JP2019201603A - Method for producing three-dimensional gingival epithelium model in periodontitis-like state - Google Patents
Method for producing three-dimensional gingival epithelium model in periodontitis-like state Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019201603A JP2019201603A JP2018100314A JP2018100314A JP2019201603A JP 2019201603 A JP2019201603 A JP 2019201603A JP 2018100314 A JP2018100314 A JP 2018100314A JP 2018100314 A JP2018100314 A JP 2018100314A JP 2019201603 A JP2019201603 A JP 2019201603A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- state
- dimensional
- periodontal disease
- gingival epithelial
- model
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
本発明は、歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルの製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a three-dimensional gingival epithelial model in a periodontal disease-like state.
歯周病は、生活習慣病の一つで、口腔内の細菌の感染によって引き起こされる炎症性疾患である。歯垢中の細菌により歯肉組織に炎症が引き起こされ、近年ではこの歯肉の炎症が、脳梗塞、動脈硬化、糖尿病をはじめとする全身疾患と関係するとされていることから、歯周病を予防する事が全身の生活習慣病を予防することにつながると考えられている。 Periodontal disease is one of lifestyle-related diseases and is an inflammatory disease caused by bacterial infection in the oral cavity. Bacteria in dental plaque cause inflammation in the gingival tissue. In recent years, inflammation of the gingiva has been associated with systemic diseases such as cerebral infarction, arteriosclerosis, and diabetes, thus preventing periodontal disease. This is thought to lead to the prevention of lifestyle-related diseases throughout the body.
歯周病の予防、治療法を評価するにあたっては、動物の歯周組織を摘出する手法（特許文献１）や、ヒト臨床試験が一般的である。しかし、このような方法では、予防・治療剤のスクリーニングを同時に多検体で行うことは困難であったり、試験費用が非常に高額であったり、さらに動物試験では、個体差によるバラツキが多く、実施施設により実験結果に差が生じやすいといった問題があった。また近年、動物愛護の観点からも動物実験に代わる試験法の開発が望まれている。 In evaluating the prevention and treatment of periodontal diseases, a technique (Patent Document 1) for extracting periodontal tissues of animals and human clinical trials are common. However, with such a method, it is difficult to screen for prophylactic / therapeutic agents simultaneously on multiple specimens, the cost of the test is very high, and in animal tests, there are many variations due to individual differences. There was a problem that the experimental results were likely to vary depending on the facility. In recent years, it has been desired to develop a test method to replace animal experiments from the viewpoint of animal welfare.
上記問題に対し、近年、細胞を用いた試験法に関する研究が進められている。歯肉関連細胞を用いた研究として、歯肉組織から採取した細胞を培養し、メカニズム解明や基礎研究がおこなわれている。歯肉上皮細胞の単層培養系においては、細菌内毒素などを培地に添加し、炎症応答を得る評価方法は細胞の取扱いが容易であり、費用も安いことから広く用いられている（非特許文献１〜４）。ただしこれらの単層培養系では、細胞の分化形態は一様であり、単層のみからなり角化層を有していないため、１層のみからなる細胞レベルでの応答確認にとどまり、立体的な組織としての応答を評価することが困難であった。さらに培地に浸漬した状態での維持となり口腔内の環境を必ずしも模していないという問題があった。 In recent years, research on a test method using cells has been promoted for the above problem. As a study using gingival-related cells, cells collected from gingival tissues are cultured, and mechanism elucidation and basic research are being conducted. In a monolayer culture system of gingival epithelial cells, an evaluation method for obtaining an inflammatory response by adding bacterial endotoxin or the like to a medium is widely used because the cells are easy to handle and inexpensive. 1-4). However, in these monolayer culture systems, the differentiation form of the cells is uniform, and it is composed of only a single layer and does not have a keratinized layer. It was difficult to evaluate the response as a healthy organization. Furthermore, there was a problem that the environment in the oral cavity was not necessarily imitated because it was maintained in a state immersed in the medium.
一方、化粧品など皮膚研究の分野では、動物実験に代わる実験方法の１つとして、三次元に構築された人工皮膚モデルを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ試験が普及しており、様々なタイプの人工皮膚モデルの作製およびこれらを用いた試験方法について研究されている。 On the other hand, in the field of skin research such as cosmetics, in vitro tests using artificial skin models constructed in three dimensions are popular as one of the experimental methods to replace animal experiments. Studies are being made on fabrication and test methods using these.
オーラルケア分野では、動物実験が一般的であった背景もあり、歯肉上皮細胞を立体構築した三次元組織モデルについては十分に研究されていない。しかし、歯肉上皮細胞においても、気層培養することで角化層を有する三次元構築されたモデルを誘導することが可能である。例えば、乾燥羊膜を支持体として培養重層上皮シートを作製する方法（特許文献２）が報告されているが、乾燥羊膜がヒトを含む動物の胎児を包む生羊膜由来であり、大学等での研究に留まり、一般的な評価法としては普及していない。細胞を積層化する培養法は難易度が高く、品質やクオリティコントロールが非常に難しい。そこで、一定のクオリティコントロールのされている三次元歯肉上皮モデルを用いて、安定的に歯周病様の炎症誘導を行うことができれば、歯周病の予防・治療研究に有用であり、動物愛護の観点からも、三次元歯肉上皮モデルの活用が望まれている。 In the oral care field, animal experiments have been common, and a three-dimensional tissue model in which gingival epithelial cells are three-dimensionally constructed has not been fully studied. However, also in gingival epithelial cells, it is possible to induce a three-dimensional model having a keratinized layer by air-layer culture. For example, a method for producing a cultured stratified epithelial sheet using a dry amniotic membrane as a support (Patent Document 2) has been reported, but the dry amniotic membrane is derived from a raw amniotic membrane that wraps the fetus of an animal including a human, and research in universities and the like. However, it is not widely used as a general evaluation method. The culture method for stacking cells is very difficult, and quality and quality control are very difficult. Therefore, if it is possible to stably induce periodontal disease-like inflammation using a three-dimensional gingival epithelial model with a certain quality control, it will be useful for the prevention and treatment of periodontal disease, and animal welfare From this point of view, utilization of a three-dimensional gingival epithelial model is desired.
