JP2019068869A - Protease activity measurement method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、プロテアーゼ活性測定法に関する。 The present invention relates to a method for measuring protease activity.
プロテアーゼは、アミノ酸がペプチド結合によって鎖状に連結したペプチド（一般に100残基未満、比較的分子量が小さい）やタンパク質（一般に100残基以上、比較的分子量が大きい）のペプチド結合を加水分解する酵素である。様々な種類のものが、生理的役割として、栄養吸収、タンパク質の廃棄とリサイクル、生体防御、活性の調節、などの幅広い分野で働いている。プロテアーゼは、触媒機構により、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ（酸性プロテアーゼ）、金属プロテアーゼ、システインプロテアーゼなどに分類される。 Protease is an enzyme that hydrolyzes peptide bonds of peptides (generally less than 100 residues and relatively small molecular weight) and proteins (generally more than 100 residues and relatively large molecular weight) in which amino acids are linked in a chain by peptide bond It is. A variety of types are working in a wide range of physiological roles, such as nutrient absorption, protein disposal and recycling, bioprotection and regulation of activity. Proteases are classified into serine protease, aspartic protease (acid protease), metal protease, cysteine protease and the like according to the catalytic mechanism.
特定のプロテアーゼの活性変化の測定は、ある特定の病状の管理処置において有意義であると考えられる。例えば、セリンプロテーゼの活性変化は、ガン転移や血栓症、関節炎などの病状と関連付けられている。また、HIVやC型肝炎ウイルスなど、ウイルス感染症においては、その成熟過程でプロテアーゼの発現が必須である。ゆえにそれらの発現を簡便に検出することは、感染症対策に重要な役割を果たすこととなり、公衆衛生上価値がある。 The measurement of activity changes of specific proteases is considered to be significant in the management and treatment of certain medical conditions. For example, changes in the activity of serine prosthesis are associated with medical conditions such as cancer metastasis, thrombosis and arthritis. In addition, in viral infections such as HIV and hepatitis C virus, expression of protease is essential during its maturation process. Therefore, convenient detection of their expression plays an important role in infection control and is of public health value.
現在までにあるサンプルに含まれる特定のプロテアーゼを認識するため、抗体を用いたイムノアッセイ法、イムノブロッティング法（ウエスタンブロッティング法）、ELISA法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)などが知られている。これらの手法は抗体を用いるため、材料の調達が高価となる。また、ウイルス病由来のプロテアーゼ、特にHIVでは変異が高頻度で発生しており、抗体が認識しなくなる危険性がある。そこで、抗体を使用しないプロテアーゼ検出システムが開発されている。例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence resonance energy transfer：FRET）応用したプロテアーゼ検出プローブがある（特許第4966469号（特許文献１）、Protease Substrate Set, JPT Peptide Technologies GmbH）。これは、近接した2個の色素分子（または発色団）の間で励起エネルギーが、電磁波にならず電子の共鳴により直接移動する現象である。実際には、基質となるペプチドのN末端を蛍光ドナー物質で、C末端をアクセプター物質で標識する。アクセプター物質はクエンチャーと呼ばれる光を吸収する物質である。蛍光ドナー物質が励起されて発生した蛍光がエネルギー転移でアクセプター物質に吸収される。プロテアーゼを加えると蛍光ドナー物質とアクセプター物質が離れ、FRETが起こらないので蛍光ドナーより蛍光を検出できるようになる。本法はプロテアーゼの認識配列を任意に設計することができ、検出も容易に行うことが可能である。しかし、認識配列の立体配置の影響でプロテアーゼ未処理の状態でもバックグラウンドの原因となる蛍光を発してしまう場合がある。すなわち、プロテアーゼ認識配列と蛍光ドナー・アクセプターの位置関係を精密に計算した分子設計が必要になるため、検出プローブの開発・製造が容易ではない。また、蛍光物質ではなくレポータータンパク質の構造変化による手法もプロテアーゼ活性の検出に利用されている（特表2007-508014（非特許文献２））。本法は、レポータータンパク質であるルシフェラーゼの内部にプロテアーゼ認識配列を組み込みこんでおく。この状態のルシフェラーゼは発光能力が失われている。これにプロテアーゼを添加して、切断が生じた場合にルシフェラーゼの構造が元に戻ることにより発光能力を有するようになる。すなわち、この発光の有無がプロテアーゼ活性の存在を確認する指標となる。この方法も上記のFRETと同じくプロテアーゼ認識配列を自由にデザイン可能であるが、ルシフェラーゼの立体構造と認識配列により定常的な発光を有してしまう可能性やルシフェラーゼの形状復帰が予想通り行われない可能性もある。そのため、プロテアーゼ認識プローブの設計に高度な計算技術が必要であることもFRET法と同様である。また、タンパク質の分子が巨大であるため、再構成に時間がかかり、プロテアーゼによる切断とルシフェラーゼの再構成にタイムラグが生じやすい問題もあり、カイネティクス解析には不向きである。 