JP2019198250A - Genome editing kit - Google Patents
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
本発明は、ゲノム編集用キット、ゲノム編集用組成物、ゲノム編集方法、及びゲノム編集された細胞又は生物の製造方法に関する。 The present invention relates to a genome editing kit, a genome editing composition, a genome editing method, and a method for producing a genome-edited cell or organism.
近年、ZFN、TALENに続く第3世代のゲノム編集ツールのCRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集技術は、多くの研究者に利用されており、ライフサイエンス研究に必要不可欠な技術になっている。しかし、免疫細胞などゲノム編集効率が低い細胞も数多く存在する。 In recent years, genome editing technology using the CRISPR / Cas9 system, the third-generation genome editing tool following ZFN and TALEN, has been used by many researchers and has become an indispensable technology for life science research. However, there are many cells with low genome editing efficiency such as immune cells.
HVJ-Eはトランスフェクション試薬の一つである。HVJ-Eは、センダイウイルス(Sendai virus ; Hemagglutinating virus of Japan)の細胞膜融合能を保持したまま、ゲノムを完全に不活化した粒子で、特殊な操作や設備を必要とせず、通常の実験室レベルで安全に使用できる非ウイルス性のトランスフェクションツールである。DNA、タンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA/miRNAなどを封入したHVJ-Eベクターは、標的細胞に接触させると、エンベロープ表面のNHタンパク質が標的細胞膜上のシアル酸と結合し、Fタンパク質が膜融合を引き起こすことで、標的細胞に封入分子を導入できる。 HVJ-E is one of the transfection reagents. HVJ-E is a particle that completely inactivates the genome while maintaining the cell membrane fusion ability of Sendai virus (Sendai virus; Hemagglutinating virus of Japan). It is a non-viral transfection tool that can be used safely. When HVJ-E vector encapsulating DNA, protein, antisense oligonucleotide, siRNA / miRNA, etc. is brought into contact with the target cell, NH protein on the envelope surface binds to sialic acid on the target cell membrane, and F protein is membrane fused Can cause inclusion molecules to be introduced into target cells.
このようなHVJ-Eを使用した技術としては、例えば、不活性化ウイルスエンベロープと外来物質とを混合する工程に先立ち、不活性化ウイルスエンベロープと界面活性剤とを接触させることにより、外来物質の導入が高効率となることが特許文献１において報告されている。また、不活性化エンベロープと外来物質とを接触させる工程以降に、遠心分離の工程がないことも特徴としており、操作性が改善されたことにより、外来物質導入のための組成物の調製が容易に実施できることも特許文献１において報告されている。 As a technique using such HVJ-E, for example, prior to the step of mixing the inactivated virus envelope and the foreign substance, the inactivated virus envelope and the surfactant are brought into contact with each other, thereby Patent Document 1 reports that the introduction is highly efficient. Another feature is that there is no centrifugation step after the step of bringing the inactivated envelope into contact with the foreign substance. The improved operability makes it easy to prepare a composition for introducing the foreign substance. It is also reported in Patent Document 1 that it can be implemented.
また、特許文献２では、HVJ-Eを含む溶液に、界面活性剤、硫酸プロタミン及びタンパク質を添加し、該溶液を攪拌してHVJ-Eへタンパク質を封入し、それを細胞に接触させることにより、1チューブ内でHVJ-Eとタンパク質を混合するだけで、簡便且つ効率的にタンパク質を細胞へ導入できることが報告されている。 In Patent Document 2, a surfactant, protamine sulfate and protein are added to a solution containing HVJ-E, and the solution is stirred to encapsulate the protein in HVJ-E and contact it with cells. It has been reported that protein can be easily and efficiently introduced into cells simply by mixing HVJ-E and protein in one tube.
特許文献３では、（Ａ）ソルビタンセスキオレエート等の脂質と、（Ｂ）アルブミン等のタンパク質と、（Ｃ）硫酸プロタミン等の正電荷物質とを混合するのみの簡便な作業により、優れた安全性及び遺伝子導入効率を備えた細胞内への遺伝子導入用組成物が得られることが報告されている。また、当該遺伝子導入用組成物には、更に（Ｆ）HVJなどのウイルスエンベロープが含まれていてもよいことが述べられている。 In Patent Document 3, (A) a lipid such as sorbitan sesquioleate, (B) a protein such as albumin, and (C) an excellent safety by simply mixing a positively charged substance such as protamine sulfate. It has been reported that a composition for gene transfer into cells having sex and gene transfer efficiency can be obtained. Further, it is stated that the gene introduction composition may further contain a virus envelope such as (F) HVJ.
しかしながら、特許文献１〜３のいずれにも、HVJ-Eをゲノム編集に応用することについて具体的に言及された記載は存在しない。 However, none of Patent Documents 1 to 3 specifically mentions the application of HVJ-E to genome editing.
本発明は、CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集を高効率で行うことが可能なゲノム編集用キット、ゲノム編集用組成物、ゲノム編集方法、及びゲノム編集された細胞又は生物の製造方法を提供することを目的とする。 The present invention provides a genome editing kit, a genome editing composition, a genome editing method, and a method for producing a genome-edited cell or organism capable of performing genome editing with a CRISPR / Cas9 system with high efficiency. With the goal.
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、HVJ-Eを用いてCas9タンパク質及びガイドRNAを標的細胞に導入することにより従来の手法と比べて高い効率でCRISPR/Cas9システムによるゲノム編集が可能であるという知見を得た。 As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors have introduced CASPR / Cas9 with higher efficiency than conventional methods by introducing Cas9 protein and guide RNA into target cells using HVJ-E. The knowledge that genome editing by the system was possible was obtained.
本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次のゲノム編集用キット、ゲノム編集用組成物、ゲノム編集方法、及びゲノム編集された細胞又は生物の製造方法を提供するものである。 The present invention has been completed based on these findings, and has been completed. The following genome editing kit, genome editing composition, genome editing method, and method for producing genome-edited cells or organisms are provided. It is to provide.
(I) ゲノム編集用キット
(I-1) ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、界面活性剤、並びに硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質を含むゲノム編集用キット。
(I-2) 前記正電荷物質が硫酸プロタミンである、(I-1)に記載のキット。
(I-3) ガイドRNAを更に含む、(I-1)又は(I-2)に記載のキット。
(I-4) ドナーDNAを更に含む、(I-1)〜(I-3)のいずれか一項に記載のキット。
(I) Genome editing kit
(I-1) A genome editing kit comprising a virus envelope, Cas9 protein, a surfactant, and at least one positively charged substance selected from the group consisting of protamine sulfate, polyarginine, polylysine, polyethyleneimine and hexadimethrine bromide .
(I-2) The kit according to (I-1), wherein the positively charged substance is protamine sulfate.
(I-3) The kit according to (I-1) or (I-2), further comprising a guide RNA.
(I-4) The kit according to any one of (I-1) to (I-3), further comprising donor DNA.
(II) ゲノム編集用組成物
(II-1) ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA、並びに硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質を含むゲノム編集用組成物。
(II-2) ドナーDNAを更に含む、(II-1)に記載の組成物。
(II-3) 前記正電荷物質が硫酸プロタミンである、(II-1)又は(II-2)に記載の組成物。
(II) Genome editing composition
(II-1) A composition for genome editing comprising a virus envelope, Cas9 protein, guide RNA, and at least one positively charged substance selected from the group consisting of protamine sulfate, polyarginine, polylysine, polyethyleneimine and hexadimethrine bromide .
(II-2) The composition according to (II-1), further comprising donor DNA.
(II-3) The composition according to (II-1) or (II-2), wherein the positively charged substance is protamine sulfate.
