JP2019076069A - Fc-binding proteins with amino acid substitution - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、免疫グロブリンに親和性のあるＦｃ結合性タンパク質に関する。より詳しくは、本発明はヒトＦｃγＲＩＩＩａのうち、特定位置のアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換することで、遺伝子組換体による生産性が向上したＦｃ結合性タンパク質に関する。 The present invention relates to Fc binding proteins with affinity to immunoglobulins. More specifically, the present invention relates to an Fc binding protein of which productivity by recombinants is improved by replacing an amino acid residue at a specific position of human FcγRIIIa with another specific amino acid residue.
抗体（免疫グロブリン）のＦｃ領域に特異的に結合するタンパク質として、細菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＰｒｏｔｅｉｎ ＡやＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ、ヒト由来のＦｃ受容体、Ｆｃ結合能を有した前記Ｆｃ受容体の部分領域等が知られている。 Examples of proteins that specifically bind to the Fc region of an antibody (immunoglobulin) include Protein A and Protein G derived from bacteria of the genus Staphylococcus, Fc receptors derived from human, partial regions of the Fc receptor having Fc binding ability, and the like. Are known.
Ｆｃ受容体は、体内の免疫機構に関与し、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。個々の分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する認識ドメインによって、単一の、または同じグループの免疫グロブリンイソタイプをＦｃ受容体上の認識ドメインによって認識している。これによって、免疫応答においてどのアクセサリー細胞が動因されるかが決まってくる。Ｆｃ受容体は、さらにいくつかのサブタイプに分類することができ、ＩｇＧに対する受容体であるＦｃγ受容体、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃε受容体、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃα受容体等がある。また各受容体は更に細かく分類されており、例えばＦｃγ受容体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂの存在が報告されている（非特許文献１）。 Fc receptors are a group of molecules involved in the body's immune system and binding to the Fc region of immunoglobulin molecules. Each molecule recognizes a single or the same group of immunoglobulin isotypes by a recognition domain on an Fc receptor by a recognition domain belonging to the immunoglobulin superfamily. This determines which accessory cells are driven in the immune response. Fc receptors can be further classified into several subtypes, such as Fcγ receptors which are receptors for IgG, Fcε receptors which bind to the Fc region of IgE, Fcα receptors which bind to the Fc region of IgA, etc. There is. In addition, each receptor is further finely divided, and for example, the presence of FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, and FcγRIIIb has been reported (Non-patent Document 1).
Ｆｃγ受容体の中でも、ヒトＦｃγＲＩＩＩａはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やマクロファージなどの細胞表面に存在しており、ヒト免疫機構の中でも重要なＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性に関与している重要な受容体である。また、抗体の糖鎖構造の違いにより、抗体との結合性が異なることが知られている（非特許文献２）。なお、ヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列（配列番号１）はＧｅｎＢａｎｋ（ＡＡＨ１７８６５．１）等の公的データベースに公表されている。 Among Fcγ receptors, human FcγRIIIa is present on cell surfaces such as natural killer cells (NK cells) and macrophages, and it is important to be involved in the ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) activity which is important among human immune mechanisms. Receptor. In addition, it is known that the binding property to the antibody is different depending on the difference in the sugar chain structure of the antibody (Non-patent Document 2). The amino acid sequence of human FcγRIIIa (SEQ ID NO: 1) is published in public databases such as GenBank (AAH17865.1).
一方、抗体の糖鎖構造は、抗体医薬品における薬効や安定性に大きく関与するため、抗体医薬品を製造する際に糖鎖構造を制御することは極めて重要である。抗体の糖鎖構造を認識するＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤を用いることで、抗体をその糖鎖構造に基づく結合性の違いにより分離できる（特許文献１および２）。このため、前記吸着剤は抗体医薬品製造時の工程分析や分取に有用である。 On the other hand, since the sugar chain structure of the antibody is greatly involved in the drug efficacy and stability of the antibody drug, it is extremely important to control the sugar chain structure when producing the antibody drug. By using an adsorbent obtained by immobilizing FcγRIIIa that recognizes the sugar chain structure of the antibody on an insoluble carrier, the antibody can be separated according to the difference in the binding property based on the sugar chain structure (Patent Documents 1 and 2). For this reason, the adsorbent is useful for process analysis and fractionation during antibody drug production.
なおヒトＦｃγＲＩＩＩａには、配列番号１における１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンであるタイプとバリン（配列番号１の態様）であるタイプの遺伝子多型が存在し、バリンのタイプの方が抗体親和性は高く、フェニルアラニンのタイプの方が抗体親和性は低いことが知られている（非特許文献３および４）。 In human FcγRIIIa, there is a gene polymorphism of the type in which the amino acid at position 176 in SEQ ID NO: 1 is phenylalanine and valine (embodiment of SEQ ID NO: 1), and the type of valine has higher antibody affinity. It is known that the type of phenylalanine has lower antibody affinity (Non-patent Documents 3 and 4).
前述した通りＦｃγＲＩＩＩａは抗体の糖鎖構造を認識することから、ＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤は抗体医薬品製造時の工程分析や分取に有用である。しかしながら、抗体医薬品の工業的製造を前記吸着剤を用いて行なおうとした場合、従来のＦｃγＲＩＩＩａでは遺伝子組換体による生産性が劣っており、コスト面で課題があった。 As described above, since FcγRIIIa recognizes the sugar chain structure of an antibody, an adsorbent obtained by immobilizing FcγRIIIa on an insoluble carrier is useful for process analysis and separation during antibody drug production. However, when attempting to industrially produce antibody pharmaceuticals using the above-mentioned adsorbent, the conventional FcγRIIIa is inferior in productivity by gene recombination and has problems in cost.
そこで本発明は、従来のＦｃγＲＩＩＩａと比較し、遺伝子組換体による生産性が向上した、ＦｃγＲＩＩＩａアミノ酸置換体を提供することにある。 Therefore, the present invention is to provide an FcγRIIIa amino acid substitution product in which the productivity by gene recombination is improved as compared to conventional FcγRIIIa.
上記課題を解決するために、本発明者らは、配列番号１に示すヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列のうち、１７６番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に網羅的に置換した結果、従来のＦｃγＲＩＩＩａよりも遺伝子組換体による生産性が向上したアミノ酸置換体を見出し、本発明を完成させるに至った。 In order to solve the above problems, as a result of exhaustive substitution of the amino acid residue at position 176 in the amino acid sequence of human FcγRIIIa shown in SEQ ID NO: 1 with other amino acid residues, the present inventors achieved conventional FcγRIIIa The present inventors have found an amino acid substitute having improved productivity by gene recombination more than that, and completed the present invention.
すなわち、本発明は以下の［１］から［１２］に記載の態様を包含する。 That is, the present invention includes the embodiments described in the following [1] to [12].
［１］ 以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のＦｃ結合性タンパク質：
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１９２番目のバリンがイソロイシン、アラニン、およびチロシンから選択されるいずれかにアミノ酸置換された、タンパク質；
（ｂ） 配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において少なくとも１９２番目のバリンがイソロイシン、アラニン、およびチロシンから選択されるいずれかにアミノ酸置換され、さらに１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、抗体結合活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において少なくとも１９２番目のバリンがイソロイシン、アラニン、およびチロシンから選択されるいずれかにアミノ酸置換されたアミノ酸配列に対して、９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、抗体結合活性を有するタンパク質。
[1] Fc binding protein described in the following (a), (b) or (c):
(A) At least amino acid residue from glycine 33 to glutamine at amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 provided that at least 192 valine at amino acid residue 33 to 208 is amino acid residue A protein which has been amino acid substituted with any one selected from isoleucine, alanine and tyrosine;
(B) an amino acid substitution of valine at least 192 in any of amino acid residues from glycine 33 to
(C) amino acid substitution of valine at least 192 in amino acid residue from glycine 33 to
［２］ 配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において、少なくとも１９２番目のバリンがイソロイシンにアミノ酸置換された、［１］に記載のＦｃ結合性タンパク質。
[2] The Fc binding property according to [1], wherein valine at least 192 is substituted for isoleucine at the amino acid residue from glycine 33 to
［３］ 以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のＦｃ結合性タンパク質：
（ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１９２番目のバリンがイソロイシン、アラニン、およびチロシンから選択されるいずれかにアミノ酸置換された、タンパク質；
（ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において少なくとも１９２番目のバリンがイソロイシン、アラニン、およびチロシンから選択されるいずれかにアミノ酸置換され、さらに１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、抗体結合活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において少なくとも１９２番目のバリンがイソロイシン、アラニン、およびチロシンから選択されるいずれかにアミノ酸置換されたアミノ酸配列に対して、９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、抗体結合活性を有するタンパク質。
[3] Fc binding protein described in the following (a), (b) or (c):
(A) At least amino acid residue from glycine 33 to glutamine at amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 provided that at least 192 valine at amino acid residue 33 to 208 is amino acid residue A protein which has been amino acid substituted with any one selected from isoleucine, alanine and tyrosine;
(B) an amino acid substitution of valine at least 192 in any of amino acid residues from glycine 33 to glutamine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 with any one selected from isoleucine, alanine and tyrosine; Furthermore, a protein comprising an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion or addition of 1 to 10 amino acid residues, and having antibody binding activity;
(C) amino acid substitution of valine at least 192 in amino acid residue from glycine 33 to
［４］ 配列番号５に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において、少なくとも１９２番目のバリンがイソロイシンにアミノ酸置換された、［３］に記載のＦｃ結合性タンパク質。
[4] The Fc binding property according to [3], wherein valine at least 192 is substituted for isoleucine at the amino acid residue from glycine 33 to
［５］ 配列番号９、１１、および１３から選択されるいずれかに記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸配列を少なくとも含む、［３］に記載のＦｃ結合性タンパク質。
[5] The Fc binding protein according to [3], which comprises at least the amino acid sequence from glycine 33 to
［６］ ［１］から［５］のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。 [6] A polynucleotide encoding the Fc binding protein according to any one of [1] to [5].