In order to recognize a specific protease contained in a sample up to the present, an immunoassay method using an antibody, an immunoblotting method (Western blotting method), an ELISA method (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) and the like are known. Since these methods use antibodies, sourcing of materials is expensive. In addition, proteases derived from viral diseases, in particular HIV, mutations frequently occur, and there is a risk that antibodies will not be recognized. Therefore, a protease detection system that does not use an antibody has been developed. For example, there is a protease detection probe to which fluorescence resonance energy transfer (FRET) is applied (patent 4966469 (patent document 1), Protease Substrate Set, JPT Peptide Technologies GmbH). This is a phenomenon in which excitation energy is directly transferred by resonance of electrons instead of electromagnetic waves between two dye molecules (or chromophores) in close proximity. In practice, the N-terminus of the substrate peptide is labeled with a fluorescent donor substance and the C-terminus with an acceptor substance. The acceptor substance is a substance that absorbs light called a quencher. The fluorescence donor substance is excited and the generated fluorescence is absorbed by the acceptor substance by energy transfer. When protease is added, the fluorescent donor substance and the acceptor substance are separated, and fluorescence can be detected from the fluorescent donor because FRET does not occur. In this method, recognition sequences for protease can be designed arbitrarily, and detection can be easily performed. However, due to the influence of the configuration of the recognition sequence, fluorescence may be emitted which causes background even in the untreated state of the protease. That is, since it is necessary to design a molecule in which the positional relationship between the protease recognition sequence and the fluorescent donor / acceptor is precisely calculated, the development and manufacture of the detection probe are not easy. In addition, a technique based on structural change of the reporter protein rather than a fluorescent substance is also used for detection of protease activity (Japanese Patent Publication No. 2007-508014 (Non-patent Document 2)). In this method, a protease recognition sequence is incorporated into the reporter protein luciferase. The luciferase in this state has lost the ability to emit light. Protease is added to this, and when cleavage occurs, the structure of luciferase is restored so that it has luminescence ability. That is, the presence or absence of this light emission serves as an index for confirming the presence of the protease activity. Although this method can also design the protease recognition sequence freely like the above-mentioned FRET, the possibility of having steady luminescence due to the three-dimensional structure of the luciferase and the recognition sequence is not performed as expected, and the shape recovery of the luciferase is not performed as expected There is also the possibility. Therefore, it is similar to the FRET method that advanced computational techniques are required to design a protease recognition probe. In addition, since the protein molecule is large, it takes time to reconstitute, and there is a problem that a time lag is likely to occur between cleavage by protease and reconstitution of luciferase, which is unsuitable for kinetic analysis.
本発明は、従来の抗体を用いる方法よりも、工程が少なく、短い作業時間で生体サンプル中のプロテアーゼを検出・測定する方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for detecting and measuring a protease in a biological sample with less steps and shorter working time than methods using conventional antibodies.
