JP2019195281A - Biofilm suppression and/or removal agent - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、バイオフィルムの形成を抑制及び/又は形成されたバイオフィルムを除去するバイオフィルム抑制及び/又は除去剤に関する。 The present invention relates to a biofilm suppression and / or removal agent that suppresses biofilm formation and / or removes the formed biofilm.
バイオフィルムとは、細菌が菌体外に分泌する多糖類等のマトリクスと菌の集合体から成る構造物である。細菌が付着・増殖すると、マトリクスに覆われた状態、即ちバイオフィルムを形成して薬剤に抵抗性を示し、また生体の防御機構からも逃れやすくなるために治療が困難になる。 A biofilm is a structure composed of a matrix of bacteria and the like, which are secreted by bacteria from outside the cells, and an aggregate of the cells. When bacteria adhere and grow, treatment is difficult because they are covered with a matrix, that is, a biofilm is formed to show resistance to the drug, and also escape from the defense mechanism of the living body.
近年、中心静脈カテーテルや人工関節等の人工医療材料を用いた治療に伴い、バイオフィルムに関連した感染症(バイオフィルム感染症)が増加している。バイオフィルム感染症としては例えば、カテーテル関連血流感染(CR-BSI)や尿道留置カテーテル関連尿路感染(UA-UTI)が問題となっている。一旦バイオフィルム感染症が起これば、感染症のコントロールは困難となり、医療材料を摘出せざるを得ないのが現況である。 In recent years, infections related to biofilms (biofilm infections) are increasing with treatment using artificial medical materials such as central venous catheters and artificial joints. Examples of biofilm infections include catheter-related bloodstream infection (CR-BSI) and urethral indwelling catheter-related urinary tract infection (UA-UTI). Once a biofilm infection occurs, it is difficult to control the infection, and medical materials must be removed.
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)は、医療機関では主に易感染患者において手術部位感染、血流感染、呼吸器感染、尿路感染等の起因菌となり、感染部位によっては難治性となって時に死因となる場合もある。特に、院内感染の原因菌とされるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus:MRSA)の進入経路は、48%が血液留置カテーテル、14%が尿路カテーテル留置によるといわれており、難治化すると同時に、重症化することが問題となる。このようにバイオフィルム感染症は外科系診療科をはじめとした全ての診療科において極めて重要な課題となっており、根本的な予防法・治療法の開発は急務である。 Staphylococcus aureus is a causative agent for surgical site infection, bloodstream infection, respiratory tract infection, urinary tract infection, etc. in highly infectious patients in medical institutions, and it becomes refractory depending on the infected site and sometimes causes death. It may become. In particular, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), which is the causative agent of nosocomial infections, is said to be intractable because 48% is due to indwelling catheter and 14% is due to indwelling urinary catheter. At the same time, becoming serious becomes a problem. Thus, biofilm infections are extremely important issues in all clinical departments including surgical departments, and the development of fundamental preventive and therapeutic methods is urgently needed.
これまでのバイオフィルムに関する研究は、実験室レベルで行われているものの、感染部位におけるバイオフィルムがどのような細菌種で構成されているのか、またそれらが採取部位や臨床所見とどのような関連性を持つか等、臨床における重要な基礎的データが得られていないのが現状である(非特許文献1,2)。 Biofilm research so far has been conducted at the laboratory level, but what kind of bacteria the biofilm is composed of at the infection site and how it relates to the collection site and clinical findings At present, no important basic data is obtained in clinical practice, such as whether or not it has sex (Non-Patent Documents 1 and 2).
バイオフィルムは菌種のみならず菌株レベルで性質が異なり、個々のバイオフィルムの細胞外マトリクス(ECM, extracellular matrix)を構成する成分を正確に評価することは、バイオフィルム形成の分子メカニズムの理解とそれぞれの性質に合わせた柔軟なバイオフィルム感染症対策の立案に重要であると考えられる(非特許文献3,4,5,6,7)。 Biofilms have different properties not only at the bacterial species but also at the bacterial strain level. Accurate evaluation of the components that make up the extracellular matrix (ECM) of individual biofilms is an understanding of the molecular mechanism of biofilm formation. It is considered to be important for the planning of a flexible biofilm infectious disease countermeasure adapted to each property (Non-Patent Documents 3, 4, 5, 6, 7).
近年、酵素を包含するバイオフィルム形成抑制剤が開発されており、例えばオリジン又はバシロリシンを有効成分とするバイオフィルム形成抑制剤が提案されている(特許文献1)。このバイオフィルム形成抑制剤はカンジダに由来するバイオフィルムの形成抑制にある程度効果を有するが、種々のバイオフィルムの形成を効果的に抑制するものではない。 In recent years, biofilm formation inhibitors including enzymes have been developed. For example, biofilm formation inhibitors containing origin or basiloricin as an active ingredient have been proposed (Patent Document 1). This biofilm formation inhibitor is effective to some extent in suppressing the formation of biofilms derived from Candida, but does not effectively suppress the formation of various biofilms.
