JP2019118303A - Lactobacillus preparation for silage preparation - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、サイレージ調製用の乳酸菌製剤及びサイレージの調製方法に関する。 The present invention relates to a lactic acid bacteria preparation for silage preparation and a method for preparing silage.
飼料作物をサイロなどで発酵させたものがサイレージである。一般には、青刈りした牧草を発酵させたもの（牧草サイレージ又はグラスサイレージ）をいうが、それ以外の場合には、サイレージの前に原料となる穀物名を付けて呼ぶこともある（例：コーンサイレージ、稲ワラサイレージ等）。乳牛、特に泌乳牛にとって、サイレージは、主食にあたる重要な飼料であり、この品質が酪農経営に大きく影響する。
サイレージは生ものである牧草や飼料作物などを長期間貯蔵するために漬物の状態にする技術である。しかしサイレージの製造に当たっては、２つの課題が指摘されている。１つは密封発酵中の酪酸菌が原因となる酪酸発酵を抑えること、もう１つはサイレージ開封後に酵母などが増えることで発熱、変敗する二次発酵を抑えることである。この２つの課題を解決するために、様々な提案がなされている。酪酸発酵は、水分含量が７５％を超えるグラスサイレージにおいてしばしば発生し、サイレージの品質低下をきたす。
また、サイレージ原料の水分含量が７５％未満の場合、サイレージ調製に必要な嫌気条件を保つことが難しくなり、このようなサイレージは、開封後の２次発酵がしばしば発生する。二次発酵は、サイレージやＴＭＲの品温が上昇し、腐敗性の細菌や、酵母・カビなどの真菌が増加するため品質が低下することであり、飼料の栄養価低下に繋がることから避けなければならない。
酪酸発酵の抑制と二次発酵の抑制は、良質のサイレージを調製するためには必須の条件である。しかし両方とも満足するサイレージの調製は困難であった。
Silage is a fermented forage crop with a silo. In general, it refers to fermented green grass (grass silage or grass silage), but in other cases, it may be called with the grain name as the raw material before silage (eg corn) Silage, rice straw silage etc.). For dairy cows, especially lactating cows, silage is an important feed serving as a staple food, and this quality greatly affects dairy management.
Silage is a technology for making pickles in order to store raw grasses and feed crops for a long time. However, two issues have been pointed out in the manufacture of silage. One is to suppress the butyric acid fermentation caused by the butyric acid bacteria during the sealed fermentation, and the other is to suppress the secondary fermentation which causes fever and deterioration by increasing the amount of yeast after opening the silage. Various proposals have been made to solve these two problems. Butyric acid fermentation often occurs in grass silage with water content> 75%, resulting in silage degradation.
In addition, when the water content of the silage raw material is less than 75%, it is difficult to maintain the anaerobic conditions required for silage preparation, and such silage often causes secondary fermentation after opening. Secondary fermentation should be avoided because the quality of silage and TMR will increase due to the increase in rotten bacteria and fungi such as yeast and mold, which will lead to a decrease in the nutritional value of feed. You must.
Suppression of butyric acid fermentation and suppression of secondary fermentation are essential conditions for preparing high quality silage. However, it was difficult to prepare silage both satisfactory.
特許文献１には、ナイシンを生産する乳酸菌をサイレージ調製用微生物製剤として用いることで、酪酸発酵を抑制し、良質なサイレージを製造できることが記載されている。しかし二次発酵の抑制については何も記載されていない。
特許文献２は、サイレージ中において乳酸産生能力の高い乳酸菌をサイレージ調製時に添加して、乳酸によるサイレージｐＨ低下を促進させ、これによって有害な微生物の増殖を抑制しようとするものである。このような作用効果を期待して、特許文献２には、耐酸性と乳酸発酵能に優れた乳酸菌、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）畜草１号株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９３０）又は好気性細菌と酪酸菌に対する抗菌作用を有する乳酸菌、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＲＯ５０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９３１）をサイレージ用乳酸菌として用いることで有害微生物によるサイレージの品質低下を防止できることが記載されている。しかし特許文献２の発明で二次発酵を抑制できるとの記載もなく、効果は不明である。 In Patent Document 2, a lactic acid bacterium having a high ability to produce lactic acid in silage is added at the time of silage preparation to promote reduction in silage pH caused by lactic acid, thereby suppressing the growth of harmful microorganisms. In the expectation of such an effect, Patent Document 2 discloses a lactic acid bacterium excellent in acid resistance and lactic acid fermentation ability, Lactobacillus plantarum stock No. 1 (FERM P-18930) or aerobic bacteria. It is described that the quality deterioration of silage by harmful microorganisms can be prevented by using Lactococcus lactis strain RO50 strain (FERM P-18931), which is a lactic acid bacterium having an antibacterial action against lactic acid bacteria and lactic acid bacteria, as a lactic acid bacteria for silage. However, there is no description that secondary fermentation can be suppressed in the invention of Patent Document 2, and the effect is unknown.
特許文献３には、バクテリオシンを産生する乳酸菌エンテロコカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＮＡＳ６２菌株（ＮＩＴＥ Ｐ−７８１）をサイレージ用乳酸菌として用いることで、バクテリオシンの抗菌作用により有害微生物を抑制しようとするものである。特許文献３にはサイレージ中の糸状菌が検出されず、発酵ＴＭＲ試料中にも糸状菌が検出されないことが記載されている。 Patent Document 3 discloses that lactic acid bacteria Enterococcus faecium NAS62 strain (NITE P-781) that produces bacteriocin is used as a lactic acid bacteria for silage to suppress harmful microorganisms by the antibacterial action of bacteriocin. It is. Patent Document 3 describes that filamentous fungi in silage are not detected, and filamentous fungi are not detected in a fermented TMR sample.
