JP2019135930A - METHODS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR TREATING α HERPES VIRUS INFECTION - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、αヘルペスウイルス感染を処置する方法及び医薬組成物に関する。 The present invention relates to methods and pharmaceutical compositions for treating alpha herpesvirus infections.
一般に、ウイルス感染に対する抗ウイルス処置の標的は、ウイルスの複製サイクルの阻止を目的とし、ウイルスのタンパク質が標的となっている。一方、宿主細胞から潜伏感染したウイルスを根絶するための有効な処置は未だ存在していない。潜伏ウイルスによる潜伏感染においては、宿主の免疫作用が回避され、任意の時点でウイルスが再活性化されるため、宿主の生涯にわたる持続的なリスクとなる。潜伏性ウイルスの一例としては、ヘルペスウイルスが挙げられ、ヘルペスウイルスは最も蔓延している病原体の1つである。 In general, antiviral treatment targets against viral infections are aimed at blocking the viral replication cycle and targeted by viral proteins. On the other hand, there is still no effective treatment for eradicating latently infected viruses from host cells. In a latent infection with a latent virus, the host's immunity is avoided and the virus is reactivated at any point of time, creating a persistent risk for the life of the host. An example of a latent virus is a herpes virus, which is one of the most prevalent pathogens.
豚の神経疾患であるオーエスキー病の病原体であるブタヘルペスウイルス1型、水疱瘡の病原体である水痘−帯状疱疹ウイルスなどのαヘルペスに対する現行ワクチンは、いずれも発症予防を目的とするものであり、ウイルスの潜伏感染およびその後の再活性化を防ぐことはできず、疾病の根絶には繋がらない。例えば、特許文献1には、ガイドされたヌクレアーゼシステムを用いてウイルス感染を選択的に処置するための組成物及び方法が記載されている。 Current vaccines against alpha herpes such as porcine herpesvirus type 1 which is a pathogen of Aujeszky's disease, which is a neurological disease of swine, and chickenpox-zoster virus which is a pathogen of chicken pox are for the purpose of preventing the onset, Virus latent infection and subsequent reactivation cannot be prevented and will not lead to eradication of the disease. For example, U.S. Patent No. 6,057,049 describes compositions and methods for selectively treating viral infections using a guided nuclease system.
しかしながら、特許文献1に記載の組成物及び方法では、ヘルペスウイルスの潜伏感染を完全に防ぐことは困難であり、ひとたび潜伏感染が成立するとウイルスの再活性化を抑制することは困難であった。本発明の一態様は、宿主に潜伏感染したαヘルペスウイルスの再活性化を抑制可能な方法を提供することを目的とする。 However, with the composition and method described in Patent Document 1, it is difficult to completely prevent herpes virus latent infection, and once latent infection is established, it is difficult to suppress virus reactivation. An object of one embodiment of the present invention is to provide a method capable of suppressing reactivation of α-herpesviruses latently infected in a host.
第一態様は、αヘルペスウイルスのUL41遺伝子に特異的な配列を有するガイドRNAをコードする塩基配列およびCas9ヌクレアーゼをコードする塩基配列を含む第一の遺伝子を、ウイルス宿主の細胞内に導入することと、該細胞内のUL41遺伝子を、該ガイドRNAの存在下に該Cas9ヌクレアーゼで切断することを含む、αヘルペスウイルス感染を処置する方法である。 In the first aspect, a first gene comprising a nucleotide sequence encoding a guide RNA having a sequence specific to the UL41 gene of α-herpesvirus and a nucleotide sequence encoding a Cas9 nuclease is introduced into a cell of a viral host. And cleaving the UL41 gene in the cell with the Cas9 nuclease in the presence of the guide RNA.
前記方法は、ウイルス宿主におけるαヘルペスウイルスの増殖を抑制する方法であってもよく、αヘルペスウイルスが潜伏感染しているウイルス宿主における潜伏αヘルペスウイルスの再活性化を抑制する方法であってもよい。また前記第一の遺伝子は、ベクターに組み込まれていてもよく、改変ウイルスに組み込まれていてもよい。また前記UL41遺伝子に特異的な配列は、配列番号2から11のいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列を含んでいてもよい。 The method may be a method of suppressing the growth of α-herpesvirus in a viral host, or a method of suppressing the reactivation of latent α-herpesvirus in a virus host that is latently infected with α-herpesvirus. Good. The first gene may be incorporated into a vector or a modified virus. Further, the sequence specific to the UL41 gene may include a base sequence complementary to any one of SEQ ID NOs: 2 to 11.
第二態様は、配列番号13から22のいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列を有するガイドRNAである。 The second embodiment is a guide RNA having a base sequence complementary to any one of SEQ ID NOS: 13 to 22.
第三態様は、配列番号13から22のいずれかの塩基配列を含む核酸分子である。 The third aspect is a nucleic acid molecule comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 13 to 22.
