JP2019152535A - MEASUREMENT METHOD FOR SPECIFICALLY DETECTING PROPANOYL-MODIFIED SITES IN AMYLOID-β PROTEIN - Google Patents
MEASUREMENT METHOD FOR SPECIFICALLY DETECTING PROPANOYL-MODIFIED SITES IN AMYLOID-β PROTEIN Download PDFInfo
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Abstract
Description
本明細書は、アミロイドβタンパク質のプロパノイル修飾部位特異的測定法に関する。 The present specification relates to a method for site-specific measurement of propanoyl modification of amyloid β protein.
アルツハイマー型認知症（以下、ＡＤともいう。）は、認知症のなかでも最も多くを占め、４０〜６０％にものぼることが試算されている。ＡＤの認知機能障害としては近時記憶障害が特徴的であるほか、妄想、うつ症状等の多彩な精神症状が認められ、病初期から認知機能障害や精神症状以外の局所神経症を認めることはまれとされている。ＡＤの病理学的特徴としては、大脳全般性萎縮と大脳皮質神経細胞の減少、老人斑の多発、神経細胞内における神経原繊維変化などが報告されているが、とりわけＡＤにおいては老人斑の形成が特徴付けられている。 Alzheimer-type dementia (hereinafter also referred to as AD) accounts for the largest proportion of dementia, and is estimated to be as high as 40 to 60%. As a cognitive dysfunction of AD, recent memory impairment is characteristic, and various psychiatric symptoms such as delusions and depressive symptoms are recognized, and cognitive dysfunction and local neuropathy other than psychiatric symptoms are recognized from the early stage of the disease. It is rare. The pathological features of AD include general cerebral atrophy and a decrease in cerebral cortical neurons, frequent senile plaques, neurofibrillary tangles in nerve cells, etc. Especially in AD, senile plaque formation Has been characterized.
老人斑を構成する主タンパク質としては、アミロイドβタンパク質（Ａβ）が同定されている。そのため、ＡＤ発症に関わる原因分子の一つと考えられている。Ａβとしては、アミノ酸残基が３８〜４３を有する様々な分子種が産生されている。これらＡβは、そもそも水溶液に可溶性であるものの、ＡＤ患者脳では高度に凝集したかたちで老人斑を形成している。こうした知見により、ＡβをＡＤ発症機序の初発因子とするアミロイド仮説では、この凝集体が、そして近年においては凝集・沈着する前の中間分子Ａβオリゴマーが神経細胞障害を引き起こしているのではないかと考えられている。 An amyloid β protein (Aβ) has been identified as the main protein constituting senile plaques. Therefore, it is considered as one of the causative molecules involved in the onset of AD. As Aβ, various molecular species having amino acid residues of 38 to 43 have been produced. Although these Aβ are originally soluble in an aqueous solution, they form senile plaques in a highly aggregated form in the AD patient's brain. Based on these findings, according to the amyloid hypothesis that Aβ is the initial factor of AD pathogenesis, this aggregate, and in recent years, the intermediate molecule Aβ oligomer before aggregation and deposition may cause neuronal damage. It is considered.
これまで、ヒト脳内でＡβ中のリジン残基がω−３系の多価不飽和脂肪酸の過酸化体によってプロパノイル（以下、ＰＲＬともいう。）化されることを見出されている（特許文献１）。さらにこのＰＲＬ化されたＡβは、ＰＲＬ修飾前のＡβよりもその凝集性や神経細胞に対する毒性が亢進されることも報告されている（非特許文献１）。 So far, it has been found that lysine residues in Aβ are converted to propanoyl (hereinafter also referred to as PRL) by a peroxidant of ω-3 polyunsaturated fatty acid in the human brain (patent). Reference 1). Further, it has been reported that this PRL-modified Aβ has enhanced aggregation property and toxicity to nerve cells than Aβ before PRL modification (Non-patent Document 1).
Ａβはリジン残基を二つ有するところ、ＡβのＰＲＬ化は、非酵素的な反応によるものと考えられており、一般的には、これらは均等にドコサヘキサエン酸などのω−３系多価不飽和脂肪酸の過酸化物によってＰＲＬ化されるものと推測される。したがって、ＰＲＬ化Ａβにおける２つのリジン残基がいずれも修飾されているのか、あるいはいずれか一方のみが修飾されているのかというＰＲＬ化部位については今までのところ全く検討されていない。 Since Aβ has two lysine residues, it is considered that PRL formation of Aβ is due to a non-enzymatic reaction. In general, these are equally divided into ω-3 polyvalent impurities such as docosahexaenoic acid. It is presumed that PRL is formed by a saturated fatty acid peroxide. Therefore, so far, no investigation has been made on the PRL-ized site as to whether two lysine residues in PRL-modified Aβ are both modified or only one of them is modified.
本明細書は、ＰＲＬ化アミロイドβを、ＰＲＬ化部位特異的に検出し、ひいては定量する方法を提供する。 The present specification provides a method for detecting and thus quantifying PRL-modified amyloid β in a PRL-ized site-specific manner.
本発明者らは、Ａβ中の二つのリジン残基におけるＰＲＬ化に着目し、ＰＲＬ化部位特異的にＡβを検出することに着目し、種々の検討を行い、二つのリジン残基のうち一方のリジン残基（Ａβ ４２の１６位リジン）がＰＲＬ化されたＡβ（１６ＰＲＬ化Ａβ）に特異的に結合するモノクローナル抗体と他方のリジン残基（Ａβ４２の２８位リジン）がＰＲＬ化されたＡβ（２８ＰＲＬ化Ａβ）に特異的に結合するモノクローナル抗体を取得した。さらに、ＡＤ及び非ＡＤのヒトから採取した髄液について、これらのモノクローナル抗体を用いて１６ＰＲＬ化Ａβと２８ＰＲＬ化Ａβとをそれぞれ検出し定量できることを見出した。本明細書は、これらの知見に基づき以下の手段を提供する。 The present inventors paid attention to the PRL formation at two lysine residues in Aβ, focused on detecting Aβ specifically at the PRL-ized site, conducted various studies, and one of the two lysine residues. A monoclonal antibody that specifically binds to Aβ (16PRL-modified Aβ) in which the lysine residue (position 16 of Aβ42) is PRLed and Aβ in which the other lysine residue (position 28 lysine of Aβ42) is PRLized A monoclonal antibody that specifically binds to (28PRLylated Aβ) was obtained. Further, it was found that cerebrospinal fluid collected from AD and non-AD humans can detect and quantify 16PRL Aβ and 28PRL Aβ, respectively, using these monoclonal antibodies. The present specification provides the following means based on these findings.
（１）プロパノイル化されたアミロイドβの検出方法であって、
アミロイドβ４２の１６位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第１のプロパノイル化アミロイドβと、アミロイドβ４２の２８位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第２のプロパノイル化アミロイドβとのいずれか又は双方を、独立して検出する工程、を備える、方法。
（２）前記第１のプロパノイル化アミロイドβは、１６位リジンがプロパノイル化されたアミロイドβ４２である、である、（１）に記載の方法。
（３）前記第２のプロパノイル化アミロイドβは、２８位リジンがプロパノイル化されたアミロイドβ４２である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記第１のプロパノイル化アミロイドβに対して特異的に結合する抗体を用いる、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記第２のプロパノイル化アミロイドβに対して特異的に結合する抗体を用いる、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）脳脊髄液、血液（血漿や血清）、鼻汁及び鼻粘膜中のプロパノイル化されたアミロイドβを検出対象とする、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）プロパノイル化されたアミロイドβの検出方法であって、
アルツハイマー病患者の脊髄液、血液（血漿や血清）、鼻汁及び鼻粘膜中のアミロイドβ４２の１６位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第１のプロパノイル化アミロイドβと、アミロイドβ４２の２８位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第２のプロパノイル化アミロイドβとのいずれか又は双方を、独立して検出する工程、を備える、方法。
（８）前記検出工程は、前記第１のプロパノイル化アミロイドβ及び前記第２のプロパノイル化アミロイドβの双方を検出する工程である、（７）に記載の方法。
（９）さらに、前記第２のプロパノイル化アミロイドβ／第１のプロパノイル化アミロイドβをアルツハイマー病の発症、重症度、予後及び合併症のいずれかと関連付けを実施する工程を備える、（８）に記載の方法。
（１０）アルツハイマー病の診断に関連したアミロイドβの検出方法であって、
アルツハイマー病患者の脊髄液、血液（血漿や血清）、鼻汁及び鼻粘膜中のアミロイドβ４２の１６位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第１のプロパノイル化アミロイドβと、アミロイドβ４２の２８位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第２のプロパノイル化アミロイドβとのいずれか又は双方を、独立して検出する工程、を備える、方法。
(1) A method for detecting propanoylated amyloid β,
A first propanoylated amyloid β in which lysine at position 16 of amyloid β42 or a lysine corresponding to the lysine is propanoylated, and a second lysine in position 28 of amyloid β42 or lysine corresponding to the lysine is propanoylated. Independently detecting either or both of the propanoylated amyloid β.
(2) The method according to (1), wherein the first propanoylated amyloid β is amyloid β42 in which the lysine at position 16 is propanoylated.
(3) The method according to (1) or (2), wherein the second propanoylated amyloid β is amyloid β42 in which the 28th lysine is propanoylated.
(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein an antibody that specifically binds to the first propanoylated amyloid β is used.
(5) The method according to any one of (1) to (4), wherein an antibody that specifically binds to the second propanoylated amyloid β is used.
(6) The method according to any one of (1) to (5), wherein propanoylated amyloid β in cerebrospinal fluid, blood (plasma and serum), nasal discharge and nasal mucosa is a detection target.
(7) A method for detecting propanoylated amyloid β,
The first propanoylated amyloid β obtained by propanoylating lysine at position 16 of amyloid β42 in the spinal fluid, blood (plasma or serum), nasal discharge and nasal mucosa of Alzheimer's disease patients, and amyloid β42 Independently detecting either or both of the lysine at position 28 or a second propanoylated amyloid β in which the lysine corresponding to the lysine is propanoylated.
(8) The method according to (7), wherein the detection step is a step of detecting both the first propanoylated amyloid β and the second propanoylated amyloid β.
(9) The method further comprises the step of associating the second propanoylated amyloid β / first propanoylated amyloid β with any of the onset, severity, prognosis, and complications of Alzheimer's disease. the method of.
(10) A method for detecting amyloid β associated with diagnosis of Alzheimer's disease,
The first propanoylated amyloid β obtained by propanoylating lysine at position 16 of amyloid β42 in the spinal fluid, blood (plasma or serum), nasal discharge and nasal mucosa of Alzheimer's disease patients, and amyloid β42 Independently detecting either or both of the lysine at position 28 or a second propanoylated amyloid β in which the lysine corresponding to the lysine is propanoylated.
本明細書の開示は、プロパノイル化されたアミロイドβの検出に関し、より具体的には、アミロイドβを、プロパノイル化部位特異的に検出する方法に関する。本発明者らが推測する、アミロイドβ４２の二つのリジン残基のプロパノイル化のスキームを図１に示す。 The disclosure herein relates to detection of propanoylated amyloid β, and more specifically to a method for detecting amyloid β in a propanoylated site-specific manner. A scheme of propanoylation of two lysine residues of amyloid β42, which is estimated by the present inventors, is shown in FIG.
図１に示すように、本方法によれば、従来、全く知られておらず、しかも、着目されていなかったアミロイドβ中の二つのリジン残基に対するプロパノイル化状態を特定し、アミロイドβ４２の１６位のリジン及び当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第１のプロパノイル化アミロイドβと、アミロイドβ４２の２８位のリジン及び当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第２のプロパノイル化アミロイドβと、をそれぞれ独立して検出できる。本発明者らによれば、アルツハイマー病患者の脳脊髄液においてこれら２種のプロパノイル化アミロイドβが異なる含有量を示した。また、非アルツハイマー病患者における第１及び第２のプロパノイル化アミロイドβの含有量とも異なっていた。生体内におけるこれら２種のプロパノイル化アミロイドβの分布傾向は、アルツハイマー病の発症等との関係において重要な特徴付けが可能であると考えられる。以下、本明細書に開示される抗体が反応する対象であるアミロイドβについて説明し、本開示の実施形態について適宜図面を参照しながら詳細に説明する。 As shown in FIG. 1, according to the present method, the propanoylation state for two lysine residues in amyloid β, which has not been known at all in the past and has not been noticed, is specified, and 16 of amyloid β42 is determined. A first propanoylated amyloid β in which the lysine corresponding to the lysine and the lysine corresponding to the lysine are propanoylated, and a lysine in position 28 of the amyloid β42 and a second propanoylated amyloid β in which the lysine corresponding to the lysine is propanoylated. And can be detected independently. According to the inventors, these two types of propanoylated amyloid β showed different contents in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease patients. It was also different from the contents of the first and second propanoylated amyloid β in patients with non-Alzheimer's disease. It is considered that the distribution tendency of these two types of propanoylated amyloid β in the living body can be importantly characterized in relation to the onset of Alzheimer's disease and the like. Hereinafter, amyloid β, to which the antibody disclosed in the present specification reacts, will be described, and embodiments of the present disclosure will be described in detail with reference to the drawings as appropriate.
（プロパノイル化されたアミロイドβの検出方法）
本明細書に開示されるプロパノイル化されたアミロイドβの検出方法（以下、単に、本検出方法ともいう。）は、アミロイドβの二つのリジン残基がそれぞれプロパノイル基で修飾されたアミロイドβを検出する工程を備えることができる。
(Method for detecting propanoylated amyloid β)
The method for detecting propanoylated amyloid β disclosed herein (hereinafter also simply referred to as this detection method) detects amyloid β in which two lysine residues of amyloid β are each modified with a propanoyl group. The process to perform can be provided.
