JP2019110894A - Method for producing amino acid and method of culturing euglena - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アミノ酸の製造方法及びユーグレナの培養方法に関する。 The present invention relates to a method for producing amino acids and a method for culturing Euglena.
近年、バイオマスを原料とする有用物質、例えば、生分解性バイオマスプラスチックの原料となる各種有機酸や、栄養源等として利用可能なアミノ酸、その他機能性物質の生産が注目されている。 BACKGROUND ART In recent years, production of useful substances that use biomass as a raw material, for example, various organic acids that are raw materials of biodegradable biomass plastics, amino acids that can be used as nutrient sources and the like, and other functional substances have attracted attention.
これらの有用物質の原料として、トウモロコシやサトウキビなどに由来する糖質を用い、従属栄養細菌の発酵を利用した生産も行われている。例えば、Ｌ−グルタミン酸や、Ｌ−リジン（リシン）等のＬ−アミノ酸は、これらのアミノ酸を生産するアミノ酸生産菌を用いて発酵法により工業的に生産されている。 As a raw material of these useful substances, production using fermentation of heterotrophic bacteria is also carried out using carbohydrates derived from corn, sugar cane and the like. For example, L-amino acids such as L-glutamic acid and L-lysine (lysine) are industrially produced by fermentation using amino acid-producing bacteria that produce these amino acids.
発酵法によるＬ−アミノ酸の工業的生産において、グルコース、フルクトース、スクロース等の糖類が炭素源として用いられている。炭素源としての糖類は、サトウキビなどの植物に由来するものが用いられている。しかし、食料系植物を原料として用いた場合、食料および飼料用需要との競合が生じ、安定供給面での問題を伴う。そのため、既存の食料生産と競合しないバイオマスを原料として有用物質を生産することが好ましい。 In the industrial production of L-amino acids by fermentation, saccharides such as glucose, fructose and sucrose are used as carbon sources. As saccharides as a carbon source, those derived from plants such as sugar cane are used. However, when food-based plants are used as a raw material, competition with the demand for food and feed arises, and there is a problem in terms of stable supply. Therefore, it is preferable to produce useful substances from biomass that does not compete with existing food production.
当該バイオマスとしては、近年では藻類が注目されている。藻類の中でもユーグレナは、光合成により様々な化合物を生産する能力を有し、燃料生産にも利用できることが知られている。例えば特許文献１には、バイオ燃料の原料となるワックスエステルを高含有するユーグレナの生産方法が開示されている。
In recent years, algae have attracted attention as the biomass. Among algae, Euglena is known to have the ability to produce various compounds by photosynthesis and can also be used for fuel production. For example,
藻類を利用して、アミノ酸などの有用物質を安定的に供給可能な生産系を確立できれば、培養時に二酸化炭素を吸収することで温室効果ガスの削減に寄与できるとともに、原料となる食糧系植物などの使用量の削減が期待できる。 If we can establish a production system that can stably supply useful substances such as amino acids using algae, we can contribute to the reduction of greenhouse gases by absorbing carbon dioxide at the time of culture, and can be used as a raw material for food-based plants It can be expected to reduce the amount of
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、ユーグレナを用いたアミノ酸の製造方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、有用物質であるアミノ酸の産出が増加する培地を用いて、ユーグレナを培養する工程を含むユーグレナの培養方法を提供することにある。
The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a method for producing an amino acid using Euglena.
Another object of the present invention is to provide a method for cultivating Euglena, which comprises the step of cultivating Euglena using a medium in which the production of an amino acid which is a useful substance is increased.
本発明者らは、鋭意研究した結果、ユーグレナを好気条件下で培養した後に、所定のｐＨの培地を用いて嫌気条件下で培養することにより、ユーグレナが産出するアミノ酸の産出が促進されることを見出した。 As a result of intensive studies, the present inventors cultured Euglena under aerobic conditions and then cultured under anaerobic conditions using a medium of a predetermined pH, thereby promoting the production of the amino acids produced by Euglena. I found out.
従って、前記課題は、本発明によれば、ユーグレナを好気条件下で培養する好気培養工程と、前記好気培養工程で得られた培養産物をｐＨが７以上の培地を用いて嫌気条件下で培養する嫌気培養工程と、を行うことを特徴とするアミノ酸の製造方法により解決される。 Therefore, according to the present invention, the subject is an aerobic culture step of culturing Euglena under aerobic conditions, and an anaerobic condition of the culture product obtained in the aerobic culture step using a medium having a pH of 7 or more. And an anaerobic culture step of culturing under the solution, which is solved by the method for producing an amino acid.
このとき、前記アミノ酸がグルタミン酸、アラニン、オルニチン、α−アミノ酪酸、アスパラギン酸、アスパラギン及びシスタチオニンを含む群より選択される一種以上であるとよい。
このとき、前記嫌気培養工程では、緩衝液を用いて前記培地のｐＨを７以上に維持するとよい。
このとき、前記嫌気培養工程では、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４を含む群より選択される少なくとも一種以上を用いて前記培地のｐＨを７以上に調整するとよい。
At this time, it is preferable that the amino acid be one or more selected from the group including glutamic acid, alanine, ornithine, α-aminobutyric acid, aspartic acid, asparagine and cystathionine.
At this time, in the anaerobic culture step, the pH of the culture medium may be maintained at 7 or more using a buffer solution.
At this time, in the anaerobic culture step, the pH of the medium may be adjusted to 7 or more using at least one selected from the group containing (NH 4 ) 2 HPO 4 , Na 2 HPO 4 , and K 2 HPO 4. .
また、前記課題は、本発明によれば、ユーグレナを好気条件下で培養する好気培養工程と、前記好気培養工程で得られた培養産物をｐＨが７未満の培地を用いて嫌気条件下で培養する嫌気培養工程と、を行うことを特徴とするアミノ酸の製造方法により解決される。 Further, according to the present invention, the subject is an aerobic culture step of culturing Euglena under aerobic conditions, and a culture product obtained in the aerobic culture step under anaerobic conditions using a culture medium having a pH of less than 7. And an anaerobic culture step of culturing under the solution, which is solved by the method for producing an amino acid.
このとき、前記アミノ酸がグルタミン酸、γ−アミノ酪酸、オルニチン、アスパラギン酸、アラニン、α−アミノ酪酸、スレオニン（トレオニン）、セリン、バリン、シスチン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、リジン、アルギニン及びシスタチオニンを含む群より選択される一種以上であるとよい。
このとき、前記嫌気培養工程では、緩衝液を用いて前記培地のｐＨを７未満に維持するとよい。
このとき、前記好気培養工程の後、前記嫌気培養工程の前に、前記好気培養工程で得られた培養産物に含まれるユーグレナ細胞を濃縮する細胞濃縮工程を行うとよい。
At this time, the amino acid is glutamic acid, γ-aminobutyric acid, ornithine, aspartic acid, alanine, α-aminobutyric acid, threonine (threonine), serine, valine, cystine, methionine, isoleucine, leucine, tyrosine, phenylalanine, lysine, arginine and It is preferable that it is one or more selected from the group containing cystathionine.
At this time, in the anaerobic culture step, the pH of the culture medium may be maintained at less than 7 using a buffer solution.
At this time, after the aerobic culture step, it is preferable to perform a cell concentration step of concentrating Euglena cells contained in the culture product obtained in the aerobic culture step before the anaerobic culture step.
また、前記課題は、本発明によれば、ユーグレナを好気条件下で培養する好気培養工程と、前記好気培養工程で得られた培養産物を、緩衝液を含む培地を用いてｐＨを７以上に維持して嫌気条件下で培養する嫌気培養工程と、を行うことを特徴とするユーグレナの培養方法により解決される。
また、前記課題は、ユーグレナを好気条件下で培養する好気培養工程と、前記好気培養工程で得られた培養産物を、緩衝液を含む培地を用いてｐＨを７未満に維持して嫌気条件下で培養する嫌気培養工程と、を行うことを特徴とするユーグレナの培養方法により解決される。
Further, according to the present invention, according to the present invention, the aerobic culture step of culturing Euglena under aerobic conditions and the culture product obtained in the aerobic culture step are subjected to pH adjustment using a medium containing a buffer solution. It is solved by the culture method of Euglena characterized by performing the anaerobic culture process of maintaining under 7 and maintaining it under anaerobic conditions.
Moreover, the said subject maintains the pH at less than 7 using the culture medium which contains the buffer solution, and the culture product obtained by the aerobic culture process which culture | cultivates Euglena under aerobic conditions, and the said aerobic culture process. And an anaerobic culture step of culturing under anaerobic conditions.
本発明のアミノ酸の製造方法及びユーグレナの培養方法によれば、藻類バイオマスであるユーグレナを利用して、有用物質であるアミノ酸を効率よく製造することが可能となる。また、アミノ酸を増加させるためにｐＨを調整する際に用いる物質は、無機物であってもよいため、糖類や植物由来の有機物ではないという利点を有する。さらに、アミノ酸の生産と同時に、種々の用途において有用なユーグレナ細胞も得ることができる。 According to the method for producing an amino acid of the present invention and the method for cultivating Euglena, it is possible to efficiently produce an amino acid which is a useful substance by using Euglena which is algal biomass. Moreover, since the substance used when adjusting pH in order to increase an amino acid may be an inorganic substance, it has the advantage that it is not an organic substance derived from saccharides or plants. Furthermore, Euglena cells useful in various applications can be obtained simultaneously with the production of amino acids.
以下、本発明の実施形態について、図１乃至図２２を参照しながら説明する。
本実施形態は、ｐＨが７以上又は７未満の培地を用いて嫌気条件下でユーグレナを培養する工程を行うアミノ酸の製造方法及びユーグレナの培養方法に関するものである。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to FIGS. 1 to 22.
The present embodiment relates to a method for producing an amino acid and a method for cultivating Euglena, which is a step of cultivating Euglena under anaerobic conditions using a culture medium having a pH of 7 or more or less than 7.
目的化合物であるアミノ酸は、嫌気培養工程で得られる培養産物中に含まれる。本明細書において「培養産物」とは、ユーグレナを培養して得られる全ての産物を包含する概念である。より具体的には、ユーグレナを培養槽に入れた培養液中で培養した場合には、ユーグレナ細胞およびユーグレナが産出した物質を含む培養液の全て、すなわち培養槽の内容物全てを包含する概念である。 The target compound amino acid is contained in the culture product obtained in the anaerobic culture step. As used herein, "culture product" is a concept encompassing all the products obtained by culturing Euglena. More specifically, when Euglena is cultured in a culture solution put in a culture vessel, it is a concept including all of the culture solution containing the substances produced by Euglena cells and Euglena, that is, all contents of the culture vessel. is there.