また例えばヘキシルレゾルシノールを所定濃度で包含するバイオフィルム形成抑制剤が提案されている(特許文献2)。このバイオフィルム形成抑制剤は緑膿菌に由来するバイオフィルムの形成抑制にある程度効果を有するが、種々のバイオフィルムの形成を効果的に抑制するものではない。またこれらのバイオフィルム形成抑制剤は、バイオフィルムの形成抑制効果のみを奏するものであり、形成されたバイオフィルムを除去するものではない。 Moreover, for example, a biofilm formation inhibitor containing hexyl resorcinol at a predetermined concentration has been proposed (Patent Document 2). This biofilm formation inhibitor is effective to some extent in suppressing the formation of biofilms derived from Pseudomonas aeruginosa, but does not effectively suppress the formation of various biofilms. In addition, these biofilm formation inhibitors exhibit only a biofilm formation inhibitory effect, and do not remove the formed biofilm.
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、種々のバイオフィルムの形成を効果的に抑制可能とするとともに形成されたバイオフィルムを除去できるバイオフィルム抑制及び/又は除去剤を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of such a problem, and provides a biofilm suppression and / or removal agent capable of effectively suppressing the formation of various biofilms and removing the formed biofilm. For the purpose.
本発明にかかるバイオフィルム抑制及び/又は除去剤は、PLA(Phospholipase A、ホスホリパーゼA)、PLC(Phospholipase C、ホスホリパーゼC)、及び、PLD(Phospholipase D、ホスホリパーゼD)の少なくとも何れか一つを含むことを特徴とする。 The biofilm suppressing and / or removing agent according to the present invention contains at least one of PLA (Phospholipase A, phospholipase A), PLC (Phospholipase C, phospholipase C), and PLD (Phospholipase D, phospholipase D). It is characterized by that.
本発明によれば、種々のバイオフィルムの形成を効果的に抑制でき、更に形成されたバイオフィルムを除去できる。 According to the present invention, the formation of various biofilms can be effectively suppressed, and the formed biofilm can be removed.
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be specifically described with reference to the accompanying drawings. However, the embodiments are for facilitating understanding of the principle of the present invention, and the scope of the present invention is as follows. The present invention is not limited to the embodiments, and other embodiments in which those skilled in the art appropriately replace the configurations of the following embodiments are also included in the scope of the present invention.
本発明にかかるバイオフィルム抑制及び/又は除去剤は、PLA(Phospholipase A、ホスホリパーゼA)、PLC(Phospholipase C、ホスホリパーゼC)、及び、PLD(Phospholipase D、ホスホリパーゼD)の少なくとも何れか一つを含む。 The biofilm suppressing and / or removing agent according to the present invention contains at least one of PLA (Phospholipase A, phospholipase A), PLC (Phospholipase C, phospholipase C), and PLD (Phospholipase D, phospholipase D). .
ホスホリパーゼは、リン脂質を脂肪酸とその他の親油性物質に加水分解する酵素であり、触媒する反応の種類によりA, B, C, Dの4種に大きく分類される。後述する実施例に示されるように、好ましくは溶血性を示さないPLAである。図1はホスホリパーゼの切断部位を説明する図である。図1に示されるように、PLA1はSN-1アシル基を切断し、PLA2はSN-2アシル基を切断してアラキドン酸を生成し、PLDはリン酸エステル結合を切断し、ホスファチジン酸とアルコールを生成する。本実施形態にかかるバイオフィルム抑制及び/又は除去剤において、PLAはPLA1又はPLA2の何れか若しくはこれらの混合物でも良いが、好ましくはPLAはPLA1である。 Phospholipases are enzymes that hydrolyze phospholipids into fatty acids and other lipophilic substances, and are roughly classified into four types, A, B, C, and D, depending on the type of reaction catalyzed. As shown in the examples described later, PLA that does not exhibit hemolysis is preferable. FIG. 1 is a diagram illustrating a phospholipase cleavage site. As shown in FIG. 1, PLA1 cleaves SN-1 acyl group, PLA2 cleaves SN-2 acyl group to produce arachidonic acid, PLD cleaves phosphate ester bond, phosphatidic acid and alcohol Is generated. In the biofilm suppressing and / or removing agent according to this embodiment, PLA may be either PLA1 or PLA2, or a mixture thereof, but preferably, PLA is PLA1.
本発明においてバイオフィルムの抑制とは、バイオフィルムの増殖を制限する他、バイオフィルムの付着予防並びに堆積防止を意味する。本発明に形成されたバイオフィルムの除去とは、付着したバイオフィルムの破壊、並びに、バイオフィルム中の細菌を抑制、死滅、除去を意味する。 In the present invention, the suppression of biofilm means not only the growth of biofilm but also the prevention of biofilm adhesion and the prevention of deposition. The removal of the biofilm formed in the present invention means the destruction of the attached biofilm and the suppression, killing, and removal of bacteria in the biofilm.