［７］ ［６］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。 [7] An expression vector comprising the polynucleotide of [6].
［８］ ［７］に記載の組換えベクターで宿主を形質転換して得られる、Ｆｃ結合性タンパク質を生産可能な形質転換体。 [8] A transformant capable of producing an Fc binding protein, which is obtained by transforming a host with the recombinant vector according to [7].
［９］ 宿主が大腸菌である、［８］に記載の形質転換体。 [9] The transformant according to [8], wherein the host is E. coli.
［１０］ ［８］または［９］に記載の形質転換体を培養することによりＦｃ結合性タンパク質を生産する工程と、得られた培養物から生産された前記Ｆｃ結合性タンパク質を回収する工程とを含む、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。 [10] A step of producing an Fc binding protein by culturing the transformant according to [8] or [9], a step of recovering the Fc binding protein produced from the obtained culture, and A method for producing an Fc binding protein, comprising
［１１］ ［１］から［５］のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる、抗体吸着剤。 [11] An antibody adsorbent obtained by immobilizing the Fc binding protein according to any one of [1] to [5] on an insoluble carrier.
［１２］ ［１１］に記載の吸着剤を充填したカラムに抗体を含む溶液を添加して当該抗体を前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、抗体の分離方法。 [12] A step of adding a solution containing an antibody to a column packed with the adsorbent according to [11] to cause the antibody to be adsorbed to the adsorbent, and eluting the antibody adsorbed to the adsorbent using an eluate A method of separating antibodies, comprising the steps of
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、抗体（免疫グロブリン）のＦｃ領域に結合性を持つヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸置換体である。具体的には、配列番号４に記載のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、少なくともＶａｌ１９２Ｉｌｅ（この表記は、配列番号４の１９２番目のバリンがイソロイシンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｖａｌ１９２Ａｌａ、Ｖａｌ１９２Ｔｙｒのうち、いずれかのアミノ酸置換が生じたタンパク質である。
The Fc binding protein of the present invention is an amino acid substitution of human FcγRIIIa having binding to the Fc region of an antibody (immunoglobulin). Specifically, it comprises at least the amino acid residue from glycine 33 to
なお配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸配列は、配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（図１のＥＣの領域）の一部である、１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸配列と同一の配列である。したがって本発明のＦｃ結合性タンパク質は、配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列のうち、１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１７６番目のバリンをイソロイシン、アラニン、チロシンのいずれかにアミノ酸置換したタンパク質と言い換えることもできる。
In the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4, the amino acid sequence from glycine 33 to
また本発明のＦｃ結合性タンパク質は、細胞外領域のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１番目から１６番目までの領域、図１のＳ）の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＣ末端側（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１９３番目から２０８番目までの領域）、細胞膜貫通領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２０９番目から２２９番目までの領域、図１のＴＭ）および細胞内領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２３０番目から２５４番目までの領域、図１のＣ）の全てまたは一部を含んでもよい。
In addition, the Fc binding protein of the present invention may be a signal peptide region (N region from the 1st to 16th regions of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, S in FIG. 1) It may include a part, the C-terminal side of the extracellular region (region from 193 to 208 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1), the cell transmembrane region (amino acid sequence of SEQ ID NO: 1)
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、抗体結合活性を有する限り、配列番号４に記載のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において、Ｖａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２Ａｌａ、およびＶａｌ１９２Ｔｙｒから選択されるいずれかのアミノ酸に置換するアミノ酸置換以外に、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含んでいてもよい。前記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には「１若しくは数個」とは、例えば１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個を意味する。上記のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）によって生じるものも含まれる。例えばヒトＦｃγＲＩＩＩａには、Ｌｅｕ８２Ｈｉｓ、Ｌｅｕ８２Ａｒｇ、Ｇｌｙ１６３Ａｓｐ、Ｔｙｒ１７４Ｈｉｓのうち、いずれか１つ以上のアミノ酸置換が生じたアミノ酸置換体が知られているが、本発明のＦｃ結合性タンパク質はこれらのアミノ酸置換をさらに含んでいてもよい。また、上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加等の例として、両アミノ酸の物理的性質と化学的性質またはそのどちらかが類似したアミノ酸間で置換する保守的置換があげられる。保守的置換は、Ｆｃ結合性タンパク質に限らず一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、アスパラギン酸とグルタミン酸間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間に生じる置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。本発明のＦｃ結合性タンパク質は、抗体結合活性を有する限り、上記アミノ酸配列（配列番号４に記載のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において、Ｖａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２Ａｌａ、およびＶａｌ１９２Ｔｙｒから選択されるいずれかのアミノ酸に置換するアミノ酸置換を生じたアミノ酸配列）全体に対して、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上の相同性を有するタンパク質であってもよい。
The Fc-binding protein of the present invention has Val192Ile at the amino acid residue from glycine 33 to
上記１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等についての記載および相同性についての記載は、後述する「配列番号５に記載のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、少なくともＶａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２Ａｌａ、およびＶａｌ１９２Ｔｙｒのうち、いずれかのアミノ酸置換が生じたタンパク質」においても準用できる。
The description of substitution and deletion, insertion, addition or the like of one or several amino acids at the above one or several positions and the description of the homology are described later in “Fc-binding protein described in SEQ ID NO: 5”. In the amino acid sequence, it comprises at least an amino acid residue from glycine 33 to
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、そのＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から目的の抗体を分離する際に有用なオリゴペプチドをさらに付加してもよい。前記オリゴペプチドとしては、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等があげられる。また本発明のＦｃ結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の固相に固定化する際に有用な、システインを含むオリゴペプチドを、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にさらに付加してもよい。Ｆｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加するオリゴペプチドの長さは、特に制限はない。前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質に付加させる際は、前記オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製後、当業者に周知の方法を用いて遺伝子工学的にＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加させてもよいし、化学的に合成した前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させて付加させてもよい。さらに本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドの例としては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、ＴｏｒＴなどのペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる（特開２０１１−０９７８９８号公報）。 The Fc binding protein of the present invention may further have an oligopeptide useful for separating an antibody of interest from a solution in the presence of a contaminant on the N-terminal side or the C-terminal side. Examples of the oligopeptide include polyhistidine, polylysine, polyarginine, polyglutamic acid and polyaspartic acid. In addition, a cysteine-containing oligopeptide useful for immobilizing the Fc-binding protein of the present invention on a solid phase such as a support for chromatography is the N-terminal side or C-terminal side of the Fc-binding protein of the present invention It may be added to The length of the oligopeptide added to the N-terminal side or C-terminal side of the Fc binding protein is not particularly limited. When adding the oligopeptide to the Fc binding protein of the present invention, after producing a polynucleotide encoding the oligopeptide, the N-terminal side of the Fc binding protein is genetically engineered using a method well known to those skilled in the art Alternatively, they may be added to the C-terminal side, or the chemically synthesized oligopeptide may be added by chemically binding to the N-terminal side or C-terminal side of the Fc binding protein of the present invention. Furthermore, to the N-terminal side of the Fc binding protein of the present invention, a signal peptide may be added to promote efficient expression in the host. Examples of the signal peptide when the host is E. coli include secreting a protein in the periplasm such as PelB, DsbA, MalE (region from the 1st to 26th of the amino acid sequences described in UniProt No. P0AEX9), TorT, etc. A signal peptide can be illustrated (Unexamined-Japanese-Patent No. 2011-097898).
本発明のＦｃ結合性タンパク質の好ましい例として、配列番号５に記載のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、少なくともＶａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２Ａｌａ、およびＶａｌ１９２Ｔｙｒのうち、いずれかのアミノ酸置換が生じたタンパク質があげられる。なお配列番号５の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基からなるポリペプチドは、配列番号４の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基からなり、但しＶａｌ４３Ｇｌｕ、Ｐｈｅ４５Ｉｌｅ、Ｔｙｒ５１Ａｓｎ、Ｇｌｎ６４Ａｒｇ、Ｐｈｅ９１Ｌｅｕ、Ａｓｎ１０８Ｓｅｒ、Ｖａｌ１３３Ｇｌｕ、Ｇｌｕ１３７ＧｌｙおよびＰｈｅ１８７Ｓｅｒのアミノ酸置換が生じたポリペプチドである。
As a preferred example of the Fc binding protein of the present invention, the amino acid sequence of the Fc binding protein of SEQ ID NO: 5 includes at least amino acid residues from glycine 33 to
前述した本発明のＦｃ結合性タンパク質の好ましい例の一態様として、
（Ｉ）配列番号５に記載のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち、Ｖａｌ１９２Ｉｌｅの置換が生じた配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質や、
（ＩＩ）配列番号５に記載のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち、Ｖａｌ１９２Ａｌａの置換が生じた配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質や、
（ＩＩＩ）配列番号５に記載のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち、Ｖａｌ１９２Ｔｙｒの置換が生じた配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
があげられる。なお配列番号９、１１および１３に記載のＦｃ結合性タンパク質のうち、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジンから３２番目のメチオニンまでがリンカー配列であり、２０９番目から２１０番目までのグリシンがリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジンがタグ配列である。
As one aspect of a preferred example of the Fc binding protein of the present invention described above,
(I) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 in which substitution of Val192Ile has occurred among the amino acid sequences of the Fc binding protein of SEQ ID NO: 5;
(II) a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 in which a substitution of Val192Ala has occurred among the amino acid sequences of the Fc binding protein set forth in SEQ ID NO: 5;
(III) a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 in which substitution of Val192Tyr has occurred among the amino acid sequences of the Fc binding protein set forth in SEQ ID NO: 5;
Can be mentioned. Among the Fc binding proteins described in SEQ ID NOS: 9, 11 and 13, the 1st methionine to the 26th alanine are the MalE signal peptide, and the 27th lysine to the 32nd methionine are the linker sequences. , And glycine at
本発明のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、単に本発明のポリヌクレオチドとも表記する）の作製方法の一例として、
（ｉ）本発明のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
（ｉｉ）本発明のＦｃ結合性タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、または本発明のＦｃ結合性タンパク質のｃＤＮＡ等からＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した当該ポリヌクレオチドを適当な方法で連結する方法、が例示できる。
As an example of a method for producing a polynucleotide encoding the Fc binding protein of the present invention (hereinafter, also simply referred to as the polynucleotide of the present invention),
(I) A method of artificially synthesizing a polynucleotide comprising the nucleotide sequence by converting the amino acid sequence of the Fc binding protein of the present invention into a nucleotide sequence,
(Ii) A polynucleotide comprising the whole or a partial sequence of the Fc binding protein of the present invention is prepared directly or artificially, or prepared from a cDNA or the like of the Fc binding protein of the present invention using a DNA amplification method such as PCR. A method of ligating the above-mentioned polynucleotides in a suitable manner can be exemplified.