＜ユーグレナ＞
実施形態において、「ユーグレナ」とは、分類学上、ユーグレナ属（Euglena）に分類される微生物、その変種、その変異種及びユーグレナ科（Euglenaceae）の近縁種を含む。
ここで、ユーグレナ属（Euglena）とは、真核生物のうち、エクスカバータ、ユーグレノゾア門、ユーグレナ藻綱、ユーグレナ目、ユーグレナ科に属する生物の一群である。
<Euglena>
In an embodiment, “Euglena” includes taxonomically classified microorganisms classified into Euglena (Euglena), variants thereof, variants thereof and closely related species of Euglenaceae.
Here, Euglena (Euglena) is a group of organisms belonging to Excata, Euglenozoa, Euglena, Euglena, Euglenidae among eukaryotes.
ユーグレナ属に含まれる種として、具体的には、Euglena chadefaudii、Euglena deses、Euglena gracilis、Euglena granulata、Euglena mutabilis、Euglena proxima、Euglena spirogyra、Euglena viridisなどが挙げられる。
ユーグレナとして、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis），特に、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株を用いることができるが、そのほか、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株の変異株ＳＭ−ＺＫ株（葉緑体欠損株）や変種のE. gracilis var. bacillaris、これらの種の葉緑体の変異株等の遺伝子変異株、Astasia longa等のその他のユーグレナ類であってもよい。
Specific examples of Euglena species include Euglena chadefaudii, Euglena deses, Euglena gracilis, Euglena granulata, Euglena mutabilis, Euglena probila, Euglena spirogyra, Euglena viridis and the like.
As Euglena, E. gracilis (E. gracilis), in particular, E. gracilis (E. gracilis) Z strain can be used, but in addition, a mutant SM-ZK strain of E. gracilis Z strain. They may be E. gracilis var. Bacillaris of a variant (chloroplast-deficient strain), gene mutants such as chloroplast mutants of these species, and other euglenas such as Astasia longa.
ユーグレナ属は、池や沼などの淡水中に広く分布しており、これらから分離した野生型のユーグレナを使用しても良く、また、既に単離されている任意のユーグレナ属を使用してもよい。遺伝子組み換えを行っていない野生型ユーグレナを用いると、培養に際して自然界との遺伝子交雑などに配慮する必要がないため、屋外でも培養することができ、培養にかかるコストを抑制することができるため好ましい。 Euglena is widely distributed in freshwater, such as ponds and marshes, and wild-type Euglena isolated from them may be used, or any Euglena isolated previously may be used. Good. It is preferable to use wild type Euglena which has not been genetically modified, since it is not necessary to consider gene hybridization with the natural world when culturing, and therefore, it can be cultured outdoors, and the cost for culturing can be suppressed.
ユーグレナ属は、その全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組換え、形質導入、形質転換等により得られたものも含有される。例えば、アミノ酸などの有用物質を多く産出するよう遺伝子組み換えを行ったユーグレナを用いてもよい。 The genus Euglena includes all its variants. Further, among these mutant strains, those obtained by genetic methods such as recombination, transduction, transformation and the like are also contained. For example, Euglena that has been genetically modified to produce a large amount of useful substances such as amino acids may be used.
＜アミノ酸の製造方法＞
本実施形態のアミノ酸の製造方法は、ユーグレナを好気条件下で培養する好気培養工程と、前記好気培養工程で得られた培養産物をｐＨが７以上又は７未満の培地を用いて嫌気条件下で培養する嫌気培養工程と、を行うことを特徴とする。
以下、各工程について図１を参照して詳細に説明する。
<Method for producing amino acid>
The method for producing an amino acid according to the present embodiment includes an aerobic culture step of culturing Euglena under aerobic conditions, and a culture product obtained in the aerobic culture step using a culture medium having a pH of 7 or more or less than 7 And an anaerobic culture step of culturing under conditions.
Hereinafter, each process will be described in detail with reference to FIG.
（好気培養工程）
好気培養工程では、ユーグレナを好気条件下で培養する（ステップＳ１）。
ユーグレナの好気培養の条件は、従来のユーグレナの培養法において知られたものを用いることができる。培養温度は、通常２０〜３４℃の範囲内とするのが効率的な生育のために好ましい。また、培地には空気をバブリングすることが好ましく、特にユーグレナはＣＯ２を資化するため、１〜５％のＣＯ２を含む空気を培地中にバブリングすることがより好ましい。好気的培養は光照射下（明条件下）で行うことが好ましく、明暗サイクル、特に概日リズムに準じた明暗サイクル条件下（例えば１２時間明暗サイクル）で行うことがより好ましい。明条件下における光強度は、３０〜２００μｍｏｌ ｍ−２ ｓ−１の範囲とすることが好ましい。培地のｐＨは３〜８の範囲とすることが好ましい。培養期間は３日間以上であり、特に５日間以上、さらに１０日間以上とすると好ましい。
(Aerobic culture process)
In the aerobic culture step, Euglena is cultured under aerobic conditions (step S1).
As the conditions for aerobic culture of Euglena, those known in conventional Euglena culture methods can be used. The culture temperature is preferably in the range of usually 20 to 34 ° C. for efficient growth. Further, preferably bubbling air into the culture medium, in particular Euglena to assimilate CO 2, more preferably bubbling air containing 1-5% of CO 2 in the medium. Aerobic culture is preferably performed under light irradiation (light conditions), more preferably light-dark cycles, particularly light-dark cycle conditions according to the circadian rhythm (for example, 12 hours light-dark cycles). The light intensity under light conditions is preferably in the range of 30 to 200 μmol m −2 s −1 . The pH of the medium is preferably in the range of 3-8. The culture period is 3 days or more, preferably 5 days or more, and more preferably 10 days or more.
好気培養工程では、例えばＣｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地（ＣＭ培地）、Ｈｕｔｎｅｒ培地、およびＫｏｒｅｎ−Ｈｕｔｎｅｒ培地、ＡＹ培地などの公知の培地の一部組成を変更した改変培地を用いることができる。 In the aerobic culture step, for example, a modified medium in which a partial composition of a known medium such as Cramer-Myers medium (CM medium), Hutner medium, Koren-Hutner medium, or AY medium is changed can be used.
好気培養工程では、窒素欠乏条件下、例えば窒素欠乏培地を用いて、ユーグレナを好気的に培養してもよい。窒素欠乏条件とするために、培地の改変、つまり窒素源の除去を行う。例えば、ＣＭ培地であれば、組成からリン酸水素アンモニウム（（ＮＨ４）２ＨＰＯ４）を除外することにより窒素欠乏条件とすることができる。ここで、窒素欠乏条件とは、培地中の窒素濃度がＮ原子換算で０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以下、特に０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以下である状態を意味する。 In the aerobic culture step, Euglena may be cultured aerobically under nitrogen deficient conditions, for example, using a nitrogen deficient medium. The medium is modified, that is, the nitrogen source is removed, in order to obtain nitrogen deficiency conditions. For example, in the case of CM medium, nitrogen deficient conditions can be obtained by excluding ammonium hydrogen phosphate ((NH 4 ) 2 HPO 4 ) from the composition. Here, the nitrogen deficiency condition means that the nitrogen concentration in the medium is 0.1 mmol / L or less, particularly 0.01 mmol / L or less in terms of N atom.
窒素欠乏条件下で培養すると、当初はユーグレナ細胞中に蓄積された窒素源が利用されるが、それを全て資化してしまった後は、ユーグレナは窒素欠乏状態に陥る。ユーグレナはそのストレスに応じて特定のアミノ酸を産出し細胞体内に蓄積するものと考えられる。窒素欠乏培養期間は３日間以上であり、特に５日間以上、さらに１０日間以上とすると、特定のアミノ酸をより多く蓄積すると考えられるため好ましい。 Culturing under nitrogen deficient conditions initially utilizes the nitrogen source accumulated in Euglena cells, but after all it has been assimilated, Euglena becomes in a nitrogen deficient state. Euglena is considered to produce specific amino acids in response to the stress and accumulate in the cell body. The nitrogen deficiency culture period is 3 days or more, and preferably 5 days or more, and more preferably 10 days or more, because it is considered that more specific amino acids are accumulated.
好気培養工程で用いる培地の改変は、ユーグレナの増殖を促進する栄養源、あるいはアミノ酸の生合成原料となるような炭素源の追加も含まれ得る。ユーグレナの培養は、炭素源が追加された培地を用いて、完全従属栄養条件下で、あるいは光合成と培地に追加された炭素源を併用可能な条件下（本明細書において、このような光合成を併用する条件も従属栄養条件の概念に包含されるものとする）で行ってもよい。従属栄養条件下でユーグレナの培養を行うことにより、独立栄養条件下で培養を行った場合と比較して、特定のアミノ酸をより多く蓄積するようになる。 Modification of the culture medium used in the aerobic culture step may also include addition of a nutrient source that promotes Euglena growth, or a carbon source that is a biosynthetic source of amino acids. The culture of Euglena is carried out under completely heterotrophic conditions, or under conditions where photosynthesis and a carbon source added to the medium can be used in combination (in this specification, such Conditions to be used in combination may also be included in the concept of heterotrophic conditions). By culturing Euglena under heterotrophic conditions, it is possible to accumulate more specific amino acids as compared to culturing under autotrophic conditions.
