。すなわち、例えば、エシェリヒア・コリＫ４株に、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードするエシェリヒア・コリＫ４株由来の遺伝子を導入してもよく、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードするエシェリヒア・コリＫ４株以外の生物由来の遺伝子を導入してもよい。また、例えば、エシェリヒア・コリＫ５株に、ヘパロサンの生産に関与するタンパク質をコードするエシェリヒア・コリＫ５株由来の遺伝子を導入してもよく、ヘパロサンの生産に関与するタンパク質をコードするエシェリヒア・コリＫ５株以外の生物由来の遺伝子を導入してもよい。 The “gene encoding a protein inherently possessed by a microorganism” may be a gene derived from the microorganism, or may be a gene derived from an organism other than the microorganism. That is, for example, a gene derived from the Escherichia coli K4 strain encoding a protein involved in the production of chondroitin may be introduced into the Escherichia coli K4 strain, and the Escherichia coli K4 encoding a protein involved in the production of chondroitin may be introduced. A gene derived from an organism other than the strain may be introduced. Further, for example, a gene derived from Escherichia coli K5 strain encoding a protein involved in heparosan production may be introduced into Escherichia coli K5 strain, and Escherichia coli K5 encoding a protein involved in heparosan production may be introduced. A gene derived from an organism other than the strain may be introduced.
コンドロイチンを生産する能力を有する微生物としては、例えば、文献（特表２０１０−５２４４３１号公報、または特表２０１３−５２０９９５号公報）に開示されているコンドロイチンを生産する能力を有する細菌が挙げられる。 Examples of the microorganism having the ability to produce chondroitin include bacteria having the ability to produce chondroitin, which are disclosed in the literature (Japanese Patent Publication No. 2010-524431 or Japanese Patent Publication No. 2013-52095).
コンドロイチンを生産する能力を有する微生物としては、文献（特表２０１０−５２４４３１号公報）に記載されている「エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA遺伝子とkfoC遺
伝子が共に導入されたエシェリヒア・コリ」を好ましく例示することができる。また、コンドロイチンを生産する能力が側鎖を有しないコンドロイチンを生産する能力である場合は、コンドロイチンを生産する能力を有する微生物としては、「エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA遺伝子とkfoC遺伝子が共に導入された、kfoD, orf3(kfoI), kfoE, orf1(kfoH)遺伝子から選択される１〜３または全ての遺伝子を有しないエシェリヒア・コリ」を好ましく例示することができる。そのようなエシェリヒア・コリとしては、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA遺伝子とkfoC遺伝子が共に導入されたエシェリヒア・コリＫ５株を好ましく例示することができる。エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA遺伝子やkfoC遺伝子の導入は、例えば、文献（特表２０１０−５２４４３１号公報）に記載された方法で行うことができる。
As the microorganism having the ability to produce chondroitin, “Escherichia coli into which both the kfoA gene and the kfoC gene derived from Escherichia coli K4 strain” described in the literature (Japanese Patent Application Publication No. 2010-524431) are preferable. Examples can be given. In addition, when the ability to produce chondroitin is the ability to produce chondroitin without a side chain, the microorganism having the ability to produce chondroitin may be `` the kfoA gene and the kfoC gene derived from the Escherichia coli K4 strain are both introduced. Escherichia coli having no 1-3 or all genes selected from the kfoD, orf3 (kfoI), kfoE, and orf1 (kfoH) genes "can be preferably exemplified. A preferred example of such an Escherichia coli is an Escherichia coli K5 strain into which both the kfoA gene and the kfoC gene derived from the Escherichia coli K4 strain have been introduced. Introduction of the kfoA gene or kfoC gene derived from the Escherichia coli K4 strain can be performed, for example, by a method described in the literature (Japanese Translation of PCT Publication No. 2010-524431).
また、コンドロイチンを生産する能力を有する微生物としては、文献（特表２０１３−５２０９９５号公報）に記載されている「エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子及びシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のxylS遺伝子が導入されたエシェリヒア・コリ」も好ましく例示することができる。また、コンドロイチンを生産する能力が側鎖を有しないコンドロイチンを生産する能力である場合は、コンドロイチンを生産する能力を有する微生物としては、「エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子及びシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のxylS遺伝子が導入された、kfoD, orf3(kfoI), kfoE, orf1(kfoH)遺伝子から選択される１〜３または全ての遺伝子を有しないエシェリヒア・コリ」も好ましく例示することができる。そのようなエシェリヒア・コリとしては、例えば、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG遺伝子を各４コピー、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子を各１コピー、及びシュードモナス・プチダ由来のxylS遺伝子を１コピー導入したエシェリヒア・コリが好ましい。なかでも、これらの遺伝子が導入されたエシェリヒア・コリK-12株が好ましい。エシェリヒア・コリK-12株としては、エシェリヒア・コリK-12 W3110株を好ましく例示することができる。エシェリヒア・コリK-12 W3110株にこれらの遺伝子が導入された細菌株は、文献（特表２０１３−５２０９９５号公報）において「MSC702株」として開示されている。これらの遺伝子の導入は、例えば、文献（特表２０１３−５２０９９５号公報）に記載された方法で行うことができる。 Examples of the microorganism having the ability to produce chondroitin include “kfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, kfoA, kfoB derived from Escherichia coli K4 strain” described in the literature (Japanese Patent Application Publication No. 2013-520995). Escherichia coli into which the kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT genes and the xylS gene derived from Pseudomonas putida have been introduced can also be preferably exemplified. Further, when the ability to produce chondroitin is the ability to produce chondroitin without a side chain, the microorganism having the ability to produce chondroitin may be `` kfoA, kfoB, kfoC, kfoF, derived from Escherichia coli K4 strain, kfoG, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT gene and xylS gene derived from Pseudomonas putida were introduced, kfoD, orf3 (kfoI), kfoE, orf1 (kfoH) "Escherichia coli having no selected 1-3 or all genes" can also be preferably exemplified. Examples of such Escherichia coli include, for example, four copies of each of the kfoA, kfoB, kfoC, kfoF, and kfoG genes derived from the Escherichia coli K4 strain, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, and kpsC derived from the Escherichia coli K4 strain. Escherichia coli into which one copy of each of the kpsS, kpsM, and kpsT genes and one copy of the xylS gene derived from Pseudomonas putida are introduced is preferable. Of these, Escherichia coli K-12 into which these genes have been introduced is preferred. Preferred examples of the Escherichia coli K-12 strain include Escherichia coli K-12 W3110 strain. A bacterial strain in which these genes have been introduced into Escherichia coli K-12 W3110 strain is disclosed as "MSC702 strain" in the literature (Japanese Translation of PCT Application No. 2013-520995). Introduction of these genes can be performed, for example, by a method described in the literature (Japanese Patent Application Publication No. 2013-520995).
なお、グリコサミノグリカンを生産する能力の付与等のために微生物の改変に使用される遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記に例示したような公知の遺伝子に限られず、例えば、そのバリアントであってもよい。微生物の改変に使用される遺伝子は、例えば、公知の遺伝子の塩基配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、且つ、元の機能が維持されたタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、微生物の改変に使用される遺伝子は、例えば、公知のタンパク質のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、且つ、元の機能が維持されたタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお、「相同性」とは、「同一性」を意味してよい。また、微生物の改変に使用される遺伝子は、例えば、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１箇所にまとまって若しくは数箇所に分散して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、元の機能が維持されたタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。「１又は数個」とは、例えば、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個であってよい。 Genes used for modification of microorganisms for imparting the ability to produce glycosaminoglycan are not limited to known genes as exemplified above, as long as they encode proteins whose original functions are maintained. Instead, for example, the variant may be used. The gene used for the modification of the microorganism is, for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 97% or more, and particularly preferably, the entire base sequence of a known gene. It may be a gene that encodes a protein having a homology of 99% or more and maintaining the original function. Further, the gene used for modifying the microorganism is, for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 97% or more, particularly preferably the entire amino acid sequence of a known protein. The gene may preferably be a gene having a homology of 99% or more and encoding a protein in which the original function is maintained. In addition, “homology” may mean “identity”. In addition, genes used for modifying microorganisms include, for example, one or several amino acids substituted, deleted, inserted, The gene may be a gene having an added amino acid sequence and encoding a protein whose original function is maintained. The “one or several” may be, for example, 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5, and particularly preferably 1 to 3. .
アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加は、タンパク質の機能が正常に維持され
る保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性ア
ミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間
で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には
、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAsp
への置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn
、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile
又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。
Amino acid substitutions, deletions, insertions, and / or additions are conservative variations that maintain normal protein function. Representative of conservative mutations are conservative substitutions. A conservative substitution is a polar amino acid between Phe, Trp and Tyr when the substitution site is an aromatic amino acid and between Leu, Ile and Val when the substitution site is a hydrophobic amino acid. In the case, between Gln, Asn, when it is a basic amino acid, between Lys, Arg, His, when it is an acidic amino acid, it is between Asp, Glu, when it is an amino acid having a hydroxyl group Is a mutation that substitutes for Ser and Thr. Examples of the substitution considered as a conservative substitution include, specifically, substitution of Ala for Ser or Thr, substitution of Arg for Gln, His or Lys, and substitution of Asn for Glu, Gln, Lys, His or Asp.
, Asp to Asn, Glu or Gln, Cys to Ser or Ala, Gln to Asn
, Glu, Lys, His, Asp or Arg substitution, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Asp substitution, Gly to Pro substitution, His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr substitution , Ile to Leu, Met, Val or Phe substitution, Leu to Ile, Met, Val or Phe substitution, Lys to Asn, Glu, Gln, His or Arg substitution, Met to Ile, Leu, Val or Phe substitution, Phe to Trp, Tyr, Met, Ile
Or substitution to Leu, substitution of Ser to Thr or Ala, substitution of Thr to Ser or Ala, substitution of Trp to Phe or Tyr, substitution of Tyr to His, Phe or Trp, and Val to Met, Substitution to Ile or Leu is mentioned.
微生物の改変に使用される遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドン（同じアミノ酸をコードする別のコドン）に置換したものであってもよい。例えば、微生物の改変に使用される遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度（宿主が発現するタンパク質をコードする核酸においてコドンとして使用される頻度）に応じて最適なコドンを有するように改変されていてもよい。 The gene used for modifying the microorganism may have any codon replaced by an equivalent codon (another codon encoding the same amino acid). For example, a gene used for modifying a microorganism has been modified to have an optimal codon according to the codon usage frequency of the host used (frequency used as a codon in a nucleic acid encoding a protein expressed by the host). You may.
「微生物由来グリコサミノグリカン」は、例えば、上記に例示したようなグリコサミノグリカンを生産する能力を有する微生物を培養することで生産できる。培養条件は、グリコサミノグリカンを生産する能力を有する微生物が生育でき、グリコサミノグリカンの生産が可能な条件ある限り、特に制限されない。グリコサミノグリカンを生産する能力を有する微生物は、例えば、細菌や酵母等の微生物を培養する通常の条件で培養することができる。培養条件としては、例えば、文献（特開２００８−２９５４５０号公報、特表２０１０−５２４４３１号公報、または特表２０１３−５２０９９５号公報）に記載されている培養条件を参照できる。 "Microbial glycosaminoglycan" can be produced, for example, by culturing a microorganism having the ability to produce glycosaminoglycan as exemplified above. Culture conditions are not particularly limited as long as a microorganism capable of producing glycosaminoglycan can grow and glycosaminoglycan can be produced. The microorganism having the ability to produce glycosaminoglycan can be cultured under ordinary conditions for culturing microorganisms such as bacteria and yeast. As the culture conditions, for example, the culture conditions described in the literature (Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2008-295450, Japanese Patent Publication No. 2010-524431, or Japanese Patent Application Publication No. 2013-520995) can be referred to.
微生物由来グリコサミノグリカンは、公知の方法により培養物から単離し精製することができる。微生物由来グリコサミノグリカンは、例えば、エタノール等の溶媒を利用して沈殿させて回収することができる。また、微生物由来グリコサミノグリカンは、この沈殿物を溶解した後に再度沈殿させる操作を繰り返すことや、陰イオン交換その他のクロマトグラフィーに供すること等によってさらに精製してもよい。 Microbial glycosaminoglycans can be isolated and purified from cultures by known methods. Microbial glycosaminoglycans can be recovered by precipitation using a solvent such as ethanol. The microorganism-derived glycosaminoglycan may be further purified by repeating the operation of dissolving the precipitate and then re-precipitating it, or subjecting it to anion exchange or other chromatography.
＜酵素合成グリコサミノグリカンの製造＞
「グリコサミノグリカンの合成酵素」とは、グリコサミノグリカンの骨格を構成する二種類の糖残基を糖鎖の非還元末端に交互に付加し、グリコサミノグリカン鎖を伸長する反応を触媒するタンパク質をいう。グリコサミノグリカンの合成酵素は、二種類の糖残基の付加を単独で触媒するタンパク質であってもよく、どちらか一方の糖残基の付加を触媒するタンパク質ともう一方の糖残基の付加を触媒するタンパク質の組み合わせであってもよい。すなわち、グリコサミノグリカンの合成酵素は、ポリメラーゼであってもよく、糖転移酵素であってもよい。ポリメラーゼとしては、コンドロイチンポリメラーゼやヘパロサンポリメラーゼが挙げられる。糖転移酵素としては、Ｎ−アセチルガラクトサミン（GalNAc）転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）転移酵素、グルクロン酸（GlcUA）
転移酵素が挙げられる。コンドロイチンポリメラーゼは、GalNAc残基の付加およびGlcUA
残基の付加の両方を単独で触媒するタンパク質である。また、ヘパロサンポリメラーゼは、GlcNAc残基の付加およびGlcUA残基の付加の両方を単独で触媒するタンパク質である。
<Production of enzyme-synthesized glycosaminoglycan>
"Glycosaminoglycan synthase" refers to a reaction that extends the glycosaminoglycan chain by alternately adding two types of sugar residues that constitute the glycosaminoglycan backbone to the non-reducing end of the sugar chain. Refers to a protein that catalyzes. The glycosaminoglycan synthase may be a protein that catalyzes the addition of two types of sugar residues alone, or a protein that catalyzes the addition of one of the sugar residues and a protein that catalyzes the addition of the other. It may be a combination of proteins that catalyze the addition. That is, the glycosaminoglycan synthase may be a polymerase or a glycosyltransferase. Examples of the polymerase include chondroitin polymerase and heparosan polymerase. Examples of glycosyltransferases include N-acetylgalactosamine (GalNAc) transferase, N-acetylglucosamine (GlcNAc) transferase, and glucuronic acid (GlcUA).
Transferase. Chondroitin polymerase adds GalNAc residues and GlcUA
It is a protein that catalyzes both addition of residues alone. Heparosan polymerase is a protein that independently catalyzes both the addition of GlcNAc residues and the addition of GlcUA residues.
コンドロイチンポリメラーゼとしては、kfoC遺伝子にコードされるKfoCタンパク質やpmCS遺伝子にコードされるPmCSタンパク質が挙げられる。kfoC遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoC遺伝子が挙げられる。pmCS遺伝子としては、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）由来のpmCS遺伝子が挙げられる。また、ヘパロサンポ
リメラーゼとしては、pmHS遺伝子にコードされるPmHSタンパク質が挙げられる。pmHS遺伝子としては、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）由来のpmHS遺伝子が挙
げられる。
Chondroitin polymerase includes a KfoC protein encoded by the kfoC gene and a PmCS protein encoded by the pmCS gene. Examples of the kfoC gene include a kfoC gene derived from Escherichia coli K4 strain. Examples of the pmCS gene include a pmCS gene derived from Pasteurella multocida. In addition, examples of the heparosan polymerase include a PmHS protein encoded by the pmHS gene. Examples of the pmHS gene include a pmHS gene derived from Pasteurella multocida.
GlcNAc転移酵素としては、kfiA遺伝子にコードされるKfiAタンパク質が挙げられる。kfiA遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ５株由来のkfiA遺伝子が挙げられる。また、GlcUA転移酵素としては、kfiC遺伝子にコードされるKfiCタンパク質が挙げられる。kfiC遺
伝子としては、エシェリヒア・コリＫ５株由来のkfiC遺伝子が挙げられる。KfiAタンパク質とKfiCタンパク質は、複合体を形成してヘパロサンポリメラーゼとして機能する。
GlcNAc transferase includes KfiA protein encoded by the kfiA gene. Examples of the kfiA gene include a kfiA gene derived from Escherichia coli K5 strain. The GlcUA transferase includes a KfiC protein encoded by the kfiC gene. Examples of the kfiC gene include a kfiC gene derived from Escherichia coli K5 strain. KfiA protein and KfiC protein form a complex to function as heparosan polymerase.
グリコサミノグリカンの合成酵素としては、例えば、微生物由来のグリコサミノグリカンの合成酵素が好ましい。微生物由来のグリコサミノグリカンの合成酵素としては、具体的には、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoC遺伝子にコードされるKfoCタンパク質（K4CP）、エシェリヒア・コリＫ５株由来のkfiA遺伝子にコードされるKfiAタンパク質、エシェリヒア・コリＫ５株由来のkfiC遺伝子にコードされるKfiCタンパク質、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）のpmCS遺伝子にコードされるPmCSタンパク質、パス
ツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）のpmHS遺伝子にコードされるPmHSタンパ
ク質等の微生物が本来的に有するグリコサミノグリカンの合成酵素が好ましく例示される。これらの中で、グリコサミノグリカンの合成酵素は、KfoCタンパク質（K4CP）、KfiAタンパク質、またはKfiCタンパク質であることが好ましい。
As the glycosaminoglycan synthase, for example, a microorganism-derived glycosaminoglycan synthase is preferable. Specific examples of the microorganism-derived glycosaminoglycan synthase include a KfoC protein (K4CP) encoded by a kfoC gene derived from Escherichia coli K4 strain and a kfiA gene derived from Escherichia coli K5 strain. KfiA protein, KfiC protein encoded by kfiC gene derived from Escherichia coli K5 strain, PmCS protein encoded by pmCS gene of Pasteurella multocida, encoded by pmHS gene of Pasteurella multocida Preferable examples include glycosaminoglycan synthases inherent in microorganisms such as PmHS proteins. Among these, the glycosaminoglycan synthase is preferably a KfoC protein (K4CP), a KfiA protein, or a KfiC protein.
グリコサミノグリカンの合成酵素は、グリコサミノグリカンの合成酵素からなるものであってもよく、その他の成分をさらに含有するものであってもよい。グリコサミノグリカンの合成酵素としては、グリコサミノグリカンの合成酵素を産生する微生物の培養物、当該培養物から分離した培養上清、当該培養物から分離した菌体、当該菌体の処理物、およびそれらから分離したグリコサミノグリカンの合成酵素が挙げられる。グリコサミノグリカンの合成酵素は、所望の程度に精製されていてよい。グリコサミノグリカンの合成酵素を産生する微生物は、本来的にグリコサミノグリカンの合成酵素を産生する微生物であってもよく、グリコサミノグリカンの合成酵素を産生するように改変された微生物であってもよい。グリコサミノグリカンの合成酵素を産生するように改変された微生物は、例えば、グリコサミノグリカンの合成酵素をコードする遺伝子を微生物に発現可能に導入することにより取得できる。遺伝子の導入は、例えば、同遺伝子を搭載したベクターを微生物に導入することや、同遺伝子を微生物の染色体上に導入することにより達成できる。 The glycosaminoglycan synthase may be composed of a glycosaminoglycan synthase, or may further contain other components. Examples of the glycosaminoglycan synthase include a culture of a microorganism that produces a glycosaminoglycan synthase, a culture supernatant separated from the culture, a cell isolated from the culture, and a processed product of the cell. And glycosaminoglycan synthases isolated therefrom. The glycosaminoglycan synthase may be purified to a desired degree. The microorganism that produces glycosaminoglycan synthase may be a microorganism that naturally produces glycosaminoglycan synthase, or a microorganism that has been modified to produce glycosaminoglycan synthase. There may be. A microorganism modified to produce a glycosaminoglycan synthase can be obtained, for example, by introducing a gene encoding a glycosaminoglycan synthase into a microorganism in an expressible manner. Introduction of a gene can be achieved by, for example, introducing a vector carrying the gene into a microorganism, or introducing the gene into a chromosome of the microorganism.
グリコサミノグリカンの合成酵素をコードする遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記に例示したような公知の遺伝子に限られず、例えば、そのバリアントであってもよい。グリコサミノグリカンの合成酵素をコードする遺伝子のバリアントについては、上述したグリコサミノグリカンを生産する能力の付与等のために微生物の改変に使用される遺伝子のバリアントに関する記載を準用できる。 The gene encoding the glycosaminoglycan synthase is not limited to the known genes as exemplified above as long as it encodes a protein whose original function is maintained, and may be, for example, a variant thereof. As for the variant of the gene encoding the glycosaminoglycan synthase, the description of the above-described variant of the gene used for modifying a microorganism for imparting the ability to produce glycosaminoglycan can be applied mutatis mutandis.
「酵素合成グリコサミノグリカン」は、例えば、上記に例示したようなグリコサミノグリカンの合成酵素を、糖供与体および糖受容体と、適当な反応系において共存させることにより合成できる。反応条件は、グリコサミノグリカンの合成が可能な条件である限り、特に制限されない。反応条件は、グリコサミノグリカンの合成酵素の由来や態様、グリコサミノグリカンの所望の重合度等の諸条件に応じて適宜設定できる。反応条件としては、
例えば、文献（特許第４１０１５４８号公報）または（特許第５０８１６２９号公報）に記載の条件を参照できる。
The “enzymatically synthesized glycosaminoglycan” can be synthesized, for example, by allowing a glycosaminoglycan synthase as exemplified above to coexist with a sugar donor and a sugar acceptor in an appropriate reaction system. The reaction conditions are not particularly limited as long as the conditions permit synthesis of glycosaminoglycan. The reaction conditions can be appropriately set according to various conditions such as the origin and aspect of the glycosaminoglycan synthase and the desired degree of polymerization of glycosaminoglycan. As reaction conditions,
For example, the conditions described in the literature (Japanese Patent No. 4101548) or (Japanese Patent No. 5081629) can be referred to.
「糖供与体」とは、グリコサミノグリカンの合成酵素によるグリコサミノグリカンの合成反応において糖残基を供与する分子をいう。糖供与体の種類は、グリコサミノグリカンの合成反応に利用可能である限り、特に限定されない。糖供与体としては、アミノ糖の供与体やウロン酸の供与体が挙げられる。糖供与体として、具体的には、GalNAc供与体、GlcNAc供与体、GlcUA供与体が挙げられる。また、糖供与体としては、糖ヌクレオチドが挙
げられる。
The “sugar donor” refers to a molecule that provides a sugar residue in a glycosaminoglycan synthesis reaction by a glycosaminoglycan synthase. The type of the sugar donor is not particularly limited as long as it can be used for the synthesis reaction of glycosaminoglycan. Examples of the sugar donor include amino sugar donors and uronic acid donors. Specific examples of the sugar donor include a GalNAc donor, a GlcNAc donor, and a GlcUA donor. Examples of the sugar donor include sugar nucleotides.
「GalNAc供与体」とは、グリコサミノグリカンの合成酵素によるグリコサミノグリカンの合成反応においてGalNAc残基を供給する分子をいう。GalNAc供与体の種類は、グリコサミノグリカンの合成反応に利用可能である限り、特に限定されない。GalNAc供与体としては、GalNAcヌクレオチドが挙げられる。GalNAcヌクレオチドとしては、UDP-GalNAc（ウリジン５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルガラクトサミン）が挙げられる。 “GalNAc donor” refers to a molecule that supplies a GalNAc residue in a glycosaminoglycan synthesis reaction by a glycosaminoglycan synthase. The type of GalNAc donor is not particularly limited as long as it can be used for a glycosaminoglycan synthesis reaction. GalNAc donors include GalNAc nucleotides. GalNAc nucleotides include UDP-GalNAc (uridine 5'-diphospho-N-acetylgalactosamine).
「GlcNAc供与体」とは、グリコサミノグリカンの合成酵素によるグリコサミノグリカンの合成反応においてGlcNAc残基を供給する分子をいう。GlcNAc供与体の種類は、グリコサミノグリカンの合成反応に利用可能である限り、特に限定されない。GlcNAc供与体としては、GlcNAcヌクレオチドが挙げられる。GlcNAcヌクレオチドとしては、UDP-GlcNAc（ウリジン５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン）が挙げられる。 “GlcNAc donor” refers to a molecule that supplies a GlcNAc residue in a glycosaminoglycan synthesis reaction by a glycosaminoglycan synthase. The type of GlcNAc donor is not particularly limited as long as it can be used for a glycosaminoglycan synthesis reaction. GlcNAc donors include GlcNAc nucleotides. GlcNAc nucleotides include UDP-GlcNAc (uridine 5'-diphospho-N-acetylglucosamine).
「GlcUA供与体」とは、グリコサミノグリカンの合成酵素によるグリコサミノグリカン
の合成反応においてGlcUA残基を供給する分子をいう。GlcUA供与体の種類は、グリコサミノグリカンの合成反応に利用可能である限り、特に限定されない。GlcUA供与体としては
、GlcUAヌクレオチドが挙げられる。GlcUAヌクレオチドとしては、UDP-GlcUA（ウリジン
５’−ジホスホ−グルクロン酸）が挙げられる。
“GlcUA donor” refers to a molecule that supplies a GlcUA residue in a glycosaminoglycan synthesis reaction by a glycosaminoglycan synthase. The type of GlcUA donor is not particularly limited as long as it can be used for a glycosaminoglycan synthesis reaction. GlcUA donors include GlcUA nucleotides. GlcUA nucleotides include UDP-GlcUA (uridine 5'-diphospho-glucuronic acid).
糖供与体は、市販品であってもよく、適宜製造して取得したものであってもよい。糖供与体は、例えば、公知の手法により調製することができる。 The sugar donor may be a commercially available product, or may be one that is appropriately manufactured and obtained. The sugar donor can be prepared, for example, by a known technique.
UDP-GlcUAは、例えば、UDP-Glcデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.22）を用い、UDP-Glc（ウリジン５’−ジホスホ−グルコース）を酸化して得ることができる。よって、例えば、UDP-Glcデヒドロゲナーゼを用いることにより、UDP-GlcをGlcUA供与体として用いることが
できる。UDP-Glcデヒドロゲナーゼとしては、kfoF遺伝子にコードされるKfoFタンパク質
、kfiD遺伝子にコードされるKfiDタンパク質が挙げられる。kfoF遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoF遺伝子が挙げられる。kfiD遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ５株由来のkfiD遺伝子が挙げられる。
UDP-GlcUA can be obtained, for example, by oxidizing UDP-Glc (uridine 5′-diphospho-glucose) using UDP-Glc dehydrogenase (EC 1.1.1.22). Thus, for example, by using UDP-Glc dehydrogenase, UDP-Glc can be used as a GlcUA donor. Examples of the UDP-Glc dehydrogenase include a KfoF protein encoded by the kfoF gene and a KfiD protein encoded by the kfiD gene. Examples of the kfoF gene include a kfoF gene derived from Escherichia coli K4 strain. Examples of the kfiD gene include a kfiD gene derived from Escherichia coli K5 strain.
UDP-GalNAcは、例えば、UDP-Glc-4-エピメラーゼ（EC 5.1.3.2）またはUDP-GlcNAc-4-
エピメラーゼ（EC 5.1.3.7）を用い、UDP-GlcNAcを異性化して得ることができる。よって、例えば、UDP-Glc-4-エピメラーゼまたはUDP-GlcNAc-4-エピメラーゼを用いることによ
り、UDP-GlcNAcをGalNAc供与体として用いることができる。UDP-Glc-4-エピメラーゼとしては、kfoA遺伝子にコードされるKfoAタンパク質が挙げられる。kfoA遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA遺伝子が挙げられる。
UDP-GalNAc is, for example, UDP-Glc-4-epimerase (EC 5.1.3.2) or UDP-GlcNAc-4-
It can be obtained by isomerizing UDP-GlcNAc using epimerase (EC 5.1.3.7). Thus, for example, by using UDP-Glc-4-epimerase or UDP-GlcNAc-4-epimerase, UDP-GlcNAc can be used as a GalNAc donor. UDP-Glc-4-epimerase includes a KfoA protein encoded by the kfoA gene. Examples of the kfoA gene include a kfoA gene derived from Escherichia coli K4 strain.
UDP-GlcNAcは、例えば、UDP-Gal-4-エピメラーゼ（EC 5.1.3.2）またはUDP-GalNAc-4-
エピメラーゼ（EC 5.1.3.7）を用い、UDP-GalNAcを異性化して得ることができる。よって、例えば、UDP-Gal-4-エピメラーゼまたはUDP-GalNAc-4-エピメラーゼを用いることによ
り、UDP-GalNAcをGlcNAc供与体として用いることができる。UDP-Gal-4-エピメラーゼとし
ては、kfoA遺伝子にコードされるKfoAタンパク質が挙げられる。kfoA遺伝子としては、エシェリヒア・コリK4株由来のkfoA遺伝子が挙げられる。
UDP-GlcNAc is, for example, UDP-Gal-4-epimerase (EC 5.1.3.2) or UDP-GalNAc-4-
It can be obtained by isomerizing UDP-GalNAc using epimerase (EC 5.1.3.7). Thus, for example, by using UDP-Gal-4-epimerase or UDP-GalNAc-4-epimerase, UDP-GalNAc can be used as a GlcNAc donor. UDP-Gal-4-epimerase includes the KfoA protein encoded by the kfoA gene. Examples of the kfoA gene include a kfoA gene derived from Escherichia coli K4 strain.
よって、本発明においては、例えば、UDP-Glc-4-エピメラーゼおよび／もしくはUDP-GlcNAc-4-エピメラーゼならびに／またはUDP-Glcデヒドロゲナーゼを用いることにより、UDP-GlcNAcおよび／またはUDP-GlcをそれぞれGalNAc供与体および／またはGlcUA供与体としてコンドロイチンの合成に用いることができる。また、本発明においては、例えば、UDP-Gal-4-エピメラーゼおよび／もしくはUDP-GalNAc-4-エピメラーゼならびに／またはUDP-Glcデヒドロゲナーゼを用いることにより、UDP-GalNAcおよび／またはUDP-GlcをそれぞれGlcNAc供与体および／またはGlcUA供与体としてヘパロサンの合成に用いることができる。 Therefore, in the present invention, for example, by using UDP-Glc-4-epimerase and / or UDP-GlcNAc-4-epimerase and / or UDP-Glc dehydrogenase, UDP-GlcNAc and / or UDP-Glc can be converted to GalNAc, respectively. It can be used in the synthesis of chondroitin as a donor and / or a GlcUA donor. In the present invention, for example, by using UDP-Gal-4-epimerase and / or UDP-GalNAc-4-epimerase and / or UDP-Glc dehydrogenase, UDP-GalNAc and / or UDP-Glc can be GlcNAc, respectively. It can be used in the synthesis of heparosan as a donor and / or a GlcUA donor.
「糖受容体」とは、グリコサミノグリカンの合成酵素によるグリコサミノグリカンの合成反応において、その非還元末端にGlcUA残基、GalNAc残基、またはGlcNAc残基が付加さ
れることによりグリコサミノグリカン鎖の伸長が開始される糖鎖（アクセプター）をいう。
The term "sugar receptor" refers to the addition of a GlcUA residue, a GalNAc residue, or a GlcNAc residue to the non-reducing end of a glycosaminoglycan synthesis reaction by a glycosaminoglycan synthase. A sugar chain (acceptor) at which elongation of a noglycan chain is started.
糖受容体としては、下記一般式（１）、（２）、または（３）で示される糖鎖が挙げられる。
ＧｌｃＵＡ−Ｒ１ （１）
ＧａｌＮＡｃ−Ｒ２ （２）
ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ３ （３）
（各式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ任意の基を表す。）
Examples of the sugar receptor include sugar chains represented by the following general formulas (1), (2), and (3).