第四態様は、Cas9ヌクレアーゼをコードする塩基配列と、αヘルペスウイルスのUL41遺伝子に特異的な配列を有するガイドRNAをコードする塩基配列とを有する核酸分子である。前記ガイドRNAをコードする塩基配列は、配列番号2から11のいずれかの塩基配列を含んでいてもよい。 The fourth aspect is a nucleic acid molecule having a base sequence encoding Cas9 nuclease and a base sequence encoding a guide RNA having a sequence specific to the UL41 gene of α herpesvirus. The base sequence encoding the guide RNA may include any one of SEQ ID NOs: 2 to 11.
第五態様は、前記核酸分子を含む医薬組成物である。前記医薬組成物は、αヘルペスウイルス感染の処置に用いられてもよい。 The fifth aspect is a pharmaceutical composition comprising the nucleic acid molecule. The pharmaceutical composition may be used for the treatment of alpha herpesvirus infection.
本発明の一態様によれば、宿主に潜伏感染したαヘルペスウイルスの再活性化を抑制可能な方法を提供することができる。 According to one embodiment of the present invention, it is possible to provide a method capable of suppressing reactivation of α-herpesvirus latently infected with a host.
αヘルペスウイルス感染の処置方法
αヘルペスウイルス感染の処置方法は、αヘルペスウイルスのUL41遺伝子に特異的な配列を有するガイドRNAをコードする塩基配列およびCas9ヌクレアーゼをコードする塩基配列を含む第一の遺伝子を、ウイルス宿主の細胞内に導入することと、該細胞内のUL41遺伝子を、該ガイドRNAの存在下に該Cas9ヌクレアーゼで切断することと、を含む。導入された第一の遺伝子によってガイドRNAおよびCas9ヌクレアーゼがウイルス宿主の細胞内で発現することで、例えば、αヘルペスウイルスの活性化の初期に発現するUL41遺伝子を選択的に破壊することができる。これにより、ウイルス宿主におけるαヘルペスウイルスの増殖を抑制することができる。また、αヘルペスウイルスが潜伏感染しているウイルス宿主における潜伏αヘルペスウイルスの再活性化を抑制することができる。
Method for treating α herpesvirus infection The method for treating α herpesvirus infection is a first gene comprising a base sequence encoding a guide RNA having a sequence specific to the UL41 gene of α herpesvirus and a base sequence encoding a Cas9 nuclease. In a cell of a viral host, and cleaving the UL41 gene in the cell with the Cas9 nuclease in the presence of the guide RNA. By expressing the guide RNA and Cas9 nuclease in the virus host cell by the introduced first gene, for example, the UL41 gene expressed at the early stage of activation of α-herpesvirus can be selectively destroyed. Thereby, the growth of α herpesvirus in the virus host can be suppressed. In addition, reactivation of the latent α-herpesvirus in a virus host in which the α-herpesvirus is latently infected can be suppressed.
αヘルペスウイルス感染の処置方法は、感染に対して施される何らかの処置であればよく、例えば、発症の予防、感染症の治療、改善及び進行の抑制(悪化の防止)、潜伏感染における再活性化の抑制等が挙げられる。 The treatment method for α herpesvirus infection may be any treatment given to the infection, such as prevention of onset, treatment of infection, improvement and suppression of progression (prevention of deterioration), reactivation in latent infection And the like.
処置方法の対象となるαヘルペスウイルスとしては、単純ヘルペスウイルス(Human herpesvirus 1, Herpes simplex virus 1;HSV−1、Human herpesvirus 2, Herpes simplex virus 2;HSV−2)、水痘−帯状疱疹ウイルス(varicella−zoster virus;VZV)、ブタヘルペスウイルス1型(Suid herpesvirus 1:Pseudorabies virus;PRV)、ヒヒヘルペスウイルス2型(Papiine herpesvirus 2)、オナガザルヘルペスウイルス16型(Cercopithecine herpesvirus 16)、Bウイルス(Macacine herpesvirus 1,Cercopithecine herpesvirus 1)、ウマヘルペスウイルス1型(Equid herpesvirus 1)、ウシヘルペスウイルス1型(Bovine herpesvirus 1)、ウシヘルペスウイルス2型(Bovine herpesvirus 2)等を挙げることができる。 Α herpesviruses to be treated are herpes simplex viruses (Human herpesvirus 1, Herpes simplex virus 1; HSV-1, Human herpesvirus 2, Herpes simplex virus 2; -Zoster virus (VZV), swine herpesvirus type 1 (Suid herpesvirus 1: Pseudorabies virus; PRV), baboon herpesvirus type 2 (Papiine herpesvirus 2), rhesus herpes virus 16 type (Cercopetic virus B) s 1, Cercopithecine herpesvirus 1), equine herpesvirus type 1 (Equid herpesvirus 1), bovine herpesvirus type 1 (Bovine herpesvirus 1), mention may be made of bovine herpes virus type 2 (Bovine Herpesvirus 2) or the like.