アミロイドβは、一般に、アミロイドβ前駆体タンパク質からβ−セクレターゼ及びγ−セレクターゼによる切断によって生成されるとされている。本明細書における「アミロイドβ」は、例えば、ヒトのアミロイドβであって、アミノ酸残基が４０個（配列番号１）のアミロイドβ４０（アミロイドβ (1-40)）、同４２個（配列番号２）のアミロイドβ４２（アミロイドβ (1-42)）ほか、同４３個（配列番号３）のアミロイドβ４３（アミロイドβ (1-43)）が挙げられ、さらに、アミロイドβ (2-42)、アミロイドβ (4-40)等が挙げられるが、特に限定しないで、ヒトなどの生体内において存在する可能性があるアミロイドβを包含する。なお、本明細書におけるアミロイドβは、アミロイドβにおいてアミノ酸置換、欠失等の変異を有する変異体を包含しうる。この場合、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対する変異の個数は、例えば、１〜５個であり、また例えば、１個〜４個であり、また例えば、１個〜３個であり、また例えば１個又は２個である。 Amyloid β is generally generated from amyloid β precursor protein by cleavage with β-secretase and γ-selectase. “Amyloid β” in the present specification is, for example, human amyloid β, 40 amino acid residues (SEQ ID NO: 1) amyloid β40 (amyloid β (1-40) ), 42 (SEQ ID NO: 2) amyloid β42 (amyloid β (1-42) ), and 43 (SEQ ID NO: 3) amyloid β43 (amyloid β (1-43) ), and amyloid β (2-42) , Examples thereof include amyloid β (4-40), but are not particularly limited, and include amyloid β that may exist in a living body such as a human. In addition, the amyloid β in the present specification may include a mutant having a mutation such as amino acid substitution or deletion in the amyloid β. In this case, the number of mutations with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is, for example, 1 to 5, for example, 1 to 4, and for example, 1 to 3, For example, one or two.
本検出方法が検出対象とするアミロイドβは、例えば、アミロイドβ４０である。ヒトにおいて、アミロイドβ４０は、アミロイドβ４２の約１０倍量産生されることが知られている。また、本検出方法が検出対象とするアミロイドβは、例えば、アミロイドβ４２である。アミロイドβ４２がアルツハイマー病等に関しアミロイドβ４０よりも悪性であることも知られている。 The amyloid β to be detected by this detection method is, for example, amyloid β40. In humans, amyloid β40 is known to be produced in an amount about 10 times that of amyloid β42. Moreover, the amyloid β to be detected by this detection method is, for example, amyloid β42. It is also known that amyloid β42 is more malignant than amyloid β40 with respect to Alzheimer's disease and the like.
本検出方法の検出工程では、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化されたアミロイドβ（第１のプロパノイル化アミロイドβ）と、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２８位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化されたアミロイドβ（第２のプロパノイル化アミロイドβ）とのいずれか又は双方を検出する。 In the detection step of the present detection method, lysine at position 16 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or amyloid β (first propanoylated amyloid β) in which lysine corresponding to the lysine is propanoylated, and SEQ ID NO: 1 Either lysine at position 28 of the amino acid sequence represented by amyloid β or amyloid β in which lysine corresponding to the lysine is propanoylated (second propanoylated amyloid β) or both are detected.
なお、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６位のリジンがプロパノイル化されたアミロイドβとは、１６位のリジンがプロパノイル化されたアミロイドβ４０を意味している。また、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６位のリジンに相当するリジンがプロパノイル化されたアミロイドβとは、アミロイドβ４０以外のアミロイドβであって、配列番号１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、当該１６位のリジンに相当するリジンがプロパノイル化されたアミロイドβを意味する。したがって、１６位のリジンがプロパノイル化されたアミロイドβ４２、同リジンがプロパノイル化されたアミロイドβ４３等が挙げられる。なお、当業者であれば、アライメントは、Protein BLASTのほか、各種公知のデータベースを利用することなどにより実施可能である。 In addition, the amyloid β in which the lysine at position 16 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is propanoylated means amyloid β40 in which the lysine at position 16 is propanoylated. Further, amyloid β in which lysine corresponding to lysine at position 16 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is propanoylated is amyloid β other than amyloid β40, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 When aligned, it means amyloid β in which lysine corresponding to lysine at position 16 is propanoylated. Accordingly, amyloid β42 in which lysine at position 16 is propanoylated, amyloid β43 in which the lysine is propanoylated, and the like can be mentioned. A person skilled in the art can perform alignment by using various known databases in addition to Protein BLAST.
同様に、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２８位のリジンがプロパノイル化されたアミロイドβは、２８位のリジンがプロパノイル化されたアミロイドβ４０を意味している。また、配列番号１で表されるアミノ酸配列の２８位のリジンに相当するリジンがプロパノイル化されたアミロイドβとは、アミロイドβ４０以外のアミロイドβであって、配列番号１で表されるアミノ酸配列とアライメントしたとき、当該２８位のリジンに相当するリジンがプロパノイル化されたアミロイドβを意味する。したがって、２８位のリジンがプロパノイル化されたアミロイドβ４２，同リジンがプロパノイル化されたアミロイドβ４３等が挙げられる。 Similarly, amyloid β in which the lysine at position 28 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is propanoylated means amyloid β40 in which the lysine at position 28 is propanoylated. In addition, amyloid β in which lysine corresponding to lysine at position 28 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is propanoylated is amyloid β other than amyloid β40, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 When aligned, it means amyloid β in which lysine corresponding to the 28th lysine is propanoylated. Accordingly, amyloid β42 in which lysine at position 28 is propanoylated, amyloid β43 in which the lysine is propanoylated, and the like can be mentioned.
なお、リジン残基がプロパノイル化された構造は、図１に示すとおりである。 The structure in which the lysine residue is propanoylated is as shown in FIG.
第１のプロパノイル化アミロイドβ及び第２のプロパノイル化アミロイドβをそれぞれ特異的に検出するには、それぞれに特異的に結合する抗体を用いた免疫学的手法によることができる。あるいは、液体クロマトグラフィーによる分離、液体クロマトグラフィー／タンデム型質量分析計、MALDI-TOF/MSなどにより可能である。 Specific detection of the first propanoylated amyloid β and the second propanoylated amyloid β can be performed by an immunological technique using an antibody that specifically binds to each. Alternatively, separation by liquid chromatography, liquid chromatography / tandem mass spectrometer, MALDI-TOF / MS, and the like are possible.
（第１のプロパノイル化アミロイドβ及び第２のプロパノイル化アミロイドβのそれぞれに特異的に結合する抗体）
本明細書に開示される抗体は、アミロイドβの１６位のリジンが又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化されたプロパノイル化アミロイドβ（第１のプロパノイル化アミロイドβ）に対する反応性が、アミロイドβの２８位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化されたアミロイドβ（第２のプロパノイル化アミロイドβ）に対する反応性よりも高い抗体（以下、当該抗体を第１の抗体ともいう。）である。また、本明細書に開示される他の抗体は、アミロイドβの２８位のリジンが又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化されたプロパノイル化アミロイドβ（第２のアミロイドβともいう。）に対する反応性が、アミロイドβの１６位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化されたアミロイドβ（第１のアミロイドβともいう。）に対する反応性よりも高い抗体（以下、第２の抗体ともいう。）である。以下、これらの抗体について、順次説明する。
(An antibody that specifically binds to each of the first propanoylated amyloid β and the second propanoylated amyloid β)
The antibody disclosed in the present specification has a reactivity to propanoylated amyloid β (first propanoylated amyloid β) in which lysine at position 16 of amyloid β or a lysine corresponding to the lysine is propanoylated. Of the lysine at position 28 or lysine corresponding to the lysine is higher in reactivity to amyloid β (propanoylated amyloid β) (hereinafter, the antibody is also referred to as the first antibody). is there. In addition, other antibodies disclosed in the present specification react with propanoylated amyloid β (also referred to as second amyloid β) in which lysine at position 28 of amyloid β or lysine corresponding to the lysine is propanoylated. An antibody (hereinafter also referred to as a second antibody) having a higher sex than the reactivity to lysine at position 16 of amyloid β or amyloid β (also referred to as first amyloid β) in which lysine corresponding to the lysine is propanoylated. .) Hereinafter, these antibodies will be described sequentially.
（第１の抗体）
第１の抗体は、第１のアミロイドβに対する反応性が、第２のアミロイドβに対する反応性よりも高い抗体である。ここで、「第１のアミロイドβに対する反応性」とは、抗体が、アミロイドβの１６位リジンがプロパノイル化されたアミロイドβと反応（典型的には結合）することを意味している。また、「第２のアミロイドβに対する反応性」とは、抗体が、アミロイドβの２８位リジンがプロパノイル化されたアミロイドβと反応（典型的には結合）することを意味している。以下、同様である。
(First antibody)
The first antibody is an antibody that has a higher reactivity to the first amyloid β than the reactivity to the second amyloid β. Here, “reactivity to the first amyloid β” means that the antibody reacts (typically binds) with amyloid β in which the lysine 16-position of amyloid β is propanoylated. In addition, “reactivity to the second amyloid β” means that the antibody reacts (typically binds) with amyloid β in which the 28th lysine of amyloid β is propanoylated. The same applies hereinafter.
第１の抗体が備える係る反応性は、当業者において周知の方法で決定することができる。任意の抗体が、その第１のアミロイドβに対する反応性が、第２のアミロイドβに対する反応性よりも高ければ、第１の抗体に該当する。 Such reactivity of the first antibody can be determined by methods well known to those skilled in the art. Any antibody corresponds to the first antibody if its reactivity to the first amyloid β is higher than the reactivity to the second amyloid β.
第１の抗体が備える反応性は、上記のような反応特性を備えていればよいが、例えば、より具体的には、以下の第１の態様を採ることができる。すなわち、配列番号４で表されるアミノ酸配列におけるリジンがプロパノイル化されたペプチド（１６ＰＲＬペプチド）に対する反応性が、配列番号５で表されるアミノ酸配列におけるリジンがプロパノイル化されたペプチド（２８ＰＲＬペプチド）に対する反応性よりも高い。 Although the reactivity with which the 1st antibody is provided should just have the above reaction characteristics, for example, the following 1st aspect can be taken more specifically. That is, the reactivity with respect to the peptide in which the lysine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is propanoylated (16PRL peptide) is related to the peptide in which the lysine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 is propanoylated (28PRL peptide). Higher than reactivity.
ここで、配列番号４で表されるアミノ酸配列は、アミロイドβ４０のアミノ酸配列の１１位〜２１位のアミノ酸配列であり、アミロイドβ４０の１６位のリジンを含んで前後５個のアミノ酸残基を含んでいる。 Here, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is an amino acid sequence at positions 11 to 21 of the amino acid sequence of amyloid β40, and includes 5 amino acid residues before and after the lysine at position 16 of amyloid β40. It is out.
また、配列番号５で表されるアミノ酸配列は、アミロイドβ４０のアミノ酸配列の２３位〜３３位のアミノ酸配列であり、アミロイドβの２８位のリジンを含んで前後５個のアミノ酸残基を含んでいる。 The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 is the amino acid sequence at positions 23 to 33 of the amino acid sequence of amyloid β40, and includes 5 amino acid residues before and after the 28th lysine of amyloid β. Yes.
第１の態様の反応性は、例えば、第１の抗体の１６ＰＲＬペプチドに対する反応性が、２８ＰＲＬペプチに対する反応性よりも、各濃度５００ｎＭ時においては１．６倍以上（また例えば、１．７倍以上、また例えば、１．８倍以上）高く、また例えば、同１６７ｎＭ時においては１．２倍以上（また例えば、１．３倍以上、また例えば、１．４倍以上）高く、また例えば、同５５．６ｎＭ時においては１倍以上（また例えば、１．１倍以上、また例えば、１．２倍以上）高く、また例えば、同１８．５ｎＭ時においては１倍以上（また例えば、１．１倍以上、また例えば１．２倍以上）高い。 The reactivity of the first aspect is, for example, that the reactivity of the first antibody to 16PRL peptide is 1.6 times or more (also, for example, 1.7 times) at each concentration of 500 nM, compared to the reactivity to 28PRL peptide. For example, at the time of 167 nM, it is 1.2 times or more (also, for example, 1.3 times or more, for example, 1.4 times or more). At 55.6 nM, it is 1 or more times (also 1.1 times or more, for example, 1.2 times or more), and for example, at 18.5 nM, it is 1 time or more (also, for example, 1 .. 1 times or more, for example, 1.2 times or more).
第１の抗体が備える反応性は、さらに、例えば、以下の第２の態様を採ることができる。すなわち、配列番号６で表されるアミノ酸配列におけるリジンがプロパノイル化されたペプチド（１６ＰＲＬペプチド−ｌｏｎｇ）に対する反応性が、配列番号４で表されるアミノ酸配列におけるリジンがプロパノイル化されたペプチド（１６ＰＲＬペプチド）に対する反応性よりも高い態様である。 The reactivity with which a 1st antibody is equipped can further take the following 2nd aspects, for example. That is, the reactivity to the peptide in which the lysine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is propanoylated (16PRL peptide-long), the peptide in which the lysine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is propanoylated (16PRL peptide) It is an aspect higher than the reactivity with respect to).
ここで、配列番号６で表されるアミノ酸配列は、アミロイドβ４０のアミノ酸配列の１位〜２１位のアミノ酸配列であり、アミロイドβのＮ末端から１６位のリジンよりＣ末端側の５個のアミノ酸残基までを含んでいる。 Here, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is the amino acid sequence at positions 1 to 21 of the amino acid sequence of amyloid β40, and 5 amino acids on the C-terminal side from the lysine at position 16 from the N-terminal of amyloid β Contains up to residues.