特許文献４には、抗真菌作用を有するロイテリン生産能を有するホモ型発酵乳酸菌と、グリセロールと、ビタミンＢ１２と、を含む、サイレージ調製用添加剤が提案されている。ロイテリン（ｒｅｕｔｅｒｉｎ）は、嫌気性雰囲気下にグリセリンを含有する培地中で、ラクトバチルス・ロイテリの産生する抗菌性物質である。上記培養上清中に、グリセリンの発酵産物であるβ−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（β−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｌｄｅｈｙｄｅ）が検出され、このβ−ヒドロキシプロピオンアルデヒドは、水溶液中で単量体、水和物および二量体の形態で存在すると推定され、ロイテリンと称されている。ロイテリンは、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、酵母およびカビに対して抗菌性を示す。 Patent Document 4, a homo-type fermented lactic acid bacteria with reuterin producing ability with antifungal, including glycerol, vitamin B 12, and silage additives have been proposed. Reuterin is an antibacterial substance produced by Lactobacillus reuteri in a medium containing glycerin under an anaerobic atmosphere. In the above culture supernatant, β-hydroxypropionaldehyde (β-hydroxypropionaldehyde), which is a fermentation product of glycerol, is detected, and this β-hydroxypropionaldehyde is a monomer, a hydrate and a dimer in aqueous solution. It is presumed to exist in a form and is called reuterin. Reuterin exhibits antibacterial activity against gram positive bacteria, gram negative bacteria, yeast and mold.
また本発明者らは、抗酵母作用を有するラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）を見いだし、この乳酸菌をサイレージ調製用乳酸菌として用いることで、サイレージの好ましい発酵と、調製されたサイレージの開封後の二次発酵を抑制できることを見いだして特許出願している（特許文献５参照）。 Moreover, the present inventors have found Lactobacillus diolivorans (Lactobacillus diolivorans) having an anti-yeast effect, and using this lactic acid bacterium as a lactic acid bacterium for silage preparation, preferable fermentation of silage and opening of the prepared silage. Patent application has been found to be able to suppress the subsequent secondary fermentation (see Patent Document 5).
種々のサイレージ調製のための乳酸菌株やこれを用いたサイレージ製造のための乳酸菌製剤が提案されているが必ずしも満足できるものがないことが現実である。また二次発酵抑制は、サイレージを原料とするＴＭＲ（ｔｏｔａｌ ｍｉｘｅｄ ｒａｔｉｏｎ：混合飼料）が普及するにつれて大きな問題となっている。サイレージの二次発酵を抑制するためにはｐＨを低く保つこと、そして酢酸を１質量％以上含有することが好ましいことが経験的に知られている。
本発明は、サイレージの二次発酵を抑制し、好ましいサイレージ調製に有用な乳酸菌製剤を提供することを課題とする。
Although various lactic acid bacteria strains for silage preparation and lactic acid bacteria preparations for silage production using the same have been proposed, it is a fact that they are not necessarily satisfactory. Moreover, secondary fermentation suppression has become a big problem as TMR (total mixed ration: mixed feed) which uses silage as a raw material spreads. It is empirically known that it is preferable to keep the pH low and to contain acetic acid at 1% by mass or more in order to suppress secondary fermentation of silage.
An object of the present invention is to provide a lactic acid bacteria preparation which suppresses secondary fermentation of silage and is useful for preparation of preferable silage.
本発明者は、従来サイレージ調製用の乳酸菌としては、一種類の乳酸菌株を用いていたが、これを複数種の乳酸菌を組み合わせてサイレージを調製すると、サイレージ調製時のｐＨの低下が速やかであり、さらにサイレージ開封後の二次発酵を抑制できることを見いだした。 The present inventor has conventionally used one type of lactic acid bacteria strain as lactic acid bacteria for silage preparation, but when a plurality of lactic acid bacteria are combined to prepare silage, the pH is rapidly reduced during silage preparation. Furthermore, it has been found that it is possible to suppress secondary fermentation after silage opening.
本発明は、次の構成からなる。
（１）ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）及びラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）からなるサイレージ調製用乳酸菌製剤。
（２）ラクトコッカス・ラクチスの培養物、ラクトバチルス・パラカゼイの培養物及びラクトバチルス・ディオリヴォランスの培養物の混合物又は培養物の凍結乾燥粉末の混合物からなるサイレージ調製用乳酸菌製剤。
（３）ラクトコッカス・ラクチスがＳＢＳ−０００１株（ＮＩＴＥ ＢＰ−１１０７）、ラクトバチルス・パラカゼイがＳＢＳ−０００３株（ＮＩＴＥ ＢＰ−１１０９）、ラクトバチルス・ディオリヴォランスがＳＢＳ−０００７株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２０９）である（１）又は（２）に記載のサイレージ調製用乳酸菌製剤。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載のサイレージ調製用乳酸菌製剤をサイレージ原料に添加し、密封し、発酵させることを特徴とするサイレージの製造方法。
（５）サイレージ原料質量当たり、乳酸菌数を少なくとも１×１０５ＣＦＵ／ｇ添加して発酵させる（４）に記載のサイレージの製造方法。
（６）（１）〜（３）のいずれかに記載のサイレージ調製用乳酸菌製剤を用いて調製したサイレージを配合した混合飼料。
（７）ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）及びラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）を含有し、乳酸を少なくとも１．５質量％、酢酸を少なくとも１質量％含有するサイレージ。
（８）ラクトコッカス・ラクチスがＳＢＳ−０００１株（ＮＩＴＥ ＢＰ−１１０７）、ラクトバチルス・パラカゼイがＳＢＳ−０００３株（ＮＩＴＥ ＢＰ−１１０９）、ラクトバチルス・ディオリヴォランスがＳＢＳ−０００７株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２０９）である（７）に記載のサイレージ。
The present invention has the following configuration.
(1) A lactobacillus preparation for silage preparation comprising Lactococcus lactis, Lactobacillus paracasei and Lactobacillus diolivorans.
(2) A lactobacillus preparation for silage preparation comprising a culture of Lactococcus lactis, a culture of Lactobacillus paracasei, and a mixture of a culture of Lactobacillus diolivorans or a mixture of lyophilized powder of the culture.
(3) Lactococcus lactis is SBS-0001 strain (NITE BP-1107), Lactobacillus paracasei is SBS-0003 strain (NITE BP-1109), Lactobacillus diolivorans is SBS-0007 strain (NITE BP) The lactic acid bacteria preparation for silage preparation as described in (1) or (2) which is -02209).
(4) A method for producing a silage, which comprises adding the lactic acid bacteria preparation for silage preparation according to any one of (1) to (3) to a silage raw material, sealing it, and fermenting it.
(5) The method for producing silage according to (4), wherein fermentation is carried out with the addition of at least 1 × 10 5 CFU / g of lactic acid bacteria per mass of silage raw material.
The mixed feed which mix | blended the silage prepared using the lactic-acid-bacteria preparation for silage preparation in any one of (6) (1)-(3).