前記（ｉ）の方法において、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のウェブサイトにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。 In the method (i), when converting an amino acid sequence to a nucleotide sequence, it is preferable to convert in consideration of the usage frequency of codons in the host to be transformed. As an example, when the host is Escherichia coli, AGA / AGG / CGG / CGA for arginine (Arg), ATA for isoleucine (Ile), CTA for leucine (Leu), GGA for glycine (Gly) However, since CCC in Proline (Pro) is used less frequently (because it is a so-called rare codon), conversion may be performed so as to avoid those codons. Analysis of codon usage can also be performed by using a public database (eg, Codon Usage Database on the website of Kazusa DNA Research Institute).
ＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチドに変異を導入することで本発明のポリヌクレオチドを作製する際、エラープローンＰＣＲ法を用いることができる。エラープローンＰＣＲ法における反応条件は、ＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチドに所望の変異を導入できる条件であれば特に限定はなく、例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ２を０．０１から１０ｍＭ（好ましくは０．１から１ｍＭ）の濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことで、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。またエラープローンＰＣＲ法以外の変異導入方法としては、Ｆｃ結合性タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドに、変異原となる薬剤を接触・作用させたり、紫外線を照射したりして、ポリヌクレオチドに変異を導入して作製する方法があげられる。当該方法において変異原として使用する薬剤としては、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン等、当業者が通常用いる変異原性薬剤を用いればよい。 When producing a polynucleotide of the present invention by introducing a mutation into a polynucleotide encoding FcγRIIIa, error-prone PCR can be used. The reaction conditions in the error-prone PCR method are not particularly limited as long as they can introduce a desired mutation into a polynucleotide encoding FcγRIIIa, and for example, four types of deoxynucleotides (dATP / dTTP / dCTP / dGTP) which are substrates The mutation can be introduced into the polynucleotide by performing the PCR by adding MnCl 2 at a concentration of 0.01 to 10 mM (preferably 0.1 to 1 mM) to the PCR reaction solution by making the concentration of . Further, as a mutation introduction method other than the error-prone PCR method, a polynucleotide containing the whole or a partial sequence of the Fc binding protein is contacted with or reacted with an agent serving as a mutagen or irradiated with ultraviolet light, There is a method of introducing a mutation into As the drug to be used as a mutagen in the method, hydroxylamine, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, nitrous acid, sulfurous acid, hydrazine and the like, mutagenic agents commonly used by those skilled in the art may be used. .
本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現させる宿主には特に制限はなく、一例として、動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞等）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等）、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１等）、大腸菌（ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等）や枯草菌があげられる。なお動物細胞や大腸菌を宿主として用いると生産性の面で好ましく、大腸菌を宿主として用いるとさらに好ましい。 The host expressing the Fc binding protein of the present invention is not particularly limited. For example, animal cells (CHO cells, HEK cells, Hela cells, COS cells, etc.), yeasts (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces) Examples include japonicus, Schizosaccharomyces octosporus, Schizosaccharomyces pombe, etc., insect cells (Sf9, Sf21, etc.), E. coli (JM109 strain, BL21 (DE3) strain, W3110 strain, etc.) and Bacillus subtilis. It is preferable to use animal cells and E. coli as a host in terms of productivity, and it is more preferable to use E. coli as a host.
本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換する場合、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いてもよいが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミド等）の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入したものを用いると、より好ましい。なお当該発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクター、ｐＣＤＦプラスミドベクター、ｐＢＢＲプラスミドベクターを例示することができる。また前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で挿入すると好ましい。当該プロモータの例として、宿主が大腸菌の場合は、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータがあげられ、宿主が動物細胞の場合は、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーターがあげられる。 When a host is transformed with the polynucleotide of the present invention, the polynucleotide of the present invention may be used, but an expression vector (eg, bacteriophage, cosmid or the like usually used for transformation of prokaryotic cells or eukaryotic cells) may be used. It is more preferable to use one in which the polynucleotide of the present invention is inserted at an appropriate position of a plasmid etc.). The expression vector is not particularly limited as long as it stably exists in the host to be transformed and can be replicated, and when using E. coli as the host, pET plasmid vector, pUC plasmid vector, pTrc plasmid vector, pCDF plasmid vector , PBBR plasmid vectors can be exemplified. The appropriate position means a position which does not destroy the replication function of the expression vector, the desired antibiotic marker, and the region involved in transferability. When inserting the polynucleotide of the present invention into the expression vector, it is preferable to insert in a state of being linked to a functional polynucleotide such as a promoter necessary for expression. Examples of such a promoter include trp promoter, tac promoter, trc promoter, lac promoter, T7 promoter, recA promoter, lpp promoter, λ PL promoter of λ phage, λ PR promoter and the like when the host is E. coli. In the case of animal cells, examples include SV40 promoter, CMV promoter and CAG promoter.
前記方法により作製した、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター（以下、本発明の発現ベクターとする）を用いて宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。例えば、宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物（大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、大腸菌Ｗ３１１０株等）を選択する場合には、公知の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５６，１９９２）に記載の方法等により形質転換すればよい。なお宿主が動物細胞である場合にはエレクトロポレーションやリポフェクションを用いればよい。前述した方法で形質転換して得られた形質転換体は、適切な方法でスクリーニングすることにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体（以下、本発明の形質転換体とする）を取得することができる。 In order to transform a host using an expression vector (hereinafter referred to as the expression vector of the present invention) containing the polynucleotide of the present invention prepared by the above-mentioned method, one skilled in the art may carry out a method commonly used. For example, when selecting a microorganism belonging to the genus Escherichia (E. coli JM109 strain, E. coli BL21 (DE3) strain, E. coli W3110 strain, etc.) as a host, known documents (eg Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 256, 1992) The transformation may be carried out by the method described in 1.). When the host is an animal cell, electroporation or lipofection may be used. The transformant obtained by transformation according to the above-mentioned method is screened by an appropriate method to obtain a transformant capable of expressing the Fc binding protein of the present invention (hereinafter referred to as the transformant of the present invention) ) Can be obtained.
本発明の形質転換体から本発明の発現ベクターを調製するには、形質転換に用いた宿主に適した方法で、本発明の形質転換体から本発明の発現ベクターを抽出し調製すればよい。
例えば、本発明の形質転換体の宿主が大腸菌の場合、形質転換体を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン製）等の市販の抽出キットを用いて調製すればよい。
In order to prepare the expression vector of the present invention from the transformant of the present invention, the expression vector of the present invention may be extracted and prepared from the transformant of the present invention by a method suitable for the host used for transformation.
For example, when the host of the transformant of the present invention is E. coli, the culture obtained by culturing the transformant is prepared using a commercially available extraction kit such as alkaline extraction method or QIAprep Spin Miniprep kit (manufactured by Qiagen). Just do it.
本発明の形質転換体を培養し、得られた培養物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収することで、本発明のＦｃ結合性タンパク質を製造することができる。なお本明細書において培養物とは、培養された本発明の形質転換体の細胞そのもののほか、培養に用いた培地も含まれる。本発明のタンパク質製造方法で用いる形質転換体は、対象宿主の培養に適した培地で培養すればよく、宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地が好ましい培地の一例としてあげられる。なお、本発明の発現ベクターの導入の有無により本発明の形質転換体を選択的に増殖させるために、培地に当該ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養すると好ましい。例えば、当該ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加してもよく、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。さらにグリシンといった前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を添加してもよく、具体的には、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃、より好ましくは２５℃前後であるが、発現させるタンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後である。また本発明のベクターに誘導性のプロモータが含まれている場合は、本発明のＦｃ結合性タンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導をかけると好ましい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を例示することができる。宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、Ｆｃ結合性タンパク質の発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１から０．５ｍＭの範囲が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。 The Fc binding protein of the present invention can be produced by culturing the transformant of the present invention and recovering the Fc binding protein of the present invention from the obtained culture. In the present specification, the term "culture" includes not only cultured cells of the transformant of the present invention but also the medium used for culture. The transformant used in the protein production method of the present invention may be cultured in a medium suitable for culturing the target host, and when the host is E. coli, LB (Luria-Bertani) medium supplemented with a necessary nutrient source is preferable An example of the culture medium is given. In order to selectively grow the transformant of the present invention depending on the presence or absence of the introduction of the expression vector of the present invention, it is preferable to culture the medium with a drug corresponding to the drug resistance gene contained in the vector. For example, when the vector contains a kanamycin resistance gene, kanamycin may be added to the medium. In addition to carbon, nitrogen and inorganic salt sources, the medium may also contain suitable nutrient sources, optionally selected from the group consisting of glutathione, cysteine, cystamine, thioglycollate and dithiothreitol. May contain one or more reducing agents. Furthermore, a reagent that promotes protein secretion from the transformant to the culture solution, such as glycine, may be added. Specifically, when the host is E. coli, the concentration of glycine is 2% (w / v) or less of the culture medium. It is preferable to add it. The culture temperature is generally 10 ° C. to 40 ° C., preferably 20 ° C. to 37 ° C., more preferably around 25 ° C. when the host is E. coli, and may be selected according to the characteristics of the protein to be expressed. The pH of the medium is pH 6.8 to pH 7.4, preferably around pH 7.0, when the host is E. coli. When the vector of the present invention contains an inducible promoter, induction is preferably performed under conditions such that the Fc binding protein of the present invention can be expressed well. As an inducer, IPTG (isopropyl-β-thiogalactopyranoside) can be exemplified. When the host is E. coli, the turbidity of the culture solution (absorbance at 600 nm) is measured, and when it reaches about 0.5 to 1.0, an appropriate amount of IPTG is added, followed by culturing to obtain Fc binding. Protein expression can be induced. The addition concentration of IPTG may be appropriately selected from the range of 0.005 to 1.0 mM, preferably in the range of 0.01 to 0.5 mM. Various conditions for IPTG induction may be performed under conditions well known in the art.