培地に追加する炭素源としては、例えば、グルコースやフルクトースなどの糖類、エタノールなどのアルコール類、酢酸やリンゴ酸などのカルボン酸や、グルタミン酸などのアミノ酸といった有機酸またはその塩等、および炭酸水素ナトリウムなどの無機炭素化合物が挙げられる。例えば、培地中にエタノールを０．５〜１．０容量％加えると、ユーグレナの生育促進につながる。なお、炭素源以外の栄養源として、塩化カリウムや塩化マグネシウムなどのアルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩を培地に加えてもよい。培地に追加する炭素源としては、糖類および有機酸が好ましく、なかでもグルコースならびに酢酸およびその塩が特に好ましい。培地に追加する炭素源は、培地の他の成分とのバランスの観点から、１〜２００ｍＭ、特に１〜１００ｍＭ、とりわけ１〜２０ｍＭの範囲の濃度で添加することが好ましい。 Examples of carbon sources to be added to the medium include saccharides such as glucose and fructose, alcohols such as ethanol, carboxylic acids such as acetic acid and malic acid, organic acids such as amino acids such as glutamic acid, or salts thereof, and sodium hydrogen carbonate And inorganic carbon compounds. For example, the addition of 0.5 to 1.0% by volume of ethanol in the medium leads to the promotion of the growth of Euglena. In addition, you may add the salt of alkali metals or alkaline-earth metals, such as potassium chloride and magnesium chloride, to a culture medium as nutrient sources other than a carbon source. As a carbon source to be added to the medium, saccharides and organic acids are preferred, and glucose and acetic acid and salts thereof are particularly preferred. The carbon source added to the medium is preferably added at a concentration in the range of 1 to 200 mM, particularly 1 to 100 mM, especially 1 to 20 mM, from the viewpoint of balance with other components of the medium.
好気培養工程に用いるユーグレナは、予め前培養されているものを用いる。好ましくは１日以上、より好ましくは２日以上、特に好ましくは３日以上前培養したユーグレナが分散した培養液を採取して遠心分離し、必要に応じて脱イオン水で洗浄した後、培地に加えるなどして、好気条件下に置く。培養工程の開始時におけるユーグレナ細胞の濃度は１０〜２０ｇ／Ｌ、培養工程の完了時におけるユーグレナ細胞の濃度は２０〜５０ｇ／Ｌとすると、ユーグレナの生育効率、さらにはアミノ酸の産出効率の面から好ましい。
Euglena used in the aerobic culture step is one which has been precultured in advance. A culture solution in which Euglena, which has been precultured preferably one day or more, more preferably two days or more, particularly preferably three days or more, is collected, centrifuged, washed with deionized water as necessary, Add aerobic conditions, for example. Assuming that the concentration of Euglena cells at the start of the culture step is 10 to 20 g / L and the concentration of Euglena cells at the completion of the culture step is 20 to 50 g / L, from the aspect of the growth efficiency of Euglena and the production efficiency of amino acids. preferable.
なお、本明細書において、ユーグレナ細胞の重量は、特に言及しない場合には乾燥重量を意味する。ユーグレナ細胞体の乾燥重量は、ユーグレナが分散した培養液の所定量をサンプリングし、遠心分離、洗浄および凍結乾燥などの工程を経て水分を除去した後のユーグレナ細胞を測定して得られる重量である。従って、ｇ／Ｌの単位で表されるユーグレナ細胞の濃度とは、培養液１リットルあたりに含まれるユーグレナ細胞の乾燥重量を意味する。 In the present specification, the weight of Euglena cells means dry weight unless otherwise stated. The dry weight of the Euglena cell body is a weight obtained by measuring a predetermined amount of the Euglena-dispersed culture fluid and measuring Euglena cells after removing water through steps such as centrifugation, washing and lyophilization. . Thus, the concentration of Euglena cells expressed in units of g / L means the dry weight of Euglena cells contained per liter of culture solution.
（細胞濃縮工程）
細胞濃縮工程では、前記好気培養工程の後、前記嫌気培養工程の前に、前記好気培養工程で得られた培養産物に含まれるユーグレナ細胞を濃縮する（ステップＳ２）。
(Cell concentration process)
In the cell concentration step, after the aerobic culture step and before the anaerobic culture step, Euglena cells contained in the culture product obtained in the aerobic culture step are concentrated (step S2).
ユーグレナ細胞の濃縮は、好気培養工程で得られた好気培養産物を遠心分離した後に上清を廃棄し、沈殿したユーグレナ細胞を少量の新たな培地に分散させるなどして、ユーグレナ細胞を濃縮することで行われる。このように、ユーグレナ細胞を濃縮するとユーグレナ細胞が培養液中にアミノ酸を放出しやすくなり、嫌気培養工程後の培養液におけるアミノ酸含有量が高くなるため好ましい。濃縮は、培養産物の容量に対する、嫌気培養工程に付されるユーグレナ細胞体分散液の容量が好ましくは１／１０以下、より好ましくは１／２０以下、更に好ましくは１／５０以下、特に好ましくは１／７５以下となるように行うと、嫌気培養工程後の培養液におけるアミノ酸含有量がより高くなるため好ましい。なお、濃縮のための方法は遠心分離に限られるものではなく、他の公知の方法、例えばフィルター濾過により分散質を集積するなどの方法で行ってもよい。 Euglena cells are concentrated by centrifuging the aerobic culture product obtained in the aerobic culture step and then discarding the supernatant, dispersing the precipitated Euglena cells in a small amount of fresh medium, etc. to concentrate the Euglena cells. It is done by doing. Thus, it is preferable to concentrate Euglena cells because Euglena cells easily release amino acids into the culture solution, and the amino acid content in the culture solution after the anaerobic culture step is increased. The concentration is preferably 1/10 or less, more preferably 1/20 or less, still more preferably 1/50 or less, particularly preferably 1/10 or less, more preferably 1/20 or less, of the volume of the Euglena cell body dispersion subjected to the anaerobic culture step relative to the volume of the culture product. It is preferable to carry out so as to be 1/75 or less because the amino acid content in the culture solution after the anaerobic culture step becomes higher. In addition, the method for concentration is not limited to centrifugation, and may be performed by another known method, such as accumulating dispersoids by filter filtration.
細胞濃縮工程は、波長７３０ｎｍにおけるＯＤ（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ：光学密度、光学濃度）が５以上、より好ましくは、１０以上、特に好ましくは２０以上となるように行うとよい。 The cell concentration step may be performed such that the OD (Optical Density: optical density, optical density) at a wavelength of 730 nm is 5 or more, more preferably 10 or more, and particularly preferably 20 or more.
（嫌気培養工程）
嫌気培養工程では、製造するアミノ酸の種類に応じて、前記好気培養工程で得られた培養産物をｐＨが７以上又はｐＨが７未満の培地を用いて嫌気条件下で培養する（ステップＳ３）。
(Anaerobic culture process)
In the anaerobic culture step, the culture product obtained in the aerobic culture step is cultured under anaerobic conditions using a medium having a pH of 7 or more or less than 7 depending on the type of amino acid to be produced (Step S3) .
本工程における「嫌気培養」とは、嫌気発酵ともいえる工程であり、ユーグレナが嫌気条件下でエネルギーを獲得するために、嫌気呼吸により有機物を酸化して、アミノ酸と二酸化炭素を生産する異化代謝を意味する。また、「嫌気条件」とは、ユーグレナが好気呼吸を行うことができる最低酸素量を下回る、実質的に酸素が存在しない条件であり、酸素濃度が、通常では１％以下、好ましくは０．５％以下、特に０．２％以下、さらに完全に無酸素（酸素量が検出限界以下）の条件を意味する。ユーグレナは、好気条件下で培養すると細胞内に特定のアミノ酸を蓄積するが、それをさらに嫌気条件で培養すると、アミノ酸の生合成がさらに促進され、またアミノ酸を細胞外に放出するようになると考えられる。嫌気条件は、培養槽内の気相中における酸素濃度を上記範囲内に調整することで達成できる。例えば、気相中の気体を、窒素やアルゴンなどの不活性ガスで置換することにより達成することができる。 "Anaerobic culture" in this process is a process that can be said as anaerobic fermentation, and in order for Euglena to acquire energy under anaerobic conditions, the catabolite metabolism to produce amino acids and carbon dioxide by oxidizing organic matter by anaerobic respiration. means. Further, "anaerobic conditions" are conditions under which the Euglena can perform aerobic respiration under conditions where substantially no oxygen is present, and the oxygen concentration is usually 1% or less, preferably 0. It means conditions of 5% or less, particularly 0.2% or less, and completely completely oxygen free (oxygen amount is below detection limit). Euglena accumulates specific amino acids in cells when cultured under aerobic conditions, but when it is further cultured under anaerobic conditions, biosynthesis of amino acids is further promoted and amino acids are released extracellularly. Conceivable. Anaerobic conditions can be achieved by adjusting the oxygen concentration in the gas phase in the culture tank within the above range. For example, it can be achieved by replacing the gas in the gas phase with an inert gas such as nitrogen or argon.
嫌気培養工程は、例えば、以下に示す培養条件で行うことが出来るが、以下の条件に限定されるものではない。 The anaerobic culture step can be performed, for example, under the following culture conditions, but is not limited to the following conditions.
・培地のｐＨ
培地のｐＨは、製造するアミノ酸の産出に適した任意のｐＨを選択すればよく、ｐＨ調整には、適当な無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、例えば、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を使用することができる。
・ PH of culture medium
The pH of the culture medium may be any pH suitable for production of the amino acid to be produced, and for pH adjustment, suitable inorganic or organic acidic or alkaline substances such as sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, Potassium bicarbonate, magnesium carbonate, sodium hydroxide, calcium hydroxide, magnesium hydroxide and the like can be used.
製造するアミノ酸の種類に応じて、適宜培地のｐＨを７以上（又は７より高く）、７．２以上（又は７．２より高く）、７．５以上（又は７．５より高く）、８以上（又は８より高く）としたり、ｐＨを７未満、６．８未満（又は６．８以下）、６．５未満（又は６．５以下）、６未満（又は６以下）、５未満（又は５以下）、４未満（又は４以下）、３未満（又は３以下）としたりすればよい。
このとき、培地のｐＨの上限値は１２以下であればよく、好ましくは１１以下、より好ましくは１０以下、特に好ましくは９以下であるとよい。また、培地のｐＨの下限値は１以上であればよく、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であるとよい。
Depending on the type of amino acid to be produced, the pH of the culture medium is appropriately 7 or more (or more than 7), 7.2 or more (or more than 7.2), 7.5 or more (or more than 7.5), 8 The pH is less than 7, 6.8 (or 6.8 or less), 6.5 (or 6.5 or less), 6 (or 6 or less), 5 or less (or higher than 8). Or 5 or less), less than 4 (or 4 or less), less than 3 (or 3 or less).
At this time, the upper limit of the pH of the culture medium may be 12 or less, preferably 11 or less, more preferably 10 or less, and particularly preferably 9 or less. Further, the lower limit value of the pH of the culture medium may be 1 or more, preferably 2 or more, and more preferably 3 or more.