上述の通り、従来、口腔ケアの評価方法としては、動物やヒト臨床試験もしくは歯肉上皮の単層培養系にて評価する方法が用いられてきた。動物やヒト臨床試験では、個体値や症例の程度が異なり均一条件での試験の継続的な実施が困難である。また研究費用が非常に高額であるという問題があった。一方、単層培養系では、研究費用は安価であるものの、角化層を含まずかつ１層のみからなる細胞レベルでの応答確認にとどまり、立体的な組織としての応答を評価することが困難であった。さらに培地に浸漬した状態での維持となり口腔内の環境を必ずしも模していないという問題があった。 As described above, conventionally, as an evaluation method for oral care, a method for evaluating in an animal or human clinical test or a monolayer culture system of gingival epithelium has been used. In animal and human clinical trials, the individual values and the degree of cases are different, and it is difficult to continuously conduct tests under uniform conditions. There was also a problem that the research costs were very high. On the other hand, in the monolayer culture system, although the research cost is low, it is difficult to evaluate the response as a three-dimensional tissue because the response is only confirmed at the cell level that does not include the cornified layer and consists of only one layer. Met. Furthermore, there was a problem that the environment in the oral cavity was not necessarily imitated because it was maintained in a state immersed in the medium.
したがって、本発明は、三次元歯肉上皮モデルにおいて歯周病様状態を誘導する手段を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide means for inducing a periodontal disease-like state in a three-dimensional gingival epithelial model.
本発明者らは、正常状態の三次元歯肉上皮モデルを、病原因子および病原細菌の少なくとも一方を含む培地で培養することで、炎症性因子の放出量の増加および歯肉上皮の細胞接着の脆弱化等の組織学的な変化を誘導し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルを構築できることを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors cultured a normal three-dimensional gingival epithelial model in a medium containing at least one of a pathogenic factor and a pathogenic bacterium, thereby increasing the amount of inflammatory factor released and weakening cell adhesion of the gingival epithelium. The present inventors have found that a three-dimensional gingival epithelial model of a periodontal disease-like state can be constructed in vitro by inducing histological changes such as the above.
すなわち、本発明の一形態によれば、正常状態の三次元歯肉上皮モデルを、病原因子および病原細菌の少なくとも一方を含む培地で培養して、歯周病様状態を誘導する誘導工程を有する、歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルの製造方法が提供される。 That is, according to one aspect of the present invention, a normal state three-dimensional gingival epithelial model is cultured in a medium containing at least one of a pathogenic factor and a pathogenic bacterium, and has an induction step of inducing a periodontal disease-like state. A method for producing a three-dimensional gingival epithelial model of a periodontal disease-like state is provided.
本発明によれば、三次元歯肉上皮モデルにおいて歯周病様状態を誘導する手段を提供することができる。 According to the present invention, a means for inducing a periodontal disease-like state in a three-dimensional gingival epithelial model can be provided.
以下、本発明を実施するための形態を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態のみに限定されることはない。 Hereinafter, although the form for implementing this invention is demonstrated in detail, the technical scope of this invention is not limited only to the following form.
＜歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルの製造方法＞
本発明の一形態は、正常状態の三次元歯肉上皮モデルを、病原因子および病原細菌の少なくとも一方を含む培地で培養して、歯周病様状態を誘導する誘導工程を有する、歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルの製造方法である。
<Method for producing a three-dimensional gingival epithelial model of periodontal disease-like state>
One aspect of the present invention is a periodontal disease-like state having an induction step of inducing a periodontal disease-like state by culturing a normal three-dimensional gingival epithelial model in a medium containing at least one of a pathogenic factor and a pathogenic bacterium. It is a manufacturing method of the three-dimensional gingival epithelial model of a state.
本発明に係る製造方法は、正常状態の三次元歯肉上皮モデルを、病原因子および病原細菌の少なくとも一方を含む培地で培養して、歯周病様状態を誘導する誘導工程を有する。 The production method according to the present invention includes an induction step of inducing a periodontal disease-like state by culturing a normal three-dimensional gingival epithelial model in a medium containing at least one of a pathogenic factor and a pathogenic bacterium.
三次元歯肉上皮モデルとは、ヒト歯肉上皮にきわめて類似した組織学的形態を有する人工再生組織モデルであり、角化組織を有する。歯周病様状態とは、歯周病様の炎症が誘導された状態であり、後述するように、炎症性因子の放出量の増加、細胞接着の脆弱化や細胞形状の変化などの歯肉細胞の組織学的な変化などによって、判断することができる。一方、正常状態とは、健康なヒト歯肉上皮と類似した組織学的形態の状態であり、少なくとも炎症の症状を有さない状態である。 The three-dimensional gingival epithelial model is an artificial regenerative tissue model having a histological form very similar to human gingival epithelium, and has a keratinized tissue. Periodontal disease-like state is a state in which periodontal disease-like inflammation is induced, and as described later, gingival cells such as increased release of inflammatory factors, weakened cell adhesion, and changes in cell shape Judgment can be made based on histological changes. On the other hand, the normal state is a state having a histological form similar to that of a healthy human gingival epithelium, and is a state having at least no inflammation symptoms.
正常状態の三次元歯肉上皮モデルは、正常ヒト歯肉上皮細胞をポリカーボネートフィルター上などで気液界面培養することにより構築されたものであることが好ましい。これにより、健常なヒト歯肉上皮にきわめて類似した組織学的形態を有する三次元歯肉上皮モデルを製造することができる。また、歯肉上皮モデルが三次元の組織モデルであること、すなわち歯肉上皮細胞が積層されていることは、顆粒層でのフィラグリンの発現、基底層上部でのケラチン６、ケラチン１０、ケラチン１３、ケラチン１６の発現などの組織学的な形態を確認することで判断することができる。このような正常状態の三次元歯肉上皮モデルの市販品としては、ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標） ＨＧＥ（株式会社ニコダームリサーチ）などが挙げられる。 The normal three-dimensional gingival epithelial model is preferably constructed by subjecting normal human gingival epithelial cells to gas-liquid interface culture on a polycarbonate filter or the like. This makes it possible to produce a three-dimensional gingival epithelial model having a histological morphology very similar to a healthy human gingival epithelium. In addition, the fact that the gingival epithelial model is a three-dimensional tissue model, that is, that gingival epithelial cells are laminated, the expression of filaggrin in the granular layer, keratin 6, keratin 10, keratin 13, keratin in the upper basal layer. It can be determined by confirming the histological form such as the expression of 16. As a commercially available product of such a normal three-dimensional gingival epithelial model, SkinEthic (registered trademark) HGE (Nikoderm Research Co., Ltd.) and the like can be mentioned.