(7) Lactococcus lactis (Lactococcus lactis), Lactobacillus paracasei (Lactobacillus paracasei) and Lactobacillus diolivorans (Lactobacillus diolivorans), containing at least 1.5% by mass of lactic acid and at least 1 mass of acetic acid % Containing silage.
(8) Lactococcus lactis is SBS-0001 strain (NITE BP-1107), Lactobacillus paracasei is SBS-0003 strain (NITE BP-1109), Lactobacillus diolivorans is SBS-0007 strain (NITE BP) The silage as described in (7) which is -02209).
本発明により提供されるサイレージ調製用乳酸菌製剤は、高水分含量のサイレージ原料を用いてサイレージを調製しても、酪酸発酵を起こさない。
また得られたサイレージは、乳酸含量が高く、酢酸を１質量％以上含有し、低いｐＨを示すため二次発酵が抑制されるものとなる。
また広い範囲のサイレージ原料に利用可能であり、均質なサイレージを得ることができる。
このため、ＴＭＲ飼料等に応用した場合、腐敗臭や変敗臭が抑制された飼料となるため、安全性が高く家畜の採食性が改善される。そして、乳牛の乳量増加や肥育牛の体重増大などが期待される。
The lactobacillus preparation for silage preparation provided by the present invention does not cause butyric acid fermentation even if silage is prepared using a silage raw material with high water content.
Moreover, since the silage obtained has a high lactic acid content, contains 1% by mass or more of acetic acid, and exhibits a low pH, secondary fermentation is suppressed.
Moreover, it can be used for a wide range of silage raw materials, and homogeneous silage can be obtained.
Therefore, when applied to TMR feed and the like, the feed is reduced in rotten odor and rancid odor, so the safety is high and the feedability of livestock is improved. And, it is expected that milk production in dairy cows and weight gain in fattening cows will be increased.
本発明は、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）及びラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）からなるサイレージ調製用乳酸菌製剤に係る発明である。
また本発明は、前記の乳酸菌製剤を用いたサイレージの調製方法に関する。
以下、本発明について詳細に説明する。
The present invention is an invention relating to a lactic acid bacterial preparation for silage preparation comprising Lactococcus lactis, Lactobacillus paracasei and Lactobacillus diolivorans.
The present invention also relates to a method of preparing silage using the above-mentioned lactic acid bacteria preparation.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明に用いるのに適したラクトコッカス・ラクチス、ラクトバチルス・パラカゼイは、牧草から分離したものを用いることが好ましい。またすでに牧草から分離され、サイレージ調製用乳酸菌として流通しているものを用いても良い。このような分離株としては、ラクトコッカス・ラクチスＳＢＳ−０００１株、ラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ０００３株を例示することができる。
ＳＢＳ−０００１株は、（独）製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（住所：〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）にＮＩＴＥ ＢＰ−１１０７として寄託されている（寄託日：平成２３年０６月１５日）。
ＳＢＳ−０００３株は、同じく（独）製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（住所：〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に（ＮＩＴＥ ＢＰ−１１０９として寄託されている（寄託日：平成２３年０６月１５日）。
As Lactococcus lactis and Lactobacillus paracasei suitable for use in the present invention, those separated from grass are preferably used. Moreover, you may use what is already isolate | separated from grass and distribute | circulates as a lactic acid bacteria for silage preparation. As such isolates, Lactococcus lactis SBS-0001 strain and Lactobacillus paracasei SBS0003 strain can be exemplified.
The SBS-0001 strain has been deposited as a NITE BP-1107 at the Patent Microorganisms Depositary Center (Product Address), National Institute of Technology for Product Evaluation (Address: 2-5-8, Kazusa, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan). (Date of deposit: June 15, 2011).
Similarly, the SBS-0003 strain is deposited as (NITE BP-1109) at the Patent Microorganisms Depositary Center of the Product Evaluation Technology Foundation (address: 2-5-8, Kazusa Tsuji, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan). (Deposition date: June 15, 2011).
本発明において適したラクトコッカス・ラクチスは、ナイシン生産性乳酸菌として選抜すると優れた菌株を選抜することができる。
詳細な選抜方法は特許文献１にしたがって行うことができる。
具体的には、アルファルファ、クローバー、チモシー、オーチャードグラス、リードカナリーグラス、シバムギ、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、トールフェスク、メドウフェスク、フェストロリウム、ケンタッキーブルーグラス、レッドトップ、ギニアグラス、ローズグラス、ネピアグラスなどの牧草を用いて、熱水で浸出させた浸出液のみを栄養源とする培地を牧草煮汁培地として使用する。ここで熱水の温度は５０〜１００℃が好ましく、さらに７０〜１００℃がより好ましい。また、牧草を熱水に浸出させる時間は、１０〜１８０分が好ましく、さらに３０〜１２０分が好ましい。浸出液は、必要によりろ過して固形分を除いて用いるのが好ましい。牧草煮汁培地中の単糖および二糖の合計含有量を１．０質量％以下、好ましくは０．７質量％以下とする。
Lactococcus lactis suitable for the present invention can be selected as a strain excellent as a nisin producing lactic acid bacterium.
The detailed selection method can be performed according to
Specifically, alfalfa, clover, timothy, orchardgrass, reed canarygrass, shibamsugi, Italian ryegrass, perennial ryegrass, tall fescue, meadow fescue, festrorium, kentucky bluegrass, red top, guineagrass, rosegrass, napiergrass etc. A medium which uses only the leachate exfoliated with hot water as a nutrient source is used as a grass broth medium. The temperature of the hot water is preferably 50 to 100 ° C., and more preferably 70 to 100 ° C. Moreover, 10 to 180 minutes are preferable, and, as for the time which makes a grass leach out to a hot water, 30 to 120 minutes are further more preferable. The leachate is preferably filtered to remove solids, if necessary. The total content of monosaccharides and disaccharides in the grass broth medium is 1.0% by mass or less, preferably 0.7% by mass or less.
培養条件は、通常の乳酸菌が生育する条件であればよく、例えば牧草煮汁培地中に０．１〜１．０質量％接種し、２５〜３５℃で８〜２４時間静置培養すればよい。 The culture conditions may be any conditions under which normal lactic acid bacteria grow, and for example, 0.1 to 1.0 mass% may be inoculated in grass broth medium and stationary culture may be performed at 25 to 35 ° C. for 8 to 24 hours.