GlcUA-R 1 (1)
GalNAc-R 2 (2)
GlcNAc-R 3 (3)
(In each formula, R 1 , R 2 , and R 3 each represent an arbitrary group.)
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３としては、水酸基や１またはそれ以上の残基数の糖鎖が挙げられる。Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３がそれぞれ糖鎖である場合、各式中、「−」はグリコシド結合を表す。糖鎖としては、グリコサミノグリカン鎖が挙げられる。グリコサミノグリカン鎖としては、コンドロイチン鎖、ヘパロサン鎖、ヒアルロン酸鎖が挙げられる。コンドロイチン鎖としては、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンや微生物由来コンドロイチンが挙げられる。ヘパロサン鎖としては、微生物由来ヘパロサンが挙げられる。また、糖鎖としては、これら糖鎖の誘導体も挙げられる。「糖鎖の誘導体」とは、原子、官能基、化合物等の構成要素が導入、置換、および／または除去された糖鎖をいう。糖鎖の誘導体としては、硫酸化された糖鎖や任意の糖が付加された糖鎖が挙げられる。すなわち、酵素合成グリコサミノグリカンの糖受容体部分は、本発明におけるグリコサミノグリカンの好適な態様に該当する構造を有していてもよいし、本発明におけるグリコサミノグリカンの好適な態様に該当しない構造を有していてもよい。 Examples of R 1 , R 2 , and R 3 include a hydroxyl group and a sugar chain having one or more residues. When each of R 1 , R 2 , and R 3 is a sugar chain, in each formula, “-” represents a glycosidic bond. The sugar chain includes a glycosaminoglycan chain. Glycosaminoglycan chains include chondroitin chains, heparosan chains, and hyaluronic acid chains. Chondroitin chains include chondroitin obtained by desulfating chondroitin sulfate and chondroitin derived from microorganisms. Heparosan chains include heparosan derived from microorganisms. In addition, examples of the sugar chain include derivatives of these sugar chains. The “sugar chain derivative” refers to a sugar chain in which constituent elements such as atoms, functional groups, and compounds have been introduced, substituted, and / or removed. Examples of the sugar chain derivative include a sulfated sugar chain and a sugar chain to which an arbitrary sugar is added. That is, the sugar acceptor portion of the enzyme-synthesized glycosaminoglycan may have a structure corresponding to the preferred embodiment of glycosaminoglycan in the present invention, or the preferred embodiment of glycosaminoglycan in the present invention It may have a structure which does not correspond to.
一般式（１）において、Ｒ１がＧａｌＮＡｃやＧｌｃＮＡｃ等の糖残基を含み、非還元末端のＧｌｃＵＡ残基がＲ１の当該糖残基と結合している場合、その結合はβ−１，３−グリコシド結合またはβ−１，４−グリコシド結合であることが好ましく、β−１，３−グリコシド結合であることがより好ましい。 In the general formula (1), when R 1 contains a sugar residue such as GalNAc or GlcNAc, and the GlcUA residue at the non-reducing end is linked to the sugar residue of R 1 , the bond is β-1, It is preferably a 3-glycosidic bond or a β-1,4-glycosidic bond, more preferably a β-1,3-glycosidic bond.
一般式（２）において、Ｒ２がＧｌｃＵＡ等の糖残基を含み、非還元末端のＧａｌＮＡｃ残基がＲ２の当該糖残基と結合している場合、その結合はβ−１，４−グリコシド結合であることが好ましい。 In the general formula (2), when R 2 contains a sugar residue such as GlcUA and the non-reducing terminal GalNAc residue is bonded to the sugar residue of R 2 , the bond is β-1,4- It is preferably a glycosidic bond.
一般式（３）において、Ｒ３がＧｌｃＵＡ等の糖残基を含み、非還元末端のＧｌｃＮＡｃ残基がＲ３の当該糖残基と結合している場合、その結合はα−１，４−グリコシド結合、またはβ−１，４−グリコシド結合であることが好ましく、α−１，４−グリコシド結合であることがより好ましい。 In the general formula (3), when R 3 contains a sugar residue such as GlcUA and the GlcNAc residue at the non-reducing end is bonded to the sugar residue of R 3 , the bond is α-1,4- It is preferably a glycoside bond or a β-1,4-glycosidic bond, and more preferably an α-1,4-glycosidic bond.
糖受容体の糖鎖の残基数（糖受容体の長さ）は、グリコサミノグリカン鎖が伸長される限り、特に制限されない。糖受容体の糖鎖の残基数は、例えば、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、または１０以上であってよく、６以上であるのが好ましい。糖受容体の糖鎖の残基数は、例えば、５０以下、４０以下、３０以下、または２０以下であってよい。糖受容体の糖鎖の残基数は、例えば、それらの組み合わせの範囲であってよい。 The number of residues of the sugar chain of the sugar receptor (length of the sugar receptor) is not particularly limited as long as the glycosaminoglycan chain is extended. The number of residues of the sugar chain of the sugar receptor may be, for example, 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, or 6 or more. The above is preferable. The number of residues of the sugar chain of the sugar acceptor may be, for example, 50 or less, 40 or less, 30 or less, or 20 or less. The number of residues in the sugar chain of the sugar acceptor may be, for example, in the range of their combination.
糖受容体としては、コンドロイチン鎖またはヘパロサン鎖が好ましい。コンドロイチン鎖は微生物由来コンドロイチンであることが好ましい。ヘパロサン鎖は微生物由来ヘパロサンであることが好ましい。糖受容体としては、具体的には、例えば、６残基以上のコンドロイチン鎖またはヘパロサン鎖を好適に用いることができる。 As the sugar receptor, a chondroitin chain or a heparosan chain is preferable. Preferably, the chondroitin chain is a microbial chondroitin. Preferably, the heparosan chain is heparosan derived from a microorganism. As the sugar receptor, specifically, for example, a chondroitin chain or a heparosan chain having 6 or more residues can be suitably used.
糖受容体は、市販品であってもよく、適宜製造して取得したものであってもよい。糖受容体は、例えば、公知の手法により調製することができる。 The sugar acceptor may be a commercially available product, or may be one that is appropriately manufactured and obtained. The sugar receptor can be prepared, for example, by a known technique.
グリコサミノグリカンの伸長は、溶液中に界面活性剤を共存させた状態で行われてよい。また、グリコサミノグリカンの伸長は、溶液中に有機溶媒を共存させた状態で行われてよい。界面活性剤や有機溶媒としては、文献（特許第５０８１６２９号公報）に記載されたものが挙げられる。 The extension of glycosaminoglycan may be carried out in the presence of a surfactant in a solution. Further, the extension of glycosaminoglycan may be performed in a state in which an organic solvent coexists in the solution. Examples of the surfactant and the organic solvent include those described in the literature (Japanese Patent No. 5081629).
酵素合成グリコサミノグリカンの調製時における反応温度は、例えば、１０〜５０℃、２０〜４０℃、または２５〜３７℃であってよい。また、酵素合成グリコサミノグリカンの調製時における反応時間は、例えば、１時間〜７日間、６〜４８時間、または１２〜２４時間であってよい。 The reaction temperature at the time of preparing the enzyme-synthesized glycosaminoglycan may be, for example, 10 to 50 ° C, 20 to 40 ° C, or 25 to 37 ° C. The reaction time at the time of preparing the enzyme-synthesized glycosaminoglycan may be, for example, 1 hour to 7 days, 6 to 48 hours, or 12 to 24 hours.
上記のように反応を行うことにより、酵素合成グリコサミノグリカンを調製することができる。酵素合成グリコサミノグリカンは、上述した微生物由来グリコサミノグリカンと同様にして、単離および精製することができる。 By performing the reaction as described above, an enzyme-synthesized glycosaminoglycan can be prepared. The enzyme-synthesized glycosaminoglycan can be isolated and purified in the same manner as the above-mentioned microorganism-derived glycosaminoglycan.
このようにして得られる「酵素合成グリコサミノグリカン」は、グリコサミノグリカンを生産する能力を有する微生物が細胞内で行う反応を、微生物の培養以外の方法、例えば、in vitroまたは無細胞系で再現して得られるグリコサミノグリカンである。すなわち、「酵素合成グリコサミノグリカン」は「微生物由来グリコサミノグリカン」と実質的に同一の反応を経て得られるグリコサミノグリカンである。よって、両者は血中滞留性等において同質のグリコサミノグリカンである。 The `` enzymatically synthesized glycosaminoglycan '' thus obtained is a method in which a microorganism having the ability to produce glycosaminoglycan performs a reaction in a cell other than the culture of the microorganism, for example, in vitro or in a cell-free system. It is a glycosaminoglycan obtained by reproducing the above. That is, the “enzymatically synthesized glycosaminoglycan” is a glycosaminoglycan obtained through substantially the same reaction as the “microbial glycosaminoglycan”. Therefore, both are glycosaminoglycans of the same quality in terms of blood retention and the like.
グリコサミノグリカンとしては、１種のグリコサミノグリカンのみが用いられてもよく、２種またはそれ以上のグリコサミノグリカンが用いられてもよい。 As the glycosaminoglycan, only one kind of glycosaminoglycan may be used, or two or more kinds of glycosaminoglycans may be used.
＜８＞本発明におけるペプチド
本発明においてペプチドは、血中滞留性の増強を所望するペプチドである限り、特に限定されない。ペプチドは、単量体（monomer）あってもよく、二量体等の多量体（multimer）であってもよい。ペプチドは、医薬として用いられるペプチドであってもよく、試薬
として用いられるペプチドであってもよく、動物試験に用いられるペプチドであってもよい。
<8> Peptide in the Present Invention The peptide in the present invention is not particularly limited as long as it is a peptide for which it is desired to enhance blood retention. The peptide may be a monomer or a multimer such as a dimer. The peptide may be a peptide used as a medicine, a peptide used as a reagent, or a peptide used in animal tests.
本発明においてペプチドの分子量は、リンカーを介してグリコサミノグリカンと複合体を形成することにより血中滞留性が増強されることが可能である限り、特に制限されない。本発明においてペプチドの分子量は、例えば、１０ｋＤａ（１×１０４）以下であってよい。本発明においてペプチドの分子量は、例えば、１×１０４以下、９×１０３以下、
８×１０３以下、７×１０３以下、６×１０３以下、または５×１０３以下であってよい。本発明においてペプチドの分子量は、例えば、１×１０３以上、２×１０３以上、または３×１０３以上であってよい。本発明においてペプチドの分子量は、例えば、それらの組み合わせの範囲であってよい。本発明においてペプチドの分子量は、例えば、１×１０３〜１×１０４、１×１０３〜８×１０３、１×１０３〜６×１０３、１×１０３〜５×１０３、２×１０３〜１×１０４、２×１０３〜８×１０３、２×１０３〜６×１０３、２×１０３〜５×１０３、３×１０３〜１×１０４、３×１０３〜８×１０３、３×１０３〜６×１０３、または３×１０３〜５×１０３であってよい。
In the present invention, the molecular weight of the peptide is not particularly limited as long as it can enhance the retention in blood by forming a complex with glycosaminoglycan via a linker. In the present invention, the molecular weight of the peptide may be, for example, 10 kDa (1 × 10 4 ) or less. In the present invention, the molecular weight of the peptide is, for example, 1 × 10 4 or less, 9 × 10 3 or less,
It may be 8 × 10 3 or less, 7 × 10 3 or less, 6 × 10 3 or less, or 5 × 10 3 or less. In the present invention, the molecular weight of the peptide may be, for example, 1 × 10 3 or more, 2 × 10 3 or more, or 3 × 10 3 or more. In the present invention, the molecular weight of the peptide may be, for example, in the range of a combination thereof. In the present invention, the molecular weight of the peptide is, for example, 1 × 10 3 to 1 × 10 4 , 1 × 10 3 to 8 × 10 3 , 1 × 10 3 to 6 × 10 3 , 1 × 10 3 to 5 × 10 3 , 2 × 10 3 to 1 × 10 4 , 2 × 10 3 to 8 × 10 3 , 2 × 10 3 to 6 × 10 3 , 2 × 10 3 to 5 × 10 3 , 3 × 10 3 to 1 × 10 4 , It may be 3 × 10 3 to 8 × 10 3 , 3 × 10 3 to 6 × 10 3 , or 3 × 10 3 to 5 × 10 3 .
本発明においてペプチドを構成するアミノ酸残基の数（ペプチドの長さ）は、リンカーを介してグリコサミノグリカンと複合体を形成することにより血中滞留性が増強されることが可能である限り、特に制限されない。本発明においてペプチドを構成するアミノ酸残基の数は、例えば、１００残基以下、９０残基以下、８０残基以下、７０残基以下、６０残基以下、５０残基以下であってよい。本発明においてペプチドを構成するアミノ酸残基の数は、例えば、１０残基以上、２０残基以上、３０残基以上であってよい。本発明においてペプチドを構成するアミノ酸残基の数は、例えば、それらの組み合わせの範囲であってよい。本発明においてペプチドを構成するアミノ酸残基の数は、例えば、１０残基〜１００残基、１０残基〜８０残基、１０残基〜６０残基、１０残基〜５０残基、２０残基〜１００残基、２０残基〜８０残基、２０残基〜６０残基、２０残基〜５０残基、３０残基〜１００残基、３０残基〜８０残基、３０残基〜６０残基、または３０残基〜５０残基であってよい。 In the present invention, the number of amino acid residues constituting the peptide (the length of the peptide) is determined as long as the retention in blood can be enhanced by forming a complex with glycosaminoglycan via a linker. Is not particularly limited. In the present invention, the number of amino acid residues constituting the peptide may be, for example, 100 residues or less, 90 residues or less, 80 residues or less, 70 residues or less, 60 residues or less, 50 residues or less. In the present invention, the number of amino acid residues constituting the peptide may be, for example, 10 or more, 20 or more, or 30 or more. In the present invention, the number of amino acid residues constituting the peptide may be, for example, in the range of a combination thereof. In the present invention, the number of amino acid residues constituting the peptide is, for example, 10 to 100 residues, 10 to 80 residues, 10 to 60 residues, 10 to 50 residues, and 20 residues. Group-100 residues, 20 residues-80 residues, 20 residues-60 residues, 20 residues-50 residues, 30 residues-100 residues, 30 residues-80 residues, 30 residues- It may be 60 residues, or 30-50 residues.
本発明においてペプチドは、疾患の治療のために長期に亘って薬効を維持することが重要なペプチドであることが好ましい。そのようなペプチドとしては、生活習慣病の治療のために投与されるペプチドが挙げられる。生活習慣病としては、脂質異常症、高血圧、糖尿病、肥満が挙げられる。本発明におけるペプチドは、糖尿病の治療のために投与されるペプチドであることが好ましい。また、本発明におけるペプチドは、血糖抑制作用を有するペプチドであることが好ましい。本発明におけるペプチドとしては、具体的には、ＧＬＰ−１、インスリンが挙げられる。 In the present invention, the peptide is preferably a peptide that is important to maintain its efficacy for a long period of time for treating a disease. Such peptides include those administered for the treatment of lifestyle-related diseases. Lifestyle-related diseases include dyslipidemia, hypertension, diabetes, and obesity. The peptide in the present invention is preferably a peptide administered for treating diabetes. Further, the peptide in the present invention is preferably a peptide having a blood sugar suppressing action. Specific examples of the peptide in the present invention include GLP-1 and insulin.
ＧＬＰ−１としては、ＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸配列を含むペプチドおよびＧＬＰ−１（７−３７）のアナログのアミノ酸配列を含むペプチド、並びにそれらのバリアントを例示することができる。 Examples of GLP-1 include a peptide containing the amino acid sequence of GLP-1 (7-37), a peptide containing the amino acid sequence of an analog of GLP-1 (7-37), and variants thereof.
バリアントについては、グリコサミノグリカンを生産する能力の付与等のために微生物の改変に使用される遺伝子のバリアントについての記載を準用できる。すなわち、ＧＬＰ−１のバリアントは、例えば、ＧＬＰ−１（７−３７）またはＧＬＰ−１（７−３７）のアナログのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、血糖抑制作用を有する、ペプチドであってよい。「１又は数個」とは、上述したとおりであるが、特にペプチドについては、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜７個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、または１〜２個を意味してもよい。また、ＧＬＰ−１のバリアントは、例えば、ＧＬＰ−１（７−３７）またはＧＬＰ−１（７−３７）のアナログのアミノ酸配列に対し、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸を含み、血糖抑制作用を有する、ペプチドであってもよい。 As for the variant, the description of the variant of the gene used for modifying the microorganism for imparting the ability to produce glycosaminoglycan can be applied mutatis mutandis. That is, for example, a GLP-1 variant is obtained by substituting, deleting, or inserting one or several amino acid residues in the amino acid sequence of GLP-1 (7-37) or an analog of GLP-1 (7-37). And / or a peptide comprising an added amino acid sequence and having a blood glucose-suppressing action. The term “one or several” is as described above, and particularly for peptides, for example, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 7, 1 to 5, 1 to It may mean four, one to three, or one to two. In addition, the GLP-1 variant is, for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more of the amino acid sequence of GLP-1 (7-37) or an analog of GLP-1 (7-37). %, More preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more.
ＧＬＰ−１として、具体的には、下記（Ａ）〜（Ｄ）に示されるペプチドを例示することができる。すなわち、本発明においてペプチドは、具体的には、例えば、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択されるペプチドであってよい。
（Ａ）下記（ａ）に示されるＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸配列を含むペプチド。
（ａ）ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（ＧＬＰ−１（７−３７）；配列番号１）
（Ｂ）下記（ｂ１）〜（ｂ３）からなる群より選択されるＧＬＰ−１（７−３７）のアナログのアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ１）ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＣ（ＧＬＰ−１Ｃ；配列番号２）
（ｂ２）ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＲＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（ＧＬＰ−１ＲＫ；配列番号３）
（ｂ３）ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＣ（ＧＬＰ−１ｏｒｉＣ；配列番号４）
（Ｃ）前記（ａ）および（ｂ１）〜（ｂ３）のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、血糖抑制作用を有する、ペプチド。
（Ｄ）前記（ａ）および（ｂ１）〜（ｂ３）のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、血糖抑制作用を有する、ペプチド。
Specific examples of GLP-1 include the following peptides (A) to (D). That is, in the present invention, the peptide may be, for example, a peptide selected from the group consisting of the following (A) to (D).
(A) A peptide comprising the amino acid sequence of GLP-1 (7-37) shown in (a) below.
(A) HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (GLP-1 (7-37); SEQ ID NO: 1)
(B) a peptide comprising an amino acid sequence of an analog of GLP-1 (7-37) selected from the group consisting of (b1) to (b3) below.
(B1) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRC (GLP-1C; SEQ ID NO: 2)
(B2) HGEGFTSDSDVSYLEGQAAREFIAWLVKGRG (GLP-1RK; SEQ ID NO: 3)
(B3) HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRC (GLP-1oriC; SEQ ID NO: 4)
(C) An amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence shown in any one of (a) and (b1) to (b3). A peptide comprising a blood sugar inhibitory action.
(D) A peptide comprising an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence shown in any one of (a) and (b1) to (b3), and having a blood glucose-suppressing action.
上記ＧＬＰ−１のバリアントにおいて、改変（例えば、置換、欠失、挿入、及び／又は付加）されるアミノ酸残基は、リンカーを結合させるアミノ酸残基以外のアミノ酸残基であってよい。 In the GLP-1 variant, the amino acid residue to be modified (for example, substitution, deletion, insertion, and / or addition) may be an amino acid residue other than the amino acid residue to which the linker is bound.
ＧＬＰ−１アナログのアミノ酸配列としては、上記（ｂ１）〜（ｂ３）に例示したアミノ酸配列に加えて、文献（ＵＳ８９５７０２１）に記載されたアミノ酸配列も例示することができる。 As the amino acid sequence of the GLP-1 analog, in addition to the amino acid sequences exemplified in the above (b1) to (b3), the amino acid sequences described in the literature (US8957021) can also be exemplified.
ＧＬＰ−１等のペプチドに結合させるリンカーについては、上述した通りである。ＧＬＰ−１（例えば、上記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに示されるペプチド）に結合させるリンカーは、例えば、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ１５）のいずれかに示される構造を有するリンカーであってよい。式中、Ａ１は、好ましくは、８〜１４、８〜１３、８〜１２、９〜１３、９〜１２、９〜１１、１０〜１２、または１０〜１１のアルキレン基であってよい。具体的には、式中、Ａ１は、炭素数８、９、１０、１１、１２、１３、または１４のアルキレン基であることが好ましく、炭素数９、１０、１１、または１２のアルキレン基であることがより好ましく、炭素数１０または１１のアルキレン基であることがさらに好ましく、炭素数１１のアルキレン基であることが特に好ましい。 The linker that binds to a peptide such as GLP-1 is as described above. The linker to be bound to GLP-1 (for example, the peptide represented by any one of the above (A) to (D)) is, for example, a linker having a structure represented by any one of the above general formulas (L1) to (L15) It may be. In the formula, A 1 may preferably be an alkylene group of 8 to 14, 8 to 13, 8 to 12, 9 to 13, 9 to 12, 9 to 11, 10 to 12, or 10 to 11. Specifically, in the formula, A 1 is preferably an alkylene group having 8, 9, 10, 11, 12, 13, or 14 carbon atoms, and an alkylene group having 9, 10, 11, or 12 carbon atoms. Is more preferable, an alkylene group having 10 or 11 carbon atoms is more preferable, and an alkylene group having 11 carbon atoms is particularly preferable.
ＧＬＰ−１等のペプチドとリンカーの結合様式については、後述する通りである。リンカーは、例えば、ペプチドのアミノ酸残基と結合させることができる。ＧＬＰ−１においてリンカーを結合させるアミノ酸残基は、Ｎ末端のアミノ酸残基から好ましくは１５残基以上、より好ましくは２０残基以上、さらに好ましくは２５残基以上、特に好ましくは３０残基以上Ｃ末端側に存在するアミノ酸残基であってよい。また、ＧＬＰ−１においてリンカーを結合させるアミノ酸残基は、Ｃ末端の近傍に存在するアミノ酸残基であることが好ましく、Ｃ末端のアミノ酸残基であることがより好ましい。ここにいう「Ｃ末端の近傍に存在するアミノ酸残基」とは、Ｃ末端から好ましくは１５残基以内、より好ましくは１２残基以内、さらに好ましくは８残基以内、特に好ましくは４残基以内に存在するアミノ酸残基である。 The binding mode between the peptide such as GLP-1 and the linker is as described later. The linker can be linked to, for example, an amino acid residue of the peptide. The amino acid residue to which the linker is bonded in GLP-1 is preferably at least 15 residues, more preferably at least 20 residues, still more preferably at least 25 residues, particularly preferably at least 30 residues from the N-terminal amino acid residue. It may be an amino acid residue present on the C-terminal side. The amino acid residue to which the linker is bonded in GLP-1 is preferably an amino acid residue existing near the C-terminus, and more preferably an amino acid residue at the C-terminus. As used herein, the term “amino acid residue present near the C-terminus” means preferably within 15 residues, more preferably within 12 residues, still more preferably within 8 residues, particularly preferably 4 residues from the C-terminus. Amino acid residues that exist within
ＧＬＰ−１においてリンカーを結合させるアミノ酸残基は、リジン（Ｋ）残基、システイン（Ｃ）残基、および／またはＣ末端のアミノ酸残基であることが好ましい。リンカーを結合させるアミノ酸残基がリジン残基である場合は、リジン残基のε−アミノ基とリンカーを結合させることが好ましい。リンカーを結合させるアミノ酸残基がシステイン残基
である場合は、システイン残基のチオール基とリンカーを結合させることが好ましい。
The amino acid residue to which the linker is bound in GLP-1 is preferably a lysine (K) residue, a cysteine (C) residue, and / or a C-terminal amino acid residue. When the amino acid residue to which the linker is bound is a lysine residue, it is preferable to bind the linker to the ε-amino group of the lysine residue. When the amino acid residue to be bonded to the linker is a cysteine residue, it is preferable to bond the thiol group of the cysteine residue to the linker.
ＧＬＰ−１（７−３７）において、Ｎ末端のアミノ酸残基は７位のヒスチジン残基である。よって、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１Ｃ、およびＧＬＰ−１ｏｒｉＣにおいてリジン残基は２６位と３４位に存在し、ＧＬＰ−１ＲＫにおいてリジン残基は３４位に存在する。また、ＧＬＰ−１ＣおよびＧＬＰ−１ｏｒｉＣにおいてシステイン残基は３７位に存在する。 In GLP-1 (7-37), the N-terminal amino acid residue is a histidine residue at position 7. Thus, in GLP-1 (7-37), GLP-1C, and GLP-1oriC, lysine residues are at positions 26 and 34, and in GLP-1RK, lysine residues are at position 34. In GLP-1C and GLP-1oriC, a cysteine residue is located at position 37.
ＧＬＰ−１（ＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸配列を含むペプチドやＧＬＰ−１（７−３７）のアナログのアミノ酸配列を含むペプチド等）においてリンカーを結合させるアミノ酸残基は、具体的には、２６位のリジン残基、３４位のリジン残基、または３７位のシステイン残基であることが好ましく、３４位のリジン残基または３７位のシステイン残基であることがより好ましく、３７位のシステイン残基であることがさらに好ましい。なお、ここに記載のアミノ酸残基の位置は、（ａ）および（ｂ１）〜（ｂ３）のいずれかに示されるアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の位置を基準とした相対的な位置を示す。よって、ここに記載のアミノ酸残基の絶対的な位置は、アミノ酸残基の欠失、挿入、及び／又は付加によって前後し得る。任意のＧＬＰ−１のアミノ酸配列におけるここに記載のアミノ酸残基の絶対的な位置は、例えば、当該任意のＧＬＰ−１のアミノ酸配列と（ａ）および（ｂ１）〜（ｂ３）のいずれかに示されるアミノ酸配列とのアラインメントにより同定できる。 In GLP-1 (eg, a peptide containing an amino acid sequence of GLP-1 (7-37) or a peptide containing an amino acid sequence of an analog of GLP-1 (7-37)), the amino acid residue to which a linker is bound is specifically described. Is preferably a lysine residue at position 26, a lysine residue at position 34, or a cysteine residue at position 37, more preferably a lysine residue at position 34 or a cysteine residue at position 37; More preferably, it is a cysteine residue. In addition, the position of the amino acid residue described here shows the relative position based on the position of the amino acid residue in the amino acid sequence shown in any one of (a) and (b1) to (b3). Thus, the absolute positions of the amino acid residues described herein may be altered by deletion, insertion, and / or addition of amino acid residues. The absolute position of the amino acid residue described herein in the amino acid sequence of any GLP-1 may be, for example, the amino acid sequence of any GLP-1 and any one of (a) and (b1) to (b3). It can be identified by alignment with the amino acid sequence shown.
ＧＬＰ−１においてリンカーを結合させるアミノ酸残基の数（グリコサミノグリカンを導入するアミノ酸残基の数）は、１つであってもよく、２つまたはそれ以上であってもよい。ＧＬＰ−１においてリンカーを結合させるアミノ酸残基の数は、１つであることが好ましい。 The number of amino acid residues (the number of amino acid residues for introducing glycosaminoglycans) to which a linker is bonded in GLP-1 may be one, two or more. It is preferable that the number of amino acid residues to which a linker is bound in GLP-1 is one.
インスリンとしては、Ａ鎖及びＢ鎖を含み、血糖抑制作用を有するペプチド多量体が挙げられる。Ａ鎖としては、インスリンＡ鎖及びそのバリアントを例示することができる。Ｂ鎖としては、インスリンＢ鎖及びそのバリアントを例示することができる。 Insulin includes a peptide multimer containing an A chain and a B chain and having a blood sugar suppressing action. Examples of the A chain include an insulin A chain and a variant thereof. Examples of the B chain include an insulin B chain and a variant thereof.
バリアントについては、ＧＬＰ−１のバリアントについての記載を準用できる。すなわち、インスリンＡ鎖及びＢ鎖のバリアントは、例えば、それぞれ、インスリンＡ鎖及びＢ鎖のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むペプチドであってよい。また、インスリンＡ鎖及びＢ鎖のバリアントは、例えば、それぞれ、インスリンＡ鎖及びＢ鎖のアミノ酸配列に対し、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであってもよい。 As for the variant, the description of the variant of GLP-1 can be applied mutatis mutandis. That is, variants of insulin A chain and B chain are, for example, amino acids in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequences of insulin A chain and B chain, respectively. It may be a peptide comprising the sequence. In addition, the variants of the insulin A chain and the B chain are, for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 97% with respect to the amino acid sequences of the insulin A and B chains, respectively. As described above, a peptide containing an amino acid sequence having at least 99% homology may be used.
インスリンとして、具体的には、下記（Ａ）に示されるペプチド及び下記（Ｂ）に示されるペプチドを含み、血糖抑制作用を有するペプチド多量体を例示することができる。すなわち、本発明においてペプチドは、具体的には、例えば、下記（Ａ）に示されるペプチド及び下記（Ｂ）に示されるペプチドを含み、血糖抑制作用を有するペプチド多量体であってよい。
（Ａ）下記（ａ１）に示されるインスリンＡ鎖のアミノ酸配列を含むペプチド、又は下記（ａ２）若しくは（ａ３）に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（ａ１）ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号５）
（ａ２）前記（ａ１）に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
（ａ３）前記（ａ１）に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するア
ミノ酸配列。
（Ｂ）下記（ｂ１）に示されるインスリンＢ鎖のアミノ酸配列を含むペプチド、又は下記（ｂ２）若しくは（ｂ３）に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ１）ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号６）
（ｂ２）前記（ｂ１）に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
（ｂ３）前記（ｂ１）に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
Specific examples of the insulin include a peptide multimer having a blood sugar-suppressing action, including the peptide shown in the following (A) and the peptide shown in the following (B). That is, in the present invention, the peptide specifically includes, for example, a peptide shown in the following (A) and a peptide shown in the following (B), and may be a peptide multimer having a blood sugar suppressing action.
(A) A peptide containing the amino acid sequence of the insulin A chain shown in (a1) below, or a peptide containing the amino acid sequence shown in (a2) or (a3) below.
(A1) GIVEQCCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 5)
(A2) an amino acid sequence in which one or several amino acid residues have been substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence shown in the above (a1).
(A3) an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence shown in (a1).
(B) A peptide containing the amino acid sequence of the insulin B chain shown in (b1) below, or a peptide containing the amino acid sequence shown in (b2) or (b3) below.
(B1) FVNQHLGCSHHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 6)
(B2) an amino acid sequence in which one or several amino acid residues have been substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence shown in (b1).
(B3) an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence shown in (b1).
上記バリアントにおいて、改変（例えば、置換、欠失、挿入、及び／又は付加）されるアミノ酸残基は、リンカーを結合させるアミノ酸残基を除く他のアミノ酸残基であってよい。 In the above variant, the amino acid residue to be modified (for example, substitution, deletion, insertion, and / or addition) may be another amino acid residue except the amino acid residue to which the linker is attached.
インスリン等のペプチドに結合させるリンカーについては、上述した通りである。インスリン（例えば、上記のペプチド多量体）に結合させるリンカーは、例えば、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ１５）のいずれかに示される構造を有するリンカーであってよい。式中、Ａ１は、好ましくは、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜４、または２〜３であってよい。具体的には、式中、Ａ１は、炭素数１、２、３、４、５、または６のアルキレン基であることが好ましく、炭素数１、２、３、または４のアルキレン基であることがより好ましく、炭素数１または２のアルキレン基であることがさらに好ましく、炭素数２のアルキレン基であることが特に好ましい。 The linker to be bound to the peptide such as insulin is as described above. The linker that binds to insulin (for example, the above-mentioned peptide multimer) may be, for example, a linker having a structure represented by any one of the general formulas (L1) to (L15). Wherein A 1 may preferably be 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-4, or 2-3. Specifically, in the formula, A 1 is preferably an alkylene group having 1, 2, 3, 4, 5, or 6 carbon atoms, and is preferably an alkylene group having 1, 2, 3, or 4 carbon atoms. Is more preferably an alkylene group having 1 or 2 carbon atoms, further preferably an alkylene group having 2 carbon atoms.