αヘルペスウイルスにおけるUL41遺伝子は、例えば、J.Vet.Med.Sci. 72(9):1179−1187,2010等に記載されているように、種々のαヘルペスウイルス株間においてよく保存されており、その遺伝子産物は宿主細胞のタンパク質合成を阻害することが知られている。本発明者らは、αヘルペスウイルスの一種であるPRVの潜伏感染における再活性化機構を解析した結果、再活性化の初期にUL41遺伝子が発現することを見出した。この新たな知見を元に、宿主細胞におけるUL41遺伝子の発現を選択的に抑制することで、宿主に潜伏感染したαヘルペスウイルスの再活性化を抑制する方法の開発に成功した。UL41遺伝子は、種々のαヘルペスウイルス株間における保存性が高いことから、特に相同性の高い配列を標的とすることで、汎用性の高いαヘルペスウイルス感染の処置方法が実現できる。 The UL41 gene in α-herpesvirus is described in, for example, J. Org. Vet. Med. Sci. 72 (9): 1179-1187, 2010, etc., are well conserved among various α herpesvirus strains, and their gene products are known to inhibit host cell protein synthesis. . As a result of analyzing the reactivation mechanism in latent infection of PRV, which is a kind of α-herpesvirus, the present inventors have found that the UL41 gene is expressed at the early stage of reactivation. Based on this new knowledge, the inventors succeeded in developing a method for suppressing reactivation of α-herpesvirus latently infected in the host by selectively suppressing the expression of UL41 gene in the host cell. Since the UL41 gene is highly conserved among various α herpes virus strains, a highly versatile treatment method for α herpes virus infection can be realized by targeting a particularly highly homologous sequence.
UL41遺伝子の塩基配列の具体例としては、例えば、PRV野生株YS−81に由来するUL41遺伝子の塩基配列(配列番号1)等を挙げることができる。 Specific examples of the base sequence of the UL41 gene include, for example, the base sequence of the UL41 gene (SEQ ID NO: 1) derived from the PRV wild strain YS-81.
PRV野生株YS−81に由来するUL41遺伝子に対する、他株のUL41遺伝子の相同性は、例えば、ブタヘルペスウイルスにおいては93%以上であり、サルヘルペスウイルスにおいては74%以上、ウマヘルペスウイルスにおいては70%以上、ウシヘルペスウイルスにおいては76%以上、ヒトヘルペスウイルスにおいても70%以上を示す。なお、遺伝子の相同性は、BLASTプログラムを用いて算出される。 The homology of the UL41 gene of other strains with respect to the UL41 gene derived from the PRV wild strain YS-81 is, for example, 93% or more in swine herpes virus, 74% or more in simian herpes virus, and in horse herpes virus 70% or more, 76% or more for bovine herpesvirus, and 70% or more for human herpesvirus. The gene homology is calculated using the BLAST program.
本実施態様の処置方法では、αヘルペスウイルスのUL41遺伝子に特異的な配列を有するガイドRNAをコードする塩基配列およびCas9ヌクレアーゼをコードする塩基配列を有する第一の遺伝子を、ウイルス宿主の細胞内に導入する。ガイドRNAとCas9ヌクレアーゼを用いて標的遺伝子を切断する方法は、CRISPER−Cas9システムとして知られている。CRISPER−Cas9システムでは、任意のゲノム位置におけるプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の上流で配列特異的にDNAを切断するため、短鎖のガイドRNA(gRNA)と、それと複合体化するCas9ヌクレアーゼを利用する。CRISPER−Cas9システムの詳細については、例えば、Cell.Res.23:465−472,2013;Nat.Biotechnol.31:227−229,2013;Nucl.Acids Res.1−11,2013、特開2016−093196号公報等を参照することができる。 In the treatment method of this embodiment, a first gene having a base sequence encoding a guide RNA having a sequence specific to the UL41 gene of α-herpesvirus and a base sequence encoding a Cas9 nuclease is introduced into a cell of a virus host. Introduce. A method of cleaving a target gene using guide RNA and Cas9 nuclease is known as a CRISPER-Cas9 system. The CRISPER-Cas9 system utilizes a short guide RNA (gRNA) and a Cas9 nuclease complexed with it to cleave DNA in a sequence-specific manner upstream of a protospacer adjacent motif (PAM) at any genomic location To do. For details of the CRISPER-Cas9 system, see, for example, Cell. Res. 23: 465-472, 2013; Nat. Biotechnol. 31: 227-229, 2013; Nucl. Acids Res. 1-11, 2013, JP-A-2006-093196, and the like can be referred to.