(III) ゲノム編集方法
(III-1) ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA、並びに硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質を細胞又は生物に接触させる工程を含む、ゲノム編集方法。
(III-2) （１）ウイルスエンベロープとCas9タンパク質とを接触させる工程、
（２）工程（１）で得られたウイルスエンベロープ及びCas9タンパク質を含む混合物と界面活性剤とを接触させる工程、
（３）工程（２）で得られたウイルスエンベロープ及びCas9タンパク質を含む混合物とガイドRNAとを接触させる工程、
（４）工程（３）で得られたウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質及びガイドRNAを含む混合物と、硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質とを接触させる工程、及び
（５）工程（４）で得られたウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA及び正電荷物質を含む混合物を細胞又は生物に接触させる工程
を含む、(III-1)に記載の方法。
(III-3) 前記工程において、更にドナーDNAを細胞又は生物に接触させる、(III-1)に記載の方法。
(III-4) 前記工程（３）において、Cas9タンパク質、ウイルスエンベロープ及びガイドRNAを含む混合物を更にドナーDNAと接触させる、(III-2)に記載の方法。
(III-5) 前記生物が非ヒト生物である、(III-1)〜(III-4)のいずれか一項に記載の方法。
(III-6) 前記細胞又は生物が浮遊細胞である、(III-1)〜(III-4)のいずれか一項に記載の方法。
(III-7) 前記正電荷物質が硫酸プロタミンである、(III-1)〜(III-6)のいずれか一項に記載の方法。
(III) Genome editing method
(III-1) Contacting a cell or an organism with a virus envelope, Cas9 protein, guide RNA, and at least one positively charged substance selected from the group consisting of protamine sulfate, polyarginine, polylysine, polyethyleneimine and hexadimethrine bromide A genome editing method including a process.
(III-2) (1) A step of bringing the virus envelope into contact with the Cas9 protein,
(2) A step of bringing the mixture containing the virus envelope and Cas9 protein obtained in step (1) into contact with a surfactant,
(3) A step of bringing the mixture containing the virus envelope and Cas9 protein obtained in step (2) into contact with guide RNA,
(4) A mixture containing the virus envelope, Cas9 protein and guide RNA obtained in step (3), and at least one positive selected from the group consisting of protamine sulfate, polyarginine, polylysine, polyethylenimine and hexadimethrin bromide. A step of contacting with a charged substance, and (5) a step of bringing the mixture containing the virus envelope, Cas9 protein, guide RNA and positively charged substance obtained in step (4) into contact with a cell or an organism (III-1 ) Method.
(III-3) The method according to (III-1), wherein in the step, the donor DNA is further brought into contact with a cell or an organism.
(III-4) The method according to (III-2), wherein in step (3), the mixture containing Cas9 protein, virus envelope and guide RNA is further contacted with donor DNA.
(III-5) The method according to any one of (III-1) to (III-4), wherein the organism is a non-human organism.
(III-6) The method according to any one of (III-1) to (III-4), wherein the cell or organism is a floating cell.
(III-7) The method according to any one of (III-1) to (III-6), wherein the positively charged substance is protamine sulfate.
(IV) ゲノム編集された細胞又は生物の製造方法
(IV-1) ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA、並びに硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質を細胞又は生物に接触させる工程を含む、ゲノム編集された細胞又は生物の製造方法。
(IV-2) （１）ウイルスエンベロープとCas9タンパク質とを接触させる工程、
（２）工程（１）で得られたウイルスエンベロープ及びCas9タンパク質を含む混合物と界面活性剤とを接触させる工程、
（３）工程（２）で得られたウイルスエンベロープ及びCas9タンパク質を含む混合物とガイドRNAとを接触させる工程、
（４）工程（３）で得られたウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質及びガイドRNAを含む混合物と、硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質とを接触させる工程、及び
（５）工程（４）で得られたウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA及び正電荷物質を含む混合物を細胞又は生物に接触させる工程
を含む、(IV-1)に記載の方法。
(IV-3) 前記工程において、更にドナーDNAを細胞又は生物に接触させる、(IV-1)に記載の方法。
(IV-4) 前記工程（３）において、Cas9タンパク質、ウイルスエンベロープ及びガイドRNAを含む混合物を更にドナーDNAと接触させる、(IV-2)に記載の方法。
(IV-5) 前記生物が非ヒト生物である、(IV-1)〜(IV-4)のいずれか一項に記載の方法。
(IV-6) 前記細胞又は生物が浮遊細胞である、(IV-1)〜(IV-4)のいずれか一項に記載の方法。
(IV-7) 前記正電荷物質が硫酸プロタミンである、(IV-1)〜(IV-6)のいずれか一項に記載の方法。
(IV) Method for producing genome-edited cell or organism
(IV-1) Contacting a cell or an organism with a virus envelope, Cas9 protein, guide RNA, and at least one positively charged substance selected from the group consisting of protamine sulfate, polyarginine, polylysine, polyethyleneimine and hexadimethrine bromide A method for producing a genome-edited cell or organism comprising a step.
(IV-2) (1) A step of bringing the virus envelope into contact with the Cas9 protein,
(2) A step of bringing the mixture containing the virus envelope and Cas9 protein obtained in step (1) into contact with a surfactant,
(3) A step of bringing the mixture containing the virus envelope and Cas9 protein obtained in step (2) into contact with guide RNA,
(4) A mixture containing the virus envelope, Cas9 protein and guide RNA obtained in step (3), and at least one positive selected from the group consisting of protamine sulfate, polyarginine, polylysine, polyethylenimine and hexadimethrin bromide. A step of contacting with a charged substance, and (5) a step of bringing the mixture containing the virus envelope, Cas9 protein, guide RNA and positively charged substance obtained in step (4) into contact with a cell or an organism (IV-1 ) Method.
(IV-3) The method according to (IV-1), wherein in the step, the donor DNA is further contacted with a cell or an organism.
(IV-4) The method according to (IV-2), wherein in step (3), the mixture containing Cas9 protein, virus envelope and guide RNA is further contacted with donor DNA.
(IV-5) The method according to any one of (IV-1) to (IV-4), wherein the organism is a non-human organism.
(IV-6) The method according to any one of (IV-1) to (IV-4), wherein the cell or organism is a floating cell.
(IV-7) The method according to any one of (IV-1) to (IV-6), wherein the positively charged substance is protamine sulfate.
本発明により、CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集を高効率で行うことが可能なゲノム編集用キット及びゲノム編集用組成物を提供することができる。また、当該キット及び組成物は、従来はゲノム編集が困難であった浮遊細胞についても高い効率でゲノム編集を行うことが可能である。さらに、Cas9タンパク質とガイドRNAを別々に一定の手順でウイルスエンベロープと混合することで更にゲノム編集の効率を高めることができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to provide a genome editing kit and a genome editing composition capable of performing genome editing with the CRISPR / Cas9 system with high efficiency. In addition, the kit and the composition can perform genome editing with high efficiency even for floating cells that have been difficult to genome edit. Furthermore, the efficiency of genome editing can be further increased by mixing the Cas9 protein and the guide RNA separately with the virus envelope in a certain procedure.
以下、本発明について詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
なお、本明細書において「含む(comprise)」とは、「本質的にからなる(essentially consist of)」という意味と、「のみからなる(consist of)」という意味をも包含する。 In the present specification, “comprise” includes the meaning of “essentially consist of” and the meaning of “consist of”.