本実施形態にかかるバイオフィルム抑制及び/又は除去剤が作用するバイオフィルムの由来は特に限定されないが、本実施形態にかかるバイオフィルム抑制及び/又は除去剤は、ブドウ球菌属(Staphylococcus)に属するグラム陽性球菌により形成されるものに対して特に抑制活性を有する。本実施形態にかかるバイオフィルム抑制及び/又は除去剤は、ブドウ球菌属のうち好ましくは、黄色ブドウ球菌 (S. aureus) 、表皮ブドウ球菌(S. epidermidis)や腐性ブドウ球菌(S. saprophyticus) 由来のバイオフィルム形成を有効に抑制する。本実施形態にかかるバイオフィルム抑制及び/又は除去剤は、黄色ブドウ球菌のうち、さらにはMRSA、MSSAやバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus:VRSA)由来のバイオフィルム形成阻害について有効に作用する。 The origin of the biofilm on which the biofilm suppression and / or removal agent according to this embodiment acts is not particularly limited, but the biofilm suppression and / or removal agent according to this embodiment is a gram belonging to Staphylococcus. In particular, it has inhibitory activity against those formed by positive cocci. The biofilm suppressing and / or removing agent according to the present embodiment is preferably S. aureus, S. epidermidis or S. saprophyticus among the genus Staphylococcus. Effectively suppresses biofilm formation. The biofilm suppressing and / or removing agent according to the present embodiment is effective for inhibiting biofilm formation from Staphylococcus aureus, MRSA, MSSA and vancomycin-resistant Staphylococcus aureus (VRSA). Works.
本実施形態にかかるバイオフィルム抑制及び/又は除去剤は、更に、DNA分解酵素(DNase I)、及び、多糖分解酵素(Dispersin B)を有することが可能である。 The biofilm suppressing and / or removing agent according to this embodiment can further include a DNA degrading enzyme (DNase I) and a polysaccharide degrading enzyme (Dispersin B).
DNA分解酵素(DNase I)は、DNAを非特異的に分解して5'-リン酸基と3'-ヒドロキシル基末端を持つジヌクレオチド、トリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドを産生するエンドヌクレアーゼである。多糖分解酵素(Dispersin B)は、種々の多糖のグルコシド結合を加水分解によって切断して、構成している単糖またはオリゴ糖(単糖が数個結合した糖)あるいはそれらの誘導体を生成する酵素である。 DNA degrading enzyme (DNase I) is an endonuclease that non-specifically degrades DNA to produce dinucleotides, trinucleotides, and oligonucleotides having 5′-phosphate groups and 3′-hydroxyl group ends. Polysaccharide-degrading enzyme (Dispersin B) is an enzyme that cleaves the glucoside bond of various polysaccharides by hydrolysis to produce constituent monosaccharides or oligosaccharides (sugars with several monosaccharides bonded) or their derivatives. It is.
バイオフィルムにおいて細胞間を埋める物質がマトリクスであり、マトリクスの成分には例えばeDNA(extracellular DNA)と呼ばれる細胞外核酸、タンパク質、及び、多糖体が挙げられる。マトリクスの成分としてのタンパク質の中にはバイオフィルム関連タンパク質や宿主細胞接着因子のみならず、多数の細胞質タンパク質が含まれる。マトリクスの成分としての多糖体としては、緑膿菌ではpsl(polysaccharide synthesis locus)やpel(pellicle formation locus)遺伝子産物によって合成されるマンノースやガラクトースあるいはグルコースを主成分とする多糖がバイオフィルム形成の鍵を握っているが、グラム陰性細菌や黄色ブドウ球菌ではPIA(polysaccharide intercellular adhesin)とも呼ばれるPNAG(poly-β(1, 6)-N-acetyl-D-glucosamine)が知られている。 A substance that fills cells in a biofilm is a matrix, and examples of matrix components include extracellular nucleic acids called eDNA (extracellular DNA), proteins, and polysaccharides. Proteins as matrix components include not only biofilm-related proteins and host cell adhesion factors, but also numerous cytoplasmic proteins. As polysaccharides as matrix components, in Pseudomonas aeruginosa, polysaccharides mainly composed of mannose, galactose or glucose synthesized by psl (polysaccharide synthesis locus) or pel (pellicle formation locus) gene products are the key to biofilm formation. However, in Gram-negative bacteria and Staphylococcus aureus, PNAG (poly-β (1, 6) -N-acetyl-D-glucosamine), also called PIA (polysaccharide intercellular adhesin), is known.