また、本発明は、精密な分子設計を必要とせず、また、バックグラウンドの原因となる蛍光や発光が少なく、かつ、プロテアーゼによる切断とルシフェラーゼの再構成にタイムラグが生じやすいといった問題もないプロテアーゼ検出・測定法を提供することも目的とする。 In addition, the present invention does not require precise molecular design, and also has a problem that there is little fluorescence or luminescence that causes background, and that there is no problem that time lag is likely to occur between cleavage by protease and reconstitution of luciferase. -The purpose is to provide a measurement method.
発明者らは、これらの問題を解決すべく、鋭意努力した結果、レポータータンパク質由来の発光・発色・蛍光から、生体サンプル中のプロテアーゼ活性を測定する新たな方法を見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive efforts to solve these problems, the inventors have found a new method for measuring protease activity in a biological sample from luminescence, color development and fluorescence derived from a reporter protein, and completed the present invention. It reached.
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）プロテアーゼ認識配列を介してレポータータンパク質が固定された担体を用意する工程、担体にプロテアーゼを接触させる工程、プロテアーゼの作用により、プロテアーゼ認識配列が切断されて、担体から遊離したレポータータンパク質を回収する工程、回収したレポータータンパク質由来の発光、発色又は蛍光を測定する工程を含む、プロテアーゼ活性の測定方法。
（２）担体がアビジンをコーティングしたビーズであり、プロテアーゼ認識配列にビオチンが結合しており、レポータータンパク質がプロテアーゼ認識配列を介してビオチン・アビジン結合により担体に固定されている（１）記載の方法。
（３）担体が金属を固定化したカラム充填剤であり、プロテアーゼ認識配列にHis tagが結合しており、レポータータンパク質がプロテアーゼ認識配列を介してHis tag・金属結合により担体に固定されている（１）記載の方法。
（４）金属が、ニッケル、銅、亜鉛及びコバルトから成る群より選択される（３）記載の方法。
（５）担体がアビジンをコーティングしたプレート底面であり、プロテアーゼ認識配列にビオチンが結合しており、レポータータンパク質がプロテアーゼ認識配列を介してビオチン・アビジン結合により担体に固定されている（１）記載の方法。
（６）プロテアーゼ認識配列が、HIV-1のプロテアーゼ認識配列である（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）HIV-1のプロテアーゼ認識配列が、MA/CA、CA/p2、p2/NC、NC/p1、p1/p6gag、NC/TFP、TFP/p6pol、p6pol/PR、PR/RTp51、RT/RTp66、RTp66/INT及びNefから成る群より選択される配列である（６）記載の方法。
（８）レポータータンパク質がルシフェラーゼであり、レポータータンパク質由来の発光がルシフェラーゼとルシフェリンとの反応により生じる発光である（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）種類の異なるレポータータンパク質のそれぞれが種類の異なるプロテアーゼ認識配列のそれぞれを介して固定された担体を用意して、種類の異なるプロテアーゼのそれぞれの活性を測定する（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）プロテアーゼ認識配列を介してレポータータンパク質が固定された担体を含む、プロテアーゼ活性の測定キット。
（１１）プロテアーゼ認識配列を介してレポータータンパク質が固定された担体。
（１２）プロテアーゼ認識配列が結合したリポータータンパク質からなるプロテアーゼ活性測定用レポータータンパク質。
The gist of the present invention is as follows.
(1) preparing a carrier on which the reporter protein is immobilized through the protease recognition sequence, contacting the carrier with the protease, and cleaving the protease recognition sequence by the action of the protease to recover the reporter protein released from the carrier A method of measuring protease activity, comprising the steps of measuring luminescence, color development or fluorescence from the recovered reporter protein.
(2) The method according to (1), wherein the carrier is avidin-coated beads, biotin is bound to the protease recognition sequence, and the reporter protein is immobilized on the carrier by biotin-avidin bond via the protease recognition sequence .