本発明における細胞又は非ヒト生物のゲノム編集方法及びゲノム編集された細胞又は非ヒト生物の製造方法は、ヒトの治療方法を含まないことを明示するものである。本明細書において、「封入」とは、ウイルスエンベロープの中にCas9タンパク質及びガイドRNA、並びに必要に応じてドナーDNAを入れることをいう。本明細書において「HAU」とは、ニワトリ赤血球0.5%を凝集可能なウイルスの活性を意味する。1HAUは、ほぼ2400万ウイルス粒子に相当する。 In the present invention, the method for genome editing of cells or non-human organisms and the method for producing genome-edited cells or non-human organisms clearly indicate that they do not include human treatment methods. As used herein, “encapsulation” refers to placing Cas9 protein and guide RNA and, if necessary, donor DNA in a viral envelope. As used herein, “HAU” means the activity of a virus capable of aggregating 0.5% of chicken erythrocytes. One HAU corresponds to almost 24 million virus particles.
本発明のゲノム編集用キットは、ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、界面活性剤、並びに硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質を含むことを特徴とする。 The kit for genome editing of the present invention comprises a virus envelope, Cas9 protein, a surfactant, and at least one positively charged substance selected from the group consisting of protamine sulfate, polyarginine, polylysine, polyethyleneimine, and hexadimethrin bromide. It is characterized by that.
本発明のゲノム編集用組成物は、ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA、並びに硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質を含むことを特徴とする。 The composition for genome editing of the present invention comprises a virus envelope, Cas9 protein, guide RNA, and at least one positively charged substance selected from the group consisting of protamine sulfate, polyarginine, polylysine, polyethyleneimine, and hexadimethrin bromide. It is characterized by that.
本発明のゲノム編集方法及びゲノム編集された細胞又は生物の製造方法(以下、これらの両方の方法を合わせて「本発明の方法」と称することがある)は、ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA、並びに硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質を細胞又は生物に接触させる工程を含むことを特徴とする。 The genome editing method of the present invention and the method of producing a genome-edited cell or organism (hereinafter, both methods may be collectively referred to as “the method of the present invention”) include a virus envelope, a Cas9 protein, a guide RNA. And at least one positively-charged substance selected from the group consisting of protamine sulfate, polyarginine, polylysine, polyethyleneimine and hexadimethrine bromide is brought into contact with the cell or organism.
本明細書において、ウイルスエンベロープは、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科及びヘパドナウイルス科に属するウイルス由来のエンベロープが挙げられるが、好ましくはパラミクソウイルス科に属するウイルス由来のエンベロープ、更に好ましくはセンダイウイルス由来エンベロープ(HVJ-E)である。より更に好ましくは、不活性化したHVJ-Eである。 In the present specification, the viral envelope is a retroviridae, togaviridae, coronaviridae, flaviviridae, paramyxoviridae, orthomyxoviridae, bunyaviridae, rhabdoviridae, poxviridae, herpesviridae, Examples include envelopes derived from viruses belonging to the family Baculoviridae and Hepadnaviridae, preferably envelopes derived from viruses belonging to the Paramyxoviridae family, and more preferably Sendai virus-derived envelopes (HVJ-E). Even more preferred is inactivated HVJ-E.
本明細書において、「不活性化」とはゲノムが不活性化されることを意味し、不活性化したウイルスとはゲノムの複製が行われず増殖及び感染能を失った物を意味する。ウイルスの不活性化の方法としては、UV照射、放射線照射、アルキル化剤による処理などが挙げられるが、UV照射、アルキル化剤による処理が好ましく、アルキル化剤による処理がより好ましい。 In the present specification, “inactivation” means that the genome is inactivated, and inactivated virus means that the genome has not replicated and has lost its ability to grow and infect. Examples of methods for inactivating viruses include UV irradiation, radiation irradiation, treatment with an alkylating agent, etc., UV irradiation, treatment with an alkylating agent are preferred, and treatment with an alkylating agent is more preferred.
本明細書において、ウイルスの「エンベロープ」とは、エンベロープを有する特定のウイルスに存在するヌクレオキャプシドの周囲を取り囲む脂質二重膜を基本とする膜構造のことをいう。 In the present specification, the “envelope” of a virus refers to a membrane structure based on a lipid bilayer surrounding the nucleocapsid present in a specific virus having an envelope.
Cas9タンパク質としては、CRISPR/Cas9システムにおいて用いられる物であれば特に制限されず、ガイドRNAと複合体を形成した状態でゲノムDNAの標的部位に結合し、該標的部位を2本鎖又は1本鎖切断できる物を各種使用することができる。Cas9タンパク質としては、野生型及び変異体のいずれであってもよく、変異体の例としては切断に関与する2つのドメインのいずれかのドメインにおいて切断活性を損なわせる変異を有する物が挙げられる。Cas9タンパク質としては、各種生物由来の物が知られている。Cas9タンパク質のアミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードする塩基配列の情報はNCBI等の公共のデータベースに登録されているので、公知の配列の情報を利用し、Cas9タンパク質をコードする核酸を導入した形質転換体を作製することでCas9タンパク質を製造することができる。また、Cas9タンパク質としては、各種市販品、例えば、Guide-it Recombinant Cas9、Alt-R S.p. Cas9 Nuclease 3NLS、Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS、Alt-R S.p. Cas9 D10A Nickase 3NLS、GeneArt Platinum Cas9 Nuclease、TrueCut Cas9 Protein v2、Cas9 Nuclease GFP NLS Protein、Alt-R A.s. Cpf1 Nuclease 2NLS、dCas9 protein NLSも存在するため、それらを使用することもできる。 Cas9 protein is not particularly limited as long as it is used in the CRISPR / Cas9 system, and binds to a target site of genomic DNA in a complex with a guide RNA, and the target site is double-stranded or single-stranded. Various materials that can be used for chain scission can be used. The Cas9 protein may be either wild type or mutant, and examples of the mutant include those having a mutation that impairs the cleavage activity in either of the two domains involved in cleavage. As the Cas9 protein, various organism-derived substances are known. Since the information on the amino acid sequence of Cas9 protein and the base sequence encoding the amino acid sequence is registered in public databases such as NCBI, transformation using a known sequence information and introducing a nucleic acid encoding Cas9 protein Cas9 protein can be produced by producing a body. As the Cas9 protein, various commercially available products such as Guide-it Recombinant Cas9, Alt-R Sp Cas9 Nuclease 3NLS, Alt-R Sp HiFi Cas9 Nuclease 3NLS, Alt-R Sp Cas9 D10A Nickase 3NLS, GeneArt Platinum Cas9 Nuclease, Since TrueCut Cas9 Protein v2, Cas9 Nuclease GFP NLS Protein, Alt-R As Cpf1 Nuclease 2 NLS, and dCas9 protein NLS also exist, they can also be used.
ガイドRNA (gRNA)としては、CRISPR/Cas9システムにおいて用いられる物であれば特に制限されず、ゲノムDNAの標的部位に結合し且つCas9タンパク質と結合することにより、Cas9タンパク質をゲノムDNAの標的部位に誘導可能な物を各種使用することができる。 The guide RNA (gRNA) is not particularly limited as long as it is used in the CRISPR / Cas9 system. By binding to the target site of genomic DNA and binding to the Cas9 protein, the Cas9 protein can be used as the target site of genomic DNA. Various types of inducible items can be used.
Cas9タンパク質がゲノムDNAに結合するためには、ゲノムDNAの標的配列は、標的配列の直後にPAM (Proto-spacer Adjacent Motif)配列を有する必要がある。 In order for Cas9 protein to bind to genomic DNA, the target sequence of genomic DNA must have a PAM (Proto-spacer Adjacent Motif) sequence immediately after the target sequence.