野生型のCas9ヌクレアーゼは、標的遺伝子の少なくとも2箇所において2本鎖切断を引き起こす。これにより、例えば非相同性末端結合(NHEJ)によって標的遺伝子に小さな挿入欠損が導入されて、標的遺伝子であるUL41遺伝子の発現を抑制することができる。Cas9ヌクレアーゼは、野生型を用いてもよいし、変異型を用いてもよい。 Wild-type Cas9 nuclease causes double-strand breaks in at least two locations of the target gene. Thereby, for example, a small insertion defect is introduced into the target gene by non-homologous end joining (NHEJ), and the expression of the target gene UL41 gene can be suppressed. The Cas9 nuclease may be a wild type or a mutant type.
ガイドRNAは、αヘルペスウイルスのUL41遺伝子に特異的な塩基配列と、さらにCas9ヌクレアーゼをリクルートするのに必要な塩基配列、例えば足場(Scaffold)機能を有する塩基配列とを有する。ガイドRNAがUL41遺伝子に特異的な塩基配列を有することで、UL41遺伝子の特定部位にCas9ヌクレアーゼをリクルートすることができる。リクルートされたCas9ヌクレアーゼによりUL41遺伝子が配列特異的に切断されて、UL41遺伝子の発現が抑制される。 The guide RNA has a base sequence specific to the UL41 gene of α-herpesvirus and a base sequence necessary for recruiting Cas9 nuclease, for example, a base sequence having a scaffold function. Since the guide RNA has a base sequence specific to the UL41 gene, a Cas9 nuclease can be recruited to a specific site of the UL41 gene. The UL41 gene is cleaved in a sequence-specific manner by the recruited Cas9 nuclease, thereby suppressing the expression of the UL41 gene.
UL41遺伝子に特異的な配列とは、UL41遺伝子の対応する塩基配列に対して相補的な塩基配列である。具体的には、UL41遺伝子の塩基配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列から5’末端側への、例えば20塩基分の塩基配列に相補的な塩基配列を挙げることができる。すなわち、ガイドRNAの3’末端側の20塩基分の塩基配列は、標的遺伝子であるUL41遺伝子の標的位置である塩基配列を特異的に認識し、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の直前に位置するDNA標的部位へ、RNA−DNA塩基対形成を介してCas9/ガイドRNA複合体をリクルートする。 The sequence specific to the UL41 gene is a base sequence complementary to the corresponding base sequence of the UL41 gene. Specifically, for example, a base sequence complementary to a base sequence of 20 bases from the protospacer adjacent motif (PAM) sequence to the 5 'end side in the base sequence of the UL41 gene can be exemplified. That is, the base sequence of 20 bases on the 3 ′ end side of the guide RNA specifically recognizes the base sequence that is the target position of the UL41 gene that is the target gene, and is located immediately before the protospacer adjacent motif (PAM). Recruit the Cas9 / guide RNA complex to the DNA target site via RNA-DNA base pairing.
UL41遺伝子に特異的な配列は、UL41遺伝子の塩基配列からPAM配列を検索して選択し、選択されたPAM配列に基づいて決定することができる。UL41遺伝子に特異的な配列は、具体的には、選択されたPAM配列から5’末端側への、例えば20塩基分の塩基配列に相補的な塩基配列とすることができる。選択されるPAM配列としては、UL41遺伝子の発現を抑制できるPAM配列であれば、いずれを選択してもよく、中でもUL41遺伝子の上流側(例えば、5’側から300塩基前後)に位置するPAM配列を選択することが好ましい。またPAM配列は、例えば、配列番号1の塩基配列から選択されてもよいし、配列番号1の塩基配列に相補的な塩基配列から選択されてもよい。 A sequence specific to the UL41 gene can be determined by searching a PAM sequence from the nucleotide sequence of the UL41 gene and selecting it, based on the selected PAM sequence. Specifically, the sequence specific to the UL41 gene can be a base sequence complementary to, for example, a base sequence of 20 bases from the selected PAM sequence to the 5 'end side. As the PAM sequence to be selected, any PAM sequence that can suppress the expression of the UL41 gene may be selected, and in particular, the PAM located upstream of the UL41 gene (for example, about 300 bases from the 5 ′ side). It is preferred to select a sequence. Further, the PAM sequence may be selected from, for example, the base sequence of SEQ ID NO: 1 or may be selected from a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1.