(3) The carrier is a column packing material on which a metal is immobilized, His tag is bound to the protease recognition sequence, and the reporter protein is immobilized on the carrier by His tag · metal bond via the protease recognition sequence ( 1) The method described.
(4) The method according to (3), wherein the metal is selected from the group consisting of nickel, copper, zinc and cobalt.
(5) The carrier is a plate bottom coated with avidin, biotin is bound to the protease recognition sequence, and the reporter protein is immobilized on the carrier by biotin / avidin bond via the protease recognition sequence (1) Method.
(6) The method according to any one of (1) to (5), wherein the protease recognition sequence is an HIV-1 protease recognition sequence.
(7) The protease recognition sequence of HIV-1 is MA / CA, CA / p2, p2 / NC, NC / p1, p1 / p6 gag , NC / TFP, TFP / p6 pol , p6 pol / PR, PR / RTp51 The method according to (6), which is a sequence selected from the group consisting of: RT / RTp66, RTp66 / INT and Nef.
(8) The method according to any one of (1) to (7), wherein the reporter protein is luciferase, and the luminescence derived from the reporter protein is luminescence generated by the reaction of the luciferase and luciferin.
(9) Prepare a carrier on which each of different types of reporter proteins is immobilized via each of different types of protease recognition sequences, and measure the activity of each of the different types of proteases (1) to (8) The method described in either.
(10) A kit for measuring protease activity, which comprises a carrier on which a reporter protein is immobilized via a protease recognition sequence.
(11) A carrier on which a reporter protein is immobilized via a protease recognition sequence.
(12) A reporter protein for measuring protease activity comprising a reporter protein to which a protease recognition sequence is bound.
本発明により、従来の抗体を用いる方法よりも、工程が少なく、短い作業時間で生体サンプル中のプロテアーゼを検出・測定することができるようになった。 The present invention makes it possible to detect and measure a protease in a biological sample in fewer steps and in a shorter working time than the method using a conventional antibody.
また、本発明により、精密な分子設計を必要とせず、また、バックグラウンドの原因となる蛍光や発光が少なく、かつ、プロテアーゼによる切断とルシフェラーゼの再構成にタイムラグが生じないプロテアーゼの検出・測定が可能となった。 Furthermore, according to the present invention, there is no need for precise molecular design, and detection and measurement of protease that causes less background fluorescence such as fluorescence and luminescence, and does not cause a time lag between cleavage by protease and reconstitution of luciferase It has become possible.
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in more detail.
本発明は、プロテアーゼ認識配列を介してレポータータンパク質が固定された担体を用意する工程、担体にプロテアーゼを接触させる工程、プロテアーゼの作用により、プロテアーゼ認識配列が切断されて、担体から遊離したレポータータンパク質を回収する工程、回収したレポータータンパク質由来の発光、発色又は蛍光を測定する工程を含む、プロテアーゼ活性の測定方法を提供する。 The present invention comprises the steps of preparing a carrier on which a reporter protein is immobilized via a protease recognition sequence, contacting the carrier with a protease, and cleaving the protease recognition sequence by the action of the protease to release the reporter protein released from the carrier. A method of measuring protease activity is provided, which comprises the steps of recovering, and measuring luminescence, color development or fluorescence from the recovered reporter protein.
プロテアーゼ認識配列としては、HIV-1のプロテアーゼ認識配列、ヘルペスウイルスのプロテアーゼ認識配列、ポリオウイルスのプロテアーゼ認識配列、C型肝炎ウイルスのプロテアーゼ認識配列などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。 Examples of the protease recognition sequence include, but are not limited to, HIV-1 protease recognition sequence, herpes virus protease recognition sequence, polio virus protease recognition sequence, hepatitis C virus protease recognition sequence, etc. Do not mean.