そして、１次スクリーニングとしてナイシン添加培地で生育する株を選抜する。選抜用の培地としてはナイシンを１００〜１０００ＩＵ／ｍＬ含有するＭＲＳ培地などを用いる。 Then, a strain grown in a nisin-supplemented medium is selected as a primary screen. As a medium for selection, an MRS medium or the like containing nisin at 100 to 1000 IU / mL is used.
本発明で好ましいラクトコッカス・ラクチス及びラクトバチルス・パラカゼイは、単糖および二糖の合計含有量が０．１〜０．４質量％の牧草煮汁培地中で上清１ｍＬあたり４０ＩＵ以上のナイシンを生産する乳酸菌である。
また、ｐＨが５という低ｐＨ条件でも、単糖および二糖の合計含有量が０．１〜０．４質量％の牧草煮汁培地中で上清１ｍＬあたり４０ＩＵ以上のナイシンを生産する能力を有する菌株を選抜する。
Lactococcus lactis and Lactobacillus paracasei, which are preferred in the present invention, produce at least 40 IU of nisin per mL of supernatant in a grass broth medium having a total content of monosaccharides and disaccharides of 0.1 to 0.4% by mass. Lactic acid bacteria.
In addition, even under low pH conditions of pH 5, it has the ability to produce at least 40 IU of nisin per mL of supernatant in grass broth medium with a total content of monosaccharides and disaccharides of 0.1 to 0.4% by mass. Select a strain.
本発明に用いるのに適したラクトバチルス・ディオリヴォランスも、牧草から分離したものを用いることが好ましい。またすでに牧草から分離されたものを用いることができる。また、サイレージ調製用乳酸菌として流通しているものを用いても良い。このような分離株としては、ラクトバチルス・ディオリヴォランスＳＢＳ−０００７株を例示することができる。
ＳＢＳ−０００７株は、（独）製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（住所：〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）にＮＩＴＥ ＢＰ−０２２０９として寄託されている（寄託日：平成２８年２月２２日）。
It is preferred that Lactobacillus diolivorans suitable for use in the present invention also be isolated from grass. Also, those already separated from grass can be used. Moreover, you may use what is distribute | circulating as lactic acid bacteria for silage preparation. Lactobacillus diolivorans SBS-0007 strain can be exemplified as such an isolate.
The SBS-0007 strain has been deposited as a NITE BP-02209 at the Patent Microorganisms Depositary Center (Product Address), National Institute of Technology and Evaluation (address: 2-5-8, Kazusa, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan). (Date of deposit: February 22, 2016).
本発明において、好ましいラクトバチルス・ディオリヴォランスの選抜方法は特許文献５にしたがって行うことができる。
例えばデントコーンなどのサイレージ調製に用いる植物の細切材料に、サイレージから分離した酵母の培養液を添加し、ポリエチレンパウチ袋に、ラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）を添加して、２５℃で２ヶ月間保存した後開封し、得られたサイレージ中の有機酸含量、酵母菌数、乳酸菌数、開封後３０℃到達時間（二次発酵時間）を指標にして第１次選抜を行う。
In the present invention, a preferred method for selecting Lactobacillus diolivorans can be performed according to Patent Document 5.
For example, a culture solution of yeast separated from silage is added to a minced material of a plant used for silage preparation such as dent corn, and Lactobacillus diolivorans is added to a polyethylene pouch bag at 25 ° C. After storing for 2 months, the container is opened, and the first selection is performed using the organic acid content in the silage obtained, the number of yeasts, the number of lactic acid bacteria, and the time to reach 30 ° C. (secondary fermentation time) after opening as an index.
次いで、サイレージとして好ましい有機酸含量、酵母菌数、乳酸菌数、開封後３０℃に到達時間（二次発酵時間）を示すラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）をＭＲＳ培地やＧＹＰ培地により培養して、菌体を回収した後破砕し、これをサイレージから分離される酵母であるＰｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓおよび／又はＩｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの増殖を指標として抗酵母作用（酵母増殖抑制作用）を確認して選別することができる。 Subsequently, Lactobacillus diolivorans (Lactobacillus diolivorans) showing the organic acid content preferable as silage, the number of yeasts, the number of lactic acid bacteria, and the reaching time (secondary fermentation time) at 30 ° C. after opening is cultured by the MRS medium or GYP medium Then, the cells are collected and then disrupted, and this is identified and checked for anti-yeast action (yeast growth inhibitory action) using the growth of the yeast Pichia membranifaciens and / or Issatchenkia orientalis isolated from silage as an indicator. Can.
本発明に用いるラクトバチルス・ディオリヴォランス乳酸菌の培養は、通常の乳酸菌用の培地を用いて行うことができる。培地としては、乳酸菌の培養に用いられる培地であれば特に限定されないが、例えばＧＹＰ培地（小崎道雄監修（１９９２）、乳酸菌実験マニュアル、朝倉書店刊）、ＭＲＳ培地（Ｊ．Ｃ．ｄｅ Ｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９６０），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，１３０−１３５）を使用することができる。培養条件については特に限定されないが、通常、ｐＨ５．０〜７．０、２５〜４０℃、１０〜２４時間で培養することができる。培養した乳酸菌は、培養液あるいは菌体を濃縮した濃縮液の状態でサイレージまたは発酵飼料に添加することもできるが、これらの液を凍結品として使用しても良い。また培養した乳酸菌を適当な保護剤や基材とともに凍結乾燥、噴霧乾燥、流動層乾燥させた粉末の状態で使用しても良い。 The culture of Lactobacillus diolivorans lactic acid bacteria used in the present invention can be carried out using a common culture medium for lactic acid bacteria. The culture medium is not particularly limited as long as it is a culture medium used for culturing lactic acid bacteria, but, for example, GYP culture medium (Mr. Ozaki edited by Michio Ozaki (1992), lactic acid bacteria experimental manual, published by Asakura Shoten), MRS medium (JC de Man, et al. (1960), Journal of Applied Bacteriology, Vol. 23, 130-135) can be used. The culture conditions are not particularly limited, but the culture can usually be carried out at pH 5.0 to 7.0, 25 to 40 ° C., for 10 to 24 hours. The cultured lactic acid bacteria can be added to silage or fermented feed in the state of a concentrated culture solution or a concentrated solution of cells, but these solutions may be used as frozen products. Also, the cultured lactic acid bacteria may be used in the form of a freeze-dried, spray-dried or fluidized-bed dried powder together with a suitable protecting agent and a base material.