インスリン等のペプチドとリンカーの結合様式については、後述する通りである。リンカーは、例えば、ペプチドのアミノ酸残基と結合させることができる。インスリンにおいてリンカーを結合させるアミノ酸残基は、リジン（Ｋ）残基またはＮ末端のアミノ酸残基であることが好ましい。リンカーを結合させるアミノ酸残基がリジン残基である場合は、リジン残基のε−アミノ基とリンカーを結合させることが好ましい。リンカーを結合させるアミノ酸残基がＮ末端のアミノ酸残基である場合は、Ｎ末端のα−アミノ基とリンカーを結合させることが好ましい。 The binding mode between the peptide such as insulin and the linker is as described later. The linker can be linked to, for example, an amino acid residue of the peptide. The amino acid residue that binds the linker in insulin is preferably a lysine (K) residue or an N-terminal amino acid residue. When the amino acid residue to be bonded to the linker is a lysine residue, it is preferable to bond the linker to the ε-amino group of the lysine residue. When the amino acid residue to which the linker is bonded is an N-terminal amino acid residue, it is preferable to bond the N-terminal α-amino group to the linker.
インスリンにおいてリンカーを結合させるアミノ酸残基は、具体的には、インスリンＡ鎖（例えば、上記（Ａ）に示されるペプチド）のＮ末端のアミノ酸残基、インスリンＢ鎖（例えば、上記（Ｂ）に示されるペプチド）のＮ末端のアミノ酸残基、またはインスリンＢ鎖の２９位のリジン残基であることが好ましく、インスリンＡ鎖のＮ末端のアミノ酸残基、またはインスリンＢ鎖の２９位のリジン残基であることがより好ましく、インスリンＡ鎖のＮ末端のアミノ酸残基であることがさらに好ましい。なお、「インスリンＢ鎖の２９位のリジン残基」の位置は、（ｂ１）に示されるアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の位置を基準とした相対的な位置を示す。よって、当該アミノ酸残基の絶対的な位置は、アミノ酸残基の欠失、挿入、及び／又は付加によって前後し得る。任意のインスリンＢ鎖のアミノ酸配列における当該アミノ酸残基の絶対的な位置は、例えば、当該任意のインスリンＢ鎖のアミノ酸配列と（ｂ１）に示されるアミノ酸配列とのアラインメントにより同定できる。 The amino acid residue to which the linker is bonded in insulin is specifically the N-terminal amino acid residue of insulin A chain (for example, the peptide shown in (A) above) or the insulin B chain (for example, in (B) above). N-terminal amino acid residue of the insulin B chain or the lysine residue at the 29-position of the insulin B chain. Group, more preferably an amino acid residue at the N-terminus of the insulin A chain. The position of “lysine residue at position 29 in the insulin B chain” indicates a relative position based on the position of the amino acid residue in the amino acid sequence shown in (b1). Thus, the absolute position of the amino acid residue can be changed by deletion, insertion, and / or addition of the amino acid residue. The absolute position of the amino acid residue in the amino acid sequence of an arbitrary insulin B chain can be identified by, for example, alignment of the amino acid sequence of the arbitrary insulin B chain with the amino acid sequence shown in (b1).
インスリンは、一態様において、Ａ鎖及びＢ鎖からなるペプチド二量体（例えば、上記（Ａ）に示されるペプチドおよび上記（Ｂ）に示されるペプチドからなるペプチド二量体）であってよい。 In one embodiment, the insulin may be a peptide dimer composed of an A chain and a B chain (for example, a peptide dimer composed of the peptide represented by the above (A) and the peptide represented by the above (B)).
インスリンにおいてＡ鎖は、６位のシステイン残基と１１位のシステイン残基がジスルフィド結合を形成していることが好ましい。また、インスリンにおいてＡ鎖とＢ鎖は、Ａ
鎖の７位のシステイン残基とＢ鎖の７位のシステイン残基およびＡ鎖の２０位のシステイン残基とＢ鎖の１９位のシステイン残基がジスルフィド結合を形成していることが好ましい。
In the A chain of insulin, it is preferable that the cysteine residue at position 6 and the cysteine residue at position 11 form a disulfide bond. In insulin, the A and B chains are represented by A
It is preferred that the cysteine residue at position 7 of the chain, the cysteine residue at position 7 of the B chain, and the cysteine residue at
上記のペプチドの説明において、「アミノ酸配列を含む」という表現は、「アミノ酸配列からなる」場合を包含する。 In the above description of the peptide, the expression “including an amino acid sequence” includes the case of “consisting of an amino acid sequence”.
ペプチドとしては、１種のペプチドのみが用いられてもよく、２種またはそれ以上のペプチドが用いられてもよい。 As the peptide, only one kind of peptide may be used, or two or more kinds of peptides may be used.
ペプチドは、例えば、化学合成により、当該ペプチドを産生する生物からの回収により、または当該ペプチドをコードする遺伝子の発現により、製造することができる。また、ペプチドは、例えば、各種試薬メーカー（ペプチド研究所社、北海道システムサイエンス社、スクラム社等）から市販品として、または合成を委託して入手することができる。 A peptide can be produced, for example, by chemical synthesis, by recovery from an organism producing the peptide, or by expression of a gene encoding the peptide. In addition, the peptide can be obtained as a commercial product from various reagent manufacturers (Peptide Research Institute, Hokkaido System Science, Scrum, etc.) or by outsourcing synthesis.
＜９＞本発明におけるグリコサミノグリカンとリンカーの結合様式
本発明においてグリコサミノグリカンとリンカーの結合様式は、両者が結合した状態を維持することが可能な様式である限り、特に制限されない。本発明においてグリコサミノグリカンとリンカーを結合させる方法としては、例えば、グリコサミノグリカンにリンカーを導入する公知の方法を用いることができる。本発明においてグリコサミノグリカンとリンカーの結合様式は、結合状態の安定性の点から、共有結合であることが好ましい。
<9> Binding Mode of Glycosaminoglycan and Linker in the Present Invention The binding mode of glycosaminoglycan and the linker in the present invention is not particularly limited as long as the binding state of both can be maintained. In the present invention, as a method for bonding a glycosaminoglycan to a linker, for example, a known method for introducing a linker into glycosaminoglycan can be used. In the present invention, the binding mode of the glycosaminoglycan and the linker is preferably a covalent bond from the viewpoint of the stability of the binding state.
リンカーは、例えば、グリコサミノグリカンの糖残基と結合させることができる。本発明においてリンカーを結合させるグリコサミノグリカンの糖残基は、還元末端の糖残基であることが好ましい。本発明においてリンカーとグリコサミノグリカンの結合は、リンカーとグリコサミノグリカンの還元末端の糖残基の１位の炭素原子との結合であることが好ましい。還元末端の糖残基は、グルコサミン残基、ガラクトサミン残基、またはグルクロン酸残基であることが好ましい。グルコサミン残基は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基であることが好ましい。ガラクトサミン残基は、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基であることが好ましい。
The linker can be linked to, for example, a sugar residue of glycosaminoglycan. In the present invention, the sugar residue of the glycosaminoglycan to which the linker is bound is preferably a sugar residue at the reducing end. In the present invention, the bond between the linker and glycosaminoglycan is preferably a bond between the linker and the carbon atom at
本発明においてリンカーとグリコサミノグリカンの結合は、リンカーの官能基とグリコサミノグリカンの官能基の反応により形成される結合であってよい。本発明においてリンカーとグリコサミノグリカンの結合は、前記一般式（Ｌ１１）〜（Ｌ１５）のいずれかに示される構造を有するリンカーの官能基Ｚ２とグリコサミノグリカンの官能基の反応により形成される結合であることが好ましい。リンカーは、具体的には、例えば、グリコサミノグリカンのアルデヒド基および／またはアミノ基と結合させることができる。当該グリコサミノグリカンの官能基は、アルデヒド基であることが好ましい。 In the present invention, the bond between the linker and glycosaminoglycan may be a bond formed by the reaction between the functional group of the linker and the functional group of glycosaminoglycan. Attachment of the linker and a glycosaminoglycan in the present invention, formed by reaction of functional groups functional groups Z 2 and glycosaminoglycans linker having a structure shown in any one of formulas (L11) ~ (L15) It is preferable that the bond be made. The linker can be specifically linked to, for example, an aldehyde group and / or an amino group of glycosaminoglycan. The functional group of the glycosaminoglycan is preferably an aldehyde group.
グリコサミノグリカンとリンカーの結合は、例えば、アルデヒド基とアミノ基の結合により行うことができる。よって、グリコサミノグリカンとリンカーの結合は、具体的には、例えば、グリコサミノグリカンが有するアルデヒド基とリンカーが有するアミノ基の結合、またはグリコサミノグリカンが有するアミノ基とリンカーが有するアルデヒド基との結合により行うことができる。 The glycosaminoglycan can be linked to the linker by, for example, linking an aldehyde group and an amino group. Therefore, specifically, the bond between the glycosaminoglycan and the linker is, for example, the bond between the aldehyde group of the glycosaminoglycan and the amino group of the linker, or the aldehyde of the amino group of the glycosaminoglycan and the linker. It can be performed by bonding with a group.
「グリコサミノグリカンが有するアルデヒド基」は、グリコサミノグリカンが還元末端に本来的に有するアルデヒド基であってもよく、人為的に導入されたアルデヒド基であってもよい。「人為的に導入されたアルデヒド基」とは、グリコサミノグリカンを化学反応に供することで導入されるアルデヒド基であることを意味する。例えば、グリコサミノグリカンを過ハロゲン酸と共存させる処理を行うことにより、還元末端ＧａｌＮＡｃ残基の
Ｃ４−Ｃ５結合、還元末端ＧｌｃＵＡ残基のＣ２−Ｃ３結合、還元末端ＧｌｃＵＡ残基のＣ５−Ｃ６結合、および／または還元末端以外のＧｌｃＵＡ残基のＣ２−Ｃ３結合を切断して、グリコサミノグリカンにアルデヒド基を人為的に導入することができる。ここにいう過ハロゲン酸としては、過ヨウ素酸が挙げられる。「グリコサミノグリカンが有するアルデヒド基」は、グリコサミノグリカンが還元末端に本来的に有するアルデヒド基であることが好ましい。
The “aldehyde group of glycosaminoglycan” may be an aldehyde group originally possessed by the glycosaminoglycan at the reducing end, or may be an aldehyde group artificially introduced. The “artificially introduced aldehyde group” means an aldehyde group introduced by subjecting glycosaminoglycan to a chemical reaction. For example, by performing a treatment in which glycosaminoglycan coexists with perhalic acid, a C4-C5 bond of a reducing terminal GalNAc residue, a C2-C3 bond of a reducing terminal GlcUA residue, and a C5-C6 bond of a reducing terminal GlcUA residue are obtained. Aldehyde groups can be artificially introduced into glycosaminoglycans by breaking the bond and / or the C2-C3 bond of the GlcUA residue other than the reducing end. The term "perhalogenic acid" used herein includes periodic acid. The “aldehyde group of glycosaminoglycan” is preferably an aldehyde group that glycosaminoglycan originally has at the reducing end.
「グリコサミノグリカンが有するアミノ基」は、グリコサミノグリカンがアミノ糖残基に本来的に有するアミノ基であってもよく、人為的に導入されたアミノ基であってもよい。「本来的に有するアミノ基」とは、グリコサミノグリカンのＧａｌＮＡｃ残基またはＧｌｃＮＡｃ残基の２位のアミノ基であることを意味する。当該アミノ基がアセチル化されている場合は、例えば、酸もしくは塩基またはヒドラジンと接触させる処理に供して脱アセチル化することにより、当該アミノ基をリンカーとの結合のために用いることができる。また、「人為的に導入されたアミノ基」とは、グリコサミノグリカンを化学反応に供することで導入されるアミノ基であることを意味する。例えば、グリコサミノグリカンをアミンと共存させる処理を行うことにより、グリコサミノグリカンの糖残基のアルデヒド基とのシッフ塩基を形成させて、グリコサミノグリカンにアミノ基を導入することができる。また、「人為的に導入されたアミノ基を有するグリコサミノグリカン」は、このようにして形成されるシッフ塩基を還元したグリコサミノグリカンであってもよい。ここにいうアミンとしては、アンモニア、アンモニウム塩（塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等）、ジアミン（エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン等のポリメチレンジアミン等）が挙げられる。 The “amino group of glycosaminoglycan” may be an amino group originally possessed by glycosaminoglycan in an amino sugar residue, or may be an amino group artificially introduced. The “natural amino group” means an amino group at the 2-position of a GalNAc residue or a GlcNAc residue of glycosaminoglycan. When the amino group is acetylated, the amino group can be used for binding to a linker, for example, by subjecting the amino group to treatment with an acid or base or hydrazine to deacetylate. Further, the “artificially introduced amino group” means an amino group introduced by subjecting glycosaminoglycan to a chemical reaction. For example, by performing a treatment in which glycosaminoglycan coexists with an amine, a Schiff base with an aldehyde group of a sugar residue of glycosaminoglycan can be formed, and an amino group can be introduced into glycosaminoglycan. . The “glycosaminoglycan having an amino group artificially introduced” may be a glycosaminoglycan obtained by reducing the Schiff base thus formed. Examples of the amine referred to herein include ammonia, ammonium salts (such as ammonium chloride and ammonium acetate), and diamines (such as polymethylenediamine such as ethylenediamine and hexamethylenediamine).
リンカーが結合するグリコサミノグリカンの糖残基は、還元末端の糖残基であることが好ましい。また、リンカーが結合するグリコサミノグリカンの部位は、グリコサミノグリカンが還元末端に本来的に有するアルデヒド基であることが好ましい。 The sugar residue of glycosaminoglycan to which the linker binds is preferably a sugar residue at the reducing end. Further, the site of glycosaminoglycan to which the linker is bonded is preferably an aldehyde group that glycosaminoglycan originally has at the reducing end.
本発明において、グリコサミノグリカンとリンカーの結合は、一態様において、下記構造式（Ｇ１）〜（Ｇ３）のいずれかに示される構造（すなわち結合）を有するものであってよい。 In the present invention, in one embodiment, the bond between the glycosaminoglycan and the linker may have a structure (ie, bond) represented by any of the following structural formulas (G1) to (G3).
上記構造式（Ｇ１）において、Ｒ１は水素、硫酸基、又はアセチル基であることが好ましく、水素又はアセチル基であることがより好ましく、アセチル基であることがさらに好ましい。上記構造式（Ｇ１）において、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して水素又は硫酸基であることが好ましく、水素であることがより好ましい。上記構造式（Ｇ１）において、Ｇ’はコンドロイチン鎖であることが好ましい。 In the above structural formula (G1), R 1 is preferably hydrogen, a sulfate group, or an acetyl group, more preferably hydrogen or an acetyl group, and still more preferably an acetyl group. In the structural formula (G1), R 2 , R 3 , and R 4 are each independently preferably a hydrogen atom or a sulfate group, more preferably hydrogen. In the structural formula (G1), G ′ is preferably a chondroitin chain.
上記構造式（Ｇ２）において、Ｒ１は水素、硫酸基、又はアセチル基であることが好ましく、水素又はアセチル基であることがより好ましく、アセチル基であることがさらに好ましい。上記構造式（Ｇ２）において、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して水素又は硫酸基であることが好ましく、水素であることがより好ましい。上記構造式（Ｇ２）において、Ｇ’はヘパロサン鎖であることが好ましい。 In the structural formula (G2), R 1 is preferably hydrogen, a sulfate group, or an acetyl group, more preferably hydrogen or an acetyl group, and still more preferably an acetyl group. In the structural formula (G2), R 2 , R 3 , and R 4 are each independently preferably a hydrogen atom or a sulfate group, more preferably hydrogen. In the structural formula (G2), G ′ is preferably a heparosan chain.
上記構造式（Ｇ３）において、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、それぞれ独立して水素又は硫酸基であることが好ましく、水素であることがより好ましい。上記構造式（Ｇ３）において、Ｒ４は水素、任意のアルカリ金属原子、又は任意のアルカリ土類金属原子であることが好ましく、水素又は任意のアルカリ金属原子であることがより好ましく、任意のアルカリ金属原子であることが好ましい。上記構造式（Ｇ３）において、Ｒ４としては、ナトリウム原子（Ｎａ）やカリウム原子（Ｋ）が例示される。上記構造式（Ｇ３）において、Ｇ’はコンドロイチン鎖またはヘパロサン鎖であることが好ましい。 In the structural formula (G3), R 1 , R 2 , and R 3 are each independently preferably a hydrogen atom or a sulfate group, more preferably hydrogen. In the above structural formula (G3), R 4 is preferably hydrogen, any alkali metal atom, or any alkaline earth metal atom, more preferably hydrogen or any alkali metal atom, and any alkali metal. It is preferably a metal atom. In the structural formula (G3), examples of R 4 include a sodium atom (Na) and a potassium atom (K). In the structural formula (G3), G ′ is preferably a chondroitin chain or a heparosan chain.
リンカーとグリコサミノグリカンは、１箇所のみで結合していてもよく、２またはそれ以上の箇所で結合していてもよい。１分子のリンカーに対し、１分子のグリコサミノグリカンのみが結合していてもよく、２分子またはそれ以上および／または２種またはそれ以上のグリコサミノグリカンが結合していてもよい。１分子のグリコサミノグリカンに対し、１分子のリンカーのみが結合していてもよく、２分子またはそれ以上および／または２種またはそれ以上のリンカーが結合していてもよい。 The linker and the glycosaminoglycan may be bonded at only one site, or may be bonded at two or more sites. Only one molecule of glycosaminoglycan may be bound to one molecule of the linker, or two or more and / or two or more types of glycosaminoglycan may be bound. One molecule of a linker may be bound to one molecule of glycosaminoglycan, or two or more and / or two or more linkers may be bound to one molecule of glycosaminoglycan.
＜１０＞本発明におけるリンカーとペプチドの結合様式
本発明においてリンカーとペプチドの結合様式は、両者が結合した状態を維持することが可能な様式である限り、特に制限されない。本発明においてリンカーとペプチドを結合させる方法としては、例えば、リンカーをペプチドに導入する公知の方法を用いることができる。本発明においてリンカーとペプチドの結合様式は、結合状態の安定性の点から、
共有結合であることが好ましい。
<10> Bonding Mode of the Linker and the Peptide in the Present Invention The bonding mode of the linker and the peptide in the present invention is not particularly limited as long as the bonding state of both can be maintained. In the present invention, as a method for bonding a linker to a peptide, for example, a known method for introducing a linker into a peptide can be used. In the present invention, the bonding mode of the linker and the peptide is, from the viewpoint of the stability of the bonding state,
It is preferably a covalent bond.
リンカーは、例えば、ペプチドのアミノ酸残基と結合させることができる。本発明においてリンカーを結合させるペプチドのアミノ酸残基は、例えば、アミノ基を有するアミノ酸残基（アルギニン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、ヒスチジン残基、リジン残基等）、チオール基を有するアミノ酸残基（システイン残基、メチオニン残基、ホモシステイン残基等）、Ｃ末端のアミノ酸残基、および／またはＮ末端のアミノ酸残基であってよい。本発明においてリンカーを結合させるペプチドのアミノ酸残基は、リジン（Ｋ）残基、システイン（Ｃ）残基、Ｃ末端のアミノ酸残基、および／またはＮ末端のアミノ酸残基であることが好ましい。 The linker can be linked to, for example, an amino acid residue of the peptide. In the present invention, the amino acid residue of the peptide to which the linker is bound includes, for example, an amino acid residue having an amino group (arginine residue, asparagine residue, glutamine residue, histidine residue, lysine residue, etc.), and a thiol group It may be an amino acid residue (cysteine residue, methionine residue, homocysteine residue, etc.), a C-terminal amino acid residue, and / or an N-terminal amino acid residue. In the present invention, the amino acid residue of the peptide to which the linker is bound is preferably a lysine (K) residue, a cysteine (C) residue, a C-terminal amino acid residue, and / or an N-terminal amino acid residue.
本発明においてリンカーとペプチドの結合は、リンカーの官能基とペプチドの官能基の反応により形成される結合であってよい。本発明においてリンカーとペプチドの結合は、前記一般式（Ｌ６）〜（Ｌ２０）のいずれかに示される構造を有するリンカーの官能基Ｚ１とペプチドの官能基の反応により形成される結合であることが好ましい。リンカーは、具体的には、例えば、ペプチドのアミノ基および／またはチオール基と結合させることができる。リンカーを結合させるアミノ酸残基がリジン残基である場合は、リジン残基のε−アミノ基とリンカーを結合させることが好ましい。リンカーを結合させるアミノ酸残基がシステイン残基である場合は、システイン残基のチオール基とリンカーを結合させることが好ましい。リンカーを結合させるアミノ酸残基がＮ末端のアミノ酸残基である場合は、Ｎ末端のα−アミノ基とリンカーを結合させることが好ましい。 In the present invention, the bond between the linker and the peptide may be a bond formed by the reaction between the functional group of the linker and the functional group of the peptide. That the binding of the linker and peptide in the present invention is a bond formed by the reaction of the functional group Z 1 with a peptide functional group of the linker having a structure shown in any one of formulas (L6) ~ (L20) Is preferred. The linker can be specifically linked to, for example, an amino group and / or a thiol group of the peptide. When the amino acid residue to which the linker is bound is a lysine residue, it is preferable to bind the linker to the ε-amino group of the lysine residue. When the amino acid residue to be bonded to the linker is a cysteine residue, it is preferable to bond the thiol group of the cysteine residue to the linker. When the amino acid residue to which the linker is bonded is an N-terminal amino acid residue, it is preferable to bond the N-terminal α-amino group to the linker.
「リンカーとペプチドの結合」は、例えば、マレイミド基またはハロアセチル基とチオール基の結合により行うことができる。よって、リンカーとペプチドの結合は、具体的には、例えば、リンカーが有するマレイミド基またはハロアセチル基とペプチドが有するチオール基の結合により行うことができる。 "Binding of a linker to a peptide" can be performed, for example, by binding of a maleimide group or a haloacetyl group to a thiol group. Therefore, specifically, the bond between the linker and the peptide can be performed, for example, by the bond between a maleimide group or a haloacetyl group of the linker and a thiol group of the peptide.
「ペプチドが有するチオール基」は、ペプチドが本来的に有するチオール基であってもよく、人為的に導入されたチオール基であってもよい。「人為的に導入されたチオール基」とは、ペプチドを化学反応に供することで導入されるチオール基であることを意味する。「ペプチドが有するチオール基」は、ペプチドが本来的に有するチオール基（システイン、メチオニン、ホモシステイン等が本来的に有するチオール基）であることが好ましい。 The “thiol group contained in the peptide” may be a thiol group originally contained in the peptide, or may be a thiol group artificially introduced. The "artificially introduced thiol group" means a thiol group introduced by subjecting a peptide to a chemical reaction. The “thiol group possessed by the peptide” is preferably a thiol group inherently possessed by the peptide (a thiol group inherently possessed by cysteine, methionine, homocysteine and the like).
リンカーが結合するペプチドのアミノ酸残基は、本来的にチオール基を有するアミノ酸残基（システイン残基、メチオニン残基、ホモシステイン残基等）であることが好ましい。これらの中でリンカーが結合するペプチドのアミノ酸残基は、システイン（Ｃ）残基であることがより好ましい。 The amino acid residue of the peptide to which the linker binds is preferably an amino acid residue originally having a thiol group (cysteine residue, methionine residue, homocysteine residue, etc.). Among these, the amino acid residue of the peptide to which the linker binds is more preferably a cysteine (C) residue.
また、「リンカーとペプチドの結合」は、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基またはアルデヒド基とアミノ基の結合により行うことができる。よって、リンカーとペプチドの結合は、具体的には、例えば、リンカーが有するＮＨＳ基またはアルデヒド基とペプチドが有するアミノ基の結合により行うことができる。 Further, the “bonding between the linker and the peptide” can be performed, for example, by bonding an N-hydroxysuccinimide (NHS) group or an aldehyde group to an amino group. Therefore, specifically, the bond between the linker and the peptide can be performed, for example, by the bond between the NHS group or aldehyde group of the linker and the amino group of the peptide.
「ペプチドが有するアミノ基」は、ペプチドが本来的に有するアミノ基であってもよく、人為的に導入されたアミノ基であってもよい。「人為的に導入されたアミノ基」とは、ペプチドを化学反応に供することで導入されるアミノ基であることを意味する。「ペプチドが有するアミノ基」は、ペプチドが本来的に有するアミノ基（アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン等が本来的に有するε−アミノ基、またはペプチドのＮ末端に存在するα−アミノ基）であることが好ましい。 The “amino group possessed by the peptide” may be an amino group originally possessed by the peptide, or may be an amino group artificially introduced. The “artificially introduced amino group” means an amino group introduced by subjecting a peptide to a chemical reaction. The “amino group possessed by the peptide” is an amino group originally possessed by the peptide (an ε-amino group inherently possessed by arginine, asparagine, glutamine, histidine, lysine, etc., or an α-amino group present at the N-terminus of the peptide) ) Is preferable.
リンカーが結合するペプチドのアミノ酸残基は、本来的にアミノ基を有するアミノ酸残基（アルギニン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、ヒスチジン残基、リジン残基等）、および／またはペプチドのＮ末端のアミノ酸残基であることが好ましい。これらの中でリンカーが結合するペプチドのアミノ酸残基は、リジン（Ｋ）および／またはペプチドのＮ末端のアミノ酸残基であることがより好ましい。 The amino acid residue of the peptide to which the linker binds may be an amino acid residue originally having an amino group (arginine residue, asparagine residue, glutamine residue, histidine residue, lysine residue, etc.) and / or N It is preferably a terminal amino acid residue. Of these, the amino acid residue of the peptide to which the linker binds is more preferably lysine (K) and / or the N-terminal amino acid residue of the peptide.
リンカーとペプチドの結合様式は、特に具体的には、本発明におけるペプチド（例えば、ＧＬＰ−１およびインスリン）に関連して説明した通りであってよい。 The mode of binding between the linker and the peptide may be particularly specifically as described in connection with the peptide (eg, GLP-1 and insulin) in the present invention.
本発明において、リンカーとペプチドの結合は、一態様において、下記（Ｐ１）〜（Ｐ３）のいずれかに示される構造（すなわち結合）を有するものであってよい。 In the present invention, in one embodiment, the bond between the linker and the peptide may have a structure (that is, a bond) shown in any of the following (P1) to (P3).
を表し、Ｐｃはペプチドのうちリンカーが結合したリジン残基等のアミノ酸残基よりＣ末端側の残余の部分を表す。）
本発明において、リンカーとペプチドの結合がリンカーとシステイン残基との結合である場合、その結合様式は前記一般式（Ｐ１）に示される結合様式であることが好ましい。本発明において、リンカーとペプチドの結合がリンカーとリジン残基との結合である場合、その結合様式は前記一般式（Ｐ３）に示される結合様式であることが好ましい。 In the present invention, when the bond between the linker and the peptide is a bond between the linker and a cysteine residue, the bond is preferably the bond shown in the general formula (P1). In the present invention, when the bond between the linker and the peptide is a bond between the linker and a lysine residue, the bond is preferably the bond shown in the general formula (P3).
リンカーとペプチドは、１箇所のみで結合していてもよく、２またはそれ以上の箇所で結合していてもよい。１分子のリンカーに対し、１分子のペプチドのみが結合していてもよく、２分子またはそれ以上および／または２種またはそれ以上のペプチドが結合していてもよい。１分子のペプチドに対し、１分子のリンカーのみが結合していてもよく、２分子またはそれ以上および／または２種またはそれ以上のリンカーが結合していてもよい。例えば、リンカーを結合させるペプチドのアミノ酸残基は、１残基であってもよく、２残基またはそれ以上であってもよい。また、リンカーは、同一のアミノ酸残基に２つまたはそれ以上導入されてもよい。 The linker and the peptide may be bonded at only one site, or may be bonded at two or more sites. Only one peptide molecule may be bound to one molecule of the linker, or two or more and / or two or more peptides may be bound. Only one molecule of the linker may be bonded to one molecule of the peptide, or two or more molecules and / or two or more types of the linker may be bonded. For example, the amino acid residue of the peptide to which the linker is attached may be one residue, two residues or more. Also, two or more linkers may be introduced at the same amino acid residue.
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。 All documents, patent applications, and technical standards described herein are to the same extent as if each individual document, patent application, and technical standard were specifically and individually stated to be incorporated by reference. Incorporated herein by reference.
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例の内容のみに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited to the contents of these examples.
＜実施例１＞コンドロイチンの調製
コンドロイチン（以下、「ＣＨ」ともいう。）は、文献（国際公開第２０１１／１０９４３８号）に記載の方法に従ってエシェリヒア・コリMSC702株を培養し、培養上清から精製して調製した。エシェリヒア・コリMSC702株は、同文献に記載の方法に基づき、エシェリヒア・コリK-12 W3110株（ATCC 27325）に、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA、kfoB、kfoC、kfoF、kfoG遺伝子を各４コピー、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC、kpsS、kpsM、kpsT遺伝子を各１コピー、及びシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のxylS遺伝子を１コピー導入して構築した。
<Example 1> Preparation of chondroitin Chondroitin (hereinafter also referred to as "CH") is obtained by culturing Escherichia coli MSC702 strain according to the method described in the literature (WO 2011/109438) and purifying it from the culture supernatant. Prepared. The Escherichia coli MSC702 strain was prepared by adding the kfoA, kfoB, kfoC, kfoF and kfoG genes derived from the Escherichia coli K4 strain to the Escherichia coli K-12 W3110 strain (ATCC 27325) based on the method described in the literature. Copy, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, and kpsT genes derived from Escherichia coli K4 strain, and 1 copy each of the gene, and xylS gene derived from Pseudomonas putida were introduced and constructed. .
＜実施例２＞ヘパロサンの調製
ヘパロサン（以下、「ＨＰＮ」ともいう。）は、公知の文献（特開２００４−０１８８４０号公報）に記載の方法に従ってエシェリヒア・コリＫ５株（Serotype O10:K5(L):H4,
ATCC 23506）を培養し、培養上清から精製して調製した。
<Example 2> Preparation of heparosan Heparosan (hereinafter, also referred to as "HPN") was obtained from Escherichia coli K5 strain (Serotype O10: K5 (L ): H4,
ATCC 23506) was cultured and purified from the culture supernatant.
