JP2019162038A - Plate production method, production device, production program and produced plate - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、プレートの製造方法、製造装置、及び製造プログラム、並びに製造されたプレートに関する。 The present invention relates to a plate manufacturing method, a manufacturing apparatus, a manufacturing program, and a manufactured plate.
近年、分析技術の高感度化により、測定対象を分子数単位で測定することが可能となっており、食品、環境検査、及び医療へ、微量核酸を検出する遺伝子検出技術の産業利用が求められている。 In recent years, with the increased sensitivity of analytical technology, it has become possible to measure the measurement target in units of the number of molecules, and the industrial use of gene detection technology that detects trace amounts of nucleic acids is required for food, environmental testing, and medical care. ing.
例えば、分子生物学研究分野で多く使用されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ)は、その技術特性から、理論上１分子の核酸からでも増幅が可能とされている。
これらの微量の遺伝子検出においては、定量解析を行う場合に、標準試料を用いる必要がある。例えば、特定の塩基配列を有するＤＮＡ断片を限界希釈し、得られた希釈液のリアルタイムＰＣＲの結果から、目的とする分子数を含む希釈液を選別する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
また、特定のコピー数のＤＮＡ断片を細胞に遺伝子組み換え技術により導入し、培養した細胞を単離することにより、目的のコピー数のＤＮＡ断片を含有する標準試料の製造方法が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
For example, the polymerase chain reaction (PCR), which is often used in the field of molecular biology research, can theoretically be amplified from a single molecule of nucleic acid because of its technical characteristics.
In detecting these trace amounts of genes, it is necessary to use a standard sample when performing quantitative analysis. For example, there has been proposed a method of limiting dilution of a DNA fragment having a specific base sequence, and selecting a diluted solution containing the target number of molecules from the result of real-time PCR of the obtained diluted solution (for example, patent document) 1).
In addition, a method for producing a standard sample containing a DNA fragment having a desired copy number has been proposed by introducing a DNA fragment having a specific copy number into a cell by genetic recombination technology and isolating the cultured cell ( For example, see Patent Document 2).
本発明は、目的の塩基配列の数が特定されている核酸を、該目的の塩基配列の数が所定数となるよう、プレート上の所定のウェルに分注することができるプレートの製造方法を提供することを目的とする。 The present invention provides a method for producing a plate capable of dispensing a nucleic acid having a specified number of target base sequences into a predetermined well on the plate such that the number of the target base sequences becomes a predetermined number. The purpose is to provide.
上記課題を解決するための手段としての本発明のプレートの製造方法は、
目的の塩基配列を有する核酸に標識を付与する標識付与工程と、
前記標識が付与された核酸を含有する核酸含有溶液を微小区画に区分する微小区画化工程と、
前記微小区画に区分する前、又は前記微小区画に区分した後に、前記標識を検出する標識検出工程と、
前記標識を検出した結果をもとに、前記微小区画の１区画内に存在する核酸の前記目的の塩基配列の数を特定する塩基配列の数特定工程と、
前記目的の塩基配列の数が特定された核酸を含む前記微小区画をプレートのウェルに配する核酸配置工程と、
を含むことを特徴とする。
The method for producing the plate of the present invention as a means for solving the above problems is as follows.
A labeling step for imparting a label to a nucleic acid having a target base sequence;
A microcompartmentation step of classifying the nucleic acid-containing solution containing the nucleic acid to which the label is attached into microcompartments;
A label detection step of detecting the label before or after dividing into the microcompartments;
Based on the result of detecting the label, the step of specifying the number of base sequences that specifies the number of the target base sequences of the nucleic acid present in one of the microcompartments,
A nucleic acid arranging step of arranging the micro compartment containing a nucleic acid having a specified number of target base sequences in a well of a plate;
It is characterized by including.
本発明によると、目的の塩基配列の数が特定されている核酸を、該目的の塩基配列の数が所定数となるよう、プレート上の所定のウェルに分注することができるプレートの製造方法を提供することができる。 According to the present invention, a method for producing a plate capable of dispensing a nucleic acid in which the number of target base sequences is specified into a predetermined well on the plate so that the number of target base sequences becomes a predetermined number. Can be provided.
従来のＰＣＲ装置を用いた個別の分析では、反応液の組成やＰＣＲ装置の性能の影響により１分子の検出が必ずしも可能とは言えない。そこで、個別の分析法について感度などの検証が求められるようになってきており、この傾向は国際的な市場の拡大を背景により強くなっている。
しかし、１分子あるいは極めて低分子数のＤＮＡの検出を対象とした方法は、いまのところ確立されていない。このような検出方法においては、含まれるＤＮＡの分子数がわかっているサンプル（標準試料）の提供が必要であるが、従来の技術では数分子レベルでの標準試料の供給は困難である。
上記特許文献２に記載の方法には、１分子の核酸の標準試料を作製する方法が記載されている。しかし、上記特許文献２に記載の方法では、２分子以上の核酸の標準試料の作製は難しい。また上記特許文献２に記載の方法では、対象配列を有するＤＮＡ断片を細胞に導入するため、細胞由来の核酸や細胞質などの夾雑物が含有する。細胞由来の夾雑物が含有された標準試料は、非特異的な増幅が起きたりＰＣＲなどの反応において反応効率が低下するなどの問題が生じるため、できるだけ標準試料には、細胞由来の夾雑物が含有されていないことが望ましい。
また、１分子あるいは極めて低分子数のＲＮＡの検出を対象とした方法はいまだ提供されていない。
In individual analysis using a conventional PCR apparatus, it is not always possible to detect one molecule due to the influence of the composition of the reaction solution and the performance of the PCR apparatus. Therefore, verification of sensitivity and the like has been required for individual analysis methods, and this tendency has become stronger against the background of international market expansion.
However, no method has been established so far for the detection of single or very low molecular weight DNA. In such a detection method, it is necessary to provide a sample (standard sample) in which the number of molecules of the contained DNA is known, but it is difficult to supply a standard sample at the level of several molecules with conventional techniques.
The method described in Patent Document 2 describes a method for preparing a standard sample of one molecule of nucleic acid. However, in the method described in Patent Document 2, it is difficult to prepare a standard sample of two or more molecules of nucleic acid. Further, in the method described in Patent Document 2, a DNA fragment having the target sequence is introduced into a cell, and therefore, impurities such as cell-derived nucleic acid and cytoplasm are contained. Standard samples containing cell-derived contaminants have problems such as non-specific amplification and reduced reaction efficiency in reactions such as PCR. Therefore, as much as possible, standard samples contain cell-derived contaminants. It is desirable that it is not contained.
In addition, a method for detecting single molecule or extremely low molecular weight RNA has not yet been provided.
本発明者らは、検討を重ねた結果、遺伝子検査に基づく分析検査等において標準試料として使用可能な、目的の塩基配列の数が既知の核酸が所定のウェルに配置されているプレートの製造方法として、以下の構成のプレートの製造方法が有効であることを見出した。
本発明のプレートの製造方法によれば、目的の塩基配列の数が特定された核酸を、該目的の塩基配列の数が所定数となるよう、プレート上の所定のウェルに分注することができる。これにより、精度の高い標準試料を作製することができる。このような高精度の標準試料を用いることで、ＤＮＡやＲＮＡを対象とした核酸増幅技術を含む遺伝子検査に基づく分析検査の性能評価や精度管理が良好に行える。
As a result of repeated studies, the present inventors have made a method for producing a plate in which a nucleic acid with a known number of target base sequences, which can be used as a standard sample in an analytical test based on a genetic test, is arranged in a predetermined well As a result, the inventors have found that the plate manufacturing method having the following configuration is effective.
According to the plate manufacturing method of the present invention, the nucleic acid having the specified number of target base sequences can be dispensed into a predetermined well on the plate so that the number of the target base sequences becomes a predetermined number. it can. Thereby, a highly accurate standard sample can be produced. By using such a high-accuracy standard sample, it is possible to satisfactorily evaluate the performance of an analytical test based on a genetic test including a nucleic acid amplification technique targeting DNA or RNA and manage the accuracy.
（プレートの製造方法、製造装置、製造プログラム）
本発明のプレートの製造方法は、標識付与工程と、微小区画化工程と、標識検出工程と、塩基配列の数特定工程と、核酸配置工程と、を含む。本発明のプレートの製造方法は、必要に応じて、その他の工程を含むことができる。
本発明のプレートの製造装置は、標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸を用いて、微小区画化手段と、標識検出手段と、塩基配列の数特定手段と、核酸配置手段と、を有する。本発明のプレートの製造装置は、必要に応じて、その他の手段を有することができる。
本発明のプレートの製造プログラムは、核酸を含む微小区画をプレートのウェルに配するプレートの製造方法に用いるプログラムである。
本発明のプレートの製造プログラムは、標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸を含有する核酸含有溶液を微小区画に区分し、微小区画に区分する前、又は微小区画に区分した後に、標識を検出する、処理をコンピュータに実行させる。また本発明のプレートの製造プログラムは、標識を検出した結果をもとに、微小区画の１区画内に存在する核酸の目的の塩基配列の数を特定し、目的の塩基配列の数が特定された核酸を含む微小区画をプレートのウェルに配する、処理をコンピュータに実行させる。
本発明のプレートの製造方法は、本発明のプレートの製造装置を用い、本発明のプレートの製造装置は、本発明のプレートの製造方法を実施することと同義であるので、本発明の製造方法の説明を通じて本発明のプレートの製造装置の詳細についても明らかにする。また、本発明のプレートの製造プログラムは、ハードウェア資源としてのコンピュータ等を用いることにより、本発明のプレートの製造装置として実現させることから、本発明のプレートの製造装置の説明を通じて本発明のプレートの製造プログラムの詳細についても明らかにする。
(Plate manufacturing method, manufacturing equipment, manufacturing program)
The plate production method of the present invention includes a labeling step, a microcompartmentation step, a label detection step, a base sequence number identification step, and a nucleic acid arrangement step. The manufacturing method of the plate of this invention can include another process as needed.
The plate manufacturing apparatus of the present invention uses a nucleic acid having a target base sequence to which a label is attached, a microcompartmenting means, a label detection means, a base sequence number specifying means, and a nucleic acid arrangement means. Have. The plate manufacturing apparatus of the present invention can have other means as required.