第２の態様の反応性は、例えば、第１の抗体の１６ＰＲＬペプチド−ｌｏｎｇに対する反応性が、１６ＰＲＬペプチドに対する反応性よりも、各濃度５００ｎＭ時において５倍以上（また例えば、５．２倍以上、また例えば、５．３倍以上、また例えば、５．４倍以上）高く、また例えば、同１６７ｎＭ時において２．５倍以上（また例えば、２．６倍以上、また例えば、２．７倍以上、また例えば、２．８倍以上、また例えば、２．９倍以上）高く、また例えば、同５５．６ｎＭ時において１．３倍以上（また例えば、１．４倍以上、また例えば、１．５倍以上、また例えば、１．６倍以上）高く、また例えば、同１８．５ｎＭ時において１倍以上（また例えば、１．１倍以上、また例えば、１．２倍以上）高い。 The reactivity of the second aspect is, for example, that the reactivity of the first antibody to 16PRL peptide-long is 5 times or more (for example, 5.2 times or more) at each concentration of 500 nM than the reactivity to 16PRL peptide. Also, for example, 5.3 times or more, for example, 5.4 times or more, and higher, for example, at 167 nM, 2.5 times or more (or, for example, 2.6 times or more, or, for example, 2.7 times). More than, for example, 2.8 times or more, for example, 2.9 times or more, and higher, for example, at 55.6 nM, 1.3 times or more (for example, 1.4 times or more, for example, 1 0.5 times or more, for example, 1.6 times or more), and, for example, at 18.5 nM, it is 1 time or more (or, for example, 1.1 times or more, for example, 1.2 times or more).
第１の抗体は、さらに、例えば、第１のアミロイドβに対する反応性が、アミロイドβの１６位のリジンが又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化されていないアミロイドβに対する反応性よりも高い抗体である。 The first antibody further has, for example, an antibody whose reactivity to the first amyloid β is higher than the reactivity to amyloid β in which lysine at position 16 of amyloid β or lysine corresponding to the lysine is not propanoylated. It is.
第１の抗体は、こうした反応特性を備えていればよいが、より具体的には、以下の態様を採ることができる。すなわち、１６ＰＲＬペプチド又は１６ＰＲＬ−ｌｏｎｇに対する反応性が、リジン残基がＰＲＬ化されていない配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、１６ペプチドともいう。）又はリジン残基がＰＲＬ化されていない配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、１６ペプチド−ｌｏｎｇともいう。）に対する反応性よりも高い態様である。 Although the 1st antibody should just be equipped with such a reaction characteristic, the following aspects can be taken more specifically. That is, the reactivity to 16PRL peptide or 16PRL-long is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in which the lysine residue is not PRL converted (hereinafter also referred to as 16 peptide) or the lysine residue is PRL converted. This is a mode higher than the reactivity to a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 (hereinafter also referred to as 16 peptide-long).
かかる態様の反応性は、例えば、第１の抗体の１６ＰＲＬペプチドに対する反応性が、１６ペプチドに対する反応性よりも、各濃度５００ｎＭ時において１．３倍以上（また例えば、１．４倍以上、また例えば、１．５倍以上）高く、また例えば、同１６７ｎＭ時において１．２倍以上（また例えば、１．３倍以上、また例えば、１．４倍以上高く、また例えば、同５５．６ｎＭ時において１倍以上（また例えば、１．１倍以上、また例えば、１．２倍以上）高く、また例えば、同１８．５ｎＭ時において１倍以上（また例えば、１．１倍以上、また例えば、１．２倍以上）高い。 The reactivity of such an embodiment is, for example, that the reactivity of the first antibody to 16PRL peptide is 1.3 times or more (or, for example, 1.4 times or more, or more than the reactivity to 16 peptide at each concentration of 500 nM, or For example, 1.5 times or more), for example, 1.2 times or more at 167 nM (for example, 1.3 times or more, for example, 1.4 times or more, for example, 55.6 nM at the same time) 1 times or more (also, for example, 1.1 times or more, for example, 1.2 times or more), and, for example, at 18.5 nM, 1 time or more (or, for example, 1.1 times or more, 1.2 times or more) High.
また例えば、第１の抗体の１６ＰＲＬペプチド−ｌｏｎｇに対する反応性が、１６ペプチド−ｌｏｎｇに対する反応性よりも、各濃度５００ｎＭ時において７倍以上（また例えば、７．２倍以上、また例えば、７．４倍以上、また例えば、７．７倍以上）高く、また例えば、同１６７ｎＭ時において３．５倍以上（また例えば、３．６倍以上、また例えば、３．８倍以上）以上高く、また例えば、同５５．６ｎＭ時において１．５倍以上（また例えば、１．６倍以上、また例えば、１．７倍以上）高く、また例えば、同１８．５ｎＭ時において１倍以上（また例えば、１．１倍以上、また例えば、１．２倍以上）高い。 Also, for example, the reactivity of the first antibody to 16PRL peptide-long is 7 times or more (also, for example, 7.2 times or more, or, for example, 7. 4 times or more, for example, 7.7 times or more) high, for example, at the same time of 167 nM, 3.5 times or more (for example, 3.6 times or more, for example, 3.8 times or more) or more, For example, at 55.6 nM, 1.5 times or more (also, for example, 1.6 times or more, or, for example, 1.7 times or more), and for example, at 18.5 nM, at least 1 time (or, for example, 1.1 times or more, for example, 1.2 times or more).
（第２の抗体）
第２の抗体は、第２のアミロイドβに対する反応性が、第１のアミロイドβに対する反応性よりも高い抗体である。ここで、「第２のアミロイドβに対する反応性」、「第１のアミロイドβに対する反応性」とは、既に説明したとおりである。
(Second antibody)
The second antibody is an antibody having a higher reactivity with the second amyloid β than the reactivity with the first amyloid β. Here, “reactivity to the second amyloid β” and “reactivity to the first amyloid β” are as described above.
第２の抗体が備える係る反応性は、当業者において周知の方法で決定することができる。任意の抗体が、その第２のアミロイドβに対する反応性が、第１のアミロイドβに対する反応性よりも高ければ、第２の抗体に該当する。 Such reactivity of the second antibody can be determined by methods well known to those skilled in the art. Any antibody corresponds to the second antibody if its reactivity to the second amyloid β is higher than the reactivity to the first amyloid β.
第２の抗体が備える反応性は、上記のような反応特性を備えていればよいが、例えば、より具体的には、以下の第１の態様を採ることができる。すなわち、配列番号５で表されるアミノ酸配列におけるリジンがプロパノイル化されたペプチド（２８ＰＲＬペプチド）に対する反応性が、配列番号４で表されるアミノ酸配列におけるリジンがプロパノイル化されたペプチド（１６ＰＲＬペプチド）に対する反応性よりも高い。 Although the reactivity with which the 2nd antibody is provided should just have the above reaction characteristics, for example, the following 1st aspect can be taken more specifically. That is, the reactivity with respect to the peptide in which the lysine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 is propanoylated (28PRL peptide) corresponds to the peptide in which the lysine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is propanoylated (16PRL peptide). Higher than reactivity.
第１の態様の反応性は、例えば、第２の抗体の２８ＰＲＬペプチドに対する反応性が、１６ＰＲＬペプチドに対する反応性よりも、各濃度５０ｎＭ時において４．５倍以上（また例えば、４．６倍以上、また例えば４．７倍以上）以上高く、また例えば、同１６．７ｎＭ時において２．５倍以上（また例えば、２．６倍以上、また例えば２．７倍以上、また例えば２．８倍以上）高く、また例えば、同５．５６ｎＭ時において１．７倍以上（また例えば、１．８倍以上、また例えば、１．９倍以上）高く、また例えば、同１．８５ｎＭ時において１．５倍以上（また例えば、１．６倍以上、また例えば、１．７倍以上）高い。 The reactivity of the first aspect is, for example, that the reactivity of the second antibody to 28PRL peptide is 4.5 times or more (also, for example, 4.6 times or more) at each concentration of 50 nM, compared to the reactivity to 16PRL peptide. In addition, for example, at 16.7 nM, 2.5 times or more (for example, 2.6 times or more, for example, 2.7 times or more, for example, 2.8 times). For example, at 5.56 nM, 1.7 times or more (for example, 1.8 times or more, for example, 1.9 times or more), and for example, 1.85 nM at 1.56 nM. 5 times or more (also 1.6 times or more, for example 1.7 times or more).
第２の抗体は、さらに、例えば、第２のアミロイドβに対する反応性が、アミロイドβの２８位のリジンが又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化されていないアミロイドβに対する反応性よりも高い抗体である。 The second antibody further has, for example, an antibody whose reactivity to the second amyloid β is higher than the reactivity to amyloid β in which lysine at position 28 of amyloid β or a lysine corresponding to the lysine is not propanoylated. It is.
第２の抗体は、こうした反応特性を備えていればよいが、より具体的には、以下の態様を採ることができる。すなわち、２８ＰＲＬペプチドに対する反応性が、リジン残基がＰＲＬ化されていない配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、２８ペプチドともいう。）に対する反応性よりも高い態様である。 Although the 2nd antibody should just be equipped with such a reaction characteristic, the following aspects can be taken more specifically. That is, the reactivity to the 28PRL peptide is higher than the reactivity to the peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 in which the lysine residue is not PRLized (hereinafter also referred to as 28 peptide).
以上説明した、第１及び第２の抗体についての反応性の比較は、それぞれの抗体について、当該抗体が本来結合する抗原を、対比すべき物質を競合物質として用いる競合ＥＬＩＳＡを用いて決定することができる。 The comparison of the reactivity of the first and second antibodies described above is to determine the antigen to which the antibody originally binds using a competitive ELISA using the substance to be compared as a competitor. Can do.
こうした抗体は、ポリクロナール抗体及びモノクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。また、こうした抗体は、ビオチン化されることにより、ストレプトアビジン等で複合化可能に構成されていてもよい。また、ヒト型抗体であるほか、由来がヒトでない場合には、当業者に周知の方法によるヒト化抗体であってもよい。 Such antibodies may be polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, but are preferably monoclonal antibodies. In addition, such an antibody may be configured to be complexed with streptavidin or the like by being biotinylated. In addition to being a human-type antibody, when the origin is not human, it may be a humanized antibody by a method well known to those skilled in the art.
（抗体の作製）
当業者であれば、上記の反応性を有する抗体を、当業者に周知の方法を適宜採用して作製することができるが、例えば、以下の方法により作製することができる。
(Production of antibody)
Those skilled in the art can prepare antibodies having the above-mentioned reactivity by appropriately adopting methods well known to those skilled in the art. For example, they can be prepared by the following methods.
（抗原の作製）
抗原の作製の概要を、図２に示す。第１のプロパノイル化アミロイドβと特異的に結合する抗体（以下、単に、第１の抗体ともいう。）を作製するための抗原は、配列番号１で表されるアミノ酸配列における１６位リジン（以下、１６Ｌｙｓともいう。）に用いるための予めプロパノイル化したリジンを準備しておき、かかるプロパノイル化リジンを用いて、例えば前後３〜８アミノ酸残基程度、典型的には５アミノ酸残基を含むアミノ酸配列のペプチドを合成する。なお、リジンのプロパノイル化は、例えば、以下のとおりに実施することができる。
(Preparation of antigen)
An outline of production of the antigen is shown in FIG. An antigen for producing an antibody that specifically binds to the first propanoylated amyloid β (hereinafter also simply referred to as the first antibody) is lysine at position 16 (hereinafter referred to as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1). Lysine that has been previously propanoylated for use in the preparation of a lysine), and using such propanoylated lysine, for example, amino acids containing about 3 to 8 amino acid residues, typically 5 amino acid residues. Synthesize peptides of sequence. In addition, the propanoylation of lysine can be implemented as follows, for example.
８３％メタノール５００μｌ中に溶かしたＮα-[(9-fluorenylmethoxy)carbonyl]-lysine（Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ）１０５ｍｇに無水プロピオン酸 (Propionic anhydride)を５７μｌ添加し、室温にて４時間反応させる。その後、さらに無水プロピオン酸５７μｌを加え、室温で反応させる。添加後、さらに４時間反応させた反応液から、プロパノイル化されたＦｍｏｃ−Ｌｙｓを高速液体クロマトグラフィーにて精製する。精製条件は、単一溶媒による分離条件で、溶媒は、０．１％トリフルオロ酢酸／５５％アセトニトリル含有Ｈ2Ｏを用いる。分離に用いたカラムは、Ｃ３０−ＵＧ−５（１０φｘ２５０ｍｍ）を用い、流速は２ｍｌ／ｍｉｎとしている。このようにして分取・精製したプロパノイル化Ｆｍｏｃ−ｌｙｓｉｎｅは、ロータリーエバポレーターおよび凍結乾燥により粉体とし、その後、ペプチド合成の素材へと供する。 To 105 mg of Nα-[(9-fluorenylmethoxy) carbonyl] -lysine (Nα-Fmoc-Lys) dissolved in 500 μl of 83% methanol, 57 μl of propionic anhydride is added and reacted at room temperature for 4 hours. Thereafter, 57 μl of propionic anhydride is further added and allowed to react at room temperature. After the addition, the propanoylated Fmoc-Lys is purified by high performance liquid chromatography from the reaction solution reacted for 4 hours. The purification conditions are separation conditions using a single solvent, and the solvent is H 2 O containing 0.1% trifluoroacetic acid / 55% acetonitrile. The column used for separation is C30-UG-5 (10φ × 250 mm), and the flow rate is 2 ml / min. The propanoylated Fmoc-lysine thus separated and purified is made into a powder by a rotary evaporator and freeze-drying, and then used as a material for peptide synthesis.
この１６Ｌｙｓプロパノイル化ペプチドを、Ｎ末側に付与したＣｙｓ残基を介して公知のキャリアタンパク質であるＫＬＨ（スカシ貝ヘモシアニン）又はＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）（ＰＲＬ１６−ＫＬＨ又はＰＲＬ１６−ＢＳＡ）と複合化して、抗体作製のための抗原とすることができる。なお、キャリアタンパク質としては、特に限定するものではなく、ＯＶＡ（オバルブミン）などの蛋白質または高分子体に結合もしくは重合させたものを適宜用いることができるが、必ずしもキャリアーは必要ではない。 This 16Lys propanoylated peptide is complexed with KLH (Scattle hemocyanin) or BSA (bovine serum albumin) (PRL16-KLH or PRL16-BSA) which is a known carrier protein via a Cys residue added to the N-terminal side. Thus, it can be used as an antigen for antibody production. The carrier protein is not particularly limited, and a protein such as OVA (ovalbumin) or a polymer bound or polymerized can be used as appropriate, but a carrier is not necessarily required.