＜参考例１＞分子量の調整
前記実施例１で得られたコンドロイチンまたは前記実施例２で得られたヘパロサンを１ｇ／Ｌとなるように蒸留水に溶解した。この溶液に終濃度で０．５Ｍとなるように塩酸を添加し、６０℃で１０分間〜５時間撹拌した。この溶液に水酸化ナトリウムを添加して中和し、透析により脱塩した後、凍結乾燥させた。続いて、当該コンドロイチンまたは当該ヘパロサンを１２．５ｍｇ／ｍＬになるように１０％メタノール／５０ｍＭ炭酸ナトリウムに溶解した後、ヘキソサミン残基（ＧａｌＮＡｃ残基またはＧｌｃＮＡｃ残基）の数に対して４モル当量の無水酢酸を添加して室温で１時間撹拌した。この溶液に酢酸ナトリウムを終濃度３％（ｗ／ｖ）となるように添加し、続いて１．６倍容の９９．５％（ｖ／ｖ）エタノールと混合した後、室温に一晩静置して得られる沈殿物を回収した。このようにして得られた沈殿物を含水エタノールで洗浄し、その後に乾燥させた。このようにして所
望の分子量を有するコンドロイチンおよびヘパロサンを得た。以下、ｎ×１０３の分子量を有するコンドロイチンおよびヘパロサンを、それぞれ、「ＣＨｎ」および「ＨＰＮｎ」ともいう。すなわち、例えば、「ＣＨ１０」とは、分子量１０ｋＤａのコンドロイチンを示す。
Reference Example 1 Adjustment of Molecular Weight The chondroitin obtained in Example 1 or heparosan obtained in Example 2 was dissolved in distilled water so as to have a concentration of 1 g / L. Hydrochloric acid was added to this solution to a final concentration of 0.5 M, and the mixture was stirred at 60 ° C for 10 minutes to 5 hours. The solution was neutralized by adding sodium hydroxide, desalted by dialysis, and lyophilized. Subsequently, the chondroitin or the heparosan is dissolved in 10% methanol / 50 mM sodium carbonate so as to have a concentration of 12.5 mg / mL. Acetic anhydride was added and stirred at room temperature for 1 hour. To this solution was added sodium acetate to a final concentration of 3% (w / v), followed by mixing with 1.6 volumes of 99.5% (v / v) ethanol, and then allowed to stand at room temperature overnight. The resulting precipitate was collected. The precipitate thus obtained was washed with aqueous ethanol and then dried. Thus, chondroitin and heparosan having a desired molecular weight were obtained. Hereinafter, chondroitin and heparosan having a molecular weight of n × 10 3 are also referred to as “CHn” and “HPNn”, respectively. That is, for example, “CH10” indicates chondroitin having a molecular weight of 10 kDa.
＜参考例２＞分子量の測定
本実施例に記載したコンドロイチンまたはヘパロサンの分子量は、以下の条件に従ったゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量である。
Reference Example 2 Measurement of Molecular Weight The molecular weight of chondroitin or heparosan described in this example is a weight average molecular weight measured by gel filtration chromatography under the following conditions.
分子量の測定は、カラムとしてUltrahydrogel Linear（内径：7.8mm×長さ：300mm、Waters社製）を用い、カラム温度を４０℃に設定して行った。移動相には０．２Ｍ ＮａＣｌを用い、流速は０．６ｍＬ／ｍｉｎとした。検出は示差屈折率検出器により行い、１ｍｇ／ｍＬに溶解した試料を１００μＬアプライして得られるピークの保持時間から較正曲線を用いて分子量を算出した。標準物質としてプルラン（昭和電工社製）を用いた測定を行い、マークホーインク補正を行って較正曲線を作成した。マークホーインク補正は、ＨＰＬＣシステム（島津製作所社製）に付属のソフトウェアを用いて行った。 The molecular weight was measured by using Ultrahydrogel Linear (inner diameter: 7.8 mm × length: 300 mm, manufactured by Waters) as a column and setting the column temperature to 40 ° C. The mobile phase used was 0.2 M NaCl, and the flow rate was 0.6 mL / min. Detection was performed by a differential refractive index detector, and the molecular weight was calculated from the retention time of the peak obtained by applying 100 μL of a sample dissolved at 1 mg / mL using a calibration curve. The measurement was performed using pullulan (manufactured by Showa Denko KK) as a standard substance, and the calibration curve was created by performing Markhoink correction. Mark Hoink correction was performed using software attached to an HPLC system (manufactured by Shimadzu Corporation).
＜実施例３＞本実施例で使用するリンカー
本実施例では、前記構造式（Ｘ１）〜（Ｘ２６）に示されるリンカーを使用した。これらのリンカーは、下記の通りに入手した。
（１）AMAS（Ｘ１）およびSulfo-SMPB（Ｘ２４）は、Thermo scientific社から入手した
。
（２）BMPS（Ｘ２）、SBA（Ｘ１０）、SIA（Ｘ１２）、SPDP（Ｘ１４）、HDA（Ｘ１８）
、BAMB（Ｘ２２）、およびBAMC（Ｘ２６）は、東京化成工業社から入手した。
（３）Sulfo-GMBS（Ｘ３）、Sulfo-EMCS（Ｘ４）、Sulfo-HMCS（Ｘ５）、Sulfo-KMUS（Ｘ６）、DTBSU（Ｘ１５）、AHT（Ｘ１９）、およびAUDT（Ｘ２０）は、同仁化学研究所から入手した。
（４）Sulfo-LMDS（Ｘ７）は、アミノドデカン酸のアミノ基をマレイミド化した後、カルボキシ基に対してsulfo-NHS（N-hydroxysulfosuccinimide）を導入して調製した。
（５）Sulfo-NMTS（Ｘ８）は、１４−アミノテトラデカン酸のカルボキシ基に対してsulfo-NHSを導入して調製した。１４−アミノテトラデカン酸は、フタルイミドと１−ブロモ
−１２−ドデカノールを光延反応でＮ−（１２−ドデシル）フタルイミドとした後、マロン酸エステルと反応させ、酸加水分解とそれにつづく脱炭酸反応により１４−フタルイミドテトラデカン酸とし、フタルイミドを分解して調製した。
（６）Sulfo-OMHS（Ｘ９）は、１６−ブロモヘキサデカン酸とアジ化ナトリウムを反応させて１６−アジドヘキサデカン酸とした後、接触還元でアジド基をアミノ基に変換して１６−アミノヘキサデカン酸とした。その後、カルボキシ基に対してsulfo-NHSを導入して
調製した。
（７）Sulfo-SBAX（Ｘ１１）は、SBA（Ｘ１０）のＮＨＳ基とアミノドデカン酸のアミノ
基を反応させて１２−[（２−ブロモアセチル）アミノ]ドデカン酸を調製した後、カルボキシ基に対してsulfo-NHSを導入して調製した。
（８）SIAX（Ｘ１３）は、Molecular BioScience社から入手した。
（９）EDA（Ｘ１６）、AET（Ｘ１７）、およびDDDA（Ｘ２１）は、和光純薬工業社から入手した。
（１０）Sulfo-MBS（Ｘ２３）、およびSulfo-SMCC（Ｘ２５）は、ProtoChem社より入手した。
<Example 3> Linker used in this example In this example, the linkers represented by the structural formulas (X1) to (X26) were used. These linkers were obtained as follows.
(1) AMAS (X1) and Sulfo-SMPB (X24) were obtained from Thermo scientific.
(2) BMPS (X2), SBA (X10), SIA (X12), SPDP (X14), HDA (X18)
, BAMB (X22), and BAMC (X26) were obtained from Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
(3) Sulfo-GMBS (X3), Sulfo-EMCS (X4), Sulfo-HMCS (X5), Sulfo-KMUS (X6), DTBSU (X15), AHT (X19), and AUDT (X20) are Dojin Chemical Obtained from the laboratory.
(4) Sulfo-LMDS (X7) was prepared by maleimidating the amino group of aminododecanoic acid and introducing sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) to the carboxy group.
(5) Sulfo-NMTS (X8) was prepared by introducing sulfo-NHS to the carboxy group of 14-aminotetradecanoic acid. 14-aminotetradecanoic acid is obtained by converting phthalimide and 1-bromo-12-dodecanol into N- (12-dodecyl) phthalimide by Mitsunobu reaction, then reacting with malonic ester, acid hydrolysis and subsequent decarboxylation reaction. -Prepared by decomposing phthalimide with phthalimide tetradecanoic acid.
(6) Sulfo-OMHS (X9) is obtained by reacting 16-bromohexadecanoic acid with sodium azide to form 16-azidohexadecanoic acid, and then converting the azide group to an amino group by catalytic reduction to obtain 16-aminohexadecanoic acid. And Thereafter, sulfo-NHS was introduced into the carboxy group to prepare the compound.
(7) Sulfo-SBAX (X11) reacts the NHS group of SBA (X10) with the amino group of aminododecanoic acid to prepare 12-[(2-bromoacetyl) amino] dodecanoic acid, On the other hand, it was prepared by introducing sulfo-NHS.
(8) SIAX (X13) was obtained from Molecular BioScience.
(9) EDA (X16), AET (X17), and DDDA (X21) were obtained from Wako Pure Chemical Industries.
(10) Sulfo-MBS (X23) and Sulfo-SMCC (X25) were obtained from ProtoChem.
＜実施例４＞還元末端にアミノ基を導入したグリコサミノグリカンの調製
グリコサミノグリカン（以下、「ＧＡＧ」ともいう。）の還元末端へのアミノ基の導入は、ジアミノリンカー（EDA、HDA、DDDA、BAMB、またはBAMC）、アンモニア、またはアン
モニウム塩を用い、還元的アミノ化反応により行った。還元末端にアミノ基を導入したグリコサミノグリカンの誘導体を、以下、総称して「ＧＡＧ−ＮＨ２」ともいう。
<Example 4> Preparation of glycosaminoglycan having amino group introduced at reducing end Amino group was introduced at the reducing end of glycosaminoglycan (hereinafter, also referred to as "GAG") by diamino linker (EDA, HDA). , DDDA, BAMB, or BAMC), ammonia, or ammonium salts by reductive amination. Glycosaminoglycan derivatives having an amino group introduced at the reducing end are hereinafter also collectively referred to as “GAG-NH 2 ”.
（１）還元末端にＥＤＡを導入したＣＨ１０（ＣＨ１０−ＥＤＡ）の調製
２００ｍｇのＣＨ１０に２８．５ｍＬのＥＤＡ溶液（３２ｍＬの注射用水（ＷＦＩ）と１ｍＬのＥＤＡを混合した後、５Ｍ ＨＣｌを添加してｐＨ７．３に調整した水溶液、以下同じ）を添加して２時間撹拌した。その後、ＥＤＡ溶液の１／２容量のＮａＢＨ３ＣＮ水溶液（１８ｍＬのＷＦＩに９００ｍｇのＮａＢＨ３ＣＮを溶解させた溶液、以下同じ）を混合し、４２℃で１６時間撹拌した。この溶液に終濃度で３％（ｗ／ｖ）となるように酢酸ナトリウムを添加して３０分間撹拌し、終濃度で７５％（ｖ／ｖ）となるようにエタノールを添加して３０分間撹拌した後、この溶液を遠心して上清を除去した。このようにして得た沈殿物をＷＦＩに溶解した後、陽イオン交換カラム（Diaion PK220（三菱化学社製）、直径：17mm×長さ：170mm）を素通りさせた。回収した溶液をＮａＯＨで中和し、
透析により脱塩した後、凍結乾燥した。このようにして１５４ｍｇのＣＨ１０−ＥＤＡを得た。
(1) Preparation of CH10 (CH10-EDA) with EDA introduced at the reducing end 28.5 mL of EDA solution (32 mL of water for injection (WFI) and 1 mL of EDA were mixed with 200 mg of CH10, and then 5 M HCl was added. Aqueous solution adjusted to pH 7.3, the same applies hereinafter) and stirred for 2 hours. Thereafter, a 1/2 volume of an aqueous solution of NaBH 3 CN (a solution of 900 mg of NaBH 3 CN dissolved in 18 mL of WFI, the same applies hereinafter) of the EDA solution was mixed and stirred at 42 ° C. for 16 hours. To this solution was added sodium acetate to a final concentration of 3% (w / v) and stirred for 30 minutes, and ethanol was added to a final concentration of 75% (v / v) and stirred for 30 minutes. After that, the solution was centrifuged to remove the supernatant. After dissolving the precipitate thus obtained in WFI, the precipitate was passed through a cation exchange column (Diaion PK220 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), diameter: 17 mm × length: 170 mm). Neutralize the recovered solution with NaOH,
After desalting by dialysis, it was freeze-dried. Thus, 154 mg of CH10-EDA was obtained.
（２）還元末端にＥＤＡを導入したＣＨ２０（ＣＨ２０−ＥＤＡ）の調製
８２．９ｍｇのＣＨ２０に５．２ｍＬのＥＤＡ溶液を添加して１．５時間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして７３．０ｍｇのＣＨ２０−ＥＤＡを得た。
(2) Preparation of CH20 (CH20-EDA) with EDA introduced at the reducing end 5.2 mL of EDA solution was added to 82.9 mg of CH20 and stirred for 1.5 hours. Thereafter, the same operation as in the above (1) was performed. Thus, 73.0 mg of CH20-EDA was obtained.
（３）還元末端にＥＤＡを導入したＣＨ３０（ＣＨ３０−ＥＤＡ）の調製
８２．６ｍｇのＣＨ３０に３．５ｍＬのＥＤＡ溶液を添加して１．５時間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして７８．７ｍｇのＣＨ３０−ＥＤＡを得た。
(3) Preparation of CH30 (CH30-EDA) with EDA introduced at the reducing end 3.5 mL of EDA solution was added to 82.6 mg of CH30 and stirred for 1.5 hours. Thereafter, the same operation as in the above (1) was performed. Thus, 78.7 mg of CH30-EDA was obtained.
（４）還元末端にＥＤＡを導入したＣＨ４０（ＣＨ４０−ＥＤＡ）の調製
２００ｍｇのＣＨ４０に３．３３ｍＬのＷＦＩと６．６６ｍＬのＥＤＡ希釈液（３２ｍＬのＷＦＩと１ｍＬのＥＤＡを混合した溶液、以下同じ）を添加して３０分間撹拌した後、４７２μＬの５Ｍ ＨＣｌを添加して３０分間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして１６７ｍｇのＣＨ４０−ＥＤＡを得た。
(4) Preparation of CH40 (CH40-EDA) in which EDA was introduced at the reducing end: 200 mg of CH40, 3.33 mL of WFI and 6.66 mL of EDA diluent (a solution obtained by mixing 32 mL of WFI and 1 mL of EDA; the same applies hereinafter) ) Was added and stirred for 30 minutes, and then 472 μL of 5M HCl was added and stirred for 30 minutes. Thereafter, the same operation as in the above (1) was performed. Thus, 167 mg of CH40-EDA was obtained.
（５）還元末端にＥＤＡを導入したＣＨ７０（ＣＨ７０−ＥＤＡ）の調製
１ｇのＣＨ７０に８．３５ｍＬのＷＦＩと１６．７ｍＬのＥＤＡ希釈液を添加して３０分間撹拌した後、２．２５ｍＬの５Ｍ ＨＣｌを添加して４０分間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして７７７ｍｇのＣＨ７０−ＥＤＡを得た。
(5) Preparation of CH70 (CH70-EDA) with EDA introduced at the reducing end 8.35 mL of WFI and 16.7 mL of EDA diluent were added to 1 g of CH70, stirred for 30 minutes, and then 2.25 mL of 5M HCl was added and stirred for 40 minutes. Thereafter, the same operation as in the above (1) was performed. Thus, 777 mg of CH70-EDA was obtained.
（６）還元末端にＥＤＡを導入したＣＨ９０（ＣＨ９０−ＥＤＡ）の調製
３００ｍｇのＣＨ９０に１．９ｍＬのＷＦＩと３．８ｍＬのＥＤＡ希釈液を添加して３０分間撹拌した後、５４０μＬの５Ｍ ＨＣｌを添加して１５分間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして２７６ｍｇのＣＨ９０−ＥＤＡを得た。
(6) Preparation of CH90 (CH90-EDA) with EDA introduced at the reducing end 1.9 mL of WFI and 3.8 mL of EDA diluent were added to 300 mg of CH90, stirred for 30 minutes, and then 540 μL of 5 M HCl was added. Added and stirred for 15 minutes. Thereafter, the same operation as in the above (1) was performed. Thus, 276 mg of CH90-EDA was obtained.
（７）還元末端にＥＤＡを導入したＣＨ１４０（ＣＨ１４０−ＥＤＡ）の調製
３００ｍｇのＣＨ１４０に１．６４ｍＬのＷＦＩと３．２８ｍＬのＥＤＡ希釈液を添加して４０分間撹拌した後、４５０μＬの５Ｍ ＨＣｌを添加して３０分間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして２８２ｍｇのＣＨ１４０−ＥＤＡを得た。
(7) Preparation of CH140 (CH140-EDA) with EDA introduced at the reducing end To 300 mg of CH140, 1.64 mL of WFI and 3.28 mL of an EDA diluent were added, stirred for 40 minutes, and then 450 μL of 5 M HCl was added. Added and stirred for 30 minutes. Thereafter, the same operation as in the above (1) was performed. Thus, 282 mg of CH140-EDA was obtained.
（８）還元末端にＥＤＡを導入したＨＰＮ５０（ＨＰＮ５０−ＥＤＡ）の調製
３０ｍｇのＨＰＮ５０に０．５ｍＬのＷＦＩと１．０ｍＬのＥＤＡ希釈液を添加して３
０分間撹拌した後、７１μＬの５Ｍ ＨＣｌを添加して３０分間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして２９．５ｍｇのＨＰＮ５０−ＥＤＡを得た。
(8) Preparation of HPN50 in which EDA was introduced into the reducing end (HPN50-EDA) 0.5 mL of WFI and 1.0 mL of EDA diluent were added to 30 mg of HPN50, and 3
After stirring for 0 minutes, 71 μL of 5M HCl was added and stirred for 30 minutes. Thereafter, the same operation as in the above (1) was performed. Thus, 29.5 mg of HPN50-EDA was obtained.
（９）還元末端にＨＤＡを導入したＣＨ７０（ＣＨ７０−ＨＤＡ）の調製
３０２ｍｇのＣＨ７０に２．５ｍＬのＷＦＩと５．０ｍＬのＨＤＡ溶液（６．５５ｍＬのＷＦＩに２０５ｍｇのＨＤＡを溶解させた後、５Ｍ ＨＣｌを添加してｐＨ８．６に調整した溶液）を添加して１時間撹拌した。その後、ＨＤＡ溶液の１／２容量のＮａＢＨ３ＣＮ水溶液を混合し、４２℃で１６時間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして２５２ｍｇのＣＨ７０−ＨＤＡを得た。
(9) Preparation of CH70 (HD70-HDA) with HDA introduced at the reducing end 2.5 mL of WFI and 5.0 mL of HDA solution in 302 mg of CH70 (205 mg of HDA was dissolved in 6.55 mL of WFI, A solution adjusted to pH 8.6 by adding 5M HCl) was added thereto, followed by stirring for 1 hour. Thereafter, a 1/2 volume of an aqueous solution of NaBH 3 CN of the HDA solution was mixed and stirred at 42 ° C. for 16 hours. Thereafter, the same operation as in the above (1) was performed. Thus, 252 mg of CH70-HDA was obtained.
（１０）還元末端にＨＤＡを導入したＣＨ１４０（ＣＨ１４０−ＨＤＡ）の調製
３０５ｍｇのＣＨ１４０に１．６４ｍＬのＷＦＩと３．２８ｍＬのＨＤＡ水溶液（３．８４ｍＬのＷＦＩに１２０ｍｇのＨＤＡを溶解させた溶液）を添加して４０分間撹拌した後、４５０μＬの５Ｍ ＨＣｌを添加して３０分間撹拌した。その後、ＨＤＡ水溶液の１／２容量のＮａＢＨ３ＣＮ水溶液を混合し、４２℃で１６時間撹拌した。以後、上記（９）と同じ操作を行った。このようにして２７６ｍｇのＣＨ１４０−ＨＤＡを得た。
(10) Preparation of CH140 (HD140-HDA) with HDA introduced at the reducing end 1.64 mL WFI and 3.28 mL HDA aqueous solution in 305 mg CH140 (solution obtained by dissolving 120 mg HDA in 3.84 mL WFI) Was added and stirred for 40 minutes, and then 450 μL of 5M HCl was added and stirred for 30 minutes. Thereafter, a half volume of an aqueous solution of HDA was mixed with an aqueous solution of NaBH 3 CN, and the mixture was stirred at 42 ° C. for 16 hours. Thereafter, the same operation as in the above (9) was performed. Thus, 276 mg of CH140-HDA was obtained.
（１１）還元末端にＤＤＤＡを導入したＣＨ９０（ＣＨ９０−ＤＤＤＡ）の調製
２００ｍｇのＣＨ９０に１．２７ｍＬのＷＦＩと２．５４ｍＬのＤＤＤＡ溶液（５．０ｍＬの５０％エタノールに２００ｍｇのＤＤＤＡを溶解させた溶液）を添加して２５分間撹拌した後、３６０μＬの５Ｍ ＨＣｌを添加して７５分間撹拌した。その後、ＤＤＤＡ溶液の１／２容量のＮａＢＨ３ＣＮ水溶液を混合し、４２℃で１６時間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして１７１ｍｇのＣＨ９０−ＤＤＤＡを得た。
(11) Preparation of CH90 (DD90-DDDA) having DDDA introduced at its reducing end 1.27 mL of WFI and 2.54 mL of DDDA solution were dissolved in 200 mg of CH90 (200 mg of DDDA was dissolved in 5.0 mL of 50% ethanol). Solution) and stirred for 25 minutes, then 360 μL of 5M HCl was added and stirred for 75 minutes. Thereafter, a 1/2 volume of an aqueous solution of NaBH 3 CN of the DDDA solution was mixed and stirred at 42 ° C. for 16 hours. Thereafter, the same operation as in the above (1) was performed. Thus, 171 mg of CH90-DDDA was obtained.
（１２）還元末端にＢＡＭＢを導入したＣＨ７０（ＣＨ７０−ＢＡＭＢ）の調製
２０４ｍｇのＣＨ７０に１．７１ｍＬのＷＦＩと３．４１ｍＬのＢＡＭＢ溶液（４．８ｍＬのＷＦＩに１５０ｍｇのＢＡＭＢを溶解させた後、５Ｍ ＨＣｌを添加してｐＨ８．４に調整した溶液、以下同じ）を添加して４０分間撹拌した。その後、ＢＡＭＢ溶液の１／２容量のＮａＢＨ３ＣＮ水溶液を混合し、４２℃で１６時間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして１３５ｍｇのＣＨ７０−ＢＡＭＢを得た。
(12) Preparation of CH70 (CH70-BAMB) with BAMB introduced at the reducing end 1.71 mL of WFI and 3.41 mL of BAMB solution in 204 mg of CH70 (150 mg of BAMB was dissolved in 4.8 mL of WFI, A solution adjusted to pH 8.4 by adding 5M HCl, the same applies hereinafter) was added thereto, followed by stirring for 40 minutes. Thereafter, a 1/2 volume of an aqueous solution of NaBH 3 CN of the BAMB solution was mixed and stirred at 42 ° C. for 16 hours. Thereafter, the same operation as in the above (1) was performed. Thus, 135 mg of CH70-BAMB was obtained.
（１３）還元末端にＢＡＭＢを導入したＣＨ１４０（ＣＨ１４０−ＢＡＭＢ）の調製
３００ｍｇのＣＨ１４０に１．６４ｍＬのＷＦＩと３．２７ｍＬのＢＡＭＢ溶液を添加して６０分間撹拌した。以後、上記（１２）と同じ操作を行った。このようにして２５８ｍｇのＣＨ１４０−ＢＡＭＢを得た。
(13) Preparation of CH140 (CH140-BAMB) Introducing BAMB at the Reducing Terminal To 300 mg of CH140, 1.64 mL of WFI and 3.27 mL of BAMB solution were added and stirred for 60 minutes. Thereafter, the same operation as in the above (12) was performed. Thus, 258 mg of CH140-BAMB was obtained.
（１４）還元末端にＢＡＭＣを導入したＣＨ７０（ＣＨ７０−ＢＡＭＣ）の調製
３０３ｍｇのＣＨ７０に２．５ｍＬのＷＦＩと５．０ｍＬのＢＡＭＣ溶液（８．８４ｍＬのＷＦＩに２７６ｍｇのＢＡＭＣを溶解させた後、５Ｍ ＨＣｌを添加してｐＨ８．１に調整した溶液、以下同じ）を添加して１時間撹拌した。その後、ＢＡＭＣ溶液の１／２容量のＮａＢＨ３ＣＮ水溶液を混合し、４２℃で１６時間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして２４２ｍｇのＣＨ７０−ＢＡＭＣを得た。
(14) Preparation of CH70 (CH70-BAMC) with BAMC introduced at the reducing end 2.5 mL of WFI and 5.0 mL of BAMC solution in 303 mg of CH70 (after dissolving 276 mg of BAMC in 8.84 mL of WFI, A solution adjusted to pH 8.1 by adding 5M HCl, and the same hereinafter) was added thereto, followed by stirring for 1 hour. Then, a 1/2 volume of an aqueous solution of NaBH 3 CN of the BAMC solution was mixed and stirred at 42 ° C. for 16 hours. Thereafter, the same operation as in the above (1) was performed. Thus, 242 mg of CH70-BAMC was obtained.
（１５）還元末端にＢＡＭＣを導入したＣＨ１４０（ＣＨ１４０−ＢＡＭＣ）の調製
３００ｍｇのＣＨ１４０に１．６４ｍＬのＷＦＩと３．２７ｍＬのＢＡＭＣ溶液を添加して１時間撹拌した。以後、上記（１４）と同じ操作を行った。このようにして２５９ｍｇのＣＨ１４０−ＢＡＭＣを得た。
(15) Preparation of CH140 (CH140-BAMC) with BAMC introduced at the reducing end 1.64 mL of WFI and 3.27 mL of BAMC solution were added to 300 mg of CH140, followed by stirring for 1 hour. Thereafter, the same operation as in the above (14) was performed. Thus, 259 mg of CH140-BAMC was obtained.
（１６）還元末端にアミノ基を導入したＣＨ７０（ＣＨ７０−ＮＨ２）の調製
３０７ｍｇのＣＨ７０に２．５ｍＬのＷＦＩと５．０ｍＬのＮＨ４ＨＣＯ３水溶液（６．４ｍＬのＷＦＩに４００ｍｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶解させた溶液、以下同じ）を添加して２０分間撹拌した後、６８９μＬの５Ｍ ＨＣｌを添加して３５分間撹拌した。その後、ＮＨ４ＨＣＯ３水溶液の１／２容量のＮａＢＨ３ＣＮ水溶液を混合し、４２℃で１６時間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして２３６ｍｇのＣＨ７０−ＮＨ２を得た。
(16) CH70 was introduced amino group at the reducing end (CH70-NH 2) NH 4 HCO 3 solution (NH in WFI in 6.4mL of 400 mg 4 of CH70 in 2.5mL of WFI and 5.0mL of preparation 307mg of A solution in which HCO 3 was dissolved, the same applies hereinafter) was added, and the mixture was stirred for 20 minutes. Then, 689 μL of 5 M HCl was added, and the mixture was stirred for 35 minutes. Thereafter, a half volume of an aqueous solution of NH 4 HCO 3 and an aqueous solution of NaBH 3 CN were mixed, and the mixture was stirred at 42 ° C. for 16 hours. Thereafter, the same operation as in the above (1) was performed. It was obtained CH70-NH 2 of 236mg this way.
（１７）還元末端にアミノ基を導入したＣＨ１４０（ＣＨ１４０−ＮＨ２）の調製（１）
２０ｍｇのＣＨ１４０に１０９μＬのＷＦＩと２１８μＬのＮＨ４ＨＣＯ３水溶液を添加して１５分間撹拌した後、３０μＬの５Ｍ ＨＣｌを添加して２０分間撹拌した。以後、上記（１６）と同じ操作を行った。このようにして２１．１ｍｇのＣＨ１４０−ＮＨ２を得た。
(17) Preparation of CH140 (CH140-NH 2 ) having an amino group introduced at the reducing end (1)
To 20 mg of CH140, 109 μL of WFI and 218 μL of an aqueous solution of NH 4 HCO 3 were added and stirred for 15 minutes, and then 30 μL of 5M HCl was added and stirred for 20 minutes. Thereafter, the same operation as in the above (16) was performed. It was obtained CH140-NH 2 of 21.1mg this way.
（１８）還元末端にアミノ基を導入したＣＨ１４０（ＣＨ１４０−ＮＨ２）の調製（２）
２０ｍｇのＣＨ１４０に１０９μＬのＷＦＩと１０９μＬのアンモニア希釈液（０．３ｍＬのＷＦＩと０．１ｍＬの２８％アンモニア水を混合した溶液）を添加して１時間撹拌した後、３０μＬの５Ｍ ＨＣｌを添加して４５分間撹拌した。その後、アンモニア希釈液と等量のＮａＢＨ３ＣＮ水溶液を混合し、４２℃で１６時間撹拌した。以後、上記（１６）と同じ操作を行った。このようにして２１．１ｍｇのＣＨ１４０−ＮＨ２を得た。
(18) Preparation of CH140 (CH140-NH 2 ) having an amino group introduced at the reducing end (2)
To 20 mg of CH140, 109 μL of WFI and 109 μL of an ammonia diluent (a solution obtained by mixing 0.3 mL of WFI and 0.1 mL of 28% aqueous ammonia) were added, and the mixture was stirred for 1 hour. And stirred for 45 minutes. Thereafter, an ammonia diluent and an equal amount of an aqueous solution of NaBH 3 CN were mixed and stirred at 42 ° C. for 16 hours. Thereafter, the same operation as in the above (16) was performed. It was obtained CH140-NH 2 of 21.1mg this way.
＜実施例５＞還元末端にチオール基を導入したグリコサミノグリカンの調製
グリコサミノグリカンの還元末端へのチオール基の導入は、二価性架橋試薬（AET、AHT、AUDT、SPDP、またはDTBSU）を用いて行った。還元末端にチオール基を導入したグリコ
サミノグリカンの誘導体を、以下、総称して「ＧＡＧ−ＳＨ」ともいう。
<Example 5> Preparation of glycosaminoglycan in which thiol group was introduced into reducing terminal Introduction of thiol group into reducing terminal of glycosaminoglycan was performed by using a divalent crosslinking reagent (AET, AHT, AUDT, SPDP, or DTBSU). ). The glycosaminoglycan derivative having a thiol group introduced at the reducing end is hereinafter also referred to as "GAG-SH".
（１）還元末端にＡＥＴを導入したＣＨ７０（ＣＨ７０−ＡＥＴ）の調製
５０ｍｇのＣＨ７０に０．４２ｍＬのＡＥＴ溶液（３ｍＬのＷＦＩに１１７ｍｇのＡＥＴを溶解させた溶液、以下同じ）を添加して３０分間撹拌した。その後、ＡＥＴ溶液の１／２容量のＮａＢＨ３ＣＮ水溶液を混合し、４２℃で１６時間撹拌した。以後、前記実施例４（１）と同じ操作を行った。このようにして３８ｍｇのＣＨ７０−ＡＥＴを得た。
(1) Preparation of CH70 (CH70-AET) having AET introduced at the reducing end 0.42 mL of an AET solution (a solution in which 117 mg of AET was dissolved in 3 mL of WFI, the same applies hereinafter) was added to 50 mg of CH70. Stirred for minutes. Thereafter, a 1/2 volume of an aqueous solution of NaBH 3 CN of the AET solution was mixed and stirred at 42 ° C. for 16 hours. Thereafter, the same operation as in Example 4 (1) was performed. Thus, 38 mg of CH70-AET was obtained.
（２）還元末端にＡＥＴを導入したＣＨ９０（ＣＨ９０−ＡＥＴ）の調製
１００ｍｇのＣＨ９０に０．８４ｍＬのＡＥＴ溶液を添加して３０分間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして１０３ｍｇのＣＨ９０−ＡＥＴを得た。
(2) Preparation of CH90 (CH90-AET) with AET introduced at the reducing end 0.84 mL of an AET solution was added to 100 mg of CH90, followed by stirring for 30 minutes. Thereafter, the same operation as in the above (1) was performed. Thus, 103 mg of CH90-AET was obtained.
（３）還元末端にＡＨＴを導入したＣＨ４０（ＣＨ４０−ＡＨＴ）の調製
５１３ｍｇのＣＨ４０に１１．５ｍＬのＡＨＴ溶液（１２．９ｍＬのＷＦＩに５０５ｍｇのＡＨＴを溶解させた溶液、以下同じ）を添加して３０分間撹拌した。その後、ＡＨＴ溶液の１／２容量のＮａＢＨ３ＣＮ水溶液を混合し、４２℃で１６時間撹拌した。以後、前記実施例４（１）と同じ操作を行った。このようにして４４７ｍｇのＣＨ４０−ＡＨＴを得た。
(3) Preparation of CH40 (CH40-AHT) having AHT introduced at the reducing end 11.5 mL of an AHT solution (a solution of 505 mg of AHT dissolved in 12.9 mL of WFI, the same applies hereinafter) was added to 513 mg of CH40. And stirred for 30 minutes. Thereafter, a 1/2 volume of an aqueous solution of AHT solution of NaBH 3 CN was mixed and stirred at 42 ° C. for 16 hours. Thereafter, the same operation as in Example 4 (1) was performed. Thus, 447 mg of CH40-AHT was obtained.