The plate manufacturing program of the present invention is a program used in a plate manufacturing method in which microcompartments containing nucleic acids are arranged in wells of a plate.
The program for producing the plate of the present invention divides a nucleic acid-containing solution containing a nucleic acid having a target base sequence to which a label is attached into fine compartments, and before or after dividing into fine compartments, The computer is caused to execute processing. Further, the plate manufacturing program of the present invention specifies the number of target base sequences of nucleic acids present in one section of a micro-partition based on the result of detecting the label, and the number of target base sequences is specified. A microcompartment containing the prepared nucleic acid is placed in the well of the plate and the computer is allowed to execute the process.
The plate manufacturing method of the present invention uses the plate manufacturing device of the present invention, and the plate manufacturing device of the present invention is synonymous with performing the plate manufacturing method of the present invention. The details of the plate manufacturing apparatus of the present invention will also be clarified through the description of the above. In addition, since the plate manufacturing program of the present invention is realized as a plate manufacturing apparatus of the present invention by using a computer or the like as a hardware resource, the plate of the present invention is explained through the description of the plate manufacturing apparatus of the present invention. The details of the manufacturing program are also clarified.
＜標識付与工程＞
標識付与工程とは、目的の塩基配列を有する核酸に標識を付与する工程である。
＜＜目的の塩基配列を有する核酸＞＞
目的の塩基配列とは、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択できるが、例えば、以下のものであると好ましい。
目的の塩基配列は、感染症検査に用いられる塩基配列（ウイルスの保存領域）、自然界に存在しない塩基配列、遺伝子組換えに用いられる塩基配列、動物由来の塩基配列、植物由来の塩基配列などが挙げられる。
核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられる。
尚、本発明においては、目的とする塩基配列そのもの（例えば、１遺伝子であるいわゆる最小単位）を１コピーともいう。さらにこの目的の塩基配列である１コピーを有し、その他の塩基配列も含む、一つにつながれた核酸の一つの単位を１分子ともいう。本発明では、検出する核酸１つ（１分子の核酸）に対して、その核酸の中に含まれている目的の塩基配列は１コピーであるのが好ましい。
<Labeling process>
The label imparting step is a step of imparting a label to the nucleic acid having the target base sequence.
<< Nucleic acid having desired base sequence >>
There is no restriction | limiting in particular with the target base sequence, Although it can select suitably according to the objective, For example, the following are preferable.
Target base sequences include base sequences used for infectious disease tests (virus storage regions), base sequences that do not exist in nature, base sequences used for genetic recombination, base sequences derived from animals, base sequences derived from plants, etc. Can be mentioned.
There is no restriction | limiting in particular as a nucleic acid, According to the objective, it can select suitably, For example, DNA, RNA, etc. are mentioned.
In the present invention, the target base sequence itself (for example, a so-called minimum unit of one gene) is also referred to as one copy. Furthermore, one unit of nucleic acid connected to one another, which has one copy which is the target base sequence and includes other base sequences, is also referred to as one molecule. In the present invention, for one nucleic acid to be detected (one molecule of nucleic acid), the target base sequence contained in the nucleic acid is preferably one copy.
標識を付与するとは、例えば、光学的ラベル、電気的又は磁気的ラベル、あるいは放射線ラベルなどを付与することが挙げられる。光学的ラベルとしては、蛍光ラベルが好ましい。
標識物質が蛍光物質である場合、例えば、蛍光物質としては、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、シアニン、テキサスレッド、ジエチルアミノクマリン、リサミン、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、Ｒ６Ｇ、Ｒ１１０などが挙げられる。
Examples of the application of a label include an optical label, an electrical or magnetic label, or a radiation label. As the optical label, a fluorescent label is preferable.
When the labeling substance is a fluorescent substance, examples of the fluorescent substance include fluorescein, tetramethylrhodamine, cyanine, Texas red, diethylaminocoumarin, lissamine, ROX, TAMRA, R6G, and R110.
核酸に標識を付与する方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。
標識が付されたヌクレオシドを、ＰＣＲ反応で増幅させる方法、ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて転写反応する方法、及びＴｄＴ反応１本鎖ＤＮＡの３’末端に目的のヌクレオチドを付加する方法のいずれかの方法を用いて、核酸に付加することなどが挙げられる。
尚、使用するプライマーは目的の塩基配列に応じて選択することができ、増幅反応条件もプライマーのＴｍ値から決定できる。
標識されたヌクレオチドを付加する数は、標識によって異なるが１００以上が好ましく、５００以上がより好ましく、１，０００以上がさらに好ましい。１００を下回ると検出下限となる可能性がある。
標識が付されたヌクレオチドとしては、例えば、標識が付されたデオキシウリジン三リン酸、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸が挙げられる。
核酸に標識を付与する方法として、例えば、標識されたヌクレオチドと標識されていないヌクレオチドを混合してＰＣＲ増幅したり、ＰＣＲ増幅において、塩基配列におけるチミンを蛍光標識されたウラシルに置換する方法が好ましく挙げられる。
Examples of a method for imparting a label to a nucleic acid include the following methods.
Any one of a method of amplifying a labeled nucleoside by PCR reaction, a method of transcription reaction using RNA Polymerase, and a method of adding a target nucleotide to the 3 ′ end of TdT reaction single-stranded DNA Use and addition to a nucleic acid.
In addition, the primer to be used can be selected according to the target base sequence, and the amplification reaction conditions can also be determined from the Tm value of the primer.
The number of labeled nucleotides to be added varies depending on the label, but is preferably 100 or more, more preferably 500 or more, and even more preferably 1,000 or more. If it is less than 100, there is a possibility that the lower limit of detection is reached.
Examples of labeled nucleotides include labeled deoxyuridine triphosphate, deoxyadenosine triphosphate, deoxyguanosine triphosphate, deoxythymidine triphosphate, and deoxycytidine triphosphate.
As a method for imparting a label to a nucleic acid, for example, a method in which a labeled nucleotide and an unlabeled nucleotide are mixed to perform PCR amplification, or in PCR amplification, a method in which thymine in a base sequence is replaced with fluorescently labeled uracil is preferable. Can be mentioned.
標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸を形成する具体的な態様としては、例えば、以下に記載の場合が挙げられる。
（ｉ）目的の塩基配列を有するＤＮＡに対し、蛍光標識されたデオキシウリジン三リン酸を用いて増幅処理することにより、標識が付与された目的の塩基配列を有するＤＮＡを得る。尚、該増幅処理後に、蛍光標識された鎖を除去するために、Ｕｒａｃｉｌ−Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）処理を行なってもよい。
（ｉｉ）目的の塩基配列を有するＤＮＡに対し、標識が付されたヌクレオチドと、ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅとを用い反応させることにより、ＲＮＡを合成し、標識が付与されたＲＮＡを得る。尚、ＲＮＡ合成処理とともに、鋳型となるＤＮＡを除去するために、ＤＮａｓｅ処理を行なってもよい。
Specific examples of forming a nucleic acid having a target base sequence to which a label is attached include the cases described below.
(I) A DNA having a target base sequence to which a label is imparted is obtained by subjecting the DNA having the target base sequence to amplification treatment using fluorescently labeled deoxyuridine triphosphate. In addition, after the amplification treatment, a uracil-N-glycosylase (UNG) treatment may be performed in order to remove the fluorescently labeled strand.
(Ii) By reacting a DNA having a target base sequence with a labeled nucleotide and RNA Polymerase, RNA is synthesized, and a labeled RNA is obtained. In addition to RNA synthesis treatment, DNase treatment may be performed in order to remove DNA serving as a template.
＜微小区画化工程＞
微小区画化工程とは、標識が付与された核酸を含有する核酸含有溶液を微小区画に区分する工程である。
微小区画に区分するとは、目的の塩基配列を１コピー有する核酸とその核酸に付与される標識との対を１単位としてみたときに、その単位を基準に、標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸を微小区画内に配置することをいう。
本発明では、標識が付与された核酸を含有する核酸含有溶液が上記１単位を基準として微小区画内に配置されるように区分されればよく、微小区画の形態に特に制限はなく、例えば、核酸含有溶液が液体状態で区画化されても、ゲル状態で区画化されてもよい。
好ましい態様としては、核酸含有溶液が液体状態で、例えば、液滴として微小区画化されることが挙げられる。
液滴とは、表面張力によりまとまった液体のかたまりをいう。
本発明の微小区画化する好ましい態様として、プレートのウェルに着弾される１液滴内に、上記１単位を基準とする標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸を配置する態様が挙げられる。
本発明では、目的の塩基配列を１コピー有する核酸とその核酸に付与される標識とからなる１単位が、その１単位を基準として液滴中に配置されるが、より好ましくは、１単位１液滴となるように区分されている態様である。
但し、１液滴に２単位入ってしまった場合を除く趣旨ではない。１液滴に２単位入っている場合でも、核酸に付与されている標識に対して行なった検出結果から、液滴中に目的の塩基配列が２コピー分入っていることを特定すれば、１液滴中に含まれる目的の核酸配列のコピー数を特定することができるからである。
<Micro compartmentalization process>
The microcompartmenting step is a step of dividing a nucleic acid-containing solution containing a labeled nucleic acid into microcompartments.
Dividing into small compartments means that when a pair of a nucleic acid having one copy of the target base sequence and a label attached to the nucleic acid is regarded as one unit, the target base sequence to which the label is attached based on that unit This means that a nucleic acid having the above is arranged in a microcompartment.
In the present invention, the nucleic acid-containing solution containing the labeled nucleic acid may be classified so as to be disposed in the microcompartment based on the above 1 unit, and the form of the microcompartment is not particularly limited. The nucleic acid-containing solution may be compartmentalized in a liquid state or in a gel state.
As a preferred embodiment, the nucleic acid-containing solution is in a liquid state, for example, micropartitioned as droplets.
A droplet refers to a mass of liquid collected by surface tension.
As a preferred mode of micro-compartmentation according to the present invention, there is a mode in which a nucleic acid having a target base sequence to which a label based on one unit is added is placed in one droplet landed on a plate well. .