同様に、第２のプロパノイル化アミロイドβと特異的に結合する抗体（以下、単に、第２の抗体ともいう。）を作製するための抗原も、配列番号１で表されるアミノ酸配列における２８位リジン（以下、単に、２８Ｌｙｓともいう。）に用いるための予めプロパノイル化したリジンを準備しておき、かかるプロパノイル化リジンを用いて、２８位リジンを含んだ適数個のアミノ酸残基からなるペプチドを合成する。この２８Ｌｙｓプロパノイル化ペプチドを、Ｎ末側に付与したＣｙｓ残基を介して公知のキャリアタンパク質であるＫＬＨ又はＢＳＡと複合化（ＰＲＬ２８−ＫＬＨ又はＰＲＬ２８−ＢＳＡ）して、抗体作製のための抗原とする。 Similarly, the antigen for producing an antibody that specifically binds to the second propanoylated amyloid β (hereinafter also simply referred to as the second antibody) is the 28th position in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. A lysine that has been previously propanoylated for use in lysine (hereinafter also simply referred to as 28Lys) is prepared, and a peptide consisting of an appropriate number of amino acid residues including lysine at position 28 using such propanoylated lysine Is synthesized. This 28Lys propanoylated peptide is complexed with a known carrier protein KLH or BSA (PRL28-KLH or PRL28-BSA) via a Cys residue attached to the N-terminal side, and an antigen for antibody production To do.
なお、第１の抗体の結合特異性を向上させるためにスクリーニングに用いる抗原として、上記１６Ｌｙｓ近傍配列よりも、さらにＮ末端に近い側のアミノ酸配列部分を含み、１６Ｌｙｓ＋５残基程度のｌｏｎｇ配列のＣ末端側にＣｙｓ残基を導入してＣ末側をキャリアタンパク質と複合化したｌｏｎｇ型抗原（ｌｏｎｇ ＰＲＬ１６−ＢＳＡ）も準備することができる。さらに、同様の目的のために、当該ｌｏｎｇ配列で１６Ｌｙｓがプロパノイル化されていない天然のアミノ酸配列からなり、Ｃ末側をキャリアタンパク質と複合したＮａｔｉｖｅ型抗原（Ｎａｔｉｖｅ ＰＲＬ１６−ＢＳＡ）も準備することができる。 The antigen used for screening to improve the binding specificity of the first antibody includes an amino acid sequence portion closer to the N-terminus than the 16 Lys vicinity sequence, and a long sequence C of about 16 Lys + 5 residues. A long-type antigen (long PRL16-BSA) in which a Cys residue is introduced on the terminal side and the C-terminal side is complexed with a carrier protein can also be prepared. Further, for the same purpose, a native antigen (Native PRL16-BSA) consisting of a natural amino acid sequence in which 16Lys is not propanoylated in the long sequence and complexed with a carrier protein at the C-terminal side may be prepared. it can.
（免疫）
第１の抗体及び第２の抗体を作製するための免疫用抗原（ＫＬＨ複合体）を、それぞれ、適宜完全アジュバンドとともに、マウスなどの公知の抗体作製用動物に腹腔内投与などにより投与して、初回免疫を行い、その後、一定間隔で不完全アジュバンドとともに追加免疫を行う。適時に、動物から血液を採取し、その血清を一次抗体として使用し、ＢＳＡ複合体である各種抗原を用いたＥＬＩＳＡ法等により、その抗体価を評価し、抗体価の十分な上昇を確認後、屠殺より３日前程度に最終免疫を行って、屠殺して脾臓を摘出する。なお、免疫に使用する動物は特に限定されないが、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ハムスター、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ、ヒト抗体を産生するヒト以外の動物等はいずれも使用できる。
(Immunity)
An antigen for immunization (KLH complex) for producing the first antibody and the second antibody is appropriately administered together with a complete adjuvant to a known antibody production animal such as a mouse by intraperitoneal administration or the like. First immunization, followed by booster with incomplete adjuvant at regular intervals. After collecting blood from the animal in a timely manner, using the serum as the primary antibody, evaluating the antibody titer by ELISA using various antigens that are BSA conjugates, and confirming a sufficient increase in the antibody titer The final immunization is performed about 3 days before the sacrifice, and the spleen is removed after sacrifice. The animal used for immunization is not particularly limited, and any of rabbits, goats, sheep, hamsters, mice, rats, guinea pigs, chickens, non-human animals producing human antibodies, and the like can be used.
（ハイブリドーマ細胞の樹立）
屠殺した動物の脾臓から得た脾臓細胞を調製し、その脾臓細胞と選択可能に特定遺伝子を欠損させたミエローマ細胞とを、ポリエチレングリコ−ル１５００などを用いる公知の方法で融合させる。また不死化の方法としては、細胞融合以外の公知の方法を用いることもできる。例えば、エプスタイン・バールウイルス（Epstein-Barr virus）を用いたトランスフォーム法（D. Kozborら、Eur J Immunol, 14:23 (1984)）により行うこともできる。その後、選択培地を用いてハイブリドーマ細胞のみを選択する。ＰＲＬ１６−ＢＳＡに対する抗体価を有するハイブリドーマ細胞につき、ＰＲＬ１６−ＢＳＡのほか、必要に応じてｌｏｎｇ ＰＲＬ１６−ＢＳＡを用いてスクリーニング及びクローニングを行うことで第１の抗体を産生する単一クローンを得ることができる。また、ＰＲＬ２８−ＢＳＡに対する抗体価を有するハイブリドーマ細胞につき、ＰＲＬ２８−ＢＳＡを用いるスクリーニング及びクローニングを行うことで、第２の抗体を産生する単一クローンを得ることができる。
(Establishment of hybridoma cells)
Spleen cells obtained from the spleen of the sacrificed animal are prepared, and the spleen cells and myeloma cells deficient in a specific gene are selectively fused by a known method using polyethylene glycol 1500 or the like. As the immortalization method, a known method other than cell fusion can be used. For example, it can also be performed by a transformation method using Epstein-Barr virus (D. Kozbor et al., Eur J Immunol, 14:23 (1984)). Thereafter, only hybridoma cells are selected using a selective medium. A hybridoma cell having an antibody titer against PRL16-BSA can be obtained by screening and cloning using long PRL16-BSA as necessary in addition to PRL16-BSA to obtain a single clone that produces the first antibody. it can. In addition, by performing screening and cloning using PRL28-BSA for hybridoma cells having an antibody titer against PRL28-BSA, a single clone that produces the second antibody can be obtained.
（抗体の取得）
第１の抗体産生ハイブリドーマ細胞の培養上清から第１の抗体を取得できる。タンパク質の精製法を適宜用いることができるが、アフィニティークロマトグラフィーを用いることが便利である。同様にして、第２の抗体産生ハイブリドーマ細胞の培養上清から第２の抗体を得ることができる。
(Acquisition of antibody)
The first antibody can be obtained from the culture supernatant of the first antibody-producing hybridoma cell. Protein purification methods can be used as appropriate, but it is convenient to use affinity chromatography. Similarly, the second antibody can be obtained from the culture supernatant of the second antibody-producing hybridoma cell.
第１の抗体及び第２の抗体については、その特異性を間接ＥＬＩＳＡや競合ＥＬＩＳＡ等により評価することができる。また、第１の抗体及び第２の抗体が有する特徴的な反応性は、実施例に開示される競合ＥＬＩＳＡを用いて決定することができる。 The specificity of the first antibody and the second antibody can be evaluated by indirect ELISA, competitive ELISA, or the like. In addition, the characteristic reactivity of the first antibody and the second antibody can be determined using a competitive ELISA disclosed in Examples.
なお、第１の抗体は、１６Ｌｙｓを特異的に検出し、第２の抗体は、２８Ｌｙｓを特異的に検出するが、アミロイドβが２つのリジン残基がプロパノイル化された１６Ｌｙｓ＋２８Ｌｙｓのアミロイドβには、第１の抗体及び第２の抗体の双方が結合することになる。 The first antibody specifically detects 16 Lys, and the second antibody specifically detects 28 Lys. However, amyloid β is an amyloid β of 16 Lys + 28 Lys in which two lysine residues are propanoylated. , Both the first antibody and the second antibody will bind.
ヒト型抗体とは、 非ヒト（マウス、ラット、ハムスター、ウサギなど）抗体をヒト型とした抗体（以下ヒト化抗体と称する）とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片（例えばFv、Fab'、F(ab')2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体としては特に、非ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体の配列を変更することによって、ヒト抗体生殖系列由来のアミノ酸配列から部分的に、あるいは全体的に構成される抗体が好ましい。このような変更は、非ヒト抗体定常領域をヒト抗体の定常領域で置換することにより実現され、医薬的使用において許容される程度の低い免疫原性を有するヒト／非ヒトキメラを作製することが可能である。さらに好ましくは、抗体の可変領域およびＣＤＲでさえもまた、現在までに当分野に周知である技術によってヒト化される。可変領域のフレームワーク領域は対応するヒトフレームワーク領域により置換され、非ヒトＣＤＲは実質的に変化がないか、あるいはそのヒトゲノム由来の配列で置換されることもある。 A human antibody is a non-human (mouse, rat, hamster, rabbit, etc.) antibody that is human (hereinafter referred to as a humanized antibody) is a chimeric immunoglobulin, an immunoglobulin chain or a fragment thereof (for example, Fv, Fab ′, F (ab ′) 2 or other antigen-binding subsequence of an antibody), which contains the minimum sequence derived from non-human immunoglobulin. Particularly as a humanized antibody, an antibody partially or wholly composed of an amino acid sequence derived from a human antibody germline by changing the sequence of an antibody having a complementarity determining region (CDR) of a non-human antibody Is preferred. Such a change is realized by replacing the non-human antibody constant region with the constant region of a human antibody, and it is possible to create a human / non-human chimera having a low immunogenicity acceptable for pharmaceutical use. It is. More preferably, even antibody variable regions and CDRs are humanized by techniques well known in the art to date. The framework region of the variable region is replaced by the corresponding human framework region, and the non-human CDR may be substantially unchanged or replaced with a sequence derived from the human genome.
ヒト化抗体とはさらに、ヒトフレームワークおよび少なくとも1つの非ヒト抗体由来ＣＤＲを含むものであり、そこに存在する任意の定常領域がヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一であるものを表す。実質的に同一とは、少なくとも８５〜１００％、好ましくは９５〜１００％のアミノ酸配列が同一であることを表す。すなわち本ヒト化抗体は、ＣＤＲ部分を除いた全ての部分が、１又はそれ以上の天然のヒト免疫グロブリン配列に対応する部分と同一となる。 A humanized antibody further includes a human framework and at least one non-human antibody-derived CDR, wherein any constant region present therein is substantially identical to a human immunoglobulin constant region. Substantially identical means that at least 85 to 100%, preferably 95 to 100% of amino acid sequences are identical. That is, in the present humanized antibody, all portions except the CDR portion are the same as portions corresponding to one or more natural human immunoglobulin sequences.
非ヒト抗体をヒト化する方法は、この分野でよく知られている。例えば、Winterらの方法（特許第２９１２６１８号公報）、Jonesらの方法(Nature, 321: 522 (1986))、Riechmannらの方法(Nature, 332: 323 (1988))、Verhoeyenらの方法(Science, 239: 1534 (1988))、Queenらの方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2869 (1991))などによって実施される。ヒト化抗体取得作業においては、ヒト化抗体を発現させる宿主細胞での発現最適化を目的として、コドンのサイレント変異を行うことが望ましい（例えばNakamuraらの方法：Nuclecic Acid Res 29: 292 (2000)）。このようにして得られた抗体は、本願に記載の特異性を有するものであれば、可変領域において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とするヒト化抗体も本願発明に含まれる。 Methods for humanizing non-human antibodies are well known in the art. For example, the method of Winter et al. (Patent No. 292618), the method of Jones et al. (Nature, 321: 522 (1986)), the method of Riechmann et al. (Nature, 332: 323 (1988)), the method of Verhoeyen et al. (Science 239: 1534 (1988)), Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2869 (1991)). In the work of obtaining a humanized antibody, it is desirable to perform silent codon mutation for the purpose of optimizing expression in a host cell that expresses the humanized antibody (for example, the method of Nakamura et al .: Nuclecic Acid Res 29: 292 (2000) ). The antibody thus obtained is characterized by having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the variable region as long as it has the specificity described in the present application. The humanized antibody is also included in the present invention.
（被験対象）
本検出方法は、アミロイドβが存在する可能性のある生体由来の試料を、特に限定することなく、被験対象とすることができる。例えば、脳漿を含む脳脊髄液、血液、尿、涙液などの体液のほか、脳、眼などの各種神経細胞の存在する組織（切片）が挙げられる。特に、アルツハイマー病などのアミロイドβの蓄積、産生ないしは関与の可能性のある神経変性疾患に罹患した個体又は当該神経変性疾患モデル動物の上記被験対象とすることが好適である。また、鼻汁及び鼻粘膜も被験対象とすることができる。
(Subject)
In this detection method, a sample derived from a living body in which amyloid β may be present can be used as a test subject without particular limitation. For example, in addition to cerebrospinal fluid including cerebrospinal fluid, bodily fluids such as blood, urine, and tears, tissues (sections) in which various nerve cells such as brain and eyes are present. In particular, it is preferable to use the test subject of an individual suffering from a neurodegenerative disease that may accumulate, produce or participate in amyloid β such as Alzheimer's disease or a model animal of the neurodegenerative disease. In addition, nasal discharge and nasal mucosa can be tested.