本発明に係る製造方法では、上記正常状態の三次元歯肉上皮モデルを、病原因子および病原細菌の少なくとも一方を含む培地で培養することを有する。これにより、効果的に歯肉上皮細胞を歯周病様状態へと誘導することができる。 The production method according to the present invention includes culturing the normal three-dimensional gingival epithelial model in a medium containing at least one of a pathogenic factor and a pathogenic bacterium. Thereby, gingival epithelial cells can be effectively induced into a periodontal disease-like state.
病原因子としては、歯周病を誘導できる物質であれば、特に制限されず、例えばリポ多糖（ＬＰＳ）などの細菌内毒素、膜タンパク（ＯＭＰ）、Ｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｅ−ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ ａｃｉｄ（Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））などの病原細菌の構成成分などが挙げられる。これらの病原因子としては、細菌由来のものを使用できる。病原因子が由来する細菌としては、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、タンネレラ・ファーサイシア（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａ）、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）などの歯周病原細菌；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などが挙げられる。病原因子は、好ましくはＬＰＳ、ＯＭＰおよびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）から選択される少なくとも一つであり、より好ましくはＬＰＳである。 The pathogenic factor is not particularly limited as long as it is a substance capable of inducing periodontal disease. For example, bacterial endotoxins such as lipopolysaccharide (LPS), membrane protein (OMP), polyinosine-polycytic acid (Poly (I: C)) ) And other components of pathogenic bacteria. As these pathogenic factors, those derived from bacteria can be used. Bacteria from which virulence factors are derived include Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Tannerella forsythia tergium tergium tergium tergium tergium tergium acc. Examples include periodontopathic bacteria such as Prevotella intermedia and Fusobacterium nucleatum; Escherichia coli. The virulence factor is preferably at least one selected from LPS, OMP and Poly (I: C), more preferably LPS.
病原因子は、ヒト口腔内から採取された口腔内細菌やヒト体内から採取された病原細菌、これらの細菌由来の成分などを超音波処理により微細化する方法で調製することができる。また、市販品を用いることもでき、例えばＬｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ｆｒｏｍ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１（富士フイルム和光純薬株式会社）、ＬＰＳ−ＰＧ（ＬＰＳ Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来）（ナカライテスク株式会社）などが挙げられる。 The pathogenic factor can be prepared by a method in which oral bacteria collected from the human oral cavity, pathogenic bacteria collected from the human body, components derived from these bacteria, and the like are refined by ultrasonic treatment. Commercially available products can also be used, for example, Lipopolysaccharide, from E.I. coli O111 (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), LPS-PG (derived from LPS P. gingivalis) (Nacalai Tesque Co., Ltd.) and the like.
培地に含まれる病原因子の量は、歯周病様状態を誘導することができれば特に制限されないが、例えば０．０１〜１０００μｇ／ｍＬであり、好ましくは１０〜５００μｇ／ｍＬであり、より好ましくは５０〜２００μｇ／ｍＬである。 The amount of the pathogenic factor contained in the medium is not particularly limited as long as it can induce a periodontal disease-like state, for example, 0.01 to 1000 μg / mL, preferably 10 to 500 μg / mL, more preferably 50-200 μg / mL.
病原細菌としては、公知の歯周病状態を誘導できる細菌を使用できる。病原細菌としては、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）などが挙げられる。 As a pathogenic bacterium, a bacterium capable of inducing a known periodontal disease state can be used. Examples of pathogenic bacteria include Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Aggregatebacter actinomycetemcomitaminetium .
培地に含まれる病原細菌の量は、歯周病様状態を誘導することができれば特に制限されないが、例えば１．０×１０４〜１．０．×１０９ＣＦＵ／モデルであり、好ましくは１．０×１０６〜１．０×１０８ＣＦＵ／モデルである。 The amount of pathogenic bacteria contained in the medium is not particularly limited as long as it can induce a periodontal disease-like state, but, for example, 1.0 × 10 4 to 1.0. × 10 9 CFU / model, preferably 1.0 × 10 6 to 1.0 × 10 8 CFU / model.
培地としては、三次元歯肉上皮モデルを維持培養できる維持培地であれば、特に制限されない。例えば、三次元歯肉上皮モデルとしてＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標） ＨＧＥ（株式会社ニコダームリサーチ）を使用する場合、同モデル専用であるＭＡＩＮＴＥＮＡＮＣＥ ＭＥＤＩＵＭ、必要に応じてＧＲＯＷＴＨ ＭＥＤＩＵＭを維持培地として使用できる。 The medium is not particularly limited as long as it is a maintenance medium that can maintain and culture a three-dimensional gingival epithelial model. For example, when SkinEthic (registered trademark) HGE (Nicoderm Research Co., Ltd.) is used as a three-dimensional gingival epithelial model, MAINTENANCE MEDIUM dedicated to the model and, if necessary, GROWTH MEDIUM can be used as a maintenance medium.
三次元歯肉上皮モデルの培養方法は、特に制限されず、培養する三次元歯肉上皮モデルに応じて適宜選択できる。ヒト歯肉上皮細胞を用いた三次元歯肉上皮モデルの場合、培養温度は、通常、３６〜３８℃程度であり、好ましくは約３７℃である。培地のｐＨは、特に制限されないが、通常６〜８程度である。培養時間は、特に制限されず、使用する病原因子および病原細菌によって異なるが、歯周病様の炎症が誘導されればよく、例えば１時間〜７日間である。細菌内毒素を用いる場合、培養時間は、通常２４時間以上であり、好ましくは２４〜９６時間であり、より好ましくは４０〜８０時間である。 The culture method of the three-dimensional gingival epithelial model is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the three-dimensional gingival epithelial model to be cultured. In the case of a three-dimensional gingival epithelial model using human gingival epithelial cells, the culture temperature is usually about 36 to 38 ° C, preferably about 37 ° C. The pH of the medium is not particularly limited, but is usually about 6-8. The culture time is not particularly limited and varies depending on the pathogenic factor and pathogenic bacteria to be used, but periodontal disease-like inflammation may be induced, for example, 1 hour to 7 days. When using bacterial endotoxin, the culture time is usually 24 hours or longer, preferably 24 to 96 hours, more preferably 40 to 80 hours.
正常状態の三次元歯肉上皮モデルが歯周病様状態に誘導されたことは、炎症性因子の放出量や歯肉細胞の組織学的な変化により確認できる。 The induction of a normal three-dimensional gingival epithelial model into a periodontal disease-like state can be confirmed by the amount of inflammatory factor released and histological changes in gingival cells.