In the present invention, one unit consisting of a nucleic acid having one copy of the target base sequence and a label attached to the nucleic acid is arranged in the droplet with reference to the one unit. It is the aspect divided so that it might become a droplet.
However, this is not intended to exclude the case where two units are contained in one droplet. Even if two units are contained in one droplet, if it is specified from the detection results performed on the label attached to the nucleic acid that the target base sequence is contained in two copies, 1 This is because the copy number of the target nucleic acid sequence contained in the droplet can be specified.
本発明においては、核酸に標識を付与し、いったん上述した１単位の関係を形成した後は、プレート上の各ウェルに分注するまで、その１単位の数や量が変化するような一切の反応は行わない。つまり、いったん核酸に標識を付与した後は、プレート上の各ウェルに分注するまで、目的の塩基配列に対し増幅反応させたり、核酸に標識となる物質を追加で付与する等の追加の反応処理は行わない。
これにより、目的の塩基配列を１コピー有する核酸に対し、その核酸に付く標識となる物質の数（量）が対応付けられ、標識を検出することにより、その検出された結果から、目的の塩基配列のコピー数を正確に特定することができる。
また、本発明では、標識する物質は、核酸に直接付与しており、細胞を用いて標識を行なっていないため、細胞を含まない態様で液滴化している。したがって、液滴を分注した各ウェルの中には、細胞を構成する成分、例えば、細胞膜、細胞質、その他細胞から分解されたものなどの細胞由来のものは入っていない。これにより、製造されたプレートを使ってそれ以降の反応を行う際、細胞由来の夾雑物が含有されていないため、反応効率の低下等の問題を防止することができる。
In the present invention, once the nucleic acid is labeled and once the above unit relationship is formed, any number or amount of the unit changes until it is dispensed to each well on the plate. There is no reaction. In other words, once the nucleic acid has been labeled, additional reactions such as amplification reaction to the target base sequence or additional labeling substances are added to the nucleic acid until it is dispensed to each well on the plate. No processing is performed.
As a result, the number (amount) of the labeling substance attached to the nucleic acid is associated with the nucleic acid having one copy of the target base sequence, and the target base is detected from the detection result by detecting the label. The copy number of the sequence can be specified accurately.
In the present invention, since the substance to be labeled is directly attached to the nucleic acid and is not labeled using cells, it is formed into droplets in a manner that does not contain cells. Therefore, each well into which the droplet has been dispensed does not contain components that constitute the cell, such as cell membranes, cytoplasm, and other cell-derived components such as those decomposed from the cells. Thereby, when performing subsequent reaction using the manufactured plate, since the contaminant derived from a cell is not contained, problems, such as a fall of reaction efficiency, can be prevented.
微小区画に区分する方法として、以下、液滴に区分する場合を例に説明する。
液滴に区分する方法としては、プレートのウェルに着弾させる１液滴内に、上記１単位を基準とする標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸を配置することができる方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて各種の方法が選択できる。
例えば、液滴を吐出する方法が挙げられる。液滴を吐出する方法としては、例えば、液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）を有する液滴形成装置を用いて液滴を吐出する方法や、フローサイトメーター／セルソーターを用いて液滴を吐出する方法などが挙げられる。
液滴に区分する方法の具体的実施形態については、後述する。
As a method of dividing into fine sections, the case of dividing into droplets will be described below as an example.
As a method of dividing into droplets, any method can be used as long as a nucleic acid having a target base sequence to which a label based on one unit is attached can be placed in one droplet to be landed on a plate well. There is no particular limitation, and various methods can be selected according to the purpose.
For example, a method of discharging droplets can be given. As a method for discharging droplets, for example, a method for discharging droplets using a droplet forming apparatus having a droplet discharge head (inkjet head), or a method for discharging droplets using a flow cytometer / cell sorter. Etc.
A specific embodiment of the method for dividing into droplets will be described later.
＜標識検出工程＞
標識検出工程とは、微小区画に区分する前、又は微小区画に区分した後に、標識を検出する工程である。
微小区画に区分する前、又は微小区画に区分した後に、標識を検出する具体的実施形態については、後述する。
標識を検出する方法としては、例えば、光学的ラベルを光学的に検出する、電気的又は磁気的ラベルを検出する、あるいは放射線ラベルの放射線量を検出等が挙げられる。
中でも、蛍光ラベルを光学的に検出することが、好ましい。
<Label detection process>
A label | marker detection process is a process of detecting a label | marker before dividing into a microcompartment or after dividing into a microcompartment.
A specific embodiment for detecting the label before or after dividing into the minute sections will be described later.
Examples of the method for detecting a label include optical detection of an optical label, detection of an electrical or magnetic label, or detection of a radiation dose of a radiation label.
Among them, it is preferable to detect the fluorescent label optically.
＜塩基配列の数特定工程＞
塩基配列の数特定工程とは、標識を検出した結果をもとに、微小区画の１区画内に存在する核酸の目的の塩基配列の数を特定する工程である。
上述したように、目的の塩基配列を１コピー有する核酸に対し、その核酸に付く標識（具体的には、標識物質、例えば、蛍光物質）の数（量）は対応付けられている。目的の塩基配列を１コピー有する核酸とその核酸に付いている標識物質とが対になり１単位を形成し、その１単位を基準に１区画内に含まれている。したがって、その標識を検出し、その結果（検出量）をもとにすれば、目的の塩基配列のコピー数を正確に特定することができる。例えば、蛍光強度を測定することにより、その蛍光強度の結果をもとに、どのくらいの標識物質が付与されているかが特定でき、さらにはその標識物質が付いている目的の塩基配列のコピー数を特定することができる。
<Step of specifying the number of base sequences>
The step of specifying the number of base sequences is a step of specifying the number of target base sequences of nucleic acids present in one of the microcompartments based on the result of detecting the label.
As described above, the number (amount) of a label (specifically, a labeling substance, for example, a fluorescent substance) attached to the nucleic acid is associated with a nucleic acid having one copy of the target base sequence. A nucleic acid having one copy of the target base sequence and a labeling substance attached to the nucleic acid form a pair to form one unit, which is contained in one section based on the one unit. Therefore, if the label is detected and the result (detection amount) is used, the copy number of the target base sequence can be accurately specified. For example, by measuring the fluorescence intensity, it is possible to specify how much labeling substance has been applied based on the result of the fluorescence intensity, and further to determine the number of copies of the target base sequence to which the labeling substance is attached. Can be identified.
＜核酸配置工程＞
核酸配置工程とは、目的の塩基配列の数が特定された核酸を含む微小区画をプレートのウェルに配する工程である。
上述したように、＜塩基配列の数特定工程＞において、１液滴中に存在する目的の塩基配列のコピー数が特定できる。したがって、プレート上の所望の位置のウェルに、目的の塩基配列の数が所望の数となるよう、液滴を所定の数分注することができる。
ウェルに配される核酸における目的の塩基配列のコピー数としては、一般的に感染症の検量線用途、例えばノロウイルスの通知法では１００から１０７までの領域で検量線が作製されることから、１００コピー以上１０７コピー以下が好ましい。
<Nucleic acid arrangement process>
A nucleic acid arrangement | positioning process is a process of arrange | positioning the microcompartment containing the nucleic acid in which the number of the target base sequences was specified to the well of a plate.
As described above, in the <number specifying step of base sequence>, the number of copies of the target base sequence present in one droplet can be specified. Therefore, a predetermined number of droplets can be dispensed into wells at desired positions on the plate so that the desired number of base sequences is the desired number.
The copy number of the object of the nucleotide sequence in a nucleic acid which is disposed in the well, generally infections of the calibration curve applications, for example in the norovirus notification method from the calibration curve is made in the region of from 10 0 to 10 7 , preferably 10 0 copies more than 10 107 copies or less.
＜プレートの製造方法、製造方法の具体的な実施形態＞
以下、本発明のプレートの製造方法、製造装置の具体的な実施形態について、説明する。
<Plate Manufacturing Method, Specific Embodiment of Manufacturing Method>
Hereinafter, specific embodiments of the plate manufacturing method and the manufacturing apparatus of the present invention will be described.
＜＜（１）液滴吐出後に標識を検出する実施形態＞＞
＜＜＜液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）を有する液滴形成装置を用いて液滴を吐出し、液滴吐出後に標識を検出する方法＞＞＞
液滴吐出後に標識を検出する方法の一例として、液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）を有する液滴形成装置を用いて液滴を吐出し、その後、標識を検出する方法が挙げられる。
これは、液滴を吐出後、プレート上のウェル内に液滴が着弾する前に、標識を検出する方法である。
−液滴形成方法−
標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸の溶液（以下、特定の核酸溶液ともいう）を、液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）を用いて、液滴として吐出する。
吐出とは、標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸の溶液を液滴として飛翔させることをいう。
<< (1) Embodiment in which a marker is detected after droplet discharge >>
<<< Method of discharging a droplet using a droplet forming apparatus having a droplet discharge head (inkjet head) and detecting a label after the droplet discharge >>>
As an example of a method for detecting a label after discharging a droplet, there is a method for discharging a droplet using a droplet forming apparatus having a droplet discharge head (inkjet head) and then detecting the label.
This is a method of detecting the label after the droplet is discharged and before the droplet reaches the well in the plate.
-Droplet formation method-
A solution of a nucleic acid having a target base sequence to which a label is attached (hereinafter also referred to as a specific nucleic acid solution) is ejected as droplets using a droplet ejection head (inkjet head).
“Discharge” means that a solution of a nucleic acid having a target base sequence to which a label is attached is ejected as droplets.
液滴を吐出する方式としては、例えば、オンデマンド方式、コンティニュアス方式などが挙げられる。
オンデマンド方式としては、例えば、液体に圧力を加えることによって液体を吐出する圧力印加方式、加熱による膜沸騰によって液体を吐出するサーマル方式、静電引力によって液滴を引っ張ることによって液滴を形成する静電方式等の既知の複数の方式などが挙げられる。
Examples of the method for ejecting droplets include an on-demand method and a continuous method.