（４）還元末端にＡＨＴを導入したＣＨ７０（ＣＨ７０−ＡＨＴ）の調製
５０ｍｇのＣＨ７０に０．４２ｍＬのＡＨＴ溶液を添加して３０分間撹拌した。以後、上記（３）と同じ操作を行った。このようにして３０ｍｇのＣＨ７０−ＡＨＴを得た。
(4) Preparation of CH70 (CH70-AHT) with AHT introduced at the reducing end 0.42 mL of AHT solution was added to 50 mg of CH70 and stirred for 30 minutes. Thereafter, the same operation as in the above (3) was performed. Thus, 30 mg of CH70-AHT was obtained.
（５）還元末端にＡＨＴを導入したＣＨ９０（ＣＨ９０−ＡＨＴ）の調製
１００ｍｇのＣＨ９０に０．８４ｍＬのＡＨＴ溶液を添加して３０分間撹拌した。以後、上記（３）と同じ操作を行った。このようにして９３．２ｍｇのＣＨ９０−ＡＨＴを得
た。
(5) Preparation of CH90 (CH90-AHT) with AHT introduced at the reducing end 0.84 mL of the AHT solution was added to 100 mg of CH90 and stirred for 30 minutes. Thereafter, the same operation as in the above (3) was performed. Thus, 93.2 mg of CH90-AHT was obtained.
（６）還元末端にＡＵＤＴを導入したＣＨ９０（ＣＨ９０−ＡＵＤＴ）の調製
５０ｍｇのＣＨ９０に０．５ｍＬのＡＵＤＴ溶液（０．６８ｍＬの５０％エタノールに３７．４ｍｇのＡＵＤＴを溶解させた溶液）を添加して３０分間撹拌した。その後、ＡＵＤＴ溶液の１／２容量のＮａＢＨ３ＣＮ水溶液を混合し、４２℃で１６時間撹拌した。以後、前記実施例４（１）と同じ操作を行った。このようにして５０ｍｇのＣＨ９０−ＡＵＤＴを得た。
(6) Preparation of CH90 (CH90-AUDT) with AUDT introduced at the reducing end 0.5 mL of AUDT solution (solution of 37.4 mg of AUDT in 0.68 mL of 50% ethanol) was added to 50 mg of CH90. And stirred for 30 minutes. Thereafter, a 1/2 volume of an aqueous solution of NaBH 3 CN of the AUDT solution was mixed and stirred at 42 ° C. for 16 hours. Thereafter, the same operation as in Example 4 (1) was performed. Thus, 50 mg of CH90-AUDT was obtained.
（７）還元末端にＳＰＤＰを導入したグリコサミノグリカンの調製
３０ｍｇのＧＡＧ−ＮＨ２（CH70-NH2、CH30-EDA、CH40-EDA、CH70-EDA、HPN50-EDA、CH70-HDA、CH30-DDDA、CH90-DDDA、CH70-BAMB、またはCH70-BAMC）を５０％Ｎ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド（ＤＭＦ）７５０μＬに溶解した後、０．５Ｍ Ｂｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．３）９０μＬと２０ｍＭ ＳＰＤＰ溶液１５０μＬを添加して反応溶液を調製し、遮光して室温で１時間撹拌した。続いて４ｍｇのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加して室温で１時間撹拌し、ピリジルジチオ基をチオール基に還元してpropanoyl-SH基（−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＳＨ）を生成させた。その後、反応溶液５００μＬと０．１Ｍギ酸アンモニウム１ｍＬを混合した溶液を脱塩カラム（Hi Trap Desalting G-25、ＧＥヘルスケア社製）（３５ｍＬ）にアプライした。移動相として０．１Ｍギ酸アンモニウムを用い、グリコサミノグリカンを含む溶出画分を回収した後、凍結乾燥した。このようにして、還元末端にチオール基を導入したグリコサミノグリカン（CH70-NH2-propanoyl-SH、CH30-EDA-propanoyl-SH、CH40-EDA-propanoyl-SH、CH70-EDA-propanoyl-SH、HPN50-EDA-propanoyl-SH、CH70-HDA-propanoyl-SH、CH70-BAMB-propanoyl-SH、CH70-BAMC-propanoyl-SH、CH30-DDDA-propanoyl-SH、およびCH90-DDDA-propanoyl-SH）を得た。
(7) GAG-NH 2 Preparation 30mg of glycosaminoglycan was introduced SPDP at the reducing end (CH70-NH 2, CH30- EDA, CH40-EDA, CH70-EDA, HPN50-EDA, CH70-HDA, CH30- DDDA, CH90-DDDA, CH70-BAMB, or CH70-BAMC) was dissolved in 750 μL of 50% N, N-dimethylformamide (DMF), and then 90 μL of 0.5 M Bicine-NaOH (pH 8.3) and 150 μL of a 20 mM SPDP solution. Was added to prepare a reaction solution, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour while protecting from light. Subsequently, 4 mg of dithiothreitol (DTT) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The pyridyldithio group was reduced to a thiol group to generate a propanoyl-SH group (—CO— (CH 2 ) 2 —SH). Was. Thereafter, a solution obtained by mixing 500 μL of the reaction solution and 1 mL of 0.1 M ammonium formate was applied to a desalting column (Hi Trap Desalting G-25, manufactured by GE Healthcare) (35 mL). Using 0.1 M ammonium formate as a mobile phase, an elution fraction containing glycosaminoglycan was collected, and then lyophilized. Thus, glycosaminoglycans having a thiol group introduced at the reducing end (CH70-NH 2 -propanoyl-SH, CH30-EDA-propanoyl-SH, CH40-EDA-propanoyl-SH, CH70-EDA-propanoyl-SH , HPN50-EDA-propanoyl-SH, CH70-HDA-propanoyl-SH, CH70-BAMB-propanoyl-SH, CH70-BAMC-propanoyl-SH, CH30-DDDA-propanoyl-SH, and CH90-DDDA-propanoyl-SH Got.
（８）還元末端にＤＴＢＳＵを導入したＣＨ７０の調製
１００ｍｇのCH70-EDAを５０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２．５ｍＬに溶解した後、０．５Ｍ Ｂｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．３）０．３ｍＬとジチオスレイトール（ＤＴＴ）２９ｍｇを添加して反応溶液を調製し、遮光して室温で１時間撹拌した。続いて７ｍＭ ＤＴＢＳＵ溶液０．６ｍＬとＤＭＦ ２ｍＬを添加して室温で２時間撹拌し、ジチオ基をチオール基に還元してundecanoyl-SH基（−ＣＯ−（ＣＨ２）１０−
ＳＨ）を生成させた。その後、反応溶液と蒸留水２ｍＬを混合した溶液を等分し、それぞれ０．１Ｍギ酸アンモニウム０．７５ｍＬと混合した。この溶液を遠心（２０，０００×ｇ、１０分間）し、上清を回収した。回収した上清を脱塩カラム（Hi Trap Desalting G-25）（３５ｍＬ）にアプライした。移動相として０．１Ｍギ酸アンモニウムを用い、グリコサミノグリカンを含む溶出画分を回収した後、凍結乾燥した。このようにして、還元末端にチオール基を導入したコンドロイチン（CH70-EDA-undecanoyl-SH）を得た。
(8) Preparation of CH70 with DTBSU introduced at the reducing
SH). Thereafter, a solution obtained by mixing the reaction solution and 2 mL of distilled water was equally divided, and each was mixed with 0.75 mL of 0.1 M ammonium formate. This solution was centrifuged (20,000 × g, 10 minutes), and the supernatant was collected. The collected supernatant was applied to a desalting column (Hi Trap Desalting G-25) (35 mL). Using 0.1 M ammonium formate as a mobile phase, an elution fraction containing glycosaminoglycan was collected, and then lyophilized. Thus, chondroitin (CH70-EDA-undecanoyl-SH) having a thiol group introduced at the reducing end was obtained.
＜実施例６＞還元末端にマレイミド基を導入したグリコサミノグリカンの調製
グリコサミノグリカンの還元末端へのマレイミド基の導入は、二価性架橋試薬（AMAS、BMPS、Sulfo-GMBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-HMCS、Sulfo-KMUS、Sulfo-LMDS、Sulfo-NMTS、Sulfo-OMHS、Sulfo-SMCC、Sulfo-MBS、またはSulfo-SMPB）を用いて行った。二価性架橋試
薬は、ＤＭＦに溶解した溶液（以下「二価性架橋試薬溶液」という。）を用いた。還元末端にマレイミド基を導入したグリコサミノグリカンの誘導体を、以下、総称して「ＧＡＧ−Ｍａｌ」ともいう。
<Example 6> Preparation of glycosaminoglycan having maleimide group introduced at reducing end Introduction of a maleimide group at the reducing end of glycosaminoglycan was performed using a divalent crosslinking reagent (AMAS, BMPS, Sulfo-GMBS, Sulfo- EMCS, Sulfo-HMCS, Sulfo-KMUS, Sulfo-LMDS, Sulfo-NMTS, Sulfo-OMHS, Sulfo-SMCC, Sulfo-MBS, or Sulfo-SMPB). As the bivalent crosslinking reagent, a solution dissolved in DMF (hereinafter, referred to as “bivalent crosslinking reagent solution”) was used. Glycosaminoglycan derivatives having a maleimide group introduced at the reducing end are hereinafter also collectively referred to as "GAG-Mal".
２０ｍｇのＧＡＧ−ＮＨ２（CH70-NH2、CH10-EDA、CH20-EDA、CH30-EDA、CH40-EDA、CH70-EDA、CH90-EDA、CH140-EDA、HPN50-EDA、CH70-HDA、CH140-HDA、CH90-DDDA、CH70-BAMB、CH140-BAMB、CH70-BAMC、またはCH140-BAMC）を５０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５００μＬに溶解した後、０．５Ｍ Ｂｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．３）
６０μＬと１０ｍＭ二価性架橋試薬溶液１２０μＬを添加して反応溶液を調製し、遮光して室温で１時間撹拌した。その後、反応溶液３４０μＬと０．１Ｍギ酸アンモニウム１．２５ｍＬを混合した溶液を脱塩カラム（Hi Trap Desalting G-25）（３５ｍＬ）にアプライした。移動相として０．１Ｍギ酸アンモニウムを用い、グリコサミノグリカンを含む溶出画分を回収した後、凍結乾燥した。このようにして、還元末端にマレイミド基を導入したグリコサミノグリカン（CH70-NH2-BMPS、CH70-NH2-KMUS、CH10-EDA-KMUS、CH20-EDA-KMUS、CH30-EDA-KMUS、CH40-EDA-BMPS、CH40-EDA-KMUS、CH40-EDA-NMTS、CH40-EDA-OMHS、CH70-EDA-AMAS、CH70-EDA-BMPS、CH70-EDA-GMBS、CH70-EDA-EMCS、CH70-EDA-HMCS、CH70-EDA-KMUS、CH70-EDA-LMDS、CH70-EDA-SMCC、CH70-EDA-MBS、CH70-EDA-SMPB、CH90-EDA-KMUS、CH90-EDA-LMDS、CH140-EDA-AMAS、CH140-EDA-GMBS、CH140-EDA-EMCS、CH140-EDA-HMCS、CH140-EDA-KMUS、CH140-EDA-LMDS、HPN50-EDA-BMPS、HPN50-EDA-LMDS、CH70-HDA-GMBS
、CH70-HDA-EMCS、CH70-HDA-HMCS、CH70-HDA-KMUS、CH140-HDA-BMPS、CH140-HDA-KMUS、CH90-DDDA-BMPS、CH90-DDDA-EMCS、CH70-BAMB-AMAS、CH70-BAMB-GMBS、CH70-BAMB-EMCS、CH70-BAMB-HMCS、CH70-BAMB-KMUS、CH70-BAMB-LMDS、CH70-BAMB-SMCC、CH70-BAMB-MBS、CH70-BAMB-SMPB、CH140-BAMB-AMAS、CH140-BAMB-BMPS、CH140-BAMB-EMCS、CH140-BAMB-HMCS、CH140-BAMB-KMUS、CH140-BAMB-LMDS、CH70-BAMC-GMBS、CH70-BAMC-EMCS、CH70-BAMC-HMCS、CH70-BAMC-KMUS、CH70-BAMC-LMDS、CH140-BAMC-BMPS、CH140-BAMC-KMUS、およびCH140-BAMC-LMDS）を得た。
20mg GAG-NH 2 (CH70- NH 2 in, CH10-EDA, CH20-EDA , CH30-EDA, CH40-EDA, CH70-EDA, CH90-EDA, CH140-EDA, HPN50-EDA, CH70-HDA, CH140- HDA, CH90-DDDA, CH70-BAMB, CH140-BAMB, CH70-BAMC, or CH140-BAMC) is dissolved in 500 μL of 50% N, N-dimethylformamide (DMF), and then 0.5M Bicine-NaOH (
A reaction solution was prepared by adding 60 μL and 120 μL of a 10 mM bivalent crosslinking reagent solution, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour while shielding light. Thereafter, a solution obtained by mixing 340 μL of the reaction solution and 1.25 mL of 0.1 M ammonium formate was applied to a desalting column (Hi Trap Desalting G-25) (35 mL). Using 0.1 M ammonium formate as a mobile phase, an elution fraction containing glycosaminoglycan was collected, and then lyophilized. In this way, glycosaminoglycans obtained by introducing a maleimide group at the reducing end (CH70-NH 2 -BMPS, CH70 -NH 2 -KMUS, CH10-EDA-KMUS, CH20-EDA-KMUS, CH30-EDA-KMUS, CH40-EDA-BMPS, CH40-EDA-KMUS, CH40-EDA-NMTS, CH40-EDA-OMHS, CH70-EDA-AMAS, CH70-EDA-BMPS, CH70-EDA-GMBS, CH70-EDA-EMCS, CH70- EDA-HMCS, CH70-EDA-KMUS, CH70-EDA-LMDS, CH70-EDA-SMCC, CH70-EDA-MBS, CH70-EDA-SMPB, CH90-EDA-KMUS, CH90-EDA-LMDS, CH140-EDA- AMAS, CH140-EDA-GMBS, CH140-EDA-EMCS, CH140-EDA-HMCS, CH140-EDA-KMUS, CH140-EDA-LMDS, HPN50-EDA-BMPS, HPN50-EDA-LMDS, CH70-HDA-GMBS
, CH70-HDA-EMCS, CH70-HDA-HMCS, CH70-HDA-KMUS, CH140-HDA-BMPS, CH140-HDA-KMUS, CH90-DDDA-BMPS, CH90-DDDA-EMCS, CH70-BAMB-AMAS, CH70 -BAMB-GMBS, CH70-BAMB-EMCS, CH70-BAMB-HMCS, CH70-BAMB-KMUS, CH70-BAMB-LMDS, CH70-BAMB-SMCC, CH70-BAMB-MBS, CH70-BAMB-SMPB, CH140-BAMB -AMAS, CH140-BAMB-BMPS, CH140-BAMB-EMCS, CH140-BAMB-HMCS, CH140-BAMB-KMUS, CH140-BAMB-LMDS, CH70-BAMC-GMBS, CH70-BAMC-EMCS, CH70-BAMC-HMCS , CH70-BAMC-KMUS, CH70-BAMC-LMDS, CH140-BAMC-BMPS, CH140-BAMC-KMUS, and CH140-BAMC-LMDS).
＜実施例７＞還元末端にハロアセチル基を導入したグリコサミノグリカンの調製
グリコサミノグリカンの還元末端へのハロアセチル基の導入は、二価性架橋試薬（SBA
、Sulfo-SBAX、SIA、SIAX）を用いて行った。還元末端にハロアセチル基を導入したグリ
コサミノグリカンの誘導体を、以下、総称して「ＧＡＧ−Ｈａｌ」ともいう。
<Example 7> Preparation of glycosaminoglycan having haloacetyl group introduced at reducing end The introduction of haloacetyl group at the reducing end of glycosaminoglycan was carried out using a divalent crosslinking reagent (SBA
, Sulfo-SBAX, SIA, SIAX). Glycosaminoglycan derivatives having a haloacetyl group introduced at the reducing end are hereinafter also collectively referred to as "GAG-Hal".
ＧＡＧ−ＮＨ２としてCH70-NH2、CH70-EDA、CH140-EDA、CH90-DDDA、CH70-BAMB、また
はCH140-BAMCを用い、上記二価性架橋試薬を用いて、前記実施例６と同じ操作を行った。このようにして、還元末端にハロアセチル基を導入したグリコサミノグリカン（CH70-NH2-SBA、CH70-NH2-SBAX、CH70-EDA-SBA、CH70-EDA-SBAX、CH70-EDA-SIA、CH140-EDA-SBA、CH140-EDA-SIAX、CH90-DDDA-SBA、CH90-DDDA-SIAX、CH70-BAMB-SBAX、およびCH140-BAMC-SBA）を得た。
CH70-NH 2 as GAG-NH 2, CH70-EDA , CH140-EDA, CH90-DDDA, CH70-BAMB or using CH140-BAMC,, by using the bifunctional cross-linking reagents, the same operation as in Example 6 Was done. In this way, glycosaminoglycans obtained by introducing a haloacetyl group on the reducing end (CH70-NH 2 -SBA, CH70 -NH 2 -SBAX, CH70-EDA-SBA, CH70-EDA-SBAX, CH70-EDA-SIA, CH140-EDA-SBA, CH140-EDA-SIAX, CH90-DDDA-SBA, CH90-DDDA-SIAX, CH70-BAMB-SBAX, and CH140-BAMC-SBA).
＜実施例８＞本実施例で使用するペプチド
本実施例では、ペプチドとして、下記のＧＬＰ−１ペプチドおよびインスリンを使用した。これらのペプチドは、下記の通りに入手した。
・ＧＬＰ−１Ｃ（配列番号２）；北海道システムサイエンス社またはスクラム社から入手した。
・ＧＬＰ−１ＲＫ（配列番号３）；スクラム社から入手した。
・ＧＬＰ−１ｏｒｉＣ（配列番号４）；スクラム社から入手した。
・インスリン（配列番号５、配列番号６）；サーモフィッシャーサイエンティフィック社から入手した。
<Example 8> Peptides used in this example In this example, the following GLP-1 peptide and insulin were used as peptides. These peptides were obtained as follows.
GLP-1C (SEQ ID NO: 2); obtained from Hokkaido System Science or Scrum.
-GLP-1RK (SEQ ID NO: 3); obtained from Scrum.
GLP-1 oriC (SEQ ID NO: 4); obtained from Scrum.
Insulin (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6); obtained from Thermo Fisher Scientific.
＜実施例９＞リジン残基にマレイミド基を有するリンカーを導入したＧＬＰ−１ＲＫ誘導体の調製
ＧＬＰ−１ＲＫ水溶液（０．６μｍｏｌ（２ｍｇ）のＧＬＰ−１ＲＫを０．６ｍＬのＷＦＩに溶解して１ｍＭに調整した溶液）に４．１μＬの０．７２Ｎトリエチルアミン、１００ｍＭ二価性架橋試薬溶液（sulfo-EMCSにおいては１２μＬ（２当量）、BMPS、sulfo-HMCS、およびsulfo-KMUSにおいては１５μＬ（２．５当量）または１８μＬ（３当量）、sulfo-LMDS、SBA、およびSPDPにおいては２１μＬ（３．５当量））を添加して反応溶液
を調製し、室温で１〜２時間撹拌した。その後、この反応溶液と１．２ｍＬの０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／８０％アセトニトリル、４．８ｍＬの０．１％ ＴＦＡを順
に混合して遠心（２０，０００×ｇ、１０分間）し、上清を逆相カラム（Capcell Pak、
内径：10mm×全長：250mm、資生堂社製）にアプライした。移動相には溶媒Ａ（０．１％
ＴＦＡ）と溶媒Ｂ（０．１％ ＴＦＡ／８０％ ＭｅＣＮ）を用いた。溶離はリニアグラジエントにより行い、分析開始から５分後までの間は溶媒Ｂの割合を３０％で維持し、５分後から３０分後までの間に溶媒Ｂの割合を３０％から７０％に変化させた。流速は４ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃とした。二価性架橋試薬とＧＬＰ−１ＲＫの複合体を含む溶出画分を回収した後、凍結乾燥した。このようにして、ＧＬＰ−１ＲＫ誘導体（マレイミド基を有するリンカーをリジン残基に結合させた構造を有する、ＧＬＰ−１ＲＫの誘導体）を得た。
Example 9 Preparation of GLP-1RK Derivative Introducing Linker Having Maleimide Group at Lysine Residue GLP-1RK aqueous solution (0.6 μmol (2 mg) of GLP-1RK dissolved in 0.6 mL WFI to 1 mM 4.1 μL of 0.72N triethylamine, 12 mM (2 equivalents for sulfo-EMCS), 15 μL (2.5 equivalents for BMPS, sulfo-HMCS and sulfo-KMUS) in 100 μl of a bifunctional crosslinking reagent solution. The reaction solution was prepared by adding 18 μL (3 equivalents) or 21 μL (3.5 equivalents) of sulfo-LMDS, SBA, and SPDP, and stirred at room temperature for 1 to 2 hours. Thereafter, the reaction solution was mixed with 1.2 mL of 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) / 80% acetonitrile and 4.8 mL of 0.1% TFA in this order, and centrifuged (20,000 × g, 10 minutes). And the supernatant is subjected to a reverse phase column (Capcell Pak,
Inner diameter: 10 mm x full length: 250 mm, manufactured by Shiseido Co.) Solvent A (0.1%
TFA) and solvent B (0.1% TFA / 80% MeCN). Elution was performed by a linear gradient, and the ratio of the solvent B was maintained at 30% from 5 minutes after the start of the analysis, and from 30% to 70% from 5 minutes to 30 minutes. Changed. The flow rate was 4 mL / min, and the column temperature was 40 ° C. The eluted fraction containing the complex of the bivalent crosslinking reagent and GLP-1RK was collected and lyophilized. Thus, a GLP-1RK derivative (a GLP-1RK derivative having a structure in which a linker having a maleimide group is bonded to a lysine residue) was obtained.
＜実施例１０＞マレイミド基を有するリンカーを導入したインスリン誘導体の調製
インスリン溶液（インスリンをＤＭＳＯに溶解して１ｍＭに調整した溶液）４００μＬに２００μＬの４ｍＭトリエチルアミン、１０ｍＭ二価性架橋試薬溶液（BMPS、EMCS、Sulfo-EMCS、またはKMUSを５０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた溶液）４０〜６０μＬを添加して反応溶液を調製し、室温で１時間撹拌した。続いて、この溶液と０．１％ ＴＦＡを混合して全量を８〜１０ｍＬとした後に遠心（２０，０００×ｇ、１０分間）し、上清を逆相カラム（Capcell Pak、内径：20mm×全長：250mm、資生堂社製）にアプライした。移動相には溶媒Ａ（０．１％ ＴＦＡ）と溶媒Ｂ（０．１％ ＴＦＡ／８０％ ＭｅＣＮ）を用いた。溶離はリニアグラジエントにより行った。二価性架橋試薬としてBMPSを用いた場合は、分析開始後または１分後からの２０分間で溶媒Ｂの割合を４０％から４５％に変化させた。二価性架橋試薬としてEMCSまたはSulfo-EMCSを用いた場合は、分析開始後または１分後からの２５分間で溶媒Ｂの割合を４２％から４８．２％に変化させた。二価性架橋試薬としてKMUSを用いた場合は、分析開始後からの２０分間で溶媒Ｂの割合を４０％から８０％に変化させた。流速は８ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃とした。このようにしてインスリンＡ鎖のα−アミノ基（Ｎ末のアミノ基）にリンカーが導入されたインスリン誘導体、インスリンＢ鎖のε−アミノ基（リジン残基のアミノ基）にリンカーが導入されたインスリン誘導体、それらの両方にリンカーが導入されたインスリン誘導体をそれぞれ分取して回収した後、凍結乾燥した。このようにして、インスリン誘導体（マレイミド基を有するリンカーを導入した、インスリンの誘導体）を得た。
Example 10 Preparation of Insulin Derivative Introducing Linker Having
＜実施例１１＞グリコサミノグリカンとＧＬＰ−１を含む複合体のアゴニスト活性の測定
以下の実施例においては、グリコサミノグリカンとＧＬＰ−１を含む複合体（以下、「ＧＡＧ／ＧＬＰ−１複合体」ともいう。）を調製し、以下の手順でそのアゴニスト活性を測定した。
<Example 11> Measurement of agonist activity of complex containing glycosaminoglycan and GLP-1 In the following examples, a complex containing glycosaminoglycan and GLP-1 (hereinafter referred to as "GAG / GLP-1") was used. A complex was also prepared, and its agonist activity was measured by the following procedure.
すなわち、ＧＡＧ／ＧＬＰ−１複合体のアゴニスト活性は、RIN-m5F細胞（ATCC CRL-11605）を用い、細胞内のcAMP濃度を指標として測定した。RIN-m5F細胞は、American Type Culture Collection（ATCC）から入手した。細胞内のcAMP濃度はcAMP-Glo Max Assay kit（プロメガ社製）を用いて測定した。 That is, the agonist activity of the GAG / GLP-1 complex was measured using RIN-m5F cells (ATCC CRL-11605) using the intracellular cAMP concentration as an index. RIN-m5F cells were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC). The intracellular cAMP concentration was measured using a cAMP-Glo Max Assay kit (promega).
RIN-m5F細胞を９６ウェルプレートに４×１０４cells/wellとなるように播種した。温
度３７℃かつＣＯ２濃度５％の条件下（以下、「培養条件下」ともいう）で１６時間静置して細胞をプレートに接着させた後、培地を血清不含培地に交換した。培養条件下で６時間静置した後、培地を０．５ｍＭ ＩＢＭＸ（3-isobutyl-1-methylxanthine）／０．１
ｍＭ Ｒｏ−２０−１７２４を含有する血清不含培地に交換し、更に培養条件下で１５分間静置した。各ウェルに被験物質（０．０６ｎＭ〜６００ｎＭに調製したＧＡＧ／ＧＬＰ−１複合体の溶液）を２０μＬ添加し、培養条件下で１０分間静置した後、各ウェルにcAMP Detection Solutionを１０μＬ添加し、室温に２０分間静置した。その後、各ウェル
にKinase-Glo Reagentを５０μＬ添加し、室温に１０分間静置した後、マルチプレートリ
ーダー（2030 ARVO X5、パーキンエルマー社製）を用いて発光強度を測定した。
RIN-m5F cells were seeded in a 96-well plate at 4 × 10 4 cells / well. After allowing the cells to adhere to the plate by allowing them to stand for 16 hours at a temperature of 37 ° C. and a CO 2 concentration of 5% (hereinafter also referred to as “culture conditions”), the medium was replaced with a serum-free medium. After allowing to stand for 6 hours under culture conditions, the medium was diluted with 0.5 mM IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine) /0.1
The medium was replaced with a serum-free medium containing mM Ro-20-1724, and further left still for 15 minutes under culture conditions. To each well, 20 μL of a test substance (a solution of a GAG / GLP-1 complex prepared at 0.06 nM to 600 nM) was added, and the mixture was allowed to stand under culture conditions for 10 minutes. Then, 10 μL of cAMP Detection Solution was added to each well. And allowed to stand at room temperature for 20 minutes. Thereafter, 50 μL of Kinase-Glo Reagent was added to each well, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes, and then the luminescence intensity was measured using a multiplate reader (2030 ARVO X5, manufactured by PerkinElmer).
各濃度の被験物質を添加した場合の発光強度の値からブランク（溶媒のみを添加した場合の発光強度）の値を減じて算出した測定値に基づき、解析用ソフトウェア（Origin ver.9.1、OriginLab Corporation社製）を用いて、Ｘ軸を被験物質の濃度、Ｙ軸を測定値と
したドットプロットからシグモイド曲線を作成した。このシグモイド曲線を４−パラメーターロジスティック曲線に回帰してＥＣ５０（ｎＭ）を算出した。
Analysis software (Origin ver.9.1, OriginLab Corporation) based on the measurement value calculated by subtracting the value of the blank (the emission intensity when only the solvent was added) from the emission intensity when the test substance at each concentration was added A sigmoid curve was created from a dot plot in which the X-axis was the concentration of the test substance and the Y-axis was the measured value. The sigmoid curve was regressed to a 4-parameter logistic curve to calculate EC 50 (nM).
＜実施例１２＞グリコサミノグリカンとインスリンを含む複合体のアゴニスト活性の測定
以下の実施例においては、グリコサミノグリカンとインスリンを含む複合体（以下、「ＧＡＧ／インスリン複合体」ともいう。）を調製し、以下の手順でそのアゴニスト活性を測定した。
<Example 12> Measurement of agonist activity of complex containing glycosaminoglycan and insulin In the following examples, a complex containing glycosaminoglycan and insulin (hereinafter, also referred to as "GAG / insulin complex"). ) Was prepared, and its agonist activity was measured by the following procedure.
すなわち、ＧＡＧ／インスリン複合体のアゴニスト活性は、3T3-L1 MBX細胞（ATCC CRL-3242）を用い、細胞内に取り込まれた［1-14C］2-deoxy-D-glucose（2-DG）の放射活性
を指標として測定した。3T3-L1 MBX細胞はAmerican Type Culture Collection （ATCC）
から、［1-14C］2-DGは日本アイソトープ協会から、それぞれ入手した。
That, GAG / agonist activity of insulin complexes with 3T3-L1 MBX cells (ATCC CRL-3242), was incorporated into the cells [1- 14 C] 2-deoxy -D-glucose (2-DG) Was measured as an index. 3T3-L1 MBX cells are from the American Type Culture Collection (ATCC)
And [1- 14 C] 2-DG were obtained from the Japan Isotope Association, respectively.
3T3-L1 MBX細胞を９６ウェルプレートに２×１０４cells/wellとなるように播種した。培養条件下で４日間静置培養した後、培地を分化培地Ａ（１０％ ＦＢＳ、１μｇ／ｍＬ
ヒト組換えインスリン（アニマルフリー）、０．５ｍＭ イソブチルメチルキサンチン、０．４μｇ／ｍＬ デキサメタゾン、２μＭ ロシグリタゾンを含むように調製したDMEM high glucose（ギブコ社製）培地）に交換した。さらに培養条件下で２日間または３
日間静置培養した後、培地を分化培地Ｂ（１０％ ＦＢＳ、１μｇ／ｍＬ ヒト組換えインスリン（アニマルフリー）を含むように調製したDMEM high glucose培地）に交換した
。さらに培養条件下で２日間または３日間静置培養した後、培地を血清含有培地（１０％
ＦＢＳを含むように調製した、DMEM high glucose培地）に交換した。以後、培養条件
下で７日間〜２１日間静置培養した。このようにして得た細胞を以後の試験に用いた。
3T3-L1 MBX cells were seeded in a 96-well plate at 2 × 10 4 cells / well. After static culturing for 4 days under culture conditions, the culture medium was changed to differentiation medium A (10% FBS, 1 μg / mL).
The medium was replaced with a DMEM high glucose (manufactured by Gibco) medium prepared to contain human recombinant insulin (animal free), 0.5 mM isobutylmethylxanthine, 0.4 μg / mL dexamethasone, and 2 μM rosiglitazone. 2 days or 3 days under culture conditions
After static culturing for one day, the medium was changed to a differentiation medium B (DMEM high glucose medium prepared to contain 10% FBS, 1 μg / mL human recombinant insulin (animal free)). Furthermore, after culturing the cells for 2 or 3 days under culture conditions, the medium was changed to a serum-containing medium (10%
(DMEM high glucose medium prepared to contain FBS). Thereafter, the cultivation was allowed to stand for 7 to 21 days under culture conditions. The cells thus obtained were used for further tests.