本発明の形質転換体を培養して得られた培養物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収するには、本発明の形質転換体における本発明のＦｃ結合性タンパク質の発現形態に適した方法で、当該培養物から分離／精製して本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収すればよい。例えば、培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明のＦｃ結合性タンパク質を精製すればよい。また、細胞内（ペリプラズムを含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加したり、超音波やフレンチプレス等を用いて菌体を破砕して本発明のＦｃ結合性タンパク質を抽出した後、精製すればよい。本発明のＦｃ結合性タンパク質を精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として液体クロマトグラフィーを用いた分離／精製があげられる。液体クロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を高純度に調製することができる。 In order to recover the Fc-binding protein of the present invention from the culture obtained by culturing the transformant of the present invention, a method suitable for the expression form of the Fc-binding protein of the present invention in the transformant of the present invention The Fc-binding protein of the present invention may be recovered by separation / purification from the culture. For example, when expressing in the culture supernatant, the cells may be separated by centrifugation, and the Fc binding protein of the present invention may be purified from the obtained culture supernatant. In addition, when expressing in cells (including periplasm), after collecting the cells by centrifugation, add an enzyme treatment agent, surfactant, etc., or use ultrasonic waves, French press, etc. After crushing the body and extracting the Fc binding protein of the present invention, purification may be performed. In order to purify the Fc binding protein of the present invention, methods known in the art may be used, such as separation / purification using liquid chromatography as an example. Liquid chromatography includes ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography, etc. The Fc binding ability of the present invention can be achieved by performing a purification operation by combining these chromatographys. Proteins can be prepared to high purity.
得られた本発明のＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧに対する結合活性を測定する方法としては、例えばＩｇＧに対する結合活性をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法や表面プラズモン共鳴法などを用いて測定すればよい。結合活性の測定に使用するＩｇＧは、ヒトＦｃ結合性タンパク質の改変型を用いる場合はヒトＩｇＧが好ましい。 As a method of measuring the binding activity of the obtained Fc binding protein of the present invention to IgG, for example, the binding activity to IgG may be measured using ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method, surface plasmon resonance method or the like. . The IgG used for measurement of binding activity is preferably human IgG when a modified form of human Fc binding protein is used.
本発明のＦｃ結合性タンパク質を用いて抗体の分離・分析を行なう際は、前述した本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化させた、抗体吸着剤を作製する必要がある。なお本明細書における抗体の分離とは、夾雑物質共存下の溶液からの抗体の分離に限らず、構造・性質・活性等に基づく抗体間の分離も含まれる。前記Ｆｃ結合性タンパク質に固定化させる不溶性担体には特に限定はなく、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタン等の合成高分子を原料とした担体や、シリカ等のセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー製）等の水酸基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ製）等のセルロースゲルがあげられる。不溶性担体の形状については特に限定はなく、粒状物または非粒状物、多孔性または非多孔性、いずれであってもよい。 When performing separation and analysis of antibodies using the Fc binding protein of the present invention, it is necessary to prepare an antibody adsorbent in which the Fc binding protein of the present invention described above is immobilized on an insoluble carrier. The separation of antibodies in the present specification is not limited to the separation of antibodies from a solution in the presence of contaminants, but also includes separation between antibodies based on structure, properties, activity and the like. The insoluble carrier to be immobilized on the Fc binding protein is not particularly limited, and carriers made of polysaccharides such as agarose, alginate (alginate), carrageenan, chitin, cellulose, dextrin, dextran and starch as raw materials, polyvinyl alcohol Carriers using synthetic polymers such as polymethacrylate, poly (2-hydroxyethyl methacrylate) and polyurethane as raw materials, and carriers using ceramics such as silica as raw materials can be exemplified. Among them, carriers derived from polysaccharides and carriers derived from synthetic polymers are preferred as insoluble carriers. Examples of the preferred carrier include polymethacrylate gels into which hydroxyl groups have been introduced such as Toyopearl (manufactured by Tosoh Corporation), agarose gels such as Sepharose (manufactured by GE Healthcare), and cellulose gels such as Celfine (manufactured by JNC). There is no particular limitation on the form of the insoluble carrier, and it may be particulate or non-particulate, porous or non-porous.
本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化するには、当該不溶性担体にＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミド等の活性基を付与し、当該活性基を介して本発明のＦｃ結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることで固定化すればよい。活性基を付与した担体は市販の担体をそのまま用いてもよいし、適切な反応条件で担体表面に活性基を導入して調製してもよい。活性基を付与した市販の担体としてはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｅｐｏｘｙ−６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０Ｍ（いずれも東ソー製）、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅｓｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）が例示できる。 In order to immobilize the Fc binding protein of the present invention on an insoluble carrier, N-hydroxysuccinimide (NHS) activated ester group, epoxy group, carboxyl group, maleimide group, haloacetyl group, tresyl group, etc. An active group such as a formyl group or haloacetamide may be provided, and the Fc-binding protein of the present invention and the insoluble carrier may be covalently bonded via the active group. A commercially available carrier may be used as it is, or a carrier provided with an active group may be prepared by introducing an active group on the surface of the carrier under appropriate reaction conditions. Commercially available carriers to which an active group is added include TOYOPEARL AF-Epoxy-650M, TOYOPEARL AF-Tresyl-650M (all from Tosoh), HiTrap NHS-activated HP Columns, NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow, Epoxy-activated Sepharose 6B (All are manufactured by GE Healthcare) and SulfoLink Coupling Resin (manufactured by Thermo Fisher Scientific) can be exemplified.
一方、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。当該化合物の一例のうち、担体表面の水酸基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。前記化合物により担体表面にエポキシ基を導入した後、担体表面にカルボキシル基を導入する化合物としては、２−メルカプト酢酸、３−メルカプトプロピオン酸、４−メルカプト酪酸、６−メルカプト酪酸、グリシン、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸を例示できる。 On the other hand, as a method of introducing an active group on the surface of a carrier, a method of reacting one of a compound having two or more active sites with a hydroxyl group, an epoxy group, a carboxyl group, an amino group, etc. present on the carrier surface is exemplified. it can. Among the examples of the compound, epichlorohydrin, ethanediol diglycidyl ether, butanediol diglycidyl ether, and hexanediol diglycidyl ether can be exemplified as a compound for introducing an epoxy group to a hydroxyl group or amino group on the carrier surface. As a compound which introduce | transduces a carboxyl group into the support | carrier surface, after introduce | transducing an epoxy group into the support | carrier surface with the said compound, 2-mercaptoacetic acid, 3-mercaptopropionic acid, 4-mercaptobutyric acid, 6-mercaptobutyric acid, glycine, 3- Aminopropionic acid, 4-aminobutyric acid, 6-aminohexanoic acid can be exemplified.
担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ−（ε−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酢酸ヒドラジド、２−アミノマレイミド、３−アミノマレイミド、４−アミノマレイミド、６−アミノマレイミド、１−（４−アミノフェニル）マレイミド、１−（３−アミノフェニル）マレイミド、４−（マレイミド）フェニルイソシアナート、２−マレイミド酢酸、３−マレイミドプロピオン酸、４−マレイミド酪酸、６−マレイミドヘキサン酸、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボニル−（６−アミノヘキサン酸）、スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸、（ｐ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。 As a compound for introducing a maleimide group to a hydroxyl group, an epoxy group, a carboxyl group or an amino group present on the carrier surface, N- (ε-maleimidocaproic acid) hydrazide, N- (ε-maleimidopropionic acid) hydrazide, 4- [4 4-N-maleimidophenyl] acetic acid hydrazide, 2-aminomaleimide, 3-aminomaleimide, 4-aminomaleimide, 6-aminomaleimide, 1- (4-aminophenyl) maleimide, 1- (3-aminophenyl) maleimide, 4- (Maleimido) phenyl isocyanate, 2-maleimidoacetic acid, 3-maleimidopropionic acid, 4-maleimidobutyric acid, 6-maleimidohexanoic acid, N- (α-maleimidoacetoxy) succinimide ester, (m-maleimidobenzoyl) N- Hydroxysuccinimide ester, sk Imididyl-4- (maleimidomethyl) cyclohexane-1-carbonyl- (6-aminohexanoic acid), succinimidyl-4- (maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylic acid, (p-maleimidobenzoyl) N-hydroxysuccinimide ester, An example is m-maleimidobenzoyl) N-hydroxysuccinimide ester.