ガイドRNAは、crRNA (CRISPR RNA)(ゲノムDNAの標的部位への結合に関与する配列)を有しており、このcrRNAが、非標的鎖のPAM配列相補配列を除いてなる配列に相補的に結合することにより、ガイドRNAはゲノムDNAの標的部位に結合することができる。crRNAは、標的部位と結合するために、標的部位と、例えば、90%、93%、95%、98%、99%又は100%の同一性を有する配列を含んでいる。 The guide RNA has crRNA (CRISPR RNA) (sequence involved in binding to the target site of genomic DNA), and this crRNA is complementary to the sequence excluding the PAM sequence complementary sequence of the non-target strand. By binding, the guide RNA can bind to the target site of genomic DNA. The crRNA contains a sequence that has, for example, 90%, 93%, 95%, 98%, 99% or 100% identity with the target site for binding to the target site.
塩基配列の同一性は、市販の又は電気通信回線(インターネット)を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。塩基配列の同一性(%)は、当該分野で慣用のプログラム(例えば、BLAST、FASTA等)を初期設定で用いて決定することができる。 The identity of the base sequence can be calculated using an analysis tool that is commercially available or available through a telecommunication line (Internet). The base sequence identity (%) can be determined using a program commonly used in the art (for example, BLAST, FASTA, etc.) by default.
また、ガイドRNAは、tracrRNA (trans-activating crRNA)(Cas9タンパク質との結合に関与する配列)を有しており、このtracrRNA配列が、Cas9タンパク質に結合することにより、Cas9タンパク質をゲノムDNAの標的部位に誘導することができる。 In addition, the guide RNA has tracrRNA (trans-activating crRNA) (sequence involved in binding to Cas9 protein), and this tracrRNA sequence binds to Cas9 protein, thereby allowing Cas9 protein to target genomic DNA. Can be directed to the site.
ガイドRNAは、通常、上記のcrRNA及びtracrRNAを含み、crRNA及びtracrRNAを含む一本鎖RNA、crRNAとtracrRNAとが相補的に結合してなるRNA複合体などのいずれの形態であってもよい。 The guide RNA usually contains any of the above-described crRNA and tracrRNA, and may take any form such as a single-stranded RNA containing crRNA and tracrRNA, or an RNA complex formed by binding crRNA and tracrRNA in a complementary manner.
標的配列の選択及びガイドRNAの設計は各種の公知の手法を採用することにより実施することができる。ガイドRNAは、化学合成(固相合成、液相合成等)、生化学的切断／再結合などの常法により調製することができる。 Selection of the target sequence and design of the guide RNA can be carried out by employing various known methods. The guide RNA can be prepared by conventional methods such as chemical synthesis (solid phase synthesis, liquid phase synthesis, etc.), biochemical cleavage / recombination.
ドナーDNAは、Cas9タンパク質に切断された部位にて生じる相同組換え修復(Homology directed repair: HDR)を利用して、標的部位に所望の塩基配列を挿入(ノックイン)するための物である。ドナーDNAは、標的領域内の塩基配列と高い同一性を有する2つの塩基配列(相同性アーム)とそれらの間に配置された挿入する塩基配列を含む。ノックインする塩基配列は特に制限されない。ドナーDNAの鎖長は、特に制限されず、好ましくは50b〜500kb、より好ましくは50b〜5kbである。 The donor DNA is used to insert (knock-in) a desired base sequence into the target site using homologous recombination repair (Homology directed repair: HDR) occurring at the site cleaved by the Cas9 protein. Donor DNA contains two base sequences (homology arm) having high identity with the base sequence in the target region and a base sequence to be inserted arranged between them. The base sequence to be knocked in is not particularly limited. The chain length of the donor DNA is not particularly limited, and is preferably 50b to 500kb, more preferably 50b to 5kb.
ドナーDNAとしては、1本鎖DNA及び2本鎖DNAのいずれも使用でき、ゲノム編集効率の観点から、ドナーDNAは2本鎖DNAであることが好ましい。ドナーDNAは、鎖状DNA及び環状DNAのいずれも使用でき、ゲノム編集において、DNAのランダムな削り込み、付加等の意図しない変異の頻度をより低減できるという観点から、ドナーDNAは環状DNAであることが好ましい。 As the donor DNA, both single-stranded DNA and double-stranded DNA can be used. From the viewpoint of genome editing efficiency, the donor DNA is preferably double-stranded DNA. Both donor DNA and circular DNA can be used as donor DNA, and donor DNA is circular DNA from the viewpoint that the frequency of unintended mutations such as random cutting and addition of DNA can be further reduced in genome editing. It is preferable.
ドナーDNAは、PCR法、化学合成(固相合成、液相合成等)、生化学的切断／再結合などの常法により調製することができる。 Donor DNA can be prepared by conventional methods such as PCR, chemical synthesis (solid phase synthesis, liquid phase synthesis, etc.), biochemical cleavage / recombination.
界面活性剤としては、特に制限されず、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤のいずれも特に制限なく使用することができ、好ましくは非イオン性界面活性剤及び両性界面活性剤である。中でも、オクチルフェノールエトキシレート(Triton (登録商標) X-100など)、ノニルフェノールエトキシレート(NP40など)、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート(CHAPS)及びオクチルグルコシドがより好ましく、オクチルフェノールエトキシレート(Triton X-100など)が更に好ましい。界面活性剤は、1種単独又は2種以上を組み合わせて使用することができる。 The surfactant is not particularly limited, and any of a nonionic surfactant, a cationic surfactant, an amphoteric surfactant, and an anionic surfactant can be used without particular limitation, preferably Nonionic surfactants and amphoteric surfactants. Among them, octylphenol ethoxylate (such as Triton® X-100), nonylphenol ethoxylate (such as NP40), 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS) and octylglucoside Is more preferable, and octylphenol ethoxylate (such as Triton X-100) is still more preferable. Surfactants can be used alone or in combination of two or more.
正電荷物質としては、硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種が挙げられ、これらの中でも、硫酸プロタミンが好ましい。正電荷物質は、1種単独又は2種以上を組み合わせて使用することができる。 Examples of the positively charged substance include at least one selected from the group consisting of protamine sulfate, polyarginine, polylysine, polyethyleneimine, and hexadimethrine bromide, and among these, protamine sulfate is preferable. Positively charged substances can be used singly or in combination of two or more.
本発明のゲノム編集用キットは、ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、界面活性剤、及び上記正電荷物質を含み、必要に応じてガイドRNA及び／又はドナーDNAを含み得る。本発明のキットは、アルコール類(例えば、エタノール)、緩衝液(例えば、リン酸緩衝生理食塩液(PBS)、HEPES緩衝液、Tris塩酸緩衝液、TE緩衝液)、細胞培養液(例えば、DMEM培地、RPMI培地)等を更に含み得る。 The genome editing kit of the present invention contains a virus envelope, Cas9 protein, a surfactant, and the positively charged substance, and may contain guide RNA and / or donor DNA as necessary. The kit of the present invention comprises alcohols (e.g., ethanol), buffers (e.g., phosphate buffered saline (PBS), HEPES buffer, Tris hydrochloric acid buffer, TE buffer), cell culture solutions (e.g., DMEM Medium, RPMI medium) and the like.
本発明のキットを構成する各成分は、それぞれ別の容器に収容されていてもよいし、任意の2以上の成分が1つの容器に収容されていてもよい。 Each component constituting the kit of the present invention may be housed in a separate container, or any two or more components may be housed in one container.