ヒト口腔内における歯周病状態では、炎症性因子の放出量が増加し炎症状態になることや、細胞接着の脆弱化、細胞形状の変化といった組織学的な変化が知られている。 In the periodontal disease state in the human oral cavity, histological changes such as an increased inflammatory factor release amount and an inflammatory state, weakened cell adhesion, and a change in cell shape are known.
したがって、本発明に係る製造方法において、上記誘導工程後、炎症性因子の放出量を測定する工程および歯肉細胞の組織学的な変化を測定または観察する工程の少なくとも一方をさらに有することが好ましい。 Therefore, the production method according to the present invention preferably further includes at least one of a step of measuring the amount of inflammatory factor released and a step of measuring or observing histological changes of gingival cells after the induction step.
炎症性因子としては、ＴＮＦα（腫瘍壊死因子、Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ α）、インターロイキン類（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｌｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２）、ケモカイン類（ＩＬ−８、ＭＧＳＡ／Ｇｒｏ、γＩＰ−１０、ＭＣＰ−１／ＭＣＡＦ）、コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ）、増殖因子（ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ＮＧＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β）、プロスタグランジン（ＰＧＥ２）、エンドセリン（ＥＴ）などが挙げられる。炎症性因子は、好ましくはＴＮＦα、およびインターロイキン類である。これらの炎症性因子の放出量の増加は、炎症状態であることを示し、よって三次元歯肉上皮モデルが歯周病様状態に誘導されたことを判断できる。 Inflammatory factors include TNFα (tumor necrosis factor, Tumor Necrosis Factor α), interleukins (IL-1α, IL-1β, IL-1lra, IL-6, IL-7, IL-10, IL-11, IL-12), chemokines (IL-8, MGSA / Gro, γIP-10, MCP-1 / MCAF), colony stimulating factor (GM-CSF, G-CSF, M-CSF), growth factor (TGF-α) , TGF-β, bFGF, PDGF, PD-ECGF, VEGF / VPF, NGF), interferon (IFN-α, IFN-β), prostaglandin (PGE2), endothelin (ET) and the like. Inflammatory factors are preferably TNFα and interleukins. An increase in the release amount of these inflammatory factors indicates an inflammatory state, and thus it can be determined that the three-dimensional gingival epithelial model has been induced to a periodontal disease-like state.
炎症性因子の放出量は、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定することができる。炎症性因子の放出量がコントロールの炎症性因子の放出量と対比して有意に多いときに、正常状態の三次元歯肉上皮モデルが歯周病様状態に誘導されていると判断することができる。「有意」のレベルは、統計的に適宜設定でき、例えば有意水準として５％（０．０５）といった基準を設定できる。 The amount of inflammatory factor released can be measured using an ELISA method. When the amount of inflammatory factor released is significantly higher than that of the control inflammatory factor, it can be determined that the normal three-dimensional gingival epithelial model is induced in a periodontal disease-like state. . The level of “significance” can be set statistically as appropriate. For example, a criterion such as 5% (0.05) can be set as the significance level.
細胞接着の脆弱化とは、細胞接着因子の減少により、細胞間の接着力が弱まり、細胞同士の結合が緩くなり、組織として崩れやすくなった状態を指す。このような細胞接着の脆弱化は、細胞凍結切片の組織像観察、ギャップジャンクションやタイトジャンクション（ＺＯ−１、オクルディン、クローディン）およびアドヘレンスジャンクション（カドヘリン、特にＥ−カドヘリン）や接着分子（ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＥＬＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、インテグリン、フィブロネクチン、ラミニン）など細胞接着因子の測定または組織染色像による観察、バリア機能の評価として一般的な経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）またはそれに代わるイオンインデックス（Ｐ値）の測定により確認できる。 The weakening of cell adhesion refers to a state in which the adhesion between cells is weakened due to a decrease in cell adhesion factors, the bonds between cells are loosened, and the tissue tends to collapse. Such weakening of cell adhesion includes observation of tissue images of frozen cell sections, gap junctions, tight junctions (ZO-1, occludin, claudin) and adherence junctions (cadherin, particularly E-cadherin) and adhesion molecules ( Measurement of cell adhesion factors such as PECAM, ICAM-1, ELAM-1, VCAM-1, integrin, fibronectin, laminin), observation by tissue staining, evaluation of barrier function, transepithelial electrical resistance (TEER) or This can be confirmed by measuring an alternative ion index (P value).
組織像観察、組織染色像による観察および経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）は、従来公知の手法を用いることができる。細胞接着因子の測定には、例えばＥＬＩＳＡ法を使用できる。また、イオンインデックス（Ｐ値）とは、高感度角層膜厚・水分計を用いて交流印加により測定され、角層の厚さやバリア機能の指標となる値である。本形態の製造方法において、Ｐ値は、７０以上であり、好ましくは８０以上であり、より好ましくは１００以上であり、さらに好ましくは２００以上である。 Conventionally known methods can be used for tissue image observation, tissue staining image observation, and transepithelial electrical resistance (TEER). For example, an ELISA method can be used to measure the cell adhesion factor. The ion index (P value) is a value measured by alternating current application using a highly sensitive stratum corneum film thickness / moisture meter and serving as an index of stratum corneum thickness and barrier function. In the production method of the present embodiment, the P value is 70 or more, preferably 80 or more, more preferably 100 or more, and further preferably 200 or more.
すなわち、「歯肉細胞の組織学的な変化を測定または観察する工程」とは、細胞凍結切片の組織像観察、細胞接着因子の測定、組織染色像による観察、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の測定およびイオンインデックス（Ｐ値）の測定の少なくとも一つを実施することを意味する。 That is, “the process of measuring or observing histological changes of gingival cells” means histological observation of frozen cell sections, measurement of cell adhesion factor, observation by tissue staining image, measurement of transepithelial electrical resistance (TEER) And at least one of measurement of ion index (P value).
正常状態の三次元歯肉上皮モデルが歯周病様状態に誘導されたことを判断する場合、複数の測定および観察を組み合わせることが好ましい。好ましい組み合わせとしては、組織染色像による観察およびＰ値の測定である。 When determining that a normal three-dimensional gingival epithelial model has been induced to a periodontal disease-like state, it is preferable to combine multiple measurements and observations. A preferred combination is observation with a tissue stained image and measurement of the P value.
