JP2019107003A - ウイルス阻害性ヌクレオチド配列およびワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
上のAGG配列を変化させるように突然変異されているウイルス核酸配列を含有する組換えウイルスに向けられる。別の具体例において、突然変異体ウイルス核酸は突然変異体HIV核酸である。
別の具体例において、本発明は、対応する野生型ウイルスより高い蛋白質発現が可能なウイルスワクチンに向けられ、該ウイルスワクチンは野生型ウイルス核酸配列よりも少数のAGG配列を持つ核酸配列を含む。別の具体例において、本発明は、対応する野生型HIVウイルスよりも高い蛋白質発現が可能なHIVワクチンに向けられ、該HIVワクチンは野生型HIVウイルス核酸配列よりも少数のAGG配列を持つ核酸配列を含む。
、または刺激する剤を同定するための方法に向けられる。別の具体例において、該方法は少なくとも1つのAGGモチーフを含有する少なくとも1つのウイルス核酸配列を含有する対照細胞、および非AGG配列に対して突然変異されている少なくとも1つのAGGモチーフを含有する少なくとも1つのウイルス核酸配列を含有するテスト細胞を供し、該テスト細胞および該対照細胞を1以上の剤と接触させ、次いで、対照細胞と比較して、テスト細胞において、RNAウイルスの生産、レンチウイルス蛋白質の生産またはウイルス粒子の生産を阻害し、または刺激する、あるいはウイルス潜伏を阻害し、または刺激する、少なくとも1つの剤を同定することを含む。他の具体例において、該剤は、HIV RNAの生産、HIV蛋白質の生産、またはHIV粒子の生産を阻害し、または刺激し、あるいはHIV潜伏を阻害し、または刺激する。
単数形「ある」「該」は、内容が明らかにそうでないことを指令しているのでなければ、複数参照を含む。かくして例えば、ある「ウイルス」への言及は、複数のこのようなウイルスを含む。
、ナノウイルス、ナルナウイルス、ネクロウイルス、ネポウイルス、ノロウイルス、ノビルハブドウイルス、ヌクレオポリヘドロウイルス、ヌクレオハブドウイルス、ヌパピローマウイルス、オカウイルス、オレアウイルス、オメガテトラウイルス、オミクロンパピローマウイルス、オルビウイルス、オルトブンニアウイルス、オルトヘパドナウイルス、オルトポックスウイルス、オルトレオウイルス、オリザウイルス、パニコウイルス、パラポックスウイルス、パレコウイルス、パルチチウイルス、パルボウイルス、ペフデンソウイルス、ペスチウイルス、ペツウイルス、ファエオウイルス、フレボウイルス、ファイトレオウイルス、ピパピローマウイルス、プラスマウイルス、プレクトロビ、ニューモウイルス、ポレロウイルス、ポリオーマウイルス、ポッテクスウイルス、ポチウイルス、プラシノウイルス、プリムネシオウイルス、シュードウイルス、ラナウイルス、ラフィドウイルス、レスピロウイルス、ラジノウイルス、リノウイルス、ロセオロウイルス、ロタウイルス、ルブウイルス、ルビラウイルス、ルディウイルス、リモウイルス、サポウイルス、セアドルナウイルス、セキウイルス、シアデノウイルス、シンプレックスウイルス、ソイモウイルス、スピロミクロウイルス、スプマウイルス、スイポックスウイルス、テクチウイルス、テショウイルス、テタパピローマウイルス、トゴトウイルス、トンブスウイルス、トポクウイルス、トロウイルス、トスポウイルス、トチウイルス、トリコウイルス、トリチモウイルス、ツングロウイルス、ティモウイルス、バリセロウイルス、ベシキュロウイルス、ベシウイルス、ビチウイルス、ワイカウイルス、ウィスポウイルス、キシパピローマウイルス、ヤタポックスウイルス、ゼータパピローマウイルス、またはそのいずれかの組合せを含む。
HIV生物学
HIVゲノムは、そのうちいくつかは、蛋白質分解切断に際して異なる機能体を生じる「ポリ蛋白質」として生産されるいくつかの蛋白質をコードする。「ポリ蛋白質」およびそれらの蛋白質分解切断産物を含めた、HIVゲノムによってコードされる蛋白質の全ては本発明の範囲内にあり、「HIV蛋白質」、「HIVペプチド」、「HIVポリ蛋白質」、「本発明の蛋白質」、「本発明のポリ蛋白質」または「本発明のペプチド」として本明細書中において言及することができる。本発明のINSは、これらの蛋白質のいずれかまたは全てをコードするヌクレオチド配列に存在させることができる。本発明のINSは、HIVゲノムの非コーディング領域に存在させることもできる。
およびp6蛋白質へウイルスプロテアーゼによって切断できるpr55 GAG蛋白質をコードする。Pr160 GAG−POL前駆体蛋白質は、翻訳フレームシフティングによって作成され、引き続いて、逆転写酵素(RT)、RNAase H、プロテアーゼ(PR)およびインテグラーゼ(IN)に切断されるポリメラーゼポリ蛋白質を生産する。Gp160エンベロープ蛋白質は、細胞プロテアーゼによって、ウイルスをCD−4受容体および共受容体に付着させるGp120蛋白質(ENV)、およびウイルスエンベロープを宿主細胞膜に融合させるGp41膜貫通蛋白質に切断される。これらは主な構造蛋白質、およびHIV粒子の酵素である。2つのさらなる蛋白質、TatおよびRevは、組み込まれたプロウイルス(Tat)の転写、およびスプライシングされていないmRNA(GAG−POLおよびウイルスゲノムRNA)の、核から細胞質(Rev)への輸送を調節する。これらの活性は、ウイルス遺伝子の発現、および複製サイクルの間の一時的事象を調節する。4つのアクセサリー蛋白質:Vpu、Vif、VprおよびNefは、細胞蛋白質とで複合体を形成し、イン・ビボにて感染性ウイルスの生産を増強させるが、いくつかの細胞培養においては最小表現型をより多く有するアダプターである。これらのHIV蛋白質の全ては本発明の範囲内にある。
性エレメント(RRE)に結合した後にのみ、より大きくスプライシングされていない、または十分にスプライシングされていないmRNAは細胞質により効果的に輸送される。このようにして、TATおよびREVの合成はウイルスのライフサイクルのタイミングを調節する。
妨げるシグナルの組を含有するようである。これらのORFの不十分な発現の主な原因は核封じ込めである。HIV−1のゲノムは、ヒトゲノムにおける既知のコーディング遺伝子の組と比較して、異常なヌクレオチド分布を有する。HIV−1の臨床的単離体にわたって平均されたアデニンの割合は、平均ヒトコーディング遺伝子を上回る。本実験およびワクチン試験で広く用いられるコドン最適化株は、ヒト細胞に導入されたGagの発現レベルを500および1000倍の間で増加させることができる。しかしながら、コドン最適化による発現の実質的な増加は、せいぜい、核単離の問題に間接的に取込むことができる。
遺伝子暗号は縮重しているゆえに、ヌクレオチド配列は、ヌクレオチドレベルにおいて相互から異なる可能性があるが、同一蛋白質またはペプチドをコードすることができる。しかしながら、天然においては、しばしば、特定のコドン用法およびAT/GC含有量についての選択的圧力がある。また、ヌクレオチド配列によってコードされる蛋白質においてアミノ酸の頻度および順序に対して選択的圧力がある。これらの選択圧の各々について正規化され、次いで、ゲノムにおいて予測される配列モチーフ(例えば、長さが2〜8ヌクレオチドの配列モチーフ)の平均頻度を計算し、これをこれらのモチーフの現実の頻度と比較する方法が開発されている。この方法は、その内容を本明細書に引用して援用する、同時係属仮特許出願第60/808,420号に、およびRobinsら(2005),Journal of Bacteriology,Vol.187,p.8370−74に記載されている。これらの内容は本明細書に引用して援用する。この方法を用いて、ゲノムにおいて過剰および/または過少発現された(under−represented)オリゴヌクレオチド配列モチーフのリフトを生じさせることができる。このような過剰および/または過少発現された配列は機能的情報を含有することができる。