培地を血清不含培地に交換し、培養条件下で一晩静置した後、培地を被験物質含有溶液（０．００１〜１００００ｎＭのＧＡＧ／インスリン複合体、０．３％ ＢＳＡを含むように調製したDMEM培地）１００μＬに置換した。培養条件下で１時間静置した後、０．１ｍＭ（５μＣｉ／ｍＬ）の［1-14C］2-DGを２０μＬ添加し、培養条件下で３０分間静置
した。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．２Ｎ ＮａＯＨを１００μＬ添加し、３７℃で３０分間静置した。ピペッティングにより懸濁した溶液をバイアルに回収し、エコシンチＸＲ（桑和貿易社製）を３ｍＬ添加して混合した後、液体シンチレーションカウンター（Tri-Carb 2910、パーキンエルマー社製）を用いて放射活性を測定した。
After replacing the medium with a serum-free medium and allowing the medium to stand overnight under culture conditions, the medium was prepared to contain a test substance-containing solution (0.001 to 10000 nM GAG / insulin complex, containing 0.3% BSA). DMEM medium) (100 μL). After standing 1 hour under culture conditions, and 20μL added [1- 14 C] 2-DG of 0.1mM (5μCi / mL), allowed to stand for 30 minutes in culture conditions. After washing three times with PBS, 100 μL of 0.2N NaOH was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes. The suspended solution was collected into a vial by pipetting, 3 mL of Eco-Scinti XR (manufactured by Kuwawa Trading Co., Ltd.) was added and mixed, and then radioactivity was measured using a liquid scintillation counter (Tri-Carb 2910, manufactured by Perkin Elmer). Was measured.
解析用ソフトウェア（Origin ver.9.1）を用いて、Ｘ軸を被験物質の濃度、Ｙ軸を１分間あたりの放射線計測回数（ｃｐｍ）としたドットプロットからシグモイド曲線を作成した。このシグモイド曲線を４−パラメーターロジスティック曲線に回帰してＥＣ５０（ｎＭ）を算出した。 Using analysis software (Origin ver. 9.1), a sigmoid curve was created from a dot plot in which the X axis was the concentration of the test substance and the Y axis was the number of radiation measurements per minute (cpm). The sigmoid curve was regressed to a 4-parameter logistic curve to calculate EC 50 (nM).
＜実施例１３＞ＧＡＧ／ＧＬＰ−１複合体の血中半減期の測定
以下の実施例においては、ＧＡＧ／ＧＬＰ−１複合体を調製し、以下の手順でその血中半減期を測定した。
<Example 13> Measurement of blood half-life of GAG / GLP-1 complex In the following examples, a GAG / GLP-1 complex was prepared and its blood half-life was measured by the following procedure.
すなわち、被験物質（ＧＡＧ／ＧＬＰ−１複合体）を３００ｎｍｏｌ／ｋｇ（ＧＬＰ−１の重量として１ｍｇ／ｋｇ）の用量で雄のＩＣＲマウス（１群につき３匹）に尾静脈注射した。投与後０〜１４４時間の各時点で採血し、回収した血液を遠心分離して血漿を得
た。
That is, a test substance (GAG / GLP-1 complex) was injected into male ICR mice (3 mice per group) via the tail vein at a dose of 300 nmol / kg (1 mg / kg as the weight of GLP-1). Blood was collected at each time point from 0 to 144 hours after administration, and the collected blood was centrifuged to obtain plasma.
ＧＡＧ／ＧＬＰ−１複合体の血中半減期（Ｔ１／２）は、血漿中の活性型ＧＬＰ−１の濃度を測定し、これを指標として算出した。当該濃度の測定にはGlucagon-Like Peptide-1 (Active) ELISA Kit（Merck Millipore社製）を用い、キットに添付のプロトコールに
従った操作を行って測定を実施した。血中半減期の算出にはPhoenix WinNonlin（サター
ラ合同会社）を用い、各個体の最終測定時点から３時点以上の測定データについてモデル非依存的解析を行って算出した。
The blood half-life (T1 / 2) of the GAG / GLP-1 complex was calculated by measuring the concentration of active GLP-1 in plasma and using this as an index. The concentration was measured using a Glucagon-Like Peptide-1 (Active) ELISA Kit (manufactured by Merck Millipore) according to the protocol attached to the kit. The blood half-life was calculated using Phoenix WinNonlin (Satara GK), and a model-independent analysis was performed on measurement data at three or more times from the final measurement time of each individual.
＜実施例１４＞ＧＡＧ／インスリン複合体の血中半減期の測定
以下の実施例においては、ＧＡＧ／インスリン複合体を調製し、以下の手順でその血中半減期を測定した。
<Example 14> Measurement of blood half-life of GAG / insulin complex In the following examples, a GAG / insulin complex was prepared and its blood half-life was measured by the following procedure.
すなわち、被験物質（ＧＡＧ／インスリン複合体）を３４０ｎｍｏｌ／ｋｇ（インスリンの重量として２ｍｇ／ｋｇ）または１００ｎｍｏｌ／ｋｇ（インスリンの重量として０．５８ｍｇ／ｋｇ）の用量で雄のＩＣＲマウス（１群につき３匹）に尾静脈注射した。投与後０〜４８時間の各時点で採血し、回収した血液を遠心分離して血清を得た。 That is, a test substance (GAG / insulin complex) was administered at a dose of 340 nmol / kg (2 mg / kg as the weight of insulin) or 100 nmol / kg (0.58 mg / kg as the weight of insulin) in male ICR mice (per group). 3) were injected via the tail vein. Blood was collected at each time point from 0 to 48 hours after administration, and the collected blood was centrifuged to obtain serum.
ＧＡＧ／インスリン複合体の血中半減期（Ｔ１／２）は、血清中のインスリン濃度を測定し、これを指標として算出した。当該濃度の測定はサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行った。測定プレートとしてはYK060 Insulin ELISAキット（矢内原研究所製）に添付され
たプレートを用いた。測定対象がＣＨ／インスリンである場合は、検出用プローブとしてはビオチン標識ヒアルロン酸結合タンパク質（生化学工業社製）を、標識試薬としてはＨＲＰ標識ストレプトアビジンを、それぞれ用いた。測定対象がＨＰＮ／インスリンである場合は、検出用プローブとして抗ヘパロサン抗体（ＮＡＨ４６、生化学工業社製）を、標識試薬としてはＨＲＰ標識抗マウスＩｇＭ＋ＩｇＧ＋ＩｇＡ（Ｈ＋Ｌ）抗体（メルクミリポア社製）を、それぞれ用いた。血中半減期の算出にはPhoenix WinNonlinを用い、各個
体の最終測定時点から３時点以上の測定データについてモデル非依存的解析を行って算出した。
The blood half-life (T1 / 2) of the GAG / insulin complex was calculated by measuring the insulin concentration in serum and using this as an index. The measurement of the concentration was performed by a sandwich ELISA method. As a measurement plate, a plate attached to a YK060 Insulin ELISA kit (manufactured by Yanaihara Laboratory) was used. When the measurement target was CH / insulin, a biotin-labeled hyaluronic acid-binding protein (manufactured by Seikagaku Corporation) was used as the detection probe, and HRP-labeled streptavidin was used as the labeling reagent. When the measurement target is HPN / insulin, an anti-heparosan antibody (NAH46, manufactured by Seikagaku Corporation) is used as a detection probe, and an HRP-labeled anti-mouse IgM + IgG + IgA (H + L) antibody (manufactured by Merck Millipore) is used as a labeling reagent. Each was used. The blood half-life was calculated using Phoenix WinNonlin, and a model-independent analysis was performed on measurement data at three or more points from the last measurement point of each individual.
＜実施例１５＞コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（１）
２０ｍｇのＣＨ−Ｍａｌ（CH40-EDA-BMPS、CH40-EDA-KMUS、CH40-EDA-NMTS、CH40-EDA-OMHS、CH70-EDA-AMAS、CH70-EDA-BMPS、CH70-EDA-GMBS、CH70-EDA-EMCS、CH70-EDA-HMCS
、CH70-EDA-KMUS、CH70-EDA-LMDS、CH140-EDA-AMAS、CH140-EDA-GMBS、CH140-EDA-EMCS、CH140-EDA-HMCS、CH140-EDA-KMUS、またはCH140-EDA-LMDS）を蒸留水６５０μＬに溶解した後、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）３２５μＬ、０．５Ｍ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．９）８１μＬ、ＧＬＰ−１Ｃ溶液（ＧＬＰ−１Ｃを１０ｍｇ／ｍＬとなるようにＤＭＦに溶解した溶液）８１μＬを添加して反応溶液を調製し、遮光して室温で一晩（１６時間）撹拌した。その後、この反応溶液と０．１％ ＴＦＡ ７ｍＬを混合して遠心（２０，０００×ｇ、１０分間）し、上清を逆相カラム（DAISOGEL SP-120-5-ODS-BP、内径：20mm×全長：250mm、大阪ソーダ社製）にアプライした。移動相には溶媒Ａ（０．１％ ＴＦ
Ａ）と溶媒Ｂ（０．１％ ＴＦＡ／８０％ ＭｅＣＮ）を用いた。溶離はリニアグラジエントにより行い、分析開始から３０分後までの間に溶媒Ｂの割合を１０％から６０％に変化させた。流速は８ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃とした。ＣＨとＧＬＰ−１Ｃの複合体を含む溶出画分（保持時間２０分〜３０分のピーク画分）を回収した後、凍結乾燥した。このようにして、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体（リンカーを介してコンドロイチンをＣ末端のシステイン残基に結合させた構造を有する、コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体）を得た。
Example 15 Preparation of Complex of Chondroitin and GLP-1C, Measurement of Activity of the Complex and Retention in Blood (1)
20 mg of CH-Mal (CH40-EDA-BMPS, CH40-EDA-KMUS, CH40-EDA-NMTS, CH40-EDA-OMHS, CH70-EDA-AMAS, CH70-EDA-BMPS, CH70-EDA-GMBS, CH70- EDA-EMCS, CH70-EDA-HMCS
, CH70-EDA-KMUS, CH70-EDA-LMDS, CH140-EDA-AMAS, CH140-EDA-GMBS, CH140-EDA-EMCS, CH140-EDA-HMCS, CH140-EDA-KMUS, or CH140-EDA-LMDS) Was dissolved in 650 μL of distilled water, 325 μL of acetonitrile (MeCN), 81 μL of 0.5 M MOPS-NaOH (pH 6.9), and a GLP-1C solution (a solution in which GLP-1C was dissolved in DMF so as to have a concentration of 10 mg / mL). A reaction solution was prepared by adding 81 μL, and the mixture was stirred overnight (16 hours) at room temperature while protecting from light. Thereafter, 7 mL of this reaction solution and 7% of 0.1% TFA were mixed and centrifuged (20,000 × g, 10 minutes), and the supernatant was subjected to a reverse phase column (DAISOGEL SP-120-5-ODS-BP, inner diameter: 20 mm). × Overall length: 250 mm, manufactured by Osaka Soda Co.) Solvent A (0.1% TF
A) and solvent B (0.1% TFA / 80% MeCN) were used. Elution was performed by a linear gradient, and the ratio of solvent B was changed from 10% to 60% within 30 minutes after the start of analysis. The flow rate was 8 mL / min, and the column temperature was 40 ° C. The eluted fraction containing the complex of CH and GLP-1C (peak fraction with a retention time of 20 minutes to 30 minutes) was collected and freeze-dried. Thus, a CH / GLP-1C complex (a complex of chondroitin and GLP-1C having a structure in which chondroitin was bound to a C-terminal cysteine residue via a linker) was obtained.
上記により得たＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）を実施例１１に記載の方法に従って、また血中半減期（Ｔ１／２）を実施例１３に記載の方法に従って、それぞれ算出した。結果を表１に示す。 The agonist activity (EC 50 ) of the CH / GLP-1C complex obtained above was calculated according to the method described in Example 11, and the half-life in blood (T1 / 2) was calculated according to the method described in Example 13. did. Table 1 shows the results.
表１において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙは表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ１）に示される結合様式である。 In Table 1, the structures of the CH / GLP-1C complexes represented by IDs in the table are all represented by the general formula “GL 1 -YL 2 -P”, wherein G is represented in the table. represents chondroitin having a molecular weight, L 1 and L 2 represents a structure shown in each of Table, Y represents a bond represented in the tables, P is representative of the GLP-1C. In the general formula, the bonding mode between G and L 1 is the bonding mode shown in the structural formula (G1) or the bonding mode shown in the structural formula (G3), and the bonding mode between L 2 and P is Is a bonding mode represented by the structural formula (P1).
表１に示されるとおり、上記の一般式で示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体において、Ｌ２が（ＣＨ２）１０、（ＣＨ２）１１、または（ＣＨ２）１３で表されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体は、いずれも２０時間以上の血中半減期を有していた。これに対し、Ｌ２が（ＣＨ２）７で表されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の血中半減期は１０時間以下、Ｌ２が（ＣＨ２）１５で表されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の血中半減期は約１４時間であった。なお、ＧＬＰ−１そのものの血中半減期は２〜６分であることが知られている。 As shown in Table 1, in CH / GLP-1C complex represented by the above general formula, L 2 is (CH 2) 10, represented by (CH 2) 11 or (CH 2) 13, CH / Each of the GLP-1C complexes had a blood half-life of 20 hours or more. In contrast, the half-life in blood of the CH / GLP-1C complex in which L 2 is represented by (CH 2 ) 7 is 10 hours or less, and the CH / GLP-1C in which L 2 is represented by (CH 2 ) 15. The complex had a blood half-life of about 14 hours. It is known that GLP-1 itself has a blood half-life of 2 to 6 minutes.
＜参考例３＞コンドロイチンを有しないＧＬＰ−１Ｃ誘導体の調製、当該誘導体の活性と血中滞留性の測定
前記実施例で確認された血中滞留性の増強効果がリンカーのみでも奏される効果であるのかを確認するため、リンカーのみを有するＧＬＰ−１Ｃ誘導体を調製し、当該誘導体の活性と血中滞留性を測定した。
Reference Example 3 Preparation of GLP-1C Derivative without Chondroitin, Measurement of Activity of the Derivative and Retention in Blood The effect of enhancing the retention in blood confirmed in the above Examples was exhibited even with only the linker. In order to confirm whether or not there was, a GLP-1C derivative having only a linker was prepared, and the activity and blood retention of the derivative were measured.
１．３ｍｇのＧＬＰ−１Ｃを蒸留水３００μＬに溶解した後、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）２００μＬと１０ｍＭアルキル化試薬溶液（マレイミド基を有するＣ１６またはＣ１４のアルキル誘導体）１３０μＬを添加し、遮光して室温で４時間撹拌した。その後、この反応溶液１０５μＬ、溶媒Ｂ（０．１％ ＴＦＡ／８０％ ＭｅＣＮ）２００μＬ、溶媒Ａ（０．１％ ＴＦＡ）７００μＬを混合して遠心（２０，０００×ｇ、１０分間）し
、上清を逆相カラム（CAPCELLPAK、内径：10mm×全長：250mm、資生堂社製）にアプライ
した。移動相には溶媒Ａと溶媒Ｂを用いた。溶離はリニアグラジエントにより行い、分析開始から３０分後までの間に溶媒Ｂの割合を３０％から７０％に変化させた。流速は４ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃とした。ＧＬＰ−１Ｃの誘導体を含む溶出画分を回収した後、凍結乾燥した。このようにして、ＧＬＰ−１Ｃ誘導体（リンカーのみをＣ末端のシステイン残基に結合させた構造を有する、ＧＬＰ−１Ｃの誘導体）を得た。
After dissolving 1.3 mg of GLP-1C in 300 μL of distilled water, 200 μL of acetonitrile (MeCN) and 130 μL of a 10 mM alkylating reagent solution (an alkyl derivative of C16 or C14 having a maleimide group) are added, and protected from light at room temperature. Stirred for hours. Thereafter, 105 μL of this reaction solution, 200 μL of solvent B (0.1% TFA / 80% MeCN), and 700 μL of solvent A (0.1% TFA) were mixed and centrifuged (20,000 × g, 10 minutes). Kiyoshi was applied to a reversed-phase column (CAPCELLPAK, inner diameter: 10 mm × total length: 250 mm, manufactured by Shiseido Co., Ltd.). Solvent A and solvent B were used as mobile phases. Elution was performed by a linear gradient, and the proportion of solvent B was changed from 30% to 70% within 30 minutes after the start of analysis. The flow rate was 4 mL / min, and the column temperature was 40 ° C. The eluted fraction containing the derivative of GLP-1C was collected and freeze-dried. Thus, a GLP-1C derivative (a GLP-1C derivative having a structure in which only a linker is bonded to a C-terminal cysteine residue) was obtained.
上記により得たＧＬＰ−１Ｃ誘導体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）を実施例１１に記載の方法に従って算出した。その結果、Ｃ１６アルキルを導入したＧＬＰ−１Ｃ誘導体のＥＣ５０は３３．６ｎＭ、Ｃ１４アルキルを導入したＧＬＰ−１誘導体のＥＣ５０は９．２ｎＭであった。また、当該ＧＬＰ−１誘導体はどちらもマウスにおいて静脈投与２４時間後の血漿において検出限界以下であったため、血中半減期（Ｔ１／２）の算出はできなかった。すなわち、リンカーのみを有する（グリコサミノグリカンを有しない）ＧＬＰ−１はグリコサミノグリカンを有するＧＬＰ−１と比較して、極めて短い血中半減期（Ｔ１／２）を有することが示された。よって、前記実施例で確認された血中滞留性の増強効果はリンカーのみによって奏される効果ではなく、コンドロイチン等のグリコサミノグリカンとの組合せにによって奏される効果であることが示された。
The agonist activity (EC 50 ) of the GLP-1C derivative obtained as described above was calculated according to the method described in Example 11. Consequently, EC 50 of GLP-1C derivative obtained by introducing C16 alkyl 33.6 nm, EC 50 of GLP-1 derivative obtained by introducing C14 alkyl was 9.2 nM. In addition, since the GLP-1 derivative was below the detection limit in
＜実施例１６＞コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（２）
ＣＨ−ＭａｌとしてCH10-EDA-KMUS、CH20-EDA-KMUS、CH30-EDA-KMUS、CH40-EDA-KMUS、CH70-EDA-KMUS、またはCH140-EDA-KMUSを用いて前記実施例１５と同じ操作を行い、ＣＨ
／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表２に示す。
Example 16 Preparation of Complex of Chondroitin and GLP-1C, Measurement of Activity of the Complex and Retention in Blood (2)
Same operation as in Example 15 using CH10-EDA-KMUS, CH20-EDA-KMUS, CH30-EDA-KMUS, CH40-EDA-KMUS, CH70-EDA-KMUS, or CH140-EDA-KMUS as CH-Mal. And CH
/ GLP-1C complex was prepared, and the agonist activity (EC 50 ) and half-life in blood (T1 / 2) of the complex were calculated. Table 2 shows the results.
表２において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙは表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ１）に示される結合様式である。 In Table 2, the structures of the CH / GLP-1C complex represented by IDs in the table are all represented by the general formula “GL 1 -YL 2 -P”, wherein G is represented in the table. represents chondroitin having a molecular weight, L 1 and L 2 represents a structure shown in each of Table, Y represents a bond represented in the tables, P is representative of the GLP-1C. In the general formula, the bonding mode between G and L 1 is the bonding mode shown in the structural formula (G1) or the bonding mode shown in the structural formula (G3), and the bonding mode between L 2 and P is Is a bonding mode represented by the structural formula (P1).
表２に示されるとおり、上記の一般式で示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体において、ＣＨの分子量が１０ｋＤａの場合は、当該分子量が２０ｋＤａ以上の場合と比較して血中滞留性がやや劣ることが示された。一方、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体において、ＣＨの分子量が２０ｋＤａ以上の場合は、いずれの複合体も１９時間以上の血中半減期を有しており、良好な血中滞留性を示した。また、ＣＨの分子量が３０ｋＤａ〜７０ｋＤａの場合は、いずれの複合体も２１時間以上の血中半減期を有しており、より良好な血中滞留性を示した。さらに、ＣＨの分子量が３０ｋＤａの場合は、２４時間以上の血中半減期を有して
おり、特に良好な血中滞留性を示した。
As shown in Table 2, in the CH / GLP-1C complex represented by the above general formula, when CH has a molecular weight of 10 kDa, the retention in blood is slightly inferior to that in the case where the molecular weight is 20 kDa or more. It was shown. On the other hand, in the CH / GLP-1C complex, when the molecular weight of CH was 20 kDa or more, each of the complexes had a blood half-life of 19 hours or more, and showed good blood retention. When the molecular weight of CH was 30 kDa to 70 kDa, each of the complexes had a blood half-life of 21 hours or more, and showed better blood retention. Furthermore, when the molecular weight of CH was 30 kDa, it had a blood half-life of 24 hours or more, and showed particularly good blood retention.
＜実施例１７＞コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（３）
ＣＨ−ＭａｌとしてCH70-NH2-BMPSまたはCH70-NH2-KMUSを用いて前記実施例１５と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表３に示す。
<Example 17> Preparation of complex of chondroitin and GLP-1C, measurement of activity of the complex and retention in blood (3)
CH-Mal do the same as in Example 15 using CH70-NH 2 -BMPS or CH70-NH 2 -KMUS as, CH / GLP-1C Preparation of the complex, as well as agonist activity (EC 50 of the complex ) And half-life in blood (T1 / 2) were calculated. Table 3 shows the results.
表３において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｙ−Ｌ−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｙは表中に示される結合を表し、Ｌは表中に示される構造を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｙ間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ１）に示される結合様式である。 In Table 3, the structures of the CH / GLP-1C complexes represented by IDs in the table are all represented by the general formula “GYLP”, wherein G has a molecular weight shown in the table. Represents chondroitin, Y represents a bond shown in the table, L represents a structure shown in the table, and P represents GLP-1C. In the above general formula, the bonding mode between G and Y is the bonding mode shown in the structural formula (G1) or the bonding mode shown in the structural formula (G3). This is a bonding mode shown in Structural Formula (P1).
表３に示されるとおり、上記の一般式で示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体において、Ｌが（ＣＨ２）１０で表されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体は、２０時間以上の血中半減期を有していた。よって、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の血中滞留時間は、前記実施例１５においてＣＨとリンカーＬ２を結合するために用いられたリンカーＬ１の有無には依存せず、Ｌ２の構造、すなわちペプチドに結合させたリンカーの構造、に依存することが示唆された。 As shown in Table 3, in the CH / GLP-1C complex represented by the above general formula, the CH / GLP-1C complex in which L is represented by (CH 2 ) 10 has a half-life in blood of 20 hours or more. Had a period. Therefore, CH / GLP-1C residence time in blood of the complex, the the presence of a linker L 1 which is used to couple the CH and the linker L 2 in Example 15 independent, the structure of L 2, In other words, it was suggested that it depends on the structure of the linker bound to the peptide.
＜実施例１８＞コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（４）
ＣＨ−ＭａｌとしてCH70-HDA-GMBS、CH70-HDA-EMCS、CH70-HDA-HMCS、CH70-HDA-KMUS、CH140-HDA-BMPS、CH140-HDA-KMUS、CH90-DDDA-BMPS、またはCH90-DDDA-EMCSを用いて前記実施例１５と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表４に示す。
<Example 18> Preparation of complex of chondroitin and GLP-1C, measurement of activity of the complex and retention in blood (4)
CH-Mal as CH70-HDA-GMBS, CH70-HDA-EMCS, CH70-HDA-HMCS, CH70-HDA-KMUS, CH140-HDA-BMPS, CH140-HDA-KMUS, CH90-DDDA-BMPS, or CH90-DDDA The same operation as in Example 15 was performed using -EMCS to prepare a CH / GLP-1C complex, and calculate the agonist activity (EC 50 ) and half-life in blood (T1 / 2) of the complex. Was. Table 4 shows the results.
表４において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙは表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ１）に示される結合様式である。 In Table 4, the structures of the CH / GLP-1C complexes represented by IDs in the table are all represented by the general formula “GL 1 -YL 2 -P”, wherein G is represented in the table. represents chondroitin having a molecular weight, L 1 and L 2 represents a structure shown in each of Table, Y represents a bond represented in the tables, P is representative of the GLP-1C. In the general formula, the bonding mode between G and L 1 is the bonding mode shown in the structural formula (G1) or the bonding mode shown in the structural formula (G3), and the bonding mode between L 2 and P is Is a bonding mode represented by the structural formula (P1).
表４に示されるとおり、上記の一般式で示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体において、Ｌ２が（ＣＨ２）１０で表されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体は、いずれも２０時間以上の血中半減期を示した。よって、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の血中滞留時間は、前記実施例１５においてＣＨとリンカーＬ２を結合するために用いられたリンカーＬ１の構造には依存せず、Ｌ２の構造、すなわちペプチドに結合させたリンカーの構造、に依存することが示された。 As shown in Table 4, in the CH / GLP-1C complex represented by the above general formula, the CH / GLP-1C complex in which L 2 is represented by (CH 2 ) 10 is longer than 20 hours. It showed a half-life in blood. Therefore, CH / GLP-1C residence time in blood of the complex, the the structure of the linker L 1 which is used to couple the CH and the linker L 2 in Example 15 independent, the structure of L 2, That is, it was shown that it depends on the structure of the linker bound to the peptide.
＜実施例１９＞コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（５）
ＣＨ−ＭａｌとしてCH70-BAMB-AMAS、CH70-BAMB-GMBS、CH70-BAMB-EMCS、CH70-BAMB-HMCS、CH70-BAMB-KMUS、CH70-BAMB-LMDS、CH140-BAMB-AMAS、CH140-BAMB-BMPS、CH140-BAMB-EMCS、CH140-BAMB-HMCS、CH140-BAMB-KMUS、またはCH140-BAMB-LMDSを用いて前記実施例１５と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表５に示す。
<Example 19> Preparation of complex of chondroitin and GLP-1C, measurement of activity of the complex and retention in blood (5)
CH-Mal as CH70-BAMB-AMAS, CH70-BAMB-GMBS, CH70-BAMB-EMCS, CH70-BAMB-HMCS, CH70-BAMB-KMUS, CH70-BAMB-LMDS, CH140-BAMB-AMAS, CH140-BAMB- The same operation as in Example 15 was performed using BMPS, CH140-BAMB-EMCS, CH140-BAMB-HMCS, CH140-BAMB-KMUS, or CH140-BAMB-LMDS to prepare a CH / GLP-1C complex, and The agonist activity (EC 50 ) and half-life in blood (T1 / 2) of the complex were calculated. Table 5 shows the results.
表５において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造（Ｐｈは１，４−フェニレン基を表す。）を表し、Ｙは表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ１）に示される結合様式である。 In Table 5, the structures of the CH / GLP-1C complexes represented by IDs in the table are all represented by the general formula “GL 1 -YL 2 -P”, wherein G is represented in the table. L 1 and L 2 each represent a structure shown in the table (Ph represents a 1,4-phenylene group), Y represents a bond shown in the table, and P represents a bond shown in the table. Represents GLP-1C. In the general formula, the bonding mode between G and L 1 is the bonding mode shown in the structural formula (G1) or the bonding mode shown in the structural formula (G3), and the bonding mode between L 2 and P is Is a bonding mode represented by the structural formula (P1).
表５に示されるとおり、上記の一般式で示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体において、Ｌ２が（ＣＨ２）１０または（ＣＨ２）１１で表されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体は、い
ずれも２０時間以上の血中半減期を示した。よって、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の血中滞留時間は、前記実施例１５においてＣＨとリンカーＬ２を結合するために用いられたリンカーＬ１の構造には依存せず、Ｌ２の構造、すなわちペプチドに結合させたリンカーの構造、に依存することが改めて示された。
As shown in Table 5, in the CH / GLP-1C complex represented by the above general formula, the CH / GLP-1C complex in which L 2 is represented by (CH 2 ) 10 or (CH 2 ) 11 is All showed a blood half-life of 20 hours or more. Therefore, CH / GLP-1C residence time in blood of the complex, the the structure of the linker L 1 which is used to couple the CH and the linker L 2 in Example 15 independent, the structure of L 2, That is, it was shown again that it depends on the structure of the linker bound to the peptide.
＜実施例２０＞コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（６）
ＣＨ−ＭａｌとしてCH70-BAMC-GMBS、CH70-BAMC-EMCS、CH70-BAMC-HMCS、CH70-BAMC-KMUS、CH70-BAMC-LMDS、CH140-BAMC-BMPS、CH140-BAMC-KMUS、またはCH140-BAMC-LMDSを用
いて前記実施例１５と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表６に示す。
Example 20 Preparation of Complex of Chondroitin and GLP-1C, Measurement of Activity of the Complex and Retention in Blood (6)
CH-Mal as CH70-BAMC-GMBS, CH70-BAMC-EMCS, CH70-BAMC-HMCS, CH70-BAMC-KMUS, CH70-BAMC-LMDS, CH140-BAMC-BMPS, CH140-BAMC-KMUS, or CH140-BAMC The same operation as in Example 15 was carried out using -LMDS to prepare a CH / GLP-1C complex and calculate the agonist activity (EC 50 ) and half-life in blood (T1 / 2) of the complex. Was. Table 6 shows the results.
表６において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造（ｃＨｅｘは１，４−シクロヘキシレン基を表す。）を表し、Ｙは表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ１）に示される結合様式である。 In Table 6, the structures of the CH / GLP-1C complexes represented by the IDs in the table are all represented by the general formula “GL 1 -YL 2 -P”, wherein G is represented in the table. is represents a chondroitin having a molecular weight, structure L 1 and L 2 are shown respectively in tables (cHex is. representing a 1,4-cyclohexylene group), Y represents represents a bond represented in Table, P Represents GLP-1C. In the general formula, the bonding mode between G and L 1 is the bonding mode shown in the structural formula (G1) or the bonding mode shown in the structural formula (G3), and the bonding mode between L 2 and P is Is a bonding mode represented by the structural formula (P1).
表６に示されるとおり、上記の一般式で示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体において、Ｌ１がＣＨ２−ｃＨｅｘ−ＣＨ２で表され、Ｌ２が（ＣＨ２）１０または（ＣＨ２）１１で表されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体は、いずれも３０時間を超える血中半減期を有していた。よって、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の血中滞留時間は、前記実施例１５においてＣＨとリンカーＬ２を結合するために用いられたリンカーＬ１の構造がシクロヘキシレン基を含んでいる場合は、特に顕著に血中滞留性を増強できることが示された。 As shown in Table 6, in the CH / GLP-1C complex represented by the above general formula, L 1 is represented by CH 2 -cHex-CH 2 , and L 2 is (CH 2 ) 10 or (CH 2 ) Each of the CH / GLP-1C complexes represented by No. 11 had a blood half-life of more than 30 hours. Therefore, CH / GLP-1C residence time in blood of the complex, if the structure of the linker L 1 which is used to couple the CH and the linker L 2 in Example 15 contains a cyclohexylene group, In particular, it was shown that the blood retentivity can be significantly enhanced.
＜実施例２１＞コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（７）
ＣＨ−ＭａｌとしてCH70-EDA-SMCC、CH70-EDA-MBS、CH70-EDA-SMPB、またはCH90-EDA-LMDSを用いて前記実施例１５と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の調製、なら
びに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表７に示す。
<Example 21> Preparation of complex of chondroitin and GLP-1C, measurement of activity of the complex and retention in blood (7)
Using CH70-EDA-SMCC, CH70-EDA-MBS, CH70-EDA-SMPB, or CH90-EDA-LMDS as CH-Mal, perform the same operation as in Example 15 to prepare a CH / GLP-1C complex. , And the agonist activity (EC 50 ) and half-life in blood (T1 / 2) of the complex were calculated. Table 7 shows the results.