一実施形態では、誘導工程において、正常状態の三次元歯肉上皮モデルの角化組織側に病原因子および病原細菌の少なくとも一方を添加して培養してもよい。角化組織側および培地側の双方に病原因子および病原細菌の少なくとも一方を添加することにより、より顕著な歯周病状態を誘導することができる。 In one embodiment, in the induction step, at least one of a pathogenic factor and a pathogenic bacterium may be added to the keratinized tissue side of a normal three-dimensional gingival epithelial model and cultured. A more prominent periodontal disease state can be induced by adding at least one of a pathogenic factor and a pathogenic bacterium to both the keratinized tissue side and the medium side.
図２は、一実施形態で使用する培養用プレートの模式図である。図２に示すように、ウェル（プレート）３には、三次元歯肉上皮モデルのウェル２が配置され、正常状態の三次元上皮モデル（細胞部分）１と接触するように病原因子および病原細菌の少なくとも一方を含む培地４が充填されている。必要に応じて、正常状態の三次元上皮モデル（細胞部分）１の上部（角化組織側）に病原因子および病原細菌の少なくとも一方を添加してもよい。 FIG. 2 is a schematic view of a culture plate used in one embodiment. As shown in FIG. 2, a well (plate) 3 is provided with a well 2 of a three-dimensional gingival epithelial model and contains pathogenic factors and pathogenic bacteria so as to come into contact with the normal three-dimensional epithelial model (cell portion) 1. The culture medium 4 containing at least one is filled. If necessary, at least one of a pathogenic factor and a pathogenic bacterium may be added to the upper part (keratinized tissue side) of the normal three-dimensional epithelial model (cell part) 1.
本発明の一実施形態は、本発明に係る製造方法により製造された、歯周病様状態の三次元上皮モデルである。歯周病様状態の三次元上皮モデルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの歯周病様状態を再現することができ、ヒトや動物を用いることなく、個体値や歯周病の程度のバラツキが抑えられ、再現性の高い試験評価を行うことができる。また、安定的に複数のモデルに対して歯周病様状態を再現できることから、歯周病に対する予防・治療に関わる成分および／または改善作用のある成分を含む薬剤や組成物がもつ作用の評価や開発を効率よく行うことができる。 One embodiment of the present invention is a three-dimensional epithelial model in a periodontal disease-like state manufactured by the manufacturing method according to the present invention. The three-dimensional epithelial model of the periodontal disease-like state can reproduce the periodontal disease-like state in vitro, and the variation in individual values and the degree of periodontal disease can be suppressed without using humans or animals. Test evaluation with high reproducibility can be performed. In addition, since the periodontal disease-like state can be stably reproduced for multiple models, the effects of drugs and compositions containing components related to prevention and treatment of periodontal disease and / or components that have an improving action can be evaluated. And can be developed efficiently.
したがって、本発明の一実施形態は、本発明に係る製造方法により製造された歯周病様状態の三次元上皮モデルを用いる、被験物質を評価またはスクリーニングする方法である。具体的には、前記被験物質の存在下、前記歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルを培養する。この際、コントロールとして、被験物質の非存在下で培養した歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルを用いることが好ましい。被験物質の存在下および非存在下で培養した歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルを比較することにより、被験物質の有用性、安全性などを判断することができる。被験物質の評価およびスクリーニングは、培養後、炎症性因子の放出量を測定したり、細胞接着の脆弱化、細胞形状の変化といった組織学的な変化を調べたりすることにより、行うことができる。コントロールと比較して、炎症性因子の放出量の低下、接着の脆弱化の抑制により、被験物質の有用性を評価できる。 Therefore, one embodiment of the present invention is a method for evaluating or screening a test substance using a three-dimensional epithelial model of a periodontal disease-like state produced by the production method according to the present invention. Specifically, the three-dimensional gingival epithelial model in the periodontal disease-like state is cultured in the presence of the test substance. In this case, it is preferable to use a three-dimensional gingival epithelial model in a periodontal disease-like state cultured in the absence of the test substance as a control. By comparing three-dimensional gingival epithelial models of periodontal disease-like state cultured in the presence and absence of the test substance, the usefulness, safety, etc. of the test substance can be determined. Evaluation and screening of a test substance can be performed by measuring the amount of inflammatory factor released after culturing, or examining histological changes such as weakening of cell adhesion and changes in cell shape. Compared with the control, the usefulness of the test substance can be evaluated by reducing the amount of inflammatory factor released and suppressing the weakening of adhesion.
被験物質の評価またはスクリーニング方法では、好ましくは被験物質の存在下、必要に応じて非存在下で、歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルを培養することを有する。 The test substance evaluation or screening method preferably includes culturing a three-dimensional gingival epithelial model in a periodontal disease-like state in the presence of the test substance, and optionally in the absence.
被験物質としては、特に制限されないが、鎮痛・消炎・抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ、ステロイドなど）、抗生物質、動植物からの抽出物、生薬、核酸、糖類、糖アルコール、ポリペプチドなどを挙げることができる。被験物質は、新規なものであっても、公知のものでもよい。 Test substances include, but are not limited to, analgesic / anti-inflammatory / anti-inflammatory drugs (NSAID, steroids, etc.), antibiotics, extracts from animals and plants, crude drugs, nucleic acids, sugars, sugar alcohols, polypeptides, etc. . The test substance may be new or known.
＜三次元歯肉上皮モデルにおける歯周病様状態を誘導する方法＞
本発明の別の形態は、正常状態の三次元歯肉上皮モデルを、病原因子および病原細菌の少なくとも一方を含む培地で培養することを有する、三次元歯肉上皮モデルにおける歯周病様状態を誘導する方法である。
<Method for inducing periodontal disease-like state in a three-dimensional gingival epithelial model>
Another aspect of the present invention induces a periodontal disease-like state in a three-dimensional gingival epithelial model comprising culturing a normal three-dimensional gingival epithelial model in a medium containing at least one of a pathogenic factor and a pathogenic bacterium. Is the method.
本発明に係る三次元歯肉上皮モデルにおける歯周病様状態を誘導する方法において、正常状態の三次元歯肉上皮モデルを、病原因子および病原細菌の少なくとも一方を含む培地で培養する方法は、上記本発明に係る製造方法と同じ方法が用いられる。よって、ここでは、詳細な説明を省略する。 In the method for inducing a periodontal disease-like state in the three-dimensional gingival epithelial model according to the present invention, the method for culturing a normal three-dimensional gingival epithelial model in a medium containing at least one of a pathogenic factor and a pathogenic bacterium is as described above. The same method as the manufacturing method according to the invention is used. Therefore, detailed description is omitted here.