本発明の組成物としては、例えば、Cas9タンパク質及びガイドRNA、並びに必要に応じてドナーDNAがウイルスエンベロープに封入されており、該ウイルスエンベロープの表面に硫酸プロタミンが存在している形態を有している。本発明の組成物における各成分の混合比及び濃度としては、ゲノム編集が行える範囲で適宜選択でき、例えば、後述する本発明の方法で得られる組成物における各成分の混合質量比及び濃度が挙げられる。 The composition of the present invention has, for example, a form in which Cas9 protein and guide RNA, and if necessary, donor DNA is enclosed in a virus envelope, and protamine sulfate is present on the surface of the virus envelope. Yes. The mixing ratio and concentration of each component in the composition of the present invention can be appropriately selected within a range where genome editing can be performed, and examples thereof include the mixing mass ratio and concentration of each component in the composition obtained by the method of the present invention described later. It is done.
本発明の組成物は、ウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA、及び上記正電荷物質、並びに必要に応じてドナーDNAの他に、水、アルコール類(例えば、エタノール)、緩衝液(例えば、リン酸緩衝生理食塩液、HEPES緩衝液、Tris塩酸緩衝液、TE緩衝液)、細胞培養液(例えば、DMEM培地、RPMI培地)等の添加物を含んでいてもよい。これら添加物の濃度は特に限定されない。本発明の組成物のpHは、6〜10が好ましい。 The composition of the present invention comprises water, alcohols (e.g., ethanol), buffer (e.g., phosphate) in addition to the virus envelope, Cas9 protein, guide RNA, and the positively charged substance, and if necessary, donor DNA. Buffer physiological saline solution, HEPES buffer solution, Tris hydrochloric acid buffer solution, TE buffer solution), cell culture solution (for example, DMEM medium, RPMI medium) and the like may be contained. The concentration of these additives is not particularly limited. The pH of the composition of the present invention is preferably 6-10.
本発明の方法は、任意の条件下で行うことができる。ウイルスエンベロープへのCas9タンパク質及びガイドRNAの封入は、Cas9タンパク質及びガイドRNAの複合体を用いて一度に行うか、又はCas9タンパク質及びガイドRNAを各々別々に用いて連続的に行うことができる。中でも、後述するように、Cas9タンパク質及びガイドRNAを各々別々に封入することが好ましい。 The method of the present invention can be performed under any conditions. Encapsulation of Cas9 protein and guide RNA in the viral envelope can be performed at once using a complex of Cas9 protein and guide RNA, or can be performed continuously using Cas9 protein and guide RNA separately. Among them, as described later, it is preferable to enclose Cas9 protein and guide RNA separately.
本発明の方法は、以下の工程（１）〜（５）を含む手順により実施することが好ましい。
（１）ウイルスエンベロープとCas9タンパク質とを接触させる工程、
（２）工程（１）で得られたウイルスエンベロープ及びCas9タンパク質を含む混合物と界面活性剤とを接触させる工程、
（３）工程（２）で得られたウイルスエンベロープ及びCas9タンパク質を含む混合物とガイドRNAとを接触させる工程、
（４）工程（３）で得られたウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、及びガイドRNAを含む混合物と、硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質とを接触させる工程、及び
（５）工程（４）で得られたウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA及び正電荷物質を含む混合物を細胞又は生物に接触させる工程
The method of the present invention is preferably carried out by a procedure including the following steps (1) to (5).
(1) a step of bringing the virus envelope into contact with the Cas9 protein,
(2) A step of bringing the mixture containing the virus envelope and Cas9 protein obtained in step (1) into contact with a surfactant,
(3) A step of bringing the mixture containing the virus envelope and Cas9 protein obtained in step (2) into contact with guide RNA,
(4) At least one selected from the group consisting of a mixture containing the viral envelope, Cas9 protein, and guide RNA obtained in step (3), and protamine sulfate, polyarginine, polylysine, polyethyleneimine, and hexadimethrin bromide. A step of contacting with a positively charged substance, and (5) a step of contacting a mixture containing the virus envelope, Cas9 protein, guide RNA and positively charged substance obtained in step (4) with a cell or an organism.
工程（１）において、ウイルスエンベロープ100 HAUに対して接触させるCas9タンパク質の量は、特に制限されず、好ましくは0.0001〜2 nmol、より好ましくは0.0002〜0.5 nmolである。工程（１）で使用するウイルスエンベロープを含む溶液の濃度は、特に制限されず、好ましくは10〜100 HAU/μl、より好ましくは15〜82 HAU/μlである。工程（１）は、低温度下で処理することが望ましく、温度は好ましくは0〜25℃であり、更に好ましくは0〜4℃である。接触させる時間は、通常1秒〜15分程度である。工程（１）によりCas9タンパク質をウイルスエンベロープに封入させることが可能となる。 In the step (1), the amount of Cas9 protein to be contacted with the virus envelope 100 HAU is not particularly limited, and is preferably 0.0001 to 2 nmol, more preferably 0.0002 to 0.5 nmol. The concentration of the solution containing the virus envelope used in step (1) is not particularly limited, and is preferably 10 to 100 HAU / μl, more preferably 15 to 82 HAU / μl. It is desirable to process a process (1) under low temperature, Preferably temperature is 0-25 degreeC, More preferably, it is 0-4 degreeC. The contact time is usually about 1 second to 15 minutes. By the step (1), the Cas9 protein can be encapsulated in the virus envelope.
工程（２）において、ウイルスエンベロープ及びCas9タンパク質を含む混合物と界面活性剤とを接触させる際、界面活性剤の最終濃度は好ましくは0.001〜0.5v/v%、より好ましくは0.02〜0.2v/v%である。工程（２）は、低温度下で処理することが望ましく、温度は好ましくは0〜25℃であり、更に好ましくは0〜4℃である。接触させる時間は、通常1秒〜15分程度である。工程（２）により、Cas9タンパク、ガイドRNA及びドナーDNAのウイルスエンベロープへの封入の効率を向上させることができる。 In the step (2), when the mixture containing the virus envelope and Cas9 protein is brought into contact with the surfactant, the final concentration of the surfactant is preferably 0.001 to 0.5 v / v%, more preferably 0.02 to 0.2 v / v. %. It is desirable to process a process (2) under low temperature, Preferably temperature is 0-25 degreeC, More preferably, it is 0-4 degreeC. The contact time is usually about 1 second to 15 minutes. By the step (2), the efficiency of encapsulation of Cas9 protein, guide RNA and donor DNA into the viral envelope can be improved.
工程（２）の後、界面活性剤の濃度を下げるための処理を行ってもよく、そのような処理としては遠心分離による上清の除去及び交換、水、緩衝液などの添加による希釈などが挙げられる。遠心分離は、遠心後、上清を除去し、得られた沈殿に界面活性剤を含まないPBSなどの液体に再懸濁することにより行うことができる。 After the step (2), a treatment for lowering the concentration of the surfactant may be performed. Examples of such treatment include removal and replacement of the supernatant by centrifugation, dilution by addition of water, buffer solution, and the like. Can be mentioned. Centrifugation can be performed by removing the supernatant after centrifugation and resuspending the resulting precipitate in a liquid such as PBS that does not contain a surfactant.
工程（３）において、ウイルスエンベロープ100 HAUに対して接触させるガイドRNAの量は、特に制限されず、好ましくは0.0001〜2 nmol、より好ましくは0.0002〜0.5 nmolである。工程（３）は、低温度下で処理することが望ましく、温度は好ましくは0〜25℃であり、更に好ましくは0〜4℃である。接触させる時間は、通常1秒〜15分程度である。工程（３）によりガイドRNAをウイルスエンベロープに封入させることができる。 In the step (3), the amount of guide RNA to be contacted with the virus envelope 100 HAU is not particularly limited, and is preferably 0.0001 to 2 nmol, more preferably 0.0002 to 0.5 nmol. It is desirable to process a process (3) under low temperature, Preferably temperature is 0-25 degreeC, More preferably, it is 0-4 degreeC. The contact time is usually about 1 second to 15 minutes. The guide RNA can be encapsulated in the virus envelope by the step (3).