本発明における乳酸菌製剤には、前記したラクトコッカス・ラクチス、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ディオリヴォランスの３種の菌株を含有させる。ラクトコッカス・ラクチスはＳＢＳ−０００１株、ラクトバチルス・パラカゼイはＳＢＳ−０００３株、ラクトバチルス・ディオリヴォランスＳＢＳ−０００７株が好ましい。また別途他の分類に属する乳酸菌を含有させても良い。 The lactic acid bacteria preparation in the present invention contains the above three strains of Lactococcus lactis, Lactobacillus paracasei and Lactobacillus diolivorans. Lactococcus lactis is preferably SBS-0001 strain, Lactobacillus paracasei is SBS-0003 strain, and Lactobacillus diolivorans SBS-0007 strain. Moreover, you may contain the lactic acid bacteria which belong to another classification separately.
前記乳酸菌製剤中の乳酸菌の含有比は、特に限定されないが、質量比で１：１：０．０５〜１の比であることが好ましい。 Although the content ratio of the lactic acid bacteria in the said lactic acid bacteria preparation is not specifically limited, It is preferable that it is a ratio of 1: 1: 0.05-1 by mass ratio.
また、本発明における乳酸菌製剤に必要に応じて、サイレージの調製に使用される公知の酵素を含有しても良い。酵素の種類としてはセルラーゼ、ヘミセルラーゼなどが例示できる。 Moreover, you may contain the well-known enzyme used for preparation of silage as needed in the lactic-acid-bacteria preparation in this invention. Examples of the type of enzyme include cellulase and hemicellulase.
本発明において、上記の乳酸菌製剤は、様々なサイレージや発酵飼料の調製に使用することができる。サイレージや発酵飼料の調製に用いられるサイレージや発酵飼料原料としては通常飼料として利用されている原料であれば特に限定されるものではないが、例えば牧草や飼料作物としてアルファルファ、クローバー、チモシー、オーチャードグラス、リードカナリーグラス、シバムギ、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、トールフェスク、メドウフェスク、フェストロリウム、ケンタッキーブルーグラス、レッドトップ、ギニアグラス、ローズグラス、ネピアグラス、エンバク、オオムギ、ライムギ、ソルガム、スーダングラス、ヒエ、トウモロコシ、飼料イネなどが挙げられる。食品製造副産物としてビール粕、豆腐粕、茶粕、焼酎粕、ウィスキー粕、ビートパルプ、バガス、コーヒー粕、ジュース粕、ケール粕、デンプン粕などが挙げられる。農産副産物として稲ワラ、麦ワラ、規格外野菜などが挙げられる。また、オカラ、ビール麦芽搾汁粕など食品製造副産物、農産副産物、乾草、濃厚飼料、ビタミン・ミネラル製剤とサイレージを混合して調製する発酵ＴＭＲにも添加することができる。これらのサイレージや発酵飼料原料は水分を４０〜９０質量％に調節して使用することが望ましい。 In the present invention, the above-mentioned lactic acid bacteria preparation can be used for the preparation of various silage and fermented feed. The silage used for preparing silage and fermented feed and the fermented feed material are not particularly limited as long as they are usually used as feed, but for example, alfalfa, clover, timothy and orchard grass as grass and feed crops , Reed canary grass, Shibamugi, Italian rye grass, Perennial rye grass, Tall fescue, Meadow fescue, Festrorium, Kentucky bluegrass, Red top, Guinea grass, Rosegrass, Napiergrass, oats, barley, rye, sorghum, sudangrass, Hye, Examples include corn and feed rice. Food production by-products include beer koji, tofu koji, tea koji, shochu, whiskey koji, beet pulp, bagasse, coffee koji, juice koji, kale koji, starch koji and the like. Agricultural by-products include rice straw, wheat straw and non-standard vegetables. It can also be added to fermented TMR which is prepared by mixing food manufacturing by-products such as okara and beer malt juice, agricultural by-products, hay, concentrated feed, vitamin / mineral preparation and silage. It is desirable to use these silage and fermented feed materials by adjusting the water content to 40 to 90% by mass.
添加する方法としては、乳酸菌製剤を水などに溶解・懸濁して原料に噴霧する方法や、粉状の乳酸菌製剤を原料に散布・混合する方法などがある。 As a method of adding, there is a method of dissolving and suspending a lactic acid bacteria preparation in water and the like and spraying it onto a raw material, a method of dispersing and mixing a powdery lactic acid bacteria preparation to the raw material and the like.
添加する乳酸菌は、菌数で、３種の菌それぞれ合計の総乳酸菌数として、原料１ｇあたり１０３〜１０７個、好ましくは１０４〜１０６個、特に好ましくは１×１０５個になるように添加することが望ましい。 The number of lactic acid bacteria to be added is 10 3 to 10 7 , preferably 10 4 to 10 6 , and particularly preferably 1 × 10 5 per 1 g of raw material, as the total number of total lactic acid bacteria in total of each of the 3 types of bacteria. It is desirable to add as.
サイレージや発酵飼料は、通常、嫌気条件下で発酵させる。発酵用の容器は、嫌気状態がある程度保持できるものであれば特に限定されない。例えばバンカーサイロ、スタックサイロ、トレンチサイロ、タワーサイロ、地下サイロ、ブロックサイロ、カップサイロ、ロールベール、フレコンバックなど、一般的にサイレージ調製用に用いる容器或いは装置が挙げられる。そして外気温（５〜３０℃程度）で１週間以上、好ましくは２ヶ月放置することで発酵させる。 Silage and fermented feed are usually fermented under anaerobic conditions. The container for fermentation is not particularly limited as long as it can maintain an anaerobic state to some extent. For example, a container or apparatus generally used for silage preparation, such as a bunker silo, a stack silo, a trench silo, a tower silo, an underground silo, a block silo, a cup silo, a roll veil, a flexible container, etc. may be mentioned. And it is fermented by leaving it for 1 week or more, preferably 2 months, at external temperature (about 5-30 degreeC).