なお、こうした神経変性疾患としては、アルツハイマー病のほか、血管性のアミロイド病変、アミロイドーシス等が挙げられる。 Examples of such neurodegenerative diseases include Alzheimer's disease, vascular amyloid lesions, amyloidosis, and the like.
本検出方法では、例えば、こうした抗体を用いて第１のプロパノイル化アミロイドβ及び第２のプロパノイル化アミロイドβをそれぞれ検出することができる。例えば、各種の被験対象につき、ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡなどの酵素免疫法、ドットブロッティング、ウェスタンブロッティング、アフィニティークロマトグラフィー、組織染色法など、抗体を用いた各種検出法にてこれらのアミロイドβを検出することができる。 In this detection method, for example, the first propanoylated amyloid β and the second propanoylated amyloid β can be detected using such an antibody. For example, for various test subjects, these amyloid βs are detected by various detection methods using antibodies such as enzyme immunization methods such as ELISA and competitive ELISA, dot blotting, western blotting, affinity chromatography, and tissue staining. Can do.
本検出方法では、これらのプロパノイル化アミロイドβをそれぞれ検出するが、検出するのみならず、相対的又は絶対的な量を定量することもできる。 In this detection method, each of these propanoylated amyloid β is detected, but not only the detection but also the relative or absolute amount can be quantified.
本検出方法では、第１のプロパノイル化アミロイドβのみを検出してもよいし、第２のプロパノイル化アミロイドβのみを検出してもよいし、双方を検出してもよい。また、これらを同時に検出してもよい。 In this detection method, only the first propanoylated amyloid β may be detected, only the second propanoylated amyloid β may be detected, or both may be detected. Moreover, you may detect these simultaneously.
種々の被験対象中の第１のプロパノイル化アミロイドβ及び／又は第２のプロパノイル化アミロイドβを検出することで、アミロイドβの酸化態様に応じて検出し、その神経組織内での分布や脳脊髄液や血液などの体液中での濃度を評価することで、アミロイドβのアシル化（プロパノイル化は、脂質過酸化物に起因する酸化である。）とアルツハイマー病などの神経変性疾患との関係を特徴付けが可能となる。 By detecting the first propanoylated amyloid β and / or the second propanoylated amyloid β in various test subjects, it is detected according to the oxidation mode of amyloid β, and its distribution in the nervous tissue and the cerebrospinal cord By evaluating the concentration in body fluids such as fluid and blood, the relationship between acylation of amyloid β (propanoylation is oxidation caused by lipid peroxide) and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease Characterization is possible.
例えば、第１のプロパノイル化アミロイドβの量、第２のプロパノイル化アミロイドβの量、及び第２のプロパノイル化アミロイドβの量／第１のプロパノイル化アミロイドβの量からなる群から選択される１種又は２種以上を、アルツハイマー病などの神経変性疾患の発症、重症度、予後及び合併症のいずれかと関連付けを実施することができる。また、こうした関連付けを利用して、これらの数値のいずれかあるいは２種以上を、こうした神経変性疾患の診断等のマーカーとして使用することができるようになる。 For example, 1 selected from the group consisting of the amount of first propanoylated amyloid β, the amount of second propanoylated amyloid β, and the amount of second propanoylated amyloid β / the amount of first propanoylated amyloid β. The species or two or more can be associated with any of the onset, severity, prognosis and complications of a neurodegenerative disease such as Alzheimer's disease. In addition, using these associations, any one or more of these numerical values can be used as a marker for diagnosis of such neurodegenerative diseases.
（アルツハイマー病の診断に関連したアミロイドβの検出方法）
本明細書に開示されるアルツハイマー病の診断に関連したアミロイドβの検出方法は、方は、アルツハイマー病患者の脊髄液、血液、鼻汁及び鼻粘膜中のアミロイドβ４２の１６位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第１のプロパノイル化アミロイドβと、アミロイドβ４２の２８位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第２のプロパノイル化アミロイドβとのいずれか又は双方を、独立して検出する工程、を備えることができる。この方法によれば、アルツハイマー病の診断に関連してアミロイドβをプロパノイル化部位特異的に検出することで、アルツハイマー病の診断を補助することができる。
(Method of detecting amyloid β associated with diagnosis of Alzheimer's disease)
The method of detecting amyloid β related to the diagnosis of Alzheimer's disease disclosed in this specification is based on the lysine at position 16 of amyloid β42 in spinal fluid, blood, nasal discharge and nasal mucosa of Alzheimer's disease patients or the lysine. Either or both of the first propanoylated amyloid β in which the corresponding lysine is propanoylated, the lysine at position 28 of amyloid β42, or the second propanoylated amyloid β in which the lysine corresponding to the lysine is propanoylated And independently detecting. According to this method, the diagnosis of Alzheimer's disease can be assisted by detecting amyloid β in a propanoylated site-specific manner in connection with the diagnosis of Alzheimer's disease.
以下、本明細書の開示をより具体的に説明するために具体例としての実施例を記載する。以下の実施例は、本明細書の開示を説明するためのものであって、その範囲を限定するものではない。 Hereinafter, in order to explain the disclosure of the present specification more specifically, specific examples will be described. The following examples are intended to illustrate the disclosure herein and are not intended to limit the scope thereof.
（抗体作製用の抗原の作製）
アミロイドβには２つ（Ｎ末端より１６番目（Ｌｙｓ１６）と２８番目（Ｌｙｓ２８））のＰＲＬ化されうるリジン残基が存在したため、この２種のＰＲＬ化部位を個別に認識することができる抗体（１６番目リジン残基のＰＲＬ化：ｍＡｂＢＳＴ３１、２８番目リジン残基のＰＲＬ化：ｍＡｂ３Ａ１１）を作製した。まずは、図２にも示ように、上段２種（ＰＲＬ１６−ａｎｔｉｇｅｎ、ＰＲＬ２８−ａｎｔｉｇｅｎ）に示すように、キャリアタンパク質（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）及びｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ））に標的とするリジン残基周辺のアミノ酸５残基をもつペプチドを結合させることで、Ｌｙｓ１６のＰＲＬ化を認識する抗体作製のための抗原（ＰＲＬ１６−ａｎｔｉｇｅｎ（ＫＬＨ ｏｒ ＢＳＡ））及びＬｙｓ２８のＰＲＬ化を認識する抗体作製のための抗原（ＰＲＬ２８−ａｎｔｉｇｅｎ（ＫＬＨ ｏｒ ＢＳＡ））を作製した。
(Preparation of antigen for antibody production)
An amyloid β has two lysine residues that can be PRLized (16th (Lys16) and 28th (Lys28)) from the N-terminus, so that these two types of PRL sites can be recognized individually (PRL conversion of the 16th lysine residue: mAb BST31, PRL conversion of the 28th lysine residue: mAb3A11) was prepared. First, as shown in FIG. 2, as shown in the upper two types (PRL16-antigen, PRL28-antigen), lysine residues targeted for carrier proteins (keyhole limpet hemocyanin (KLH) and bovine serum albumin (BSA)) An antibody for recognizing PRL-formation of Lys16 (PRL16-antigen (KLH or BSA)) and an antibody for recognizing PRL-formation of Lys28 by binding a peptide having 5 amino acid residues around the group Antigen (PRL28-antigen (KLH or BSA)) was prepared.
また、ＰＲＬ１６−ａｎｔｉｇｅｎに関しては、より特異な抗体の作製を目的にペプチド鎖が長いＬｏｎｇＰＲＬ１６−ａｎｔｉｇｅｎ（Ａβ配列のＮ末端より２１番目のアミノ酸配列を含有する）とその未修飾体であるＮａｔｉｖｅ１６−ａｎｔｉｇｅｎを作製した。すべての抗原に使用したペプチドは、キャリアータンパク質に結合させていない、遊離型のものも作製した。 Regarding PRL16-antigen, LongPRL16-antigen (containing the 21st amino acid sequence from the N-terminal of the Aβ sequence) and its unmodified native16-antigen are used for the purpose of producing more specific antibodies. Was made. Peptides used for all antigens were also made free, not bound to a carrier protein.
（抗体の取得）
実施例１で作製した抗原のうち、ＰＲＬ１６−ａｎｔｉｇｅｎ（ＫＬＨ）あるいはＰＲＬ２８−ａｎｔｉｇｅｎ（ＫＬＨ）の２種の抗原をそれぞれ完全アジュバンド（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ， ＦＣＡ）と共に、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢）に腹腔内投与し、初回免疫を行った。その後、隔週にて不完全アジュバンド（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ，ＦＩＡ）と共に追加免疫を行った。具体的には以下のように実施した。
(Acquisition of antibody)
Of the antigens prepared in Example 1, two types of antigens, PRL16-antigen (KLH) or PRL28-antigen (KLH), together with complete adjuvant (Freund's complete adjuvant, FCA), female BALB / c mice ( 6 weeks old) was intraperitoneally administered and the first immunization was performed. Then, every two weeks, booster immunization was performed with incomplete adjuvant (FIA). Specifically, it was carried out as follows.
（１）マウス腹腔内投与による免疫
初回免疫は、ＰＲＬ１６−ＫＬＨ（１ｍｇ／ｍｌ）あるいはＰＲＬ２８−ＫＬＨ（１ｍｇ／ｍｌ）１５０μｌ＋リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）３５０ μｌ＋ＦＣＡ ５００μｌにてエマルジョン形成させ、２００μｌ／匹にて腹腔内投与した。追加免疫は、初回免疫の2週間後より行った。ＰＲＬ１６−ＫＬＨ（１ｍｇ／ｍｌ）あるいはＰＲＬ２８−ＫＬＨ（１ｍｇ／ｍｌ）１５０μｌ＋ＰＢＳ ３５０μｌ＋ＦＩＡ ５００μｌにてエマルジョン形成させ、２００μｌ／匹にて隔週で腹腔内投与した。
(1) Immunization by intraperitoneal administration of mice The initial immunization was carried out by forming an emulsion with PRL16-KLH (1 mg / ml) or PRL28-KLH (1 mg / ml) 150 μl + phosphate buffered saline (PBS) 350 μl + FCA 500 μl, and 200 μl Per mouse. Booster immunization was performed 2 weeks after the first immunization. Emulsion was formed with PRL16-KLH (1 mg / ml) or PRL28-KLH (1 mg / ml) 150 μl + PBS 350 μl + FIA 500 μl and intraperitoneally administered at 200 μl / animal every other week.
尾静脈より血液を採取し、ＥＬＩＳＡ法にて各種抗原（ｎａｔｉｖｅ ＢＳＡ、ＰＲＬ−ＢＳＡ（ＢＳＡを直接ＰＲＬ化した抗原）、Ｎａｔｉｖｅ１６−ＢＳＡ、ＰＲＬ１６−ＢＳＡ、ＬｏｎｇＰＲＬ１６−ＢＳＡ、ＰＲＬ２８−ＢＳＡ）に対する抗体価の上昇を経時的に確認した。すなわち、各追加免疫を行った一週間後にマウス尾静脈より採血を行い、遠心処理にて得られた血清を一次抗体として使用したＥＬＩＳＡ法により、各種抗原に対する抗体価を検討した。なお、ＥＬＩＳＡ法は以下のように実施した。 Blood was collected from the tail vein, and antibody titers against various antigens (native BSA, PRL-BSA (antigen obtained by directly converting BSA into PRL), Native16-BSA, PRL16-BSA, LongPRL16-BSA, PRL28-BSA) by ELISA Was confirmed over time. That is, one week after each booster immunization, blood was collected from the mouse tail vein, and antibody titers against various antigens were examined by ELISA using serum obtained by centrifugation as a primary antibody. The ELISA method was performed as follows.
（１）Ｃｏａｔｉｎｇ（９６ｗｅｌｌプレートへの抗原の固相）：
Ｎａｔｉｖｅ ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、ＰＲＬ−ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、Ｎａｔｉｖｅ１６−ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、ＬｏｎｇＰＲＬ１６−ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、ＰＲＬ１６−ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、ＰＲＬ２８−ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳにて０．５ μｇ／ｍｌに希釈し、９６ｗｅｌｌプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌずつ散布した。その後、４℃下で一晩、静置した。
（２）洗浄：０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ（ＴＰＢＳ）２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（３）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ：
粉末ブロックエースを超純水にて１％溶液を作製し、２００μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。その後、３７℃にて１時間、保温した。
（４）洗浄：ＴＰＢＳ２００ μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（５）一次抗体：
抗体価を測定したい血清あるいは、ハイブリドーマ培養上清、精製抗体をＴＰＢＳにて１０００倍希釈したものから、３倍ずつ段階希釈し、それぞれの希釈液を１００μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。その後、３７℃にて１時間、保温した。
（６）洗浄：ＴＰＢＳ２００ μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（７）二次抗体：
Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体をＴＰＢＳにて５０００倍希釈し、１００μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。その後、３７℃にて１時間、保温した。
（８）洗浄：ＴＰＢＳ ２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（９）発色及び測定：
３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）発色溶液［１％ＴＭＢ：４０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）：３０％Ｈ２Ｏ２＝５０：５０００：２の比率で混ぜた混合液］を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ散布することで発色させた。１０分間、室温下で発色させた後、１Ｎリン酸（１００μｌ／ｗｅｌｌ）にて停止させ、４５０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダーにて測定した。
(1) Coating (solid phase of antigen on 96-well plate):
Native BSA (1 mg / ml), PRL-BSA (1 mg / ml), Native16-BSA (1 mg / ml), LongPRL16-BSA (1 mg / ml), PRL16-BSA (1 mg / ml), PRL28-BSA (1 mg / ml) ml) was diluted to 0.5 μg / ml with PBS and sprayed on a 96-well plate at 100 μl / well. Then, it left still at 4 degreeC overnight.
(2) Washing: Washed 3 times with 0.05 μTween-containing PBS (TPBS) 200 μl / well.
(3) Blocking:
A 1% solution of powder block ace was prepared with ultrapure water and sprayed at 200 μl / well. Then, it kept warm at 37 degreeC for 1 hour.
(4) Washing: Washed 3 times with TPBS 200 μl / well.
(5) Primary antibody:
Serum to be measured for antibody titer, hybridoma culture supernatant, and purified antibody diluted 1000-fold with TPBS were serially diluted 3 times, and each diluted solution was sprayed at 100 μl / well. Then, it kept warm at 37 degreeC for 1 hour.
(6) Washing: Washed 3 times with TPBS 200 μl / well.
(7) Secondary antibody:
Horseradish peroxidase (HRP) -labeled anti-mouse IgG antibody was diluted 5000 times with TPBS and sprayed at 100 μl / well. Then, it kept warm at 37 degreeC for 1 hour.
(8) Washing: Washed 3 times with TPBS 200 μl / well.
(9) Color development and measurement:
3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) coloring solution [1% TMB: 40 mM citrate phosphate buffer (pH 5.0): 30% H 2 O 2 = 50: 5000: 2 The mixture was sprayed at 100 μl / well to develop color. After developing the color for 10 minutes at room temperature, it was stopped with 1N phosphoric acid (100 μl / well), and the absorbance at 450 nm was measured with a plate reader.
抗体価の上昇を確認後、屠殺し、脾臓を摘出する３日前にＰＲＬ１６−ＫＬＨ抗原＋滅菌ＰＢＳ懸濁液あるいはＰＲＬ２８−ＫＬＨ抗原＋滅菌ＰＢＳ懸濁液を尾静脈へ投与することで最終免疫を行い、屠殺し脾臓を摘出した。 After confirming the increase in the antibody titer, the final immunization is performed by administering PRL16-KLH antigen + sterile PBS suspension or PRL28-KLH antigen + sterile PBS suspension to the tail vein 3 days before sacrifice and removal of the spleen. And sacrificed to remove the spleen.
（２）ハイブリドーマ細胞の樹立
次いで、各抗原を免疫したマウス血清中において、ＰＲＬ１６−ＢＳＡ及びＬｏｎｇＰＲＬ１６−ＢＳＡに対する抗体価を有するマウスからはＰＲＬ１６−アミロイドβ抗体を、ＰＲＬ２８−ＢＳＡに対する抗体価を有するマウスからはＰＲＬ２８−アミロイドβ抗体の樹立を行った。すなわち、半永続的に培養維持が可能なミエローマ細胞と各マウスから得られる脾臓細胞との融合を行うことで、抗体を半永続的に産生し続けることが可能なハイブリドーマ細胞を樹立した。具体的には以下のように実施した。
(2) Establishment of hybridoma cells Next, in the sera of mice immunized with each antigen, PRL16-amyloid β antibody was selected from mice having antibody titers against PRL16-BSA and LongPRL16-BSA, and mice having antibody titers against PRL28-BSA Established PRL28-amyloid β antibody. That is, hybridoma cells capable of semipermanently producing antibodies were established by fusing myeloma cells that can be maintained semipermanently with spleen cells obtained from each mouse. Specifically, it was carried out as follows.
屠殺したマウスの脾臓から脾臓細胞を調製し、ミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）とポリエチレングリコール１５００を介して融合させた。その後、ＨＡＴ培地を用いて融合後の細胞を培養することで、ハイブリドーマとなった細胞のみを選択した。ＨＡＴ培地中では、アミノプテリンがｄｅ ｎｏｖｏ経路を介するＤＮＡ合成経路を阻害し、サルベージ経路でのＤＮＡ合成を進めるため、サルベージ経路に必要なhypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase（ＨＧＰＲＴ）を欠損するＰ３Ｕ１ではｄｅ ｎｏｖｏ経路に依存したＤＮＡ合成ができず、増殖・生存ができない。しかしながら、脾臓細胞自体はこのＨＧＰＲＴを有するため、脾臓細胞と融合したミエローマ細胞、つまりは、ハイブリドーマ細胞はＨＡＴ培地中においてＤＮＡ合成が行え、生存できる。このようにしてＨＡＴ培地での選別後、培養上清を用いたＥＬＩＳＡを行うことで、目的の抗体を産生しているハイブリドーマのみを選択した。なお、ＥＬＩＳＡは既述のＥＬＩＳＡ法プロトコールに従って行った。 Spleen cells were prepared from the spleens of sacrificed mice and fused with myeloma cells (P3U1) via polyethylene glycol 1500. Thereafter, the cells after the fusion were cultured using HAT medium, so that only the cells that became hybridomas were selected. In HAT medium, aminopterin inhibits the DNA synthesis pathway via the de novo pathway and advances DNA synthesis in the salvage pathway. Therefore, P3U1 lacking hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase (HGPRT) required for the salvage pathway is de novo It cannot synthesize DNA depending on the pathway, and cannot grow or survive. However, since spleen cells themselves have this HGPRT, myeloma cells fused with spleen cells, that is, hybridoma cells can synthesize DNA in HAT medium and survive. Thus, after selection with the HAT medium, ELISA using the culture supernatant was performed to select only the hybridoma producing the target antibody. The ELISA was performed according to the ELISA protocol described above.
これら細胞の選別（スクリーニング、クローニング）を繰り返すことで単一のクローンとして当該抗体産生株として樹立した。ＰＲＬ１６−Ａβに対する特異抗体産生クローンとしては「ＢＳＴ３１」と、ＰＲＬ２８−Ａβに対する特異抗体産生クローンとしては「３Ａ１１」と命名した。以下抗体としては、ｍＡｂＢＳＴ３１、ｍＡｂ３Ａ１１とした。 By repeating the selection (screening and cloning) of these cells, the antibody-producing strain was established as a single clone. The specific antibody-producing clone against PRL16-Aβ was named “BST31”, and the specific antibody-producing clone against PRL28-Aβ was named “3A11”. Hereinafter, mAbBST31 and mAb3A11 were used as antibodies.
なお、本クローンの樹立に関して、細胞融合を行った後のＥＬＩＳＡにおけるスクリーニング時にＰＲＬ１６−ＢＳＡだけでなく、ＬｏｎｇＰＲＬ１６−ＢＳＡを並行してスクリーニングを行うことで、ＰＲＬ１６−ＢＳＡのみでのスクリーニングでは認められたＰＲＬ２８−ＢＳＡにも交差性を有してしまう非特異的な抗体のセレクションが排除された。また、それだけでなく、アミロイドβのアミノ酸配列をより多く有するペプチド中のリジン残基のＰＲＬ化を認識できることから、より「アミロイドβ配列中における１６番目リジン残基のＰＲＬ化」に対して特異性の高い抗体の樹立へとつながったといえる。 In addition, regarding the establishment of this clone, not only PRL16-BSA but also LongPRL16-BSA was screened in parallel during screening in ELISA after cell fusion, which was recognized in screening with PRL16-BSA alone. The selection of non-specific antibodies that also have cross-reactivity to PRL28-BSA was eliminated. Moreover, since it can recognize PRL of a lysine residue in a peptide having a larger amino acid sequence of amyloid β, it is more specific for “PRL of the 16th lysine residue in the amyloid β sequence”. It can be said that this has led to the establishment of high-antibody antibodies.
（３）プロテインＧカラムによる各抗体の精製
抗体産生ハイブリドーマ細胞の培養上清からプロテインＧカラムを用いたアフィニティー精製により抗体を精製した。各抗体を精製後、タンパク質の定量を行い、抗体濃度として１ｍｇ／ｍｌの濃度にて調製し、−３０℃あるいは−８０℃下で保存した。なお、アフィニティークロマトグラフィーは以下のようにペリスタポンプあるいは手動にて実施した。
(3) Purification of each antibody using protein G column Antibodies were purified from the culture supernatant of antibody-producing hybridoma cells by affinity purification using a protein G column. After purification of each antibody, protein was quantified, and the antibody concentration was adjusted to 1 mg / ml and stored at -30 ° C or -80 ° C. Affinity chromatography was performed by a peristaltic pump or manually as follows.
（１）超純水でラインを流しながら、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムを接続し平衡化した。
（２）０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（ＰＢ）に置換し、２０分、平衡化した。
（３）０．０２Ｍ ＰＢにて平衡化後、培養上清へとカラムを置換し、培養上清すべてをカラムに通した。
（４）培養上清をカラムに流し終えた後、０．０２Ｍ ＰＢにて２０分、洗浄した。
（５）洗浄中に１．５ｍｌのチューブ５本分に１Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液を７５μｌ加えておいた。
（６）０．０２Ｍ ＰＢにて洗浄後、０．１Ｍ Ｇｌｙｓｉｎｅ／ＨＣｌ（ｐＨ２．５）にて溶出した。溶出液は、上記１Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液入り１．５ｍｌチューブにそれぞれ１ｍｌずつ回収した（合計５本分の画分として回収）。
（７）各画分のタンパク質含量をＢＣＡ ａｓｓａｙにて測定し、抗体溶出画分を判別した。
（８）抗体溶出画分を回収し、４℃にてＰＢＳに対して透析を２日間行い、１ｍｇ／ｍｌに濃度を調製し、−３０℃あるいは−８０℃に保存した。
(1) While flowing the line with ultrapure water, a Protein G column was connected and equilibrated.
(2) It was replaced with 0.02M phosphate buffer (pH 7.0) (PB) and equilibrated for 20 minutes.
(3) After equilibration with 0.02M PB, the column was replaced with the culture supernatant, and the entire culture supernatant was passed through the column.
(4) After flowing the culture supernatant through the column, it was washed with 0.02M PB for 20 minutes.
(5) 75 μl of 1M Tris aqueous solution was added to five 1.5 ml tubes during washing.
(6) After washing with 0.02 M PB, elution was performed with 0.1 M Glycine / HCl (pH 2.5). 1 ml each of the eluate was collected in the 1.5 ml tube containing the 1M Tris aqueous solution (collected as a total of 5 fractions).
(7) The protein content of each fraction was measured by BCA assay, and the antibody elution fraction was discriminated.
(8) The antibody elution fraction was collected, dialyzed against PBS at 4 ° C for 2 days, adjusted to a concentration of 1 mg / ml, and stored at -30 ° C or -80 ° C.
（樹立したモノクローナル抗体ｍＡｂＢＳＡ３１及びｍＡｂ３Ａ１１の特異性解析）
（１）間接ＥＬＩＳＡ法による検討
精製したモノクローナル抗体を使用して、各抗原に対する交差性を検証した。ｍＡｂＢＳＴ３１に関しては、ｎａｔｉｖｅ ＢＳＡ、ＰＲＬ−ＢＳＡ、Ｎａｔｉｖｅ１６−ＢＳＡ、ＰＲＬ１６−ＢＳＡ、ＬｏｎｇＰＲＬ１６−ＢＳＡ、ＰＲＬ２８−ＢＳＡを使用し、ｍＡｂ３Ａ１１に関しては、Ｎａｔｉｖｅ ＢＳＡ、ＰＲＬ−ＢＳＡ、ＰＲＬ１６−ＢＳＡ、ＰＲＬ２８−ＢＳＡを用いて、既述のＥＬＩＳＡ法プロトコールに従い行った。その結果、ｍＡｂＢＳＴ３１は、ＰＲＬ１６−ＢＳＡに加え、ＬｏｎｇＰＲＬ１６−ＢＳＡの２種に対してのみ交差することが認められ、さらにＬｏｎｇＰＲＬ１６−ＢＳＡに対してより強く反応していることが認められた。そのため、よりアミノ酸残基の長く、アミロイドβのおおよそ半分の２１残基を含有するＬｏｎｇＰＲＬ１６−ＢＳＡ（０．５μｇ／ｍｌ、１００μl／ｗｅｌｌ）を競合ＥＬＩＳＡのＣｏａｔｉｎｇ時の抗原として使用することにした。ｍＡｂＢＳＴ３１の抗体濃度としては、０．２μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ｗｅｌｌにて用いることにした。ｍＡｂ３Ａ１１においては、ＰＲＬ２８−ＢＳＡに対してのみ交差性が認められた。よって、Ｃｏａｔｉｎｇ時の抗原としてはＰＲＬ２８−ＢＳＡ（０．５μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ｗｅｌｌ）を使用し、ｍＡｂ３Ａ１１の抗体の濃度として０．１μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ｗｅｌｌにて競合ＥＬＩＳＡに使用することにした。
(Specificity analysis of established monoclonal antibodies mAbBSA31 and mAb3A11)
(1) Examination by indirect ELISA method Purified monoclonal antibodies were used to verify the cross-reactivity to each antigen. For mAbBST31, native BSA, PRL-BSA, Native16-BSA, PRL16-BSA, LongPRL16-BSA, PRL28-BSA are used, and for mAb3A11, Native BSA, PRL-BSA, PRL16-BSA, PRL28-BSA are used. The ELISA method protocol described above was performed. As a result, mAb BST31 was observed to cross only two types of LongPRL16-BSA in addition to PRL16-BSA, and further, it was recognized that it reacted more strongly with LongPRL16-BSA. Therefore, it was decided to use LongPRL16-BSA (0.5 μg / ml, 100 μl / well), which has a longer amino acid residue and contains approximately 21 residues of amyloid β, as an antigen during the coating of competitive ELISA. The antibody concentration of mAb BST31 was 0.2 μg / ml and 50 μl / well. In mAb3A11, the cross property was recognized only with respect to PRL28-BSA. Therefore, PRL28-BSA (0.5 μg / ml, 100 μl / well) is used as an antigen during coating, and the antibody concentration of mAb3A11 is 0.1 μg / ml, 50 μl / well. did.
（２）競合ＥＬＩＳＡ法による検討
作製した抗体の特異性を検証する実験として競合ＥＬＩＳＡがある。競合ＥＬＩＳＡは、抗体とプレート上にある抗原と、さらに競合物質とを共存させることで、抗体がプレート上の抗原と交差することを競合物質が阻害するかどうかで抗体とその競合物質との交差性を検討できる実験である。用いた各抗原と抗体の条件は、前述の通りであり、以下のＥＬＩＳＡ法プロトコールに従って行った。結果を図３及び図４に示す。
(2) Examination by competitive ELISA method There is a competitive ELISA as an experiment for verifying the specificity of the prepared antibody. In the competitive ELISA, an antibody, its antigen on the plate, and a competitor are also allowed to coexist, so that the competitor crosses the antigen on the plate. It is an experiment that can examine the sex. The conditions of each antigen and antibody used were as described above, and were performed according to the following ELISA method protocol. The results are shown in FIGS.
（１）Ｃｏａｔｉｎｇ（９６ｗｅｌｌプレートへの抗原の固相）：
ｍＡｂＢＳＴ３１を使用した競合ＥＬＩＳＡの場合：ＬｏｎｇＰＲＬ１６−ＢＳＡ（０．５μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ｗｅｌｌ）、
ｍＡｂ３Ａ１１を使用した競合ＥＬＩＳＡの場合：ＰＲＬ２８−ＢＳＡ（０．５μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ｗｅｌｌ）にて、９６ｗｅｌｌプレートに散布した。その後、４℃下で一晩、静置した。
（２）洗浄：ＴＰＢＳ２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（３）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ：
粉末ブロックエースを超純水にて１％溶液を作製し、２００ μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。その後、３７℃にて１時間、保温した。
（４）洗浄：ＴＰＢＳ ２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（５）一次抗体：以下に挙げるペプチドを、各抗体と同時に加えた。
ｍＡｂＢＳＴ３１：ＰＲＬ１６−ｐｅｐｔｉｄｅ、ＰＲＬ２８−ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｌｏｎｇ１６−ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｎａｔｉｖｅ１６−ｐｅｐｔｉｄｅ（各抗原のキャリアタンパク質が結合していない遊離型のペプチド）を、５００ｎＭを上限としてＴＰＢＳにて３段階希釈したものを競合物質として５０μｌ／ｗｅｌｌにて加えた。
ｍＡｂ３Ａ１１：ＰＲＬ１６−ｐｅｐｔｉｄｅ、ＰＲＬ２８−ｐｅｐｔｉｄｅを、５０ｎＭを上限としてＴＰＢＳにて３段階希釈したものを競合物質として５０μｌ／ｗｅｌｌにて加えた。両者ともに、その後、４℃下で一晩、静置した。
（６）洗浄：ＴＰＢＳ ２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（７）二次抗体：
Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体をＴＰＢＳにて５０００倍希釈し、１００μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。その後、３７℃にて１時間、保温した。
（８）洗浄：ＴＰＢＳ ２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（９）発色及び測定：
３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）発色溶液［１％ＴＭＢ：４０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）：３０％Ｈ２Ｏ２＝５０：５０００：２の比率で混ぜた混合液］を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ散布することで発色させた。２０分間、室温下で発色させた後、１Ｎリン酸（１００μｌ／ｗｅｌｌ）にて停止させ、４５０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダーにて測定した。
(1) Coating (solid phase of antigen on 96-well plate):
For competitive ELISA using mAbBST31: LongPRL16-BSA (0.5 μg / ml, 100 μl / well),
In the case of competitive ELISA using mAb3A11: PRL28-BSA (0.5 μg / ml, 100 μl / well) was spread on a 96-well plate. Then, it left still at 4 degreeC overnight.
(2) Washing: Washed 3 times with TPBS 200 μl / well.
(3) Blocking:
A 1% solution of powder block ace was prepared with ultrapure water and sprayed at 200 μl / well. Then, it kept warm at 37 degreeC for 1 hour.
(4) Washing: Washed 3 times with TPBS 200 μl / well.
(5) Primary antibody: The following peptides were added simultaneously with each antibody.
mAbBST31: PRL16-peptide, PRL28-peptide, Long16-peptide, Native16-peptide (free peptide to which each antigen's carrier protein is not bound) diluted to 500nM in 3 steps with TPBS as a competitor As 50 μl / well.
mAb3A11: PRL16-peptide and PRL28-peptide were diluted in three steps with TPBS up to 50 nM as an upper limit, and added as a competitor at 50 μl / well. Both were then allowed to stand overnight at 4 ° C.
(6) Washing: Washed 3 times with 200 μl / well of TPBS.
(7) Secondary antibody:
Horseradish peroxidase (HRP) -labeled anti-mouse IgG antibody was diluted 5000 times with TPBS and sprayed at 100 μl / well. Then, it kept warm at 37 degreeC for 1 hour.
(8) Washing: Washed 3 times with TPBS 200 μl / well.
(9) Color development and measurement:
3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) coloring solution [1% TMB: 40 mM citrate phosphate buffer (pH 5.0): 30% H 2 O 2 = 50: 5000: 2 The mixture was sprayed at 100 μl / well to develop color. The color was developed for 20 minutes at room temperature, then stopped with 1N phosphoric acid (100 μl / well), and the absorbance at 450 nm was measured with a plate reader.
図３に示すように、ｍＡｂＢＳＴ３１は、Ｎａｔｉｖｅ１６−ｐｅｐｔｉｄｅおよびＰＲＬ２８−ｐｅｐｔｉｄｅとは交差せず、ＰＲＬ１６−ｐｅｐｔｉｄｅおよびＬｏｎｇＰＲＬ１６−ｐｅｐｔｉｄｅに対してのみ交差し、なかでもＬｏｎｇＰＲＬ１６−ｐｅｐｔｉｄｅに対してより強く交差する抗体であることが認められた。また、図４に示すように、ｍＡｂ３Ａ１１に関しては、ＰＲＬ１６−ｐｅｐｔｉｄｅには交差せず、ＰＲＬ２８−ｐｅｐｔｉｄｅに対してのみ交差する抗体であることが認められた。以上のことから、これら抗体は、アミロイドβ配列中のＰＲＬ化を部位特異的に検出することが可能な抗体であると認められた。 As shown in FIG. 3, mAbBST31 does not cross Native16-peptide and PRL28-peptide, but only crosses PRL16-peptide and LongPRL16-peptide, and more specifically crosses longer PRL16-peptide. It was confirmed that Moreover, as shown in FIG. 4, it was recognized that mAb3A11 is an antibody that does not cross PRL16-peptide but only crosses PRL28-peptide. From the above, these antibodies were recognized as antibodies capable of site-specific detection of PRL formation in the amyloid β sequence.
（各抗体の高感度化のためのｂｉｏｔｉｎ化）
ｂｉｏｔｉｎは、卵黄中から発見された低分子で、卵白中のａｖｉｄｉｎと強力な非共有結合を形成する性質を有する。そのため、このｂｉｏｔｉｎを抗体に複数結合させることで、ｂｉｏｔｉｎ化された抗体に多くのａｖｉｄｉｎが結合させることができ、ａｖｉｄｉｎを介した検出感度の増加が可能となる。よって、ｍＡｂＢＳＴ３１およびｍＡｂ３Ａ１１のｂｉｏｔｉｎ標識を行った。なお、ｂｉｏｔｉｎ標識の確認は、抗体の検出に用いるプローブをＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用することで行った。
(Biotinization for high sensitivity of each antibody)
Biotin is a small molecule discovered in egg yolk and has the property of forming a strong non-covalent bond with avidin in egg white. Therefore, by binding a plurality of biotins to the antibody, a large amount of avidin can be bound to the biotinylated antibody, and the detection sensitivity via avidin can be increased. Therefore, biotin labeling of mAbBST31 and mAb3A11 was performed. Biotin labeling was confirmed by using Streptavidin-HRP (BD Biosciences) as a probe used for antibody detection.
（１）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６−（ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ（ＥＺ−ｌｉｎｋ ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）０．００２３ｇを５００μｌ Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ（ＤＭＦ）に溶解させた（Ｂｉｏｔｉｎ化試薬）。
（２）ｍＡｂＢＳＴ３１およびｍＡｂ３Ａ１１を各々２ｍｇ（ＰＢＳ溶液中）に対して上記のＢｉｏｔｉｎ化試薬２７μｌ添加した。
（３）氷上で２時間静置した。
（４）ＰＢＳ１ Ｌに対してセロハン膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ７ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＭＷＣＯ １００００、ＳＰＥＣＴＲＵＭ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）を用いて２日間、透析を行った。
（５）ＢＣＡ ａｓｓａｙによりタンパク濃度を測定し、ｍＡｂＢＳＴ３１は０．８ｍｇ／ｍｌ、ｍＡｂ３Ａ１１は０．５ｍｇ／ｍｌに調製し、−３０℃に保存した。
(1) Succinimidyl-6- (biotinamido) hexanoate (EZ-link NHS-LC-Biotin, Thermo Fisher) 0.0023 g was dissolved in 500 μl N, N-dimethylformamide (DMF) (Biotinization reagent).
(2) 27 μl of the above biotin reagent was added to 2 mg (in PBS solution) of mAb BST31 and mAb 3A11.
(3) It left on ice for 2 hours.
(4) Dialysis was carried out against PBS1 L using a cellophane membrane (Spectra / Por 7 Dialysis Membrane MWCO 10000, SPECTRUM LABORATORIES) for 2 days.
(5) Protein concentration was measured by BCA assay, mAbBST31 was prepared at 0.8 mg / ml, and mAb3A11 was prepared at 0.5 mg / ml and stored at −30 ° C.
（ｍＡｂＢＳＴ３１を用いた競合ＥＬＩＳＡ定量法の構築）
Ｂｉｏｔｉｎ標識ｍＡｂ３Ａ１１を基盤とした競合ＥＬＩＳＡにより、ＰＲＬ１６-Aβの定量法を構築した。様々な条件検討の結果、以下のようなプロトコールを開発した。これにより作成した検量線を図５に示す。
(Construction of competitive ELISA assay using mAbBST31)
A quantification method for PRL16-Aβ was constructed by competitive ELISA based on Biotin-labeled mAb3A11. As a result of studying various conditions, the following protocol was developed. The calibration curve thus created is shown in FIG.
（競合ＥＬＩＳＡ-ＰＲＬ１６-アミロイドβの定量法）
なお、本定量法においては、９６Ｆ ＭＡＸＩＳＯＲＰ ＢＬＡＣＫ ＭＩＣＲＯＷＥＬＬ、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＰｉｅｒｃｅTM Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）ＥＬＩＳＡ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。
(Quantitative method for competitive ELISA-PRL16-amyloid β)
In the present assay, 96F MAXISORP BLACK MICROWELL, StartingBlock TM (PBS) Blocking Buffer (Thermo Fisher Scientific) and Pierce TM High Sensitivity Streptavidin-HRP ( Pierce), SuperSignal ( TM) ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher Scientific) was used.
（手順）
（１）Ｃｏａｔｉｎｇ（９６ｗｅｌｌプレートへの抗原の固相）：
ＬｏｎｇＰＲＬ１６−ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳにて５０００００倍に希釈し、９６Ｆ ＭＡＸＩ ＳＯＲＰ ＢＬＡＣＫ ＭＩＣＲＯＷＥＬＬの各ｗｅｌｌに１００μｌずつ散布した。その後、４℃下にて一晩、静置した。
（２）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて５回洗浄した。
（３）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ：
ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを２００μｌ／ｗｅｌｌにて散布し、室温にて３０分間、静置した。
（４）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて５回洗浄した。
（５）競合反応：
・競合物質の調製（検量線作成用）
ＬｏｎｇＰＲＬ１６−Ｐｅｐｔｉｄｅ
ＴＰＢＳにて１０００ｎＭに調製し、これを上限として１０倍ずつ段階希釈した。９６ｗｅｌｌには５０μｌ／ｗｅｌｌにて添加した。
・ヒト髄液は原液をそのまま５０μｌ／ｗｅｌｌにて添加した。
・一次抗体の調製
ｍＡｂＢＳＴ３１−ｂｉｏｔｉｎ（０．８ｍｇ／ｍＬ）をＴＰＢＳにて５００００倍に希釈して用いた。
以上の調製液を９６ｗｅｌｌプレートに加える際は、競合物質（ＬｏｎｇＰＲＬ１６−ｐｅｐｔｉｄｅ）あるいはヒト髄液を先に添加し、その後に一次抗体を添加した。
以上の添加後、４℃下にて一晩、静置した。
（６）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて５回洗浄した。
（７）二次抗体：
ＰｉｅｒｃｅTM Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰをＴＰＢＳにて１０００００倍希釈し、１００μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。
その後、３７℃下にて１時間、保温した。
（８）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて５回洗浄した。
（９）化学発光：
ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）ＥＬＩＳＡ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを１００μｌ／ｗｅｌｌにて添加し、化学発光させ、添加後１分の発光強度をプレートリーダーにて測定した。
(procedure)
(1) Coating (solid phase of antigen on 96-well plate):
LongPRL16-BSA (1 mg / ml) was diluted 500,000 times with PBS, and 100 μl was sprayed on each well of 96F MAXI SORP BLACK MICROWELL. Then, it left still at 4 degreeC overnight.
(2) Washing: Washed 5 times with 200 μl / well of TPBS solution.
(3) Blocking:
StartingBlock ™ (PBS) Blocking Buffer was sprayed at 200 μl / well and allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
(4) Washing: Washed 5 times with 200 μl / well of TPBS solution.
(5) Competitive reaction:
・ Preparation of competitive substances (for creating calibration curves)
LongPRL16-Peptide
The solution was adjusted to 1000 nM with TPBS, and this was serially diluted 10-fold with the upper limit. 96 well was added at 50 μl / well.
・ Human spinal fluid was directly added at 50 μl / well.
-Preparation of primary antibody mAbBST31-biotin (0.8 mg / mL) was diluted 50000 times with TPBS and used.
When the above preparation solution was added to the 96-well plate, the competitor (LongPRL16-peptide) or human cerebrospinal fluid was added first, followed by the primary antibody.
After the above addition, the mixture was allowed to stand overnight at 4 ° C.
(6) Washing: Washed 5 times with 200 μl / well of TPBS solution.
(7) Secondary antibody:
Pierce ™ High Sensitivity Streptavidin-HRP was diluted 100000 times with TPBS and sprayed at 100 μl / well.
Then, it kept warm at 37 degreeC for 1 hour.
(8) Washing: Washed 5 times with 200 μl / well of TPBS solution.
(9) Chemiluminescence:
SuperSignal (registered trademark) ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate was added at 100 μl / well to cause chemiluminescence, and the luminescence intensity for 1 minute after the addition was measured with a plate reader.
（ｍＡｂ３Ａ１１を用いた競合ＥＬＩＳＡ定量法の構築）
Ｂｉｏｔｉｎ標識ｍＡｂ３Ａ１１を基盤とした競合ＥＬＩＳＡにより、ＰＲＬ２８−Ａβの定量法を構築した。様々な条件検討の結果、以下のようなプロトコールを開発した。これにより作成した検量線を図６に示す。
(Construction of competitive ELISA assay using mAb3A11)
A quantification method for PRL28-Aβ was constructed by competitive ELISA based on Biotin-labeled mAb3A11. As a result of studying various conditions, the following protocol was developed. The calibration curve thus created is shown in FIG.
（競合ＥＬＩＳＡ−ＰＲＬ２８アミロイドβの定量法）
なお、この定量法では、Ｆ９６ ＣＥＲＴ ＭＡＸＩＳＯＲＰ ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ ＰＬＡＴＥ、Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ Ｐｏｗｄｅｒ（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）、ＰｉｅｒｃｅTM Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた。
(Quantitative method of competitive ELISA-PRL28 amyloid β)
In this quantification method, F96 CERT MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE, Block Ace Powder (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.), and Pierce ™ High Sensitivity Strepvidin-HRP (Pierce) were used.
（１）Ｃｏａｔｉｎｇ（９６ｗｅｌｌプレートへの抗原の固相）：
ＰＲＬ２８−ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳにて８０００倍に希釈し、９６ｗｅｌｌプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌずつを散布した。その後、４℃下にて一晩、静置した。
（２）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（３）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ：
Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ ｐｏｗｄｅｒを超純水にて１％溶液を作製し、２００ μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。その後、３７℃下にて１時間、保温した。
（４）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（５）競合反応：
・競合物質の調製（検量線作成用）
ＰＲＬ２８−Ｐｅｐｔｉｄｅ
ＴＰＢＳにて２８０ｎＭに調製し、これを上限として３倍ずつ段階希釈した。９６ｗｅｌｌには５０μｌ／ｗｅｌｌにて添加した。
・ヒト髄液は原液をそのまま５０μｌ／ｗｅｌｌにて添加した。
・一次抗体の調製
ｍＡｂ３Ａ１１−ｂｉｏｔｉｎ（０．５ｍｇ／ｍＬ）をＴＰＢＳにて４００００倍に希釈して用いた。
以上の調製液を９６ｗｅｌｌプレートに加える際は、競合物質（ＰＲＬ２８−ｐｅｐｔｉｄｅ）あるいはヒト髄液を先に添加し、その後に一次抗体を添加した。
以上の添加後、４℃下にて一晩、静置した。
（６）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（７）二次抗体：
ＰｉｅｒｃｅTM Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰをＴＰＢＳにて２００００倍希釈し、１００μｌ／ｗｅｌｌにて散布した。その後、３７℃下にて１時間、保温した。
（８）洗浄：ＴＰＢＳ溶液２００μｌ／ｗｅｌｌにて３回洗浄した。
（９）発色及び測定：
ＴＭＢ発色溶液［１％ＴＭＢ：４０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）：３０％Ｈ2Ｏ2＝５０：５０００：２の比率で混ぜた混合液］を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ散布することで発色させた。２０分間、室温下で発色させた後、１Ｎリン酸（１００μｌ／ｗｅｌｌ）にて停止させ、４５０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダーにて測定した。
(1) Coating (solid phase of antigen on 96-well plate):
PRL28-BSA (1 mg / ml) was diluted 8000 times with PBS, and 100 μl / well was sprayed onto a 96-well plate. Then, it left still at 4 degreeC overnight.
(2) Washing: Washed 3 times with 200 μl / well of TPBS solution.
(3) Blocking:
A 1% solution of Block Ace powder was prepared with ultrapure water and sprayed at 200 μl / well. Then, it kept warm at 37 degreeC for 1 hour.
(4) Washing: Washed 3 times with 200 μl / well of TPBS solution.
(5) Competitive reaction:
・ Preparation of competitive substances (for creating calibration curves)
PRL28-Peptide
The solution was adjusted to 280 nM with TPBS, and this was serially diluted 3 times with this as the upper limit. 96 well was added at 50 μl / well.
・ Human spinal fluid was directly added at 50 μl / well.
-Preparation of primary antibody mAb3A11-biotin (0.5 mg / mL) was diluted 40000 times with TPBS and used.
When the above preparation solution was added to the 96-well plate, the competitor (PRL28-peptide) or human cerebrospinal fluid was added first, followed by the primary antibody.
After the above addition, the mixture was allowed to stand overnight at 4 ° C.
(6) Washing: Washed 3 times with 200 μl / well of TPBS solution.
(7) Secondary antibody:
Pierce ™ High Sensitiveity Streptavidin-HRP was diluted 20000 times with TPBS and sprayed at 100 μl / well. Then, it kept warm at 37 degreeC for 1 hour.
(8) Washing: Washed 3 times with 200 μl / well of TPBS solution.
(9) Color development and measurement:
By spraying 100 μl / well of TMB coloring solution [1% TMB: 40 mM citrate phosphate buffer (pH 5.0): mixed solution mixed at a ratio of 30% H 2 O 2 = 50: 5000: 2]. Color was developed. The color was developed for 20 minutes at room temperature, then stopped with 1N phosphoric acid (100 μl / well), and the absorbance at 450 nm was measured with a plate reader.
なお、図６においては、競合物質への抗体の交差反応性はＢ／Ｂ0にて表した。
Ｂ：各濃度の競合物質存在下における吸光度
Ｂ0：競合物質が存在しないｍＡｂ３Ａ１１の吸光度（発色時における最大吸光度）
In FIG. 6, the cross-reactivity of the antibody to the competitor is represented by B / B 0 .
B: Absorbance in the presence of competitor at each concentration B 0 : Absorbance of mAb3A11 without competitor (maximum absorbance during color development)
（ヒト髄液からのＰＲＬ１６−Ａβ及びＰＲＬ２８−Ａβの定量）
実施例５に記載したように、各修飾部位特異抗体を用いて定量可能なＥＬＩＳＡ法を開発した。この２種のプロトコールから作成した検量線を使用し、ヒト髄液中に含まれるＡβの各ＰＲＬ修飾部位の定量を行った。また、ｎｏｎ ＡＤ患者（ＡＤではない患者）とＡＤ患者間での比較を行った。ＰＲＬ１６−Ａβ及びＰＲＬ２８−Ａβの定量値を図７に示す。また、図８に、同じ髄液中におけるＡβ４０及び４２の定量値の比較も示す。
(Quantification of PRL16-Aβ and PRL28-Aβ from human cerebrospinal fluid)
As described in Example 5, an ELISA method capable of quantification using each modified site-specific antibody was developed. Using the calibration curve created from these two protocols, each PRL modification site of Aβ contained in human cerebrospinal fluid was quantified. In addition, comparison was made between non AD patients (patients who are not AD) and AD patients. The quantitative values of PRL16-Aβ and PRL28-Aβ are shown in FIG. FIG. 8 also shows a comparison of quantitative values of Aβ40 and 42 in the same cerebrospinal fluid.
図７に示すように、開発したＥＬＩＳＡ法によるヒト髄液中におけるＡβの各ＰＲＬ化部位の定量をおこなったところ、１６番目のＰＲＬ化Ａβは、ＡＤ患者の髄液中において未修飾Ａβ（４０及び４２）の定量値（図８参照）と同様に対照群（ｎｏｎ ＡＤ）と比べて「減少」するのに対し、２８番目のＰＲＬ化Ａβは、ＡＤ患者髄液中においてむしろ「増加」する値を示した。このような変化を示すことからも、ＡＤのバイオマーカーとして新たに２種の定量法を提案することで、ＡＤの発症機構の解明や、診断における生化学バイオマーカーになりうると考えられ、これら定量法である本発明は新規性の高いものであると考えられた。 As shown in FIG. 7, when the PRL-ized sites of Aβ in human cerebrospinal fluid were quantified by the developed ELISA method, the 16th PRL-converted Aβ was found to be unmodified Aβ (40 And 42) are “decreased” as compared to the control group (non AD) as well as the quantitative values (see FIG. 8), whereas the 28th PRLylated Aβ is rather “increased” in the CSF of AD patients. The value is shown. From these changes, it is thought that by proposing two new quantitative methods as biomarkers for AD, it is possible to elucidate the pathogenesis of AD and become biochemical biomarkers in diagnosis. The present invention, which is a quantitative method, was considered highly novel.
また、髄液中のＰＲＬ−Ａβの存在量に関しては、ＰＲＬ２８−Ａβが２００−６００ｐＭであるのに対し、ＰＲＬ１６−Ａβは１０ｐＭ以下であり、ＰＲＬ１６−Ａβ、ＰＲＬ２８−Ａβ間でヒト髄液中の存在量が大きく異なることが明らかとなった。 Further, regarding the abundance of PRL-Aβ in the cerebrospinal fluid, PRL28-Aβ is 200-600 pM, whereas PRL16-Aβ is 10 pM or less, and between PRL16-Aβ and PRL28-Aβ in human cerebrospinal fluid It became clear that the abundance of was greatly different.
ＡＤ患者では髄液中のＡβ４２が低下し、髄液中のタウが上昇するとされ、これらを組み合わせることで８０％を超える感度・特異度でＡＤの診断が可能（Ｋｎｏｐｍａｎ，ＤＳ； ＤｅＫｏｓｋｙ，ＳＴ； Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，ＪＬ；ｅｔ ａｌ，２００１）であることや、ヒト髄液中でＡβオリゴマー体の中でもある特定の構造をもった毒性オリゴマー体とＡβ４２の比が有意に上昇する［入江一浩、村上一馬、実験医学（羊土社）Vol.35 No.12 p52-59 (2017)。］ことが報告されている。本開示によれば、ＡＤ患者で髄液中のＰＲＬ２８−Ａβが増加していたが、これはＡＤ患者で毒性Ａβオリゴマー／Ａβ４２比が上昇することに類似している。この共通点からも、ＡＤ患者ではＡβ中の２８番目のリジン残基のＰＲＬ化がＡＤ発症の過程で亢進しており、ＡＤ発症の何かしらの要因になっている可能性が推察された。 In AD patients, Aβ42 in cerebrospinal fluid is decreased and tau in cerebrospinal fluid is increased. By combining these, AD can be diagnosed with sensitivity and specificity exceeding 80% (Knopman, DS; DeKosky, ST; Cummings, JL; et al, 2001), and the ratio of Aβ42 to toxic oligomers having a specific structure among Aβ oligomers in human cerebrospinal fluid is significantly increased [Kazuhiro Irie, Kazuma Murakami. , Experimental Medicine (Yodosha) Vol.35 No.12 p52-59 (2017). ] Has been reported. According to the present disclosure, AD patients had an increase in CRL28-Aβ in cerebrospinal fluid, which is similar to an increased toxic Aβ oligomer / Aβ42 ratio in AD patients. Also from this common point, in AD patients, PRL conversion of the 28th lysine residue in Aβ was promoted during the onset of AD, and it was speculated that this may be a factor in the onset of AD.
Claims (10)
アミロイドβ４２の１６位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第１のプロパノイル化アミロイドβと、アミロイドβ４２の２８位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第２のプロパノイル化アミロイドβとのいずれか又は双方を、独立して検出する工程、を備える、方法。 A method for detecting propanoylated amyloid β, comprising:
A first propanoylated amyloid β in which lysine at position 16 of amyloid β42 or a lysine corresponding to the lysine is propanoylated, and a second lysine in position 28 of amyloid β42 or lysine corresponding to the lysine is propanoylated. Independently detecting either or both of the propanoylated amyloid β.
アルツハイマー病に罹患した個体又はアルツハイマー病モデル動物の脊髄液、血液、鼻汁及び鼻粘膜中のアミロイドβ４２の１６位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第１のプロパノイル化アミロイドβと、アミロイドβ４２の２８位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第２のプロパノイル化アミロイドβとのいずれか又は双方を、独立して検出する工程、を備える、方法。 A method for detecting propanoylated amyloid β, comprising:
A first propanoylated amyloid β obtained by propanoylating lysine at position 16 of amyloid β42 in spinal fluid, blood, nasal secretion and nasal mucosa of an individual suffering from Alzheimer's disease or an Alzheimer's disease model animal; , And independently detecting either or both of the lysine at position 28 of amyloid β42 or the second propanoylated amyloid β in which lysine corresponding to the lysine is propanoylated.
アルツハイマー病患者の脊髄液、血液、鼻汁及び鼻粘膜中のアミロイドβ４２の１６位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第１のプロパノイル化アミロイドβと、アミロイドβ４２の２８位のリジン又は当該リジンに相当するリジンがプロパノイル化された第２のプロパノイル化アミロイドβとのいずれか又は双方を、独立して検出する工程、を備える、方法。 A method for detecting amyloid β associated with the diagnosis of Alzheimer's disease,
The first propanoylated amyloid β obtained by propanoylating lysine at position 16 of amyloid β42 or lysine corresponding to the lysine in spinal fluid, blood, nasal fluid and nasal mucosa of Alzheimer's disease patients, and lysine at position 28 of amyloid β42 Or independently detecting either or both of the second propanoylated amyloid β in which lysine corresponding to the lysine is propanoylated.
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