担体表面に存在する水酸基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２−（ヨードアセトアミド）酢酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３−（ブロモアセトアミド）プロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−（ヨードアセチル）アミノ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。なお担体表面に存在する水酸基やアミノ基にω−アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω−アルケニル部位をハロゲン化し活性化する方法も例示できる。ω−アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３−ブテニルグリシジルエーテル、４−ペンテニルグリシジルエーテルを例示でき、ハロゲン化剤としてはＮ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミドを例示できる。 Examples of compounds for introducing a haloacetyl group to a hydroxyl group or amino group present on the surface of a carrier include chloroacetic acid, bromoacetic acid, iodoacetic acid, chloroacetic acid chloride, bromoacetic acid chloride, bromoacetic acid bromide, chloroacetic acid anhydride, bromoacetic acid anhydride, Iodoacetic anhydride, 2- (iodoacetamido) acetic acid-N-hydroxysuccinimide ester, 3- (bromoacetamido) propionic acid-N-hydroxysuccinimide ester, 4- (iodoacetyl) aminobenzoic acid-N-hydroxysuccinimide ester It can be illustrated. In addition, after making (omega) -alkenyl alkane glycidyl ether react with the hydroxyl group and amino group which exist on the support | carrier surface, the method of halogenating and activating (omega) -alkenyl part with a halogenating agent can also be illustrated. Examples of ω-alkenyl alkane glycidyl ether include allyl glycidyl ether, 3-butenyl glycidyl ether and 4-pentenyl glycidyl ether, and examples of a halogenating agent include N-chlorosuccinimide, N-bromosuccinimide and N-iodosuccinimide it can.
担体表面に活性基を導入する方法の別の例として、担体表面に存在するカルボキシル基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性化基を導入する方法がある。縮合剤としては１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。また添加剤としてはＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４−ニトロフェノール、１−ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。 As another example of the method of introducing an active group to the surface of a carrier, there is a method of introducing an activating group to a carboxyl group present on the surface of a carrier using a condensing agent and an additive. As a condensing agent, 1-ethyl 3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), dicyclohexyl carbodiimide, carbonyl diimidazole can be illustrated. Moreover, N-hydroxy succinimide (NHS), 4-nitrophenol, 1-hydroxy benztriazole can be illustrated as an additive.
本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化する際用いる緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、５℃から５０℃までの温度範囲の中から活性基の反応性やＦｃ結合性タンパク質の安定性を考慮の上、適宜設定すればよく、好ましくは１０℃から３５℃の範囲である。 Acetate buffer solution, phosphate buffer solution, MES (2-Morpholinoethanesulfonic acid) buffer solution, HEPES (4- (2-hydroxyethyl)-) as a buffer used when immobilizing the Fc binding protein of the present invention to an insoluble carrier 1-piperazine (Ethanesulfonic acid) buffer, Tris buffer, borate buffer can be exemplified. The reaction temperature for immobilization may be appropriately set in the temperature range of 5 ° C. to 50 ° C. in consideration of the reactivity of the active group and the stability of the Fc binding protein, and preferably 10 ° C. to It is in the range of 35 ° C.
前述した方法により得られた抗体吸着剤を用いて本発明の分離方法を実施するには、当該抗体吸着剤を充填したカラムに、ポンプ等の送液手段を用いて抗体を含む溶液を添加することで、当該吸着剤に抗体を特異的に吸着させた後、適切な溶出液を当該カラムに添加することで、抗体を溶出すればよい。なお抗体を含む溶液は、カラムに添加する前にあらかじめ適切な緩衝液を用いて溶媒置換させるとよい。また抗体を含む溶液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化すると、抗体をより高純度に分離できるため好ましい。平衡化に用いる緩衝液（平衡化液）としてはリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液が例示でき、さらに前記緩衝液に、１０ｍＭから１００ｍＭの塩化ナトリウム等の無機塩を添加してもよい。抗体吸着剤に吸着した抗体を溶出させるには、抗体とリガンド（本発明のＦｃ結合性タンパク質）との相互作用を弱めればよく、具体的には、緩衝液によるｐＨの低下、カウンターペプチドの添加、温度上昇、塩濃度変化が例示できる。抗体吸着剤に吸着した抗体を溶出させるための溶出液の具体例として、抗体吸着剤に抗体を吸着させる際に用いた溶液よりも酸性側の緩衝液があげられる。その緩衝液の種類としては酸性側に緩衝能を有するクエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。緩衝液のｐＨは、抗体が有する機能（抗原への結合性等）を損なわない範囲で設定すればよい。 In order to carry out the separation method of the present invention using the antibody adsorbent obtained by the above-described method, a solution containing the antibody is added to a column packed with the antibody adsorbent using a liquid delivery means such as a pump. Thus, after the antibody is specifically adsorbed to the adsorbent, the antibody may be eluted by adding an appropriate eluate to the column. The solution containing the antibody may be solvent-replaced in advance using an appropriate buffer before being added to the column. In addition, it is preferable to equilibrate the column with an appropriate buffer before adding a solution containing the antibody to the column, since the antibody can be separated with higher purity. Examples of buffers (equilibration solutions) used for equilibration include phosphate buffer, acetate buffer and MES buffer, and further, inorganic salts such as sodium chloride of 10 mM to 100 mM may be added to the buffer. Good. In order to elute the antibody adsorbed to the antibody adsorbent, it is sufficient to weaken the interaction between the antibody and the ligand (the Fc binding protein of the present invention). Specifically, the pH is lowered by the buffer, the counter peptide Addition, temperature rise, change in salt concentration can be exemplified. As a specific example of the eluate for eluting the antibody adsorbed to the antibody adsorbent, a buffer solution on the more acidic side than the solution used for adsorbing the antibody to the antibody adsorbent can be mentioned. Examples of the type of the buffer include citrate buffer having buffering capacity on the acid side, glycine hydrochloride buffer, and acetate buffer. The pH of the buffer may be set within a range that does not impair the function (such as the binding to an antigen) possessed by the antibody.
さらに、溶出された抗体が含まれる画分を分取することができ、得られた画分から抗体を得ることができる。分取は常法により行ってよい。具体的には、例えば、一定の時間ごとや、一定の容量ごとに回収容器を交換する方法や、溶出液のクロマトグラムの形状に合わせて回収容器を換える方法や、オートサンプラー等の自動フラクションコレクター等により画分の分取をすることが挙げられる。 Furthermore, fractions containing the eluted antibody can be fractionated, and antibodies can be obtained from the obtained fractions. The sorting may be performed according to a conventional method. Specifically, for example, a method of replacing the collection container every fixed time or every fixed volume, a method of changing the collection container according to the shape of the chromatogram of the eluate, or an automatic fraction collector such as an autosampler It can be mentioned that the fraction is fractionated by the like.
本発明は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａのうち、特定位置のアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換することで、遺伝子組換体による生産性を向上させることができる。 The present invention can improve productivity by gene recombination by replacing an amino acid residue at a specific position in human FcγRIIIa with another specific amino acid residue.
なお本発明のＦｃ結合性タンパク質は、従来のＦｃγＩＩＩａと同等の抗体への親和性を有している。そのため、当該タンパク質を不溶性担体に固定して得られる抗体吸着剤は、抗体医薬品の工業的製造における工程分析および分取用途に有用といえる。 The Fc binding protein of the present invention has an affinity to an antibody equivalent to that of conventional FcγIIIa. Therefore, an antibody adsorbent obtained by immobilizing the protein on an insoluble carrier can be useful for process analysis and preparative use in industrial production of antibody pharmaceuticals.
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail using examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例１ ＦｃＲ９アミノ酸置換体の作製
特開２０１６−１６９１９７号公報（特許文献２）に記載の方法で作製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９（配列番号５）に対し、１９２番目（配列番号１では１７６番目に相当）のアミノ酸残基を他のアミノ酸へ置換することの有用性を確認するため、以下に示すアミノ酸置換を行なった。具体的にはＦｃＲ９をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）を含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ９（特開２０１６−１６９１９７号公報）に対し、ＰＣＲを用いてアミノ酸の置換を行ない、ＦｃＲ９（配列番号５）のうち１９２番目のバリンを他のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質を作製した。なおＦｃＲ９（配列番号５）は、配列番号４に示すヒトＦｃγＲＩＩＩ細胞外領域を含むＦｃ結合性タンパク質において、４３番目（配列番号１では２７番目に相当）のバリンをグルタミン酸に、４５番目（配列番号１では２９番目に相当）のフェニルアラニンをイソロイシンに、５１番目（配列番号１では３５番目に相当）のチロシンをアスパラギンに、６４番目（配列番号１では４８番目に相当）のグルタミンをアルギニンに、９１番目（配列番号１では７５番目に相当）のフェニルアラニンをロイシンに、１０８番目（配列番号１では９２番目に相当）のアスパラギンをセリンに、１３３番目（配列番号１では１１７番目に相当）のバリンをグルタミン酸に、１３７番目（配列番号１では１２１番目に相当）のグルタミン酸をグリシンに、および１８７番目（配列番号１では１７１番目に相当）のフェニルアラニンをセリンに、それぞれアミノ酸置換されたＦｃ結合性タンパク質である。
Example 1 Preparation of FcR9 Amino Acid Substituent The Fc-binding protein FcR9 (SEQ ID NO: 5) prepared by the method described in JP-A-2016-169197 (Patent Document 2), the 192nd (the 176th in SEQ ID NO: 1) In order to confirm the usefulness of substituting the amino acid residue of (corresponding to) with another amino acid, the following amino acid substitutions were performed. Specifically, amino acid substitution is performed on a plasmid pET-FcR9 (Japanese Patent Laid-Open No. 2016-169197) containing a polynucleotide encoding FcR9 (SEQ ID NO: 6) using PCR to obtain FcR9 (SEQ ID NO: 5). An Fc binding protein was prepared in which valine at position 192 was replaced with another amino acid. FcR9 (SEQ ID NO: 5) is a 43rd (corresponding to the 27th in SEQ ID NO: 1) valine of glutamic acid in the Fc binding protein containing the extracellular domain of human FcγRIII shown in SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 5) In 1) phenylalanine is equivalent to isoleucine, 51st (corresponding to 35th in SEQ ID NO: 1) tyrosine is asparagine, and 64th (corresponding to 48th in SEQ ID NO: 1) glutamine is arginine, 91 The phenylalanine is leucine, the 108th (corresponding to 92nd in SEQ ID NO: 1) is serine, and the valine is 133th (corresponding to 117th in SEQ ID NO: 1). In the glutamate, the glutamate at position 137 (corresponding to position 121 in SEQ ID NO: 1) was glycine And phenylalanine to serine 187th (corresponding to 171 th in SEQ ID NO: 1), the Fc binding proteins respectively amino acid substitutions.