ガイドRNAにおけるUL41遺伝子に特異的な配列の認識対象となるUL41遺伝子の塩基配列の具体例としては、例えば下表に示すPRVvhs(配列番号2)、PRVvhs11(配列番号3)、PRVvhs26(配列番号4)、PRVvhs34(配列番号5)、PRVvhs41(配列番号6)、PRVvhs51(配列番号7)、PRVvhs61(配列番号8)、PRVvhs81(配列番号9)、PRVvhs93(配列番号10)、PRVvhs103(配列番号11)等を挙げることができる。中でもPRVvhs、PRVvhs34、PRVvhs41、PRVvhs61、PRVvhs81、PRVvhs93、及びPRVvhs103からなる群から選択される少なくとも1つが好ましく、PRVvhs、PRVvhs34、PRVvhs61、PRVvhs81、PRVvhs93及びPRVvhs103からなる群から選択される少なくとも1つがより好ましい。 Specific examples of the base sequence of the UL41 gene that is the recognition target of the sequence specific to the UL41 gene in the guide RNA include, for example, PRVvhs (SEQ ID NO: 2), PRVvhs11 (SEQ ID NO: 3), and PRVvhs26 (SEQ ID NO: 4) shown in the table below. ), PRVvhs34 (SEQ ID NO: 5), PRVvhs41 (SEQ ID NO: 6), PRVvhs51 (SEQ ID NO: 7), PRVvhs61 (SEQ ID NO: 8), PRVvhs81 (SEQ ID NO: 9), PRVvhs93 (SEQ ID NO: 10), PRVvhs103 (SEQ ID NO: 11) Etc. Among them, at least one selected from the group consisting of PRVvhs, PRVvhs34, PRVvhs41, PRVvhs61, PRVvhs81, PRVvhs93, and PRVvhs103 is preferable, and at least one selected from the group consisting of PRVvhs, PRVvhs34, PRVvhs81, PRVvhs93, and PRVvhs93. .
ガイドRNAは、UL41遺伝子に特異的な塩基配列に加えて、好ましくは足場配列を含む。足場配列をコードする塩基配列としては、例えば以下の塩基配列を挙げることができる。 The guide RNA preferably includes a scaffold sequence in addition to a base sequence specific to the UL41 gene. Examples of the base sequence encoding the scaffold sequence include the following base sequences.
したがってガイドRNAをコードする塩基配列の具体例としては、以下に示す塩基配列が挙げられる。 Therefore, specific examples of the base sequence encoding the guide RNA include the base sequences shown below.
第一の遺伝子が含むガイドRNAをコードする塩基配列としては、ガイドRNAの塩基配列に相補的な塩基配列を用いることができる。またCas9ヌクレアーゼをコードする塩基配列としては、Cas9ヌクレアーゼ遺伝子が組み込まれた市販のベクター等(例えば、pGuide−it−ZsGreen1 Vector(Linear):タカラバイオ社製等)に含まれる塩基配列を用いることができる。第一の遺伝子は、例えば、Cas9ヌクレアーゼをコードする塩基配列が組み込まれたベクターに、ガイドRNAをコードする塩基配列を有する遺伝子を組み込むことで容易に構築することができる。これにより、同一の核酸分子上にガイドRNAをコードする塩基配列及びCas9ヌクレアーゼをコードする塩基配列を有する第一の遺伝子が得られる。またガイドRNAをコードする塩基配列及びCas9ヌクレアーゼをコードする塩基配列は異なる核酸分子上に存在してもよい。 As the base sequence encoding the guide RNA included in the first gene, a base sequence complementary to the base sequence of the guide RNA can be used. In addition, as a base sequence encoding Cas9 nuclease, a base sequence contained in a commercially available vector or the like in which a Cas9 nuclease gene is incorporated (for example, pGuide-it-ZsGreen1 Vector (Linear): manufactured by Takara Bio Inc.) may be used. it can. The first gene can be easily constructed by, for example, incorporating a gene having a base sequence encoding a guide RNA into a vector in which a base sequence encoding Cas9 nuclease is integrated. Thereby, the 1st gene which has the base sequence which codes guide RNA and the base sequence which codes Cas9 nuclease on the same nucleic acid molecule is obtained. Further, the base sequence encoding guide RNA and the base sequence encoding Cas9 nuclease may be present on different nucleic acid molecules.
第一の遺伝子が導入されるウイルス宿主には、αヘルペスウイルスが感染し得る動物、αヘルペスウイルスに感染し発症している動物、αヘルペスウイルスが潜伏感染している動物等が含まれる。また動物には哺乳動物が含まれ、哺乳動物にはヒトが含まれる。 Viral hosts into which the first gene is introduced include animals that can be infected with α herpes virus, animals that are infected with α herpes virus, animals that are latently infected with α herpes virus, and the like. In addition, mammals include mammals, and mammals include humans.
ウイルス宿主の細胞内への第一の遺伝子の導入は、非ウイルスベクター及びウイルスベクターを含む当該技術分野において公知である様々な方法によって行うことができる。非ウイルスベクターによる方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質:核酸コンジュゲート、人工ビリオン等が挙げられ、いずれも公知の方法から適宜選択すればよい。 Introduction of the first gene into the cells of the viral host can be performed by various methods known in the art including non-viral vectors and viral vectors. Non-viral vector methods include lipofection, nucleofection, microinjection, liposomes, immunoliposomes, polycations or lipid: nucleic acid conjugates, artificial virions, etc., all of which may be appropriately selected from known methods.