本発明の乳酸菌製剤を用いて得られるサイレージや発酵飼料は、牛の嗜好性、採食量が良好であり、ケトーシスも生じない。また発酵も比較的低温から高温の条件でも好ましい発酵を持続する。また、本発明のサイレージは、サイレージを構成する乳酸菌が主としてラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）及びラクトバチルス・ディオリヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）からなり、さらに乳酸を少なくとも１．５質量％、酢酸を少なくとも１質量％含有している、さらにまたサイレージのｐＨが４以下となる。そのため、酪酸菌の成育が抑制され、異常発酵が生じない。さらに、本発明のサイレージは、サイレージ中の酵母数が１×１０２ｃｆｕ／ｇ以下となり、さらに酢酸含有量が高いため、サイレージを密封状態から好気的環境に開放しても酵母の増殖が起こらず、二次発酵の心配がないものとなる。 The silage and the fermented feed obtained using the lactic acid bacteria preparation of the present invention have good cow preference and feed intake, and no ketosis occurs. Fermentation also sustains a favorable fermentation under relatively low to high temperature conditions. In the silage of the present invention, lactic acid bacteria constituting the silage are mainly composed of Lactococcus lactis, Lactobacillus paracasei and Lactobacillus diolivorans, and lactic acid is further added. It contains at least 1.5% by mass, at least 1% by mass of acetic acid, and the pH of silage is 4 or less. Therefore, growth of butyric acid bacteria is suppressed and abnormal fermentation does not occur. Furthermore, the silage of the present invention has a yeast number of 1 × 10 2 cfu / g or less in the silage, and further has a high acetic acid content, so that even if the silage is released from the sealed state to the aerobic environment It does not happen and there is no concern about secondary fermentation.
雪印種苗株式会社において、保有しているサイレージから分離し樹立した、ラクトコッカス・ラクチスＳＢＳ−０００１株（ＮＩＴＥ ＢＰ−１１０７）、ラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ−０００３株（ＮＩＴＥ ＢＰ−１１０９）、ラクトバチルス・ディオリヴォランスＳＢＳ−０００７株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２０９）を用いたこの３株の菌学的性質は下記の表１のとおりである。 Lactobacillus lactis SBS-0001 strain (NITE BP-1107), Lactobacillus paracasei SBS-0003 strain (NITE BP-1109), Lactobacillus strain, isolated and established from Silage held by Snow Brand Seed Co., Ltd. The bacteriological properties of these three strains using Diorivorus SBS-0007 strain (NITE BP-02209) are as shown in Table 1 below.
（１）サイレージ調製用乳酸菌製剤の製造
１）菌株の培養
この３株を、下記の表２に示す組成の液体培地で、表３の培養条件でそれぞれ培養した。
(1) Production of Lactic Acid Bacteria Preparation for Silage Preparation 1) Cultivation of Strain The three strains were cultured under the culture conditions of Table 3 in a liquid medium having the composition shown in Table 2 below.
２）培養菌体の回収
培養終了後培養液を回収し、各菌株の培養液を１６０Ｌ得た。
この培養液中の乳酸菌数を常法によって計数したところ下記表４のとおりであった。
2) Recovery of cultured cells After completion of the culture, the culture solution was collected to obtain 160 L of culture solution of each strain.
The number of lactic acid bacteria in this culture solution was counted according to a conventional method and is as shown in Table 4 below.
３）凍結乾燥菌体の製造
回収した液体培養液のすべてを、連続式遠心分離器で遠心分離し、菌体濃縮物４０Ｌを得た。この濃縮液と、１２１℃１５分間滅菌し放冷した８０Ｌの１５％トレハロース溶液を混合し、１５℃で３０分間振盪混合させて懸濁液としたのち、マイナス３０℃で冷凍し、凍結乾燥まで保存した。各菌体の懸濁液の凍結物を凍結乾燥装置で乾燥させ、菌体の凍結乾燥粉末を得た。この凍結乾燥粉末乳酸菌数を同様に測定した。測定結果は下記の表５に示すとおりであった。この凍結乾燥粉末を以下のサイレージ調製試験に用いる乳酸菌製剤とした。
3) Production of Lyophilized Bacteria All of the collected liquid culture broth was centrifuged using a continuous centrifuge to obtain 40 L of a bacterial cell concentrate. This concentrated solution is mixed with 80 L of 15% trehalose solution which has been sterilized and cooled at 121 ° C. for 15 minutes, mixed by shaking for 30 minutes at 15 ° C. to obtain a suspension, frozen at minus 30 ° C., and freeze-dried saved. The frozen product suspension of each bacterial cell was dried by a lyophilizer to obtain a lyophilized powder of the bacterial cell. The number of freeze-dried powdered lactic acid bacteria was similarly measured. The measurement results were as shown in Table 5 below. This lyophilized powder was used as a lactic acid bacteria preparation used in the following silage preparation test.
（２）サイレージ調製試験（エンバクサイレージ）
１）サイレージの調製
成育適期のエンバクを収穫し、１００ｇずつ小分けして、乳酸菌製剤を添加したパウチサイレージを調製した。サイレージの調製条件は、２５℃、５４日間とした。なお収穫したエンバクは、日照下で２時間乾燥させたため、水分量は６８質量％であった。
添加した乳酸菌は、上記と同様にラクトコッカス・ラクチスＳＢＳ−０００１株（ＮＩＴＥ ＢＰ−１１０７）、ラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ−０００３株（ＮＩＴＥ ＢＰ−１１０９）、ラクトバチルス・ディオリヴォランスＳＢＳ−０００７株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２０９）である。添加する乳酸菌は、下記表６の組み合わせで、単独又は混合したものを用いた。また添加する乳酸菌数は、ＳＢＳ−０００１株およびＳＢＳ−０００３株、ＳＢＳ−０００７株とも１×１０５ｃｆｕ／ｇとなるようにした。
なお試験試料は、各群とも３パウチとした。
(2) Silage preparation test (oat silage)
1) Preparation of Silage Oat was harvested at an appropriate growth stage, and divided into 100 g portions to prepare pouch silage to which a lactic acid bacteria preparation was added. The preparation conditions of silage were at 25 ° C. for 54 days. The harvested oats were dried for 2 hours under sunshine, and the water content was 68% by mass.
The added lactic acid bacteria are Lactococcus lactis SBS-0001 strain (NITE BP-1107), Lactobacillus paracasei SBS-0003 strain (NITE BP-1109) and Lactobacillus diolivorans SBS-0007 strain as described above. (NITE BP-02209). The lactic acid bacteria to be added were used alone or in combination of the combinations shown in Table 6 below. In addition, the number of lactic acid bacteria added was adjusted to 1 × 10 5 cfu / g for both SBS-0001 strain, SBS-0003 strain, and SBS-0007 strain.
The test samples were 3 pouches in each group.