（１）鋳型ＤＮＡとして特開２０１６−１６９１９７号公報に記載の方法で作製したＦｃＲ９（配列番号５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）を含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ９（特開２０１６−１６９１９７号公報）を、フォワードプライマーとして配列番号２（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号７（５’−ＣＡＴＴＴＴＴＧＣＴＧＣＣＭＮＮＣＡＧＣＣＣＡＣＧＧＣＡＧＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いて、表１に示す組成からなる反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することでＰＣＲを行なった。得られたＰＣＲ産物をＶ１９２ｐ１とした。 (1) A plasmid pET-FcR9 (JP-A-2016-169197) containing a polynucleotide (SEQ ID NO: 6) encoding FcR9 (SEQ ID NO: 5) prepared by the method described in JP-A-2016-169197 as a template DNA ), An oligonucleotide consisting of the sequence described in SEQ ID NO: 2 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') as a forward primer, and an oligo consisting of the sequence described in SEQ ID NO: 7 (5'-CATTTTTGCTGCCMNCAGCCCCACGGCAGG-3') as a reverse primer After preparing a reaction solution having the composition shown in Table 1 using each of the nucleotides, the reaction solution is heat-treated at 95 ° C. for 2 minutes, and the first step for 30 seconds at 95 ° C., the second step for 30 seconds at 50 ° C. Step, 90 seconds at 72 ° C The third 30 cycle without rows react with one cycle steps were performed last PCR by heat treatment at 72 ° C. 7 minutes. The resulting PCR product was designated V192p1.
（２）フォワードプライマーとして配列番号８（５’−ＣＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＧＮＮＫＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号３（５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた他は（１）と同様な方法でＰＣＲを行ない、得られたＰＣＲ産物をＶ１９２ｐ２とした。 (2) An oligonucleotide consisting of the sequence described in SEQ ID NO: 8 (5′-CCTGCCGTGGGCTGNNKGGCAGCAAAAATG-3 ′) as a forward primer, and an oligo consisting of the sequence described in SEQ ID NO: 3 (5′-TATGCTAGTTATTGCTCAG-3 ′) as a reverse primer The PCR was performed in the same manner as in (1) except that each nucleotide was used, and the obtained PCR product was designated as V192p2.
（３）ＰＣＲ産物として（１）で得られたＶ１９２ｐ１と（２）で得られたＶ１９２ｐ２との混合物を用いて、表２に示す組成からなる反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、Ｖ１９２ｐ１とＶ１９２ｐ２を連結したＰＣＲ産物Ｖ１９２ｐを得た。 (3) Using a mixture of V192p1 obtained in (1) and V192p2 obtained in (2) as a PCR product, a reaction solution having the composition shown in Table 2 is prepared, and then the reaction solution is heated to 98 ° C. After heat treatment for 5 minutes, perform PCR for 5 cycles of 1 cycle at 98 ° C for 10 seconds, 2nd step for 5 seconds at 55 ° C, 3rd step for 1 minute at 72 ° C, and V192p1 A PCR product V192p in which V192p2 was ligated was obtained.
（４）ＰＣＲ産物として（３）で得られたＶ１９２ｐを、フォワードプライマーとして配列番号２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いて、表３に示す組成からなる反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なうＰＣＲを行ない、ＦｃＲ９（配列番号５）の１９２番目のバリンを任意のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得た。得られたポリヌクレオチドをＶ１９２ｐ３とした。 (4) The oligonucleotide consisting of the sequence described in SEQ ID NO: 2 as the forward primer, the V192p obtained in (3) as the PCR product, and the oligonucleotide consisting of the sequence described in SEQ ID NO: 3 as the reverse primer After preparing a reaction solution having the composition shown in Table 3, the reaction solution is heat-treated at 98.degree. C. for 5 minutes, and the first step at 98.degree. C. for 10 seconds, the second step at 55.degree. PCR was carried out by performing 30 cycles of reaction with 1 cycle of the third step as one cycle to obtain a polynucleotide encoding an Fc binding protein in which valine at position 192 of FcR9 (SEQ ID NO: 5) was substituted with any amino acid . The obtained polynucleotide was designated V192p3.
（５）（４）で得られたＶ１９２ｐ３を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。 (5) After purification of V192p3 obtained in (4), it is digested with restriction enzymes NcoI and HindIII, and ligated in expression vector pETMalE (Japanese Patent Laid-Open No. 2011-206046) which has been previously digested with restriction enzymes NcoI and HindIII. Was used to transform E. coli BL21 (DE3) strain.
（６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出した。 (6) The resulting transformant was cultured in LB medium supplemented with 50 μg / mL kanamycin. The plasmid was extracted from the collected cells (transformants).
（７）得られたプラスミドのうちＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフテクノロジーズ製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号２または配列番号３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。 (7) Among the obtained plasmids, the polynucleotide encoding the Fc binding protein and the surrounding region are subjected to a cycle sequencing reaction using BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Life Technologies) based on the chain terminator method. The nucleotide sequence was analyzed using a fully automated DNA sequencer Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (manufactured by Life Technologies). In addition, at the time of the said analysis, the oligonucleotide which consists of a sequence of sequence number 2 or sequence number 3 was used as a primer for a sequence.
配列解析の結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９（配列番号５）の１９２番目のバリンがアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンのいずれかに置換されたＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を得た。 As a result of sequence analysis, valine at position 192 of Fc binding protein FcR9 (SEQ ID NO: 5) is alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, A transformant expressing an Fc binding protein substituted with any of proline, serine, threonine, tryptophan and tyrosine was obtained.
実施例２ Ｆｃ結合性タンパク質のＩｇＧに対する結合活性測定
（１）実施例１で得た形質転換体のうち、ＦｃＲ９（配列番号５）の１９２番目（配列番号１では１７６番目）のアミノ酸残基をイソロイシン（以下、Ｖａｌ１９２Ｉｌｅとも表記）、アラニン（以下、Ｖａｌ１９２Ａｌａとも表記）またはチロシン（以下、Ｖａｌ１９２Ｔｙｒとも表記）に置換したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
Example 2 Measurement of Binding Activity of Fc-Binding Protein to IgG (1) Among the transformants obtained in Example 1, the 192nd amino acid residue (176th in SEQ ID NO: 1) of FcR 9 (SEQ ID NO: 5) Transformants expressing Fc binding proteins substituted with isoleucine (hereinafter also indicated as Val192Ile), alanine (hereinafter also indicated as Val192Ala) or tyrosine (hereinafter also indicated as Val192Tyr) are each 2 mL containing 50 μg / mL kanamycin Was precultured by aerobic shaking culture overnight at 37 ° C.
（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２０ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に前培養液を０．２ｍＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。 (2) 0.2 mL of the preculture liquid is inoculated into 20 mL of 2YT liquid medium (Peptone 16 g / L, yeast extract 10 g / L, sodium chloride 5 g / L) supplemented with 50 μg / mL kanamycin, and aerobically at 37 ° C. Shaking culture was performed.
（３）培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養した。その後、終濃度０．０１ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養した。 (3) After 1.5 hours from the start of culture, the culture temperature was changed to 20 ° C., and shake culture was performed for 30 minutes. Thereafter, IPTG (isopropyl-β-thiogalactopyranoside) was added to a final concentration of 0.01 mM, and then aerobic shaking culture was continued at 20 ° C. overnight.
（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。 (4) After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation and a protein extract was prepared using BugBuster Protein extraction kit (Takara Bio).
（５）Ｆｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、下記に示すＥＬＩＳＡ法にて測定した。
（５−１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌで添加して固定化（４℃で一晩）後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ ＭＩＬＫ（ＢＤ製）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）をウェルに添加することでブロッキングした。
（５−２）洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、抗体結合活性を評価するＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を添加し、Ｆｃ結合性タンパク質と固定化ガンマグロブリンとを反応させた（３０℃で１時間）。
（５−３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ−６Ｈｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（５−４）３０℃で１時間反応させ、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（テカン製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
(5) The antibody binding activity of the Fc binding protein was measured by the ELISA method described below.
(5-1) 2% after immobilization by adding 1 μg / well of a human antibody gamma globulin preparation (manufactured by Chemotherapy and Serum Therapy Research Institute) to the wells of a 96-well microplate at 1 μg / well (overnight at 4 ° C.) Blocking was performed by adding (w / v) SKIM MILK (manufactured by BD) and 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 150 mM sodium chloride to the wells.