HIV-1のプロテアーゼ認識配列としては、MA/CA、CA/p2、p2/NC、NC/p1、p1/p6gag、NC/TFP、TFP/p6pol、p6pol/PR、PR/RTp51、RT/RTp66、RTp66/INT、Nefなどを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。 HIV-1 protease recognition sequences include MA / CA, CA / p2, p2 / NC, NC / p1, p1 / p6 gag , NC / TFP, TFP / p6 pol , p6 pol / PR, PR / RT p51, RT Examples include / RTp66, RTp66 / INT, Nef, etc., but are not limited thereto.
MA/CA、CA/p2、p2/NC、NC/p1、p1/p6gag、NC/TFP、TFP/p6pol、p6pol/PR、PR/RTp51、RT/RTp66、RTp66/INT、Nefの配列と切断部位は下記の通りである。
MA/CA
Ser-Gln-Asn-Tyr / Pro-Ile-Val-Gln（配列番号１１）
NC/p1
Arg-Gln-Ala-Asn / Phe-Leu-Gly-Lys（配列番号１２）
p2/NC
Thr-Ala-Ile-Met / Met-Gln-Lys-Gly（配列番号１３）
または
Ser-Ala-Ile-Met / Met-Gln-Lys-Gly（配列番号１４）
p1/p6gag
Pro-Gly-Asn-Phe / Leu-Gln-Ser-Arg（配列番号１５）
NC/TFP
Arg-Gln-Ala-Asn / Phe-Leu-Arg-Glu（配列番号１６）
TFP/p6pol
Asn-Leu-Ala-Phe / Gln-Gln-Gly-Glu（配列番号１７）
または
Asn-Leu-Ala-Phe / Any-Gln-Gly-Glu（配列番号１８）
または
Asp-Leu-Ala-Phe / Leu-Gln-Gly-Lys（配列番号１９）
p6pol/PR
Ser-Phe-Ser-Phe / Pro-Gln-Ile-Thr（配列番号２０）
または
Ser-Phe-Any-Phe / Pro-Gln-Ile-Thr（配列番号２１）
または
Ser-Phe-Asn-Phe / Pro-Gln-Val-Thr（配列番号２２）
PR/RTp51
Thr-Leu-Asn-Phe / Pro-Ile-Ser-Pro（配列番号２３）
RT/RTp66
Ala-Glu-Thr-Phe / Tyr-Val-Asp-Gly（配列番号２４）
RTp66/INT
Arg-Lys-Val-Leu / Phe-Leu-Asp-Gly（配列番号２５）
Nef
Asp-Cys-Ala-Trp / Leu-Glu-Ala-Gln（配列番号２６）
または
Ala-Cys-Ala-Trp / Leu-Glu-Ala-Gln（配列番号２７）
CA/p2
Ala-Arg-Val-Leu / Ala-Glu-Ala-Met（配列番号２８）
ただし、記号は以下の意味を表す。
/ 切断部位
Ala アラニン
Arg アルギニン
Asn アスパラギン
Asp アスパラギン酸
Cys システイン
Gln グルタミン
Glu グルタミン酸
Gly グリシン
Ile イソロイシン
Leu ロイシン
Lys リシン
Met メチオニン
Phe フェニルアラニン
Pro プロリン
Ser セリン
Thr スレオニン
Trp トリプトファン
Tyr チロシン
Val バリン
Any すべてのアミノ酸
レポータータンパク質としては、甲虫ルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの発光、発色又は蛍光酵素などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
Sequence of MA / CA, CA / p2, p2 / NC, NC / p1, p1 / p6 gag , NC / TFP, TFP / p6 pol , p6 pol / PR, PR / RTp51, RT / RTp66, RTp66 / INT, Nef And the cleavage site is as follows.