２）サイレージの品質試験
発酵終了後パウチを開封し、発酵状態を確認後、各サイレージの水分量（乾物率）、酸生成量及びｐＨを測定した。サイレージ中の酸として、乳酸、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸を測定した。測定した結果は、３パウチの平均値を求め、各試験試料の測定結果についてTukey法による有意差検定を行った。
2) Quality test of silage After the completion of fermentation, the pouch was opened, and after confirming the state of fermentation, the water content (dry matter rate), acid production amount and pH of each silage were measured. As acids in silage, lactic acid, acetic acid, propionic acid and n-butyric acid were measured. The measured result calculated | required the average value of 3 pouches, and performed the significant difference test by the Tukey method about the measured result of each test sample.
３）結果
測定結果を下記表７及び図１に示した。
3) Results The measurement results are shown in Table 7 below and FIG.
試験試料１は、酪酸濃度が高まり、悪臭の強い不良発酵サイレージとなった。試験試料２は、乳酸濃度が高くｐＨが低く良質なサイレージとなったが、酢酸濃度が低いため、二次発酵リスクのあるサイレージと評価した。
試験試料３は、乳酸濃度が低く、酢酸濃度の高い、飼料として好ましくない発酵状態であった。またｐＨが４．２５と高く、二次発酵リスクの高いサイレージであると判断した。試験試料４は、乳酸含有量が約３％となり、さらにｐＨが３．７と低値であり、酢酸濃度も高いことから二次発酵抑制作用を有すると判断した。また水分含量が高くとも酪酸発酵を起こさず、家畜の嗜好性の高いサイレージとなった。
表７、図１からも理解できるよう、本発明の乳酸菌製剤を用いて調製したサイレージはｐＨ４以下であり、発酵品質も良好であり、飼料として好ましい発酵状態であって、また酢酸濃度が約１．３質量％と高いことから、良質な発酵特性と二次発酵抑制を併せ持ったサイレージとなった。
試験試料１においては、他と比較して有意（p<0.05）に乳酸が低く、酪酸が高い結果であり、またｐＨが高かった。試験試料２においては、他と比較して有意（p<0.05）に乳酸が高く、ｐＨが低い結果であった。試験試料３および４においては、他と比較して有意（p<0.05）に酢酸が多い結果であったが、試験試料４のほうが有意（p<0.05）に乳酸が増え、またｐＨが低い結果であった。
The
Test sample 3 had a low lactic acid concentration, a high acetic acid concentration, and was in a fermentation state which was not preferable as feed. In addition, it was judged that the pH was as high as 4.25, and the silage had a high risk of secondary fermentation. The test sample 4 had a lactic acid content of about 3%, a pH as low as 3.7, and a high acetic acid concentration, so it was judged to have a secondary fermentation inhibitory action. Moreover, even if the water content was high, butyric acid fermentation did not occur, and the silage was highly palatable to livestock.
As can be understood from Table 7 and FIG. 1, silage prepared using the lactic acid bacteria preparation of the present invention has a pH of 4 or less, good fermentation quality, a preferable fermentation state as feed, and an acetic acid concentration of about 1 Since it is as high as 3% by mass, it is a silage combining good fermentation characteristics and secondary fermentation suppression.
In
（３）サイレージ調製試験（イタリアンサイレージ）
１）サイレージの調製
宮崎県内で収穫したイタリアンライグラス（品種：ヤヨイワセ）を予乾し、水分７３．７％とした。
イタリアンライグラスをマウントカッターで３ｃｍに細切した。乳酸菌を添加したのち、牧草は良く混合し８００ｇ／１Ｌの密度で、１Ｌサイズのボトルに詰め込み密封、２５℃環境下で２ヶ月保存した。
添加した乳酸菌は、上記と同様にラクトコッカス・ラクチスＳＢＳ−０００１株（ＮＩＴＥ ＢＰ−１１０７）、ラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ−０００３株（ＮＩＴＥ ＢＰ−１１０９）、ラクトバチルス・ディオリヴォランスＳＢＳ−０００７株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２０９）である。添加する乳酸菌は、下記表８の組み合わせで、混合したものを用いた。また添加する乳酸菌数は、ＳＢＳ−０００１株およびＳＢＳ−０００３株、ＳＢＳ−０００７株は１×１０５ｃｆｕ／ｇとなるようにした。
なお試験試料は、各群とも３ボトル調製した。
(3) Silage preparation test (Italian silage)
1) Preparation of silage Italian ryegrass (variety: Yayoi ase) harvested in Miyazaki Prefecture was predried to a moisture content of 73.7%.
Cut Italian ryegrass to 3 cm with a mount cutter. After the addition of the lactic acid bacteria, the grass was mixed well, packed at a density of 800 g / 1 L into a 1 L-sized bottle, sealed, and stored for 2 months at 25 ° C. environment.
The added lactic acid bacteria are Lactococcus lactis SBS-0001 strain (NITE BP-1107), Lactobacillus paracasei SBS-0003 strain (NITE BP-1109) and Lactobacillus diolivorans SBS-0007 strain as described above. (NITE BP-02209). The lactic acid bacteria to be added were used in combination of the combinations shown in Table 8 below. Further, the number of lactic acid bacteria to be added was adjusted to be 1 × 10 5 cfu / g for the SBS-0001 strain, the SBS-0003 strain, and the SBS-0007 strain.
The test samples were prepared in 3 bottles for each group.
２）サイレージの品質試験
発酵終了後開封し、ｐＨと有機酸含量を同様に測定した。またポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ培地）を用いて希釈平板法によって酵母菌数を測定した。測定した結果は、３ボトルの平均値を求め、各試験試料の測定結果についてTukey法による有意差検定を行った。
2) Quality test of silage It opened after completion of fermentation, and pH and organic acid content were measured similarly. The number of yeast was determined by dilution plate method using potato dextrose agar medium (PDA medium). The measured result calculated | required the average value of 3 bottles, and performed the significant difference test by the Tukey method about the measured result of each test sample.
３）結果
測定結果を下記表９及び図２、３に示した。
3) Results The measurement results are shown in Table 9 below and FIGS.
本発明の乳酸菌製剤を用いた試験試料６のサイレージでは、ｐＨが低下し乳酸及び酢酸量が増加した。酢酸含有量は１．１９％に達した。また、ｎ−酪酸の生産量は抑制された。
この結果、酵母菌数が低下し、開封後に二次発酵がしにくいサイレージとなった。
本発明の乳酸菌製剤は、イタリアンライグラスサイレージにおいても有効であり、二次発酵を抑制できることが明らかとなった。
In the silage of the test sample 6 using the lactic acid bacteria preparation of the present invention, the pH decreased and the amount of lactic acid and acetic acid increased. The acetic acid content reached 1.19%. In addition, the amount of n-butyric acid production was suppressed.