表７において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造（ｍＰｈは１，３−フェニレン基を、ｐＰｈは１，４−フェニレン基を、それぞれ表す。）を表し、Ｙは表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ１）に示される結合様式である。 In Table 7, the structures of the CH / GLP-1C complexes represented by the IDs in the table are all represented by the general formula “GL 1 -YL 2 -P”, wherein G is represented in the table. is represents a chondroitin having a molecular weight, structure L 1 and L 2 are shown respectively in tables (a mPh is 1,3-phenylene group, PPH is a 1,4-phenylene group,. respectively), Y represents Represents a bond shown in the table, and P represents GLP-1C. In the general formula, the bonding mode between G and L 1 is the bonding mode shown in the structural formula (G1) or the bonding mode shown in the structural formula (G3), and the bonding mode between L 2 and P is Is a bonding mode represented by the structural formula (P1).
＜実施例２２＞コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（８）
ＣＨ−Ｍａｌに代えてＣＨ−Ｈａｌ（CH70-NH2-SBA）を用いて前記実施例１５と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表８に示す。
Example 22 Preparation of Complex of Chondroitin and GLP-1C, Measurement of Activity of the Complex and Retention in Blood (8)
The same operation as in Example 15 was performed using CH-Hal (CH70-NH 2 -SBA) instead of CH-Mal to prepare a CH / GLP-1C complex, and the agonist activity (EC 50 ) of the complex. ) And half-life in blood (T1 / 2) were calculated. Table 8 shows the results.
表８において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造は一般式「Ｇ−Ｙ−Ｌ−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｙは表中に示される結合を表し、Ｌは表中に示される構造を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｙ間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ２）に示される結合様式である。 In Table 8, the structure of the CH / GLP-1C complex represented by ID in the table is represented by the general formula “GYLP”, wherein G represents chondroitin having a molecular weight shown in the table. Y represents the bond shown in the table, L represents the structure shown in the table, and P represents GLP-1C. In the above general formula, the bonding mode between G and Y is the bonding mode shown in the structural formula (G1) or the bonding mode shown in the structural formula (G3). This is a bonding mode represented by Structural Formula (P2).
＜実施例２３＞コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（９）
ＣＨ−ＨａｌとしてCH70-NH2-SBAXを用いて前記実施例２２と同じ操作を行い、ＣＨ／
ＧＬＰ−１Ｃ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表９に示す。
Example 23 Preparation of Complex of Chondroitin and GLP-1C, Measurement of Activity of the Complex and Retention in Blood (9)
The same operation as in Example 22 was performed using CH70-NH 2 -SBAX as CH-Hal, and CH /
The GLP-1C complex was prepared, and the agonist activity (EC 50 ) and half-life in blood (T1 / 2) of the complex were calculated. Table 9 shows the results.
表９において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造は一般式「Ｇ−Ｙ１−Ｌ１−Ｙ２−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンド
ロイチンを表し、Ｙ１およびＹ２はそれぞれ表中に示される結合を表し、Ｌ１およびＬ２は表中に示される構造を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｙ間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ２）に示される結合様式である。
In Table 9, the structure of the CH / GLP-1C complex represented by the ID in the table is represented by the general formula “GY 1 -L 1 -Y 2 -L 2 -P”, where G is a number in the table. Represents a chondroitin having a molecular weight shown in Table 1 , Y 1 and Y 2 each represent a bond shown in the table, L 1 and L 2 represent a structure shown in the table, and P represents GLP-1C. In the above general formula, the bonding mode between G and Y is the bonding mode shown in the structural formula (G1) or the bonding mode shown in the structural formula (G3), and the bonding mode between L 2 and P is This is the bonding mode shown in the structural formula (P2).
＜実施例２４＞コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（１０）
ＣＨ−ＨａｌとしてCH90-DDDA-SBA、CH140-BAMC-SBA、CH70-EDA-SIA、またはCH140-EDA-SBAを用いて前記実施例２２と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表１０に示す。
<Example 24> Preparation of complex of chondroitin and GLP-1C, measurement of activity of the complex and retention in blood (10)
Using CH90-DDDA-SBA, CH140-BAMC-SBA, CH70-EDA-SIA, or CH140-EDA-SBA as CH-Hal, perform the same operation as in Example 22 to prepare a CH / GLP-1C complex. , And the agonist activity (EC 50 ) and half-life in blood (T1 / 2) of the complex were calculated. Table 10 shows the results.
表１０において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造（ｃＨｅｘは１，４−シクロヘキシレン基を表す。）を表し、Ｙは表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ２）に示される結合様式である。 In Table 10, the structures of the CH / GLP-1C complex represented by the IDs in the table are all represented by the general formula “GL 1 -YL 2 -P”, wherein G is represented in the table. is represents a chondroitin having a molecular weight, structure L 1 and L 2 are shown respectively in tables (cHex is. representing a 1,4-cyclohexylene group), Y represents represents a bond represented in Table, P Represents GLP-1C. In the general formula, the bonding mode between G and L 1 is the bonding mode shown in the structural formula (G1) or the bonding mode shown in the structural formula (G3), and the bonding mode between L 2 and P is Is a bonding mode represented by the structural formula (P2).
＜実施例２５＞コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（１１）
ＣＨ−ＨａｌとしてCH90-DDDA-SIAX、CH70-BAMB-SBAX、CH70-EDA-SBAX、またはCH140-EDA-SIAXを用いて前記実施例２２と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の調製、
ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表１１に示す。
<Example 25> Preparation of complex of chondroitin and GLP-1C, measurement of activity of the complex and retention in blood (11)
Using CH90-DDDA-SIAX, CH70-BAMB-SBAX, CH70-EDA-SBAX, or CH140-EDA-SIAX as CH-Hal, perform the same operation as in Example 22 to prepare a CH / GLP-1C complex. ,
The agonist activity (EC 50 ) and half-life in blood (T1 / 2) of the complex were calculated. Table 11 shows the results.
表１１において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ１−Ｌ２−Ｙ２−Ｌ３−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はそれぞれ表中に示される構造（Ｐｈは１，４−フェニレン基を表す。）を表し、Ｙは表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ３−Ｐ
間の結合様式は前記構造式（Ｐ２）に示される結合様式である。
In Table 11, the structures of the CH / GLP-1C complexes represented by the IDs in the table are all represented by the general formula “GL 1 -Y 1 -L 2 -Y 2 -L 3 -P”. , G represents a chondroitin having a molecular weight shown in the table, L 1 , L 2 and L 3 each represent a structure shown in the table (Ph represents a 1,4-phenylene group), and Y represents a table. Wherein P represents GLP-1C. Further, in the general formula, the binding mode between G-L 1 is a bond manner shown in coupled manner or the structural formula shown in the structural formula (G1) (G3), L 3 -P
The bonding mode between them is the bonding mode shown in the structural formula (P2).
＜実施例２６＞コンドロイチンとＧＬＰ−１ＲＫの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（１）
ＣＨ−Ｍａｌに代えてＣＨ−ＳＨ（CH70-NH2-propanoyl-SH）を、ＧＬＰ−１Ｃに代え
てＧＬＰ−１ＲＫ誘導体（ＥＭＣＳ／ＧＬＰ−１ＲＫまたはＫＭＵＳ／ＧＬＰ−１ＲＫ）を用いて前記実施例１５と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表１２に示す。
Example 26 Preparation of Complex of Chondroitin and GLP-1RK, Measurement of Activity of the Complex and Retention in Blood (1)
The above examples were described using CH-SH (CH70-NH 2 -propanoyl-SH) instead of CH-Mal and a GLP-1RK derivative (EMCS / GLP-1RK or KMUS / GLP-1RK) instead of GLP-1C. The same operation as in 15 was performed to prepare a CH / GLP-1RK complex, and calculate the agonist activity (EC 50 ) and half-life in blood (T1 / 2) of the complex. Table 12 shows the results.
表１２において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙは表中に示される結合（Ｓ−Ｓｕｃは前記構造式（Ｙ１４）に示される結合様式を表す。）を表し、ＰはＧＬＰ−１ＲＫを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ３）に示される結合様式である。 In Table 12, the structures of the CH / GLP-1RK complexes represented by the IDs in the table are all represented by the general formula “GL 1 -YL 2 -P”, wherein G is represented in the table. represents chondroitin having a molecular weight, L 1 and L 2 represents a structure shown in each of Table, Y is a bond (S-Suc shown in Table represent a binding manner shown in the structural formula (Y14) .), And P represents GLP-1RK. In the general formula, the bonding mode between G and L 1 is the bonding mode shown in the structural formula (G1) or the bonding mode shown in the structural formula (G3), and the bonding mode between L 2 and P is Is a bonding mode represented by the structural formula (P3).
＜実施例２７＞コンドロイチンとＧＬＰ−１ＲＫの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（２）
ＣＨ−ＳＨとしてCH30-EDA-propanoyl-SH、CH40-EDA-propanoyl-SH、CH70-EDA-propanoyl-SH、またはCH70-EDA-undecanoyl-SHを、ＧＬＰ−１ＲＫ誘導体としてＢＭＰＳ／ＧＬ
Ｐ−１ＲＫ、ＥＭＣＳ／ＧＬＰ−１ＲＫ、ＫＭＵＳ／ＧＬＰ−１ＲＫ、またはＬＭＤＳ／ＧＬＰ−１ＲＫを用いて前記実施例２６と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表１３に示す。
<Example 27> Preparation of complex of chondroitin and GLP-1RK, measurement of activity of the complex and retention in blood (2)
CH30-EDA-propanoyl-SH, CH40-EDA-propanoyl-SH, CH70-EDA-propanoyl-SH or CH70-EDA-undecanoyl-SH as CH-SH, and BMPS / GL as GLP-1RK derivative
The same operation as in Example 26 was performed using P-1RK, EMCS / GLP-1RK, KMUS / GLP-1RK, or LMDS / GLP-1RK to prepare a CH / GLP-1RK complex and to prepare the complex. The agonist activity (EC 50 ) and the half-life in blood (T1 / 2) were calculated. Table 13 shows the results.
表１３において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ１−Ｌ２−Ｙ２−Ｌ３−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はそれぞれ表中に示される構造
を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ表中に示される結合（Ｓ−Ｓｕｃは前記構造式（Ｙ１４）に示される結合様式を表す。）を表し、ＰはＧＬＰ−１ＲＫを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ３）に示される結合様式である。
Structure of CH / GLP-1RK complex represented by ID in Table in Table 13 is represented by either general formula "G-L 1 -Y 1 -L 2 -Y 2 -L 3 -P ', wherein , G represent chondroitin having the molecular weight shown in the table, L 1 , L 2 and L 3 represent the structures shown in the table, respectively, and Y 1 and Y 2 represent the bonds (S- Suc represents the bonding mode represented by the structural formula (Y14)), and P represents GLP-1RK. In the general formula, the bonding mode between G and L 1 is the bonding mode shown in the structural formula (G1) or the bonding mode shown in the structural formula (G3), and the bonding mode between L 2 and P is Is a bonding mode represented by the structural formula (P3).
＜実施例２８＞コンドロイチンとＧＬＰ−１ＲＫの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（３）
ＣＨ−ＳＨとしてCH70-BAMB-propanoyl-SH、CH70-BAMC-propanoyl-SH、CH70-HDA-propanoyl-SH、CH30-DDDA-propanoyl-SH、またはCH90-DDDA-propanoyl-SHを、ＧＬＰ−１ＲＫ
誘導体としてＢＭＰＳ／ＧＬＰ−１ＲＫ、ＥＭＣＳ／ＧＬＰ−１ＲＫ、ＨＭＣＳ／ＧＬＰ−１ＲＫ、ＫＭＵＳ／ＧＬＰ−１ＲＫ、またはＬＭＤＳ／ＧＬＰ−１ＲＫを用いて前記実施例２６と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表１４に示す。
Example 28 Preparation of Complex of Chondroitin and GLP-1RK, Measurement of Activity of the Complex and Retention in Blood (3)
CH70-BAMB-propanoyl-SH, CH70-BAMC-propanoyl-SH, CH70-HDA-propanoyl-SH, CH30-DDDA-propanoyl-SH or CH90-DDDA-propanoyl-SH as CH-SH, GLP-1RK
The same operation as in Example 26 was performed using BMPS / GLP-1RK, EMCS / GLP-1RK, HMCS / GLP-1RK, KMUS / GLP-1RK, or LMDS / GLP-1RK as a derivative, and performing CH / GLP-1RK. Preparation of the complex and calculation of the agonist activity (EC 50 ) and half-life in blood (T1 / 2) of the complex were performed. Table 14 shows the results.
表１４において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ１−Ｌ２−Ｙ２−Ｌ３−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はそれぞれ表中に示される構造（ｐＰｈは１，４−フェニレン基を、ｃＨｅｘは１，４−シクロヘキシレン基を、それぞれ表す。）を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ表中に示される結合（Ｓ−Ｓｕｃは前記構造式（Ｙ１４）に示される結合様式を表す。）を表し、ＰはＧＬＰ−１ＲＫを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ３）に示される結合様式である。 In Table 14, the structures of the CH / GLP-1RK complexes represented by the IDs in the table are all represented by the general formula “GL 1 -Y 1 -L 2 -Y 2 -L 3 -P”. , G represents a chondroitin having a molecular weight shown in the table, L 1 , L 2 and L 3 each represent a structure shown in the table (pPh represents 1,4-phenylene group, cHex represents 1,4-cyclohexylene). And Y 1 and Y 2 each represent a bond shown in the table (S-Suc represents a bond mode shown in the structural formula (Y14)), and P represents GLP-. Represents 1 RK. In the general formula, the bonding mode between G and L 1 is the bonding mode shown in the structural formula (G1) or the bonding mode shown in the structural formula (G3), and the bonding mode between L 2 and P is Is a bonding mode represented by the structural formula (P3).
＜実施例２９＞コンドロイチンとＧＬＰ−１ＲＫの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（４）
ＣＨ−ＳＨとしてCH90-AET、CH70-AHT、CH90-AHT、またはCH90-AUDTを、ＧＬＰ−１Ｒ
Ｋ誘導体としてＢＭＰＳ／ＧＬＰ−１ＲＫ、ＥＭＣＳ／ＧＬＰ−１ＲＫ、ＫＭＵＳ／ＧＬＰ−１ＲＫ、またはＬＭＤＳ／ＧＬＰ−１ＲＫを用いて前記実施例２６と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表１５に示す。
<Example 29> Preparation of complex of chondroitin and GLP-1RK, measurement of activity of the complex and retention in blood (4)
CH90-AET, CH70-AHT, CH90-AHT, or CH90-AUDT as CH-SH, GLP-1R
Using BMPS / GLP-1RK, EMCS / GLP-1RK, KMUS / GLP-1RK, or LMDS / GLP-1RK as the K derivative, the same operation as in Example 26 was performed to prepare a CH / GLP-1RK complex. The agonist activity (EC 50 ) and half-life in blood (T1 / 2) of the complex were calculated. Table 15 shows the results.
表１５において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙは表中に示される結合（Ｓ−Ｓｕｃは前記構造式（Ｙ１４）に示される結合様式を表す。）を表し、ＰはＧＬＰ−１ＲＫを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ３）に示される結合様式である。 In Table 15, the structures of the CH / GLP-1RK complexes represented by the IDs in the table are all represented by the general formula “GL 1 -YL 2 -P”, wherein G is represented in the table. represents chondroitin having a molecular weight, L 1 and L 2 represents a structure shown in each of Table, Y is a bond (S-Suc shown in Table represent a binding manner shown in the structural formula (Y14) .), And P represents GLP-1RK. In the general formula, the bonding mode between G and L 1 is the bonding mode shown in the structural formula (G1) or the bonding mode shown in the structural formula (G3), and the bonding mode between L 2 and P is Is a bonding mode represented by the structural formula (P3).
＜実施例３０＞コンドロイチンとＧＬＰ−１ＲＫの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（５）
ＣＨ−ＭａｌとしてCH70-EDA-BMPS、またはCH70-EDA-KMUSを、ＧＬＰ−１Ｃに代えてＧＬＰ−１ＲＫ誘導体（ｐｒｏｐａｎｏｙｌ−ＳＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ）を用いて前記実施例１５と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性および血中半減期の算出を行った。結果を表１６に示す。
Example 30 Preparation of Complex of Chondroitin and GLP-1RK, Measurement of Activity of the Complex and Retention in Blood (5)
The same operation as in Example 15 was performed by using CH70-EDA-BMPS or CH70-EDA-KMUS as CH-Mal and using a GLP-1RK derivative (propanoyl-SH / GLP-1RK) instead of GLP-1C, Preparation of a CH / GLP-1RK complex and calculation of agonist activity and half-life in blood of the complex were performed. Table 16 shows the results.
表１６において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ１−Ｌ２−Ｙ２−Ｌ３−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ表中に示される結合（Ｓｕｃ−Ｓは前記構造式（Ｙ１３）に示される結合様式を表す。）を表し、ＰはＧＬＰ−１ＲＫを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ３）に示される結合様式である。 In Table 16 is indicated by even general formula any structure of CH / GLP-1RK complex represented by ID in the table, "G-L 1 -Y 1 -L 2 -Y 2 -L 3 -P ', wherein , G represent chondroitin having the molecular weight shown in the table, L 1 , L 2 and L 3 represent the structures shown in the table, respectively, and Y 1 and Y 2 represent the bonds (Suc- S represents the bonding mode represented by the structural formula (Y13)), and P represents GLP-1RK. In the general formula, the bonding mode between G and L 1 is the bonding mode shown in the structural formula (G1) or the bonding mode shown in the structural formula (G3), and the bonding mode between L 2 and P is Is a bonding mode represented by the structural formula (P3).
＜実施例３１＞コンドロイチンとＧＬＰ−１ＲＫの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（６）
ＣＨ−ＳＨとしてCH70-EDA-propanoyl-SHまたはCH90-DDDA-propanoyl-SHを、ＧＬＰ−
１ＲＫ誘導体としてＳＢＡ／ＧＬＰ−１ＲＫを用いて前記実施例２６と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）
および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表１７に示す。
Example 31 Preparation of Complex of Chondroitin and GLP-1RK, Measurement of Activity of the Complex and Retention in Blood (6)
CH70-EDA-propanoyl-SH or CH90-DDDA-propanoyl-SH as CH-SH, GLP-
The same operation as in Example 26 was performed using SBA / GLP-1RK as a 1RK derivative to prepare a CH / GLP-1RK complex, and the agonist activity (EC 50 ) of the complex.
And the half-life in blood (T1 / 2) was calculated. Table 17 shows the results.
表１７において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ１−Ｌ２−Ｙ２−Ｌ３−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１ＲＫを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ３）に示される結合様式である。 Structure of CH / GLP-1RK complex represented by ID in Table in Table 17 is represented by either general formula "G-L 1 -Y 1 -L 2 -Y 2 -L 3 -P ', wherein , G represents chondroitin having the molecular weight shown in the table, L 1 , L 2 and L 3 each represent a structure shown in the table, Y 1 and Y 2 each represent a bond shown in the table, P represents GLP-1RK. In the general formula, the bonding mode between G and L 1 is the bonding mode shown in the structural formula (G1) or the bonding mode shown in the structural formula (G3), and the bonding mode between L 2 and P is Is a bonding mode represented by the structural formula (P3).
＜実施例３２＞コンドロイチンとＧＬＰ−１ＲＫの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（７）
ＣＨ−ＳＨとしてCH90-AUDTを、ＧＬＰ−１ＲＫ誘導体としてＳＢＡ／ＧＬＰ−１ＲＫ
を用いて前記実施例２６と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表１８に示す。
<Example 32> Preparation of complex of chondroitin and GLP-1RK, measurement of activity of the complex and retention in blood (7)
CH90-AUDT as CH-SH and SBA / GLP-1RK as GLP-1RK derivative
Was used to prepare the CH / GLP-1RK complex, and to calculate the agonist activity (EC 50 ) and half-life in blood (T1 / 2) of the complex. The results are shown in Table 18.
表１８において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の構造は一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙは表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１ＲＫを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ３）に示される結合様式である。 In Table 18, the structure of the CH / GLP-1RK complex represented by the ID in the table is represented by the general formula “GL 1 -YL 2 -P”, where G is the molecular weight shown in the table Wherein L 1 and L 2 each represent a structure shown in the table, Y represents a bond shown in the table, and P represents GLP-1RK. In the general formula, the bonding mode between G and L 1 is the bonding mode shown in the structural formula (G1) or the bonding mode shown in the structural formula (G3), and the bonding mode between L 2 and P is Is a bonding mode represented by the structural formula (P3).
＜実施例３３＞コンドロイチンとＧＬＰ−１ＯｒｉＣの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定
ＣＨ−ＭａｌとしてCH140-EDA-KMUSを、ＧＬＰ−１Ｃに代えてＧＬＰ−１ＯｒｉＣを用いて前記実施例１５と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１ＯｒｉＣ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表１９に示す。
Example 33 Preparation of Complex of Chondroitin and GLP-1 OriC, Measurement of Activity of the Complex and Retention in Blood CH140-EDA-KMUS was used as CH-Mal, and GLP-1 OriC was used instead of GLP-1C. The same operation as in Example 15 was performed to prepare a CH / GLP-1 OriC complex, and to calculate the agonist activity (EC 50 ) and half-life in blood (T1 / 2) of the complex. The results are shown in Table 19.
表１９において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１ＯｒｉＣ複合体の構造は一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙは表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１ＯｒｉＣを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ１）に示される結合様式である。 In Table 19, the structure of the CH / GLP-1 OriC complex represented by the ID in the table is represented by the general formula “GL 1 -YL 2 -P”, where G is the molecular weight shown in the table Wherein L 1 and L 2 each represent a structure shown in the table, Y represents a bond shown in the table, and P represents GLP-1 OriC. In the general formula, the bonding mode between G and L 1 is the bonding mode shown in the structural formula (G1) or the bonding mode shown in the structural formula (G3), and the bonding mode between L 2 and P is Is a bonding mode represented by the structural formula (P1).
＜実施例３４＞ヘパロサンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定
ＣＨ−Ｍａｌに代えてＨＰＮ−Ｍａｌ（HPN50-EDA-BMPSまたはHPN50-EDA-LMDS）を用いて前記実施例１５と同じ操作を行い、ＨＰＮ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表２０に示す。
<Example 34> Preparation of complex of heparosan and GLP-1C, measurement of activity of the complex and retention in blood HPN-Mal (HPN50-EDA-BMPS or HPN50-EDA-LMDS) instead of CH-Mal Was used to prepare an HPN / GLP-1C complex, and to calculate the agonist activity (EC 50 ) and half-life in blood (T1 / 2) of the complex. The results are shown in Table 20.
表２０において表中のＩＤで示されるＨＰＮ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するヘパロサンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙは表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ２）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ１）に示される結合様式である。 In Table 20, the structures of the HPN / GLP-1C complexes represented by the IDs in the table are all represented by the general formula “GL 1 -YL 2 -P”, wherein G is represented in the table. represents heparosan having a molecular weight, L 1 and L 2 represents a structure shown in each of Table, Y represents a bond represented in the tables, P is representative of the GLP-1C. In the above general formula, the bonding mode between G and L 1 is the bonding mode shown in the structural formula (G2) or the bonding mode shown in the structural formula (G3), and the bonding mode between L 2 and P is Is a bonding mode represented by the structural formula (P1).
表２０に示されるとおり、上記の一般式で示されるＨＰＮ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体において、Ｌ２が（ＣＨ２）１１で表されるＨＰＮ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体は、約３４時間もの血中半減期を有していた。よって、本発明において血中滞留性の増強に使用することができるグリコサミノグリカンは、コンドロイチンには限定されず、ヘパロサンも使用可能であることが示された。 As shown in Table 20, in the HPN / GLP-1C complex represented by the above-mentioned general formula, the HPN / GLP-1C complex in which L 2 is represented by (CH 2 ) 11 has a blood level of about 34 hours. Had a half-life. Therefore, it was shown that glycosaminoglycans that can be used for enhancing blood retention in the present invention are not limited to chondroitin, and heparosan can also be used.
＜実施例３５＞コンドロイチンとインスリンの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（１）
インスリン誘導体を６ｍｇ／ｍＬとなるようにＤＭＦに溶解し、これに０．５Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を終濃度５０ｍＭとなるように添加した。この溶液に４０ｍｇ／ｍＬのＣＨ−ＳＨ（CH90-EDA-propanoyl-SH、またはCH90-AET）の水溶液を当該溶液
の１０倍容、ＤＭＦをＣＨ−ＳＨ水溶液の１／２容量、それぞれ添加した後、遮光して室温で１６時間撹拌した。その後、この溶液に０．１％ ＴＦＡを全量が６〜１０ｍとなるように混合して遠心（２０，０００×ｇ、１０分間）し、その上清を逆相カラム（DAISOGEL SP-120-5-ODS-BP、内径：20mm×全長：250mm、大阪ソーダ社製、またはSHISEIDO CAPCELL PAK C18、内径：20mm×全長：250mm、資生堂社製）にアプライした。移動相には溶媒Ａ（０．１％ ＴＦＡ）と溶媒Ｂ（０．１％ ＴＦＡ／８０％ ＭｅＣＮ）を用いた。溶離はリニアグラジエントにより行い、分析開始５分後から３５分後までの間に溶媒Ｂの割合を１０％から８０％に変化させた。流速は８ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃とした。ＣＨとインスリンの複合体を含む溶出画分（保持時間２０分〜３０分のピーク画分）を回収した後、凍結乾燥した。このようにして、ＣＨ／インスリン複合体（リンカーを介し
てコンドロイチンをインスリンＡ鎖のＮ末端のアミノ酸残基および／またはインスリンＢ鎖のリジン残基に結合させた構造を有する、コンドロイチンとインスリンの複合体）を得た。このようにして得たＣＨ／インスリン複合体を逆相カラムにアプライして分取し、インスリンＡ鎖にのみコンドロイチンを有するＣＨ／インスリン複合体、インスリンＢ鎖にのみコンドロイチンを有するＣＨ／インスリン複合体、インスリンＡ鎖およびインスリンＢ鎖にコンドロイチンを有するＣＨ／インスリン複合体をそれぞれ得た。
Example 35 Preparation of Complex of Chondroitin and Insulin, Measurement of Activity of the Complex and Retention in Blood (1)
The insulin derivative was dissolved in DMF to a concentration of 6 mg / mL, and a 0.5 M HEPES buffer (pH 7.0) was added to the solution to a final concentration of 50 mM. After adding an aqueous solution of 40 mg / mL CH-SH (CH90-EDA-propanoyl-SH or CH90-AET) to this
上記により得たＣＨ／インスリン複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）を実施例１２に記載の方法に従って、また血中半減期（Ｔ１／２）を実施例１４に記載の方法に従って、それぞれ算出した。結果を表２１に示す。 The agonist activity (EC 50 ) of the CH / insulin complex obtained above was calculated according to the method described in Example 12, and the half-life in blood (T1 / 2) was calculated according to the method described in Example 14. The results are shown in Table 21.
表２１において表中のＩＤで示されるＣＨ／インスリン複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ１−Ｌ２−Ｙ２−Ｌ３−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ表中に示される結合（Ｓ−Ｓｕｃは前記構造式（Ｙ１４）に示される結合様式を表す。）を表し、Ｐはインスリンを表し、部位αはコンドロイチンがリンカーを介してインスリンＡ鎖のα−アミノ基（Ｎ末端のアミノ基）に結合していることを示し、部位εはコンドロイチンがリンカーを介してインスリンＢ鎖のε−アミノ基（リジン残基のアミノ基）に結合していることを示し、部位α／εはコンドロイチンがリンカーを介してインスリンＡ鎖のα−アミノ基（Ｎ末端のアミノ基）とインスリンＢ鎖のε−アミノ基（リジン残基のアミノ基）の両方に結合していることを示す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式である。 In Table 21, the structures of the CH / insulin complex represented by the IDs in the table are all represented by the general formula “GL 1 -Y 1 -L 2 -Y 2 -L 3 -P”. Represents chondroitin having the molecular weight shown in the table, L 1 , L 2 and L 3 represent the structures shown in the table, respectively, and Y 1 and Y 2 each represent a bond shown in the table (S-Suc is Wherein P represents insulin, and site α is a site where chondroitin is bonded to the α-amino group (N-terminal amino group) of insulin A chain via a linker. The site ε indicates that chondroitin is bonded to the ε-amino group of the insulin B chain (amino group of lysine residue) via a linker, and the site α / ε indicates that chondroitin has a linker. Insulin through This indicates that the compound is bound to both the α-amino group of the A chain (N-terminal amino group) and the ε-amino group of the insulin B chain (amino group of lysine residue). Further, in the general formula, the binding mode between G-L 1 is a bond manner shown in coupled manner or the structural formula shown in the structural formula (G1) (G3).
＜実施例３６＞コンドロイチンとインスリンの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（２）
ＣＨ−ＳＨとしてCH90-AETを用いて前記実施例３５と同じ操作を行い、ＣＨ／インスリン複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表２２に示す。
Example 36 Preparation of Complex of Chondroitin and Insulin, Measurement of Activity of the Complex and Retention in Blood (2)
The same operation as in Example 35 was performed using CH90-AET as CH-SH to prepare a CH / insulin complex, and to determine the agonist activity (EC 50 ) and half-life in blood (T1 / 2) of the complex. Calculation was performed. The results are shown in Table 22.
表２２において表中のＩＤで示されるＣＨ／インスリン複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙはそれぞれ表中に示される結合（Ｓ−Ｓｕｃは前記構造式（Ｙ１４）に示される結合様式を表す。）を表し、Ｐはインスリンを表し、部位αはコンドロイチンがリンカーを介してインスリンＡ鎖のα−アミノ基（Ｎ末端のアミノ基）に結合していることを示し、部位α／εはコンドロイチンがリンカーを介してインスリンＡ鎖のα−アミノ基（Ｎ末端のアミノ基）とインスリンＢ鎖のε−アミノ基（リジン残基のアミノ基）の両方に結合していることを示す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式である。 In Table 22, the structures of the CH / insulin conjugates indicated by IDs in the table are all represented by the general formula “GL 1 -YL 2 -P”, where G is the molecular weight shown in the table Wherein L 1 and L 2 each represent a structure shown in the table, and Y each represents a bond shown in the table (S-Suc represents a bond mode shown in the structural formula (Y14). ), P represents insulin, the site α indicates that chondroitin is bound to the α-amino group (N-terminal amino group) of the insulin A chain via a linker, and the site α / ε indicates that chondroitin is This indicates that the compound is bound to both the α-amino group of the insulin A chain (N-terminal amino group) and the ε-amino group of the insulin B chain (amino group of lysine residue) via a linker. Further, in the general formula, the binding mode between G-L 1 is a bond manner shown in coupled manner or the structural formula shown in the structural formula (G1) (G3).
＜実施例３７＞ヘパロサンとインスリンの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定
ＣＨ−ＮＨＳに代えてＨＰＮ−ＳＨ（HPN50-EDA-propanoyl-SH）を用いて前記実施例３５と同じ操作を行い、ＨＰＮ／インスリン複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表２３に示す。
<Example 37> Preparation of a complex of heparosan and insulin, measurement of activity of the complex and retention in blood The above-mentioned example was conducted using HPN-SH (HPN50-EDA-propanoyl-SH) instead of CH-NHS. The same operation as in Example 35 was performed to prepare an HPN / insulin complex, and calculate the agonist activity (EC 50 ) and half-life in blood (T1 / 2) of the complex. The results are shown in Table 23.