このとき、特定の塩を用いて、培地のｐＨ（初期ｐＨ）を７以上、より好ましくはｐＨを７．２以上に調整してもよく、例えば、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４などのリン酸塩を適宜所定の量で組み合わせて用いることが可能である。 At this time, the pH (initial pH) of the culture medium may be adjusted to 7 or more, more preferably 7.2 or more, using a specific salt, for example, (NH 4 ) 2 HPO 4 , Na 2 HPO 4 and phosphates such as K 2 HPO 4 can be used in appropriate combinations in predetermined amounts.
また、嫌気培養工程における培地として、緩衝液をベースとして用いてｐＨを所定の値に維持すると好適である。ベースとなる緩衝液としては、グリシン−ＨＣｌバッファー、酢酸ナトリウムバッファー、クエン酸ナトリウムバッファー、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＰＢＳバッファー、ＭＯＰＳバッファー、ＭＥＳバッファーなどが挙げられる。 In addition, it is preferable to maintain the pH at a predetermined value using a buffer as a medium in the anaerobic culture step. The base buffer includes glycine-HCl buffer, sodium acetate buffer, sodium citrate buffer, HEPES-KOH buffer, HEPES buffer, Tris buffer, PBS buffer, MOPS buffer, MES buffer and the like.
ここで、ＨＥＰＥＳは、4-(2-HydroxyEthyl)-1-PiperazineEthaneSulfonic acid（CAS登録番号、7365-45-9）であり、Ｔｒｉｓはトリスヒドロキシメチルアミノメタン（CAS登録番号、77-86-1）であり、ＰＢＳバッファーはリン酸緩衝生理食塩水であり、ＭＯＰＳは３−モルホリノプロパンスルホン酸（CAS登録番号、1132-61-2）であり、ＭＥＳは２−モルホリノエタンスルホン酸（CAS登録番号、4432-31-9）である。 Here, HEPES is 4- (2-HydroxyEthyl) -1-piperazineEthaneSulfonic acid (CAS registration number, 7365-45-9), and Tris is trishydroxymethylaminomethane (CAS registration number, 77-86-1). PBS buffer is phosphate buffered saline, MOPS is 3-morpholinopropane sulfonic acid (CAS Registry Number, 1132-61-2), MES is 2-morpholinoethane sulfonic acid (CAS Registry Number, 4432-31-9).
嫌気培養工程で用いる培地のベースとして、栄養源としてグルコースなどの有機炭素源を含まないＣＭ培地などの独立栄養培地を用いることが好ましいがこれに限定されるものではない。例えば、窒素源、リン源、ミネラルなどの栄養塩類を添加した培養液、例えば、Ｃｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地や、改変Ｃｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地を用いることができる。 It is preferable to use an autotrophic medium such as CM medium which does not contain an organic carbon source such as glucose as a nutrient source as a base of the medium used in the anaerobic culture step, but the invention is not limited thereto. For example, a culture solution to which a nutrient source such as a nitrogen source, a phosphorus source, or a mineral has been added, such as a Cramer-Myers medium or a modified Cramer-Myers medium can be used.
また、嫌気培養工程で用いる培地には、リン酸アンモニウム（（ＮＨ４）３ＰＯ４）、リン酸水素二アンモニウム（（ＮＨ４）２ＨＰＯ４）、リン酸二水素アンモニウム（ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４）などのリン酸塩や、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、硝酸アンモニウム（ＮＨ４ＮＯ３）などの硫酸塩や、炭酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＣＯ３）、炭酸水素アンモニウム（（ＮＨ４）ＨＣＯ３）などの炭酸塩や、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）などの塩酸塩を添加してもよい。 In addition, as media used in the anaerobic culture step, ammonium phosphate ((NH 4 ) 3 PO 4 ), diammonium hydrogen phosphate ((NH 4 ) 2 HPO 4 ), ammonium dihydrogen phosphate (NH 4 H 2 PO 4 ) 4 ) Phosphate such as ammonium sulfate (such as ammonium sulfate ((NH 4 ) 2 SO 4 ), ammonium nitrate (NH 4 NO 3 ), ammonium carbonate ((NH 4 ) 2 CO 3 ), ammonium hydrogencarbonate (( Carbonates such as NH 4 ) HCO 3 ) and hydrochlorides such as ammonium chloride (NH 4 Cl) may be added.
・培養温度
培養温度は、アミノ酸の産出に適した温度、例えば、通常１５〜４０℃であり、２０〜３４℃であることが好ましく、特に２３〜２８℃であることが好適である。
Culture temperature The culture temperature is a temperature suitable for producing an amino acid, for example, usually 15 to 40 ° C., preferably 20 to 34 ° C., particularly preferably 23 to 28 ° C.
・培養期間
培養期間は、アミノ酸が十分に産出される期間であれば特に限定されず、例えば、２〜３０日、好ましくは３〜１４日、特に好ましくは３〜５日であればよい。
Culture Period The culture period is not particularly limited as long as the amino acid is sufficiently produced, and may be, for example, 2 to 30 days, preferably 3 to 14 days, and particularly preferably 3 to 5 days.
・暗・嫌気培養
嫌気培養工程では、暗・嫌気培養を行うことが好ましい。
暗条件とは、光照射を行うことなく、光を遮った条件のことをいい、具体的には、光強度が１μｍｏｌ ｍ−２ ｓ−１以下の弱光条件または光のない暗黒条件をいう。
嫌気条件とするために、窒素ガス等の不活性ガスを供給して培養を行う、またはＣＯ２などの不活性ガスを通気しながら培養を行う等の方法を用いることができる。なお、嫌気条件とするために用いる窒素ガスは、培養系から酸素を除くために用いられるものであり、ユーグレナが窒素源として資化するために用いられるものではない。
-Dark and anaerobic culture In the anaerobic culture step, it is preferable to perform dark and anaerobic culture.
Dark conditions refer to conditions in which light is blocked without light irradiation, and more specifically, to weak light conditions in which the light intensity is 1 μmol m −2 s −1 or less or dark conditions in which there is no light. .
In order to set anaerobic conditions, it is possible to use a method such as culturing by supplying an inert gas such as nitrogen gas or culturing while aerating an inert gas such as CO 2 . The nitrogen gas used for anaerobic conditions is used to remove oxygen from the culture system, and it is not used to utilize Euglena as a nitrogen source.
・培養方式及び培養装置
嫌気培養は、例えば供給バッチ法を用いて行われ得るが、フラスコ培養や発酵槽を用いた培養、回分培養法、半回分培養法（流加培養法）、連続培養法（灌流培養法）等、いずれの液体培養法により行ってもよい。
培養は、レースウェイ型、チューブ型等の公知の培養装置や、坂口フラスコ、三角フラスコ、試薬ビンなどの実験用の培養容器を用いて行うことができる。
嫌気培養は、静置培養法、振盪培養法のいずれの方法によって行ってもよいが、振盪培養とすると、嫌気培養工程後の培養液におけるアミノ酸含有量がより高くなるため好ましい。
各種培養の条件は、培養を通じて一定であってもよいが、アミノ酸の産出量を向上させるために、培養期間に応じて各種培養条件を変化させることも可能である。
・ Culture system and culture apparatus Anaerobic culture can be performed using, for example, a fed-batch method, but flask culture, culture using a fermenter, batch culture method, semi-batch culture method (feed-batch culture method), continuous culture method It may be carried out by any liquid culture method such as (perfusion culture method).
The culture can be performed using a known culture apparatus such as a raceway type or a tube type, or an experimental culture container such as a Sakaguchi flask, an Erlenmeyer flask, or a reagent bottle.
Anaerobic culture may be performed by any of a stationary culture method and a shake culture method, but shake culture is preferable because the amino acid content in the culture solution after the anaerobic culture step becomes higher.
The conditions of various cultures may be constant throughout the culture, but it is also possible to change various culture conditions in accordance with the culture period in order to improve the yield of amino acids.
嫌気培養工程を行うことで、ユーグレナはアミノ酸を培養液中に放出する。嫌気培養後の培養液中には、培養終了直後の非濃縮状態で１００ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは２００ｍｇ／Ｌ以上、特に好ましくは３００ｍｇ／Ｌ以上のアミノ酸が含まれる。嫌気培養後の培養液中のアミノ酸含有量は、培養条件を最適化することにより、８００ｍｇ／Ｌ以上、１０００ｍｇ／Ｌ以上、さらには１５００ｍｇ／Ｌ以上とすることも可能である。従って、嫌気培養後の培養液中には、培養終了直後の非濃縮状態で、１００ｍｇ／Ｌ以上、２００ｍｇ／Ｌ以上、３００ｍｇ／Ｌ以上、８００ｍｇ／Ｌ以上、１０００ｍｇ／Ｌ以上、または１５００ｍｇ／Ｌ以上のアミノ酸が含まれ得る。 By performing the anaerobic culture step, Euglena releases amino acids into the culture solution. The culture solution after the anaerobic culture contains 100 mg / L or more, preferably 200 mg / L or more, particularly preferably 300 mg / L or more of amino acids in a non-concentrated state immediately after completion of the culture. The amino acid content in the culture solution after the anaerobic culture can be 800 mg / L or more, 1000 mg / L or more, and further 1500 mg / L or more by optimizing the culture conditions. Therefore, in the culture solution after anaerobic culture, 100 mg / L or more, 200 mg / L or more, 300 mg / L or more, 800 mg / L or more, 1000 mg / L or more, or 1500 mg / L or more in a non-concentrated state immediately after completion of culture. The above amino acids may be included.
嫌気培養後の培養液中のアミノ酸含有量は、嫌気培養産物を遠心分離して採取した上清を乾燥させて得られたサンプルを、例えばＨＰＬＣなどにより分析することにより求めることができる。嫌気培養後のユーグレナ細胞体の乾燥重量に対する、上清に含まれるアミノ酸の重量比率は０．５重量％以上であることが好ましく、特に１重量％以上、さらに１．５重量％以上であることがより好ましい。 The amino acid content in the culture solution after anaerobic culture can be determined by analyzing a sample obtained by centrifuging the anaerobic culture product and drying the supernatant collected, for example, by HPLC or the like. The weight ratio of amino acids contained in the supernatant to the dry weight of Euglena cell bodies after anaerobic culture is preferably 0.5% by weight or more, in particular 1% by weight or more, and further preferably 1.5% by weight or more. Is more preferred.