バイオフィルムを形成する菌種によってマトリクスの主成分が異なり、例えばMRSAではeDNAが主成分であり、MSSAではタンパク質が主成分であり、表皮ブドウ球菌ではPIAが主成分である場合が多いが、本実施形態にかかるバイオフィルム抑制及び/又は除去剤では、更に、DNA分解酵素(DNase I)及び多糖分解酵素(Dispersin B)を有することにより、更に、種々のバイオフィルムの形成を効果的に抑制可能となる。 The main component of the matrix differs depending on the bacterial species that forms the biofilm.For example, in MRSA, eDNA is the main component, in MSSA, protein is the main component, and in Staphylococcus epidermidis, PIA is the main component. The biofilm suppressing and / or removing agent according to the embodiment can further effectively suppress the formation of various biofilms by further comprising a DNA degrading enzyme (DNase I) and a polysaccharide degrading enzyme (Dispersin B). It becomes.
そのため本実施形態にかかるバイオフィルム抑制剤は、例えば、下記構成となる。
・PLAを有するバイオフィルム抑制及び/又は除去剤
・PLCを有するバイオフィルム抑制及び/又は除去剤
・PLDを有するバイオフィルム抑制及び/又は除去剤
・PLA及びPLCを有するバイオフィルム抑制及び/又は除去剤
・PLA及びPLDを有するバイオフィルム抑制及び/又は除去剤
・PLC及びPLDを有するバイオフィルム抑制及び/又は除去剤
・PLA、PLC及びPLDを有するバイオフィルム抑制及び/又は除去剤
・PLA、DNase I及びDispersin Bを有するバイオフィルム抑制及び/又は除去剤
・PLC、DNase I及びDispersin Bを有するバイオフィルム抑制及び/又は除去剤
・PLD、DNase I及びDispersin Bを有するバイオフィルム抑制及び/又は除去剤
・PLA、PLC、DNase I及びDispersin Bを有するバイオフィルム抑制及び/又は除去剤
・PLA、PLD、DNase I及びDispersin Bを有するバイオフィルム抑制及び/又は除去剤
・PLC、PLD、DNase I及びDispersin Bを有するバイオフィルム抑制及び/又は除去剤
・PLA、PLC、PLD、DNase I及びDispersin Bを有するバイオフィルム抑制及び/又は除去剤
Therefore, the biofilm inhibitor according to the present embodiment has the following configuration, for example.
Biofilm suppression and / or removal agent with PLA Biofilm suppression and / or removal agent with PLC Biofilm suppression and / or removal agent with PLD Biofilm suppression and / or removal agent with PLA and PLC -Biofilm inhibition and / or removal agent with PLA and PLD-Biofilm inhibition and / or removal agent with PLC and PLD-Biofilm inhibition and / or removal agent with PLA, PLC and PLD-PLA, DNase I and Biofilm Suppression and / or Removal Agent with Dispersin B ・ PLC, Biofilm Suppression and / or Removal Agent with DNase I and Dispersin B ・ Biofilm Suppression and / or Removal Agent with PLA, DNase I and Dispersin B ・ PLA Biofilm suppression and / or removal agent with PLC, DNase I and Dispersin B ・ Biofilm suppression with PLA, PLD, DNase I and Dispersin B and Or removers · PLC, PLD, DNase I and biofilm inhibition and / or removal agents · PLA having Dispersin B, PLC, PLD, DNase I and biofilm inhibition and / or removing agent having Dispersin B
本実施形態にかかるバイオフィルム抑制及び/又は除去剤において、特に限定されるものではないが、例えば、PLA 20〜200 μg/mL、PLC 20〜200 μg/mL、PLD 100〜1,000 U/mL、DNase I 10〜100 U/mL、Dispersin B 2〜20 μg/mLである。 In the biofilm suppression and / or removal agent according to this embodiment, although not particularly limited, for example, PLA 20-200 μg / mL, PLC 20-200 μg / mL, PLD 100-1,000 U / mL, DNase I 10-100 U / mL, Dispersin B 2-20 μg / mL.
PLA、DNase I及びDispersin Bを有するバイオフィルム抑制及び/又は除去剤において、各酵素の配合割合は特に限定されるものではないが、例えばPLA 20〜200 μg/mL、DNase I 10〜100 U/mL、及び、Dispersin B 2〜20 μg/mLである。 In the biofilm suppression and / or removal agent having PLA, DNase I and Dispersin B, the mixing ratio of each enzyme is not particularly limited. For example, PLA 20-200 μg / mL, DNase I 10-100 U / mL and Dispersin B 2-20 μg / mL.
PLC、DNase I及びDispersin Bを有するバイオフィルム抑制及び/又は除去剤において、各酵素の配合割合は特に限定されるものではないが、例えばPLC 20〜200 μg/mL、DNase I 10〜100 U/mL、及び、Dispersin B 2〜20 μg/mLである。 In the biofilm suppression and / or removal agent having PLC, DNase I and Dispersin B, the mixing ratio of each enzyme is not particularly limited. For example, PLC 20-200 μg / mL, DNase I 10-100 U / mL and Dispersin B 2-20 μg / mL.