As an on-demand method, for example, a pressure application method in which liquid is discharged by applying pressure to the liquid, a thermal method in which liquid is discharged by film boiling by heating, or a droplet is formed by pulling a droplet by electrostatic attraction A plurality of known methods such as an electrostatic method may be used.
圧力印加方式としては、ピエゾ素子を用いて液体に圧力を加える方式、電磁バルブ等のバルブによって圧力を加える方式などが挙げられる。
液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）の構成例を図１Ａ〜図１Ｃに示す。
図１Ａは、電磁バルブ方式の液滴吐出ヘッドの一例を示す模式図である。電磁バルブ方式の液滴吐出ヘッドは、電動機１３ａ、電磁弁１２、液室１０、特定の核酸溶液１４、及びノズル１１を有する。
電磁バルブ方式の液滴吐出ヘッドとしては、例えば、ＴｅｃｈＥｌａｎ社のディスペンサなどを好適に用いることができる。
また、図１Ｂは、ピエゾ方式の液滴吐出ヘッドの一例を示す模式図である。ピエゾ方式の液滴吐出ヘッドは、圧電素子１３ｂ、液室１０、特定の核酸溶液１４、及びノズル１１を有する。
ピエゾ方式の液滴吐出ヘッドとしては、Ｃｙｔｅｎａ社のシングルセルプリンターなどを好適に用いることができる。
また、より好ましい構成として図１Ｃに示した構成なども挙げられる。図１Ｃは、図１Ｂにおける圧電素子を用いたピエゾ方式の液滴吐出ヘッドの変形例の模式図である。図１Ｃの液滴吐出ヘッドは、圧電素子１３ｃ、液室１０、特定の核酸溶液１４、及びノズル１１を有する。
図１Ｃの液滴吐出ヘッドでは、図示していない制御装置からの圧電素子１３ｃに対して電圧印加することにより、紙面横方向に圧縮応力が加わりメンブレンを紙面上下方向に変形させることができる。
Examples of the pressure application method include a method of applying pressure to the liquid using a piezo element and a method of applying pressure using a valve such as an electromagnetic valve.
A configuration example of a droplet discharge head (inkjet head) is shown in FIGS. 1A to 1C.
FIG. 1A is a schematic diagram illustrating an example of an electromagnetic valve type droplet discharge head. The electromagnetic valve type droplet discharge head includes an electric motor 13 a, an electromagnetic valve 12, a liquid chamber 10, a specific nucleic acid solution 14, and a nozzle 11.
As the electromagnetic valve type liquid droplet ejection head, for example, a dispenser manufactured by TechElan Co., Ltd. can be preferably used.
FIG. 1B is a schematic diagram illustrating an example of a piezoelectric droplet discharge head. The piezoelectric droplet discharge head includes a piezoelectric element 13 b, a liquid chamber 10, a specific nucleic acid solution 14, and a nozzle 11.
As a piezo-type droplet discharge head, a Cytena single cell printer or the like can be suitably used.
A more preferable configuration includes the configuration shown in FIG. 1C. FIG. 1C is a schematic view of a modification of the piezo-type droplet discharge head using the piezoelectric element in FIG. 1B. The liquid droplet ejection head in FIG. 1C includes a piezoelectric element 13 c, a liquid chamber 10, a specific nucleic acid solution 14, and a nozzle 11.
In the droplet discharge head of FIG. 1C, by applying a voltage to the piezoelectric element 13c from a control device (not shown), a compressive stress is applied in the horizontal direction of the paper surface, and the membrane can be deformed in the vertical direction of the paper surface.
本発明において使用することができる液滴吐出ヘッドの液滴形成動作に関して、以下に説明する。
液滴吐出ヘッドは、圧電素子に形成された上下電極に、パルス状の電圧を印加することにより液滴を吐出することができる。図２Ａ〜図２Ｃは、それぞれのタイミングにおける液滴の状態を示す模式図である。図２Ａは、まず、圧電素子１３ｃに電圧を印加することにより、メンブレン１５が急激に変形することによって、液室１０内に保持された特定の核酸溶液とメンブレン１５との間に高い圧力が発生し、この圧力によってノズル部から液滴が外に押し出される。次に、図２Ｂに示すように、圧力が上方に緩和するまでの時間、ノズル部からの液押し出しが続き液滴が成長する。最後に、図２Ｃに示すように、メンブレン１５が元の状態に戻る際に特定の核酸溶液とメンブレン１５との界面近傍の液圧力が低下し、液滴１６が形成される。
The droplet forming operation of the droplet discharge head that can be used in the present invention will be described below.
The droplet discharge head can discharge droplets by applying a pulsed voltage to the upper and lower electrodes formed on the piezoelectric element. 2A to 2C are schematic diagrams showing the state of the liquid droplets at each timing. In FIG. 2A, a high pressure is generated between a specific nucleic acid solution held in the liquid chamber 10 and the membrane 15 by first applying a voltage to the piezoelectric element 13c to rapidly deform the membrane 15. However, the liquid droplet is pushed out from the nozzle portion by this pressure. Next, as shown in FIG. 2B, the liquid is continuously pushed out from the nozzle portion until the pressure is relaxed upward, and a droplet grows. Finally, as shown in FIG. 2C, when the membrane 15 returns to its original state, the liquid pressure near the interface between the specific nucleic acid solution and the membrane 15 decreases, and the droplet 16 is formed.
本発明のプレートの製造方法では、凹部が形成されたプレートを移動可能なステージ上に固定し、ステージの駆動と液滴吐出ヘッドとからの液滴形成を組み合わせることにより、凹部に順次液滴を着弾させる。ここで、ステージの移動としてプレートを移動させる方法を示したが、当然のことながら液滴吐出ヘッドを移動させてもよい。 According to the plate manufacturing method of the present invention, the plate in which the concave portion is formed is fixed on a movable stage, and droplets are sequentially applied to the concave portion by combining the driving of the stage and the droplet formation from the droplet discharge head. Let it land. Here, the method of moving the plate as the movement of the stage has been described, but the droplet discharge head may be moved as a matter of course.
図３は、プレートのウェル内に順次液滴を着弾させるプレートの製造装置の一例を示す概略図である。
図３に示すように、液滴を着弾させるプレートの製造装置２は、液滴形成装置１と、プレート２３と、ステージ２４と、制御装置２５とを有している。
FIG. 3 is a schematic view showing an example of a plate manufacturing apparatus for sequentially landing droplets in the wells of the plate.
As shown in FIG. 3, the plate manufacturing apparatus 2 for landing droplets includes a droplet forming apparatus 1, a plate 23, a stage 24, and a control device 25.
プレートの製造装置２において、プレート２３は、移動可能に構成されたステージ２４上に配置されている。プレート２３には液滴形成装置１の液滴吐出ヘッドから吐出された液滴２２が着滴する複数のウェル２０（凹部）が形成されている。制御装置２５は、ステージ２３を移動させ、液滴形成装置１の液滴吐出ヘッドとそれぞれのウェル２０との相対的な位置関係を制御する。これにより、液滴形成装置１の液滴吐出ヘッドからそれぞれのウェル２０中に順次、蛍光標識された目的の塩基配列を有する核酸（以下、特定の核酸ともいう）２１を含む液滴２２を吐出することができる。 In the plate manufacturing apparatus 2, the plate 23 is disposed on a stage 24 configured to be movable. The plate 23 is formed with a plurality of wells 20 (concave portions) on which droplets 22 ejected from the droplet ejection head of the droplet forming apparatus 1 are deposited. The control device 25 moves the stage 23 and controls the relative positional relationship between the droplet discharge head of the droplet forming device 1 and each well 20. As a result, droplets 22 containing a nucleic acid (hereinafter also referred to as a specific nucleic acid) 21 having a target base sequence fluorescently labeled are sequentially discharged from the droplet discharge head of the droplet forming apparatus 1 into each well 20. can do.
制御装置２５は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、メインメモリ等を含む構成とすることができる。この場合、制御装置２５の各種機能は、ＲＯＭ等に記録されたプログラムがメインメモリに読み出されてＣＰＵにより実行されることによって実現できる。ただし、制御装置２５の一部又は全部は、ハードウェアのみにより実現されてもよい。又、制御装置２５は、物理的に複数の装置等により構成されてもよい。 For example, the control device 25 may include a CPU, a ROM, a RAM, a main memory, and the like. In this case, various functions of the control device 25 can be realized by reading a program recorded in the ROM or the like into the main memory and executing it by the CPU. However, part or all of the control device 25 may be realized only by hardware. Further, the control device 25 may be physically configured by a plurality of devices.
−液滴の吐出後に標識を検出する検出方法：光学的な検出方法−
図４Ａを用いて、液滴の吐出後に標識を検出する方法であって、光学的に標識を検出する方法について、以下説明する。
図４Ａは、液滴形成装置の一例を示す模式図である。図４Ｂは、液滴形成装置の他の一例を示す模式図である。図４Ａに示すように、液滴形成装置１は、液滴形成手段である液滴吐出ヘッド３０と、駆動手段３４と、標識物質の検出手段である光照射手段（光源）３５及び受光手段（受光素子）３６と、制御手段３７とを有する。
駆動手段３４によって液滴吐出ヘッド３０から液滴が吐出され、駆動手段３４からの駆動信号と同期して発光する光Ｌによって飛翔液滴中の蛍光標識が蛍光を発する。その蛍光を受光素子３６が受光し、受光素子３６からの標的物質の検出結果の情報をもとに、飛翔液滴中の目的の塩基配列のコピー数がカウントされる。
図４Ａ及び図４Ｂを用いて、さらに詳しく説明する。
-Detection method for detecting a marker after discharging a droplet: Optical detection method-
With reference to FIG. 4A, a method of detecting a label after discharging a droplet and detecting the label optically will be described below.
FIG. 4A is a schematic diagram illustrating an example of a droplet forming apparatus. FIG. 4B is a schematic diagram illustrating another example of the droplet forming apparatus. As shown in FIG. 4A, the droplet forming apparatus 1 includes a droplet discharge head 30 that is a droplet forming unit, a driving unit 34, a light irradiation unit (light source) 35 that is a detection unit for a labeling substance, and a light receiving unit ( Light receiving element) 36 and a control means 37.