As a result, the number of yeasts decreased, resulting in silage in which secondary fermentation is difficult after opening.
The lactobacillus preparation of the present invention is also effective in Italian ryegrass silage, and it has become clear that secondary fermentation can be suppressed.
（４）サイレージ調製試験（ロールサイレージ調製試験）
１）ロールサイレージの調製
栽培した成育適期のチモシーを収穫し、１個当たり約５００ｋｇのロールサイレージを調製した。サイレージの保存期間は、２０１６年６月２３日〜８月２３日であり、６月の平均気温は１４．７℃、７月は１８．４℃、８月は２２．２℃の環境下で、２ヶ月間保存した。なお収穫したチモシーの水分量は７８．３質量％であった。
添加した乳酸菌は、上記と同様にラクトコッカス・ラクチスＳＢＳ−０００１株（ＮＩＴＥ ＢＰ−１１０７）、ラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ−０００３株（ＮＩＴＥ ＢＰ−１１０９）、ラクトバチルス・ディオリヴォランスＳＢＳ−０００７株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２０９）である。添加する乳酸菌は、下記表１０の組み合わせで、単独又は混合したものを用いた。また添加する乳酸菌数は、ＳＢＳ−０００１株およびＳＢＳ−０００３株、ＳＢＳ−０００７株とも１×１０５ｃｆｕ／ｇとなるようにした。
なお試験試料は、各群とも３ロールとした。
(4) Silage preparation test (roll silage preparation test)
1) Preparation of Roll Silage Timothy grown at an appropriate growth stage was harvested, and about 500 kg of roll silage was prepared per piece. The silage storage period is June 23-August 23, 2016, and the average temperature in June is 14.7 ° C, in July 18.4 ° C, in August 22.2 ° C. And stored for 2 months. The moisture content of the harvested timothy was 78.3% by mass.
The added lactic acid bacteria are Lactococcus lactis SBS-0001 strain (NITE BP-1107), Lactobacillus paracasei SBS-0003 strain (NITE BP-1109) and Lactobacillus diolivorans SBS-0007 strain as described above. (NITE BP-02209). The lactic acid bacteria to be added were used alone or in combination of the combinations shown in Table 10 below. In addition, the number of lactic acid bacteria added was adjusted to 1 × 10 5 cfu / g for both SBS-0001 strain, SBS-0003 strain, and SBS-0007 strain.
The test samples were 3 rolls in each group.
２）サイレージの品質試験
発酵終了後開封し、ｐＨと有機酸として乳酸及び酢酸含量を同様に測定した。またポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ培地）を用いて希釈平板法によって酵母菌数を測定した。測定した結果は、３ロールの平均値を求め、各試験試料の測定結果についてTukey法による有意差検定を行った。
2) Quality test of silage It opened after completion of fermentation, pH and lactic acid and acetic acid content as an organic acid were measured similarly. The number of yeast was determined by dilution plate method using potato dextrose agar medium (PDA medium). The measured result calculated | required the average value of 3 rolls, and performed the significant difference test by the Tukey method about the measured result of each test sample.
３）結果
ｐＨ及び有機酸測定結果を下記表１１及び図４に示した。
3) Results The results of pH and organic acid measurement are shown in Table 11 and FIG. 4 below.
試験試料７〜９は、いずれもサイレージとして適切な乳酸量であった。またサイレージとしての好ましい風味を有していた。特に本発明の製剤を用いた試験試料９は、酢酸含有量が１．５質量％と有意に高く、酵母による二次発酵を抑制する機能を有している。 The test samples 7 to 9 all had an appropriate amount of lactic acid as silage. Moreover, it had a desirable flavor as silage. In particular, the test sample 9 using the preparation of the present invention has a significantly high acetic acid content of 1.5% by mass and has a function of suppressing secondary fermentation by yeast.
酵母菌数の測定結果を表１２及び図５に示す。
また表１２、図５から明らかなように、試験試料９（本発明製剤使用サイレージ）は、酵母菌数が試験試料７の５万分の１、試験試料８の１０００分の１ときわめて低いことがわかる。本発明の製剤は、サイレージ中の乳酸菌数には影響を及ぼさず、酵母増加による好気性の発酵を抑制していることがわかった。
Further, as apparent from Table 12 and FIG. 5, the test sample 9 (silage using the preparation of the present invention) has a yeast cell count as extremely low as 1 / 50,000 of the
（５）二次発酵試験
１）試験試料調製
前記試験で調製したロールサイレージの二次発酵の確認試験を行った。
断熱材で保温し上面を開放した容器内に試験試料７、試験試料８、試験試料９を、それぞれ５００ｇ／Ｌの密度になるよう．開封直後のサイレージを充填し、これを２５℃の室温に放置し、経時的に温度を測定した（１時間間隔で測定）。
(5) Secondary Fermentation Test 1) Test Sample Preparation A confirmation test of secondary fermentation of the roll silage prepared in the above test was conducted.
Test sample 7, test sample 8, and test sample 9 are each brought to a density of 500 g / L in a container kept warm with a heat insulating material and the upper surface is opened. Immediately after opening, the silage was charged, it was left at room temperature of 25 ° C., and the temperature was measured over time (measured at 1 hour intervals).
２）結果
それぞれの試験試料の温度変化を測定した。１６５時間目までの温度変化グラフを図６に示す。
試験試料７は、７２時間目に３０℃を超え、試験試料８は、６３時間目に３０℃を超え、明らかに二次発酵による品温の上昇をきたした。一方、本発明の製剤を使用した試験試料は、室温（２５℃）に到達したあと、その後の温度上昇は認められなかった。
この試験結果から本発明の製剤を使用して調製したサイレージは二次発酵による温度上昇を抑制していることがわかった。
2) Results The temperature change of each test sample was measured. The temperature change graph up to the 165th hour is shown in FIG.
The test sample 7 exceeded 30 ° C. at 72 hours, and the test sample 8 exceeded 30 ° C. at 63 hours, apparently resulting in an increase in material temperature due to secondary fermentation. On the other hand, in the test sample using the preparation of the present invention, no temperature rise was observed after reaching room temperature (25 ° C.).
From this test result, it was found that silage prepared using the preparation of the present invention suppresses the temperature rise due to the secondary fermentation.
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