嫌気培養後の培養液中には、アミノ酸以外にも有機酸が含まれる。アミノ酸以外の有機酸の含有量は、アミノ酸に比較して極めて少なくなることが多い。嫌気培養後の培養液中に含まれるアミノ酸以外の有機酸の量は、アミノ酸含有量の１／５以下、１／６以下、特に１／７、さらに１／１０以下であってもよい。アミノ酸以外の有機酸の量が少ないことは、アミノ酸の分離精製の観点から好ましい。また、嫌気培養後の培養液中には、その他の下記のような有用な化合物が含まれ得る：３−ヒドロキシプロピオン酸、マロン酸、プロピオン酸、アセトイン、フマル酸、３−ヒドロキシブチロラクトン、アラビニトール、フルフラール、イタコン酸、レブリン酸、プロリン、キシリトール、キシロン酸、アコニット酸、クエン酸、２，５−フランジカルボン酸、グルカル酸、レボグルコサン、ソルビトール。これらの有用な化合物の含有量は、アミノ酸含有量の１／５以下、特に１／６以下、とりわけ１／７、さらに１／１０以下であってもよい。 The culture solution after the anaerobic culture contains an organic acid in addition to the amino acid. The content of organic acids other than amino acids is often extremely small compared to amino acids. The amount of organic acids other than amino acids contained in the culture solution after anaerobic culture may be 1/5 or less, 1/6 or less, particularly 1/7, and further 1/10 or less of the amino acid content. It is preferable from the viewpoint of separation and purification of amino acids that the amount of organic acids other than amino acids is small. In addition, the culture solution after anaerobic culture may contain other useful compounds as described below: 3-hydroxypropionic acid, malonic acid, propionic acid, acetoin, fumaric acid, 3-hydroxybutyrolactone, arabinitol, Furfural, itaconic acid, levulinic acid, proline, xylitol, xylonic acid, aconitic acid, citric acid, 2,5-furandicarboxylic acid, glucaric acid, levoglucosan, sorbitol. The content of these useful compounds may be 1/5 or less, in particular 1/6 or less, especially 1/7 or even 1/10 or less of the amino acid content.
また、上述のとおり、本実施形態の方法において嫌気培養工程後の培養液中には、培養終了直後の非濃縮状態で１００ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは２００ｍｇ／Ｌ以上、特に好ましくは３００ｍｇ／Ｌ以上のアミノ酸が含まれる。より好ましくは、嫌気培養工程後の培養液中には、培養終了直後の非濃縮状態で１００ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは２００ｍｇ／Ｌ以上、特に好ましくは３００ｍｇ／Ｌ以上のアミノ酸が含まれる。従って、本実施形態はさらに別の側面において、ユーグレナが産出したアミノ酸を１００ｍｇ／Ｌ以上の濃度で含有する、ユーグレナを培養して得られる培養産物、特に培養液に関する。 Further, as described above, in the culture solution after the anaerobic culture step in the method of the present embodiment, it is 100 mg / L or more, preferably 200 mg / L or more, particularly preferably 300 mg / L or more in the non-concentrated state immediately after the culture is completed. Amino acids are included. More preferably, the culture solution after the anaerobic culture step contains 100 mg / L or more, preferably 200 mg / L or more, particularly preferably 300 mg / L or more of amino acids in a non-concentrated state immediately after completion of the culture. Therefore, this embodiment relates, in yet another aspect, to a culture product, particularly a culture solution, obtained by culturing Euglena, which contains the amino acid produced by Euglena at a concentration of 100 mg / L or more.
さらに、嫌気培養工程を行った後の嫌気培養産物には、培養液中のみならず、ユーグレナ細胞中にもアミノ酸が含まれる。ユーグレナ細胞中に含まれるアミノ酸は、水または有機溶媒で抽出することにより取り出すことができる。その際、超音波破砕装置などにより機械的な力を加えるか、あるいはリゾチームなどの酵素を添加するなどして細胞膜を破壊してもよい。なお、ユーグレナ細胞中にも、アミノ酸のみならず、上記に述べたような有用な化合物が含まれ得る。 Furthermore, the anaerobic culture product after the anaerobic culture step contains amino acids not only in the culture solution but also in Euglena cells. The amino acids contained in Euglena cells can be removed by extraction with water or an organic solvent. At that time, the cell membrane may be broken by applying mechanical force with an ultrasonic disrupter or adding an enzyme such as lysozyme. Euglena cells may also contain not only amino acids but also useful compounds as described above.
（アミノ酸回収工程）
アミノ酸回収工程では、前記嫌気培養工程で得られた培養産物からアミノ酸を回収する（ステップＳ４）。
ここで、本工程における培養産物は、培地、ユーグレナ細胞アミノ酸、その他成分等の産出物を含む概念である。従って、培養産物からアミノ酸を回収するとは、ユーグレナ細胞を除去した培地からアミノ酸を回収することや、ユーグレナ細胞を含む培地からアミノ酸を回収すること、培養後のユーグレナ細胞からアミノ酸を回収することを含む概念である。
回収されるアミノ酸は、グルタミン酸、γ−アミノ酪酸、オルニチン、アスパラギン酸、アスパラギン、アラニン、α−アミノ酪酸、スレオニン、セリン、バリン、シスチン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、リジン、アルギニン及びシスタチオニンを含む群より選択される一種以上である。
(Amino acid recovery process)
In the amino acid recovery step, amino acids are recovered from the culture product obtained in the anaerobic culture step (step S4).
Here, the culture product in this step is a concept including products of a culture medium, Euglena cell amino acids, other components and the like. Therefore, recovering amino acids from the culture product includes recovering amino acids from the medium from which Euglena cells have been removed, recovering amino acids from the medium containing Euglena cells, and recovering amino acids from Euglena cells after culture. It is a concept.
The amino acids recovered are glutamic acid, γ-aminobutyric acid, ornithine, aspartate, asparagine, alanine, α-aminobutyric acid, threonine, serine, valine, cystine, methionine, isoleucine, leucine, tyrosine, phenylalanine, lysine, arginine, and cystathionine And at least one selected from the group comprising
アミノ酸回収工程には、適当な分離方法（例えば、遠心分離や、濾過、有機溶剤による抽出工程、高速液体クロマトグラフィーなどの組み合わせ）によりアミノ酸を分離して得る分離工程や、適切な分離カラムや再結晶によって所望のアミノ酸を精製する精製工程が含まれる。 In the amino acid recovery step, a separation step in which amino acids are separated by a suitable separation method (for example, a combination of centrifugation, filtration, extraction with an organic solvent, high performance liquid chromatography, etc.), an appropriate separation column, A purification step is included to purify the desired amino acid by crystallization.
＜ユーグレナの培養方法＞
上述のアミノ酸の製造方法において、嫌気培養工程後に得られた嫌気培養産物中のユーグレナ細胞は、細胞内に含有されるアミノ酸のみならず、細胞それ自体も有用性を有する。ユーグレナ細胞は、数多くのビタミン、ミネラル、アミノ酸、不飽和脂肪酸などを含有することが知られており、食品もしくは栄養補助食品または飼料として有用である。また、本実施形態の方法で嫌気培養工程後に得られるユーグレナ細胞では、嫌気培養の間に細胞に含有される糖質が減少しているため、従来よりも高付加価値である低糖質のユーグレナ細胞を提供することが可能となる。
<Euglena culture method>
In the above-described method for producing amino acids, Euglena cells in the anaerobic culture product obtained after the anaerobic culture step not only have amino acids contained in the cells, but also the cells themselves. Euglena cells are known to contain many vitamins, minerals, amino acids, unsaturated fatty acids and the like, and are useful as food or nutraceuticals or feed. In addition, in the Euglena cells obtained after the anaerobic culture step according to the method of the present embodiment, since the sugar contained in the cells is reduced during the anaerobic culture, the low-sugar Euglena cells having higher added value than conventional It is possible to provide
従って、本実施形態は別の側面において、上述の好気培養工程と嫌気培養工程とを行うことを特徴とするユーグレナの培養方法にも関する。
具体的には、ユーグレナを好気条件下で培養する好気培養工程と、前記好気培養工程で得られた培養産物をｐＨが７以上（又はｐＨが７未満）の培地を用いて嫌気条件下で培養する嫌気培養工程と、を行うことを特徴とするユーグレナの培養方法に関する。
また、ユーグレナを好気条件下で培養する好気培養工程と、前記好気培養工程で得られた培養産物を、緩衝液を含む培地を用いてｐＨを７以上（又は７未満）に維持して嫌気条件下で培養する嫌気培養工程と、を行うことを特徴とするユーグレナの培養方法であると好適である。
Therefore, in another aspect, the present embodiment also relates to a culture method of Euglena, characterized by performing the above-mentioned aerobic culture step and anaerobic culture step.
Specifically, an aerobic culture step of culturing Euglena under aerobic conditions, and a culture product obtained in the aerobic culture step are subjected to anaerobic conditions using a medium having a pH of 7 or more (or a pH of less than 7). The present invention relates to a culture method of Euglena which is characterized by performing an anaerobic culture step of culturing under.
Also, the aerobic culture step of culturing Euglena under aerobic conditions and the culture product obtained in the aerobic culture step are maintained at a pH of 7 or more (or less than 7) using a medium containing a buffer solution. It is preferable that the culture method of Euglena is characterized by performing an anaerobic culture step of culturing under an anaerobic condition.
以下、具体的実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
以下の試験例では、ユーグレナを好気的に培養した後に、様々な培地を用いてユーグレナの嫌気培養を行い、ユーグレナの各種アミノ酸産出に対する影響の検討を行った。
Hereinafter, the present invention will be specifically described based on specific examples, but the present invention is not limited to these.
In the following test examples, Euglena was aerobically cultured, then Euglena was anaerobically cultured using various media, and the influence on the production of various amino acids of Euglena was examined.