A droplet is ejected from the droplet ejection head 30 by the driving unit 34, and the fluorescent label in the flying droplet emits fluorescence by the light L emitted in synchronization with the drive signal from the driving unit 34. The fluorescence is received by the light receiving element 36, and the number of copies of the target base sequence in the flying droplet is counted based on the information on the detection result of the target substance from the light receiving element 36.
This will be described in more detail with reference to FIGS. 4A and 4B.
図４Ａでは、目的の塩基配列を有する核酸を蛍光ラベルによって付加した後に所定の溶液に分散した液（特定の核酸溶液）を用いている。液体吐出ヘッドから形成した液滴に光源から発せられる特定の波長を有する光を照射し標識物質から発せられる蛍光を受光素子によって検出することによって計数を行う。 In FIG. 4A, a liquid (specific nucleic acid solution) in which a nucleic acid having a target base sequence is added with a fluorescent label and then dispersed in a predetermined solution is used. Counting is performed by irradiating the droplets formed from the liquid discharge head with light having a specific wavelength emitted from a light source and detecting the fluorescence emitted from the labeling substance by the light receiving element.
液体吐出ヘッド３０は、液室１０と、メンブレン３１と、駆動素子１３ｂとを有しており、特定の核酸溶液３２を液滴として吐出することができる。 The liquid discharge head 30 includes a liquid chamber 10, a membrane 31, and a drive element 13b, and can discharge a specific nucleic acid solution 32 as a droplet.
駆動素子１３ｂに駆動手段３４から駆動信号を供給することにより、メンブレン３１を振動させることができる。メンブレン３１の振動により、特定の核酸溶液３２の液滴２２を、ノズル３３から吐出させることができる。 The membrane 31 can be vibrated by supplying a drive signal from the drive means 34 to the drive element 13b. Due to the vibration of the membrane 31, the droplet 22 of the specific nucleic acid solution 32 can be discharged from the nozzle 33.
光源３５は、飛翔中の液滴２２に光Ｌを照射する。 The light source 35 irradiates the flying droplet 22 with light L.
受光素子３６は、飛翔中の液滴２２に蛍光ラベルが付与された目的の塩基配列を有する核酸（特定の核酸）２１が含有されていた場合に、蛍光ラベルが光Ｌを励起光として吸収して発する蛍光Ｌｆを受光する。 The light receiving element 36 absorbs the light L as excitation light when the droplet 22 in flight contains a nucleic acid (specific nucleic acid) 21 having a target base sequence to which a fluorescent label is attached. The fluorescence Lf emitted is received.
制御手段３７は、駆動手段３４及び光源３５を制御する機能を有している。 The control unit 37 has a function of controlling the driving unit 34 and the light source 35.
図４Ｂは、図４Ａの液滴形成装置の他の変形例を示す模式図である。図４Ｂに示すように、液滴形成装置１は、特定の核酸２１から発せられる蛍光Ｌｆ１を受光する受光素子３６−１に加え、特定の核酸２１から発せられる蛍光Ｌｆ２を受光する受光素子３６−２を設けた点が、図４Ａの液滴形成装置１と相違する。 FIG. 4B is a schematic view showing another modification of the droplet forming apparatus of FIG. 4A. As shown in FIG. 4B, the droplet forming apparatus 1 receives the fluorescence Lf 2 emitted from the specific nucleic acid 21 in addition to the light reception element 36-1 that receives the fluorescence Lf 1 emitted from the specific nucleic acid 21. The point 36-2 is different from the droplet forming apparatus 1 of FIG. 4A.
ここで、蛍光Ｌｆ１及びＬｆ２は、特定の核酸２１から四方八方に発せられる蛍光の一部を示している。受光素子３６−１及び３６−２は、特定の核酸２１から異なる方向に発せられる蛍光を受光できる任意の位置に配置することができる。 Here, the fluorescences Lf 1 and Lf 2 indicate a part of the fluorescence emitted from the specific nucleic acid 21 in all directions. The light receiving elements 36-1 and 36-2 can be arranged at arbitrary positions where the fluorescence emitted from the specific nucleic acid 21 in different directions can be received.
制御手段３７のコピー数を計数する手段は、受光素子３６からの情報に基づいて、液滴２２に含有された特定の核酸２１における目的の塩基配列のコピー数（ゼロである場合も含む）を計数する。ここで、受光素子３６からの情報とは、蛍光標識された目的の塩基配列を有する核酸２１に付与されている蛍光物質にもとづく輝度値（光量）である。
コピー数を計数する手段は、例えば、受光素子３６が受光した光量と予め設定された閾値とを比較して、蛍光標識された目的の塩基配列を有する核酸２１のコピー数を特定（計数）することができる。
The means for counting the copy number of the control means 37 is based on the information from the light receiving element 36, and the copy number of the target base sequence in the specific nucleic acid 21 contained in the droplet 22 (including the case where it is zero). Count. Here, the information from the light receiving element 36 is a luminance value (light quantity) based on the fluorescent substance attached to the nucleic acid 21 having the target base sequence that is fluorescently labeled.
For example, the means for counting the number of copies identifies (counts) the number of copies of the nucleic acid 21 having the fluorescently labeled target base sequence by comparing the amount of light received by the light receiving element 36 with a preset threshold value. be able to.
＜＜＜液滴を吐出する方式の別態様＞＞＞
上述した、オンデマンド方式以外の方式で液滴を吐出する方法として、例えば、連続的に液滴を吐出させるコンティニュアス方式による液滴形成方法が挙げられる。
コンティニュアス方式では、液滴を加圧してノズルから押し出す際に圧電素子やヒーターによって定期的なゆらぎを与え、それによって微小な液滴を連続的に作り出すことができる。さらに、飛翔中の液滴の吐出方向を電圧を印加することによって制御することにより、ウェルに着弾させるか、回収部に回収するかを選ぶことも可能である。
このような方式は、セルソーター、又はフローサイトメーターで用いられており、例えば、ソニー株式会社製の装置名：セルソーターＳＨ８００を用いることができる。
尚、セルソーター、又はフローサイトメーターは、液滴吐出前に標識を検出する態様で使用することもできる。よって、その場合の態様については、下記＜＜（２）液滴吐出前に標識を検出する実施形態＞＞の欄で詳しく説明する。
<<< Another aspect of a method for discharging droplets >>>
As a method for ejecting droplets by a method other than the above-described on-demand method, for example, a continuous droplet forming method in which droplets are continuously ejected may be mentioned.
In the continuous method, when liquid droplets are pressurized and pushed out from a nozzle, periodic fluctuations are given by a piezoelectric element or a heater, whereby fine droplets can be continuously produced. Furthermore, by controlling the ejection direction of the droplets in flight by applying a voltage, it is possible to select whether to land on the well or to collect in the recovery unit.
Such a method is used in a cell sorter or a flow cytometer. For example, a device name: Cell Sorter SH800 manufactured by Sony Corporation can be used.
The cell sorter or flow cytometer can also be used in such a manner that the label is detected before droplet discharge. Therefore, the mode in that case will be described in detail in the section << (2) Embodiment in which a marker is detected before droplet discharge >>.
＜＜＜電気的又は磁気的な検出による態様＞＞＞
上述した光学的な検出を、電気的又は磁気的な検出に変えることもできる。電気的又は磁気的に検出する方法としては、図５に示すように、液室１０から特定の核酸溶液を液滴２２としてプレート３９に吐出する液滴吐出ヘッドの直下に、コピー数計数のためのコイル３８がセンサとして設置されている。核酸には特定の磁気ビーズが付加されており、磁気ビーズが付着した核酸がコイル中を通過する際に発生する誘導電流によって、飛翔液滴中の目的の塩基配列の有無を検出することができる。
<<< Embodiment by Electrical or Magnetic Detection >>>
The optical detection described above can also be changed to electrical or magnetic detection. As a method for electrical or magnetic detection, as shown in FIG. 5, a copy of a specific nucleic acid solution from a liquid chamber 10 as a droplet 22 onto a plate 39 is performed immediately below a droplet discharge head for counting the number of copies. The coil 38 is installed as a sensor. Specific magnetic beads are added to the nucleic acid, and the presence or absence of the target base sequence in the flying droplet can be detected by the induced current generated when the nucleic acid to which the magnetic beads are attached passes through the coil. .
＜＜（２）液滴吐出前に標識を検出する実施形態＞＞
＜＜＜フローサイトメーター／セルソーターを用いて、液滴吐出前に標識を検出する方法＞＞＞
液滴を吐出する前に標識を検出する方法としては、図６に示すマイクロ流路４１中を通過してきた特定の核酸２１をカウントする方法が挙げられる。図６はセルソーター装置において用いられている方法であり、例えば、ソニー株式会社製のセルソーターＳＨ８００を用いることができる。図６では、マイクロ流路４１中に光源４４からレーザー光を照射して散乱光や蛍光を、集光レンズ４３を用いて検出器４２により検出することによって目的の塩基配列を有する核酸の有無を識別しながら液滴を形成することが可能である。本方法を用いることによって、マイクロ流路４１中に通過した目的の塩基配列のコピー数を特定することができる。特定の核酸２１が存在する領域、存在しない領域のそれぞれに対応した液滴が吐出されるため、特定の核酸２１が液滴内に配置されている液滴を選択することができ、特定の核酸２１が液滴内に配置されている液滴のみをウェル中に着弾させることができる。これにより、所定のコピー数の目的の塩基配列を有する核酸を、ウェル中に着弾させることができる。
<< (2) Embodiment for Detecting Markers Before Droplet Discharge >>
<<< Method of Detecting Markers Before Droplet Discharge Using a Flow Cytometer / Cell Sorter >>>
Examples of the method for detecting the label before discharging the droplet include a method of counting the specific nucleic acid 21 that has passed through the microchannel 41 shown in FIG. FIG. 6 shows a method used in the cell sorter apparatus. For example, a cell sorter SH800 manufactured by Sony Corporation can be used. In FIG. 6, the presence or absence of a nucleic acid having a target base sequence is detected by irradiating laser light from a light source 44 into a microchannel 41 and detecting scattered light and fluorescence with a detector 42 using a condenser lens 43. It is possible to form droplets while identifying them. By using this method, the copy number of the target base sequence that has passed through the microchannel 41 can be specified. Since the droplet corresponding to each of the region where the specific nucleic acid 21 exists and the region where the specific nucleic acid 21 does not exist is ejected, the droplet in which the specific nucleic acid 21 is arranged in the droplet can be selected. Only droplets 21 can be landed in the well. Thereby, a nucleic acid having a desired base sequence having a predetermined copy number can be landed in a well.