のゲノムにおいて存在することが可能である。一つの具体例において、本発明は、限定されるものではないが、アデノウイルス、アルファモウイルス、アレキシウイルス、アロレビウイルス、アルファクリプトウイルス、アルファリポトリクスウイルス、アルファノドアウイルス、アルファパピローマウイルス、アルファレトロウイルス、アルファウイルス、アンドウイルス、アンペロウイルス、アフソウイルス、アクアビルナウイルス、アクアレオウイルス、アレナウイルス、アルテリウイルス、アスコウイルス、アスフィウイルス、アタデノウイルス、オーレウスウイルス、アバストロウイルス、アベナウイルス、アビアドノウイルス、アビビルナウイルス、アビヘパドナウイルス、アビポックスウイルス、アブラウイルス、バブウイルス、バドナウイルス、バルナウイルス、ブデッルロミクロウイルス、ベゴモウイルス、ベータクリプトウイルス、ベータリポトリクスウイルス、ベータノドウイルス、ベータパピローマウイルス、ベータレトロウイルス、ベータテトラウイルス、ボカウイルス、ボルナウイルス、ブラコウイルス、ブレビデンソウイルス、ブロモウイルス、ビモウイルス、カピロウイルス、カプリポックスウイルス、カルディオウイルス、カルラウイルス、カルモウイルス、カウリモウイルス、カベモウイルス、クラミジアミクロウイルス、クロロウイルス、クロリリドウイルス、クリソウイルス、シルコウイルス、クロステロウイルス、コッコリトウイルス、コルチウイルス、コモウイルス、コロナウイルス、コルチコウイルス、クリパウイルス、ククモウイルス、クルトウイルス、シポウイルス、シストウイルス、サイトメガロウイルス、サイトラブドウイルス、ダイントウイルス、デルタパピローマウイルス、デルタレトロウイルス、デンソウイルス、デペンドウイルス、エボラウイルス、エナモウイルス、エンテロウイルス、エントモビルナウイルス、エントモポックスウイルスA、エントモポックスウルスB、エントモポックスウイルスC、エフェメロウイルス、イプシロンパピローマウイルス、イプシロンレトロウイルス、エルボウイルス、エランチウイルス、エリスロウイルス、エタパピローマウイルス、ファバウイルス、フィジウイルス、フラビウイルス、フォベアウイルス、フセロウイルス、ガンマリポトリクスウイルス、ガンマパピローマウイルス、ガンマレトロウイルス、ジャルディアウイルス、グラヌロウイルス、グッタウイルス、ジロウイルス、ハンタウイルス、ヘミウイルス、ヘニパウイルス、ヘパシウイルス、ヘパドナウイルス、ヘパトウイルス、ヒポウイルス、イクノウイルス、イクタルリウイルス、イドノレオウイルス、イラルウイルス、イルトウイルス、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、インフルエンザCウイルス、イノウイルス、イオタパピローマウイルス、イポモウイルス、イリドウイルス、イサウイルス、イテラウイルス、カッパパピローマウイルス、コブウイルス、ラゴウイルス、ラムダパピローマウイルス、レイシュマニアウイルス、レンチウイルス、レポリポックスウイルス、レビウイルス、ルテオウイルス、リンフォクリプトウイルス、リンフォシスチウイルス、リサウイルス、マクロモウイルス、マクルラウイルス、マキュラウイルス、ママストロウイルス、マンダリウイルス、マラフィウイルス、マルブルグウイルス、マルジウイルス、マルナウイルス、マスタデノウイルス、マストレウイルス、メガロシトウイルス、メタニューモウイルス、メタウイルス、ミクロウイルス、マイトウイルス、モルシポックスウイルス、モルビリウイルス、ムパピローマウイルス、ムロメガロウイルス、マイコレオウイルス、ナイロウイルス、ナノウイルス、ナルナウイルス、ネクロウイルス、ネポウイルス、ノロウイルス、ノビルハブドウイルス、ヌクレオポリヘドロウイルス、ヌクレオハブドウイルス、ヌパピローマウイルス、オカウイルス、オレアウイルス、オメガテトラウイルス、オミクロンパピローマウイルス、オルビウイルス、オルトブンニアウイルス、オルトヘパドナウイルス、オルトポックスウイルス、オルトレオウイルス、オリザウイルス、パニコウイルス、パラポックスウイルス、パレコウイルス、パルチチウイルス、パルボウイルス、ペフデンソウイルス、ペスチウイルス、ペツウイルス、ファエオウイルス、フレボウイルス、ファイトレオウイルス、ピパピローマウイルス、プラスマウイルス、プレクトロビ、ニューモウイルス、ポレロウイルス、ポリオーマウイルス、ポッテクスウイルス、ポチウイルス、プラシノウイルス、プリムネシオウイルス、シュードウイルス、ラナウイルス、ラフィドウイルス、レスピロウイルス、ラジノウイルス、リノウイルス、ロセオロウイルス、ロタウイルス、ルビウイルス、ルブラウイルス
、ルディウイルス、リモウイルス、サポウイルス、セアドルナウイルス、セキウイルス、シアデノウイルス、シンプレックスウイルス、ソイモウイルス、スピロミクロウイルス、スプマウイルス、スイポックスウイルス、テクチウイルス、テショウイルス、テタパピローマウイルス、トゴトウイルス、トンブスウイルス、トポクウイルス、トロウイルス、トスポウイルス、トチウイルス、トリコウイルス、トリチモウイルス、ツングロウイルス、ティモウイルス、バリセロウイルス、ベシキュロウイルス、ベシウイルス、ビチウイルス、ワイカウイルス、ウィスポウイルス、キシパピローマウイルス、ヤタポックスウイルス、ゼータパピローマウイルス科のウイルスを含めたいずれのウイルス科のゲノムにおけるINS配列にも向けられる。
チーフ中の第二のヌクレオチドは、GからA、T、C、U、またはいずれかの他の天然に生じるまたは合成ヌクレオチドに突然変異していてもよい。AGGモチーフにおける第三のヌクレオチドは、GからA、T、C、U、またはいずれかの他の天然に生じるまたは合成ヌクレオチドに突然変異されていてもよい。AGGモチーフのいずれの1つの位置が変化されていてもよく、あるいはAGGモチーフの多数の位置が変化されていてもよい。例えば、AGGモチーフ中のいずれかのヌクレオチド位置1、2または3が変化されていてよい(ここで、位置1は元来Aであった位置であり、位置2は元来Gであった位置、および位置3は元来第二のGであった蛋白質である)。さらに、AGGモチーフのいずれの2つの位置は前記したように変化されてよく、あるいはAGGモチーフの全ての3つの位置は前記したように変化されてもよい。非AGG配列へのAGGモチーフの突然変異は、AGGモチーフを分裂するための1以上のヌクレオチドの挿入、または他のヌクレオチドの代わりにそれらで置換することのないAGGからの1以上のヌクレオチドの欠失のような他のタイプの突然変異も含む。
992)Anal.Biochem.200、p81、Kunkelら(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82、p488、Kunkeら(1987)Meth.Enzymol.154、p367、Taylorら(1985)Nucl.Acids Res.13、p8764、Nakamayeら(1986)Nucl.Acids Res.14、p9679、Higuchiら(1988)Nucl.Acids Res.16、p7351、Shimadaら(1996)Meth.Mol.Biol.57、p157、Hoら(1989)Gene 77、p51、Hortonら(1989)Gene 77、p61、およびSarkarら(1990)Bio Techniques 8、p404に見出すことができる。Stratgene Inc.からのQuikChange(登録商標)II部位特異的突然変異誘発キット、およびPromega Inc.からのAltered Sites(登録商標)IIイン・ビトロ突然変異誘発系のような、部位特異的突然変異誘発を行うための多数のキットは商業的に入手可能である。このような商業的に入手可能なキットを用いて、ACGモチーフを非AGG配列に突然変異させるのに用いることもできる。