HDRを行う場合は、工程（３）において、ウイルスエンベロープ及びCas9タンパク質を含む混合物を更にドナーDNAと接触させる。ウイルスエンベロープ100 HAUに対して接触させるドナーDNAの量は、特に制限されず、好ましくは0.0001〜2 nmol、より好ましくは0.0002〜0.5 nmolである。ドナーDNAとの接触は、ガイドRNAとの接触の後に行うことが好ましい。Cas9タンパク質が封入されたウイルスエンベロープを更にドナーDNAと接触させることで、ガイドRNAをウイルスエンベロープに封入させることができる。 When HDR is performed, in step (3), the mixture containing the virus envelope and Cas9 protein is further contacted with donor DNA. The amount of donor DNA to be contacted with virus envelope 100 HAU is not particularly limited, and is preferably 0.0001 to 2 nmol, more preferably 0.0002 to 0.5 nmol. The contact with the donor DNA is preferably performed after the contact with the guide RNA. By bringing the viral envelope encapsulating Cas9 protein into contact with donor DNA, the guide RNA can be encapsulated in the viral envelope.
工程（４）において、工程（３）で得られたウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質及びガイドRNAを含む混合物と正電荷物質とを接触させる際、正電荷物質の最終濃度は好ましくは0.01〜5000μg/ml、より好ましくは0.1〜3000μg/mlである。工程（４）は、低温度下で処理することが望ましく、温度は好ましくは0〜25℃であり、更に好ましくは0〜4℃である。接触させる時間は、通常1秒〜15分程度である。正電荷物質を添加する際には、必要により、工程（３）の後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などにより希釈を行う。このように正電荷物質と接触させることでウイルスエンベロープの表面に正電荷物質が存在することになり、ゲノム編集の効率をより高めることができる。 In the step (4), when the positively charged substance is brought into contact with the mixture containing the viral envelope, Cas9 protein and guide RNA obtained in the step (3), the final concentration of the positively charged substance is preferably 0.01 to 5000 μg / ml, More preferably, it is 0.1 to 3000 μg / ml. It is desirable to process a process (4) under low temperature, Preferably temperature is 0-25 degreeC, More preferably, it is 0-4 degreeC. The contact time is usually about 1 second to 15 minutes. When adding a positively charged substance, if necessary, it is diluted with phosphate buffered saline (PBS) after step (3). By contacting with a positively charged substance in this way, the positively charged substance is present on the surface of the virus envelope, and the efficiency of genome editing can be further increased.
工程（５）において、Cas9タンパク質、ウイルスエンベロープ、ガイドRNA及び正電荷物質を含む混合物を接触させる細胞としては、インビトロ培養細胞、生体から抽出した細胞、生体内に存在する細胞等が挙げられる。当該細胞は、接着細胞及び浮遊細胞のいずれであってもよい。中でも、浮遊細胞は従来技術と比べて、本発明の方法は高い効率でゲノム編集が可能である。一般には導入の困難な細胞系である初期細胞系、幹細胞系、線維芽細胞系、マクロファージ細胞系等を含め、広範囲な細胞を使用することができる。また、本発明で使用する細胞及び生物としては、好ましくは哺乳動物及びその細胞であり、哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギなどが挙げられる。 Examples of the cells to be contacted with the mixture containing Cas9 protein, virus envelope, guide RNA and positively charged substance in the step (5) include in vitro cultured cells, cells extracted from the living body, cells existing in the living body, and the like. The cells may be either adherent cells or floating cells. Among them, the method of the present invention can edit genomes of floating cells with high efficiency compared to the prior art. In general, a wide range of cells can be used, including early cell lines, stem cell lines, fibroblast lines, macrophage cell lines, and the like, which are difficult to introduce cell lines. The cells and organisms used in the present invention are preferably mammals and their cells. Examples of mammals include humans, monkeys, mice, rats, guinea pigs, hamsters, cows, pigs, sheep, goats, Examples include horses, dogs, cats and rabbits.
培養細胞又は生体から取り出した細胞に本発明の組成物を接触させる場合、例えば、細胞懸濁液又は培養上清中に本発明の組成物を添加することにより行うことができる。この場合、ウイルスエンベロープを添加する量は特に制限されず、好ましくは細胞5000〜100,000 cells当たり20〜60 HAUである。その後、例えば、細胞を37℃で約1時間インキュベート後、細胞の至適温度で20時間〜74時間インキュベートし、ゲノム編集が行われる。また、本発明の組成物は生体にin vivo法での投与又は全身的な投与を行うことも可能である。また、ex vivo法も可能であり、この場合には、常法に従い、対象個体の細胞を採取し、本発明の組成物で処理を行い、その後に当該細胞を対象個体へ戻すことにより行うことができる。 When the composition of the present invention is brought into contact with cultured cells or cells taken out from a living body, for example, the composition of the present invention can be added to a cell suspension or a culture supernatant. In this case, the amount of virus envelope added is not particularly limited, and is preferably 20 to 60 HAU per 5000 to 100,000 cells. Thereafter, for example, after the cells are incubated at 37 ° C. for about 1 hour, the cells are incubated at the optimal temperature of the cells for 20 hours to 74 hours, and genome editing is performed. In addition, the composition of the present invention can be administered to a living body by an in vivo method or systemic administration. In addition, an ex vivo method is also possible. In this case, according to a conventional method, the cells of the target individual are collected, treated with the composition of the present invention, and then returned to the target individual. Can do.
本発明のキット及びゲノム編集用組成物により、CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集を高効率で行うことが可能となる。また、当該キット及び組成物は、従来はゲノム編集が困難であった浮遊細胞についても高い効率でゲノム編集を行うことができる。さらに、本発明の方法では、Cas9タンパク質とガイドRNAを別々に一定の手順でウイルスエンベロープに封入することで更にゲノム編集の効率を高めることができる。 With the kit and the composition for genome editing of the present invention, genome editing by the CRISPR / Cas9 system can be performed with high efficiency. In addition, the kit and the composition can perform genome editing with high efficiency even for floating cells that have been difficult to genome edit. Furthermore, in the method of the present invention, the efficiency of genome editing can be further increased by enclosing Cas9 protein and guide RNA separately in a virus envelope by a certain procedure.
本発明により、これまでゲノムの破壊、修復などの編集(ノックアウト/ノックイン)が困難であった動物及び動物細胞において、短期間・低コストでゲノム編集が可能となり、疾患モデル細胞及び動物を作製し、それらを用いての治療研究、がん細胞及び多能性幹細胞でのスクリーニングによる機能解析などが可能となる。 According to the present invention, genome editing can be performed in a short period of time and at low cost in animals and animal cells that have previously been difficult to edit (knockout / knock-in) such as genome destruction and repair. , Therapeutic research using them, functional analysis by screening with cancer cells and pluripotent stem cells, and the like become possible.
以下に実施例を記載し、本発明を具体的に説明するが、これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであって、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限するものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。以下、実験で使用したHVJ-Eは商品名「GenomOne (登録商標)-Si」(石原産業株式会社製)に梱包されているHVJ-Eを使用した。当該HVJ-Eの濃度は1μlあたり34.1 HAUである。 The present invention will be specifically described with reference to the following examples, but these exemplifications are for explaining specific specific embodiments of the present invention, and limit the scope of the invention disclosed in the present application. It is not intended to be restricted or restricted. In the present invention, it should be understood that various embodiments based on the idea of the present specification are possible. Hereinafter, the HVJ-E used in the experiment was the HVJ-E packaged under the trade name “GenomOne (registered trademark) -Si” (manufactured by Ishihara Sangyo Co., Ltd.). The concentration of HVJ-E is 34.1 HAU per μl.