−フローサイトメーター／セルソーターの形態−
フローサイトメーター／セルソーターの形態としては、図７Ａに示すキャピラリー方式のフローセル、図７Ｂに示すシース液方式のフローセル、いずれも用いることができる。
図７Ａ、及び図７Ｂにおいて、符号４１はマイクロ流路を、符号２１は目的の塩基配列を有する核酸（特定の核酸）を、符号４５は光源を、符号４６は分光器・検出器を、符号４７は荷電手段を、符号４８はシース液導入を示す。
荷電手段４７は、水流が液滴に分かれる直前に＋又は−の荷電を加える手段である。これにより、特定の核酸が含まれている液滴を＋又は−に帯電させることができる。例えば、液滴が偏光板の間を落下するとき、帯電されている液滴は＋に荷電した液滴は−極板側に、−に荷電した液滴は＋極板側に、引き寄せられる。これにより、特定の核酸が含まれる液滴をプレートのウェル上に着弾させることができる。一方、帯電されなかった液滴はそのまま落下するため、回収して廃棄することができる。
-Flow cytometer / cell sorter configuration-
As a form of the flow cytometer / cell sorter, either a capillary type flow cell shown in FIG. 7A or a sheath liquid type flow cell shown in FIG. 7B can be used.
7A and 7B, reference numeral 41 denotes a microchannel, reference numeral 21 denotes a nucleic acid (specific nucleic acid) having a target base sequence, reference numeral 45 denotes a light source, reference numeral 46 denotes a spectroscope / detector, and reference numeral 46 denotes a spectroscope / detector. Reference numeral 47 denotes a charging means, and reference numeral 48 denotes sheath liquid introduction.
The charging means 47 is a means for applying a positive or negative charge immediately before the water stream is divided into droplets. Thereby, a droplet containing a specific nucleic acid can be charged to + or −. For example, when a droplet falls between polarizing plates, a charged droplet is attracted to a positively charged droplet and a negatively charged droplet is attracted to a positive electrode side. Thereby, a droplet containing a specific nucleic acid can be landed on the well of the plate. On the other hand, uncharged droplets fall as they are, and can be collected and discarded.
＜＜＜ドロップレットジェネレータを用いて、液滴吐出前に標識を検出する方法＞＞＞
ドロップレットジェネレータを用いて、液滴吐出前に標識を検出することもできる。ドロップレットジェネレータでは、例えば、図８で示すように、液滴吐出前にマイクロ流路内で標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸（特定の核酸）２１を含む液滴５１が形成されている。マイクロ流路内で液滴状態を形成する方法としては、特許第３７４６７６６号の方法等を用いることができる。
図８において、符号２１は特定の核酸を、符号５１は液滴を、符号５２は光源を、符号５３は分光器・検出器を、符号５４は負電極を、符号５５は正電極を、符号５６はオイル導入を示す。
ドロップレットジェネレータでは、特定の核酸が含まれる液滴を含まれていない液滴と区別した後、該液滴を吐出することにより、特定の核酸が含まれる液滴をプレートのウェル上に着弾させることができる。
<<< Method of detecting a marker before droplet discharge using a droplet generator >>>
A droplet generator can also be used to detect the label prior to droplet ejection. In the droplet generator, for example, as shown in FIG. 8, a droplet 51 including a nucleic acid (specific nucleic acid) 21 having a target base sequence to which a label is attached in a microchannel before droplet ejection is formed. ing. As a method for forming a droplet state in the microchannel, the method of Japanese Patent No. 3746766 can be used.
In FIG. 8, reference numeral 21 denotes a specific nucleic acid, reference numeral 51 denotes a droplet, reference numeral 52 denotes a light source, reference numeral 53 denotes a spectroscope / detector, reference numeral 54 denotes a negative electrode, reference numeral 55 denotes a positive electrode, reference numeral Reference numeral 56 denotes oil introduction.
In the droplet generator, a droplet containing a specific nucleic acid is distinguished from a droplet not containing a specific nucleic acid, and then the droplet containing the specific nucleic acid is landed on the well of the plate by discharging the droplet. be able to.
＜プレートの製造プログラム＞
プレートの製造プログラムは、ハードウェア資源としてのコンピュータ等を用いることにより、本発明のプレートの製造装置において、プレートの製造方法を実行させるものである。
プレートの製造プログラムによる処理は、プレートの製造装置を構成する制御部を有するコンピュータを用いて実行することができる。
プレートの製造装置は、例えば、図３で示すように、液滴形成装置１と、プレート２３と、ステージ２４と、制御装置２５とを有する。液滴形成装置１は、図４Ａで示すように、液滴吐出ヘッド３０と、駆動手段３４と、光源３５と、受光素子３６と、制御手段３７とを有する。ここで、プレートの製造装置における制御装置２５は、液滴形成装置１の制御手段３７を兼ねることもできる。
そして、このプレートの製造装置における制御装置２５において、プレートの製造プログラムを実行することができる。
<Plate manufacturing program>
The plate manufacturing program causes a plate manufacturing method to be executed in the plate manufacturing apparatus of the present invention by using a computer or the like as a hardware resource.
The processing by the plate manufacturing program can be executed by using a computer having a control unit constituting the plate manufacturing apparatus.
For example, as shown in FIG. 3, the plate manufacturing apparatus includes a droplet forming device 1, a plate 23, a stage 24, and a control device 25. As shown in FIG. 4A, the droplet forming apparatus 1 includes a droplet discharge head 30, a drive unit 34, a light source 35, a light receiving element 36, and a control unit 37. Here, the control device 25 in the plate manufacturing apparatus can also serve as the control means 37 of the droplet forming apparatus 1.
The plate manufacturing program can be executed by the control device 25 in the plate manufacturing apparatus.
本発明のプレートの製造プログラムの処理手順の一例を示す。図９は、本発明のプレートの製造装置を用いて、液滴吐出ヘッドから吐出された液滴に含まれる特定の核酸のコピー数を特定し、液滴をプレートのウェルに着弾させるまでの、プレートの製造プログラムの処理手順の一例を示すフローチャートである。 An example of the processing procedure of the manufacturing program of the plate of this invention is shown. FIG. 9 shows how to specify the number of copies of a specific nucleic acid contained in a droplet ejected from a droplet ejection head using the plate manufacturing apparatus of the present invention and land the droplet on a well of the plate. It is a flowchart which shows an example of the process sequence of the manufacturing program of a plate.
（製造されたプレート）
上記本発明のプレートの製造方法により、以下のプレートが製造される。
本発明のプレートは、少なくとも１つのウェルを有する。
プレートにおけるウェルには、目的の塩基配列の数が特定された核酸が含まれており、細胞を構成する成分、例えば、細胞膜、細胞質、その他細胞から分解されたものなどの細胞由来のものは入っていない。
プレートは、プレートを認識するための認識手段と、ウェルに含まれている核酸に関する情報を保持する情報保持手段とを有する。
(Manufactured plate)
The following plates are manufactured by the plate manufacturing method of the present invention.
The plate of the present invention has at least one well.
Wells in the plate contain nucleic acids with a specified number of base sequences, and contain cell components such as cell membranes, cytoplasm, and other cell-derived products such as those decomposed from cells. Not.
The plate has a recognition means for recognizing the plate and an information holding means for holding information relating to the nucleic acid contained in the well.
＜ウェル＞
ウェルは、その形状、数、容積、材質、色などについては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
ウェルの形状としては、核酸などを配することができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平底、丸底、Ｕ底、Ｖ底等の凹部、プレート上の区画などが挙げられる。
ウェルの数は、少なくとも１つであり、２以上の複数であることが好ましい。
ウェルの容積としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、一般的な核酸検査装置に用いられる試料量を考慮すると、１０μＬ以上１,０００μＬ以下が好ましい。
ウェルの材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ふっ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレートなどが挙げられる。
<Well>
The shape, number, volume, material, color and the like of the well are not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose.
The shape of the well is not particularly limited as long as nucleic acid or the like can be arranged, and can be appropriately selected according to the purpose. For example, a recess such as a flat bottom, a round bottom, a U bottom, and a V bottom, and a partition on the plate Etc.
The number of wells is at least one and is preferably a plurality of two or more.
The volume of the well is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. For example, considering the amount of sample used in a general nucleic acid test apparatus, it is preferably 10 μL or more and 1,000 μL or less.
The material of the well is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples thereof include polystyrene, polypropylene, polyethylene, fluorine resin, acrylic resin, polycarbonate, polyurethane, polyvinyl chloride, and polyethylene terephthalate. .
＜プレート＞
プレートの材質、形状、大きさ、構造などについて特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
プレートの材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、半導体、セラミックス、金属、ガラス、石英ガラス、プラスチックスなどが挙げられる。これらの中でも、プラスチックスが好ましい。
<Plate>
There is no restriction | limiting in particular about the material of a plate, a shape, a magnitude | size, a structure, etc., It can select suitably according to the objective.
There is no restriction | limiting in particular as a material of a plate, According to the objective, it can select suitably, For example, a semiconductor, ceramics, a metal, glass, quartz glass, plastics etc. are mentioned. Among these, plastics are preferable.
＜認識手段＞
認識手段は、プレートに設けられ、プレートを認識するための手段である。
認識手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メモリ、ＩＣチップ、バーコード、ＱＲコード（登録商標）、Ｒａｄｉｏ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（以下、「ＲＦＩＤ」とも称することがある）、色分け、印刷などが挙げられる。
認識手段を設ける位置及び認識手段の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
<Recognition means>
The recognition means is a means provided on the plate for recognizing the plate.
The recognition means is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. For example, it can be selected as a memory, IC chip, barcode, QR code (registered trademark), Radio Frequency Identifier (hereinafter also referred to as “RFID”). Color coding, printing, etc.