本発明の方法および組成物は、ワクチンの生産で特に有用であろう。長期間の間、細胞内にとどまるそれらの能力とカップリングさせた、感染サイクルの間に生じるウイルス粒子の低い量は、HIVのようなレンチウイルスの免疫系への曝露を制限する。この特性はウイルスにとって有利であるが、効果的なワクチンを生じさせる能力に悪影響を及ぼす。例えば、宿主細胞において感染し、複製するように設計されたウイルスワクチンは低レベルの子孫を生じさせることができ、長期間の、宿主細胞において「隠された」ままであってよい。結果として、このようなワクチンは、免疫応答および免疫学的記憶を効果的にトリガーできなくてもよい。同様に、1以上のレンチまたはウイルス抗原をコードするDNAワクチンは宿主において低レベルの抗原を発現するようであり、今度は、免疫応答および免疫学的記憶を生じさせるにおけるDNAワクチンの有効性を制限する。
ンは、病気の兆候、重症度、および/または持続期間を減少させることができる。HIVの場合には、治療ワクチンの投与は、末期AIDSへの進行を妨げ、または遅延させることができる。
A)減弱化ウイルスワクチン
一つの具体例において、本発明は、突然変異した1以上のAGG配列を有する減弱化ウイルスワクチンを提供する。減弱化されたウイルスは、それらがもはや病気を引き起こさないが、依然として、免疫応答を刺激できるように、それらを弱めるように改変されたウイルスである。ウイルスを減弱化することができる多くの方法がある。例えば、ウイルスは、免疫系によって認識される抗原をコードする配列を無傷のままとして、病気を引き起こすのに必要なウイルス配列の除去または破壊によって減弱化することができる。減弱化されたウイルスは、宿主細胞中で複製できてもできなくてもよい。複製できる減弱化ウイルスが有用である。なぜならば、ウイルスは対象への投与の後にイン・ビボで増幅され、かくして、免疫応答を刺激するのに入手できる免疫原の量を増加させるからである。
全ウイルス(SIV)は、SIVでの挑戦に対して霊長類を保護するのに用いられてきた。例えば、Danielら、「Protective effects of a live attenuated SIV vaccine with a deletion in the nef gene」(1992)Science 258、p1938、Almondら、「Protection by attenuated simian immunodeficiency virus in macaques against challenge with virus−infected cells」(1995)Lancet 345、p1342参照。これらの文献に開示された減弱化の方法および減弱化されたウイルス株は、本発明と組合せて用いてもよい。減弱化の他の方法は、Desrosiersら(「Identification of highly attenuated mutants of simian immunodeficiency virus」(1998)J.Virol.72、p1431)およびGuanら(「Construction and in vitro properties of a series of attenuated simian immunodeficiency viruses with all accessory genes deleted」(2001)J.Virol.75、p4056)によって記載されている。SIVはHIVに対する共通して用いられるモデルであり、SIVで有用な減弱化方法はHIVに対しても有用であり得ることに注意すべきである。公開された国際公開特許第2001/007637号は、テトラサイクリンアナログの存在下においてのみ複製するように修飾された生減弱化HIVワクチンを記載する。種々の他の生減弱化HIV株が開発されており、例えば、nef、vpr、vpu、およびNef応答性エレメントまたはNRE遺伝子を欠如するHIV−1である「デルタ4」、およびデルタ4ワクチン株に基づくが、NFkB結合エレメントをコードする遺伝子においてさらに欠失を有する「デルタkURN」がある。また、どのようにして生減弱化HIVワクチンを生じさせることができるかを記載するいくつかの論文がある。例えば、Millsら「Live attenuated HIV vaccines:a proposal for further research and development.」(2000)AIDS Res Hum Retroviruses 16,p1453参照。減弱化のためのいずれかのこのような方法は、本発明に従って用いることができる。もし用いる減弱化方法がウイルスゲノム内の、またはウイルス核酸内の欠失を含むならば、これらの突然変異を、偶然の復帰を低下させるのに十分な大きさとすることができる。例えば、もしこのような方法を用いるならば、20塩基以上を欠失させることができる。
別の具体例において、本発明は、突然変異された1以上のAGG配列を有する「殺傷された」または「不活化された」ウイルスワクチンを提供する。このようなワクチンは、一般には、非機能的であり、かくして、ウイルス遺伝子を発現せず、またはワクチン接種された対象において複製しない。しかしながら、本発明の方法を用いて、ウイルスの不活化に先立って、イン・ビトロまたはエクス・ビボでウイルスの拡大および成長を容易とすることができる。例えば、ウイルス中の1以上のAGGモチーフを非AGG配列に突然変異することによって、ウイルス拡大の速度は、より多量のウイルスを生産でき、次いで、ワクチンとして使用するために不活化できるように増加させることができる。
ccine」(2001)AIDS Vaccine Sep 5−8、要旨no.192参照)。他の者は、その免疫原性を保有しつつ、0.2%ベータ−プロピオラクトン(BPL)を用いて化学的にHIVウイルスを不活化する方法を開発している(Addaweら「Chemically inactivated whole HIV vaccine induces cellular responses in mice」(1996)Int Conf AIDS Jul 7−12、11:4、要旨no.Mo.A.100参照)。全不活化HIVワクチンもまたヒト試験でテストされてきた。例えば、化学的処理および照射の組合せによって不活化された(「HIV−1免疫原」、「Salkワクチン」、または「AG1661」としても知られる)治療ワクチンRemune(登録商標)は、HIV感染患者において免疫療法として研究されてきた(Fernandez−Cruzら「5−year evaluation of a therapeutic vaccine(HIV−1 immunogen)administered with antiretrovirals in patients with
HIV chronic infection:induction of long−lasting HIV−specific cellular immunity that impact on viral load」(2003)Second International AIDS Society Conference on HIV Pathogenesis and Treatment、Paris、要旨486参照)。本発明の方法は、前記した不活化方法のいずれか、または当該分野で知られる他のウイルス不活化方法と組合せて用いることができる。