試験例１
シクロフィリンＢ(PPIB)をターゲットとしたガイドRNA (gRNA、Dharmacon製)を用いて、周囲を氷で囲み0℃〜10℃程度に保ちながら、図１に示す試薬を上から順に、記載された分量で使用した。始めにHVJ-EにTriton X-100溶液(MP Biomedicals, Inc.製)を加え混合後、遠心分離(100000g、5分間、4℃)を行って上清除去し、バッファー(リン酸緩衝生理食塩水(PBS、Sigma-Aldrich製)：1リットル中の成分は、8 gのNaCl、0.2 gのKH2PO4、1.15 gのNa2HPO4、及び0.2 gのKClである。)で再懸濁した。その後、分注し、Cas9/gRNA複合体(Cas9RNPs、予め、18.4μM Cas9タンパク溶液 3.66μlと 50μM gRNA 5.44μlを混合した液)を添加及び混合後、硫酸プロタミン(PS)(ナカライテスク株式会社製)を加えた組成物を細胞に添加しゲノム編集を行った。編集によって生じたゲノム配列ミスマッチをT7 Endonuclease I (NEB製)アッセイ(T7E1アッセイ)で検出した。
Test example 1
Using guide RNA (gRNA, manufactured by Dharmacon) targeted to cyclophilin B (PPIB), the reagents shown in FIG. 1 are listed in order from the top while being surrounded by ice and kept at about 0 ° C. to 10 ° C. Used in. First, Triton X-100 solution (manufactured by MP Biomedicals, Inc.) is added to HVJ-E, mixed, centrifuged (100,000 g, 5 minutes, 4 ° C.), the supernatant is removed, and the buffer (phosphate buffered saline) is added. Water (PBS, Sigma-Aldrich): The ingredients in 1 liter are 8 g NaCl, 0.2 g KH 2 PO 4 , 1.15 g Na 2 HPO 4 , and 0.2 g KCl). It became cloudy. Then, after dispensing and adding Cas9 / gRNA complex (Cas9RNPs, 3.66 μl of 18.4 μM Cas9 protein solution and 5.44 μl of 50 μM gRNA in advance), protamine sulfate (PS) (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) ) Was added to the cells for genome editing. Genomic sequence mismatches generated by editing were detected by T7 Endonuclease I (NEB) assay (T7E1 assay).
ゲノム編集のためのCas9タンパク質(Clontech製)及びガイドRNAのトランスフェクションを行った後、2日間培養後、ゲノムを抽出した。ターゲット部分を含む約500bpをPCRで増幅後、精製したPCR断片を、再アニーリングし、ミスマッチを含むDNAのみを認識して切断するT7E1と反応させた。導入したガイドRNAでゲノム編集が起きていた場合にはアガロースゲル電気泳動で約330bpと約174bpの断片が観察される(図中の矢印の部分)。 After transfection with Cas9 protein (manufactured by Clontech) and guide RNA for genome editing, the genome was extracted after culturing for 2 days. After amplification of about 500 bp including the target portion by PCR, the purified PCR fragment was re-annealed and reacted with T7E1 that recognizes and cleaves only the DNA containing the mismatch. When genome editing has occurred with the introduced guide RNA, fragments of about 330 bp and about 174 bp are observed by agarose gel electrophoresis (the part indicated by the arrow in the figure).
図１に結果を示す。上記の試験方法に基づいたサンプルはlane 3に対応する。lane 2はHVJ-E、Triton X-100等の試薬の処理を行わず細胞をそのまま測定したもの、lane 4はHVJ-Eの代わりにLipofectamine (登録商標) CRISPRMAX (Invitrogen製)を製品プロトコル通りに用いたものである。一般にトランスフェクションが難しいとされている浮遊系免疫細胞のJurkat細胞ではLipofectamine CRISPRMAXではゲノム編集が認められず、HVJ-EでCas9タンパク質及びガイドRNAをトランスフェクションした区にゲノム編集効果が認められた。 The results are shown in FIG. The sample based on the above test method corresponds to lane 3. In lane 2, cells were measured as they were without treatment with reagents such as HVJ-E and Triton X-100, and in lane 4, Lipofectamine (registered trademark) CRISPRMAX (manufactured by Invitrogen) was used according to the product protocol instead of HVJ-E. It is what was used. Genomic editing was not observed with Lipofectamine CRISPRMAX in Jurkat cells, which are generally considered to be difficult to transfect, and genome editing effects were observed in the transfection of Cas9 protein and guide RNA with HVJ-E.
試験例２
図２に示す試薬を上から順に、記載された分量で使用し、試験例１と同様の方法でゲノム編集を行った。
Test example 2
Genome editing was performed in the same manner as in Test Example 1 using the reagents shown in FIG.
結果を図２に示す。上記の試験方法に基づいたサンプルはlane 3及び5に対応する。lane 2はHVJ-E、Triton X-100等の試薬の処理を行わず細胞をそのまま測定したもの、lane 4はTriton X-100を使用しないこと以外はlane 3及び5と同じ方法で行ったもの、lane 6はHVJ-Eの代わりにCRISPRMAXを用いたものである。HVJ-Eベクター懸濁液の形成において、HVJ-Eに界面活性剤を添加することで、Cas9RNPsが細胞に導入されることが分かる。 The results are shown in FIG. Samples based on the above test method correspond to lanes 3 and 5. Lane 2 was measured without measuring the reagents such as HVJ-E and Triton X-100, and lane 4 was measured in the same way as lanes 3 and 5 except that Triton X-100 was not used. Lane 6 uses CRISPRMAX instead of HVJ-E. In the formation of the HVJ-E vector suspension, it can be seen that Cas9RNPs are introduced into the cells by adding a surfactant to HVJ-E.
試験例３
図３に示す試薬を上から順に、記載された分量で使用し、条件2は試験例１と同様の方法でゲノム編集を行った。条件1はHVJ-EにCas9タンパク質を加えて混合後、Triton X-100の所定濃度の溶液を加え混合し、遠心及び上清除去後、バッファー(試験例１と同じ)で再懸濁した。その後、ガイドRNAを添加及び混合後、硫酸プロタミンを加えた組成物を細胞に添加した。
Test example 3
The reagents shown in FIG. 3 were used in order from the top in the amounts described, and under condition 2, genome editing was performed in the same manner as in Test Example 1. Condition 1 was that Cas9 protein was added to HVJ-E and mixed, then a solution with a predetermined concentration of Triton X-100 was added and mixed. After centrifugation and removal of the supernatant, the suspension was resuspended in a buffer (same as in Test Example 1). Then, after adding and mixing guide RNA, the composition added with protamine sulfate was added to the cells.