PLD、DNase I及びDispersin Bを有するバイオフィルム抑制及び/又は除去剤において、各酵素の配合割合は特に限定されるものではないが、例えばPLD 100〜1,000 U/mL、DNase I 10〜100 U/mL、及び、Dispersin B 2〜20 μg/mLである。 In the biofilm suppression and / or removal agent having PLD, DNase I and Dispersin B, the mixing ratio of each enzyme is not particularly limited. For example, PLD 100 to 1,000 U / mL, DNase I 10 to 100 U / mL mL and Dispersin B 2-20 μg / mL.
本実施形態にかかる医療用器具は、上記バイオフィルム抑制及び/又は除去剤で処理されてなる医療用器具、例えば、医療用デバイス、医療用ドレッシングや医療用テープ等である。バイオフィルム抑制及び/又は除去剤で処理されてなる医療用器具とは、当該医療用器具の表面の一部若しくは全体をバイオフィルム抑制及び/又は除去剤でコーティングされているか、又は医療用器具の一部若しくは全体にバイオフィルム抑制及び/又は除去剤が浸透しているものである。 The medical instrument according to this embodiment is a medical instrument processed with the biofilm suppression and / or removal agent, for example, a medical device, a medical dressing, a medical tape, or the like. A medical device treated with a biofilm suppressing and / or removing agent is a part of or the entire surface of the medical device coated with a biofilm suppressing and / or removing agent, or a medical device. The biofilm suppression and / or removal agent penetrates partly or entirely.
医療用デバイスは例えばインプラント(implant)である。インプラントの例として、特に限定されないが、例えばカテーテル、人工歯(デンタルインプラント)、骨折・リウマチ等の治療で骨を固定するためのボルト、ペースメーカー、人工心臓弁、人工関節、ボイスプロテーゼ、コンタクトレンズ等が挙げられる。前記カテーテルとしては、尿道カテーテル、腹腔カテーテル及び中心静脈カテーテル等が挙げられる。 The medical device is, for example, an implant. Examples of implants include, but are not limited to, for example, catheters, artificial teeth (dental implants), bolts for fixing bones in the treatment of fractures, rheumatism, pacemakers, artificial heart valves, artificial joints, voice prostheses, contact lenses, etc. Is mentioned. Examples of the catheter include a urinary catheter, an abdominal catheter, and a central venous catheter.
なお本実施形態にかかるバイオフィルム抑制及び/又は除去剤には、必要に応じて、バイオフィルムを形成しうる菌に有効な消毒薬、例えばグルコン酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、両性界面活性剤、アルコール、次亜塩素酸ナトリウム、ポビドンヨード、グルタラール等を併用して用いることも可能である。なお、ブドウ球菌に対する持続効果の面ではクロルヘキシジンが効果的である。 In addition, the biofilm suppressing and / or removing agent according to the present embodiment includes an antiseptic effective for bacteria capable of forming a biofilm, for example, chlorhexidine gluconate, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, an amphoteric interface, if necessary. An activator, alcohol, sodium hypochlorite, povidone iodine, glutaral and the like can be used in combination. In addition, chlorhexidine is effective in terms of a sustained effect on staphylococci.
1.菌株、酵素及び試薬類
下記に示す菌株を使用した。
・黄色ブドウ球菌臨床分離株:慈恵医大病院で患者から分離されたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)10株及びメチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)7株
・表皮ブドウ球菌臨床分離株: 慈恵医大病院で患者から分離された表皮ブドウ球菌4株
下記に示す酵素を使用した。
・PLA: Phospholipase A1 from Thermomyces lanuginosus (Sigma-Aldrich, Cat#: L3295)
・PLC: Phospholipase C from Clostridium perfringens (Sigma-Aldrich, Cat#: P4039)
・PI-PLC: Phosphatidylinositol-specific phospholipase C from Bacillus cereus (Sigma-Aldrich, Cat#: P5542)
・PLD: Phospholipase D from Streptomyces chromofuscus (Sigma-Aldrich, Cat#: P0065)
・Lipase from Candida rugosa (Sigma-Aldrich, Cat#: L1754)
・DNase: DNase I recombinant, RNase-free from Bovine pancreas, expressed in Pichia pastoris (Roche, Cat#: 4716728001)
・DispB: Dispersin B (beta-1,6-N-acetylglucosaminidase) from Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Kane Biotech)
・PK: Proteinase K from Tritirachium album (Sigma-Aldrich, Cat#: P6556)
下記に示す試薬類を使用した。
・Brain heart infusion (BHI) medium (Becton Dickinson, Cat#: 211065): 37 g/Lとなるように脱イオン水に溶かし、121°Cで15分間オートクレーブして滅菌した。
・BHIG培地: 1% glucoseを含むBHI培地。
・Glucose (Nacalai Tesque, Cat#: 16805-35)
・Crystal violet (CV): 50 mgのCVを秤とり、1 mLのエタノールに溶かし、滅菌水で500 mLとなるようにメスアップした。
・Phosphate buffered saline (PBS)
・滅菌水
1. Strains, enzymes and reagents The following strains were used.
-Staphylococcus aureus clinical isolates: 10 methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) strains and 7 methicillin-sensitive Staphylococcus aureus (MSSA) isolates from patients at Jikei University Hospital: Staphylococcus epidermidis clinical isolates: at Jikei University Hospital Four strains of Staphylococcus epidermidis isolated from patients The following enzymes were used.
・ PLA: Phospholipase A 1 from Thermomyces lanuginosus (Sigma-Aldrich, Cat #: L3295)
・ PLC: Phospholipase C from Clostridium perfringens (Sigma-Aldrich, Cat #: P4039)
PI-PLC: Phosphatidylinositol-specific phospholipase C from Bacillus cereus (Sigma-Aldrich, Cat #: P5542)
・ PLD: Phospholipase D from Streptomyces chromofuscus (Sigma-Aldrich, Cat #: P0065)
・ Lipase from Candida rugosa (Sigma-Aldrich, Cat #: L1754)
・ DNase: DNase I recombinant, RNase-free from Bovine pancreas, expressed in Pichia pastoris (Roche, Cat #: 4716728001)
DispB: Dispersin B (beta-1,6-N-acetylglucosaminidase) from Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Kane Biotech)
・ PK: Proteinase K from Tritirachium album (Sigma-Aldrich, Cat #: P6556)
The following reagents were used.
Brain heart infusion (BHI) medium (Becton Dickinson, Cat #: 211065): Dissolved in deionized water to 37 g / L, autoclaved at 121 ° C for 15 minutes and sterilized.
-BHIG medium: BHI medium containing 1% glucose.
・ Glucose (Nacalai Tesque, Cat #: 16805-35)
Crystal violet (CV): 50 mg of CV was weighed, dissolved in 1 mL of ethanol, and diluted to 500 mL with sterilized water.
・ Phosphate buffered saline (PBS)
・ Sterile water
2.バイオフィルム形成抑制試験
(a)グリセロールストックから滅菌爪楊枝を使って滅菌したBHI培地2 mLにブドウ球菌臨床分離株を接種し、37°Cで一晩振とう培養した(振とう速度:150 rpm)。
2. Biofilm formation inhibition test
(a) Staphylococcal clinical isolates were inoculated into 2 mL of BHI medium sterilized from a glycerol stock using a sterile toothpick, and cultured overnight at 37 ° C. (shaking speed: 150 rpm).
(b)一晩培養した培養液を滅菌したBHIG培地に1,000倍希釈した。 (b) The overnight culture was diluted 1,000 times in a sterilized BHIG medium.
(c)希釈した菌液を滅菌した96穴ポリスチレンプレートに1穴あたり200 μLずつ分注し、各種酵素(200 μg/mL PLA, 200 μg/mL PLC, 200 μg/mL PI-PLC, 1,000 U/mL PLD, 200 μg/mL Lipase, 100 μg/mL PK, 100 U/mL DNase I, 20 μg/mL Dispersin B)を単独もしくは様々な組み合わせで添加した。 (c) Dispense 200 μL of diluted bacterial solution into a sterilized 96-well polystyrene plate per well, and use various enzymes (200 μg / mL PLA, 200 μg / mL PLC, 200 μg / mL PI-PLC, 1,000 U / mL PLD, 200 μg / mL Lipase, 100 μg / mL PK, 100 U / mL DNase I, 20 μg / mL Dispersin B) alone or in various combinations.
(d)37°Cで24時間静置培養した。 (d) The culture was stationary at 37 ° C for 24 hours.
(e)アスピレーターを使って培養液と浮遊菌を吸い取り、150 μLのPBSでバイオフィルムが形成されたプレートの穴を洗浄した。 (e) The culture solution and the floating bacteria were sucked up using an aspirator, and the hole of the plate on which the biofilm was formed was washed with 150 μL of PBS.
(f)アスピレーターを使って洗浄液を吸い取り、0.05% の CV を1穴あたり150 μL添加し、25 °Cで約3分間染色した。 (f) The washing solution was sucked using an aspirator, 0.05% CV was added at 150 μL per well, and staining was performed at 25 ° C. for about 3 minutes.
(g)アスピレーターを使って染色液を吸い取り、150 μLのPBSでバイオフィルムが形成されたプレートの穴を洗浄した。 (g) The staining solution was sucked using an aspirator, and the plate hole on which the biofilm was formed was washed with 150 μL of PBS.
(h)プレートリーダーInfinite F200 Proを使って、プラスチックプレートに形成されたバイオフィルムの吸光度(595 nm)を測定した。 (h) The absorbance (595 nm) of the biofilm formed on the plastic plate was measured using a plate reader Infinite F200 Pro.
図2は、MRSA、MSSA、及び、表皮ブドウ球菌が形成するバイオフィルムに対する各種の単体酵素(PLA、PLC、PI-PLC、PLD、Lipase)によるバイオフィルム形成抑制効果を示す図である。PLDは、MSSA及び表皮ブドウ球菌が形成するバイオフィルムに対する形成抑制効果は優れているが、溶血性が示された。PLAは、溶血性が示されず、更にMRSA及びMSSAが形成するバイオフィルムに対する形成抑制効果が優れているものの、表皮ブドウ球菌が形成するバイオフィルムに対する形成抑制効果はコントロールとほぼ同じであった。図2の結果は、MRSA、MSSA及び表皮ブドウ球菌が形成するバイオフィルムのマトリクスの主構成物が、それぞれ、相違するため、各種酵素によるバイオフィルム形成抑制効果のバラツキがあることを示す。 FIG. 2 is a diagram showing the biofilm formation inhibitory effect of various simple enzymes (PLA, PLC, PI-PLC, PLD, Lipase) on biofilms formed by MRSA, MSSA, and Staphylococcus epidermidis. PLD was excellent in the formation-inhibiting effect on biofilms formed by MSSA and Staphylococcus epidermidis, but showed hemolytic properties. PLA does not show hemolysis, and further has an excellent formation inhibitory effect on biofilms formed by MRSA and MSSA, but the formation inhibitory effect on biofilms formed by Staphylococcus epidermidis was almost the same as the control. The results in FIG. 2 show that the main components of the biofilm matrix formed by MRSA, MSSA, and Staphylococcus epidermidis are different, and thus there are variations in the biofilm formation inhibitory effect of various enzymes.
図3は、MRSA10株、MSSA7株及び表皮ブドウ球菌4株が形成するバイオフィルムに対する各種の単体酵素(PLA、PLC、PK、DNase、DispB)によるバイオフィルム形成抑制効果を示す図である。図3の結果は、MRSA(図3A)、MSSA(図3B)及び表皮ブドウ球菌(図3C)の株ごとにおいて、各種酵素によるバイオフィルム形成抑制効果のバラツキがあることを示す。 FIG. 3 is a diagram showing the biofilm formation inhibitory effect of various simple enzymes (PLA, PLC, PK, DNase, DispB) on biofilms formed by MRSA10 strain, MSSA7 strain and 4 S. epidermidis strains. The results in FIG. 3 show that there are variations in the effect of inhibiting biofilm formation by various enzymes in each strain of MRSA (FIG. 3A), MSSA (FIG. 3B), and Staphylococcus epidermidis (FIG. 3C).
図4は、MRSA10株(図4A)、MSSA7株(図4B)及び表皮ブドウ球菌4株(図4C)が形成するバイオフィルムに対する各種のカクテル酵素によるバイオフィルム形成抑制効果を示す図である。カクテル酵素は、PK/DNase/DispBの混合酵素、PLC/DNase/DispBの混合酵素、及び、PLA/DNase/DispBの混合酵素であった。PK/DNase/DispBは、PK 100 μg/mL、DNase I 100 U/mL、及び、Dispersin B 20 μg/mLであった。PLC/DNase/DispBは、PLC 200 μg/mL、DNase I 100 U/mL、及び、Dispersin B 20 μg/mLであった。PLA/DNase/DispBは、PLA 200 μg/mL、DNase I 100 U/mL、及び、Dispersin B 20 μg/mLであった。PLC/DNase/DispBの混合酵素は、MRSA10株、MSSA7株及び表皮ブドウ球菌4株が形成するバイオフィルムに対する形成抑制効果が優れていた。PLA/DNase/DispBの混合酵素は、PLC/DNase/DispBの混合酵素よりも、更に、MRSA10株、MSSA7株及び表皮ブドウ球菌4株が形成するバイオフィルムに対する形成抑制効果が優れていた。 FIG. 4 is a diagram showing biofilm formation inhibitory effects of various cocktail enzymes on biofilms formed by MRSA10 strain (FIG. 4A), MSSA7 strain (FIG. 4B), and 4 S. epidermidis strains (FIG. 4C). The cocktail enzyme was a mixed enzyme of PK / DNase / DispB, a mixed enzyme of PLC / DNase / DispB, and a mixed enzyme of PLA / DNase / DispB. PK / DNase / DispB was PK 100 μg / mL, DNase I 100 U / mL, and Dispersin B 20 μg / mL. PLC / DNase / DispB was PLC 200 μg / mL, DNase I 100 U / mL, and Dispersin B 20 μg / mL. PLA / DNase / DispB was PLA 200 μg / mL, DNase I 100 U / mL, and Dispersin B 20 μg / mL. The mixed enzyme of PLC / DNase / DispB was excellent in the formation inhibitory effect on the biofilm formed by MRSA10 strain, MSSA7 strain and 4 strains of S. epidermidis. The mixed enzyme of PLA / DNase / DispB was superior to the mixed enzyme of PLC / DNase / DispB in that the formation inhibitory effect on the biofilm formed by MRSA10 strain, MSSA7 strain and 4 S. epidermidis strains was superior.
3.共焦点レーザー顕微鏡(CLSM)を用いたバイオフィルムの観察
(a)MRSA No.11株(MR11株)のグリセロールストックから滅菌した爪楊枝を使って滅菌したBHI培地2 mLに菌を接種し、37°Cで一晩振とう培養した(振とう速度:150 rpm)。
3. Observation of biofilm using confocal laser microscope (CLSM)
(a) Bacteria were inoculated into 2 mL of sterilized BHI medium using a toothpick sterilized from a glycerol stock of MRSA No. 11 strain (MR11 strain) and cultured overnight at 37 ° C (shaking speed: 150) rpm).
(b)一晩培養した培養液を滅菌したBHIG培地に1,000倍希釈した。 (b) The overnight culture was diluted 1,000 times in a sterilized BHIG medium.
(c)希釈した菌液を滅菌したガラス底培養皿(松浪硝子工業, Cat#: D111300)に2 mLずつ分注し、37°Cで24時間静置培養した。 (c) 2 mL of the diluted bacterial solution was dispensed into a sterilized glass bottom culture dish (Matsunami Glass Industrial Co., Ltd., Cat #: D111300), followed by stationary culture at 37 ° C for 24 hours.
(d)バイオフィルム培養液に200 μg/mL PLAを添加し、37°Cで2時間インキュベートすることでバイオフィルムを破壊した。 (d) Biofilm was destroyed by adding 200 μg / mL PLA to the biofilm culture and incubating at 37 ° C. for 2 hours.
(e)アスピレーターを使って培養液と浮遊菌を吸い取り、2 mLの酢酸バッファー(pH 5.0)で2回洗浄した。 (e) The culture solution and the floating bacteria were sucked up using an aspirator and washed twice with 2 mL of acetate buffer (pH 5.0).
(f)4%パラフォルムアルデヒド/PBSを2 mL添加し、バイオフィルムを室温で10分間固定した。 (f) 2 mL of 4% paraformaldehyde / PBS was added, and the biofilm was fixed at room temperature for 10 minutes.
(g)アスピレーターを使って固定液を吸い取り、2 mLの酢酸バッファー(pH 5.0)で3回洗浄した。 (g) The fixative was sucked using an aspirator and washed 3 times with 2 mL of acetate buffer (pH 5.0).
(h)FilmTracerTM FMTM 1-43 Green Biofilm Cell Stain(Themo Fisher Scientific, Cat#: F10317)を用いてバイオフィルムに含まれるリン脂質(細胞膜等)を室温で30分間染色した。 (h) Phospholipids (cell membrane, etc.) contained in the biofilm were stained at room temperature for 30 minutes using FilmTracer ™ FM ™ 1-43 Green Biofilm Cell Stain (Themo Fisher Scientific, Cat #: F10317).
(i)アスピレーターを使って染色液を吸い取り、2 mLの滅菌水で3回洗浄した。 (i) The staining solution was sucked using an aspirator and washed 3 times with 2 mL of sterile water.
(j)滅菌水を2 mL添加し、NucBlueTM Fixed Cell ReadyProbesTM Reagent(Themo Fisher Scientific, Cat#: R37606)を2滴滴下し、核酸を染色した。 (j) 2 mL of sterilized water was added, and 2 drops of NucBlue ™ Fixed Cell ReadyProbes ™ Reagent (Themo Fisher Scientific, Cat #: R37606) was added dropwise to stain the nucleic acid.
(k)共焦点レーザー顕微鏡LSM-880(カールツァイス)を用いてバイオフィルムを観察した。 (k) The biofilm was observed using a confocal laser microscope LSM-880 (Carl Zeiss).
図5は、MR11が形成するバイオフィルムに対するPLAによるバイオフィルム破壊効果を示す共焦点レーザー顕微鏡(CLSM)を用いたイメージ図である。PLAによるバイオフィルム破壊効果が、視覚的に確認できる。 FIG. 5 is an image diagram using a confocal laser microscope (CLSM) showing the biofilm destruction effect of PLA on the biofilm formed by MR11. The biofilm destruction effect by PLA can be visually confirmed.
バイオフィルムの形成抑制および除去に利用できる。 It can be used to suppress and remove biofilm formation.
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