1以上のAGG配列を非AGG配列に変化させるように突然変異された本発明のレンチウイルスまたはウイルス核酸配列もまた、対象への投与に適したウイルスベクターに組込むこともできる。レンチウイルスまたはウイルス核酸は、限定されるものではないが、GAG、p17MA、p24CA、p7およびp6、GAG−POL、RT、RNAase
H、PR、IN、Gp160、Gp120ENV、Gp41、Tat、Rev、Vpu、Vif、VprおよびNef、およびその断片、変種、ホモログおよび誘導体を含めたいずれのレンチウイルスまたはウイルス蛋白質もコードすることができる。適当なウイルスベクターの例は、限定されるものではないが、(修飾されたワクシニアウイルスAnkaraまたは「MVA」、天然痘ワクチンで用いるワクシニアのかなり減弱化された株のような)ワクシニアウイルス、レトロウイルス、(カナリア痘、牛痘、および鶏痘を含めた)ポックスウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルスを含む。これらのウイルスベクターは、それらの天然ウイルスカウンターパートと比較して改変することができ、例えば、それらは減弱化されており、および/または非複製的であってよい。
本発明は、対象への投与に適したDNAワクチンも含む。1以上のAGG配列を、いずれかのレンチウイルスまたはウイルス蛋白質、あるいはその部分、断片、誘導体またはホモログをコードする非AGG配列へ変化させるレンチウイルスまたはウイルス核酸をDNAプラスミドまたは発現ベクターに挿入して、本発明に従ってDNAワクチンを作成することができる。例えば、一つの具体例において、DNAワクチンは、1以上のAGG配列を、GAG、p17MA、p24CA、p7およびp6、GAG−POL、RT、RNAase H、PR、IN、Gp160、Gp120ENV、Gp41、Tat、Rev、Vpu、Vif、VprおよびNef、およびその断片、変種、ホモログおよび誘導体よりなる群から選択される蛋白質をコードする非AGG配列に変化させるために1以上のレンチウイルスまたはウイルス核酸を含有するプラスミドを含む。
LTR(HTLV−LTR)および単純疱疹ウイルス(HSV)チミジンキナーゼプロモータを含む。
うなワクチンの効率を改良することができ、今度は、ワクチン接種された対象におけるレンチウイルスまたはウイルス蛋白質の改良された発現に導く。
本発明は、蛋白質性ワクチンも含む。いずれのレンチウイルスまたはウイルス蛋白質、またはその断片、誘導体、変種またはホモログを用いて、本発明に従って、蛋白質性ワクチンを作成することもできる。例えば、一つの具体例において、本発明の方法によって修飾されるべき選択されたレンチウイルスまたはウイルス核酸は、GAG、p17MA、p24CA、p7およびp6、GAG−POL、RT、RNAase H、PR、IN、Gp160、Gp120ENV、Gp41、Tat、Rev、Vpu、Vif、VprおよびNef、およびその断片、変種、ホモログおよび誘導体をコードする核酸よりなる群から選択される。このようなワクチンを生産するために本発明の方法を用いる利点は、1以上のAGGモチーフを非AGG配列に突然変異させることによって、生産された蛋白質の量、および/または蛋白質生産速度を実質的に増加させることができることにある。
LTR(HTLV−LTR)、単純疱疹ウイルス(HSV)チミジンキナーゼプロモータ、およびSV40ウイルス初期プロモータを含む。適当な発現ベクターは、限定されるものではないが、とりわけ、コスミド、プラスミド、ならびに複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、減弱化ワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、レンチウイルスおよびヘルペスウイルスのようなウイルスベクターを含む。適当なプロモータ、および外因性核酸の付加のためのクローニング部位を既に含有する商業的に入手可能な発現ベクターを用いることもできる。
哺乳動物から直接的に得られる一次または二次細胞を発現系として用いることもできる。
本発明のワクチン組成物は、前記したもののような、(減弱化ウイルス、不活化ウイルス、およびウイルスベクターを含めた)少なくとも1つのウイルス、核酸、または蛋白質を含む。組成物は、限定されるものではないが、医薬上許容される担体、緩衝液、安定化剤、(水のような)希釈剤、保存剤、可溶化剤、または免疫変調剤を含めた1以上のさらなる成分を含むこともできる。適当な免疫変調剤は、限定されるものではないが、アジュバント、サイトカイン、サイトカインをコードするポリヌクレオチド、および本発明のワクチンの少なくとも1つの成分の免疫系による認識を容易とする剤を含む。当業者であれば、本発明のワクチン組成物に含める適当な添加剤を容易に選択することができる。
は変化させることができ、他の生体適合性ポリマーはポリエチレングリコール、例えば、ポリビニルピロリドンを置き換えることができ、他の糖または多糖をデキストロースの代わりに置換することができる。別法として、疎水性免疫原性化合物のための他の送達系を使用することもできる。リポソームおよびエマルジョンは、疎水性薬物のための送達ビヒクルまたは担体のよく知られた例である。ジメチルスルホキシドのようなある種の有機溶媒を使用することもできるが、通常、より大きな毒性という犠牲を払うものである。加えて、化合物は、治療剤を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスのような徐放系を用いて送達してもよい。種々のタイプの徐放性材料が確立されており、当業者によってよく知られている。徐放性カプセルは、それらの化学的性質に応じて、数週間から100日を超えるまで化合物を放出することができる。治療試薬の化学的性質および生物学的安定性に応じて、蛋白質または他の有効成分安定化のためのさらなる戦略を使用することができる。
本発明のワクチン組成物の「免疫学的に有効な量」を対照に投与すべきである。本明細書中で用いるように、用語「免疫学的に有効な量」とは、対象において所望の免疫応答を
誘導でき、または該誘導を増強させることができる量をいう。所望の応答は、とりわけ、抗体または細胞媒介免疫応答、または双方の誘導、ウイルス負荷の低下、感染の兆候の改善、兆候の開始の遅延、感染の持続期間の低下などを含むことができる。免疫学的に有効な量は、保護免疫性を誘導するのに十分な量でもあろう。
本発明のワクチン組成物は、単一用量、複数用量にて、あるいは「プライム・ブースト」法を用いて投与することができる。プライム・ブースト法を用いる場合、本発明のワクチンは「プライミング」剤または「ブースティング」剤または双方として用いてもよい。組成物は、限定されるものではないが、非経口、皮内、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、経口、または眼内経路を含めたいずれかの適当な経路によってあるいは経路の組合せによって投与することができる。組成物は、本発明の組成物がその上にコーティングされた、金粒子のような粒子を火炎処理する「ガン」デバイスを用いて、対象の皮膚に投与してもよい。当業者であれば、選択された送達経路に従ってワクチン組成物を処方できるであろう。
不活化ウイルスの精製方法は当該分野で知られており、例えば、勾配遠心、超遠心、連続流超遠心、ならびにイオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、および液体アフィニティクロマトグラフィのようなクロマトグラフィの1以上を含んでもよい。さらなる精製方法は限外濾過および透析濾過を含む。J P Gregersen「Herstellung von Virussimpfstoffen aus Zellkulturen」Chapter 4.2 in Pharmazeutische