MA / CA
Ser-Gln-Asn-Tyr / Pro-Ile-Val-Gln (SEQ ID NO: 11)
NC / p1
Arg-Gln-Ala-Asn / Phe-Leu-Gly-Lys (SEQ ID NO: 12)
p2 / NC
Thr-Ala-Ile-Met / Met-Gln-Lys-Gly (SEQ ID NO: 13)
Or
Ser-Ala-Ile-Met / Met-Gln-Lys-Gly (SEQ ID NO: 14)
p1 / p6 gag
Pro-Gly-Asn-Phe / Leu-Gln-Ser-Arg (SEQ ID NO: 15)
NC / TFP
Arg-Gln-Ala-Asn / Phe-Leu-Arg-Glu (SEQ ID NO: 16)
TFP / p6 pol
Asn-Leu-Ala-Phe / Gln-Gln-Gly-Glu (SEQ ID NO: 17)
Or
Asn-Leu-Ala-Phe / Any-Gln-Gly-Glu (SEQ ID NO: 18)
Or
Asp-Leu-Ala-Phe / Leu-Gln-Gly-Lys (SEQ ID NO: 19)
p6 pol / PR
Ser-Phe-Ser-Phe / Pro-Gln-Ile-Thr (SEQ ID NO: 20)
Or
Ser-Phe-Any-Phe / Pro-Gln-Ile-Thr (SEQ ID NO: 21)
Or
Ser-Phe-Asn-Phe / Pro-Gln-Val-Thr (SEQ ID NO: 22)
PR / RTp51
Thr-Leu-Asn-Phe / Pro-Ile-Ser-Pro (SEQ ID NO: 23)
RT / RTp66
Ala-Glu-Thr-Phe / Tyr-Val-Asp-Gly (SEQ ID NO: 24)
RTp66 / INT
Arg-Lys-Val-Leu / Phe-Leu-Asp-Gly (SEQ ID NO: 25)
Nef
Asp-Cys-Ala-Trp / Leu-Glu-Ala-Gln (SEQ ID NO: 26)
Or
Ala-Cys-Ala-Trp / Leu-Glu-Ala-Gln (SEQ ID NO: 27)
CA / p2
Ala-Arg-Val-Leu / Ala-Glu-Ala-Met (SEQ ID NO: 28)
However, the symbols have the following meanings.
/ Cleavage site
Ala alanine
Arg arginine
Asn asparagine
Asp aspartic acid
Cys Cysteine
Gln glutamine
Glu glutamate
Gly glycine
Ile isoleucine
Leu leucine
Lys ricin
Met methionine
Phe phenylalanine
Pro Proline
Ser serine
Thr Threonine
Trp tryptophan
Tyr tyrosine
Val valine
Any All amino acid Reporter proteins include beetle luciferase, sea pansy luciferase, Gaussia luciferase, chloramphenicol acetyltransferase (CAT), green fluorescent protein (GFP), luminescence such as peroxidase, alkaline phosphatase, chromogenic or fluorescent enzymes, etc. Can be exemplified, but not limited thereto.
ルシフェラーゼとしては、ルシフェラーゼ基質と反応して、発光を生ぜしめるルシフェラーゼであればよく、特に限定されるわけではないが、好ましくは、甲虫由来のホタル・ルシフェリン（すなわち、多複素式有機酸Ｄ−（−）−２−（６‘ヒドロキシ−２’−ベンゾチアゾリル）−△２−チアゾリン−４−カルボン酸）を発光基質とし、これを酸化触媒して光子を発する酵素で、ホタル科、ヒカリコメツキ科、ホタルモドキ科、イリオモテボタル科など発光甲虫由来で発光反応に与る酵素全てを含む。この中には組換えDNA技術や変異技術などにより、酵素タンパク自体の安定性（耐熱性も含む）や発光特性などが人為的に改変された酵素も含まれる。耐熱性の向上したルシフェラーゼとしては、特表平09-510610、特表2008-244507、特開2000-197487等で示されているルシフェラーゼなどが知られており、これらを用いてもよい。 The luciferase is not particularly limited as long as it is a luciferase capable of causing luminescence in reaction with a luciferase substrate, but preferably firefly luciferin derived from beetles (ie, multi-complex organic acid D- ( An enzyme that emits a photon by catalyzing the oxidation substrate by using-)-2- (6'hydroxy-2'-benzothiazolyl) -Δ2-thiazoline-4-carboxylic acid) as a light-emitting substrate. It includes all enzymes involved in the light emission reaction that are derived from light-emitting beetles such as the firefly family, Iriomotefly family. These include enzymes in which the stability (including heat resistance) of the enzyme protein itself and the luminescence characteristics are artificially modified by recombinant DNA technology, mutation technology and the like. As luciferases having improved heat resistance, luciferases described in JP-A-09-510610, JP-A-2008-244507, JP-A-2000-197487 and the like are known, and these may be used.