There is no restriction | limiting in particular as the position which provides a recognition means, and the number of recognition means, According to the objective, it can select suitably.
＜情報保持手段＞
情報保持手段は、プレートの測定領域以外の部位に、複数のウェルに収容されている核酸に関する情報を記憶する手段である。なお、プレートの測定領域とは、測定対象物を保持可能なウェル部をいう。
情報保持手段としては、例えば、メモリ、ＩＣチップなどが挙げられる。
プレートの測定領域以外の部位としては、測定する領域以外の部位であれば、プレートの内部であってもプレートの外部であってもよい。
情報保持手段は、プレートから着脱可能に設けられていることが好ましい。情報保持手段の着脱方法としては、プレートと情報保持手段の境界部にミシン目を設けておくことにより、必要に応じてミシン目に沿って情報保持手段を切り離すことができる。これにより、プレートを分析装置に挿入する際には、情報保持手段をプレートから切り離して、切り離した情報保持手段を読み取り装置に入れて、両者を対応付けすることができる。
情報保持手段は、結合部材によりプレートに取り付けられていることが好ましい。これにより、情報保持手段の紛失を防止することができる。結合部材としては、例えば、紐、磁石などが挙げられる。
認識手段に記憶させる情報としては、ウェルに含まれている核酸に関する情報であり、各ウェルにおける、目的の塩基配列のコピー数の情報や、その他、例えば、分析結果（発光強度等）、核酸の種類、測定日時、測定者の氏名などの情報が挙げられる。
<Information holding means>
The information holding means is means for storing information on nucleic acids contained in a plurality of wells in a part other than the measurement region of the plate. In addition, the measurement area | region of a plate means the well part which can hold | maintain a measuring object.
Examples of the information holding means include a memory and an IC chip.
The part other than the measurement area of the plate may be inside the plate or outside the plate as long as it is a part other than the measurement area.
The information holding means is preferably provided so as to be detachable from the plate. As a method for attaching and detaching the information holding means, by providing a perforation at the boundary between the plate and the information holding means, the information holding means can be separated along the perforation as necessary. Thus, when the plate is inserted into the analyzer, the information holding means can be separated from the plate, and the separated information holding means can be put into the reading device so as to be associated with each other.
The information holding means is preferably attached to the plate by a coupling member. Thereby, the loss of the information holding means can be prevented. Examples of the coupling member include a string and a magnet.
Information to be stored in the recognition means is information on the nucleic acid contained in the well, such as information on the number of copies of the target base sequence in each well, and other information such as analysis results (emission intensity, etc.), nucleic acid Information such as type, date and time of measurement, and name of the measurer.
認識手段の読み取りは、目視、プレートを分析装置に装着した際に、装置に内蔵している読み取り機構により行うことができる。また、分析装置の外部にある読み取り装置を用いることもできる。
情報保持手段に記憶されている情報の読み取りは、外部の情報読み取り装置を用いて行うことができ、プレートを分析装置に装着した際に、装置に内蔵している読み取り機構により行うことができる。
Reading of the recognition means can be performed by a visual reading mechanism or a reading mechanism built in the apparatus when the plate is mounted on the analyzer. Also, a reading device outside the analyzer can be used.
Reading of the information stored in the information holding means can be performed using an external information reading device, and can be performed by a reading mechanism built in the device when the plate is mounted on the analyzer.
認識手段と情報保持手段との対応付け方法は、情報保持手段にも認識手段と同じ認識表示を記憶させたり、認識手段が有する認識情報を情報保持手段が記憶することで行われる。 The method of associating the recognition means with the information holding means is performed by storing the same recognition display as the recognition means in the information holding means or by storing the recognition information held by the recognition means.
上述したように、本発明のプレートの製造方法においては、標識する物質は、核酸に直接付与しており、細胞を用いて標識を行なっていない。したがって、液滴を分注した各ウェルの中には、細胞を構成する成分、例えば、細胞膜、細胞質、その他細胞から分解されたものなどの細胞由来のものは入っていない。これにより、製造されたプレートを使ってそれ以降の反応を行う際、細胞由来の夾雑物が含有されていないため、反応効率の低下等の問題を有効に防止することができる。 As described above, in the method for producing a plate of the present invention, the substance to be labeled is directly attached to the nucleic acid and is not labeled using cells. Therefore, each well into which the droplet has been dispensed does not contain components that constitute the cell, such as cell membranes, cytoplasm, and other cell-derived components such as those decomposed from the cells. Thereby, when the subsequent reaction is performed using the manufactured plate, since impurities derived from cells are not contained, problems such as a decrease in reaction efficiency can be effectively prevented.
本発明のプレートの製造方法により得られたプレートは、バイオ関連産業、ライフサイエンス産業、及び医療産業等において幅広く使用され、例えば、装置構成や感染症の検量線作成などの標準プレート等に好適に用いることができる。 The plate obtained by the plate manufacturing method of the present invention is widely used in the bio-related industry, life science industry, medical industry, and the like, and is suitable for, for example, a standard plate for preparing a calibration curve for an apparatus configuration or infectious disease. Can be used.
＜標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸の作製＞
目的の塩基配列を有する核酸（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）としてＣＲＭ ６２０４−ｂ（産業技術総合研究所：配列番号１）に、２μＭのＲｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ、ＰＣＲ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｍｉｘ、Ｈ２Ｏを、下記表１で示す処方で加えた。そして、６５℃、５分間処理し、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１を得た。
ここで、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ：サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製（配列番号３）を用いた。ＰＣＲ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｍｉｘは、Ｒｏｃｈｅ：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製を用いた。
<Preparation of a nucleic acid having a target base sequence to which a label is attached>
In CRM 6204-b (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology: SEQ ID NO: 1) as a nucleic acid having a target base sequence (Template), 2 μM Reverse Primer, PCR Fluorescein Labeling Mix, and H 2 O have the formulations shown in Table 1 below. added. And it processed at 65 degreeC for 5 minute (s), and Solution1 was obtained.
Here, as the Reverse Primer, Thermofisher: manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. (SEQ ID NO: 3) was used. As the PCR Fluorescein Labeling Mix, Roche: manufactured by Roche Diagnostics Co., Ltd. was used.
次いで、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶ Ｂｕｆｆｅｒ、１００ｍＭ ＤＴＴ、ＲｎａｓｅＯＵＴ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを、下記表２で示す処方で加えた。そして、５５℃、３０分間処理後、８０℃、１０分間処理し、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２を得た。
ここで、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ：サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製を用いた。
Next, SuperScript IV, Super Script IV Buffer, 100 mM DTT, and RnaseOUT RNase Inhibitor were added to Solution 1 in the formulation shown in Table 2 below. And after processing for 30 minutes at 55 degreeC, it processed for 80 minutes at 80 degreeC, and Solution2 was obtained.
Here, SuperScript IV: Thermo Fisher: manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. was used.
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２に、Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｗｉｔｈ ＭｇＣｌ２、２μＭのＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ、２μＭのＲｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ、ＰＣＲ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｍｉｘを、下記表３で示す処方で分注し、混合した。
ここで、Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、Ｒｏｃｈｅ：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製を用いた。ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｗｉｔｈ ＭｇＣｌ２は、Ｒｏｃｈｅ：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製を用いた。Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ：サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製（配列番号２）を用いた。Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ：サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製（配列番号３）を用いた。ＰＣＲ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｍｉｘは、Ｒｏｃｈｅ：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製を用いた。
To Solution 2, Taq DNA Polymerase, PCR Buffer with MgCl 2 , 2 μM Forward Primer, 2 μM Reverse Primer, and PCR Fluorescein Labeling Mix were dispensed according to the formulation shown in Table 3 below and mixed.
Here, Roche: Roche Diagnostics Co., Ltd. was used for Taq DNA Polymerase. PCR Buffer with MgCl 2 is, Roche: using the Roche Diagnostics Co., Ltd.. Forward Primer, Thermofisher: manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. (SEQ ID NO: 2) was used. As the Reverse Primer, Thermofisher: manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. (SEQ ID NO: 3) was used. As the PCR Fluorescein Labeling Mix, Roche: manufactured by Roche Diagnostics Co., Ltd. was used.
次いで、サーマルサイクラー（Ｂｉｏ ｒａｄ製 Ｔ１００）を用いて、下記表４で示す条件で蛍光標識核酸を合成した。 Subsequently, the fluorescence labeled nucleic acid was synthesize | combined on the conditions shown in following Table 4 using the thermal cycler (Biorad T100).
次いで得られた蛍光標識核酸を含む溶液の液滴を、セルソーター（Ｓｏｎｙ製ＳＨ８００）を用いて形成した。液滴吐出前に、蛍光標識を検出することにより、蛍光標識核酸に含まれる目的の塩基配列のコピー数を特定した。目的の塩基配列の数が既知の核酸が含まれている液滴をプレート上のウェル内に着弾させた。プレートは、ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６−Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ(Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ：サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製)を用いた。
液滴内における目的の塩基配列の数がわかっているので、プレートの全てのウェルに対し、目的の塩基配列が１０コピーになるよう、液滴を分注した。
これにより、目的の塩基配列の数が既知である核酸をウェルに配したプレートを作製できた。
Next, droplets of a solution containing the obtained fluorescently labeled nucleic acid were formed using a cell sorter (SH800 manufactured by Sony). By detecting the fluorescent label before discharging the droplet, the number of copies of the target base sequence contained in the fluorescently labeled nucleic acid was specified. A droplet containing a nucleic acid with a known number of base sequences was landed in a well on the plate. As the plate, MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (Thermo Fisher: manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) was used.
Since the number of target base sequences in the droplets is known, the droplets were dispensed so that the target base sequences were 10 copies for all wells of the plate.
As a result, a plate was prepared in which nucleic acids having a known number of base sequences were arranged in wells.