Biotecnology(eds.O.Kayser and R H Mueller)Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft、Stuttgart、2000参照。また、O’Neilら、「Virus Harvesting and Affinity Based Liquid Chromatography.A Method for Virus Concentration
and Purification」、Biotechnology(1993)11:173−177、Priorら、「Process Development for
Manufacture of Inactivated HIV−1」、Pharmaceutical Technology(1995)30−52、およびMajhdiら、「Isolation and Characterization of a Coronavirus from Elk Calves with diarrhea」Journal of Clinical Microbiology(1995)35(11):2937−2942参照。
logical Methods(1981)3(4):201−211、Hagenら、「Optimization of Poly(ethylene glycol)Precipitation of Hepatitis Virus Used to prepare VAQTA,a Highly Purified Inactivated Vaccine」Biotechnology Progress(1996)12:406−412、およびCarlssonら、「Purification of
Infectious Pancreatic Necrosis Virus by
Anion Exchange Chromatography Increases
the Specific Infectivity」Journal of Virological Methods(1994)47:27−36参照)ならびに限外濾過およびミクロ濾過(Payら、Developments in Biological Standardization(1985)60:171−174、Tsurumiら「Structure and filtration performances
of improved cuprammonium regenerated cellulose hollow fibre(improved BMM hollow
fibre)for virus removal」Polymer Journal(1990)22(12):1085−1100、およびMakinoら、「Concentration of live retrovirus with a regenerated cellulose hollow fibre,BMM」、Archives of Virology(1994)139(1−2):87−96参照)を含む。
ドトキシン)に見出される蛋白質のバルクをカラムから洗浄し、結合したウイルスの一定程度の精製が達成される。
別の具体例において、本発明は、ウイルスRNAの生産、ウイルス蛋白質の生産、またはウイルス粒子の生産を阻害し、または刺激する、あるいはウイルス潜伏を阻害し、または刺激する剤を同定するための方法に向けられる。別の具体例において、該方法は、少なくとも1つのAGGモチーフを含有する少なくとも1つのウイルス核酸配列を含有する対照細胞、および非AGG配列に突然変異されている少なくとも1つのAGGモチーフを含有する少なくとも1つのウイルス核酸配列を含有するテスト細胞を供し、テスト細胞および対照細胞を1以上の剤と接触させ、次いで、対照細胞と比較してテスト細胞において、ウイルスRNAの生産、ウイルス蛋白質の生産またはウイルス粒子の生産を阻害し、または刺激する、あるいはウイルス潜伏を阻害しまたは刺激する少なくとも1つの剤を同定することを含む。
を同定するのに適した他の方法は当該分野で知られており、このような方法のいずれを用いても、AGGモチーフに結合する剤を同定することもできよう。本発明は、本発明の方法を用いて同定されたもののようなAGGモチーフ結合剤も含む。
遺伝暗号は縮重しているので、ヌクレオチド配列はヌクレオチドレベルにおいて相互に異なることができるが、同一蛋白質またはペプチドをコードすることができる。しかしながら、自然においては、しばしば、特定のコドン用法およびAT/GC含有量についての選択圧がある。また、ヌクレオチド配列によってコードされた蛋白質におけるアミノ酸の頻度および順序に対して選択圧がある。これらの選択圧の各々を正規化し、次いで、ゲノムにおいて予測される配列モチーフ(例えば、長さが2から8のヌクレオチドの配列モチーフ)の平均頻度を計算し、これを、そのゲノムにおけるこれらのモチーフの現実の頻度と比較する方法を用いて、ヒトゲノムと比較して、HIV−1ゲノムにおいて過剰発現され、および過少発現される配列モチーフを探した。この方法は、その内容を本明細書に引用して援用する、同時係属仮特許出願第60/808,420号、およびRobinsら(Journal of Bacteriology、(2005)Vol.187、p.8370−74)に記載されている。
AGGモチーフの存在は、HIV−2、サル免疫不全ウイルス(SIV)のいくつかの株、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)およびウマ感染性貧血ウイルス(EIAV)を含めた広く種々のレンチウイルスにおいて調査された。これらのウイルスのすべては、AGGモチーフの予測された、または予測されたよりも高い頻度を有することが判明した。しかしながら、ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV−1)およびヒトレトロトランスポゾン
LINE−1はAGGモチーフの予測された、または予測されたよりも高い頻度を有しなかった。
HIVゲノムはAGGモチーフに加えてさらなるINS配列を含有する可能性がある。また、AGGモチーフはより大きなINS配列または複数配列の一部を形成する可能性がある。AGGモチーフの同定のための前記した方法を適用して、HIVゲノムにおいて、または事実、他のレンチウイルス、または他のレトロウイルスのようないずれの他のウイルスのゲノムにおいてもさらなるINS配列を発見することができる。
AGGモチーフの役割は、アミノ酸についてのコーディングを変化させることなく1以上のモチーフを突然変異させることによってテストされるであろう。例えば、各々が、HIV LTRによって調節される、野生型または突然変異体HIV−1 gag配列を含有するプラスミドは同一の細胞型に(一過的にまたは安定して)トランスフェクトされ、生産されるgag mRNAの定常状態レベルは、例えば、リアルタイムPCRを用いて測定されるであろう。この実験は、gag遺伝子におけるAGG配列が転写の速度、このmRNAの細胞質への輸送、またはmRNAの半減期に影響するか否かをテストするであろう。この同一実験は、gagおよびpol領域双方において突然変異した1以上のAGG配列を有する構築体にて反復されるであろう。
今日、HIV挑戦に対して免疫性を付与することができる商業的に入手可能なワクチンはない。なぜこのようなワクチンを作成するのが可能でなかったかには多くの理由がある。ワクチンの生産を困難にしたであろう1つの因子は、HIVが細胞内に長時間留まる能力であろう。細胞内ウイルスは抗体媒介(しかし、CD−8 T細胞媒介はそうではない)免疫性から保護される。HIVウイルスは、細胞内部での生産のその遅い速度、細胞内部で潜伏したままであるその能力、および細胞融合によって細胞から細胞に拡大するその