レポータータンパク質が、ルシフェラーゼである場合、レポータータンパク質由来の発光として、ルシフェラーゼとルシフェリンとの反応により生じる発光を測定することができる。ルシフェラーゼとルシフェリンとの反応により生じる発光は、市販のルシフェリン／ルシフェラーゼ発光試薬（LL発光試薬）を用いて発光させ、その発光をルミノメーターで測定することにより行うことができる。 When the reporter protein is a luciferase, the luminescence generated by the reaction of luciferase and luciferin can be measured as luminescence derived from the reporter protein. Luminescence generated by the reaction of luciferase and luciferin can be performed by causing luminescence using a commercially available luciferin / luciferase luminescence reagent (LL luminescence reagent) and measuring the luminescence with a luminometer.
担体としては、ビーズ、カラム充填剤、プレートなどを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。 The carrier may be exemplified by beads, column packing agents, plates and the like, but is not limited thereto.
ビーズは、平均粒子径が 50-150umで、1-10％ 高度架橋アガロースであるとよい。 The beads should have an average particle size of 50-150 um and 1-10% highly cross-linked agarose.
担体として用いられるビーズは、磁気ビーズであってもよい。磁気ビーズは、磁気により分離することができるので、便利である。 The beads used as a carrier may be magnetic beads. Magnetic beads are convenient because they can be separated magnetically.
ビーズは、カラム充填剤として用いてもよい。 Beads may be used as column packings.
プレートとしては、マイクロタイタープレートを利用できる。マイクロタイタープレートは、一般的に販売されているものを使用できる。ウェルの数には6、24、96、384などがあり、いずれの数でも対応可能である。材質としてはアクリル樹脂・ポリエチレン・ポリプロピレン・ポリスチレン・ガラス製などいずれも使用できる。 As a plate, a microtiter plate can be used. The microtiter plate may be one commonly marketed. The number of wells includes 6, 24, 96, 384, etc., and any number can be used. As a material, any of acrylic resin, polyethylene, polypropylene, polystyrene, glass and the like can be used.
担体は、プロテアーゼ認識配列を介してレポータータンパク質を固定できる表面を有しているとよい。プロテアーゼ認識配列を介してレポータータンパク質を担体に固定するには、ビオチン・アビジン結合、His-tag Ni結合などを利用するとよい。 The carrier may have a surface on which the reporter protein can be immobilized via the protease recognition sequence. In order to immobilize a reporter protein on a carrier via a protease recognition sequence, biotin-avidin binding, His-tag Ni binding or the like may be used.
例えば、担体（例えば、ビーズ、プレート）表面にアビジンをコーティングし、プロテアーゼ認識配列にビオチンを結合しておけば、ビオチン・アビジン結合により、プロテアーゼ認識配列を介してレポータータンパク質を担体に固定することができる。 For example, if avidin is coated on the surface of a carrier (for example, a bead, a plate) and biotin is bound to a protease recognition sequence, immobilization of a reporter protein to the carrier via the protease recognition sequence by biotin-avidin binding is possible. it can.