＜試験１ グルタミン及びグルタミン酸産出における塩の種類の検討＞
（試験方法）
試験１では、独立栄養培地であるＣＭ培地をベースとして、アンモニウムイオン濃度又はリン酸イオン濃度を、アンモニウム塩又はリン酸塩で調整した培養液を用いて嫌気培養工程を行い、嫌気培養工程後の培養液に含まれるグルタミン及びグルタミン酸の量を測定した。
<
(Test method)
In
（１）好気培養工程
ユーグレナ・グラシリスＺ株（ＮＩＥＳ−４８株、窒素充足下の通常の培養環境で１〜２週間程度の前培養を行ったもの）は、ＣＭ培地をベースとして、ｐＨを３.５に調整した。具体的には、脱イオン水（ＤＷ）を用いて、表１に示す組成の改変ＣＭ培地を作製し、硫酸を用いてｐＨ３.５に調整してからオートクレーブで滅菌した。
(1) Aerobic culture process Euglena gracilis Z strain (NIES-48 strain, which has been precultured for about 1 to 2 weeks in a normal culture environment with sufficient nitrogen) has a pH based on CM medium. Adjusted to 3.5. Specifically, a modified CM medium having the composition shown in Table 1 was prepared using deionized water (DW), adjusted to pH 3.5 using sulfuric acid, and then sterilized with an autoclave.
調製した培地１Ｌを１Ｌ容量のメジューム瓶に入れた後、初期濃度がＯＤ７３０＝０.０１になるようにユーグレナ・グラシリスの種藻体を接種し、添加した。 After 1 L of the prepared medium was placed in a 1 L medium bottle, Euglena gracilis seed algal cells were inoculated and added such that the initial concentration was OD 730 = 0.01.
１ｖｏｌ％濃度でＣＯ２を混合した空気を３０〜５０ｍｌ／分の流量で通気し、光源として白色蛍光灯（三菱電機照明株式会社製、ネオルミスーパー、ＦＬＲ４０ＳＷ）を用い、培養液水面に注ぐ光が５０〜８０μＥ／ｍ２・秒の強度となるように調節し、培養を行った。光の照射時間は、屋外の昼夜条件に近づけるため、１２時間点灯後に１２時間消灯する明暗サイクルとした。
培養温度２５℃で１４日間以上、１８日間以内で培養を行った。
The air mixed with 1 vol% concentration of CO 2 is ventilated at a flow rate of 30 to 50 ml / min, and light is poured onto the water surface of the culture solution using a white fluorescent lamp (Neorumisuper, FLR40SW manufactured by Mitsubishi Electric Lighting Co., Ltd.) as a light source Was adjusted to give an intensity of 50 to 80 μE / m 2 · sec. The irradiation time of light was a light and dark cycle in which light was turned on for 12 hours and then turned off for 12 hours in order to approach the outdoor day and night conditions.
The culture was carried out at a culture temperature of 25 ° C. for 14 days or more and 18 days or less.
（２）濃縮工程及び嫌気培養工程
好気培養工程で得られた培養液を所定量５０ｍＬプラスチックチューブに採取して遠心分離（８０００ｒｐｍ×２分）し、上清を捨てた。得られたユーグレナ細胞体を１０ｍＬの所定の培養液に加え、濁度がＯＤ７３０＝２０となるように、細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。バイアル瓶内の懸濁液に窒素ガスを１〜１０分間導入して酸素を除去し、ブチルゴムで蓋をして、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、２５℃で３日間振盪培養した。
(2) Concentration step and anaerobic culture step The culture solution obtained in the aerobic culture step was collected in a predetermined amount of 50 mL plastic tube and centrifuged (8000 rpm × 2 minutes), and the supernatant was discarded. The obtained Euglena cell bodies were added to 10 mL of a predetermined culture solution, and the cells were concentrated and suspended so as to have a turbidity of OD 730 = 20, and transferred to a gas chromatography vial. Nitrogen gas was introduced into the suspension in the vial for 1 to 10 minutes to remove oxygen, covered with butyl rubber, and anaerobic in the vial. The vial was wrapped in aluminum foil to give dark conditions, and shake cultured at 25 ° C. for 3 days.
そして、表１に記載のＣＭ培地をベースとして、アンモニウムイオン濃度又はリン酸イオン濃度を、アンモニウム塩又はリン酸塩で調整した培養液を用いて嫌気培養工程を行った。
アンモニウム塩としては、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮＨ４Ｃｌを用い、リン酸塩としては、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４を用いた。
また、コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）として、ＣＭ培地を用いて嫌気培養工程を行った。
Then, based on the CM medium described in Table 1, the anaerobic culture step was performed using a culture solution in which the ammonium ion concentration or the phosphate ion concentration was adjusted with ammonium salt or phosphate.
As the ammonium salt, (NH 4 ) 2 HPO 4 , (NH 4 ) 2 SO 4 , NH 4 Cl was used, and as the phosphate, KH 2 PO 4 , Na 2 HPO 4 , K 2 HPO 4 was used .
Moreover, the anaerobic culture process was performed using CM culture medium as control (control).
（３）グルタミン酸及びグルタミンの定量
グルタミン酸及びグルタミンは、バイオセンサ（ＢＦ−７Ｄ／王子計測機器社製）を用いて定量した。定量は、酵素法を用いた。培養液を遠心分離にかけることで細胞を分離し、０．４５μｍフィルターで濾過をした上清３００μＬを用いた。
(3) Quantitative Determination of Glutamic Acid and Glutamine Glutamic acid and glutamine were quantified using a biosensor (BF-7D / manufactured by Oji Scientific Instruments). The quantification used the enzyme method. The culture solution was centrifuged to separate cells, and 300 μL of supernatant filtered through a 0.45 μm filter was used.
（試験１の結果）
試験１の結果を図２乃至７に示す。
図２乃至４は、アンモニウム塩を用いた場合の結果であり、図５乃至７は、リン酸塩を用いた場合の結果である。
(Result of test 1)
The results of
FIGS. 2 to 4 show the results in the case of using an ammonium salt, and FIGS. 5 to 7 show the results in the case of using a phosphate.
図２は、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４を用いた場合の結果を示すグラフであり、グルタミン酸の生産量がコントロールと比較して（ＮＨ４）２ＨＰＯ４が１８〜３７ｍＭの場合で減少していた。（ＮＨ４）２ＨＰＯ４濃度が３７ｍＭから濃度が高くになるにつれてグルタミン酸の生産量が増加し、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４濃度が７５ｍＭと９８ｍＭの場合、コントロールに対して有意にグルタミン酸の生産量が増加した。
また、グルタミンの生産量は、コントロールに対して減少する傾向があった。
FIG. 2 is a graph showing the results when (NH 4 ) 2 HPO 4 was used, and the production amount of glutamic acid was reduced at 18 to 37 mM of (NH 4 ) 2 HPO 4 compared to the control. The (NH 4) 2 HPO 4 concentration is increased production of glutamic acid as becomes higher concentration of 37mM, (NH 4) 2 When HPO 4 concentration of 75mM and 98 mM, the production of significant glutamate to the control increased.
In addition, glutamine production tended to decrease relative to the control.
図３は、（ＮＨ４）２ＳＯ４を用いた場合の結果を示すグラフであり、グルタミン酸及びグルタミンの生産量は、コントロールと比較して変化しなかった。 FIG. 3 is a graph showing the results when (NH 4 ) 2 SO 4 was used, and the production amounts of glutamic acid and glutamine did not change as compared with the control.
図４は、ＮＨ４Ｃｌを用いた場合の結果を示すグラフであり、グルタミン酸及びグルタミンの生産量は、コントロールと比較して変化しなかった。 FIG. 4 is a graph showing the results when NH 4 Cl was used, and the production amounts of glutamic acid and glutamine did not change as compared with the control.
図５は、ＫＨ２ＰＯ４を用いた場合の結果を示すグラフであり、グルタミン酸及びグルタミンの生産量は、コントロールと比較して変化しなかった。 FIG. 5 is a graph showing the results when KH 2 PO 4 was used, and the production amounts of glutamic acid and glutamine did not change as compared with the control.
図６は、Ｎａ２ＨＰＯ４を用いた場合の結果を示すグラフであり、グルタミン酸の生産量がコントロールと比較してＮａ２ＨＰＯ４濃度が１１〜２２ｍＭの場合で減少していた。Ｎａ２ＨＰＯ４濃度が４４〜８８ｍＭの場合、コントロールに対してグルタミン酸の生産量が増加した。
また、グルタミンの生産量は、コントロールと比較して変化しなかった。
FIG. 6 is a graph showing the results when Na 2 HPO 4 was used, and the production amount of glutamic acid was decreased when the Na 2 HPO 4 concentration was 11 to 22 mM as compared with the control. Na 2 HPO 4 when the concentration is 44～88MM, production of glutamic acid is increased relative to the control.
Also, the amount of glutamine produced did not change compared to the control.
図７は、Ｋ２ＨＰＯ４を用いた場合の結果を示すグラフであり、グルタミン酸の生産量がコントロールと比較してＫ２ＨＰＯ４濃度が１１〜２２ｍＭの場合で減少していた。Ｋ２ＨＰＯ４濃度が４４ｍＭ〜８８ｍＭの場合、コントロールに対してグルタミン酸の生産量が有意に増加した。
また、グルタミンの生産量は、コントロールと比較して変化しなかった。
FIG. 7 is a graph showing the results when K 2 HPO 4 was used, and the production amount of glutamic acid was decreased when the K 2 HPO 4 concentration was 11 to 22 mM as compared with the control. When the K 2 HPO 4 concentration was 44 mM to 88 mM, the amount of glutamate produced was significantly increased relative to the control.
Also, the amount of glutamine produced did not change compared to the control.
（試験１の考察）
試験１の結果から、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４を用いた場合、グルタミン酸の生産量が増加したが、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、ＫＨ２ＰＯ４を用いた場合、グルタミン酸の生産量が増加しなかったことが示された。
(Discussion of Test 1)
From the results of
ここで、嫌気培養に用いた培地に各種塩を添加した際のｐＨ（嫌気培養開始時のｐＨ，以下初期ｐＨという）を測定した。結果を表２に示す。表２における濃度は、アンモニウム塩濃度又はリン酸塩濃度を示している。なお、ＫＨ２ＰＯ４については、元の培地にも含まれており、表２に記載の数値は追加分に相当するため、＋を付して表示している。 Here, the pH (pH at the start of anaerobic culture, hereinafter referred to as initial pH) when various salts were added to the medium used for anaerobic culture was measured. The results are shown in Table 2. The concentrations in Table 2 indicate ammonium salt concentration or phosphate concentration. Note that the KH 2 PO 4, is also included in the original medium, numerical values in Table 2 for corresponding to the additional amount, is displayed are designated by the +.