表２３において表中のＩＤで示されるＣＨ／インスリン複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ１−Ｌ２−Ｙ２−Ｌ３−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するヘパロサンを表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ表中に示される結合（Ｓ−Ｓｕｃは前記構造式（Ｙ１４）に示される結合様式を表す。）を表し、Ｐはインスリンを表し、部位αはヘパロサンがリンカーを介してインスリンＡ鎖のα−アミノ基（Ｎ末端のアミノ基）に結合していることを示し、部位εはヘパロサンがリンカーを介してインスリンＢ鎖のε−アミノ基（リジン残基のアミノ基）に結合していることを示し、部位α／εはヘパロサンがリンカーを介してインスリンＡ鎖のα−アミノ基（Ｎ末端のアミノ基）とインスリンＢ鎖のε−アミノ基（リジン残基のアミノ基）の両方に結合していることを示す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式である。 In Table 23, each of the structures of the CH / insulin complex represented by ID in the table is represented by the general formula “GL 1 -Y 1 -L 2 -Y 2 -L 3 -P”. Represents heparosan having the molecular weight shown in the table, L 1 , L 2 and L 3 represent the structures shown in the table, respectively, and Y 1 and Y 2 represent the bonds shown in the table (S-Suc is Wherein P represents insulin, and the site α is heparosan bonded to an α-amino group (N-terminal amino group) of the insulin A chain via a linker. The site ε indicates that heparosan is bonded to the ε-amino group (amino group of lysine residue) of insulin B chain via a linker, and the site α / ε indicates that heparosan is Α-amino acid of insulin A chain (N-terminal amino group) of the show that is bonded to both the insulin B chain of ε- amino group (an amino group of a lysine residue). Further, in the general formula, the binding mode between G-L 1 is a bond manner shown in coupled manner or the structural formula shown in the structural formula (G1) (G3).
＜実施例３８＞ＣＨ／ＧＬＰ−１複合体のマウスにおける血中濃度の推移（１）
被験物質（GLP27-4（実施例１５）、GLP28-5（実施例２０）、またはリラグルチド（Novo Nordisk社製））を１００ｎｍｏｌ／ｋｇ（ＧＬＰ−１の重量として０．３４ｍｇ／ｋｇ）の用量で雄のＩＣＲマウスに皮下注射した。投与後０〜１４４時間の各時点で採血し、回収した血液を遠心分離して血漿を得た。血漿中の活性型ＧＬＰ−１濃度の測定にはGlucagon-Like Peptide-1 (Active) ELISA Kitを用い、キットに添付のプロトコールに従った操作を行って当該濃度を測定した。結果を図１に示す。
<Example 38> Changes in blood concentration of CH / GLP-1 complex in mice (1)
The test substance (GLP27-4 (Example 15), GLP28-5 (Example 20), or liraglutide (Novo Nordisk)) was administered at a dose of 100 nmol / kg (0.34 mg / kg as the weight of GLP-1). Male ICR mice were injected subcutaneously. Blood was collected at each time point from 0 to 144 hours after administration, and the collected blood was centrifuged to obtain plasma. Glucagon-Like Peptide-1 (Active) ELISA Kit was used to measure the concentration of active GLP-1 in plasma, and the concentration was measured by performing an operation according to the protocol attached to the kit. The results are shown in FIG.
図１に示されるとおり、ＣＨ／ＧＬＰ−１複合体は持効型ＧＬＰ−１製剤であるリラグルチドよりも有意に良好な血中滞留性を示した。 As shown in FIG. 1, the CH / GLP-1 complex showed significantly better blood retention than the long-acting GLP-1 preparation liraglutide.
＜実施例３９＞ＣＨ／ＧＬＰ−１複合体のマウスにおける血中濃度の推移（２）
被験物質（GLP40-1（実施例２１））を３００ｎｍｏｌ／ｋｇ（ＧＬＰ−１の重量とし
て１ｍｇ／ｋｇ）の用量で雄のＩＣＲマウスに尾静脈注射（iv）または皮下注射（sc）した。以後、前記実施例３８と同じ操作を行った。結果を図２に示す。
<Example 39> Change in blood concentration of CH / GLP-1 complex in mice (2)
A test substance (GLP40-1 (Example 21)) was injected into male ICR mice at a dose of 300 nmol / kg (1 mg / kg by weight of GLP-1) via tail vein injection (iv) or subcutaneous injection (sc). Thereafter, the same operation as in Example 38 was performed. FIG. 2 shows the results.
図２に示されるとおり、ＣＨ／ＧＬＰ−１複合体は投与方法（静脈注射または皮下注射）には依存せず、同様の濃度推移を示した。 As shown in FIG. 2, the CH / GLP-1 complex showed a similar concentration transition without depending on the administration method (intravenous injection or subcutaneous injection).
＜実施例４０＞ＣＨ／ＧＬＰ−１複合体のマウスにおける薬効持続性（１）
被験物質（GLP30-1（実施例２９）、GLP27-4（実施例１５）、GLP28-5（実施例２０）
、またはリラグルチド）を１００ｎｍｏｌ／ｋｇ（ＧＬＰ−１の重量として０．３４ｍｇ／ｋｇ）の用量で雄のＩＣＲマウスに皮下注射した。投与後２４〜９６時間の各時点でグルコースを１ｇ／ｋｇの用量で腹腔内に負荷し、グルコース負荷後の血糖値変化を継時的に測定した。血糖値の測定には簡易型自己血糖測定器（ライフチェック、エーザイ社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って測定を実施した。グルコース負荷０分後、１５分後、３０分後、および６０分後の血糖値から血糖値推移曲線を作成し、当該曲線の下面積（AUC0-60）を算出して、各被験物質の血糖上昇抑制効果を比較した。結果を
図３に示す。
<Example 40> Persistence of CH / GLP-1 complex in mice (1)
Test substances (GLP30-1 (Example 29), GLP27-4 (Example 15), GLP28-5 (Example 20)
Or liraglutide) was injected subcutaneously into male ICR mice at a dose of 100 nmol / kg (0.34 mg / kg by weight of GLP-1). Glucose was intraperitoneally loaded at a dose of 1 g / kg at each time point of 24 to 96 hours after administration, and changes in blood glucose level after glucose loading were continuously measured. The measurement of the blood glucose level was carried out using a simple self-monitoring blood glucose meter (Life Check, manufactured by Eisai Co., Ltd.) and performing the operation according to the attached protocol. A blood glucose level transition curve was created from the blood glucose levels at 0, 15, 30, and 60 minutes after the glucose load, and the area under the curve (AUC 0-60 ) was calculated. The effects of suppressing blood glucose elevation were compared. The results are shown in FIG.
図３に示されるとおり、ＣＨ／ＧＬＰ−１複合体はリラグルチドを上回る薬効持続性を示した。 As shown in FIG. 3, the CH / GLP-1 complex exhibited a longer duration of drug efficacy than liraglutide.
＜実施例４１＞ＣＨ／ＧＬＰ−１複合体のマウスにおける薬効持続性（２）
被験物質（GLP40-1（実施例２１）またはリラグルチド）を３００ｎｍｏｌ／ｋｇ（Ｇ
ＬＰ−１の重量として１ｍｇ／ｋｇ）の用量で雄のＩＣＲマウスに皮下注射した。投与後９６〜１６８時間の各時点でグルコースを１ｇ／ｋｇの用量で腹腔内に負荷し、グルコース負荷後の血糖値変化を継時的に測定した。以後、前記実施例４０と同じ操作を行った。結果を図４に示す。
<Example 41> Persistence of drug efficacy of CH / GLP-1 complex in mice (2)
A test substance (GLP40-1 (Example 21) or liraglutide) was administered at 300 nmol / kg (G
Male ICR mice were injected subcutaneously at a dose of 1 mg / kg of LP-1 by weight. At each time point of 96 to 168 hours after the administration, glucose was intraperitoneally loaded at a dose of 1 g / kg, and changes in blood glucose level after glucose loading were measured over time. Thereafter, the same operation as in Example 40 was performed. FIG. 4 shows the results.
図４に示されるとおり、ＣＨ／ＧＬＰ−１複合体はリラグルチドを上回る薬効持続性を示した。 As shown in FIG. 4, the CH / GLP-1 complex exhibited a longer duration of drug efficacy than liraglutide.
＜実施例４２＞ＨＰＮ／ＧＬＰ−１複合体のマウスにおける血中濃度の推移
被験物質（GLP42-1またはGLP42-2（いずれも実施例３４））を３００ｎｍｏｌ／ｋｇ（ＧＬＰ−１の重量として１ｍｇ／ｋｇ）の用量で雄のＩＣＲマウスに尾静脈注射（iv）または皮下注射（sc）した。以後、前記実施例３８と同じ操作を行った。結果を図５に示す。
<Example 42> Changes in blood concentration of HPN / GLP-1 complex in
図５に示されるとおり、ＨＰＮ／ＧＬＰ−１複合体はＣＨ／ＧＬＰ−１複合体と同様、投与方法（静脈注射または皮下注射）には依存せず、同様の濃度推移を示した。 As shown in FIG. 5, the HPN / GLP-1 complex showed the same concentration transition as the CH / GLP-1 complex without depending on the administration method (intravenous injection or subcutaneous injection).
＜実施例４３＞ＨＰＮ／ＧＬＰ−１複合体のマウスまたはラットにおける血中濃度の推移
被験物質（GLP42-1（実施例３４））を３００ｎｍｏｌ／ｋｇ（ＧＬＰ−１の重量とし
て１ｍｇ／ｋｇ）の用量で雄のＩＣＲマウスまたは雄のＦ３４４ラットに尾静脈注射した。以後、前記実施例３８と同じ操作を行った。結果を図６に示す。
Example 43 Changes in Blood Concentration of HPN / GLP-1 Complex in Mice or Rats The concentration of a test substance (GLP42-1 (Example 34)) was 300 nmol / kg (1 mg / kg as the weight of GLP-1). Male ICR mice or male F344 rats were injected at the dose via the tail vein. Thereafter, the same operation as in Example 38 was performed. FIG. 6 shows the results.
図６に示されるとおり、ＨＰＮ／ＧＬＰ−１複合体はマウスとラットにおいて同様の濃
度推移を示した。
As shown in FIG. 6, the HPN / GLP-1 complex showed a similar concentration transition in mice and rats.
＜実施例４４＞ＨＰＮ／ＧＬＰ−１複合体のマウスにおける薬効持続性
被験物質（GLP42-2（実施例３４）またはリラグルチド）を３００ｎｍｏｌ／ｋｇ（Ｇ
ＬＰ−１の重量として１ｍｇ／ｋｇ）の用量で雄のＩＣＲマウスに皮下注射した。投与後７２〜１６８時間の各時点でグルコースを１ｇ／ｋｇの用量で腹腔内に負荷し、グルコース負荷後の血糖値変化を継時的に測定した。以後、前記実施例４０と同じ操作を行った。結果を図７に示す。
<Example 44> Persistence of efficacy of HPN / GLP-1 complex in mice A test substance (GLP42-2 (Example 34) or liraglutide) was administered at 300 nmol / kg (G
Male ICR mice were injected subcutaneously at a dose of 1 mg / kg of LP-1 by weight. Glucose was loaded intraperitoneally at a dose of 1 g / kg at each time point of 72 to 168 hours after administration, and the change in blood glucose level after glucose loading was measured over time. Thereafter, the same operation as in Example 40 was performed. FIG. 7 shows the results.
図７に示されるとおり、ＣＨ／ＧＬＰ−１複合体と同様に、ＨＰＮ／ＧＬＰ−１複合体はリラグルチドを上回る薬効持続性を示した。 As shown in FIG. 7, similar to the CH / GLP-1 complex, the HPN / GLP-1 complex exhibited a longer duration of efficacy than liraglutide.
＜実施例４５＞ＣＨ／インスリン複合体のマウスにおける血中濃度の推移（１）
被験物質（Ins3-1、Ins3-2、またはIns3-3（いずれも実施例３５））を３４０ｎｍｏｌ／ｋｇ（インスリンの重量として２ｍｇ／ｋｇ）の用量で雄のＩＣＲマウスに尾静脈注射（iv）または皮下注射（sc）した。投与後０〜４９時間の各時点で採血し、回収した血液を遠心分離して血清を得た。血清中のインスリン濃度は実施例１４に記載の方法に従って測定した。結果を図８に示す。
<Example 45> Changes in blood concentration of CH / insulin complex in mice (1)
The test substance (Ins3-1, Ins3-2, or Ins3-3 (all in Example 35)) was injected into male ICR mice via the tail vein at a dose of 340 nmol / kg (2 mg / kg as the weight of insulin) (iv). Or subcutaneous injection (sc). Blood was collected at each time point from 0 to 49 hours after administration, and the collected blood was centrifuged to obtain serum. Serum insulin concentration was measured according to the method described in Example 14. FIG. 8 shows the results.
＜実施例４６＞ＣＨ／インスリン複合体のマウスにおける血中濃度の推移（２）
被験物質としてIns4-1、Ins4-2、またはIns4-3（いずれも実施例３５）を用い、投与後０〜４８時間の各時点で採血したことの他は、前記実施例４５と同じ操作を行った。結果を図９に示す。
<Example 46> Change in blood concentration of CH / insulin complex in mice (2)
Ins4-1, Ins4-2, or Ins4-3 (all in Example 35) were used as test substances, and blood was collected at each time point from 0 to 48 hours after administration. went. FIG. 9 shows the results.
＜実施例４７＞ＣＨ／インスリン複合体のマウスにおける血中濃度の推移（３）
被験物質としてIns5-1、Ins5-2、またはIns5-3（いずれも実施例３５）を用い、前記実施例４６と同じ操作を行った。結果を図１０に示す。
<Example 47> Change in blood concentration of CH / insulin complex in mice (3)
Using Ins5-1, Ins5-2, or Ins5-3 (all in Example 35) as test substances, the same operation as in Example 46 was performed. The results are shown in FIG.
図８〜図１０に示されるとおり、ＣＨ／インスリン複合体はＣＨ／ＧＬＰ−１複合体と同様、投与方法（静脈注射または皮下注射）には依存せず、同様の濃度推移を示した。 As shown in FIGS. 8 to 10, the CH / insulin complex exhibited the same concentration transition as the CH / GLP-1 complex without depending on the administration method (intravenous injection or subcutaneous injection).
＜実施例４８＞ＣＨ／インスリン複合体のマウスにおける薬効持続性
ストレプトゾトシンを２００ｍｇ／ｋｇの用量で雄のＩＣＲマウスに尾静脈注射し、糖尿病を惹起した。被験物質（Ins4-1、Ins5-2、Ins4-3（いずれも実施例３５）、デグルデク（Novo Nordisk社製）、またはグラルギン（Eli Lilly and Company社製））を１００
ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で雄のＩＣＲマウスに皮下注射した。投与後２〜２４時間の各時点で血糖値を測定した。血糖値の測定には簡易型自己血糖測定器（ライフチェック）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って測定を実施した。結果を図１１に示す。
<Example 48> Persistence of efficacy of CH / insulin complex in mice Streptozotocin was injected into male ICR mice at a dose of 200 mg / kg via tail vein to induce diabetes. A test substance (Ins4-1, Ins5-2, Ins4-3 (all in Example 35), degludec (Novo Nordisk), or glargine (Eli Lilly and Company)) was added in 100 parts.
Male ICR mice were injected subcutaneously at a dose of nmol / kg. Blood glucose levels were measured at each time point 2 to 24 hours after administration. The measurement of the blood glucose level was carried out by using a simple self-monitoring blood glucose meter (life check) and performing the operation according to the attached protocol. The results are shown in FIG.
図１１に示されるとおり、ＣＨ／インスリン複合体は持効型インスリン製剤であるデグルデクやグラルギンと同等以上の薬効持続性を示した。 As shown in FIG. 11, the CH / insulin conjugate exhibited a sustained efficacy equal to or greater than that of degludec or glargine, which is a long-acting insulin preparation.
＜実施例４９＞ＨＰＮ／インスリン複合体のマウスにおける血中濃度の推移
被験物質（Ins7-1、Ins7-2、Ins7-3、Ins6-1、Ins6-2、またはIns6-3（いずれも実施例３７））を１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で雄のＩＣＲマウスに尾静脈注射した。投与後０〜４８時間の各時点で採血し、回収した血液を遠心分離して血清を得た。以後、前記実施例４５と同じ操作を行った。結果を図１２に示す。
<Example 49> Change in blood concentration of HPN / insulin complex in mice Test substance (Ins7-1, Ins7-2, Ins7-3, Ins6-1, Ins6-2, or Ins6-3 (all examples) 37)) was injected into male ICR mice via the tail vein at a dose of 100 nmol / kg. Blood was collected at each time point from 0 to 48 hours after administration, and the collected blood was centrifuged to obtain serum. Thereafter, the same operation as in Example 45 was performed. FIG. 12 shows the results.
＜実施例５０＞ＨＰＮ／インスリン複合体のラットにおける血中濃度の推移
被験物質（Ins7-1（実施例３７））を９０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で雄のＦ３４４ラット
に尾静脈注射または皮下注射した。以後、前記実施例４５と同じ操作を行った。結果を図１３に示す。
<Example 50> Transition of blood concentration of HPN / insulin complex in rats A test substance (Ins7-1 (Example 37)) was injected into male F344 rats at a dose of 90 nmol / kg by tail vein injection or subcutaneous injection. Thereafter, the same operation as in Example 45 was performed. FIG. 13 shows the results.
＜実施例５１＞ＨＰＮ／インスリン複合体のマウスにおける薬効持続性
ストレプトゾトシンを２００ｍｇ／ｋｇの用量で雄のＩＣＲマウスに尾静脈注射し、糖尿病を惹起した。被験物質（Ins7-1、Ins7-2、Ins7-3（いずれも実施例３７）、デグルデク、またはグラルギン）を１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で雄のＩＣＲマウスに皮下注射した。以後、前記実施例４８と同じ操作を行った。結果を図１４に示す。
<Example 51> Persistence of efficacy of HPN / insulin complex in mice Streptozotocin was injected into male ICR mice at a dose of 200 mg / kg via tail vein to induce diabetes. Test substances (Ins7-1, Ins7-2, Ins7-3 (all in Example 37), degludec or glargine) were injected subcutaneously into male ICR mice at a dose of 100 nmol / kg. Thereafter, the same operation as in Example 48 was performed. FIG. 14 shows the results.
図１４に示されるとおり、ＨＰＮ／インスリン複合体は持効型インスリン製剤であるデグルデクやグラルギンと同等以上の薬効持続性を示した。 As shown in FIG. 14, the HPN / insulin conjugate exhibited a sustained efficacy equal to or higher than that of degludec or glargine, which is a long-acting insulin preparation.
＜実施例５２＞ＨＰＮ／インスリン複合体のラットにおける薬効持続性
被験物質（Ins7-1（実施例３７）、デグルデク、またはグラルギン）を１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で雄のＦ３４４ラットに皮下注射した。以後、前記実施例４８と同じ操作を行った。結果を図１５に示す。
<Example 52> Persistence of drug efficacy of HPN / insulin complex in rats A test substance (Ins7-1 (Example 37), degludec, or glargine) was injected subcutaneously into male F344 rats at a dose of 100 nmol / kg. Thereafter, the same operation as in Example 48 was performed. The results are shown in FIG.
図１５に示されるとおり、ＨＰＮ／インスリン複合体は、ラットにおいてもデグルデクやグラルギンと同等の薬効持続性を示した。 As shown in FIG. 15, the HPN / insulin conjugate also exhibited a sustained effect in rats equivalent to that of degludec or glargine.
本発明によれば、ペプチドの血中滞留性を増強することができる。よって、本発明によれば、例えば、ペプチドを有効成分とする医薬や製剤の効果を長期間持続させることができる。したがって、本発明は臨床においても研究においても極めて有用である。 According to the present invention, the retention of a peptide in blood can be enhanced. Therefore, according to the present invention, for example, the effects of a drug or a preparation containing a peptide as an active ingredient can be maintained for a long time. Therefore, the present invention is extremely useful both in clinical practice and in research.
Claims (15)
−Ａ１− （Ｌ１）
（式中、Ａ１は炭素数１以上のアルキレン基を表す。）
−Ａ１−Ｙ１−Ａ２− （Ｌ２）
（式中、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１は任意の結合を表す。）
−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｙ２−Ａ３− （Ｌ３）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立して任意の結合を表す。）
−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｐｈ−Ａ３− （Ｌ４）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｐｈはフェニレン基を表す。）
−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−ｃＨｅｘ−Ａ３− （Ｌ５）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、ｃＨｅｘはシクロヘキシレン基を表す。） The method according to claim 1, wherein the linker has a structure represented by any of the following general formulas (L1) to (L5).
-A 1- (L1)
(In the formula, A 1 represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms.)
-A 1 -Y 1 -A 2- (L2)
(In the formula, A 1 and A 2 each independently represent an alkylene group having 1 or more carbon atoms, and Y 1 represents an arbitrary bond.)
-A 1 -Y 1 -A 2 -Y 2 -A 3 - (L3)
(In the formula, A 1 , A 2 and A 3 each independently represent an alkylene group having 1 or more carbon atoms, and Y 1 and Y 2 each independently represent an arbitrary bond.)
-A 1 -Y 1 -A 2 -Ph-A 3- (L4)
(In the formula, A 1 , A 2 and A 3 each independently represent an alkylene group having 1 or more carbon atoms, A 2 and A 3 may or may not be independently present, and Y 1 may be any And Ph represents a phenylene group.)
-A 1 -Y 1 -A 2 -cHex-A 3- (L5)
(In the formula, A 1 , A 2 and A 3 each independently represent an alkylene group having 1 or more carbon atoms, A 2 and A 3 may or may not be independently present, and Y 1 may be any And cHex represents a cyclohexylene group.)
Ｚ１−Ａ１− （Ｌ６）
（式中、Ａ１は炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｚ１は任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２− （Ｌ７）
（式中、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｙ２−Ａ３− （Ｌ８）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立して任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｐｈ−Ａ３− （Ｌ９）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表し、Ｐｈはフェニレン基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−ｃＨｅｘ−Ａ３− （Ｌ１０）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表し、ｃＨｅｘはシクロヘキシレン基を表す。） The method according to claim 1, wherein the linker has a structure represented by any of the following formulas (L6) to (L10).
Z 1 -A 1- (L6)
(In the formula, A 1 represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms, and Z 1 represents an arbitrary functional group.)
Z 1 -A 1 -Y 1 -A 2- (L7)
(In the formula, A 1 and A 2 each independently represent an alkylene group having 1 or more carbon atoms, Y 1 represents an arbitrary bond, and Z 1 represents an arbitrary functional group.)
Z 1 -A 1 -Y 1 -A 2 -Y 2 -A 3 - (L8)
(Where A 1 , A 2 and A 3 each independently represent an alkylene group having 1 or more carbon atoms, Y 1 and Y 2 each independently represent an arbitrary bond, and Z 1 represents an arbitrary functional group Represents.)
Z 1 -A 1 -Y 1 -A 2 -Ph-A 3- (L9)
(In the formula, A 1 , A 2 and A 3 each independently represent an alkylene group having 1 or more carbon atoms, A 2 and A 3 may or may not be independently present, and Y 1 may be any Wherein Z 1 represents an arbitrary functional group, and Ph represents a phenylene group.)
Z 1 -A 1 -Y 1 -A 2 -cHex-A 3- (L10)
(In the formula, A 1 , A 2 and A 3 each independently represent an alkylene group having 1 or more carbon atoms, A 2 and A 3 may or may not be independently present, and Y 1 may be any Wherein Z 1 represents an arbitrary functional group, and cHex represents a cyclohexylene group.)
Ｚ１−Ａ１−Ｚ２ （Ｌ１１）
（式中、Ａ１は炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立して任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｚ２ （Ｌ１２）
（式中、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立して任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｙ２−Ａ３−Ｚ２ （Ｌ１３）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立して任意の結合を表し、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立して任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｐｈ−Ａ３−Ｚ２ （Ｌ１４）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立して任意の官能基を表し、Ｐｈはフェニレン基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−ｃＨｅｘ−Ａ３−Ｚ２ （Ｌ１５）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立して任意の官能基を表し、ｃＨｅｘはシクロヘキシレン基を表す。） The method according to claim 1, wherein the linker has a structure represented by any of the following formulas (L11) to (L15).
Z 1 -A 1 -Z 2 (L11)
(In the formula, A 1 represents an alkylene group having 1 or more carbon atoms, and Z 1 and Z 2 each independently represent an arbitrary functional group.)
Z 1 -A 1 -Y 1 -A 2 -Z 2 (L12)
(In the formula, A 1 and A 2 each independently represent an alkylene group having 1 or more carbon atoms, Y 1 represents an arbitrary bond, and Z 1 and Z 2 each independently represent an arbitrary functional group. )
Z 1 -A 1 -Y 1 -A 2 -Y 2 -A 3 -Z 2 (L13)
(In the formula, A 1 , A 2 and A 3 each independently represent an alkylene group having 1 or more carbon atoms, Y 1 and Y 2 each independently represent an arbitrary bond, and Z 1 and Z 2 each represent Independently represents any functional group.)
Z 1 -A 1 -Y 1 -A 2 -Ph-A 3 -Z 2 (L14)
(In the formula, A 1 , A 2 and A 3 each independently represent an alkylene group having 1 or more carbon atoms, A 2 and A 3 may or may not be independently present, and Y 1 is optional , Z 1 and Z 2 each independently represent an arbitrary functional group, and Ph represents a phenylene group.)
Z 1 -A 1 -Y 1 -A 2 -cHex-A 3 -Z 2 (L15)
(In the formula, A 1 , A 2 and A 3 each independently represent an alkylene group having 1 or more carbon atoms, A 2 and A 3 may or may not be independently present, and Y 1 is optional Wherein Z 1 and Z 2 each independently represent an arbitrary functional group, and cHex represents a cyclohexylene group.)
−Ｎ＝ＣＨ− （Ｙ１）
−ＣＨ＝Ｎ− （Ｙ２）
−ＮＨ−ＣＨ２− （Ｙ３）
―ＣＨ２−ＮＨ− （Ｙ４）
−ＮＨ−ＣＯ− （Ｙ５）
−ＣＯ−ＮＨ− （Ｙ６）
−Ｓ− （Ｙ７）
−Ｓ−Ｓ− （Ｙ８）
−ＣＯ−ＣＨ２−Ｓ− （Ｙ９）
−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ− （Ｙ１０）
−Ｓｕｃ−Ｓ− （Ｙ１１）
（式中、Ｓｕｃは１，３−ピロリジン−２，５−ジオン基を表す。）
−Ｓ−Ｓｕｃ− （Ｙ１２）
（式中、Ｓｕｃは１，３−ピロリジン−２，５−ジオン基を表す。） 5. The method according to claim 2, wherein Y 1 and Y 2 each independently have a structure represented by any one of the following general formulas (Y1) to (Y12). 6.
-N = CH- (Y1)
-CH = N- (Y2)
-NH-CH 2 - (Y3)
-CH 2 -NH- (Y4)
-NH-CO- (Y5)
-CO-NH- (Y6)
-S- (Y7)
-SS- (Y8)
-CO-CH 2 -S- (Y9)
—S—CH 2 —CO— (Y10)
-Suc-S- (Y11)
(In the formula, Suc represents a 1,3-pyrrolidine-2,5-dione group.)
-S-Suc- (Y12)
(In the formula, Suc represents a 1,3-pyrrolidine-2,5-dione group.)
−ＮＨ２ （Ｚ１）
−ＳＨ （Ｚ２）
−ＣＨＯ （Ｚ３）
−ＣＯ−ＣＨ２−Ｘ （Ｚ４）
（式中、Ｘは任意のハロゲン原子を表す。）
−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ （Ｚ５）
−Ｍａｌ （Ｚ６）
（式中、ＭａｌはＮ−マレイミド基を表す。）
−ＣＯ−Ｏ−Ｓｕ （Ｚ７）
（式中、ＳｕはＮ−スクシンイミジル基又は３−スルホ−Ｎ−スクシンイミジル基を表す。） The method according to any one of claims 3 to 5, wherein Z 1 and Z 2 each independently have a structure represented by any one of the following general formulas (Z1) to (Z7).
—NH 2 (Z1)
-SH (Z2)
-CHO (Z3)
—CO—CH 2 —X (Z4)
(In the formula, X represents any halogen atom.)
-N = C = S (Z5)
-Mal (Z6)
(In the formula, Mal represents an N-maleimide group.)
-CO-O-Su (Z7)
(In the formula, Su represents an N-succinimidyl group or a 3-sulfo-N-succinimidyl group.)
（Ａ）下記（ａ）に示されるＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸配列を含むペプチド。
（ａ）ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（ＧＬＰ−１（７−３７））
（Ｂ）下記（ｂ１）〜（ｂ３）からなる群より選択されるＧＬＰ−１（７−３７）のアナログのアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ１）ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＣ（ＧＬＰ−１Ｃ）
（ｂ２）ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＲＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（ＧＬＰ−１ＲＫ）
（ｂ３）ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＣ（ＧＬＰ−１ｏｒｉＣ）
（Ｃ）前記（ａ）および（ｂ１）〜（ｂ３）のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、血糖抑制作用を有する、ペプチド。
（Ｄ）前記（ａ）および（ｂ１）〜（ｂ３）のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、血糖抑制作用を有する、ペプチド。 The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the peptide is a peptide selected from the group consisting of the following (A) to (D).
(A) A peptide comprising the amino acid sequence of GLP-1 (7-37) shown in (a) below.
(A) HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (GLP-1 (7-37))
(B) a peptide comprising an amino acid sequence of an analog of GLP-1 (7-37) selected from the group consisting of (b1) to (b3) below.
(B1) HGEGFTFTSDVSYLEGQAAKEFIAWLVKGRC (GLP-1C)
(B2) HGGETFTSDVSSYLEGQAAREFIAWLVKGRG (GLP-1RK)
(B3) HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRC (GLP-1oriC)
(C) An amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence shown in any one of (a) and (b1) to (b3). A peptide comprising a blood sugar inhibitory action.
(D) A peptide comprising an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence shown in any one of (a) and (b1) to (b3), and having a blood glucose-suppressing action.
（Ａ）下記（ａ１）に示されるインスリンＡ鎖のアミノ酸配列を含むペプチド、又は下記（ａ２）若しくは（ａ３）に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（ａ１）ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ
（ａ２）前記（ａ１）に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
（ａ３）前記（ａ１）に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
（Ｂ）下記（ｂ１）に示されるインスリンＢ鎖のアミノ酸配列を含むペプチド、又は下記（ｂ２）若しくは（ｂ３）に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ１）ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ
（ｂ２）前記（ｂ１）に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
（ｂ３）前記（ｂ１）に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。 The peptide according to any one of claims 1 to 6, wherein the peptide is a peptide multimer containing the peptide shown in the following (A) and the peptide shown in the following (B), and is a peptide multimer having a blood sugar suppressing action. the method of.
(A) A peptide containing the amino acid sequence of the insulin A chain shown in (a1) below, or a peptide containing the amino acid sequence shown in (a2) or (a3) below.
(A1) GIVEQCCCTSICLYLYQLENYCN
(A2) an amino acid sequence in which one or several amino acid residues have been substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence shown in the above (a1).
(A3) an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence shown in (a1).
(B) A peptide containing the amino acid sequence of the insulin B chain shown in (b1) below, or a peptide containing the amino acid sequence shown in (b2) or (b3) below.
(B1) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT
(B2) an amino acid sequence in which one or several amino acid residues have been substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence shown in (b1).
(B3) an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence shown in (b1).
（式中、Ｚ１は任意の官能基を表し、Ｌはリンカーを表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。） A glycosaminoglycan derivative having a structure represented by Z 1 -LG.
(In the formula, Z 1 represents an arbitrary functional group, L represents a linker, and G represents glycosaminoglycan.)
（式中、Ｐはペプチドを表し、Ｌはリンカーを表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。） A complex of a glycosaminoglycan and a peptide having a structure represented by PLG.
(Wherein, P represents a peptide, L represents a linker, and G represents glycosaminoglycan.)
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| KR101309566B1 (en) * | 2010-12-10 | 2013-09-17 | 포항공과대학교 산학협력단 | Hyaluronic acid-protein conjugate, and preparation method thereof |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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