(5-2) Fc for evaluating antibody binding activity after washing with washing buffer (20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 0.05% (w / v) Tween 20, 150 mM NaCl) A solution containing binding protein was added to react Fc binding protein with immobilized gamma globulin (1 hour at 30 ° C.).
(5-3) After completion of the reaction, the plate was washed with the washing buffer, and Anti-6His antibody (manufactured by Bethyl Laboratories) diluted to 100 ng / mL was added at 100 μL / well.
(5-4) After reacting at 30 ° C. for 1 hour and washing with the above-mentioned washing buffer, TMB Peroxidase Substrate (manufactured by KPL) was added at 50 μL / well. Color development was stopped by adding 1 M phosphoric acid at 50 μL / well, and absorbance at 450 nm was measured with a microplate reader (manufactured by TEKAN).
（６）（５）の方法で得られたＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧに対する結合活性よりＦｃ結合性タンパク質の発現量を算出した。 (6) The expression level of Fc binding protein was calculated from the binding activity of the Fc binding protein obtained by the method of (5) to IgG.
結果を表４に示す。Ｖａｌ１９２Ｉｌｅのアミノ酸置換を含むＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ｉ（配列番号９）、Ｖａｌ１９２Ａｌａのアミノ酸置換を含むＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ａ（配列番号１１）、およびＶａｌ１９２Ｔｙｒのアミノ酸置換を含むＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ｙ（配列番号１３）を発現する形質転換体における培養液１ＬあたりのＦｃ結合性タンパク質発現量はそれぞれ、１３０．６ｍｇ、２１．７ｍｇおよび１４．６ｍｇとなった。 The results are shown in Table 4. FcR9_I (SEQ ID NO: 9) which is an Fc binding protein containing an amino acid substitution of Val192Ile, FcR9_A (SEQ ID NO: 11) which is an Fc binding protein containing an amino acid substitution of Val192Ala, and Fc binding protein containing an amino acid substitution of Val192Tyr The amount of Fc binding protein expressed per liter of culture solution in a transformant expressing a certain FcR9_Y (SEQ ID NO: 13) was 130.6 mg, 21.7 mg and 14.6 mg, respectively.
本実施例で検討したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ｉのアミノ酸配列を配列番号９に、前記ＦｃＲ９＿Ｉをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１０にそれぞれ示す。なお配列番号９において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ９（配列番号５）の３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列においてＶａｌ１９２Ｉｌｅのアミノ酸置換が生じたポリペプチドであり、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また、Ｖａｌ１９２Ｉｌｅのイソロイシンは配列番号９では１９２番目の位置に存在する。 The amino acid sequence of FcR9_I, which is the Fc binding protein examined in this example, is shown in SEQ ID NO: 9, and the sequence of the polynucleotide encoding FcR9_I is shown in SEQ ID NO: 10. In SEQ ID NO: 9, the 1st methionine (Met) to the 26th alanine (Ala) is a MalE signal peptide, the 27th lysine (Lys) to the 32nd methionine (Met) is a linker sequence, , Amino acid substitution of Val192Ile in the amino acid sequence from glycine 33 (Gly) to 208 glutamine (Gln) in FcR9 (SEQ ID NO: 5) from glycine 33 (Gly) to glutamine (Gln) 208 It is a generated polypeptide, and glycine (Gly) from 209 to 210 is a linker sequence, and histidine (His) from 211 to 216 is a tag sequence. In addition, isoleucine of Val192Ile is present at the 192nd position in SEQ ID NO: 9.
本実施例で検討したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ａのアミノ酸配列を配列番号１１に、前記ＦｃＲ９＿Ａをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１２に示す。なお配列番号１１は、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ９（配列番号５）の３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列においてＶａｌ１９２Ａｌａのアミノ酸置換が生じたポリペプチドである他は、配列番号９と同じ配列である。また、Ｖａｌ１９２Ａｌａのアラニンは配列番号１１では１９２番目の位置に存在する。
The amino acid sequence of FcR9_A, which is the Fc binding protein examined in this example, is shown in SEQ ID NO: 11, and the sequence of the polynucleotide encoding FcR9_A is shown in SEQ ID NO: 12. In SEQ ID NO: 11, the amino acid sequence from glycine (Gly) at position 33 to glutamine (Gln) at
本実施例で検討したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ｙのアミノ酸配列を配列番号１３に、前記ＦｃＲ９＿Ｙをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１４に示す。なお配列番号１３は、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ９（配列番号５）の３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列においてＶａｌ１９２Ｔｙｒのアミノ酸置換が生じたポリペプチドである他は、配列番号９と同じ配列である。また、Ｖａｌ１９２Ｔｙｒのチロシンは配列番号１３では１９２番目の位置に存在する。
The amino acid sequence of FcR9_Y, which is the Fc binding protein examined in this example, is shown in SEQ ID NO: 13, and the sequence of the polynucleotide encoding FcR9_Y is shown in SEQ ID NO: 14. SEQ ID NO: 13 corresponds to the amino acid sequence of glycine (Gly) at position 33 to glutamine (Gln) at
比較例１
形質転換体として、特開２０１６−１６９１９７号公報（特許文献２）で開示のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９（配列番号５）を発現する形質転換体を用いたこと以外は実施例２と同様に行なった。
Comparative Example 1
The same procedure as in Example 2 was carried out except that a transformant expressing the Fc binding protein FcR9 (SEQ ID NO: 5) disclosed in JP-A-2016-169197 (Patent Document 2) was used as a transformant. .
結果を表４に示す。培養液１ＬあたりのＦｃ結合性タンパク質の発現量は１．４ｍｇとなった。以上の結果から、ＦｃＲ９にＶａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２Ｔｙｒのいずれかのアミノ酸置換を導入したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体は、ＦｃＲ９を発現する形質転換体と比較し、発現量が大幅に向上していることがわかる。 The results are shown in Table 4. The amount of Fc binding protein expressed per liter of culture solution was 1.4 mg. From the above results, a transformant expressing an Fc binding protein in which any of amino acid substitutions of Val192Ile, Val192Ile, and Val192Tyr is introduced into FcR9 has a significantly improved expression level as compared to a transformant expressing FcR9. You can see that
比較例２
形質転換体として、ＦｃＲ９（配列番号５）の１９２番目（配列番号１では１７６番目）のアミノ酸残基をフェニルアラニン（以下、Ｖａｌ１９２Ｐｈｅとも表記）、アルギニン（以下、Ｖａｌ１９２Ａｒｇとも表記）、ロイシン（以下、Ｖａｌ１９２Ｌｅｕとも表記）、アスパラギン（以下、Ｖａｌ１９２Ａｓｎとも表記）、アスパラギン酸（以下、Ｖａｌ１９２Ａｓｐとも表記）、システイン（以下、Ｖａｌ１９２Ｃｙｓとも表記）、グルタミン（以下、Ｖａｌ１９２Ｇｌｎとも表記）、グルタミン酸（以下、Ｖａｌ１９２Ｇｌｕとも表記）、グリシン（以下、Ｖａｌ１９２Ｇｌｙとも表記）、ヒスチジン（以下、Ｖａｌ１９２Ｈｉｓとも表記）、リジン（以下、Ｖａｌ１９２Ｌｙｓとも表記）、メチオニン（以下、Ｖａｌ１９２Ｍｅｔとも表記）、プロリン（以下、Ｖａｌ１９２Ｐｒｏとも表記）、セリン（以下、Ｖａｌ１９２Ｓｅｒとも表記）、スレオニン（以下、Ｖａｌ１９２Ｔｈｒとも表記）またはトリプトファン（以下、Ｖａｌ１９２Ｔｒｐとも表記）に置換したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を用いたこと以外は実施例２と同様に行なった。
Comparative example 2
As a transformant, the 192nd (176th in SEQ ID NO: 1) amino acid residue of FcR9 (SEQ ID NO: 5) is phenylalanine (hereinafter also denoted as Val192Phe), arginine (hereinafter also denoted as Val192Arg), leucine (hereinafter, Val192Leu) Asparagine (hereinafter also referred to as Val192Asn), aspartic acid (hereinafter also referred to as Val192Asp), cysteine (hereinafter also referred to as Val192Cys), glutamine (hereinafter also referred to as Val192Gln), glutamic acid (hereinafter also referred to as Val192Glu), Glycine (hereinafter also referred to as Val192Gly), histidine (hereinafter referred to as Val192His), lysine (hereinafter also referred to as Val192Lys), methionine (hereinafter referred to as Val192Met) In addition, proline (hereinafter also referred to as Val192Pro), serine (hereinafter also referred to as Val192Ser), threonine (hereinafter also referred to as Val192Thr), or a trait that expresses an Fc binding protein substituted with tryptophan (hereinafter referred to as Val192Trp) It carried out like Example 2 except having used the transformant.
結果を表４に示す。いずれも培養液１ＬあたりのＦｃ結合性タンパク質の発現量はゼロまたは１ｍｇ未満であった。 The results are shown in Table 4. In all cases, the expression level of Fc binding protein per liter of culture solution was zero or less than 1 mg.
実施例３ Ｆｃ結合性タンパク質とＩｇＧ１との結合親和性評価
（１）実施例１で得た形質転換体のうち、ＦｃＲ９＿Ｉ（配列番号９）またはＦｃＲ＿Ａ（配列番号１１）を発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１００ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
Example 3 Evaluation of Binding Affinity between Fc Binding Protein and IgG1 (1) Among the transformants obtained in Example 1, a transformant expressing FcR9_I (SEQ ID NO: 9) or FcR_A (SEQ ID NO: 11) The preculture was carried out by inoculating 100 mL of 2YT liquid medium containing 50 μg / mL of kanamycin each and aerobically culturing at 37 ° C. overnight.