表２に示すように、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４を用いた場合、グルタミン酸生産量が増加した濃度領域において、初期ｐＨが７以上であることがわかった。
一方、グルタミン酸の生産量が増加しなかった（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、ＫＨ２ＰＯ４を用いた場合、いずれの濃度においてもｐＨが７未満であった。
したがって、嫌気培養工程における培養液の初期ｐＨを７以上とした場合に、グルタミン酸の生産量が増加することが示唆された。
As shown in Table 2, when (NH 4 ) 2 HPO 4 , Na 2 HPO 4 and K 2 HPO 4 were used, it was found that the initial pH was 7 or more in the concentration range where the amount of glutamate production increased. .
On the other hand, when (NH 4 ) 2 SO 4 , NH 4 Cl, and KH 2 PO 4 in which the amount of glutamate production did not increase were used, the pH was less than 7 at any concentration.
Therefore, it was suggested that the production amount of glutamic acid increases when the initial pH of the culture solution in the anaerobic culture step is 7 or more.
＜試験２ グルタミン及びグルタミン酸産出におけるｐＨの検討＞
（試験方法）
試験２では、２００ｍＭのＭＯＰＳ−ＫＯＨバッファーを用いて、ｐＨを６．５または７．５に維持した培養液を用いて嫌気培養工程を行った以外は試験１の試験方法に従って、嫌気培養工程後の培養液に含まれるグルタミン及びグルタミン酸の量を測定した。
具体的には、ｐＨを６．５に維持することで（ＮＨ４）２ＨＰＯ４低濃度の状態を模倣し、ｐＨを７．５に維持することで（ＮＨ４）２ＨＰＯ４高濃度の状態を模倣した。
また、コントロールとして、ＭＯＰＳ−ＫＯＨバッファーを含まないＣＭ培地を用いて嫌気培養工程を行った。
<
(Test method)
In the
Specifically, maintaining the pH at 6.5 mimics the low concentration of (NH 4 ) 2 HPO 4 and maintaining the pH at 7.5 increases the concentration of (NH 4 ) 2 HPO 4 Mimics the condition.
Moreover, the anaerobic culture process was performed using CM culture medium which does not contain MOPS-KOH buffer as control.
（試験２の結果と考察）
試験２の結果を図８及び９に示す。
図８はグルタミン酸生産量を示し、図９はグルタミン生産量を示す。
(Result and consideration of Test 2)
The results of
FIG. 8 shows glutamate production, and FIG. 9 shows glutamine production.
グルタミン酸に関し、ｐＨ７．５の場合、全ての（ＮＨ４）２ＨＰＯ４濃度において、グルタミン酸の生産量がコントロールに対して増加していた。ｐＨ６．５の場合、グルタミン酸の生産量はコントロールに対して減少していた。
つまり、コントロールに含まれている（ＮＨ４）２ＨＰＯ４に依存せず、ｐＨ＝７．５ではグルタミン酸の生産量が増加し、ｐＨ＝６．５ではグルタミン酸の生産量が低下することがわかった。
したがって、ユーグレナのグルタミン酸生産には、嫌気培養時の培養液のｐＨが重要な因子であり、培養液のｐＨを７より高い塩基性条件とすると、ユーグレナのグルタミン酸生産量がｐＨ７未満の場合と比較して増加することが示された。
With regard to glutamic acid, at pH 7.5, the production amount of glutamic acid was increased relative to the control at all (NH 4 ) 2 HPO 4 concentrations. At pH 6.5, the amount of glutamate produced was reduced relative to the control.
In other words, it was found that glutamic acid production increased at pH = 7.5 and decreased at pH = 6.5, regardless of (NH 4 ) 2 HPO 4 contained in the control. The
Therefore, the pH of the culture solution during anaerobic culture is an important factor for the production of glutamate in Euglena, and when the pH of the culture solution is a basic condition higher than 7, the production of glutamate in Euglena is compared with that when pH is less than 7 Was shown to increase.
グルタミンに関し、ｐＨに依存せず（ＮＨ４）２ＨＰＯ４を添加することでグルタミンの生産量が低下する傾向があった。ｐＨ＝６．５とｐＨ＝７．５でグルタミンの生産量の差異はそれほどなく、バッファーが含まれないコントロールと比べて減少傾向にあった。 With regard to glutamine, the addition of (NH 4 ) 2 HPO 4 regardless of pH tended to reduce glutamine production. There was no significant difference in the amount of glutamine produced at pH = 6.5 and pH = 7.5, and tended to decrease compared to the control without buffer.
＜試験３ 各種アミノ酸産出における（ＮＨ４）２ＨＰＯ４濃度（ｐＨ）依存性の検討＞
（試験方法）
試験３では、試験１の試験方法に従い、嫌気培養工程を、ＣＭ培地をベースとして、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４濃度が３０ｍＭ（ＣＭ培地の３倍、ｐＨ＝６．７７）または９８ｍＭ（ＣＭ培地の１２倍、ｐＨ＝７．３０）である培養液を用いて行い、嫌気培養工程後の培養液に含まれる各種アミノ酸の量を測定した。
また、コントロールとして、ＣＭ培地（（ＮＨ４）２ＨＰＯ４濃度７.６ｍＭ）を用いて嫌気培養工程を行った。
<
(Test method)
In
Further, as a control, were anaerobic culture step using CM medium ((NH 4) 2 HPO 4 concentration 7.6 mM).
アミノ酸は、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｌ−８９００（日立ハイテクノロジーズ社製）を用いて分析した。定量は、ニンヒドリン発色溶液キットを用いた。培養液を遠心分離にかけることで細胞を分離し、０．４５ μｍフィルターで濾過した上清２００ μＬを真空乾燥によって内容物を固化させた。これを３％トリクロロ酢酸によって除タンパクを行い、遠心分離後の上清を用いた。 Amino acids were analyzed using Amino Acid Analyzer L-8900 (manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation). For quantification, a ninhydrin coloring solution kit was used. The culture solution was centrifuged to separate cells, and 200 μL of the supernatant filtered through a 0.45 μm filter was solidified by vacuum drying. This was deproteinized with 3% trichloroacetic acid, and the supernatant after centrifugation was used.
（試験３の結果）
試験３の結果を図１０乃至１７に示す。
図１０に示すように、グルタミン酸やアスパラギンの量は、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４濃度が３０ｍＭ（ｐＨ＝６．７７）において、コントロールよりも減少するが、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４濃度が９８ｍＭ（ｐＨ＝７．３０）では、コントロールよりも増加することがわかった。
(Result of trial 3)
The results of
As shown in FIG. 10, although the amount of glutamic acid and asparagine is lower than that of the control when the (NH 4 ) 2 HPO 4 concentration is 30 mM (pH = 6.77), the (NH 4 ) 2 HPO 4 concentration is 98 mM At (pH = 7.30), it was found to increase over the control.
図１１に示すように、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の量は、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４濃度が３０ｍＭ（ｐＨ＝６．７７）において、コントロールよりも増加するが、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４濃度が９８ｍＭ（ｐＨ＝７．３０）では、コントロールよりも減少することがわかった。 As shown in FIG. 11, the amount of γ- aminobutyric acid (GABA), the (NH 4) 2 HPO 4 concentration of 30mM (pH = 6.77), but increased than the control, (NH 4) 2 HPO It was found that the concentration of 4 at 98 mM (pH = 7.30) was lower than that of the control.
図１２に示すように、オルニチンやアスパラギン酸の量は、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４濃度が３０ｍＭ（ｐＨ＝６．７７）および９８ｍＭ（ｐＨ＝７．３０）において、コントロールよりも増加しており、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４濃度（ｐＨ）が高くなるにつれて、その量が増加する傾向があることがわかった。 As shown in FIG. 12, the amounts of ornithine and aspartic acid were increased over the control at (NH 4 ) 2 HPO 4 concentrations of 30 mM (pH = 6.77) and 98 mM (pH = 7.30). It was found that as the (NH 4 ) 2 HPO 4 concentration (pH) increases, the amount tends to increase.
図１３に示すように、アラニン、α−アミノ酪酸（α−ＡＲＡ）、シスタチオニンの量は、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４濃度が３０ｍＭ（ｐＨ＝６．７７）および９８ｍＭ（ｐＨ＝７．３０）において、コントロールよりも増加しているが、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４濃度（ｐＨ）が高くなると、その量が減少する傾向があることがわかった。 As shown in FIG. 13, the amounts of alanine, α-aminobutyric acid (α-ARA) and cystathionine were 30 mM (pH = 6.77) and 98 mM (pH = 7.30) of (NH 4 ) 2 HPO 4 concentration. It was found that the amount of (NH 4 ) 2 HPO 4 (pH) was higher than that of the control, but the amount tended to decrease.
図１４乃至１６に示すように、シトルリン、β−アラニン、シスチン、ヒスチジン、カルニチン、トリプトファン、グルタミン、メチオニン、スレオニン、セリン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、尿素、バリン、アルギニン、ロイシン、リジンの量は、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４濃度が３０ｍＭ（ｐＨ＝６．７７）および９８ｍＭ（ｐＨ＝７．３０）において、コントロールよりも減少していた。 As shown in FIGS. 14 to 16, the amounts of citrulline, β-alanine, cystine, histidine, carnitine, tryptophan, glutamine, methionine, threonine, serine, isoleucine, tyrosine, phenylalanine, urea, valine, arginine, leucine, and lysine are as follows. The (NH 4 ) 2 HPO 4 concentration was reduced at 30 mM (pH = 6.77) and 98 mM (pH = 7.30) than in the control.
図１７に示すように、ホスフォエタノールアミン、エタノールアミン、ホスフォセリン、プロリンは、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４濃度（ｐＨ）によってそれほど変化しないか、濃度（ｐＨ）に依存しない不規則な傾向を示した。 As shown in FIG. 17, phosphoethanolamine, ethanolamine, phosphoserine, and proline show little change with (NH 4 ) 2 HPO 4 concentration (pH) or show irregular tendency independent of concentration (pH). The
＜試験４ 各種アミノ酸産出及び有機酸産出におけるｐＨ依存性の検討＞
（試験方法）
試験４では、嫌気培養時のｐＨを各種バッファーにて一定に維持して、各種アミノ酸産出及び有機酸産出に与える影響を検討した。
<
(Test method)
In
（１）好気培養工程
ユーグレナ・グラシリスＺ株（ＮＩＥＳ−４８株、窒素充足下の通常の培養環境で１〜２週間程度の前培養を行ったもの）は、独立栄養培地であるＣＭ培地をベースとして、ｐＨを３.５に調整した。具体的には、脱イオン水（ＤＷ）を用いて、表１に示す組成の改変ＣＭ培地を作製し、硫酸を用いてｐＨ３.５に調整してからオートクレーブで滅菌した。
(1) Aerobic culture process Euglena gracilis Z strain (NIES-48 strain, which has been precultured for about 1 to 2 weeks in a normal culture environment with sufficient nitrogen), uses CM medium which is an autotrophic medium The pH was adjusted to 3.5 as a base. Specifically, a modified CM medium having the composition shown in Table 1 was prepared using deionized water (DW), adjusted to pH 3.5 using sulfuric acid, and then sterilized with an autoclave.