能力のため長時間細胞内に隠れていることができる。
前記したのと同様な実験において、野生型および突然変異体gag−pol構築体は、安定して細胞にトランスフェクトされるであろう。野生型AGGの取込みコピーを有する細胞系は、AGG配列の活性のため、低いレベルのGAGおよびPOL RNAおよび蛋白質を生産するであろうと予測される。またクローンのいくつかは、潜伏に関与すると信じられている確率論的表現型スイッチングの現象のため、いずれのGAG−POL mRNAまたは蛋白質を生産しないであろうと予測される。これらのクローンは潜伏の細胞培養モデルを供するであろう。
−POL−GFPを発現する細胞は蛍光検出方法によって検出することができ、(蛍光活性化細胞ソーティングまたはFACSのような)細胞ソーティングを用いて、2つのもの、すなわち、GAG−POL−GFPを発現するもの、および発現しないものを分離することができる。また、これらのクローンをテストして、それらが、事実、GAG−POL−GFP蛋白質をコードする核酸の取込みコピーを含有することを確認するのも可能であろう。
IMS配列は、転写に対して不活性であるクロマチンを生産するように作用する細胞蛋白質を結合させることによって作用することができると提案されてきた(Schneiderら参照)。この研究において、HIVと同程度に高いAGG頻度を有する、スクリーニングされた4,000遺伝子のうち9つの細胞遺伝子が同定された。従って、ヒト細胞に存在する細胞AGG結合蛋白質がある可能性がある。このような蛋白質が存在するか、およびもしそうであれば該蛋白質を単離するかを決定するために、T細胞抽出物は、コンペティターヒトDNAの洗浄をしつつAGGオリゴヌクレオチドカラムを通過するであろう。もしこのような蛋白質が同定されれば、蛋白質のアミノ酸配列が決定され、蛋白質をコードする遺伝子が同定されるであろう。
/またはFIVのようなHIVに対する動物モデルでテストすることもできる。
本発明実施例においては、核封じ込めにおいて原因となる役割を演じることが疑われる多数のヌクレオチドモチーフが、HIV−1ゲノムおよびヒトゲノムの系統的比較において同定される。短いモチーフAGGが同定され、これは、ヒトゲノムおよびHIV−1ゲノムにおけるコーディング遺伝子の間に最大微分表現を有する。この同定は、本発明の方法の使用を介してなされた。該方法はHIV−1ゲノムおよびヒトコーディング遺伝子の間の表現の実質的差を呈する数ダースのモチーフを同定する。本実施例で呈された結果は単一のモチーフに焦点をあてて、制御された実験における発現レベルに対するその寄与を単離する。Gagのコドン最適化バージョンを修飾し、同様な変化を行って、AGGの出現の数を低下させる。2つのプラスミドが作り出され、1つはGagの元のコドン最適化(CO)配列を備えたものであり、他方は有意に低下されたAGGを持つモチーフ最大化(MO)配列を備えたものである。構築体はヒト上皮細胞系(293細胞)においてトランスフェクトされ、Gagの発現はMO配列について70%高いことが示される。Gagの2つの配列を注射マウスワクチンに作製して、2つの構築体の間の微分抗体応答についてテストする。ワクチンのMOバージョンを持つマウスは4週間後に4.5倍大きな抗Gag抗体応答を有する。4週間におけるDNAブースト、および6週間における第二の読み出しを伴い、ギャップはMOおよびCOワクチンの間に継続的に拡大している。
3つの組合せがある。それらは、MEDが多数の反復の制限において獲得されるようなシャフリング手法において重み付けされる。
ヌクレオチドの偏りを考慮するHIVにおける高い頻度でもって見出される。本発明の目的は、モチーフAGGの頻度を低下させることによるHIVのORFの再暗号化が、蛋白質発現を増加させるであろうということである。
Claims (84)
- 非AGG配列に対して1以上のAGG配列を変化させるように突然変異されているウイルス核酸。
- 前記ウイルスがレンチウイルスである、請求項1に記載のウイルス核酸。
- 前記ウイルスがHIVである、請求項1に記載のウイルス核酸。
- 1以上の非AGG配列に対して1以上のAGG配列の変化をもたらす突然変異を含むHIV核酸。
- 非AGG配列に対してgag、pol、またはenv遺伝子いずれかにおける1以上のAGG配列の変化をもたらす1以上の突然変異を含むウイルス核酸。
- 非AGG配列に対してgag、pol、またはenv遺伝子いずれかにおける1以上のAGG配列の変化をもたらす1以上の突然変異を含むHIV核酸。
- gag遺伝子において47未満のAGG配列を持つ配列を有するHIV核酸。
- gag遺伝子において約45未満のAGG配列を持つ配列を有するHIV核酸。
- gag遺伝子において約43未満のAGG配列を持つ配列を有するHIV核酸。
- gag遺伝子において約41未満のAGG配列を持つ配列を有するHIV核酸。
- gag遺伝子において約39未満のAGG配列を持つ配列を有するHIV核酸。
- gag遺伝子において約37未満のAGG配列を持つ配列を有するHIV核酸。
- gag遺伝子において約35未満のAGG配列を持つ配列を有するHIV核酸。
- gag遺伝子において約33未満のAGG配列を持つ配列を有するHIV核酸。
- gag遺伝子において約31未満のAGG配列を持つ配列を有するHIV核酸。
- gag遺伝子において約29未満のAGG配列を持つ配列を有するHIV核酸。
- gag遺伝子において約27未満のAGG配列を持つ配列を有するHIV核酸。
- gag遺伝子において約25未満のAGG配列を持つ配列を有するHIV核酸。
- gag遺伝子において25未満のAGG配列を持つ配列を有するHIV核酸。
- 図1に示されたAGG突然変異の1以上を含むHIV核酸。
- 1以上のAGG配列を含有するウイルス核酸を供し、非AGG配列に対してAGG配列の1以上を突然変異させることを含む、突然変異した1以上のAGG配列を有する突然変異体ウイルス核酸を生産する方法。
- AGG配列の1以上が、蛋白質をコードするウイルス核酸の領域にあるとき、AGG配列がそれに対して突然変異される非AGG配列が、それが、ウイルス核酸によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を改変しないように選択される、請求項21に記載の方法。
- AGG配列の1以上が、蛋白質をコードするウイルス核酸の領域にあるとき、AGG配列がそれに対して突然変異される非AGG配列が、それが、ウイルス核酸によってコードされる蛋白質の構造、機能または免疫原性を改変しないように選択される、請求項21に記載の方法。
- 非AGG配列に対してAGG配列の1以上を変化させる工程が、部位特異的突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、陽性抗生物質選択、ユニークな制限部位排除、デオキシウリジン取込み、ホスホロチオエート取込み、およびPCRベースの突然変異誘発よりなる群から選択される方法を用いて行われる、請求項21に記載の方法。
- 前記ウイルス核酸がウイルスの全ゲノムを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記ウイルス核酸が、宿主細胞中のウイルス粒子の生産を指令するのに十分であるウイルスゲノムの部分を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記ウイルス核酸が、少なくとも1つのウイルス蛋白質の発現を指令するのに十分なウイルスゲノムの部分を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記ウイルス核酸が、少なくとも1つのウイルス蛋白質、またはその断片、誘導体、変種またはホモログをコードする、請求項21に記載の方法。