結果を図３に示す。左のlaneから順に、「分子量マーカー」、「HVJ-E、Triton X-100等の試薬の処理を行わず細胞をそのまま測定したもの(無処理)」、「条件2のもの」、「条件1のものでガイドRNAが順に600 nM、400 nM、200 nM、100 nMのもの」である。HVJ-EにCas9タンパク質を添加後、Triton X-100を添加し、遠心分離(100000g、5分間、4℃)及び上清除去後、バッファー(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、試験例1と同様)で再懸濁し、ガイドRNA、(PBSを添加)硫酸プロタミンを添加した組成物を細胞に添加すると、図３からわかるように高いゲノム編集が得られた。調製方法条件1でガイドRNA 100 nMは条件2よりもゲノム編集効果が高かった。条件2のようにCas9RNPsでHVJ-Eベクター懸濁液を形成する調製方法よりも、条件1の調製方法によるHVJ-Eベクター懸濁液をトランスフェクションした方がゲノム編集の効果が高い。 The results are shown in FIG. In order from the left lane, "Molecular weight marker", "Measurement of cells without treatment with reagents such as HVJ-E, Triton X-100 (no treatment)", "Condition 2", "Condition 1" With guide RNA of 600 nM, 400 nM, 200 nM and 100 nM in this order. After adding Cas9 protein to HVJ-E, add Triton X-100, centrifuge (100,000 g, 5 minutes, 4 ° C.) and remove supernatant, then buffer (phosphate buffered saline (PBS), Test Example 1 3), and a composition containing guide RNA and protamine sulfate (with PBS added) was added to the cells. As shown in FIG. 3, high genome editing was obtained. In preparation method condition 1, guide RNA 100 nM had higher genome editing effect than condition 2. Compared with the preparation method of forming an HVJ-E vector suspension with Cas9RNPs as in condition 2, transfection of the HVJ-E vector suspension by the preparation method of condition 1 has a higher genome editing effect.
試験例４
図４に示す試薬を上から順に、記載された分量で使用し、ゲノム編集を行った。具体的には、HVJ-EにCas9タンパク質を添加後、Triton X-100を添加し、遠心及び上清除去後、バッファーで再懸濁し、ガイドRNA、硫酸プロタミンを添加した組成物を細胞に添加(トランスフェクション)した。
Test example 4
Genomic editing was performed using the reagents shown in FIG. 4 in the order described from the top. Specifically, after adding Cas9 protein to HVJ-E, add Triton X-100, centrifuge and remove the supernatant, resuspend in buffer, and add the composition containing guide RNA and protamine sulfate to the cells. (Transfection).
結果を図４に示す。図４からわかる通り、高いゲノム編集が得られた。Lipofectamine CRISPRMAX及びTransIT-X2試薬(Mirus製)よりも、HVJ-EベクターによってCas9タンパク質及びガイドRNAを細胞にトランスフェクションした方が高いゲノム編集効果が得られた。 The results are shown in FIG. As can be seen from FIG. 4, high genome editing was obtained. Compared with Lipofectamine CRISPRMAX and TransIT-X2 reagent (manufactured by Mirus), a higher genome editing effect was obtained when the Cas9 protein and guide RNA were transfected into cells with the HVJ-E vector.
試験例５
図５〜７に示す試薬を上から順に、記載された分量で使用し、試験例３の条件1と同様の方法でゲノム編集を行った。なお、図５の実験ではHPRT1をターゲットとしたガイドRNAを用いた。
Test Example 5
Genome editing was performed in the same manner as in Condition 1 of Test Example 3, using the reagents shown in FIGS. In the experiment of FIG. 5, a guide RNA targeting HPRT1 was used.
結果を図５〜７に示す。Lipofectamine CRISPRMAX及びTransIT-X2試薬ではゲノム編集が難しい浮遊系免疫細胞のJurkat細胞、K-562細胞及びU-937細胞において、HVJ-EベクターによってCas9タンパク質及びガイドRNAを細胞にトランスフェクションするとゲノム編集効果が得られた。 The results are shown in FIGS. Genomic editing effect when transfection of Cas9 protein and guide RNA into cells with HVJ-E vector in Jurkat, K-562 and U-937 cells, which are difficult to genome edit with Lipofectamine CRISPRMAX and TransIT-X2 reagents was gotten.
試験例６
本発明の組成物にssDNA (ドナーDNA)を添加することで、ガイドRNAがターゲットとする箇所に組換え(ノックイン)ゲノム編集が可能である。図８及び９に示す試薬を上から順に、記載された分量で使用して、ゲノム編集を試みた。具体的には、BamHIサイトを持たせたドナーDNA (ノックインされる塩基配列GGATCCの上流と下流にそれぞれ30塩基のホモロジーアームを付加したドナーDNA、Dharmacon製)、並びにCas9タンパク質及びガイドRNAを含むHVJ-Eベクター懸濁液を細胞に添加してトランスフェクション後、37℃ CO2インキュベーターで2日間培養し、細胞からゲノムを抽出した。ターゲット部分を含む約500bpをPCRで増幅後、精製したPCR断片を、制限酵素BamHI (タカラバイオ株式会社製)と反応させた。ゲノム編集のターゲットとなるゲノムに組換え(ノックイン)が起きていた場合にはアガロースゲル電気泳動で約330bpと約174bpの断片が観察される(図中の矢印の部分)。
Test Example 6
By adding ssDNA (donor DNA) to the composition of the present invention, recombination (knock-in) genome editing can be performed at a target RNA target site. Genomic editing was attempted using the reagents shown in FIGS. 8 and 9 in order from the top in the indicated amounts. Specifically, donor DNA with a BamHI site (donor DNA with 30 base homology arms added upstream and downstream of the knocked-in base sequence GGATCC, manufactured by Dharmacon), and HVJ containing Cas9 protein and guide RNA -E vector suspension was added to the cells and transfected, and then cultured in a 37 ° C CO 2 incubator for 2 days to extract the genome from the cells. About 500 bp including the target portion was amplified by PCR, and the purified PCR fragment was reacted with restriction enzyme BamHI (manufactured by Takara Bio Inc.). When recombination (knock-in) has occurred in the genome that is the target of genome editing, fragments of about 330 bp and about 174 bp are observed by agarose gel electrophoresis (indicated by arrows in the figure).
結果を図８及び９に示す。HeLa細胞でノックインが観察された。また、硫酸プロタミンの添加量を増量するとノックイン効果は高まった。一般にノックイン効果を高めるとされるエンハンサー効果よりも硫酸プロタミンの添加量を増やした方がその効果は高かった。 The results are shown in FIGS. Knock-in was observed in HeLa cells. In addition, the knock-in effect increased as the amount of protamine sulfate added was increased. The effect was higher when the amount of protamine sulfate added was increased than the enhancer effect, which is generally considered to increase the knock-in effect.
Claims (13)
（２）工程（１）で得られたウイルスエンベロープ及びCas9タンパク質を含む混合物と界面活性剤とを接触させる工程、
（３）工程（２）で得られたウイルスエンベロープ及びCas9タンパク質を含む混合物とガイドRNAとを接触させる工程、
（４）工程（３）で得られたウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質及びガイドRNAを含む混合物と、硫酸プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びヘキサジメトリンブロマイドからなる群より選ばれる少なくとも1種の正電荷物質とを接触させる工程、及び
（５）工程（４）で得られたウイルスエンベロープ、Cas9タンパク質、ガイドRNA及び正電荷物質を含む混合物を細胞又は生物に接触させる工程
を含む、請求項７に記載の方法。 (1) a step of bringing the virus envelope into contact with the Cas9 protein,
(2) A step of bringing the mixture containing the virus envelope and Cas9 protein obtained in step (1) into contact with a surfactant,
(3) A step of bringing the mixture containing the virus envelope and Cas9 protein obtained in step (2) into contact with guide RNA,
(4) A mixture containing the virus envelope, Cas9 protein and guide RNA obtained in step (3), and at least one positive selected from the group consisting of protamine sulfate, polyarginine, polylysine, polyethylenimine and hexadimethrin bromide. The method according to claim 7, comprising the step of contacting with a charged substance, and (5) contacting the cell or organism with the mixture containing the viral envelope, Cas9 protein, guide RNA and positively charged substance obtained in step (4). The method described.
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS, vol. 332, JPN6022015075, 2008, pages 10 - 17, ISSN: 0004892142 * |
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