（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した１０００ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に前培養液を１０ｍＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。 (2) Inoculate 10 mL of the preculture liquid into 1000 mL of 2YT liquid medium (Peptone 16 g / L, yeast extract 10 g / L, sodium chloride 5 g / L) supplemented with 50 μg / mL kanamycin, and aerobically at 37 ° C Shake culture was performed.
（３）培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養した。その後、終濃度０．０１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養した。 (3) After 1.5 hours from the start of culture, the culture temperature was changed to 20 ° C., and shake culture was performed for 30 minutes. After that, IPTG was added to a final concentration of 0.01 mM, and aerobic culture was continued at 20 ° C. overnight.
（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で懸濁し、超音波破砕した。その後、遠心分離により上清を回収した。 (4) After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation, suspended in a buffer solution (20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 150 mM NaCl), and sonicated. Thereafter, the supernatant was recovered by centrifugation.
（５）回収した上清は、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）を充填したカラムに通液し、洗浄緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で十分量の洗浄を行なった後、溶出緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌと５００ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で溶出し、当該溶出画分を回収した。 (5) The collected supernatant is passed through a column packed with Ni Sepharose 6 Fast Flow (manufactured by GE Healthcare), and a washing buffer (20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 150 mM NaCl) After sufficient washing was performed, elution buffer was eluted with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 150 mM NaCl and 500 mM imidazole, and the eluted fraction was collected.
（６）（５）で回収した溶出画分を、ＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）を充填したカラムに通液し、洗浄緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で十分量の洗浄を行なった後、溶出緩衝液（１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ３．０））で溶出し、当該溶出画分を回収した。 (6) The eluted fraction collected in (5) is passed through a column packed with IgG Sepharose 6 Fast Flow (manufactured by GE Healthcare), and the washing buffer (20 mM Tris-HCl buffer (150 mM NaCl) After sufficient washing with pH 7.4)), elution was performed with elution buffer (100 mM glycine buffer (pH 3.0)), and the eluted fraction was collected.
（７）（６）の溶出画分として回収したＦｃ結合性タンパク質とＩｇＧ１との結合性評価を表面プラズモン共鳴法を用いて行なった。表面プラズモン共鳴法を用いた結合性の測定において、測定装置としてはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（ＧＥヘルスケア製）を、センサーチップとしてはＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥヘルスケア製）を、解析ソフトとしてはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケア製）を、それぞれ用いた。 (7) The evaluation of the binding between the Fc binding protein collected as the eluted fraction of (6) and IgG1 was performed using surface plasmon resonance. In the measurement of connectivity using surface plasmon resonance, Biacore T100 (manufactured by GE Healthcare) as a measuring device, Sensor Chip CM5 (manufactured by GE Healthcare) as a sensor chip, and Biacore T100 Evaluation Software as analysis software. (Manufactured by GE Healthcare) were used respectively.
（８）Ａｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア製）を用いてＦｃ結合性タンパク質を固定化したセンサーチップに対し、ＩｇＧ１（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）をＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥヘルスケア製）で希釈した溶液を流すことでセンサグラムを得た。当該センサグラムを基にカーブフィッティングを行なうことで、ＩｇＧ１に対する結合性を算出した。 (8) A solution obtained by diluting IgG1 (manufactured by SIGMA-ALDRICH) with HBS-EP (manufactured by GE Healthcare) with respect to a sensor chip on which Fc binding protein is immobilized using Amine Coupling Kit (manufactured by GE Healthcare) A sensorgram was obtained by flowing it. The binding to IgG1 was calculated by performing curve fitting based on the sensorgram.
ＩｇＧ１に対する親和性を算出した結果を表５に示す。なお表５において、ＫＤ値（解離定数）が低いほど、高いアフィニティ（親和性）を有している。ＦｃＲ９＿Ｉ（配列番号９）およびＦｃＲ９＿Ａ（配列番号１１）のＫＤ値は、それぞれ６．０×１０−８Ｍおよび３．６×１０−８Ｍとなった。 The results of calculating the affinity for IgG1 are shown in Table 5. In Table 5, the lower the K D value (dissociation constant), the higher the affinity (affinity). K D values of FcR9_I (SEQ ID NO: 9) and FcR9_A (SEQ ID NO: 11), respectively a 6.0 × 10 -8 M and 3.6 × 10 -8 M.
比較例３
形質転換体として、特開２０１６−１６９１９７号公報（特許文献２）で開示のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９（配列番号５）を発現する形質転換体を用いたこと以外は実施例３と同様に行なった。
Comparative example 3
The same procedure as in Example 3 was performed except that a transformant expressing the Fc binding protein FcR9 (SEQ ID NO: 5) disclosed in JP-A-2016-169197 (Patent Document 2) was used as a transformant. .
ＩｇＧ１に対する親和性を算出した結果を表５に示す。ＦｃＲ９のＫＤ値は７．７×１０−８Ｍであり、ＦｃＲ９＿Ｉ（配列番号９）およびＦｃＲ９＿Ａ（配列番号１１）と同等の親和性であった。このことから本発明のＦｃ結合性タンパク質の一態様である、ＦｃＲ９＿ＩおよびＦｃＲ９＿Ａは、ＦｃＲ９と同様、不溶性担体に固定化することで抗体医薬品製造における工程分析および分取のための抗体吸着剤として使用可能であることが示唆される。 The results of calculating the affinity for IgG1 are shown in Table 5. K D values of FcR9 is 7.7 × 10 -8 M, was comparable affinity and FcR9_I (SEQ ID NO: 9) and FcR9_A (SEQ ID NO: 11). From this, FcR9_I and FcR9_A, which is one aspect of the Fc binding protein of the present invention, is used as an antibody adsorbent for step analysis and separation in antibody drug manufacture by immobilizing it on an insoluble carrier like FcR9. It is suggested that it is possible.
比較例４
形質転換体として、ＦｃＲ９（配列番号５）の１９２番目（配列番号１では１７６番目）のバリンをフェニルアラニンに置換したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ＿Ｆ）を発現する形質転換体を用いたこと以外は実施例３と同様に行なった。
Comparative example 4
As a transformant, a transformant expressing an Fc binding protein (FcR_F) in which valine at position 192 (position 176 in SEQ ID NO: 1) of FcR9 (SEQ ID NO: 5) was substituted with phenylalanine was used. It carried out similarly to 3.
ＩｇＧ１に対する親和性を算出した結果を表５に示す。ＦｃＲ９＿ＦのＫＤ値は、３．３×１０−６Ｍとなり、本発明のＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ｉ（配列番号９９）およびＦｃＲ＿Ａ（配列番号１１）ならびにＦｃＲ９（配列番号５）と比較し、親和性が低いことを確認した。 The results of calculating the affinity for IgG1 are shown in Table 5. K D values of FcR9_F compares 3.3 × 10 -6 M becomes, FcR9_I (SEQ ID NO: 99) is a Fc binding proteins of the invention and FcR_A (SEQ ID NO: 11) and FcR9 (SEQ ID NO: 5), It confirmed that the affinity was low.
Claims (12)
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１９２番目のバリンがイソロイシン、アラニン、およびチロシンから選択されるいずれかにアミノ酸置換された、タンパク質；
（ｂ） 配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において少なくとも１９２番目のバリンがイソロイシン、アラニン、およびチロシンから選択されるいずれかにアミノ酸置換され、さらに１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、抗体結合活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において少なくとも１９２番目のバリンがイソロイシン、アラニン、およびチロシンから選択されるいずれかにアミノ酸置換されたアミノ酸配列に対して、９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、抗体結合活性を有するタンパク質。 The Fc binding protein described in the following (a), (b) or (c):
(A) At least amino acid residue from glycine 33 to glutamine at amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 provided that at least 192 valine at amino acid residue 33 to 208 is amino acid residue A protein which has been amino acid substituted with any one selected from isoleucine, alanine and tyrosine;
(B) an amino acid substitution of valine at least 192 in any of amino acid residues from glycine 33 to glutamine 208 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 with any one selected from isoleucine, alanine and tyrosine; Furthermore, a protein comprising an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion or addition of 1 to 10 amino acid residues, and having antibody binding activity;
(C) amino acid substitution of valine at least 192 in amino acid residue from glycine 33 to glutamine 208 in amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is selected from isoleucine, alanine and tyrosine A protein comprising an amino acid sequence having 90% or more homology to an amino acid sequence, and having antibody binding activity.
（ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１９２番目のバリンがイソロイシン、アラニン、およびチロシンから選択されるいずれかにアミノ酸置換された、タンパク質；
（ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において少なくとも１９２番目のバリンがイソロイシン、アラニン、およびチロシンから選択されるいずれかにアミノ酸置換され、さらに１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、抗体結合活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において少なくとも１９２番目のバリンがイソロイシン、アラニン、およびチロシンから選択されるいずれかにアミノ酸置換されたアミノ酸配列に対して、９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、抗体結合活性を有するタンパク質。 The Fc binding protein described in the following (a), (b) or (c):
(A) At least amino acid residue from glycine 33 to glutamine at amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 provided that at least 192 valine at amino acid residue 33 to 208 is amino acid residue A protein which has been amino acid substituted with any one selected from isoleucine, alanine and tyrosine;
(B) an amino acid substitution of valine at least 192 in any of amino acid residues from glycine 33 to glutamine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 with any one selected from isoleucine, alanine and tyrosine; Furthermore, a protein comprising an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion or addition of 1 to 10 amino acid residues, and having antibody binding activity;
(C) amino acid substitution of valine at least 192 in amino acid residue from glycine 33 to glutamine 208 in amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 is selected from isoleucine, alanine and tyrosine A protein comprising an amino acid sequence having 90% or more homology to an amino acid sequence, and having antibody binding activity.
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