- 前記ウイルス核酸が、GAG、POL、ENV、およびその断片、誘導体およびホモログよりなる群から選択される少なくとも1つのウイルス蛋白質をコードする、請求項28に記載の方法。
- 非AGG配列に対して1以上のAGG配列を変化させるように突然変異されているゲノムを有する突然変異体ウイルス。
- レンチウイルスではない組換えウイルスであって、非AGG配列に対して1以上のAGG配列を変化させるように突然変異されているレンチウイルス核酸配列を含有する組換えウイルス。
- 非AGG配列に対して1以上のAGG配列を変化させるように突然変異されているウイルス核酸配列を含むウイルスワクチン。
- 非AGG配列に対して1以上のAGG配列を変化させるように突然変異されているHIV核酸配列を含むHIVワクチン。
- 野生型ウイルスよりも小数のAGGを有するウイルス核酸配列を含むウイルスワクチン。
- 野生型HIVよりも小数のAGGを有するHIV核酸配列を含むHIVワクチン。
- 対応する野生型ウイルスよりも高い蛋白質発現が可能であるウイルスワクチンであって、前記ウイルスワクチンは野生型ウイルス核酸配列よりも少数のAGG配列を持つ核酸配列を含むウイルスワクチン。
- 対応する野生型HIVウイルスよりも高い蛋白質発現が可能なHIVワクチンであって、前記HIVワクチンは野生型HIVウイルス核酸配列よりも少数のAGG配列を持つ核酸配列を含むHIVワクチン。
- 非AGG配列に対して1以上のAGG配列を変化させるように突然変異されているウイルス核酸の発現によって生産された蛋白質を含むウイルスワクチン。
- 蛋白質はイン・ビトロにて宿主細胞にて発現される、請求項38に記載のウイルスワクチン。
- 前記蛋白質が無細胞イン・ビトロ転写および翻訳系を用いて発現される、請求項38に記載のウイルスワクチン。
- 非AGG配列に対して1以上のAGG配列を変化させるように突然変異されているHIV核酸から発現された蛋白質を含むHIVワクチン。
- 前記蛋白質がイン・ビトロにて宿主細胞にて発現される、請求項41に記載のHIVワクチン。
- 前記蛋白質が無細胞イン・ビトロ転写および翻訳系を用いて発現される、請求項41に記載のHIVワクチン。
- 請求項32から43のいずれかに記載のワクチンと、医薬上許容される希釈剤、担体、賦形剤およびアジュバントよりなる群から選択されるさらなる成分とを含む免疫原性組成物。
- 有効量の請求項32、34、36および38から40のいずれか一項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物を対象に投与することを含む、対象をウイルスに対して免疫化する方法。
- 有効量の請求項33、35、37、および39から41のいずれかに記載のワクチンまたは免疫原性組成物を対象に投与することを含む、対象をHIVでの挑戦に対して免疫化する方法。
- 有効量の、非AGG配列に対して1以上のAGG配列を変化させるように突然変異されているウイルスをコードする核酸を対象に投与することを含む、対象をウイルスに対して免疫化する方法。
- 有効量の、非AGG配列に対して1以上のAGG配列を変化するように突然変異されているヒト免疫不全ウイルスをコードする核酸を対象に投与すること含む、対象をHIVに対して免疫化する方法。
- 有効量の、非AGG配列に対して1以上のAGG配列を変化させるように突然変異されているウイルス核酸から発現されたウイルス蛋白質を対象に投与することを含む、対象をウイルスに対して免疫化する方法。
- 有効量の、非AGG配列に対して1以上のAGG配列を変化させるように突然変異されているHIV核酸から発現された蛋白質を対象に投与すること含む、対象をHIVに対して免疫化する方法。
- (a)(i)宿主細胞と、(ii)宿主細胞のゲノムの少なくとも一部からのヌクレオチド配列と、(iii)ウイルス核酸配列とを供することと、
(b)ヌクレオチドのランダム分布と比較して宿主配列において過少発現されるか、あるいは宿主配列において過剰発現される1以上のヌクレオチド配列モチーフを同定することであって、各モチーフは長さが約6ヌクレオチドであることと、
(c)ウイルス配列が(b)において過少発現または過剰発現されると同定された1以上のモチーフを含むかを決定することと、
(d)過少発現される配列の数を増加させるか、または過剰発現される配列の数を減少させ、または双方を行うようにウイルス配列を改変して、宿主において蛋白質生産を最適化することと、
を含む、宿主においてウイルス蛋白質の生産を最適化する方法。 - ウイルス核酸配列が増加したウイルス蛋白質生産が得られるように改変されるように、ワクチン生産のためにウイルス核酸配列を最適化する方法であって、
(a)(i)宿主細胞と、(ii)宿主細胞のゲノムの少なくとも一部からのヌクレオチド配列と、(iii)ウイルス核酸配列とを供することと、
(b)ヌクレオチドのランダム分布と比較して、宿主配列において過少発現されるか、あるいは宿主配列において過剰発現される1以上のヌクレオチド配列モチーフを同定することであって、各モチーフは長さが約6から約12ヌクレオチドであることと、
(c)前記ウイルス配列が(b)で過少発現または過剰発現されたと同定された1以上のモチーフを含むかを決定することと、
(d)過少発現された配列の数を増加させ、または過剰発現された配列の数を低下させ、または双方を行うようにウイルス配列を改変して、宿主において、ウイルス核酸配列を最適化し、および増加した蛋白質生産を得ることと、
を含む、方法。 - 前記一部が長さが少なくとも50キロベースである、請求項51または52に記載の方法。
- 前記一部が長さが少なくとも100キロベースである、請求項51または52に記載の方法。
- 前記一部が1以上のEST配列である、請求項51または52に記載の方法。
- 前記最適化されたウイルス核酸配列が、宿主細胞において非最適化ウイルス核酸よりも効果的に発現される、請求項51または52に記載の方法。
- ウイルス配列によってコードされた得られたアミノ酸配列が(d)における改変に続いて変化しない、請求項51または52に記載の方法。
- 前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項51または52に記載の方法。
- 前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項51または52に記載の方法。
- 前記宿主細胞が細菌細胞である、請求項51または52に記載の方法。
- 前記宿主細胞が昆虫細胞である、請求項51または52に記載の方法。
- 前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項51または52に記載の方法。
- 前記宿主細胞がヒト細胞である、請求項51または52に記載の方法。
- 前記宿主細胞が霊長類細胞である、請求項51または52に記載の方法。
- 前記宿主細胞がCHO細胞である、請求項51または52に記載の方法。
- 前記宿主細胞がマウス細胞である、請求項51または52に記載の方法。
- 前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項51または52に記載の方法。
- 前記宿主細胞がヤギ細胞である、請求項51または52に記載の方法。
- 前記宿主細胞がヒツジ細胞である、請求項51または52に記載の方法。
- 前記宿主細胞が鳥類細胞である、請求項51または52に記載の方法。
- 前記宿主細胞がニワトリ細胞である、請求項51または52に記載の方法。
- 前記宿主細胞がトランスジェニック動物内にある、請求項51または52に記載の方法。