ウイルスベクターには、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等の通常用いられるウイルスベクターに加えて、αヘルペスウイルスを用いることができる。ウイルスベクターを用いる方法は、ウイルスに第一の遺伝子を発現可能に組み込んだ改変ウイルスを構築することで行うことができる。例えば、αヘルペスウイルスを用いる場合、UL41遺伝子の領域に第一の遺伝子を組み換えることで改変ウイルスを構築することができる。具体的には例えば、サムブロックら(J. Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Press)によって記載されている公知の遺伝子操作技術ならびに細胞工学技術によって行うことができる。 As a viral vector, α herpes virus can be used in addition to a commonly used viral vector such as a retrovirus, a lentivirus, an adenovirus, and an adeno-associated virus. The method using a viral vector can be performed by constructing a modified virus in which a first gene is incorporated into a virus so that the first gene can be expressed. For example, when α-herpesvirus is used, a modified virus can be constructed by recombining the first gene in the UL41 gene region. Specifically, for example, known genetic manipulation described by Sambrook et al. (J. Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Press). This can be done by techniques as well as by cell engineering techniques.
ガイドRNA
本発明の別の態様は、αウイルス感染を処置する方法に用いられるガイドRNAである。ガイドRNAは、αヘルペスウイルスのUL41遺伝子に特異的な塩基配列と、Cas9ヌクレアーゼの標的部位へのリクルートを可能にする塩基配列とを有して構成される。ガイドRNAの具体例としては、配列番号13から22のいずれかの塩基配列でコードされる核酸分子(例えば、RNA)を挙げることができる。
Guide RNA
Another aspect of the present invention is a guide RNA used in a method for treating alphavirus infection. The guide RNA has a base sequence specific to the UL41 gene of α-herpesvirus and a base sequence that enables recruitment to the target site of Cas9 nuclease. Specific examples of the guide RNA include a nucleic acid molecule (for example, RNA) encoded by any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 13 to 22.
核酸分子
本発明の別の態様は、前記ガイドRNAをコードする塩基配列を含む核酸分子である。当該核酸分子は、ガイドRNAをコードする塩基配列に加えてCas9ヌクレアーゼをコードする塩基配列を含んでいてもよく、さらに必要に応じてこれらの遺伝子を効率的に発現させるのに必要なプロモーター等の遺伝子群を含んでいてもよい。
Nucleic acid molecule Another aspect of the present invention is a nucleic acid molecule comprising a base sequence encoding the guide RNA. The nucleic acid molecule may contain a base sequence encoding Cas9 nuclease in addition to the base sequence encoding guide RNA, and further, if necessary, such as a promoter necessary for efficiently expressing these genes. It may contain a gene group.
本発明に係るαヘルペスウイルス感染を処置する方法は、αヘルペスウイルスのUL41遺伝子の発現を抑制することで、ウイルスの増殖を抑制とそれによる初感染における発症防御、並びに潜伏ウイルスの再活性化をも抑制するという利点を有する。本方法に用いられる非ウイルスベクターまたはウイルスベクターは、一次投与によってαヘルペスウイルス感染症の発症を抑制することができる。さらに二次投与によって潜伏感染したαヘルペスウイルスの再活性化を抑制することができる。 The method for treating α-herpesvirus infection according to the present invention suppresses the expression of the UL41 gene of α-herpesvirus, thereby suppressing the growth of the virus, thereby preventing the onset of the initial infection and reactivating the latent virus. It has the advantage of suppressing. The non-viral vector or viral vector used in this method can suppress the onset of α-herpesvirus infection by primary administration. Furthermore, reactivation of latently infected α herpesvirus can be suppressed by secondary administration.
ところでαヘルペスウイルス感染を処置する方法は、αヘルペスウイルスのUL41遺伝子の発現を抑制する方法であれば、Crisper−Cas9システム以外のヌクレアーゼシステムを適用して実施することもできる。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、メガヌクレアーゼ等を適用して実施することもできる。 By the way, the method for treating α-herpesvirus infection can be carried out by applying a nuclease system other than the Crisper-Cas9 system as long as it suppresses the expression of the UL41 gene of α-herpesvirus. For example, zinc finger nuclease, transcription activator-like effector nuclease (TALEN), meganuclease and the like can be applied.