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲がこれに限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited thereto.
実施例１：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＬＰＳによる歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルの作製
１．試験概要
Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＬＰＳを用いて歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルを作製して、炎症性因子の放出量と組織学上の変化を確認した。
Example 1: Preparation of three-dimensional gingival epithelial model of periodontal disease-like state by LPS derived from E. coli Test Outline E. A three-dimensional gingival epithelial model of periodontal disease-like state was prepared using LPS derived from E. coli, and the amount of inflammatory factor released and histological changes were confirmed.
２．試験試料
三次元歯肉上皮モデル：ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標） ＨＧＥ（株式会社ニコダームリサーチ）
細菌内毒素：Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ， ｆｒｏｍ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１（富士フイルム和光純薬株式会社）
ＰＢＳ（−）：リン酸緩衝生理食塩水。
2. Test sample Three-dimensional gingival epithelial model: SkinEthic (registered trademark) HGE (Nikoderm Research Co., Ltd.)
Bacterial endotoxins: Lipopolysaccharide, from E. E. coli O111 (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
PBS (-): phosphate buffered saline.
３．試験方法
ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標） ＨＧＥ（以下、「ＨＧＥ」とも称す）を製造会社のプロトコルに従って、維持培地（ＭＡＩＮＴＥＮＡＮＣＥ ＭＥＤＩＵＭ）を添加したプレートにて一晩馴化した。培地として、維持培地（コントロール）または５０、１００もしくは２００μｇ／ｍＬのＬｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ， ｆｒｏｍ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１（以下、「Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＰＳ」とも称す）を含有する維持培地を別のプレートに１ｍＬ添加して、馴化したＨＧＥを設置した。設置後、ＰＢＳ（−）１５０μＬをＨＧＥ上部に適用して、３７℃にて培養を開始した。４８時間培養後、培地を維持培地に交換した。ＨＧＥ上部のＰＢＳ（−）を除去した後、ＰＢＳ（−）を１５０μＬ適用し、さらに２４時間培養した（７２時間培養）。
3. Test Method SkinEthic (registered trademark) HGE (hereinafter also referred to as “HGE”) was conditioned overnight on a plate supplemented with maintenance medium (MAINTENANCE MEDIUM) according to the manufacturer's protocol. As the medium, maintenance medium (control) or 50, 100 or 200 μg / mL Lipopolysaccharide, from E. coli. 1 mL of maintenance medium containing E. coli O111 (hereinafter also referred to as “E. coli LPS”) was added to another plate, and conditioned HGE was installed. After installation, 150 μL of PBS (−) was applied to the top of HGE, and culture was started at 37 ° C. After culturing for 48 hours, the medium was replaced with a maintenance medium. After removing PBS (−) at the top of HGE, 150 μL of PBS (−) was applied and further cultured for 24 hours (72 hours culture).
４８時間培養後の培地および７２時間培養後の培地を回収して、培養上清中の炎症性因子（４８時間培養後：ＴＮＦα、ＩＬ−６およびＩＬ−８、７２時間培養後：ＴＮＦαおよびＩＬ−８）の量を、ＥＬＩＳＡ法（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いて測定した。バリア機能は、角層膜厚・水分計ＡＳＡ−ＭＸ１００（日本アッシュ株式会社）を用いて、Ｐ値（イオンインデックス）を測定した。測定後の三次元歯肉上皮モデルから凍結切片を作成して組織像を顕微鏡（カールツァイス社製、倍率：１００）を用いて観察した。有意差検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定を行い、コントロールと比較評価した。 The culture medium after 48-hour culture and the culture medium after 72-hour culture were collected, and inflammatory factors in the culture supernatant (after 48-hour culture: TNFα, IL-6 and IL-8, after 72-hour culture: TNFα and IL) The amount of -8) was measured using the ELISA method (R & D Systems). For the barrier function, the P value (ion index) was measured using a stratum corneum film thickness / moisture meter ASA-MX100 (Nippon Ash Corporation). A frozen section was prepared from the three-dimensional gingival epithelial model after measurement, and a tissue image was observed using a microscope (manufactured by Carl Zeiss, magnification: 100). For the significant difference test, a Student t test was performed and compared with the control.
７２時間培養後のＨＧＥの細胞生存率をアラマブルー法にて評価したところ、細胞生存率は、ほぼ１００％であった（データ示さず）。 When the cell viability of HGE after 72 hours of culture was evaluated by the Alama Blue method, the cell viability was almost 100% (data not shown).
４．結果
回収した培地中の炎症性因子の測定結果を表１〜３に示す。培養４８時間後のＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳを含む培地では、ＴＮＦα、ＩＬ−６およびＩＬ−８の有意な増加が認められた（表１〜３）。維持培地（Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＰＳ未含有培地）に交換して、さらに２４時間培養した培地では、ＴＮＦαおよびＩＬ−８の有意な増加が維持されていることが確認された（表１および３）。７２時間培養終了後のＨＧＥのＰ値は有意に増加し（表４）、組織切片像においても細胞接着の脆弱化を確認した（図１）。これらの変化は歯周病に見られる特徴である。
4). Result The measurement result of the inflammatory factor in the collect | recovered culture medium is shown to Tables 1-3. E. coli after 48 hours of culture. In the medium containing E. coli LPS, significant increases in TNFα, IL-6 and IL-8 were observed (Tables 1 to 3). It was confirmed that a significant increase in TNFα and IL-8 was maintained in the medium that was replaced with the maintenance medium (E. coli LPS-free medium) and cultured for another 24 hours (Tables 1 and 3). The P value of HGE after 72 hours of culture was significantly increased (Table 4), and weakening of cell adhesion was also confirmed in the tissue section image (FIG. 1). These changes are characteristic of periodontal disease.
実施例２：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＬＰＳによる歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルを用いた薬剤の有用性評価
１．試験概要
歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルを用いた抗炎症剤の有用性を評価した。
Example 2: Efficacy evaluation of drugs using a three-dimensional gingival epithelial model of periodontal disease-like state by LPS derived from E. coli Test Outline The usefulness of anti-inflammatory agents using a three-dimensional gingival epithelial model of periodontal disease-like state was evaluated.