調製した培地１Ｌを１Ｌ容量のメジューム瓶に入れた後、初期濃度がＯＤ７３０＝０.０１になるようにユーグレナ・グラシリスの種藻体を接種し、添加した。 After 1 L of the prepared medium was placed in a 1 L medium bottle, Euglena gracilis seed algal cells were inoculated and added such that the initial concentration was OD 730 = 0.01.
１ｖｏｌ％濃度でＣＯ２を混合した空気を３０〜５０ｍｌ／分の流量で通気し、光源として白色蛍光灯（三菱電機照明株式会社製、ネオルミスーパー、ＦＬＲ４０ＳＷ）を用い、培養液水面に注ぐ光が５０〜８０μＥ／ｍ２・秒の強度となるように調節し、培養を行った。光の照射時間は、屋外の昼夜条件に近づけるため、１２時間点灯後に１２時間消灯する明暗サイクルとした。
培養温度２５℃で１５日間培養を行った。
The air mixed with 1 vol% concentration of CO 2 is ventilated at a flow rate of 30 to 50 ml / min, and light is poured onto the water surface of the culture solution using a white fluorescent lamp (Neorumisuper, FLR40SW manufactured by Mitsubishi Electric Lighting Co., Ltd.) as a light source Was adjusted to give an intensity of 50 to 80 μE / m 2 · sec. The irradiation time of light was a light and dark cycle in which light was turned on for 12 hours and then turned off for 12 hours in order to approach the outdoor day and night conditions.
The culture was carried out at a culture temperature of 25 ° C. for 15 days.
（２）濃縮工程及び嫌気培養工程
好気培養工程で得られた培養液を所定量５０ｍＬプラスチックチューブに採取して遠心分離（８０００ｒｐｍ×２分）し、上清を捨てた。得られたユーグレナ細胞体を１０ｍＬの各ｐＨ（バッファーで調整）の培養液に加え、濁度がＯＤ７３０＝２０となるように、細胞を濃縮、懸濁し、ガスクロマトグラフィー用のバイアル瓶に移した。バイアル瓶内の懸濁液に窒素ガスを１〜１０分間導入して酸素を除去し、ブチルゴムで蓋をして、バイアル瓶中を嫌気状態にした。バイアル瓶をアルミホイルで包んで暗条件とし、２５℃で３日間振盪培養した。
(2) Concentration step and anaerobic culture step The culture solution obtained in the aerobic culture step was collected in a predetermined amount of 50 mL plastic tube and centrifuged (8000 rpm × 2 minutes), and the supernatant was discarded. The obtained Euglena cell bodies are added to 10 mL of culture solution of each pH (adjusted with buffer), and the cells are concentrated and suspended so that the turbidity is OD 730 = 20, and transferred to a vial for gas chromatography did. Nitrogen gas was introduced into the suspension in the vial for 1 to 10 minutes to remove oxygen, covered with butyl rubber, and anaerobic in the vial. The vial was wrapped in aluminum foil to give dark conditions, and shake cultured at 25 ° C. for 3 days.
培養液に添加したバッファーは、以下のとおりである（ｐＨ３，ｐＨ６〜８のバッファー濃度は２０ｍＭ，ｐＨ４、５のバッファー濃度は３５０ｍＭ）。
ｐＨ３：グリシン−ＨＣｌバッファー
ｐＨ４：酢酸ナトリウムバッファー
ｐＨ５：酢酸ナトリウムバッファー
ｐＨ６：クエン酸ナトリウムバッファー
ｐＨ７：ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨバッファー
ｐＨ８：ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨバッファー
The buffer added to the culture solution is as follows (
pH 3: glycine-HCl buffer pH 4: sodium acetate buffer pH 5: sodium acetate buffer pH 6: sodium citrate buffer pH 7: HEPES-KOH buffer pH 8: HEPES-KOH buffer
（３）アミノ酸及び有機酸の定量
アミノ酸は、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｌ−８９００（日立ハイテクノロジーズ社製）を用いて分析した。定量は、ニンヒドリン発色溶液キットを用いた。培養液を遠心分離にかけることで細胞を分離し、０．４５μｍフィルターで濾過した上清２００μＬを真空乾燥によって内容物を固化させた。これを３％トリクロロ酢酸によって除タンパクを行い、遠心分離後の上清を用いた。
(3) Determination of Amino Acid and Organic Acid The amino acid was analyzed using Amino Acid Analyzer L-8900 (manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation). For quantification, a ninhydrin coloring solution kit was used. The culture solution was centrifuged to separate cells, and 200 μL of the supernatant filtered through a 0.45 μm filter was solidified by vacuum drying. This was deproteinized with 3% trichloroacetic acid, and the supernatant after centrifugation was used.
（試験４の結果）
試験４の結果を図１８乃至２２に示す。
(Result of Test 4)
The results of
なお、図１８乃至２２における成分名の略称は以下のとおりである。
フォスフォセリン（Ｐ−Ｓｅｒ）、タウリン（Ｔａｕ）、ホスフォエタノールアミン（ＰＥＡ）、尿素（Ｕｒｅａ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、セリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（ＡｓｐＮＨ２）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（ＧｌｕＮＨ２）、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、α−アミノ−ｎ−酪酸（α−ＡＢＡ）、バリン（Ｖａｌ）、シスチン（Ｃｙｓｔｉｎｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、シスタチオニン（Ｃｙｓｔａ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、β−アラニン（β−Ａｌａ）、β−アミノイソ酪酸（β−ＡｉＢＡ）、γ−アミノ酪酸（γ−ＡＢＡ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、エタノールアミン（ＥＯＨＮＨ２）、アンモニア（ＮＨ３）、（５−）ヒドロキシ−Ｌ−リジン（Ｈｙｌｙｓ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、リジン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、カルノシン（Ｃａｒ）、アルギニン（Ａｒｇ）。
The abbreviation of the component name in FIGS. 18 to 22 is as follows.
Phosphoserine (P-Ser), Taurin (Tau), Phosphoethanolamine (PEA), Urea (Urea), Aspartic Acid (Asp), Threonine (Thr), Serine (Ser), Asparagine (AspNH2), Glutamic Acid Glu), glutamine (GluNH2), glycine (Gly), alanine (Ala), citrulline (Cit), α-amino-n-butyric acid (α-ABA), valine (Val), cystine (Cystine), methionine (Met) , Cystathionine (Cysta), isoleucine (Ile), leucine (Leu), tyrosine (Tyr), phenylalanine (Phe), β-alanine (β-Ala), β-aminoisobutyric acid (β-AiBA), γ-aminobutyric acid γ-ABA), tryptophan (Trp), ethanol Amine (EOHNH2), ammonia (NH3), (5-) hydroxy-L-lysine (Hylys), ornithine (Orn), lysine (Lys), histidine (His), carnosine (Car), arginine (Arg).
図１８至２２に示すように、嫌気培養工程における培地のｐＨを７未満に維持したとき、特にｐＨを６未満（ｐＨを５以下）に維持したときに、スレオニン、セリン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、シスチン、メチオニン、シスタチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、オルニチン、リジン及びアルギニンが増加する傾向にあることがわかった。 As shown in FIGS. 18 to 22, threonine, serine, glutamic acid, glycine, and alanine are maintained when the pH of the medium in the anaerobic culture step is maintained at less than 7, particularly when the pH is maintained at less than 6 (pH is 5 or less). It was found that valine, cystine, methionine, cystathionine, isoleucine, leucine, leucine, tyrosine, phenylalanine, ornithine, lysine and arginine tended to increase.
また、嫌気培養工程における培地のｐＨを７以上に維持したときに、アラニン、ロイシン、オルニチンが増加する傾向にあることがわかった。
In addition, it was found that when the pH of the medium in the anaerobic culture step is maintained at 7 or more, alanine, leucine and ornithine tend to increase.
Claims (10)
前記好気培養工程で得られた培養産物をｐＨが７以上の培地を用いて嫌気条件下で培養する嫌気培養工程と、
を行うことを特徴とするアミノ酸の製造方法。 Aerobic culture step of culturing Euglena under aerobic conditions;
An anaerobic culture step of culturing the culture product obtained in the aerobic culture step under anaerobic conditions using a medium having a pH of 7 or more;
A method of producing an amino acid characterized in that
前記好気培養工程で得られた培養産物をｐＨが７未満の培地を用いて嫌気条件下で培養する嫌気培養工程と、
を行うことを特徴とするアミノ酸の製造方法。 Aerobic culture step of culturing Euglena under aerobic conditions;
An anaerobic culture step of culturing the culture product obtained in the aerobic culture step under anaerobic conditions using a medium having a pH of less than 7;
A method of producing an amino acid characterized in that
前記好気培養工程で得られた培養産物を、緩衝液を含む培地を用いてｐＨを７以上に維持して嫌気条件下で培養する嫌気培養工程と、
を行うことを特徴とするユーグレナの培養方法。 Aerobic culture step of culturing Euglena under aerobic conditions;
An anaerobic culture step of culturing the culture product obtained in the aerobic culture step under an anaerobic condition by maintaining pH at 7 or more using a medium containing a buffer solution;
A culture method of Euglena characterized by performing.
前記好気培養工程で得られた培養産物を、緩衝液を含む培地を用いてｐＨを７未満に維持して嫌気条件下で培養する嫌気培養工程と、
を行うことを特徴とするユーグレナの培養方法。
Aerobic culture step of culturing Euglena under aerobic conditions;
An anaerobic culture step of culturing the culture product obtained in the aerobic culture step under anaerobic conditions by maintaining pH at less than 7 using a medium containing a buffer solution;
A culture method of Euglena characterized by performing.
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