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
YS−81 UL41遺伝子のクローニング及び塩基配列決定
PRV野外株YS−81ゲノムを鋳型とし、以下に示すプライマー(配列番号23及び24)を用い、94℃×30秒、55℃×30秒、72℃×1分のサイクルを45サイクルのPCRにより、UL41遺伝子を増幅し、pTA2クローニングベクターにダイレクトクローニングした。得られたベクターについて、北海道システムサイエンス社にシークエンスを依頼し、全塩基配列を決定した。決定された塩基配列は、配列番号1として示される塩基配列であった。
Cloning and nucleotide sequencing of YS-81 UL41 gene Using PRV field strain YS-81 genome as a template, primers shown below (SEQ ID NOs: 23 and 24), 94 ° C. × 30 seconds, 55 ° C. × 30 seconds, 72 ° C. The UL41 gene was amplified by PCR for 45 cycles of x 1 minute and directly cloned into the pTA2 cloning vector. About the obtained vector, the Hokkaido system science company was requested to sequence and the whole base sequence was determined. The determined base sequence was the base sequence shown as SEQ ID NO: 1.
pGuide−it−ZsGreen1ベクターの構築
UL41の塩基配列の情報を元にPAM配列を検索し、ガイドRNA(sgRNA)のUL41遺伝子に特異的な配列(以下、ガイド配列ともいう)に対応するUL41遺伝子の塩基配列として以下のPRVvhs配列(配列番号2)を選択した。選択した塩基配列を有するオリゴDNAをシグマ−アルドリッチ社に依頼して合成し、得られたオリゴDNAをpGuide−it−ZsGreen1プラスミドベクター(タカラバイオ社製)にクローニングして、ガイドRNA及びCas9ヌクレアーゼをコードする塩基配列を有するプラスミド(pGuide−itCRISPR/Cas9 YSvhs;以下、単に「YSvhs」ともいう)を作製した。得られたプラスミドの構成図を図1に示す。
Construction of pGuide-it-ZsGreen1 vector A PAM sequence is searched based on information on the base sequence of UL41, and a UL41 gene corresponding to a sequence specific to the UL41 gene of guide RNA (sgRNA) (hereinafter also referred to as guide sequence) is detected. The following PRVvhs sequence (SEQ ID NO: 2) was selected as the base sequence. Oligo DNA having the selected base sequence was synthesized by requesting Sigma-Aldrich, and the obtained oligo DNA was cloned into pGuide-it-ZsGreen1 plasmid vector (manufactured by Takara Bio Inc.) to obtain guide RNA and Cas9 nuclease. A plasmid (pGuide-itCRISPR / Cas9 YSvhs; hereinafter simply referred to as “YSvhs”) having a base sequence to be encoded was prepared. A structural diagram of the resulting plasmid is shown in FIG.
同様にして、ガイド配列に対応するUL41遺伝子の塩基配列として下表に示す塩基配列(配列番号3から11)を有するプラスミド(YSvhs11からYSvhs103)をそれぞれ作製した。 Similarly, plasmids (YSvhs11 to YSvhs103) having the base sequences (SEQ ID NOs: 3 to 11) shown in the following table as the base sequences of the UL41 gene corresponding to the guide sequences were prepared.
プラーク抑制試験
上記で得られたプラスミド1μg/穴をjetPRIME4μlと専用バッファー100μlに混和して、6穴プレートに1×106cellsで播種したブタ腎臓細胞PK−15に接種して、プラスミドを導入した。37℃、5%CO2下で24時間培養後に、YS−81 100PFU/穴を接種し、培養5日後にクリスタルバイオレット添加10%ホルマリン溶液で染色して現れたプラークの数を計測した。コントロールとしては、ガイド配列を組み込んでいないpGuide−it−ZsGreen1プラスミドを用いた。結果を下表に示す。なお、プラーク数が少ないほどYS−81に対する抑制効果が大きいことを意味する。
Plaque suppression test 1 μg / well of the plasmid obtained above was mixed with 4 μl of jetPRIME and 100 μl of dedicated buffer, and inoculated into porcine kidney cells PK-15 seeded at 1 × 10 6 cells in a 6-well plate to introduce the plasmid. . After culturing at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours, YS-81 100PFU / well was inoculated, and the number of plaques that appeared after staining with 10% formalin solution with crystal violet added after 5 days of culture was counted. As a control, pGuide-it-ZsGreen1 plasmid not incorporating a guide sequence was used. The results are shown in the table below. In addition, it means that the suppression effect with respect to YS-81 is so large that the number of plaques is small.
表8から、ガイドRNAとCas9ヌクレアーゼをコードする塩基配列を有するプラスミドを、ブタ腎臓細胞PK−15に導入しておくことで、YS−81の増殖が抑制されることがわかる。 From Table 8, it can be seen that introduction of a plasmid having a base sequence encoding guide RNA and Cas9 nuclease into porcine kidney cell PK-15 suppresses the growth of YS-81.