２．試験試料
三次元歯肉上皮モデル：ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標） ＨＧＥ（株式会社ニコダームリサーチ）
細菌内毒素（ＬＰＳ）：Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ， ｆｒｏｍ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１（富士フイルム和光純薬株式会社）
抗炎症剤：グリチルリチン酸ジカリウム
ＰＢＳ（−）：リン酸緩衝生理食塩水。
2. Test sample Three-dimensional gingival epithelial model: SkinEthic (registered trademark) HGE (Nikoderm Research Co., Ltd.)
Bacterial endotoxin (LPS): Lipopolysaccharide, from E. E. coli O111 (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
Anti-inflammatory agent: dipotassium glycyrrhizinate PBS (-): phosphate buffered saline.
３．試験方法
ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標） ＨＧＥ（以下、「ＨＧＥ」とも称す）を製造会社のプロトコルに従って、維持培地（ＭＡＩＮＴＥＮＡＮＣＥ ＭＥＤＩＵＭ）を添加したプレートにて一晩馴化した。培地として、維持培地（コントロール）または５０、１００もしくは２００μｇ／ｍＬのＬｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ， ｆｒｏｍ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１（以下、「Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＰＳ」とも称す）を含有する維持培地を別のプレートに１ｍＬ添加して、馴化したＨＧＥを設置した。設置後、ＰＢＳ（−）１５０μＬをＨＧＥ上部に適用して、３７℃にて培養を開始した。４８時間培養後、培地を維持培地に交換した。ＨＧＥ上部のＰＢＳ（−）を除去した後、０．０１質量％のグリチルリチン酸ジカリウムを含有する薬剤溶液またはＰＢＳ（−）を１５０μＬ適用して、さらに２４時間培養した。培養上清中の炎症性因子（ＴＮＦαおよびＩＬ−８）の量を、ＥＬＩＳＡ法（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いて測定した。有意差検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定を行い、コントロールと比較評価した。
3. Test Method SkinEthic® HGE (hereinafter also referred to as “HGE”) was conditioned overnight on a plate supplemented with maintenance medium (MAINTENANCE MEDIUM) according to the manufacturer's protocol. As the medium, maintenance medium (control) or 50, 100 or 200 μg / mL of Lipopolysaccharide, from E. coli. 1 mL of maintenance medium containing E. coli O111 (hereinafter also referred to as “E. coli LPS”) was added to another plate, and conditioned HGE was installed. After installation, 150 μL of PBS (−) was applied to the top of HGE, and culture was started at 37 ° C. After culturing for 48 hours, the medium was replaced with a maintenance medium. After removing PBS (−) at the top of HGE, 150 μL of a drug solution containing 0.01% by mass of dipotassium glycyrrhizinate or PBS (−) was applied and further cultured for 24 hours. The amount of inflammatory factors (TNFα and IL-8) in the culture supernatant was measured using an ELISA method (R & D Systems). For the significant difference test, a Student t test was performed and compared with the control.
４．結果
回収した培地中の炎症性因子の測定結果を表５および６に示す。歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルでは、ＴＮＦαおよびＩＬ−８が増加したのに対し、歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルに薬剤を２４時間適用することで炎症性因子の放出量を抑える作用が確認された。
4). Results Tables 5 and 6 show the measurement results of inflammatory factors in the collected medium. In the three-dimensional gingival epithelial model in the periodontal disease-like state, TNFα and IL-8 increased, whereas the release of inflammatory factors by applying the drug to the three-dimensional gingival epithelial model in the periodontal disease-like state for 24 hours The effect of reducing the amount was confirmed.
実施例３：ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）由来ＬＰＳによる歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルの作製
１．試験概要
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来ＬＰＳを用いて歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルを作製して、炎症性因子の放出量と組織学上の変化を確認した。
Example 3: Preparation of a three-dimensional gingival epithelial model of periodontal disease-like state by LPS derived from P. gingivalis Outline of test Using gingivalis-derived LPS, a three-dimensional gingival epithelial model in a periodontal disease-like state was prepared, and the amount of inflammatory factor released and histological changes were confirmed.
２．試験試料
三次元歯肉上皮モデル：ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標） ＨＧＥ（株式会社ニコダームリサーチ）
細菌内毒素：ＬＰＳ−ＰＧ（ＬＰＳ Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来）（ナカライテスク株式会社）
ＰＢＳ（−）：リン酸緩衝生理食塩水。
2. Test sample Three-dimensional gingival epithelial model: SkinEthic (registered trademark) HGE (Nikoderm Research Co., Ltd.)
Bacterial endotoxin: LPS-PG (derived from LPS P. gingivalis) (Nacalai Tesque, Inc.)
PBS (-): phosphate buffered saline.
３．試験方法
ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標） ＨＧＥ（以下、「ＨＧＥ」とも称す）を製造会社のプロトコルに従って、維持培地（ＭＡＩＮＴＥＮＡＮＣＥ ＭＥＤＩＵＭ）を添加したプレートにて一晩馴化した。培地として、維持培地（コントロール）または２００μｇ／ｍＬのＬＰＳ−ＰＧ（ＬＰＳ Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来）（以下、「Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＬＰＳ」とも称す）を含有する維持培地を別のプレートに１ｍＬ添加して、馴化したＨＧＥを設置した。設置後、ＰＢＳ（−）１５０μＬをＨＧＥ上部に適用して、３７℃にて４８時間培養した。
3. Test Method SkinEthic (registered trademark) HGE (hereinafter also referred to as “HGE”) was conditioned overnight on a plate supplemented with maintenance medium (MAINTENANCE MEDIUM) according to the manufacturer's protocol. As a medium, 1 mL of maintenance medium containing maintenance medium (control) or 200 μg / mL LPS-PG (derived from LPS P. gingivalis) (hereinafter also referred to as “P. gingivalis LPS”) was added to another plate, Acclimatized HGE was installed. After installation, 150 μL of PBS (−) was applied to the top of the HGE and cultured at 37 ° C. for 48 hours.
４８時間培養後の培地を回収して、培養上清中の炎症性因子（ＴＮＦα、ＩＬ−８）の量を、ＥＬＩＳＡ法（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いて測定した。バリア機能は、角層膜厚・水分計ＡＳＡ−ＭＸ１００（日本アッシュ株式会社）を用いて、Ｐ値（イオンインデックス）を測定した。４８時間培養後のＨＧＥの細胞生存率をアラマブルー法にて評価したところ、細胞生存率は、ほぼ１００％であった（データ示さず）。 The culture medium after 48 hours of culture was collected, and the amount of inflammatory factors (TNFα, IL-8) in the culture supernatant was measured using the ELISA method (R & D Systems). For the barrier function, the P value (ion index) was measured using a stratum corneum film thickness / moisture meter ASA-MX100 (Nippon Ash Corporation). When the cell viability of HGE after 48 hours of culture was evaluated by the Alama Blue method, the cell viability was almost 100% (data not shown).