本発明の態様は、例えば、以下のとおりである。
＜１＞ 目的の塩基配列を有する核酸に標識を付与する標識付与工程と、
前記標識が付与された核酸を含有する核酸含有溶液を微小区画に区分する微小区画化工程と、
前記微小区画に区分する前、又は前記微小区画に区分した後に、前記標識を検出する標識検出工程と、
前記標識を検出した結果をもとに、前記微小区画の１区画内に存在する核酸の前記目的の塩基配列の数を特定する塩基配列の数特定工程と、
前記目的の塩基配列の数が特定された核酸を含む前記微小区画をプレートのウェルに配する核酸配置工程と、
を含むことを特徴とするプレートの製造方法である。
＜２＞ 前記標識付与工程は、標識が付されたヌクレオシドを、増幅反応、転写反応、及びＴｄＴ反応のうちいずれかの反応を用いて、前記核酸に付加することにより行う、前記＜１＞に記載のプレートの製造方法である。
＜３＞ 前記ヌクレオシドが、ウリジンである、前記＜２＞に記載のプレートの製造方法である。
＜４＞ 目的の塩基配列を有するＤＮＡに対し、前記標識が付されたヌクレオシドと、ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅとを反応させることにより、ＲＮＡを合成し、標識が付与されたＲＮＡを合成する工程をさらに含む、前記＜２＞から＜３＞のいずれかに記載のプレートの製造方法である。
＜５＞ 前記微小区画化工程が、液滴を形成することにより行われる、前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のプレートの製造方法である。
＜６＞ 前記標識の検出が、光学的ラベルの検出、電気的又は磁気的ラベルの検出、及び放射線ラベルの検出のいずれかである、前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のプレートの製造方法である。
＜７＞ 標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸を含有する核酸含有溶液を微小区画に区分する微小区画化手段と、
前記微小区画に区分する前、又は前記微小区画に区分した後に、前記標識を検出する標識検出手段と、
前記標識を検出した結果をもとに、前記微小区画の１区画内に存在する核酸の前記目的の塩基配列の数を特定する塩基配列の数特定手段と、
前記目的の塩基配列の数が特定された核酸を含む前記微小区画をプレートのウェルに配する核酸配置手段と、
を有することを特徴とするプレートの製造装置である。
＜８＞ 核酸を含む微小区画をプレートのウェルに配するプレートの製造方法に用いるプレートの製造プログラムであって、
標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸を含有する核酸含有溶液を微小区画に区分し、
前記微小区画に区分する前、又は前記微小区画に区分した後に、前記標識を検出し、
前記標識を検出した結果をもとに、前記微小区画の１区画内に存在する核酸の前記目的の塩基配列の数を特定し、
前記目的の塩基配列の数が特定された核酸を含む前記微小区画をプレートのウェルに配する、
処理をコンピュータに実行させることを特徴とするプレートの製造プログラムである。
＜９＞ 少なくとも１つのウェルを有するプレートであって、
前記ウェルが、目的の塩基配列の数が特定された核酸を含み、
前記ウェルには、細胞を構成する成分は含まれておらず、
前記プレートは、前記プレートを認識するための認識手段と、前記ウェルに含まれている前記核酸に関する情報を保持する情報保持手段とを有することを特徴とするプレートである。
Aspects of the present invention are as follows, for example.
<1> a label imparting step for imparting a label to a nucleic acid having a target base sequence;
A microcompartmentation step of classifying the nucleic acid-containing solution containing the nucleic acid to which the label is attached into microcompartments;
A label detection step of detecting the label before or after dividing into the microcompartments;
Based on the result of detecting the label, the step of specifying the number of base sequences that specifies the number of the target base sequences of the nucleic acid present in one of the microcompartments,
A nucleic acid arranging step of arranging the micro compartment containing a nucleic acid having a specified number of target base sequences in a well of a plate;
It is a manufacturing method of the plate characterized by including.
<2> The labeling step is performed by adding a labeled nucleoside to the nucleic acid using any one of an amplification reaction, a transcription reaction, and a TdT reaction. It is a manufacturing method of the described plate.
<3> The method for producing a plate according to <2>, wherein the nucleoside is uridine.
<4> A step of synthesizing RNA by reacting the labeled nucleoside with RNA Polymerase with respect to DNA having the target base sequence, and further synthesizing the labeled RNA. The method for producing a plate according to any one of <2> to <3>.
<5> The plate manufacturing method according to any one of <1> to <4>, wherein the micro-compartmenting step is performed by forming droplets.
<6> The plate according to any one of <1> to <5>, wherein the detection of the label is any one of detection of an optical label, detection of an electrical or magnetic label, and detection of a radiation label. It is a manufacturing method.
<7> A micro-compartmenting means for classifying a nucleic acid-containing solution containing a nucleic acid having a target base sequence to which a label is attached into micro-compartments;
Label detection means for detecting the label before or after dividing into the micro-compartments;
Based on the result of detecting the label, a means for specifying the number of base sequences for specifying the number of the target base sequences of the nucleic acid present in one section of the microsection;
Nucleic acid arrangement means for arranging the micro-compartments containing nucleic acids having a specified number of base sequences in a well of a plate;
It is a plate manufacturing apparatus characterized by having.
<8> A program for producing a plate used in a method for producing a plate in which a micro compartment containing a nucleic acid is arranged in a well of the plate,
Dividing a nucleic acid-containing solution containing a nucleic acid having a target base sequence to which a label is attached into fine compartments;
Detecting the label before or after dividing into the micro compartments;
Based on the result of detecting the label, specify the number of the target base sequence of the nucleic acid present in one section of the microcompartment,
Placing the microcompartment containing a nucleic acid with a specified number of base sequences in a well of a plate;
A plate manufacturing program that causes a computer to execute processing.
<9> A plate having at least one well,
The well contains a nucleic acid in which the number of target base sequences is specified;
The well does not contain components that constitute cells,
The plate is characterized by having a recognition means for recognizing the plate and an information holding means for holding information on the nucleic acid contained in the well.
前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のプレートの製造方法、前記＜７＞に記載のプレートの製造装置、前記＜８＞に記載のプレートの製造プログラム、及び前記＜９＞に記載のプレートによると、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。 The plate production method according to any one of <1> to <6>, the plate production apparatus according to <7>, the plate production program according to <8>, and the <9>. According to this plate, the above-mentioned problems can be solved and the object of the present invention can be achieved.
１ 液滴形成装置
２ プレートの製造装置
２３ プレート
２４ ステージ
２５ 制御装置
３０ 液滴吐出ヘッド
３４ 駆動手段
３５ 光源
３６ 受光素子
３７ 制御手段
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Droplet formation apparatus 2 Plate manufacturing apparatus 23 Plate 24 Stage 25 Control apparatus 30 Droplet discharge head 34 Drive means 35 Light source 36 Light receiving element 37 Control means
Claims (9)
前記標識が付与された核酸を含有する核酸含有溶液を微小区画に区分する微小区画化工程と、
前記微小区画に区分する前、又は前記微小区画に区分した後に、前記標識を検出する標識検出工程と、
前記標識を検出した結果をもとに、前記微小区画の１区画内に存在する核酸の前記目的の塩基配列の数を特定する塩基配列の数特定工程と、
前記目的の塩基配列の数が特定された核酸を含む前記微小区画をプレートのウェルに配する核酸配置工程と、
を含むことを特徴とするプレートの製造方法。 A labeling step for imparting a label to a nucleic acid having a target base sequence;
A microcompartmentation step of classifying the nucleic acid-containing solution containing the nucleic acid to which the label is attached into microcompartments;
A label detection step of detecting the label before or after dividing into the microcompartments;
Based on the result of detecting the label, the step of specifying the number of base sequences that specifies the number of the target base sequences of the nucleic acid present in one of the microcompartments,
A nucleic acid arranging step of arranging the micro compartment containing a nucleic acid having a specified number of target base sequences in a well of a plate;
The manufacturing method of the plate characterized by including.
前記微小区画に区分する前、又は前記微小区画に区分した後に、前記標識を検出する標識検出手段と、
前記標識を検出した結果をもとに、前記微小区画の１区画内に存在する核酸の前記目的の塩基配列の数を特定する塩基配列の数特定手段と、
前記目的の塩基配列の数が特定された核酸を含む前記微小区画をプレートのウェルに配する核酸配置手段と、
を有することを特徴とするプレートの製造装置。 A microcompartmenting means for classifying a nucleic acid-containing solution containing a nucleic acid having a target base sequence to which a label is attached into microcompartments;
Label detection means for detecting the label before or after dividing into the micro-compartments;
Based on the result of detecting the label, a means for specifying the number of base sequences for specifying the number of the target base sequences of the nucleic acid present in one section of the microsection;
Nucleic acid arrangement means for arranging the micro-compartments containing nucleic acids having a specified number of base sequences in a well of a plate;
An apparatus for manufacturing a plate, comprising:
標識が付与された目的の塩基配列を有する核酸を含有する核酸含有溶液を微小区画に区分し、
前記微小区画に区分する前、又は前記微小区画に区分した後に、前記標識を検出し、
前記標識を検出した結果をもとに、前記微小区画の１区画内に存在する核酸の前記目的の塩基配列の数を特定し、
前記目的の塩基配列の数が特定された核酸を含む前記微小区画をプレートのウェルに配する、
処理をコンピュータに実行させることを特徴とするプレートの製造プログラム。 A program for producing a plate for use in a method for producing a plate in which a micro compartment containing a nucleic acid is arranged in a well of the plate,
Dividing a nucleic acid-containing solution containing a nucleic acid having a target base sequence to which a label is attached into fine compartments;
Detecting the label before or after dividing into the micro compartments;
Based on the result of detecting the label, specify the number of the target base sequence of the nucleic acid present in one section of the microcompartment,
Placing the microcompartment containing a nucleic acid with a specified number of base sequences in a well of a plate;
A plate manufacturing program for causing a computer to execute processing.
前記ウェルが、目的の塩基配列の数が特定された核酸を含み、
前記ウェルには、細胞を構成する成分は含まれておらず、
前記プレートは、前記プレートを認識するための認識手段と、前記ウェルに含まれている前記核酸に関する情報を保持する情報保持手段とを有することを特徴とするプレート。 A plate having at least one well,
The well contains a nucleic acid in which the number of target base sequences is specified;
The well does not contain components that constitute cells,
The plate has a recognition means for recognizing the plate and an information holding means for holding information on the nucleic acid contained in the well.
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