- 前記同定が、
a)前記宿主細胞のゲノム配列を供することと、
b)前記宿主細胞ゲノムと同一のアミノ酸含有量および遺伝子当たりのコドン用法を有するか、そうでなければランダムである、ランダム化されたバックグラウンドゲノムを供することと、
c)反復方法を行って、宿主細胞のゲノム配列において、バックグラウンドゲノムおよび宿主細胞ゲノムの間の差に対して最も寄与する配列を表す長さが約2から約7ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列を同定することとを含み、
前記方法が、
i)バックグラウンドゲノムから宿主細胞ゲノムを最も有意に分離するオリゴヌクレオチド配列を選択する工程と、
ii)バックグラウンド確率分布を再度評価して、工程(i)において選択されたオリゴヌクレオチドによる差を取り除く工程と、
iii)バックグラウンド分布が宿主分布に近くなるまで工程(i)を反復し、それにより、ヌクレオチドのランダム分布と比較して、宿主配列において過少発現されるか、または宿主配列において過剰発現されるヌクレオチド配列モチーフを同定する工程と、
を含む、請求項51または52に記載の方法。 - 宿主細胞または宿主生物において注目するウイルス蛋白質の生産を増加させる方法であって、前記蛋白質は前記宿主に対して外来性であり、前記方法は、置換が、ランダム分布と比較して、宿主のヌクレオチド配列において過剰発現される核酸配列内に1以上の配列モチーフを作り出すように、前記蛋白質をコードする核酸配列において1以上のヌクレオチドを置換することを含み、宿主のヌクレオチド配列において過剰発現されるフレーズは、
a)宿主細胞のゲノム配列を供することと、
b)宿主細胞ゲノムと同一のアミノ酸含有量および遺伝子当たりのコドン用法を有するが、そうでなければランダムである、ランダム化されたバックグラウンドゲノムを供することと、
c)反復方法を行って、バックグラウンドゲノムおよび宿主細胞ゲノムの間の差に対して最も寄与する配列を表す長さが約2から約7ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列を、宿主細胞のゲノム配列において同定することとを含む方法を用いて同定され、前記方法は:
i)バックグラウンドゲノムから宿主細胞ゲノムを最も有意に分離するオリゴヌクレオチド配列を選択する工程と、
ii)バックグラウンド確率分布を再度評価して、工程(i)で選択されたオリゴヌクレオチドによる差を除去する工程と、
iii)バックグラウンド分布が宿主分布に近くなるまで工程(i)を反復し、それにより、ヌクレオチドのランダム分布と比較して、宿主配列において、過少発現されるか、あるいは宿主配列において過剰発現されるヌクレオチド配列フレーズを同定する工程と、
を含む、方法。 - 宿主細胞または宿主生物においてウイルス蛋白質の生産を増加させる方法であって、前記ウイルス蛋白質は前記宿主に対して外来性であり、前記方法は、置換が、ヌクレオチドのランダム分布と比較して、宿主のヌクレオチド配列において過少発現される外来性核酸配列内の1以上の配列モチーフを除去するように、注目するウイルス蛋白質をコードする核酸配列において1以上のヌクレオチドを置換することを含み、宿主のヌクレオチド配列において過少発現されるモチーフは、
a)前記宿主細胞のゲノム配列を供することと、
b)宿主細胞ゲノムと同一のアミノ酸含有量および遺伝子当たりのコドン用法を有するが、そうでなければランダムであるランダム化されたバックグラウンドゲノムを供することと、
c)反復方法を行って、バックグラウンドゲノムおよび宿主細胞ゲノムの間の差に最も寄与する配列を表す長さが約2から約7ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列を宿主細胞のゲノム配列において同定することとを含む方法を用いて同定され、または決定され、前記方法は:
i)バックグラウンドゲノムから宿主細胞ゲノムを最も有意に分離するオリゴヌクレオチド配列を選択する工程と、
ii)バックグラウンド確率分布を再度評価して、工程(i)において選択されたオリゴヌクレオチドによる差を除去する工程と、
iii)バックグラウンド分布が宿主分布に近くなるまで工程(i)を反復し、それにより、ヌクレオチドのランダムな分布と比較して、宿主配列において過少発現されるか、あるいは宿主配列において過剰発現されるヌクレオチド配列フレームを同定する工程と、
を含む、方法。 - (a)少なくとも1つのAGGモチーフを含有する少なくとも1つのウイルス核酸配列を含有する対照細胞および非AGG配列に対して突然変異されている少なくとも1つのAGGモチーフを含有する少なくとも1つのウイルス核酸配列を含有するテスト細胞を供することと、
(b)前記テスト細胞および前記対照細胞を1以上の剤と接触させることと、
(c)前記テスト細胞と比較して、前記対照細胞において、ウイルスRNAの生産、レンチウイルス蛋白質の生産、ウイルス粒子の生産を阻害し、または刺激する、あるいはウイルス潜伏を阻害し、または刺激する少なくとも1つの剤を同定することと、
を含む、ウイルスRNA、ウイルス蛋白質、またはウイルス粒子の生産を阻害し、または刺激するあるいはウイルス潜伏を阻害し、または刺激する剤を同定する方法。 - (a)少なくとも1つのAGGモチーフを含有する核酸を供することと、
(b)前記核酸を1以上の剤と接触させることと、
(c)前記核酸に結合する少なくとも1つの剤を同定することと、
を含む、AGG結合剤を同定する方法。 - (a)少なくとも1つのAGGモチーフを含有する対照核酸、および非AGG配列に対して突然変異されている少なくとも1つのAGGモチーフを含有するテスト核酸を供することと、
b)前記テスト核酸および前記対照核酸を1以上の剤と接触させることと、
c)前記対照核酸に結合するが、前記テスト核酸に結合しない少なくとも1つの剤を同定することと、
を含む、AGGモチーフ結合剤を同定する方法。 - (a)少なくとも1つのAGGモチーフを含有する少なくとも1つのウイルス核酸配列を含有する対照細胞、および非AGG配列に対して突然変異されている少なくとも1つのAGGモチーフを含有する少なくとも1つのウイルス核酸配列を含有するテスト細胞を供することと、
b)前記テスト細胞および前記対照細胞を1以上の剤と接触させることと、
c)前記テスト細胞と比較して、前記対照細胞において、ウイルスRNAの生産、ウイルス蛋白質の生産、ウイルス粒子の生産を阻害し、または刺激する、あるいはウイルス潜伏を阻害し、または刺激する少なくとも1つの剤を同定することと、
を含む、AGGモチーフ結合剤を同定する方法。 - 請求項77から79のいずれか一項に記載の方法を用いて同定されたAGGモチーフ結合剤。
- 少なくとも1つのAGGモチーフを含有する核酸へのAGG結合剤の結合を阻害し、または刺激する剤。
- (a)少なくとも1つのAGGモチーフを含有する核酸を供することと、
(b)前記核酸をAGG結合剤および少なくとも1つの第2の剤を接触させることと、
(c)前記核酸へのAGG結合剤の結合を阻害し、または刺激する第2の剤を同定することと、
を含む、少なくとも1つのAGGモチーフを含有する核酸へのAGG結合剤の結合を阻害しまたは刺激する剤を同定する方法。 - 前記ウイルスがレンチウイルスである、請求項5、21、30、32、34、36、38、44、45、47、49、51、52、74、75、76または79のいずれかに記載の方法。
- 前記ウイルスがHIVである、請求項5、21、30、32、34、36、38、44、45、47、49、51、52、74、75、76または79のいずれかに記載の方法。
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