４．結果
回収した培地中の炎症性因子の測定結果を表７〜９に示す。培養４８時間後のＰ.ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＬＰＳを含む培地では、ＴＮＦαおよびＩＬ−８の有意な増加が認められた（表７および８）。培養４８時間後のＨＧＥのＰ値は有意に増加した（表９）。
4). Result The measurement result of the inflammatory factor in the collect | recovered culture medium is shown to Tables 7-9. In medium containing P. gingivalis LPS after 48 hours of culture, significant increases in TNFα and IL-8 were observed (Tables 7 and 8). The P value of HGE after 48 hours of culture increased significantly (Table 9).
１ 正常状態の三次元歯肉上皮モデル（細胞部分）
２ 三次元歯肉上皮モデルのウェル
３ ウェル（プレート）
４ 培地
1 Normal three-dimensional gingival epithelial model (cell part)
2 Well of 3D gingival epithelial model 3 Well (plate)
4 Medium
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018100314A JP7049738B2 (en) | 2018-05-25 | 2018-05-25 | Method for manufacturing a three-dimensional gingival epithelial model of periodontal disease-like state |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018100314A JP7049738B2 (en) | 2018-05-25 | 2018-05-25 | Method for manufacturing a three-dimensional gingival epithelial model of periodontal disease-like state |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2019201603A true JP2019201603A (en) | 2019-11-28 |
| JP7049738B2 JP7049738B2 (en) | 2022-04-07 |
Family
ID=68725185
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2018100314A Active JP7049738B2 (en) | 2018-05-25 | 2018-05-25 | Method for manufacturing a three-dimensional gingival epithelial model of periodontal disease-like state |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7049738B2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7462411B2 (en) | 2019-12-19 | 2024-04-05 | 日光ケミカルズ株式会社 | A method for producing a three-dimensional gingival epithelium model induced in a periodontal disease-like state |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016049103A (en) * | 2014-08-28 | 2016-04-11 | 日光ケミカルズ株式会社 | Transmucosal absorption evaluation device, and evaluation method |
-
2018
- 2018-05-25 JP JP2018100314A patent/JP7049738B2/en active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016049103A (en) * | 2014-08-28 | 2016-04-11 | 日光ケミカルズ株式会社 | Transmucosal absorption evaluation device, and evaluation method |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| 「世界のウェブアーカイブ｜国立国会図書館インターネット資料収集保存事業」、[ONLINE]、平成２９年６月３, JPN6021043531, ISSN: 0004629711 * |
| ARCH. ORAL BIOL., 2015, 60(6), PP.845-853, JPN6021043535, ISSN: 0004629707 * |
| BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., 2018, 495(4), PP.2383-2389, EPUB 2017 DEC 24, JPN6021043533, ISSN: 0004629709 * |
| J. PERIODONTOL., 2012, 83(2), PP.242-247, JPN6021043532, ISSN: 0004629710 * |
| J. VIS. EXP., 2018 APR 3, 134:57157, JPN6021043534, ISSN: 0004629708 * |
| PLOS ONE, 2014, 9(9):E106766, JPN6021043538, ISSN: 0004629706 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7462411B2 (en) | 2019-12-19 | 2024-04-05 | 日光ケミカルズ株式会社 | A method for producing a three-dimensional gingival epithelium model induced in a periodontal disease-like state |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP7049738B2 (en) | 2022-04-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sonnenberg et al. | Innate lymphoid cells in the initiation, regulation and resolution of inflammation | |
| Liu et al. | Macrophage polarization in periodontal ligament stem cells enhanced periodontal regeneration | |
| Zhang et al. | Butyrate inhibits interleukin-17 and generates Tregs to ameliorate colorectal colitis in rats | |
| Liu et al. | Local administration of stromal cell-derived factor-1 promotes stem cell recruitment and bone regeneration in a rat periodontal bone defect model | |
| Jiang et al. | Calcium hydroxide reduces lipopolysaccharide-stimulated osteoclast formation | |
| Huang et al. | Immuno-pathogenesis of periodontal disease: current and emerging paradigms | |
| Cruchley et al. | Structure and functions of the oral mucosa | |
| EP3402502A1 (en) | Active ingredient obtained fromophiopogon japonicus | |
| Tan et al. | Amnion epithelial cells promote lung repair via lipoxin A4 | |
| Peng et al. | Interleukin-22 promotes T helper 1 (Th1)/Th17 immunity in chlamydial lung infection | |
| EA036724B1 (en) | Mixture of fatty acids and use thereof in the treatment of inflammatory pathologies | |
| JP2019201603A (en) | Method for producing three-dimensional gingival epithelium model in periodontitis-like state | |
| Liao et al. | Human platelet lysate maintains stemness of umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells and promote lung repair in rat bronchopulmonary dysplasia | |
| Libreros et al. | Infectious neutrophil deployment is regulated by resolvin D4 | |
| Mostefaoui et al. | In vitro analyses of tissue structure and interleukin-1β expression and production by human oral mucosa in response to Candida albicans infections | |
| Euler et al. | Interleukin-6 in neutrophils from peripheral blood and inflammatory periradicular tissues | |
| Vahabi et al. | Correlation between interleukin-1β, interleukin-6 and tumor necrosis factor-α and clinical parameters in chronic and aggressive periodontal disease | |
| Giuroiu et al. | Detection and assessment of interleukin 6 in irreversible pulp inflamation | |
| KR20210021358A (en) | Pharmaceutical dermatological composition and use thereof | |
| Myose et al. | Macrophage-mediated repair of intraepithelial damage in rat oral mucosa | |
| CA2410946A1 (en) | In vitro tissue test system | |
| US20200256853A1 (en) | Models of Reconstructed Sensitive Skin | |
| JP7462411B2 (en) | A method for producing a three-dimensional gingival epithelium model induced in a periodontal disease-like state | |
| Giannakis et al. | Dynamic lipid mediator changes support macrophage subtype transitions during muscle regeneration | |
| Mohammed et al. | Immunological Defense Role of Oral Mucosa against Candidiasis Isolated from Human and Domestic Cats |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A80 | Written request to apply exceptions to lack of novelty of invention |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A80 Effective date: 20180621 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180710 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210120 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20211029 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20211102 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211210 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220315 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220324 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7049738 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |