JP2019170350A - Screening method for squalene consuming enzyme, and squalene-hopene cyclase - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、スクアレン消費酵素のスクリーニング方法及びスクアレン−ホペン環化酵素に関する。 The present invention relates to a screening method for squalene consuming enzyme and squalene-hopene cyclase.
スクアレンは、Ｃ３０の直鎖状炭化水素であり、化粧品原料、食油、燃料として注目されている。さらに、スクアレンを前駆体として生合成されるトリテルペン類も注目されている。
しかし、これらのスクアレンを起点とする有価化合物の合成活性をスクリーニングする系の開発が不十分であった。そのため、生合成経路の解明は限定的である。当然であるが、生合成経路が解明されていないので、スクアレンを起点とする有価化合物の生合成の試みもほとんどされていない状況である。
Squalene is a C30 linear hydrocarbon and has attracted attention as a cosmetic raw material, edible oil, and fuel. Furthermore, triterpenes biosynthesized with squalene as a precursor have also attracted attention.
However, the development of a system for screening the synthetic activity of valuable compounds starting from these squalenes has been insufficient. Therefore, elucidation of the biosynthetic pathway is limited. Naturally, since the biosynthetic pathway has not been elucidated, there are almost no attempts to biosynthesize valuable compounds starting from squalene.
スクアレン環化酵素である精製されたAlicyclobacillus由来のスクアレン／ホベンサイクラーゼに有機合成された人工基質を与えると、非天然のC35テルペン骨格が得られることが知られている(非特許文献１：Ａｂｅ，ＪAＣＳ，124，14514(2002):Hoshino，Ｃｈｅｍ Ｅｕｒ;Ｊ．１５，2091(2009))。このような新規機能の候補が無数に存在するが、それらの組織的な探索、あるいはそれらの特異性の改変は、スクリーニング系の不在により極めて困難であった。 It is known that a non-natural C35 terpene skeleton can be obtained by providing an organically synthesized artificial substrate to purified Alicyclobacillus-derived squalene / hoven cyclase, which is a squalene cyclase (Non-Patent Document 1: Abe, JACS, 124, 14514 (2002): Hoshino, Chem Eur; J. 15, 2091 (2009)). There are innumerable candidates for such new functions, but their systematic search or modification of their specificity has been extremely difficult due to the absence of a screening system.
スクアレン−ホペン環化酵素の変異型酵素（D377C、D377N、Y420H、Y420W等）を用いることによって、スクアレンから、単環性トリテルペンである３−デオキシアキレオールＡを得る方法が知られている｛非特許文献２： Biosci. Biotechnol. Biochem., (1999) Vol.63, pp. 2189-2198、非特許文献３：Biosci. Biotechnol. Biochem., (2001) Vol.65, pp.2233-2242、非特許文献４：Biosci. Biotechnol. Biochem., (2002) Vol.66, pp.1660-1670）｝。
しかし、本発明の変異型スクアレン−ホペン環化酵素と前記変異型酵素と比較した場合、アミノ酸置換が明らかに異なる。
There is known a method for obtaining 3-deoxyacetylol A, which is a monocyclic triterpene, from squalene by using a squalene-hopene cyclase mutated enzyme (D377C, D377N, Y420H, Y420W, etc.) Patent Document 2: Biosci. Biotechnol. Biochem., (1999) Vol. 63, pp. 2189-2198, Non-patent Document 3: Biosci. Biotechnol. Biochem., (2001) Vol. 65, pp. 2233-2242, Non Patent Document 4: Biosci. Biotechnol. Biochem., (2002) Vol. 66, pp. 1660-1670)}.
However, the amino acid substitution is clearly different when compared with the mutant squalene-hopene cyclase of the present invention and the mutant enzyme.
本発明者らは、「テルペン合成酵素変異体をコードする遺伝子であって、酵素活性及び／又はその発現が野生型酵素と比較して増強されたテルペン合成酵素変異体をコードする遺伝子を導入した細胞に、被検遺伝子を導入して培養し、細胞に導入した被検遺伝子のうち生存した細胞に導入した被検遺伝子を選択することを含む、テルペン合成酵素の遺伝子及び／又はその変異体のスクリーニング方法（参照：特許文献１）」を開示している。
しかし、前記スクリーニング方法は、本発明のスクアレン消費酵素及び／又はその変異体のスクリーニング方法とは原理が異なる。
The present inventors have introduced "a gene encoding a terpene synthase variant, which encodes a terpene synthase variant whose enzyme activity and / or its expression is enhanced compared to the wild-type enzyme. A terpene synthase gene and / or a variant thereof comprising introducing a test gene into a cell and culturing, and selecting a test gene introduced into a living cell among the test genes introduced into the cell "Screening method (Reference: Patent Document 1)".
However, the principle of the screening method is different from the screening method of the squalene consuming enzyme and / or variant thereof of the present invention.
本発明者らは、「被検遺伝子を色素合成可能な細胞に導入し、色素合成量の低下を検出することを特徴とする、テルペン合成酵素の遺伝子及び／又はその変異体のスクリーニング方法（参照：特許文献２）」を開示している。
しかし、前記スクリーニング方法は、本発明のスクアレン消費酵素及び／又はその変異体のスクリーニング方法とはスクリーニングの対象が異なる。
The present inventors have described "a method for screening a terpene synthase gene and / or its mutant, characterized by introducing a test gene into a cell capable of pigment synthesis and detecting a decrease in the amount of pigment synthesis (see : Patent Document 2) ".
However, the screening method is different from the screening method for the squalene consuming enzyme and / or variant thereof of the present invention.
本発明は、新規なスクアレン消費酵素のスクリーニング方法及びスクアレン−ホペン環化酵素を提供することである。 The present invention is to provide a novel screening method for squalene consuming enzyme and squalene-hopene cyclase.
本発明者らは鋭意検討した結果、スクアレン消費酵素遺伝子を、スクアレンを経由して合成される色素合成可能な細胞に導入し、該色素合成量の増加又は低下を指標とする、スクアレン消費酵素及び／又はその変異体のスクリーニング方法を完成し、さらに該方法により変異型スクアレン−ホペン環化酵素を得ることができて、本発明を完成した。 As a result of intensive studies, the present inventors have introduced a squalene-consuming enzyme gene into a cell capable of dye synthesis synthesized via squalene, and using the increase or decrease in the amount of dye synthesis as an index, A method for screening mutants thereof was completed, and a mutant squalene-hopene cyclase could be obtained by the method, thereby completing the present invention.
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．配列番号１で示されるアミノ酸配列における４２位、６１位、６９位、７１位、９０位、１０７位、１１７位、１２０位、１２４位、１２８位、１２９位、１３１位、１３６位、１４２位、１４５位、１５３位、１５７位、１５９位、１７１位、１８１位、１８７位、１９５位、２０３位、２０７位、２０８位、２１１位、２１４位、２１９位、２３６位、２５１位、２５５位、２５７位、２５９位、２６５位、２７１位、２８５位、２９８位、３３２位、３３５位、３４８位、３５４位、３５７位、３５９位、３６５位、３７８位、３９０位、４２４位、４３７位、４３９位、４４０位、４７８位、４９７位、５０３位、５１４位、５２５位、５７４位、６０４位、及び６２３位からなる群より選択される少なくとも１つの部位にアミノ酸置換を有することを特徴とする、変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体。
２．前記変異型スクアレン−ホペン環化酵素は、野生型スクアレン−ホペン環化酵素と比較して、ホペン合成量が高いことを特徴とする、前項１に記載の変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体。
３．前記のアミノ酸配列番号１の部位で示されるアミノ酸置換は、以下の群より選択される少なくとも１以上からなる前項１又は２に記載の変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体、
M42V、Ｍ42Ｔ、Ｍ61Ｖ、L69S、E71D、T90M、Ｅ107Ｋ、I117Ｖ、Q120R、Ｅ124Ｇ、F129L、Ｖ128L、Ｖ128Ｍ、R131Q、L136Ｐ、W142Ｒ、V145A、Ｍ153L、Ｋ157Ｅ、Ｍ159I、Ｒ171Ｑ、Ｍ181Ｖ、M181R、Ｍ181Ｔ、F187L、Ｙ195Ａ、Ｖ203Ｇ、R207W、Ｒ208Ｈ、Ｋ211Ｒ、K211Ｍ、Ｇ214Ｃ、D219G、F236S、F236L、Ｄ251Ｈ、Ｄ255Ｇ、S257N、G259S、Ｗ265Ｃ、Ａ271Ｖ、Ｋ285Ｅ、Ｄ298Ｅ、Ｒ332Ｃ、Ｋ335Ｒ、P348S、Ｋ354Ｍ、Ｎ357Ｙ、Ｋ359Ｍ、F365L、Ｔ378Ａ、L390S、Ｎ424Ｄ、F437L、Ｅ439Ｇ、Ｖ440L、Ｅ478Ｇ、T497S 、A503Ｖ、P514S、Ｑ525Ｒ、Ａ574Ｔ、Ｄ604Ｇ及びＲ623L。
４．前記アミノ酸置換は、以下のいずれから選択される１以上からなる前項１〜３のいずれか１項に記載の変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体、
M181V、V128L、L136P、N424D、V440L。
５．前記アミノ酸置換は、以下の（１）〜（２４）のいずれから選択される１からなる前項１〜３のいずれか１項に記載の変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体、
（１）R131Q、M159I、F437L
（２）F129L、F236L、P514S、R623L
（３）G259S、K335R、F437L、Q525R、A574T
（４）V128L
（５）L136P
（６）F236S、A503V、D604G
（７）V145A、E478G
（８）I117V、Q120R、R171Q、D251H
（９）V440L
（１０）M153L、E439G
（１１）E71D、Y195A、D219G、A271V、T378A
（１２）W142R、K211R、K359M
（１３）R208H、S257N、W265C
（１４）M42V、V203G
（１５）M181T、T497S
（１６）M42T、M61V、L69S、K157E、D255G、K285E
（１７）N424D
（１８）T90M、E124G、P348S
（１９）E107K、M181R、K354M、L390S
（２０）G214C、D298E
（２１）M181V
（２２）R207W、K211M
（２３）V128M、F187L、及び、
（２４）R332C、N357Y、F365L。
６．配列番号１で示されるアミノ酸配列において、R131Q、M159I及びF437Lのアミノ酸置換を有することを特徴とする、変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体。
７．以下の（１）〜（７）のいずれか１である遺伝子からなる変異型スクアレン−ホペン環化酵素遺伝子、
（１）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子、
（２）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（３）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（４）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、
（５）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（６）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1〜50個の塩基配列が置換、欠損、挿入及び／又は付加しているDNAからなる遺伝子、及び、
（７）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAと相同性が90%以上のDNAからなる遺伝子。
８．以下の（１）〜（３）のいずれか１であるアミノ酸配列からなる変異型スクアレン−ホペン環化酵素、
（１）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列、
（２）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性を有するアミノ酸配列、及び、
（３）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性を有するアミノ酸配列。
９．スクアレン消費酵素遺伝子を、スクアレンを経由して合成される色素合成可能な細胞に導入し、該色素合成量の増加又は低下を指標とする、スクアレン消費酵素及び／又はその変異体のスクリーニング方法。
１０．前記色素合成量の低下が、色素合成に関与する又は競合する酵素の基質がスクアレン消費酵素により消費されることによる色素合成量の低下である、前項９に記載のスクリーニング方法。
１１．前記細胞が大腸菌又は酵母である、前項９又は１０に記載のスクリーニング方法。
１２．前記細胞がスクアレンを経由して合成される色素合成に関与する若しくは競合する遺伝子又はその変異体により形質転換された細胞である、前項９〜１１のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
１３．スクアレン消費酵素がスクアレン−ホペン環化酵素であり、スクアレンを経由して合成される色素合成に関与する遺伝子がスクアレン不飽和化酵素（CrtN）遺伝子である、前項９〜１２のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
１４．スクアレン消費酵素がスクアレン不飽和化酵素であり、スクアレンを経由して合成される色素合成に競合する遺伝子がスクアレン−ホペン環化酵素遺伝子である、前項９〜１２のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
That is, the present invention is as follows.
1. 42, 61, 69, 71, 90, 107, 117, 120, 124, 128, 129, 131, 136, 142 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. 145, 153, 157, 159, 171, 181, 187, 195, 203, 207, 208, 211, 214, 219, 236, 251, 255 , 257, 259, 265, 271, 285, 298, 332, 335, 348, 354, 357, 359, 365, 378, 390, 424, 437, 439, 440, 478, 497, 503, 514, 525, 574, 604, and 623 amino acids in at least one site selected from the group consisting of And having a conversion, mutant squalene - Hopen cyclase or a derivative thereof.
2. The mutant squalene-hopene cyclizing enzyme according to item 1 above, wherein the mutant squalene-hopene cyclizing enzyme has a higher amount of hopene synthesis than wild-type squalene-hopene cyclizing enzyme Derivative.
3. The amino acid substitution shown at the site of the amino acid sequence No. 1 is the mutant squalene-hopene cyclase or the derivative thereof according to item 1 or 2, comprising at least one selected from the following group,
M42V, M42T, M61V, L69S, E71D, T90M, E107K, I117V, Q120R, E124G, F129L, V128L, V128M, R131Q, L136P, W142R, V145A, M153L, K157E, M159I, R171Q, M181V, M181R, M181T, F187 Y195A, V203G, R207W, R208H, K211R, K211M, G214C, D219G, F236S, F236L, D251H, D255G, S257N, G259S, W265C, A271V, K285E, D298E, R332C, K335R, P348S, K354M, N357Y, 359M, N357Y, 359M T378A, L390S, N424D, F437L, E439G, V440L, E478G, T497S, A503V, P514S, Q525R, A574T, D604G and R623L.
4). The mutant amino acid squalene-hopene cyclizing enzyme or derivative thereof according to any one of items 1 to 3, wherein the amino acid substitution is one or more selected from the following:
M181V, V128L, L136P, N424D, V440L.
5. The mutant squalene-hopene cyclase or derivative thereof according to any one of items 1 to 3, wherein the amino acid substitution is 1 selected from any of the following (1) to (24):
(1) R131Q, M159I, F437L
(2) F129L, F236L, P514S, R623L
(3) G259S, K335R, F437L, Q525R, A574T
(4) V128L
(5) L136P
(6) F236S, A503V, D604G
(7) V145A, E478G
(8) I117V, Q120R, R171Q, D251H
(9) V440L
(10) M153L, E439G
(11) E71D, Y195A, D219G, A271V, T378A
(12) W142R, K211R, K359M
(13) R208H, S257N, W265C
(14) M42V, V203G
(15) M181T, T497S
(16) M42T, M61V, L69S, K157E, D255G, K285E
(17) N424D
(18) T90M, E124G, P348S
(19) E107K, M181R, K354M, L390S
(20) G214C, D298E
(21) M181V
(22) R207W, K211M
(23) V128M, F187L, and
(24) R332C, N357Y, F365L.
6). A mutant squalene-hopene cyclase or a derivative thereof, which has amino acid substitutions of R131Q, M159I and F437L in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
7. A mutant squalene-hopene cyclase gene comprising a gene which is any one of the following (1) to (7):
(1) a gene encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 4,
(2) In the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 2 to 4, 1 to 20 amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added, and any one of SEQ ID NOs: 2 to 4 A gene encoding a polypeptide having an activity substantially equivalent to the activity of cyclizing squalene of a polypeptide comprising the described amino acid sequence to produce a pentacyclic hopene,
(3) Squalene possessed by a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 4 having 90% or more homology with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 4 A gene encoding a polypeptide having an activity substantially equivalent to that of producing a pentacyclic hopene by closing
(4) a gene consisting of a DNA comprising the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 5 to 7,
(5) It hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 5 to 7, and any one of SEQ ID NOs: 2 to 4 A gene encoding a polypeptide having an activity substantially equivalent to the activity of ring-closing squalene contained in the polypeptide comprising the amino acid sequence described in to produce a pentacyclic hopene,
(6) a gene comprising a DNA comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 5 to 7, wherein 1 to 50 nucleotide sequences are substituted, deleted, inserted and / or added; and
(7) A gene comprising a DNA having a homology of 90% or more with the DNA comprising the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 5 to 7.
8). A mutant squalene-hopene cyclase comprising an amino acid sequence of any one of the following (1) to (3):
(1) the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 2 to 4,
(2) In the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 2 to 4, 1 to 20 amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added, and any one of SEQ ID NOs: 2 to 4 An amino acid sequence having an activity to cyclize squalene of a polypeptide comprising the amino acid sequence described above to generate a pentacyclic hopene; and
(3) Squalene possessed by a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 4 having 90% or more homology with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 4 An amino acid sequence having the activity of closing a ring to produce a pentacyclic hopene.
9. A screening method for a squalene consuming enzyme and / or a variant thereof, wherein a squalene consuming enzyme gene is introduced into a cell capable of dye synthesis synthesized via squalene, and the increase or decrease in the amount of dye synthesis is used as an indicator.
10. 10. The screening method according to item 9, wherein the decrease in the amount of dye synthesis is a decrease in the amount of dye synthesis due to consumption of a substrate of an enzyme involved in or competing with dye synthesis by a squalene consuming enzyme.
11. 11. The screening method according to 9 or 10 above, wherein the cell is Escherichia coli or yeast.
12 12. The screening method according to any one of items 9 to 11, wherein the cell is a cell transformed with a gene involved in or competing with pigment synthesis synthesized via squalene or a mutant thereof.
13. In any one of the above items 9 to 12, the squalene consuming enzyme is squalene-hopene cyclase, and the gene involved in dye synthesis synthesized via squalene is a squalene desaturase (CrtN) gene. The screening method described.
14 [13] The screening according to any one of [9] to [12], wherein the squalene consuming enzyme is a squalene desaturase, and the gene that competes for dye synthesis synthesized via squalene is a squalene-hopene cyclase gene. Method.
本発明は、野生型スクアレン−ホペン環化酵素と比較してホペン合成量が高い変異型スクアレン−ホペン環化酵素並びに該酵素のスクリーニング方法を提供することができた。 The present invention was able to provide a mutant squalene-hopene cyclizing enzyme having a higher amount of hopene synthesis than the wild-type squalene-hopene cyclizing enzyme and a screening method for the enzyme.
本発明は、「変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその変異体」、並びに、「スクアレン消費酵素及び／又はその変異体のスクリーニング方法」に関する。 The present invention relates to “mutant squalene-hopene cyclase or a variant thereof” and “screening method for squalene consuming enzyme and / or a variant thereof”.
（変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体）
本発明の変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体は、野生型スクアレン−ホペン環化酵素と比較して、アミノ酸又は塩基が１以上異なる酵素を意味する。
野生型スクアレン−ホペン環化酵素は、Alicyclobacillus属、Zymomonas属、Bradyrhizobium属、Methylococcus属等の細菌で産出され、スクアレンを閉環して、５環性のホペン又はホパノールを生成する酵素として知られている。
特に、本発明の変異型スクアレン−ホペン環化酵素又はその誘導体は、野生型スクアレン−ホペン環化酵素と比較して、ホペン合成量が高い（合成活性が高い）ことを特徴とする。
また、本発明の誘導体とは、変異型スクアレン−ホペン環化酵素の保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、若しくはアセチル化誘導体を対象とする。
なお、保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、若しくはアセチル化誘導体は、自体公知の方法で得ることができる。
(Mutant squalene-hopene cyclase or derivative thereof)
The mutant squalene-hopene cyclizing enzyme or derivative thereof of the present invention means an enzyme having one or more amino acids or bases different from those of wild-type squalene-hopene cyclizing enzyme.
Wild-type squalene-hopene cyclase is produced by bacteria such as Alicyclobacillus genus, Zymomonas genus, Bradyrhizobium genus, and Methylococcus genus, and is known as an enzyme that cyclizes squalene to produce pentacyclic hopene or hopanol. .
In particular, the mutant squalene-hopene cyclase or the derivative thereof of the present invention is characterized by a higher amount of hopene synthesis (higher synthesis activity) than that of wild-type squalene-hopene cyclase.
In addition, the derivative of the present invention is a protected derivative, sugar chain modified product, acylated derivative, or acetylated derivative of a mutant squalene-hopene cyclizing enzyme.
The protected derivative, sugar chain modified product, acylated derivative, or acetylated derivative can be obtained by a method known per se.
本発明の変異型スクアレン−ホペン環化酵素は、Alicyclobacillus acidocaldarius由来のスクアレン−ホペン環化酵素（配列番号１）と比較して、アミノ酸配列に以下で示される置換を有する。
４２位、６１位、６９位、７１位、９０位、１０７位、１１７位、１２０位、１２４位、１２８位、１２９位、１３１位、１３６位、１４２位、１４５位、１５３位、１５７位、１５９位、１７１位、１８１位、１８７位、１９５位、２０３位、２０７位、２０８位、２１１位、２１４位、２１９位、２３６位、２５１位、２５５位、２５７位、２５９位、２６５位、２７１位、２８５位、２９８位、３３２位、３３５位、３４８位、３５４位、３５７位、３５９位、３６５位、３７８位、３９０位、４２４位、４３７位、４３９位、４４０位、４７８位、４９７位、５０３位、５１４位、５２５位、５７４位、６０４位、及び／又は６２３位。
また、本発明の変異型スクアレン−ホペン環化酵素は、Alicyclobacillus acidocaldarius由来のスクアレン−ホペン環化酵素（配列番号１）と比較して、アミノ酸配列に以下で示される置換を有する。
M42V、Ｍ42Ｔ、Ｍ61Ｖ、L69S、E71D、T90M、Ｅ107Ｋ、I117Ｖ、Q120R、Ｅ124Ｇ、F129L、Ｖ128L、Ｖ128Ｍ、R131Q、L136Ｐ、W142Ｒ、V145A、Ｍ153L、Ｋ157Ｅ、Ｍ159I、Ｒ171Ｑ、Ｍ181Ｖ、M181R、Ｍ181Ｔ、F187L、Ｙ195Ａ、Ｖ203Ｇ、R207W、Ｒ208Ｈ、Ｋ211Ｒ、K211Ｍ、Ｇ214Ｃ、D219G、F236S、F236L、Ｄ251Ｈ、Ｄ255Ｇ、S257N、G259S、Ｗ265Ｃ、Ａ271Ｖ、Ｋ285Ｅ、Ｄ298Ｅ、Ｒ332Ｃ、Ｋ335Ｒ、P348S、Ｋ354Ｍ、Ｎ357Ｙ、Ｋ359Ｍ、F365L、Ｔ378Ａ、L390S、Ｎ424Ｄ、F437L、Ｅ439Ｇ、Ｖ440L、Ｅ478Ｇ、T497S 、A503Ｖ、P514S、Ｑ525Ｒ、Ａ574Ｔ、Ｄ604Ｇ及び／又はＲ623L。
The mutant squalene-hopene cyclase of the present invention has the following substitutions in the amino acid sequence as compared with squalene-hopene cyclase derived from Alicyclobacillus acidocaldarius (SEQ ID NO: 1).
42, 61, 69, 71, 90, 107, 117, 120, 124, 128, 129, 131, 136, 142, 145, 153, 157 159, 171, 181, 187, 195, 203, 207, 208, 211, 214, 219, 236, 251, 255, 257, 259, 265 271st, 285th, 298th, 332th, 335th, 348th, 354th, 357th, 359th, 359th, 378th, 390th, 424th, 437th, 439th, 440th, 478, 497, 503, 514, 525, 574, 604, and / or 623.
In addition, the mutant squalene-hopene cyclase of the present invention has the following substitution in the amino acid sequence as compared to squalene-hopene cyclase derived from Alicyclobacillus acidocaldarius (SEQ ID NO: 1).
M42V, M42T, M61V, L69S, E71D, T90M, E107K, I117V, Q120R, E124G, F129L, V128L, V128M, R131Q, L136P, W142R, V145A, M153L, K157E, M159I, R171Q, M181V, M181R, M181T, F187 Y195A, V203G, R207W, R208H, K211R, K211M, G214C, D219G, F236S, F236L, D251H, D255G, S257N, G259S, W265C, A271V, K285E, D298E, R332C, K335R, P348S, K354M, N357Y, 359M, N357Y, 359M T378A, L390S, N424D, F437L, E439G, V440L, E478G, T497S, A503V, P514S, Q525R, A574T, D604G and / or R623L.
本発明の変異型スクアレン−ホペン環化酵素は、Alicyclobacillus acidocaldarius由来のスクアレン−ホペン環化酵素（配列番号１）と比較して、アミノ酸配列に以下の（１）〜（２４）のいずれか１で示される置換を有する。
（１）R131Q、M159I、F437L（配列番号２、配列番号５）
（２）F129L、F236L、P514S、R623L（配列番号３、配列番号６）
（３）G259S、K335R、F437L、Q525R、A574T（配列番号４、配列番号７）
（４）V128L
（５）L136P
（６）F236S、A503V、D604G
（７）V145A、E478G
（８）I117V、Q120R、R171Q、D251H
（９）V440L
（１０）M153L、E439G
（１１）E71D、Y195A、D219G、A271V、T378A
（１２）W142R、K211R、K359M
（１３）R208H、S257N、W265C
（１４）M42V、V203G
（１５）M181T、T497S
（１６）M42T、M61V、L69S、K157E、D255G、K285E
（１７）N424D
（１８）T90M、E124G、P348S
（１９）E107K、M181R、K354M、L390S
（２０）G214C、D298E
（２１）M181V
（２２）R207W、K211M
（２３）V128M、F187L
（２４）R332C、N357Y、F365L
The mutant squalene-hopene cyclase of the present invention is any one of the following (1) to (24) in amino acid sequence as compared to squalene-hopene cyclase derived from Alicyclobacillus acidocaldarius (SEQ ID NO: 1). With the indicated substitution.
(1) R131Q, M159I, F437L (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5)
(2) F129L, F236L, P514S, R623L (SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6)
(3) G259S, K335R, F437L, Q525R, A574T (SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7)
(4) V128L
(5) L136P
(6) F236S, A503V, D604G
(7) V145A, E478G
(8) I117V, Q120R, R171Q, D251H
(9) V440L
(10) M153L, E439G
(11) E71D, Y195A, D219G, A271V, T378A
(12) W142R, K211R, K359M
(13) R208H, S257N, W265C
(14) M42V, V203G
(15) M181T, T497S
(16) M42T, M61V, L69S, K157E, D255G, K285E
(17) N424D
(18) T90M, E124G, P348S
(19) E107K, M181R, K354M, L390S
(20) G214C, D298E
(21) M181V
(22) R207W, K211M
(23) V128M, F187L
(24) R332C, N357Y, F365L
本発明の変異型スクアレン−ホペン環化酵素は、Alicyclobacillus acidocaldarius由来のスクアレン−ホペン環化酵素（配列番号１）と比較して、以下のいずれから１以上のアミノ酸置換を有することにより、野生型スクアレン−ホペン環化酵素と比較して、ホペン合成量が高いことを下記の実施例で確認している。
M181V、V128L、L136P、N424D及びV440L。
Compared with Alicyclobacillus acidocaldarius-derived squalene-hopene cyclase (SEQ ID NO: 1), the mutant squalene-hopene cyclase of the present invention has one or more amino acid substitutions from the following, so that wild-type squalene -Compared with hopene cyclase, the following examples confirm that the amount of hopene synthesis is high.
M181V, V128L, L136P, N424D and V440L.
ホペン合成量（ホペン合成活性）が高いとは、Alicyclobacillus acidocaldarius由来の野生型スクアレン−ホペン環化酵素（配列番号１）と比較して、1.1倍以上、1.5倍以上、2.0倍以上、3.0倍以上、約4.0倍（以上）、約5.0倍（以上）、約6.0倍（以上）、約7.0倍（以上）、約8.0倍（以上）、約9.0倍（以上）、約10倍（以上）、約11倍（以上）、約12倍（以上）、約13倍（以上）、約14倍（以上）、約15倍（以上）、約16倍（以上）、約17倍（以上）、約18倍（以上）、約19倍（以上）、約20倍（以上）、約21倍（以上）、約22倍（以上）、約23倍（以上）、約24倍（以上）、約25倍（以上）、約26倍（以上）、約27倍（以上）、約28倍（以上）、約29倍（以上）、約30倍（以上）、約31倍（以上）、約35倍（以上）、約40倍（以上）のホペン合成量を例示することができる。 Compared with Alicyclobacillus acidocaldarius-derived wild-type squalene-hopene cyclase (SEQ ID NO: 1), the amount of hopene synthesis (hopene synthesis activity) is 1.1 times or more, 1.5 times or more, 2.0 times or more, 3.0 times or more , Approximately 4.0 times (or higher), approximately 5.0 times (or higher), approximately 6.0 times (or higher), approximately 7.0 times (or higher), approximately 8.0 times (or higher), approximately 9.0 times (or higher), approximately 10 times (or higher), Approximately 11 times (or higher), approximately 12 times (or higher), approximately 13 times (or higher), approximately 14 times (or higher), approximately 15 times (or higher), approximately 16 times (or higher), approximately 17 times (or higher), approximately 18 times (more), about 19 times (more), about 20 times (more), about 21 times (more), about 22 times (more), about 23 times (more), about 24 times (more), about 25 Times (over), about 26 times (over), about 27 times (over), about 28 times (over), about 29 times (over), about 30 times (over), about 31 times (over), about 35 times (Above), about 40 times (or more) hopene synthesis amount can be exemplified.
（変異型スクアレン−ホペン環化酵素遺伝子）
本発明の変異型スクアレン−ホペン環化酵素遺伝子は、（１）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子、（２）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸、好ましくは1〜15個、より好ましくは1〜10個、最も好ましくは1〜5個が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、（３）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、（４）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、（５）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、（６）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1〜50個の塩基配列が置換、欠損、挿入及び／又は付加しているDNAからなる遺伝子、（７）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAと90%以上の相同性を有するDNAからなる遺伝子を、含む。
上記（１）の遺伝子は、本発明のスクアレン消費酵素及び／又はその変異体のスクリーニング方法から得られたスクアレン−ホペン環化酵素をコードする遺伝子である。該スクアレン−ホペン環化酵素は、スクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性を持つ。
上記（２）の遺伝子は、本発明の変異型スクアレン−ホペン環化酵素に対して酵素活性を失わせない程度の変異を導入したポリペプチドをコードする遺伝子である。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982）などを挙げることができる。変異したアミノ酸の数は、通常は、20アミノ酸以内であり、好ましくは10アミノ酸以内であり、更に好ましくは５アミノ酸以内であり、最も好ましくは3アミノ酸である。変異を導入したポリペプチドが酵素活性を保持しているかどうかは、例えば、変異を導入したポリペプチドをコードする遺伝子を大腸菌等に導入し、発現させ、その大腸菌等がスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成することができるかどうか調べることによりわかる。特に、本実施例により、Alicyclobacillus acidocaldarius由来のスクアレン−ホペン環化酵素のアミノ酸配列において、酵素活性に重要なアミノ酸の位置であるM181、V128、L136、N424及びV440を特定している。これらのアミノ酸の位置・部位に変異が導入されると酵素活性が失われる可能性が高いので、変異はこれらのアミノ酸以外のアミノ酸に導入されることが好ましい。
上記（３）の遺伝子に関し、「配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性と実質的同等の活性」とは、その活性程度が、配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列のスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性と比較して強くても弱くてもよい。例えば、0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1.0倍、1.1倍、1.2倍、1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍の活性を例示することができる。
また、相同性は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center forBiological Information）等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算することができる。
上記（５）の遺伝子は、DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる遺伝子である。この遺伝子における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、5×SSC、1％SDSを含む緩衝液中の37℃でのハイブリダイゼーション及び1×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による37℃での洗浄処理といった条件であり、好ましくは、5×SSC、1％SDSを含む緩衝液中の42℃でのハイブリダイゼーション及び0.5×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による42℃での洗浄処理といった条件であり、更に好ましくは、5×SSC、1％SDSを含む緩衝液中の65℃でのハイブリダイゼーション及び0.2×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による65℃での洗浄処理といった条件である。ハイブリダイゼーションを利用することにより得られたDNAが、活性を有するポリペプチドをコードするかどうかは、例えば、そのDNAを大腸菌等に導入し、発現させ、その大腸菌等がスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成することができるかどうか調べることによりわかる。ハイブリダイゼーションにより得られるDNAは、上記（４）の遺伝子（配列番号５〜７のいずれか１）と通常、高い相同性を有する。高い相同性とは、90％以上の相同性、好ましくは95％以上の相同性、更に好ましくは98％以上の相同性を指す。
上記（６）の遺伝子は、配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1〜50個、好ましくは1〜30個、より好ましくは1〜20個、特に好ましくは1〜10個、最も好ましくは1〜5個の塩基配列が置換、欠損、挿入及び／又は付加しているDNAからなる遺伝子である。
上記（７）の遺伝子は、配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAと90%以上、好ましくは93％以上、より好ましくは95％以上、最も好ましくは98％以上の相同性を有するDNAからなる遺伝子を、含む。
(Mutant squalene-hopene cyclase gene)
The mutant squalene-hopene cyclase gene of the present invention includes (1) a gene encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 4, and (2) any of SEQ ID NOs: 2 to 4. 1 to 20 amino acids, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, most preferably 1 to 5 are substituted, deleted, inserted and / or added. And encoding a polypeptide having an activity substantially equivalent to the activity of ring-closing squalene contained in the polypeptide having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 4 to produce a pentacyclic hopene A gene, (3) a polypeptide having 90% or more homology with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 4 and comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 4 Having a suku A gene encoding a polypeptide having an activity substantially equivalent to the activity of cyclizing len to produce a pentacyclic hopene, (4) from a DNA comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 5-7 (5) hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to a DNA consisting of the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 5 to 7, and A gene encoding a polypeptide having an activity substantially equivalent to the activity of generating a pentacyclic hopene by closing squalene of a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of (1), (6) SEQ ID NO: 5 7. A DNA comprising the nucleotide sequence of any one of 7 in which 1 to 50 nucleotide sequences are substituted, deleted, inserted and / or added, (7) any of SEQ ID NOs: 5 to 7 Or 1 A gene comprising a DNA comprising the described nucleotide sequence and a DNA having a homology of 90% or more.
The gene of the above (1) is a gene encoding squalene-hopene cyclase obtained from the screening method of the squalene consuming enzyme and / or mutant thereof of the present invention. The squalene-hopene cyclase has an activity of cyclizing squalene to produce a pentacyclic hopene.
The gene of (2) above is a gene encoding a polypeptide into which a mutation is introduced so as not to lose the enzyme activity of the mutant squalene-hopene cyclase of the present invention. Such mutations include artificial mutations in addition to mutations that occur in nature. Examples of means for causing artificial mutation include site-directed mutagenesis (Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982). The number of mutated amino acids is usually 20 amino acids or less, preferably 10 amino acids or less, more preferably 5 amino acids or less, and most preferably 3 amino acids. Whether the polypeptide into which the mutation has been introduced retains the enzyme activity, for example, a gene encoding the mutation-introduced polypeptide is introduced into E. coli and expressed, and the E. coli or the like closes squalene to form a 5-ring. It can be seen by examining whether sex hoppens can be produced. In particular, according to this example, M181, V128, L136, N424 and V440, which are amino acid positions important for enzyme activity, are identified in the amino acid sequence of squalene-hopene cyclase derived from Alicyclobacillus acidocaldarius. Since it is highly possible that the enzyme activity is lost when a mutation is introduced at the position / site of these amino acids, the mutation is preferably introduced into amino acids other than these amino acids.
Regarding the gene of (3) above, “an activity substantially equivalent to an activity of cyclizing squalene contained in a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 4 to produce a pentacyclic hopene” The degree of activity may be stronger or weaker than the activity of ring-closing squalene having the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 2 to 4 to produce a pentacyclic hopene. For example, 0.1 times, 0.2 times, 0.3 times, 0.4 times, 0.5 times, 0.6 times, 0.7 times, 0.8 times, 0.9 times, 1.0 times, 1.1 times, 1.2 times, 1.5 times, 2.0 times, 2.5 times, 3.0 times, Examples include 4.0 times, 5.0 times, 10 times, 15 times, 20 times, 30 times, 40 times, and 50 times the activity.
The homology can be calculated using BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information) or the like (for example, using default or default parameters).
The gene (5) is a gene obtained by utilizing hybridization between DNAs. “Stringent conditions” in this gene refers to conditions under which only specific hybridization occurs and non-specific hybridization does not occur. Such conditions are usually hybridization at 37 ° C. in a buffer containing 5 × SSC and 1% SDS and washing treatment at 37 ° C. with a buffer containing 1 × SSC and 0.1% SDS. Preferably, conditions such as hybridization at 42 ° C. in a buffer containing 5 × SSC and 1% SDS and washing treatment at 42 ° C. with a buffer containing 0.5 × SSC and 0.1% SDS, more preferably , Hybridization at 65 ° C. in a buffer containing 5 × SSC and 1% SDS, and washing treatment at 65 ° C. with a buffer containing 0.2 × SSC and 0.1% SDS. Whether the DNA obtained by utilizing hybridization encodes an active polypeptide can be determined by, for example, introducing the DNA into Escherichia coli or the like and allowing the Escherichia coli or the like to close squalene to form a 5-cycle. It can be seen by examining whether sex hoppens can be produced. The DNA obtained by hybridization usually has high homology with the gene (4) (any one of SEQ ID NOs: 5 to 7). High homology refers to a homology of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more.
The gene of (6) above has 1 to 50, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20, particularly preferably DNA in the DNA comprising the nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 5 to 7. A gene consisting of DNA having 1 to 10, most preferably 1 to 5 base sequences substituted, deleted, inserted and / or added.
The gene (7) is 90% or more, preferably 93% or more, more preferably 95% or more, most preferably 98% or more of the DNA comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 5 to 7 A gene comprising DNA having homology is included.
（変異型スクアレン−ホペン環化酵素）
本発明の変異型スクアレン−ホペン環化酵素は、（１）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列、（２）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列において、1〜20個、好ましくは1〜15個、より好ましくは1〜10個、最も好ましくは1〜5個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性を有するアミノ酸配列、（３）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性を有するアミノ酸配列を、含む。
なお、ペプチドの変異の導入において、当該ペプチドの基本的な性質（物性、機能、生理活性又は免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸及び芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。
(Mutant squalene-hopene cyclase)
The mutant squalene-hopene cyclase of the present invention is (1) the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 2 to 4, and (2) the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 2 to 4, 1 to 20, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, most preferably 1 to 5 amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added, and SEQ ID NOs: 2 to 4 An amino acid sequence having an activity of ring-closing squalene contained in a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one to generate a pentacyclic hopene; (3) the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 4 Amino acid sequence having 90% or more homology with squalene in the polypeptide consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 4 and having the activity of producing a pentacyclic hopene including.
From the viewpoint of not changing the basic properties (physical properties, functions, physiological activity, immunological activity, etc.) of the peptide in the introduction of peptide mutation, for example, homologous amino acids (polar amino acids, nonpolar amino acids, Mutual substitution between hydrophobic amino acids, hydrophilic amino acids, positively charged amino acids, negatively charged amino acids, aromatic amino acids, etc.) is readily envisioned.
（本発明のスクリーニング方法）
本発明のスクアレン消費酵素のスクリーニング方法は、スクアレン消費酵素の探索を行うため、基質から色素を合成することができる細胞にスクアレン消費酵素遺伝子を導入し発現させて、基質の消費をスクアレン消費酵素と競合する酵素と競合させ、色素合成量の増減を検出することによる、スクアレン消費酵素遺伝子のスクリーニング方法に関する。
さらに、本発明は、スクアレン消費酵素遺伝子ライブラリ（特に、ランダム変異を導入したスクアレン消費酵素遺伝子ライブラリ）を色素合成可能な細胞に導入し、色素合成量の増減を検出することによる、野生型スクアレン消費酵素と比較して活性の高い変異型スクアレン消費酵素遺伝子のスクリーニング方法に関する。
(Screening method of the present invention)
In the screening method for squalene consuming enzyme of the present invention, in order to search for squalene consuming enzyme, a squalene consuming enzyme gene is introduced into a cell capable of synthesizing a pigment from the substrate and expressed, and the consumption of the substrate is determined as squalene consuming enzyme. The present invention relates to a screening method for a squalene-consuming enzyme gene by competing with a competing enzyme and detecting an increase or decrease in the amount of dye synthesis.
Furthermore, the present invention introduces a squalene consuming enzyme gene library (particularly, a squalene consuming enzyme gene library into which random mutations have been introduced) into a cell capable of pigment synthesis, and detects wild type squalene consumption by detecting an increase or decrease in pigment synthesis amount The present invention relates to a screening method for a mutant squalene consuming enzyme gene having a higher activity than that of an enzyme.
（スクアレン消費酵素）
本発明での「スクアレン消費酵素」とは、スクアレンの消費に関与する酵素（複数の酵素群も含む）である。特に、スクアレン消費酵素は、スクアレンを直接又は間接的に色素に転換する作用を有すれば特に限定されない。
例えば、スクアレン−ホペン環化酵素、スクアレン不飽和化酵素、CrtNb（4, 4'-diapolycopene oxidase）、スクアレンエポキシダーゼ、アンブレイン合成酵素、スクアレン水素化酵素及びスクアレン飽和化酵素等を例示することができる。
また、本発明での「スクアレン消費酵素遺伝子」とは、スクアレン消費酵素をコードする遺伝子である。「その変異体」とは、スクアレン消費酵素遺伝子のＤＮＡがその一部のヌクレオチドの置換、欠失、付加などにより変異した遺伝子の概念である。自然界で生じた変異でもよいし、人工的になされた変異でもよい。
変異は、発現酵素の酵素活性、発現量又は安定性が高くなる変異が好ましい。また基質特異性を高めるような変異も好ましい。特に、酵素活性を高める変異が好ましい。
変異体のライブラリを作成し、そのライブラリから、その宿主において酵素活性、発現量又は安定性が高い変異体を本発明の方法により、スクリーニングできる。
本発明における「スクアレンを経由して合成される色素合成可能な細胞へ導入されるスクアレン消費酵素遺伝子」とは、スクアレン消費酵素遺伝子若しくはその変異体を含むと考えられる遺伝子又は遺伝子群である。天然の細胞から抽出した遺伝子、作製したライブラリの遺伝子、化学合成遺伝子、ＰＣＲ増幅遺伝子など由来は問わない。本発明のスクリーニング方法は、発現する酵素の基質消費能を指標とするため、未同定の遺伝子をスクリーニングすることができる。
スクアレン消費酵素遺伝子又はその変異体の、スクアレンを経由して合成される色素合成可能な細胞への導入は、遺伝子組み換え技術で用いられている常法によることができる。例えば、ベクターにスクリーニング対象の遺伝子を組み込み、細胞を形質転換する等である。
(Squalene consuming enzyme)
The “squalene consuming enzyme” in the present invention is an enzyme (including a plurality of enzyme groups) involved in squalene consumption. In particular, the squalene consuming enzyme is not particularly limited as long as it has an effect of directly or indirectly converting squalene into a pigment.
For example, squalene-hopene cyclase, squalene desaturase, CrtNb (4,4'-diapolycopene oxidase), squalene epoxidase, ambrain synthase, squalene hydrogenase, squalene saturase, etc. it can.
The “squalene consuming enzyme gene” in the present invention is a gene encoding squalene consuming enzyme. The “variant thereof” is a concept of a gene in which the DNA of a squalene consuming enzyme gene is mutated by substitution, deletion, addition or the like of a part of its nucleotides. It may be a naturally occurring mutation or an artificially made mutation.
The mutation is preferably a mutation that increases the enzyme activity, expression level or stability of the expressed enzyme. Also preferred are mutations that increase substrate specificity. In particular, mutations that increase enzyme activity are preferred.
A library of mutants is prepared, and mutants having high enzyme activity, expression level or stability in the host can be screened from the library by the method of the present invention.
The “squalene consuming enzyme gene introduced into a cell capable of dye synthesis synthesized via squalene” in the present invention is a gene or a gene group considered to contain a squalene consuming enzyme gene or a variant thereof. It does not matter if it is derived from a gene extracted from a natural cell, a gene from a prepared library, a chemically synthesized gene, a PCR amplified gene or the like. Since the screening method of the present invention uses the substrate consumption ability of the expressed enzyme as an index, an unidentified gene can be screened.
Introduction of a squalene consuming enzyme gene or a mutant thereof into a cell capable of dye synthesis synthesized via squalene can be performed by a conventional method used in gene recombination techniques. For example, a gene to be screened is incorporated into a vector and cells are transformed.
（スクアレン消費酵素と競合する酵素）
本発明での「スクアレン消費酵素と競合する酵素」とは、基質の消費をスクアレン消費酵素と競合する特性を有する。
例えば、下記の表１に記載の酵素を例示することができる。
(Enzyme competing with squalene consuming enzyme)
The “enzyme that competes with a squalene-consuming enzyme” in the present invention has a characteristic of competing for consumption of a substrate with a squalene-consuming enzyme.
For example, the enzymes described in Table 1 below can be exemplified.
（色素合成に関与又は競合する酵素の基質）
本発明での「色素合成に関与又は競合する酵素の基質」とは、スクアレンだけでなく、スクアレンの前駆物質や、スクアレン派生物質であるジアポニューロスポレン、ジアポリコペン等も対象とする。
(Enzyme substrate involved in or competing with dye synthesis)
The “substrate of an enzyme that participates in or competes with dye synthesis” in the present invention includes not only squalene but also a squalene precursor, squalene derivative diaponeurosporene, diapolicopene, and the like.
（本発明のスクリーニング方法での組合せ）
本発明のスクリーニング方法では、下記の表１に記載の組合せを例示することができるが、特に限定されない。
(Combination in the screening method of the present invention)
In the screening method of the present invention, the combinations described in Table 1 below can be exemplified, but not particularly limited.
例えば、色素合成に関与又は競合する酵素の基質がスクアレンであり、スクアレン消費酵素がスクアレン−ホペン環化酵素であり、スクアレン消費酵素と競合する酵素がスクアレン不飽和化酵素の時、スクアレン消費酵素の活性が高い場合にはジアポニューロスポレン（黄色）の合成量が低下し（ホペン（無色）の合成量が増加し）、スクアレン消費酵素の活性が低い場合にはジアポニューロスポレン（黄色）の合成量が上昇する（ホペン（無色）の合成量が低下する）。
例えば、色素合成に関与又は競合する酵素の基質がスクアレンであり、スクアレン消費酵素がスクアレン不飽和化酵素であり、スクアレン消費酵素と競合する酵素がスクアレン−ホペン環化酵素の時、スクアレン消費酵素の活性が高い場合にはジアポニューロスポレン（黄色）の合成量が上昇し（ホペン（無色）の合成量が低下する）、スクアレン消費酵素の活性が低い場合にはジアポニューロスポレン（黄色）の合成量が減少する（ホペン（無色）の合成量が増加する）。
例えば、色素合成に関与又は競合する酵素の基質がスクアレンであり、スクアレン消費酵素がスクアレン−ホペン環化酵素であり、スクアレン消費酵素と競合する酵素がスクアレン不飽和化酵素CrtN及びCrtNb（4, 4'-diapolycopene oxidase）のオペロンの時、スクアレン消費酵素の活性が高い場合には赤色色素であるジアポリコペンジアールの合成量が低下し（ホペンの合成量が増加し）、スクアレン消費酵素の活性が低い場合には赤色色素であるジアポリコペンジアールの合成量が増加する（ホペンの合成量が低下する）。
例えば、色素合成に関与又は競合する酵素の基質がスクアレンであり、スクアレン消費酵素がスクアレンエポキシダーゼであり、スクアレン消費酵素と競合する酵素がスクアレン不飽和化酵素の時、スクアレン消費酵素の活性が高い場合にはジアポニューロスポレン（黄色）の合成量が低下する。
例えば、色素合成に関与又は競合する酵素の基質がスクアレンであり、スクアレン消費酵素がアンブレイン合成酵素であり、スクアレン消費酵素と競合する酵素がスクアレン不飽和化酵素の時、スクアレン消費酵素の活性が高い場合にはジアポニューロスポレン（黄色）の合成量が低下する。
例えば、色素合成に関与又は競合する酵素の基質がスクアレンであり、スクアレン消費酵素がスクアレン水素化酵素（スクアレン飽和化酵素）であり、スクアレン消費酵素と競合する酵素がスクアレン不飽和化酵素の時、スクアレン消費酵素の活性が高い場合にはジアポニューロスポレン（黄色）の合成量が低下する。
For example, when the substrate of an enzyme involved in or competing with dye synthesis is squalene, the squalene consuming enzyme is squalene-hopene cyclase, and the enzyme that competes with the squalene consuming enzyme is a squalene desaturase, the squalene consuming enzyme When the activity is high, the synthesis amount of diaponeurosporene (yellow) decreases (the synthesis amount of hopene (colorless) increases), and when the activity of squalene consuming enzyme is low, diaponeurosporene (yellow) ) Increases (the amount of hopene (colorless) decreases).
For example, when the substrate of an enzyme that participates or competes in dye synthesis is squalene, the squalene-consuming enzyme is squalene desaturase, and the enzyme that competes with squalene-consuming enzyme is squalene-hopene cyclase, When the activity is high, the synthesis amount of diaponeurosporene (yellow) increases (the synthesis amount of hopene (colorless) decreases), and when the activity of squalene-consuming enzyme is low, diaponeurosporene (yellow) ) Decreases (the amount of hopene (colorless) increases).
For example, the substrate of an enzyme involved or competing in dye synthesis is squalene, the squalene-consuming enzyme is squalene-hopene cyclase, and the squalene-consuming enzyme is an enzyme that competes with squalene desaturase CrtN and CrtNb (4, 4 When the activity of the squalene consuming enzyme is high, the synthesis amount of the red pigment diapolicopene dial decreases (the amount of hopene synthesized increases) and the activity of the squalene consuming enzyme Is low, the amount of red pigment diapolicopene dial synthesized increases (the amount of hopene synthesized decreases).
For example, when the substrate of the enzyme involved in or competing with the dye synthesis is squalene, the squalene consuming enzyme is squalene epoxidase, and the enzyme that competes with the squalene consuming enzyme is squalene desaturase, the activity of the squalene consuming enzyme is high. In this case, the synthesis amount of diaponenurosporene (yellow) decreases.
For example, when the substrate of the enzyme involved in or competing with the dye synthesis is squalene, the squalene consuming enzyme is an umbrain synthase, and the enzyme competing with the squalene consuming enzyme is a squalene desaturase, the activity of the squalene consuming enzyme is When it is high, the synthesis amount of diaponeurosporene (yellow) decreases.
For example, when the substrate of the enzyme involved in or competing with the dye synthesis is squalene, the squalene-consuming enzyme is squalene hydrogenase (squalene-saturating enzyme), and the enzyme that competes with the squalene-consuming enzyme is squalene-unsaturating enzyme, When the activity of the squalene consuming enzyme is high, the synthesis amount of diaponeurosporene (yellow) decreases.
（スクアレンを経由して合成される色素合成可能な細胞）
本発明での「スクアレンを経由して合成される色素合成可能な細胞」は、上記の酵素により色素を生合成することができる細胞であれば制限されない。天然の細胞でも、遺伝子組み換えにより形質転換されている細胞でもよい。遺伝子組み換え細胞は、遺伝子組み換えの操作に簡便な細胞である、大腸菌、枯草菌、酵母などが挙げられる。
本発明で用いる好ましい色素合成可能な細胞は、色素合成に関与する酵素遺伝子若しくはその変異体、及び／又は、色素合成に競合する酵素遺伝子若しくはその変異体により形質転換されている細胞である。また、さらにイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（idi）遺伝子により、Idiを細胞に導入し、イソプレノイド経路を強化した細胞が好ましい。
本発明で用いる色素合成可能な細胞は、必要に応じて、ジアポフィトエン合成酵素（CrtM）遺伝子若しくはその変異体、及び／又はデヒドロスクアレン不飽和化酵素（CrtN）遺伝子若しくはその変異体を形質転換された細胞でも良い。その色素合成可能細胞は、C15PPを基質として、ジアポニューロスポレン（黄色）ジアポリコペン(赤色)等を生成し、細胞が黄色や赤色等になる。CrtM遺伝子とCrtN遺伝子又はそれらの変異体は、同一のベクターに組み込まれていてもよいし、別のベクターに組み込まれていてもよい。
また、本発明で用いる色素合成可能な細胞は、必要に応じて、CrtM遺伝子若しくはその変異体、及び／又はCrtN遺伝子若しくはその変異体に加えさらにゲラニル二リン酸合成酵素（GPS）遺伝子又はその変異体により形質転換された細胞でも良い。その色素合成可能な細胞は、C10PPを基質として、ジアポニューロスポレン（黄色）ジアポリコペン(赤色)等を生成し、細胞が黄色や赤色等になる。CrtM遺伝子、CrtN遺伝子及びGPS遺伝子又はそれらの変異体は、同一のベクターに組み込まれていてもよいし、別のベクターに組み込まれていてもよい。
また、本発明で用いる色素合成可能な細胞は、必要に応じて、フィトエン合成酵素（CrtB）遺伝子若しくはその変異体、及び／又はフィトエン脱水素酵素（CrtI）遺伝子若しくはその変異体により形質転換された細胞でも良い。その色素合成可能細胞は、C20PPを基質として、リコペン（赤色）等を生成し、細胞がピンク色等になる。CrtB遺伝子及びCrtI遺伝子又はそれらの変異体は、同一のベクターに組み込まれていてもよいし、別のベクターに組み込まれていてもよい。
また、本発明で用いる色素合成可能な細胞は、必要に応じて、CrtB遺伝子若しくはその変異体、及び／又はCrtI遺伝子若しくはその変異体に加えさらにゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（CrtE）遺伝子又はその変異体により形質転換された細胞でも良い。その色素合成可能細胞は、C20PPを基質として、リコペン（赤色）等を生成し、細胞がピンク色等になる。特にC20PPを合成しない宿主（例えば大腸菌）にはCrtE遺伝子の導入が必要になる。CrtB遺伝子、CrtI遺伝子及びCrtE遺伝子又はそれらの変異体は、同一のベクターに組み込まれていてもよいし、別のベクターに組み込まれていてもよい。
(Dye-synthesizeable cells synthesized via squalene)
The “cell capable of dye synthesis synthesized via squalene” in the present invention is not limited as long as it is a cell capable of biosynthesizing a pigment by the above enzyme. Natural cells or cells transformed by genetic recombination may be used. Examples of the genetically modified cells include Escherichia coli, Bacillus subtilis, and yeast, which are simple cells for genetic engineering.
Preferred pigment-synthesizable cells for use in the present invention are cells that have been transformed with an enzyme gene involved in pigment synthesis or a variant thereof and / or an enzyme gene that competes with pigment synthesis or a variant thereof. Further, cells in which Idi is introduced into cells by an isopentenyl diphosphate isomerase (idi) gene to enhance the isoprenoid pathway are preferred.
The dye-synthesizable cell used in the present invention is transformed with a diapophytoene synthase (CrtM) gene or a variant thereof, and / or a dehydrosqualene desaturase (CrtN) gene or a variant thereof, as necessary. Cell may be used. The pigment-synthesizable cell produces diaponeurosporene (yellow) diapolicopene (red) or the like using C15PP as a substrate, and the cells become yellow or red. The CrtM gene and the CrtN gene or mutants thereof may be incorporated into the same vector or may be incorporated into different vectors.
In addition, if necessary, the cells capable of dye synthesis used in the present invention include a CrtM gene or a variant thereof, and / or a CrtN gene or a variant thereof, and further a geranyl diphosphate synthase (GPS) gene or a variant thereof. It may be a cell transformed by the body. The cells capable of dye synthesis produce diaponeurosporene (yellow) diapolicopene (red) or the like using C10PP as a substrate, and the cells become yellow or red. The CrtM gene, CrtN gene and GPS gene or their variants may be incorporated into the same vector, or may be incorporated into different vectors.
In addition, cells capable of dye synthesis used in the present invention were transformed with a phytoene synthase (CrtB) gene or a variant thereof and / or a phytoene dehydrogenase (CrtI) gene or a variant thereof as necessary. It can be a cell. The pigment-synthesizable cell produces lycopene (red) or the like using C20PP as a substrate, and the cell becomes pink or the like. The CrtB gene and the CrtI gene or variants thereof may be incorporated into the same vector or may be incorporated into different vectors.
In addition, if necessary, the cell capable of dye synthesis used in the present invention is a CrtB gene or a variant thereof, and / or a CrtI gene or a variant thereof, and further a geranylgeranyl diphosphate synthase (CrtE) gene or a variant thereof. It may be a cell transformed by the body. The pigment-synthesizable cell produces lycopene (red) or the like using C20PP as a substrate, and the cell becomes pink or the like. In particular, introduction of the CrtE gene is necessary for hosts that do not synthesize C20PP (for example, E. coli). The CrtB gene, the CrtI gene and the CrtE gene or their mutants may be incorporated into the same vector or into different vectors.
（色素合成量の増加又は低下）
本発明での「色素合成量の増加又は低下」は、細胞における色素生合成の量が増加又は低下し、細胞中の色素量が増加又は減少することである。スクアレン消費酵素とスクアレン消費酵素と競合する酵素が基質の消費を競合することにより、色素合成量が増加又は低下する。すなわち、本発明のスクリーニング方法では、スクアレン消費酵素遺伝子を導入した色素合成可能な細胞における色素合成量を、スクアレン消費酵素遺伝子を導入していない色素合成可能な細胞における色素合成量と比較し、色素合成量が増加又は低下した細胞を選択し、その細胞に導入された該遺伝子をスクアレン消費酵素遺伝子であると決定する。
(Increase or decrease in dye synthesis amount)
In the present invention, “increase or decrease in the amount of dye synthesis” means that the amount of dye biosynthesis in the cell increases or decreases, and the amount of dye in the cell increases or decreases. When the squalene consuming enzyme and an enzyme that competes with the squalene consuming enzyme compete with each other for consumption of the substrate, the amount of dye synthesis increases or decreases. That is, in the screening method of the present invention, the amount of dye synthesis in a cell capable of synthesizing a dye into which a squalene consuming enzyme gene has been introduced is compared with the amount of dye synthesis in a cell capable of synthesizing the dye without introducing a squalene consuming enzyme gene, A cell having an increased or decreased amount of synthesis is selected, and the gene introduced into the cell is determined to be a squalene consuming enzyme gene.
色素合成量の増加若しくは低下を検出する方法、又は色素合成量の増加若しくは低下を測定する方法は、視認により実施できる。また、各種測定機器、マイクロプレートリーダー、分光光度計、測色光度計などの各種測定機器により検出できる。
本発明のスクリーニング方法を用いれば、細胞を破壊することなく、スクアレン消費酵素の活性を検出又は測定することができる。具体的には、視認によるときは、細胞のコロニーをプレート上に作成し、コロニー色を観察する。視認によるものであれば、0.3-1.5 mm、特に0.5-1.0 mm直径のコロニーを形成させ、目視により探索する。
スループットをあげる必要があるときは、低倍率拡大鏡などを用い、より小さなコロニーを密集させる手法を用いることができる。また、画像解析ソフトウエアを用いることによって、コロニー色の強弱を定量化し、コロニーピッカーを用いてスクリーニング全般を半自動化することもできる。
The method for detecting the increase or decrease in the amount of dye synthesis or the method for measuring the increase or decrease in the amount of dye synthesis can be carried out by visual recognition. Moreover, it can detect with various measuring instruments, such as various measuring instruments, a microplate reader, a spectrophotometer, and a colorimetric photometer.
By using the screening method of the present invention, the activity of squalene consuming enzyme can be detected or measured without destroying cells. Specifically, when visual recognition is performed, a colony of cells is created on a plate and the colony color is observed. If it is by visual observation, colonies with a diameter of 0.3-1.5 mm, especially 0.5-1.0 mm, are formed and searched visually.
When it is necessary to increase the throughput, it is possible to use a technique of densely gathering smaller colonies using a low-magnification magnifier or the like. Further, by using image analysis software, the strength of colony color can be quantified, and the entire screening can be semi-automated using a colony picker.
（色素合成可能細胞の製造方法）
色素合成可能細胞は、常法により製造することができる。例えば、各遺伝子を、購入又はＰＣＲなどにより常法により調製し、その遺伝子を宿主に適する発現ベクターに常法により組み込み、目的のベクターを選択し、そのベクターにより宿主細胞を常法により形質転換することにより得られる。
用いる宿主細胞は、制限されないが、培養時間の短縮やクローニングの容易さを考えれば、大腸菌、枯草菌、酵母などが好ましい。特に大腸菌、酵母が好ましく、好適な大腸菌としては、Escherichia coli XL1-Blueのようなクローニング株、HB101やBL21などの発現株に加え、テルペン前駆体の合成量が豊富な遺伝子ノックアウト株、たとえばJW1750 ΔgdhA (glutamate dehydrogenase欠損)、JW0110 ΔaceE(pyruvate dehydrogenase欠損)（Baba,T. et al.; Mol Syst Biol 2, 2006 0008 (2006)）等が挙げられ、好適な酵母としては、標準的な発芽酵母、INVSc1(invitrogen)、YPH499(stratagene)等が挙げられる。
好適なベクターは、特に制限はなく、一般に用いられているベクターでよい。例えば、宿主が大腸菌であるときは、pUC18、pACYC184、などに由来するものが挙げられ、宿主が枯草菌であるときはpUB110、pE194、pC194、pHY300PLK DNAなどが、宿主が酵母であるときは、pRS303、YEp213、TOp2609等が挙げられる。
(Method for producing cells capable of dye synthesis)
A cell capable of dye synthesis can be produced by a conventional method. For example, each gene is purchased or prepared by a conventional method such as PCR, the gene is incorporated into an expression vector suitable for the host by a conventional method, a target vector is selected, and a host cell is transformed by the vector using a conventional method. Can be obtained.
The host cell to be used is not limited, but Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast and the like are preferable in view of shortening of the culture time and ease of cloning. In particular, Escherichia coli and yeast are preferable. Suitable Escherichia coli includes cloning strains such as Escherichia coli XL1-Blue, expression strains such as HB101 and BL21, and gene knockout strains with abundant terpene precursor synthesis, such as JW1750 ΔgdhA. (glutamate dehydrogenase deficiency), JW0110 ΔaceE (pyruvate dehydrogenase deficiency) (Baba, T. et al .; Mol Syst Biol 2, 2006 0008 (2006)) and the like. INVSc1 (invitrogen), YPH499 (stratagene), etc. are mentioned.
A suitable vector is not particularly limited, and a commonly used vector may be used. For example, when the host is E. coli, examples include those derived from pUC18, pACYC184, etc., when the host is Bacillus subtilis, pUB110, pE194, pC194, pHY300PLK DNA, etc., when the host is yeast, pRS303, YEp213, TOp2609 and the like.
（スクアレン消費酵素遺伝子又はその変異体のスクリーニング用キット）
本発明のスクアレン消費酵素遺伝子又はその変異体のスクリーニング用キットは、色素合成可能細胞を含むものであり得る。色素合成可能細胞は、冷凍保存してバイアル内に封入したものが好適である。あるいは、本発明に係るキットは、所望の細胞を色素合成可能細胞に形質転換するための色素合成酵素遺伝子発現ベクターを構成要素として含むものであり得る。
さらに、上記本発明に係るキットは、被検遺伝子用の発現ベクター、クローニング酵素セット、メタゲノムソース、あるいは配列データベースをもとに作製された（候補）遺伝子ライブラリ、マイクロプレート、イソプレノイド経路（テルペン上流経路）の強化された菌株、培地や添加剤などのスクリーニングに有用な物質や器具（画像スキャナや測色光度計、色見本、コロニーピッカー）などをキットの構成要素として加えることができる。
(Screening kit for squalene consuming enzyme gene or its variant)
The kit for screening a squalene consuming enzyme gene or a variant thereof of the present invention may contain a cell capable of dye synthesis. The dye-synthesizable cells are preferably those stored frozen and enclosed in a vial. Alternatively, the kit according to the present invention may contain a pigment synthase gene expression vector for transforming desired cells into pigment-synthesizable cells as a component.
Furthermore, the kit according to the present invention includes a (candidate) gene library, microplate, isoprenoid pathway (terpene upstream pathway) prepared based on an expression vector for a test gene, a cloning enzyme set, a metagenome source, or a sequence database. ) Enhanced strains, substances useful for screening such as media and additives (image scanners, colorimetric photometers, color samples, colony pickers) and the like can be added as components of the kit.
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated, this invention is not limited at all by these Examples.
（ＳＨＣライブラリの作製）
以下の通り、スクアレン消費酵素であるスクアレン・ホペンサイクラーゼ（スクアレン−ホペン環化酵素）の遺伝子全域にｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲを施してランダム変異を導入し、ＳＨＣライブラリ（ｐＪ２１１ −ｐｌａｃ−［ＳＨＣ］ｌｉｂ）を作製した。概要を図１に示す。
(Preparation of SHC library)
As shown below, random mutations were introduced by performing error-prone PCR over the entire gene of squalene consuming squalene hopene cyclase (squalene-hopene cyclase), and the SHC library (pJ211-plac- [SHC] lib). An overview is shown in FIG.
（ランダム変異導入）
（１）テンプレートとしてｐＪ２１１−ｐｌａｃ−ＳＨＣｗｔ（図２）からＰＣＲ増幅したＳＨＣｗｔ（５ｎｇ）、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５−ｕｎｉｔｓ、ＮＥＢ）、プライマー（ｐＪ２１１−ＳＨＣＦ：5'-TTTTGAATTCTCGGGAGGTACATATGGCTGAGCAGTTGGTGGA-3'：配列番号８及びｐＪ２１１−ＳＨＣＲ：5'-TTTTACTAGTTTACCTGCGCTCGATGGCTT-3'：配列番号９）、ＭｎＣｌ２（０、１０又は２０μＭ）、ｄＮＴＰ（各２ｍＭ）、５％ＤＭＳＯ及び超純水（残部）を混合し総量５０μＬとした。
（２）９４℃５秒、続いて（９４℃１５秒−５７℃１５秒−６８℃２分）×２５サイクル、最後に６８℃５分のサイクルでＰＣＲを行い、ＭｎＣｌ２濃度０μＭ、１０μＭ及び２０μＭにおいて得られたＰＣＲ産物をそれぞれプラスミドライブラリ化に用いるインサートとした。
（３）ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、ＰＣＲ産物のシングルバンドの所見より増幅効率を確認した。
その結果、ＰＣＲ増幅収量は、ＭｎＣｌ２が０μＭの場合５μｇ、ＭｎＣｌ２が１０μＭの場合５μｇ、及びＭｎＣｌ２が２０μＭの場合３μｇであり、増幅効率はそれぞれ１０００倍、１０００倍、及び６００倍であったことを確認した。
(Random mutagenesis)
(1) SHC wt (5 ng), Taq DNA polymerase (5-units, NEB), primer (pJ211-SHCF: 5'-TTTTGAATTCTCGGGAGGTACATATGGCTGAGCAGTTGGTGGA-3 ': sequence amplified from pJ211-plac-SHC wt (FIG. 2) as a template No. 8 and pJ211-SHCR: 5′-TTTTACTAGTTTACCTGCGCTCGATGGCTT-3 ′: SEQ ID NO: 9), MnCl 2 (0, 10 or 20 μM), dNTP (each 2 mM), 5% DMSO and ultrapure water (remainder) are mixed to make a total amount 50 μL.
(2) PCR was performed at 94 ° C for 5 seconds, followed by (94 ° C for 15 seconds-57 ° C for 15 seconds-68 ° C for 2 minutes) x 25 cycles, and finally at a cycle of 68 ° C for 5 minutes, and MnCl 2 concentration of 0 µM, 10 µM and Each PCR product obtained at 20 μM was used as an insert for plasmid library preparation.
(3) The PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, and the amplification efficiency was confirmed from the single band findings of the PCR product.
As a result, the PCR amplification yield was 5 μg when MnCl 2 was 0 μM, 5 μg when MnCl 2 was 10 μM, and 3 μg when MnCl 2 was 20 μM, and the amplification efficiencies were 1000, 1000, and 600 times, respectively. I confirmed that.
（プラスミドライブラリ化）
（１）ｐＪ２１１−ｐｌａｃ−ＳＨＣｗｔをテンプレートとしてＱ５ポリメラーゼ（ＮＥＢ）でベクター部分を増幅した。
（２）前記ベクター部分及び前記インサートをＥｃｏＲＩ／Ｓｐｅｌで切断し、ライゲーションした。
（３）ＢＷ２５１１３エレクトロポレーション用コンピテントセルに形質転換し、ライブラリを回収し、ＭｎＣｌ２濃度０μＭ、１０μＭ及び２０μＭ（０μＭライブラリ、１０μＭライブラリ及び２０μＭライブラリ）におけるライブラリサイズを確認した。
結果を表２に示す。
(Plasmid library)
(1) The vector portion was amplified with Q5 polymerase (NEB) using pJ211-plac-SHC wt as a template.
(2) The vector portion and the insert were cut with EcoRI / Spel and ligated.
(3) Transformed into competent cells for BW25113 electroporation, the library was recovered, and the library size was confirmed at MnCl 2 concentrations of 0 μM, 10 μM, and 20 μM (0 μM library, 10 μM library, and 20 μM library).
The results are shown in Table 2.
（ＳＨＣライブラリのスクアレン消費酵素スクリーニングのためのＣｒｔＮの選択）
実施例３のＳＨＣライブラリを使用したスクアレン消費酵素スクリーニングで使用するスクアレンを経由して合成される色素合成に関与する酵素であるＣｒｔＮを選択するため、ｐＵＣ-ｈＳＱＳＣｒｔＮｏｐｔ、大腸菌に最適化していないｐＵＣ−ｈＳＱＳ−ＣｒｔＮ及びＣｒｔＮを合成しないｐＵＣ-ｈＳＱＳを用いて評価した。
(Selection of CrtN for squalene consuming enzyme screening of SHC library)
PUC-hSQSCrtN opt , pUC not optimized for E. coli to select CrtN, an enzyme involved in dye synthesis synthesized via squalene used in the squalene consuming enzyme screening using the SHC library of Example 3 Evaluation was made using pUC-hSQS that does not synthesize hSQS-CrtN and CrtN.
（手順）
（１）大腸菌コドンに最適化されたＣｒｔＮ（ＣｒｔＮｏｐｔ）について、翻訳開始配列を３通りに変え、それぞれ開始効率を高（ＣｒｔＮｏｐｔ １００，０００）・中（ＣｒｔＮｏｐｔ １０，０００）・低（ＣｒｔＮｏｐｔ ５００）に設計し、３種類のｐＵＣ−ｈＳＱＳ−ＣｒｔＮｏｐｔを作製した。
（２）作製したｐＵＣ-ｈＳＱＳＣｒｔＮｏｐｔ、大腸菌に最適化していないｐＵＣ−ｈＳＱＳ−ＣｒｔＮ及びＣｒｔＮを合成しないｐＵＣ-ｈＳＱＳをｐＪ２１１−Φ、ｐＪ２１１−ＳＨＣｗｔ、ｐＪ２１１−ＳＨＣｄｅａｄ、ｐＪ２１１−ＳＨＣＥ４５Ｄ、ｐＪ２１１−ＳＨＣＦ４３７Ｌと共にＸＬ１Ｂに導入し、ニトロセルロース膜上に植菌した。３７℃で４８時間静置培養した後、コロニーの色を観察した。
(procedure)
(1) For CrtN (CrtN opt ) optimized for E. coli codon, the translation initiation sequence was changed in three ways, and the initiation efficiency was high (CrtN opt 100,000 ), medium (CrtN opt 10,000 ), low ( CrtN opt 500 ) and three types of pUC-hSQS-CrtN opt were prepared.
(2) The prepared pUC-hSQSCrtN opt , pUC-hSQS-CrtN not optimized for E. coli, and pUC-hSQS not synthesizing CrtN are pJ211-Φ, pJ211-SHC wt , pJ211-SHC dead , pJ211-SHC E45D , pJ211 -It was introduced into XL1B together with SHC F437L and inoculated on a nitrocellulose membrane. After culturing at 37 ° C. for 48 hours, the color of the colonies was observed.
（結果）
結果を図３に示す。
植菌後３７℃で４４時間静置培養したプレートを観察した結果、ＣｒｔＮの種類によらず、色の濃さはｐＪ２１１−Φ≒ｐＪ２１１−ＳＨＣｄｅａｄ＞ｐＪ２１１−ＳＨＣｗｔ＞ｐＪ２１１−ＳＨＣＥ４５Ｄ＞ｐＪ２１１−ＳＨＣＦ４３７Ｌとなった。
なお、ＳＨＣＥ４５Ｄは野生型よりも低温活性型、ΦはSHCを発現しない型、ＳＨＣｄｅａｄはスクアレン―ホペン環化酵素の活性がない型（D376R）、ＳＨＣＦ４３７ＬはＳＨＣＥ４５Ｄよりもさらに低温活性型を意味する。
よって、ｐＵＣ−ｈＳＱＳ−ＣｒｔＮｏｐｔ １０，０００（図４）、ｐＵＣ−ｈＳＱＳ−ＣｒｔＮｏｐｔ １，０００、ｐＵＣ−ｈＳＱＳ−ＣｒｔＮｏｐｔ ５００及びｐＵＣ−ｈＳＱＳ−ＣｒｔＮの全てについて、ＳＨＣ活性（スクアレン消費活性）のスクリーニングに適していた。
次に、植菌後３７℃で４８時間静置培養したプレートを観察した結果、ＣｒｔＮｏｐｔ ５００では、ｐＪ２１１−ＳＨＣｗｔの方が低温適応型（大腸菌内活性が高いと思われる）として知られるｐＪ２１１−ＳＨＣＥ４５Ｄよりも色素蓄積量の違いが明確であった。すなわち、ＣｒｔＮｏｐｔ ５００株は野生型よりも高い活性を見分けるのに適していることが確認できた。
また、ＣｒｔＮｏｐｔ １０，０００では、ｐＪ２１１−ＳＨＣｗｔ及びｐＪ２１１−ＳＨＣＥ４５Ｄの色素蓄積量は同程度であった。すなわち、ｐＪ２１１−ＳＨＣＥ４５Ｄよりもさらに強い活性の探索に適していることが確認できた。
(result)
The results are shown in FIG.
As a result of observing the plate which was statically cultured at 37 ° C. for 44 hours after inoculation, the color density was pJ211−Φ≈pJ211−SHC dead > pJ211−SHC wt > pJ211−SHC E45D > pJ211 regardless of the type of CrtN. -SHC F437L .
In addition, SHC E45D is a low-temperature active type than the wild type, Φ is a type that does not express SHC, SHC dead is a type without squalene-hopene cyclase activity (D376R), and SHC F437L is a low-temperature active type than SHC E45D Means.
Therefore, all of pUC-hSQS-CrtN opt 10,000 (FIG. 4), pUC-hSQS-CrtN opt 1,000 , pUC-hSQS-CrtN opt 500 and pUC-hSQS-CrtN opt 500 , SHC activity (squalene consumption activity) Suitable for screening.
Next, as a result of observing a plate that was statically cultured at 37 ° C. for 48 hours after inoculation, pJ211-SHC wt is known as a cold-adapted type (it seems to have higher activity in E. coli) in CrtN opt 500. -The difference in the amount of accumulated pigment was clearer than that of SHC E45D . That is, it was confirmed that the CrtN opt 500 strain was suitable for distinguishing higher activity than the wild type.
In addition, with CrtN opt 10,000 , the dye accumulation amounts of pJ211-SHC wt and pJ211-SHC E45D were comparable. That is, it was confirmed that it was suitable for searching for a stronger activity than pJ211-SHC E45D .
（ＳＨＣライブラリのスクアレン消費スクリーニング）
ｐＵＣ−ｈＳＱＳ−ＣｒｔＮｏｐｔ １０，０００を用いて、実施例１で作製したＳＨＣライブラリのＳＨＣ活性について、大腸菌コロニーの色から判断するスクアレン消費スクリーニングを行い、活性が上がったＳＨＣ変異体を探索した。
(Squalene consumption screening of SHC library)
Using pUC-hSQS-CrtN opt 10,000 , the SHC activity of the SHC library prepared in Example 1 was screened for squalene consumption judging from the color of E. coli colonies to search for SHC mutants with increased activity.
（手順）
（１）ｐＵＣ−ｈＳＱＳ−ＣｒｔＮｏｐｔ １０，０００を導入したＸＬ１Ｂｌｕｅのケミカルコンピテントセルに、実施例１で作製したＳＨＣライブラリ（０μＭライブラリ、１０μＭライブラリ及び２０μＭライブラリ）、ｐＪ２１１−ＳＨＣｗｔ又はｐＪ２１１−ＳＨＣｄｅａｄを形質転換し、ＬＢ固体培地｛カルベニシリン及びカナマイシン含有（Ｃａｒｂ．Ｋａｎ．）｝に敷いたＮＣ膜上に植菌した。
（２）プレートを３７℃で３８時間静置培養した後、室温に取り出し、さらに１０時間静置培養し、コロニーの様子を観察した。
（３）ｐＪ２１１−ＳＨＣｗｔよりも特に色が薄いコロニーをピックし、２ ｍＬ ＬＢ 液体培地（Ｃａｒｂ．Ｋａｎ．）を分注した４８穴ディープウェルで一晩培養した後、プラスミドを回収した。
(procedure)
(1) The SHC libraries (0 μM library, 10 μM library, and 20 μM library), pJ211-SHC wt or pJ211-SHC prepared in Example 1 in XL1Blue chemically competent cells into which pUC-hSQS-CrtN opt 10,000 was introduced. dead was transformed and inoculated on an NC membrane spread on LB solid medium {containing carbenicillin and kanamycin (Carb. Kan.)}.
(2) The plate was statically cultured at 37 ° C. for 38 hours, then taken out to room temperature, and further statically cultured for 10 hours, and the state of the colony was observed.
(3) A colony having a lighter color than pJ211-SHC wt was picked and cultured overnight in a 48-well deep well into which 2 mL LB liquid medium (Carb. Kan.) Was dispensed, and then the plasmid was recovered.
（結果）
結果を図５に示す。
各ライブラリ中に、ｐＪ２１１−ＳＨＣｗｔよりも色が薄いコロニーが多く見つかった（図５）。その中でも特に色が薄いコロニーをピックして回収した。詳細を下記表３に示す。ミニプレップ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、ＳＨＣの正しいサイズにバンドが検出されたＳＨＣ変異体は合計２８個であった。
(result)
The results are shown in FIG.
Many colonies that were lighter in color than pJ211-SHC wt were found in each library (FIG. 5). Among them, particularly light-colored colonies were picked and collected. Details are shown in Table 3 below. As a result of miniprep and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, a total of 28 SHC mutants were detected with bands at the correct size of SHC.
（ＳＨＣ変異体のアミノ酸変異マッピング）
実施例３で取得した２８個のＳＨＣ変異体のうち、２４個について配列解析し、公知の方法により、アミノ酸一次配列上へのＳＨＣ変異体のアミノ酸変異マッピングを行った。
(Amino acid mutation mapping of SHC mutant)
Of the 28 SHC mutants obtained in Example 3, 24 were sequence-analyzed, and amino acid mutation mapping of the SHC mutants onto the primary amino acid sequence was performed by a known method.
（ＳＨＣ変異体の生産物解析）
配列解析したＳＨＣ変異体についてｈＳＱＳと共発現して生産物解析を行った。方法は以下の通りである。
（手順）
（１）ＸＬ１ＢｌｕｅをｐＵＣ−ｈＳＱＳ並びにｐＪ２１１−ＳＨＣｗｔ若しくは上記で配列解析したＳＨＣ変異体（ｐＪ２１１−ＳＨＣｍｕｔａｎｔｓ）で共形質転換しコロニーを形成させた。
（２）コロニーをピックしてＬＢ液体培地（Ｃａｒｂ．Ｋａｎ．）培地で３７°Ｃ、１６時間培養した。
（３）培養液を５０ｍＬフラスコに分注したＴＢ（Ｃａｒｂ．Ｋａｎ．）培地１０ｍＬに１／１００量（１００μＬ）植菌し３７°Ｃで４８時間培養した。
（４）各サンプル培養液１０ｍＬを遠心（３７５０ｒｐｍ、４℃、１５分）により集菌し、生理食塩水で洗浄し、ペレットにアセトン１０ｍＬを加えて脂溶性画分を抽出した。
（５）脂溶性画分をｌｍＬヘキサンで抽出し、ＭｇＳＯ４を加え水分を除去した。このうちヘキサン７００μＬを分取し、ＴＦＨ：ＭｅＯＨ＝６：４の溶媒７０μＬに濃縮した。
（６）得られたサンプルのうち５μＬを用いてＨＰＬＣ−ＭＳによる解析を行った。固定相にはＳｈｉｍｐａｃｋカラム（１５０×２ｍｍ）、移動相にはメタノールを用い、流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎとした。検出にはフォトダイオードアレイ検出器及び質量分析器（イオン化：ＡＰＣＩ）を用いた。生産物量はＭＳのＳＩＭモードの４１１．４ｍＺｚのイオンで得られたクロマトグラムのピーク面積から、スクアレン標品を用いて作製した検量線を用いて算出した。
(Product analysis of SHC variants)
SHC mutants subjected to sequence analysis were co-expressed with hSQS for product analysis. The method is as follows.
(procedure)
(1) XL1Blue was cotransformed with pUC-hSQS and pJ211-SHC wt or the SHC mutant sequence analyzed above (pJ211-SHC mutants ) to form colonies.
(2) The colonies were picked and cultured in LB liquid medium (Carb. Kan.) Medium at 37 ° C. for 16 hours.
(3) A 1/100 volume (100 μL) of the culture solution was inoculated into 10 mL of TB (Carb. Kan.) Medium dispensed into a 50 mL flask and cultured at 37 ° C. for 48 hours.
(4) 10 mL of each sample culture solution was collected by centrifugation (3750 rpm, 4 ° C., 15 minutes), washed with physiological saline, and 10 mL of acetone was added to the pellet to extract a fat-soluble fraction.
(5) The fat-soluble fraction was extracted with 1 mL hexane, and water was removed by adding MgSO 4 . Of this, 700 μL of hexane was collected and concentrated to 70 μL of a solvent of TFH: MeOH = 6: 4.
(6) Analysis by HPLC-MS was performed using 5 μL of the obtained sample. A Shimpack column (150 × 2 mm) was used for the stationary phase, methanol was used for the mobile phase, and the flow rate was 0.4 mL / min. For detection, a photodiode array detector and a mass analyzer (ionization: APCI) were used. The amount of product was calculated from the peak area of the chromatogram obtained with 411.4 mZZ ions in the SIM mode of MS, using a calibration curve prepared using a squalene sample.
（結果）
アミノ酸変異マッピングと生産物解析の結果を併せた結果を図７及び表４に示す。
生産物解析の結果を図６に示す。
今回解析したＳＨＣ変異体は、全て細胞あたりのホペン合成量が野生型よりも増えていた。最も高い変異体は２９倍も多くなっていた（図６のサンプルＮｏ．１０−２）。
単独で活性を上げる変異が５個あり、複数の変異体に見られた変異箇所が６個あった（表４のＶ１２８及びＭ１８１はどちらにも当てはまる）。これらを組み合わせることによって、さらに活性の高い変異体が得られる。
(result)
The combined results of amino acid mutation mapping and product analysis are shown in FIG.
The result of product analysis is shown in FIG.
All of the SHC mutants analyzed this time had higher hopene synthesis per cell than the wild type. The highest mutant was 29 times as many (sample No. 10-2 in FIG. 6).
There were 5 mutations that increased activity alone, and 6 mutation sites were found in multiple mutants (V128 and M181 in Table 4 apply to both). By combining these, mutants with higher activity can be obtained.
本発明は、野生型スクアレン−ホペン環化酵素と比較してホペン合成量が高い変異型スクアレン−ホペン環化酵素並びに該酵素のスクリーニング方法を提供することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can provide a mutant squalene-hopene cyclase having a higher hopene synthesis amount than a wild-type squalene-hopene cyclase and a screening method for the enzyme.
Claims (14)
42, 61, 69, 71, 90, 107, 117, 120, 124, 128, 129, 131, 136, 142 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. 145, 153, 157, 159, 171, 181, 187, 195, 203, 207, 208, 211, 214, 219, 236, 251, 255 , 257, 259, 265, 271, 285, 298, 332, 335, 348, 354, 357, 359, 365, 378, 390, 424, 437, 439, 440, 478, 497, 503, 514, 525, 574, 604, and 623 amino acids in at least one site selected from the group consisting of Characterized in that it has a conversion, mutant squalene - Hopen cyclase or a derivative thereof.
The mutant squalene-hopene cyclase according to claim 1, wherein the mutated squalene-hopene cyclase has a higher hopene synthesis amount than the wild-type squalene-hopene cyclase. Its derivatives.
M42V、Ｍ42Ｔ、Ｍ61Ｖ、L69S、E71D、T90M、Ｅ107Ｋ、I117Ｖ、Q120R、Ｅ124Ｇ、F129L、Ｖ128L、Ｖ128Ｍ、R131Q、L136Ｐ、W142R、V145A、Ｍ153L、Ｋ157Ｅ、Ｍ159I、Ｒ171Ｑ、Ｍ181Ｖ、M181R、Ｍ181Ｔ、F187L、Ｙ195Ａ、Ｖ203Ｇ、R207W、Ｒ208Ｈ、Ｋ211Ｒ、K211Ｍ、Ｇ214Ｃ、D219G、F236S、F236L、Ｄ251Ｈ、Ｄ255Ｇ、S257N、G259S、Ｗ265Ｃ、Ａ271Ｖ、Ｋ285Ｅ、Ｄ298Ｅ、Ｒ332Ｃ、Ｋ335Ｒ、P348S、Ｋ354Ｍ、Ｎ357Ｙ、Ｋ359Ｍ、F365L、Ｔ378Ａ、L390S、Ｎ424Ｄ、F437L、Ｅ439Ｇ、Ｖ440L、Ｅ478Ｇ、T497S 、A503Ｖ、P514S、Ｑ525Ｒ、Ａ574Ｔ、Ｄ604Ｇ及びＲ623L。
The amino acid substitution shown at the site of the amino acid sequence number 1 consists of at least one or more selected from the following group, mutant squalene-hopene cyclase or a derivative thereof according to claim 1 or 2;
M42V, M42T, M61V, L69S, E71D, T90M, E107K, I117V, Q120R, E124G, F129L, V128L, V128M, R131Q, L136P, W142R, V145A, M153L, K157E, M159I, R171Q, M181V, M181R, L181T, F187 Y195A, V203G, R207W, R208H, K211R, K211M, G214C, D219G, F236S, F236L, D251H, D255G, S257N, G259S, W265C, A271V, K285E, D298E, R332C, K335R, P348S, K354M, N357Y, 359M, N357Y, 359M T378A, L390S, N424D, F437L, E439G, V440L, E478G, T497S, A503V, P514S, Q525R, A574T, D604G and R623L.
M181V、V128L、L136P、N424D、V440L。
The mutated squalene-hopene cyclase or derivative thereof according to any one of claims 1 to 3, wherein the amino acid substitution comprises one or more selected from the following:
M181V, V128L, L136P, N424D, V440L.
（１）R131Q、M159I、F437L
（２）F129L、F236L、P514S、R623L
（３）G259S、K335R、F437L、Q525R、A574T
（４）V128L
（５）L136P
（６）F236S、A503V、D604G
（７）V145A、E478G
（８）I117V、Q120R、R171Q、D251H
（９）V440L
（１０）M153L、E439G
（１１）E71D、Y195A、D219G、A271V、T378A
（１２）W142R、K211R、K359M
（１３）R208H、S257N、W265C
（１４）M42V、V203G
（１５）M181T、T497S
（１６）M42T、M61V、L69S、K157E、D255G、K285E
（１７）N424D
（１８）T90M、E124G、P348S
（１９）E107K、M181R、K354M、L390S
（２０）G214C、D298E
（２１）M181V
（２２）R207W、K211M
（２３）V128M、F187L、及び、
（２４）R332C、N357Y、F365L。
The mutant squalene-hopene cyclase or a derivative thereof according to any one of claims 1 to 3, wherein the amino acid substitution comprises 1 selected from any of the following (1) to (24):
(1) R131Q, M159I, F437L
(2) F129L, F236L, P514S, R623L
(3) G259S, K335R, F437L, Q525R, A574T
(4) V128L
(5) L136P
(6) F236S, A503V, D604G
(7) V145A, E478G
(8) I117V, Q120R, R171Q, D251H
(9) V440L
(10) M153L, E439G
(11) E71D, Y195A, D219G, A271V, T378A
(12) W142R, K211R, K359M
(13) R208H, S257N, W265C
(14) M42V, V203G
(15) M181T, T497S
(16) M42T, M61V, L69S, K157E, D255G, K285E
(17) N424D
(18) T90M, E124G, P348S
(19) E107K, M181R, K354M, L390S
(20) G214C, D298E
(21) M181V
(22) R207W, K211M
(23) V128M, F187L, and
(24) R332C, N357Y, F365L.
A mutant squalene-hopene cyclase or a derivative thereof, which has amino acid substitutions of R131Q, M159I and F437L in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
（１）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子、
（２）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（３）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（４）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、
（５）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（６）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1〜50個の塩基配列が置換、欠損、挿入及び／又は付加しているDNAからなる遺伝子、及び、
（７）配列番号５〜７のいずれか１に記載の塩基配列からなるDNAと相同性が90%以上のDNAからなる遺伝子。
A mutant squalene-hopene cyclase gene comprising a gene which is any one of the following (1) to (7):
(1) a gene encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 4,
(2) In the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 2 to 4, 1 to 20 amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added, and any one of SEQ ID NOs: 2 to 4 A gene encoding a polypeptide having an activity substantially equivalent to the activity of cyclizing squalene of a polypeptide comprising the described amino acid sequence to produce a pentacyclic hopene,
(3) Squalene possessed by a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 4 having 90% or more homology with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 4 A gene encoding a polypeptide having an activity substantially equivalent to that of producing a pentacyclic hopene by closing
(4) a gene consisting of a DNA comprising the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 5 to 7,
(5) It hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 5 to 7, and any one of SEQ ID NOs: 2 to 4 A gene encoding a polypeptide having an activity substantially equivalent to the activity of ring-closing squalene contained in the polypeptide comprising the amino acid sequence described in to produce a pentacyclic hopene,
(6) a gene comprising a DNA comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 5 to 7, wherein 1 to 50 nucleotide sequences are substituted, deleted, inserted and / or added; and
(7) A gene comprising a DNA having a homology of 90% or more with the DNA comprising the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 5 to 7.
（１）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列、
（２）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性を有するアミノ酸配列、及び、
（３）配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ配列番号２〜４のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するスクアレンを閉環して５環性のホペンを生成する活性を有するアミノ酸配列。
A mutant squalene-hopene cyclase comprising an amino acid sequence of any one of the following (1) to (3):
(1) the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 2 to 4,
(2) In the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 2 to 4, 1 to 20 amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added, and any one of SEQ ID NOs: 2 to 4 An amino acid sequence having an activity to cyclize squalene of a polypeptide having the amino acid sequence described above to generate a pentacyclic hopene; and
(3) Squalene possessed by a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 4 having 90% or more homology with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 4 An amino acid sequence having the activity of closing a ring to produce a pentacyclic hopene.
A screening method for a squalene consuming enzyme and / or a variant thereof, wherein a squalene consuming enzyme gene is introduced into a cell capable of dye synthesis synthesized via squalene, and the increase or decrease in the amount of dye synthesis is used as an indicator.
The screening method according to claim 9, wherein the decrease in the amount of dye synthesis is a decrease in the amount of dye synthesis due to consumption of a substrate of an enzyme involved in or competing with dye synthesis by a squalene consuming enzyme.
The screening method according to claim 9 or 10, wherein the cell is Escherichia coli or yeast.
The screening method according to any one of claims 9 to 11, wherein the cell is a cell transformed with a gene involved in or competing with pigment synthesis synthesized via squalene or a mutant thereof.
The squalene-consuming enzyme is a squalene-hopene cyclase, and the gene involved in pigment synthesis synthesized via squalene is a squalene desaturase (CrtN) gene. A screening method according to 1.
Priority Applications (2)
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| JP2018066299A JP2019170350A (en) | 2018-03-30 | 2018-03-30 | Screening method for squalene consuming enzyme, and squalene-hopene cyclase |
| JP2022082579A JP7426052B2 (en) | 2018-03-30 | 2022-05-19 | Screening method for squalene consuming enzyme and squalene-hopene cyclase |
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Patent Citations (1)
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| WO2016170099A1 (en) * | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Givaudan Sa | Enzymes and applications thereof |
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| CN113755478B (en) * | 2020-06-02 | 2023-05-26 | 东北林业大学 | Method for changing activity or function of 2, 3-oxidation squalene cyclase |
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