潜伏感染モデルマウスの作製
4週齢Balb/cマウスの腹腔内に、PBS(−)を用いて1:128相当に希釈したブタ抗ウイルス血清を0.25ml前投与した。30分後に同じくPBS(−)で102LD50相当に希釈した野外ウイルスYS−81 0.5mlで腹腔内に投与して攻撃した。攻撃から2カ月以上生残したマウスを潜伏感染モデルマウスとして使用した。
Preparation of latent infection model mouse A 4-week-old Balb / c mouse was intraperitoneally administered with 0.25 ml of porcine antiviral serum diluted with PBS (-) equivalent to 1: 128. Thirty minutes later, 0.5 ml of the field virus YS-81 diluted to the equivalent of 10 2 LD50 with PBS (−) was administered intraperitoneally and attacked. Mice that survived more than 2 months from the challenge were used as latent infection model mice.
脳室内投与による潜伏PRV再活性化抑制試験
潜伏感染モデルマウスの脳内に、プラスミド(pGuide−itCRISPR/Cas9 YSvhs)1μgをTransIT−Neural100μlに混和して接種した。24時間後に塩化アセチルコリン腹腔内接種により潜伏ウイルスの再活性化を行った。以下のようにして、継日的に鼻腔スワブを採取してPCRによりウイルスDNAの検出を行った。
Inhibition test of latent PRV reactivation by intraventricular administration 1 μg of plasmid (pGuide-itCRISPR / Cas9 YSvhs) was mixed with TransIT-Neural 100 μl and inoculated into the brain of latent infection model mice. After 24 hours, latent virus was reactivated by intraperitoneal inoculation with acetylcholine chloride. As described below, nasal swabs were collected daily and viral DNA was detected by PCR.
鼻腔スワブは、三種混合麻酔(メデトミジン0.3mg/kg、ミダゾラム4mg/kg、ブトルファノール5mg/kg)下で、右鼻孔からMEM培養液100μlを、マイクロピペットを用いて流入させ、洗浄液を綿棒で採取してMEM培養液300μlに混和し、これを鼻腔スワブとした。得られた鼻腔スワブのサンプルは、2倍量のISOGEN(LS)(和光純薬社製)に混和し、キットのプロトコールに従ってDNAを抽出した。 For nasal swabs, 100 μl of MEM culture solution was allowed to flow from the right nostril using a micropipette under three-kind anesthesia (medetomidine 0.3 mg / kg, midazolam 4 mg / kg, butorphanol 5 mg / kg), and the washing solution was collected with a cotton swab. Then, it was mixed with 300 μl of MEM culture solution to obtain a nasal swab. The sample of the obtained nasal swab was mixed with twice the amount of ISOGEN (LS) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and DNA was extracted according to the protocol of the kit.
ウイルスDNAの検出として、抽出したDNAを鋳型としてgG遺伝子に対するPCR反応を行った。下表に示すプライマーを用い、プログラムは94℃×2分、94℃×1分、56℃×1分、及び72℃×2分のサイクルを30サイクル行い、72℃×7分で伸展させた。増幅産物について1.0%アガロースを用いた電気泳動法により531bpの特異バンドの有無を確認した。結果を表10に示す。なお、表中のMockは、潜伏感染していないBalb/cマウスを意味する。 For detection of viral DNA, PCR reaction was performed on the gG gene using the extracted DNA as a template. Using the primers shown in the table below, the program was carried out for 30 cycles of 94 ° C. × 2 minutes, 94 ° C. × 1 minute, 56 ° C. × 1 minute, and 72 ° C. × 2 minutes, and extended at 72 ° C. × 7 minutes. . The presence or absence of a 531 bp specific band was confirmed by electrophoresis using 1.0% agarose. The results are shown in Table 10. In the table, Mock means a Balb / c mouse that is not latently infected.
表10から、ガイドRNAとCas9ヌクレアーゼをコードするプラスミドを脳内に接種することで、潜伏感染モデルマウスに再活性化刺激を与えてもウイルスを排泄しないことが分かる。すなわち、プラスミド接種により、潜伏感染モデルマウスにおけるウイルスの再活性化が抑制されることが分かる。なお、χ2検定の結果はp=0.005613であった。 From Table 10, it can be seen that by inoculating a plasmid encoding guide RNA and Cas9 nuclease into the brain, the virus is not excreted even when a reactivation stimulus is given to a latently infected model mouse. That is, it can be seen that plasmid inoculation suppresses virus reactivation in a latently infected model mouse. The result of the χ 2 test was p = 0.000513.
Claims (12)
該細胞内のUL41遺伝子を、該ガイドRNAの存在下に該Cas9ヌクレアーゼで切断することと、
を含む、αヘルペスウイルス感染を処置する方法。 introducing a first gene comprising a base sequence encoding a guide RNA having a sequence specific to the UL41 gene of α-herpesvirus and a base sequence encoding a Cas9 nuclease into a cell of a viral host;
Cleaving the intracellular UL41 gene with the Cas9 nuclease in the presence of the guide RNA;
A method of treating alpha herpesvirus infection.
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