プロテアーゼ認識配列にビオチンを結合させるには、プロテアーゼ認識配列にビオチン結合配列（配列の例示、Leu-Glu-Ala-Met-Lys-Met-Glu-Thr-Glu-Ile（配列番号２９）（5番目のリジンの部位にビオチンがタンパク質を発現させる宿主により付加される））を付加するとよい。 In order to attach biotin to a protease recognition sequence, a biotin binding sequence (exemplary sequence, Leu-Glu-Ala-Met-Lys-Met-Glu-Thr-Glu-Ile (SEQ ID NO: 29) (SEQ ID NO: 29) (a fifth sequence) The biotin may be added by the host expressing the protein) at the site of lysine of
また、担体（例えば、カラム充填剤）表面に金属を固定化し、プロテアーゼ認識配列にHis tagを付加しておけば、His tag・金属結合により、プロテアーゼ認識配列を介してレポータータンパク質を担体に固定することができる。金属としては、ニッケル、銅、亜鉛、コバルトなどを挙げることができる。 In addition, if a metal is immobilized on the surface of a carrier (eg, column packing) and a His tag is added to the protease recognition sequence, the reporter protein is immobilized on the carrier via the protease recognition sequence by His tag · metal bond. be able to. Examples of the metal include nickel, copper, zinc, cobalt and the like.
さらに、レポータータンパク質には、His tagを付加してもよい。これにより、レポータータンパク質をNi結合リガンド充填カラムで精製することが可能となる。 Furthermore, a His tag may be added to the reporter protein. This allows the reporter protein to be purified on a Ni-bound ligand packed column.
プロテアーゼ認識配列を介してレポータータンパク質を担体に固定するには、上述のように、プロテアーゼ認識配列にビオチン結合配列又はHis tag配列を付加させるとよく、これらの配列を付加したプロテアーゼ認識配列を結合したレポータータンパク質（後述の実施例では、「プロテアーゼ認識プローブタンパク質」と記す）を遺伝子工学的手法で作製し、このプロテアーゼ認識プローブタンパク質を担体に固定するとよい。プロテアーゼ認識プローブタンパク質において、ビオチン結合配列又はHis tag配列がプロテアーゼ認識配列のN末端側に付加される場合には、レポータータンパク質はプロテアーゼ認識配列のC末端側に結合させるとよく、逆に、ビオチン結合配列又はHis tag配列がプロテアーゼ認識配列のC末端側に付加される場合には、レポータータンパク質はプロテアーゼ認識配列のN末端側に結合させるとよい。プロテアーゼ認識プローブタンパク質を遺伝子工学的手法で作製する際には、ベクターを使用することになるので、そのベクターに由来する配列をプロテアーゼ認識プローブタンパク質中に含んでもよい。 In order to immobilize the reporter protein on the carrier via the protease recognition sequence, as described above, a biotin binding sequence or His tag sequence may be added to the protease recognition sequence, and the protease recognition sequence having these sequences added is linked. A reporter protein (referred to as a "protease recognition probe protein" in the following examples) may be produced by genetic engineering techniques, and this protease recognition probe protein may be immobilized on a carrier. In the protease recognition probe protein, when a biotin binding sequence or His tag sequence is added to the N-terminal side of the protease recognition sequence, the reporter protein may be bound to the C-terminal side of the protease recognition sequence; If the sequence or His tag sequence is added to the C-terminal side of the protease recognition sequence, the reporter protein may be linked to the N-terminal side of the protease recognition sequence. Since a vector will be used when producing a protease recognition probe protein by genetic engineering techniques, sequences derived from the vector may be included in the protease recognition probe protein.
本発明の方法において、プロテアーゼ認識配列を介してレポータータンパク質が固定された担体にプロテアーゼを接触させると、プロテアーゼの作用により、プロテアーゼ認識配列が切断されて、担体からレポータータンパク質が遊離する。遊離したレポータータンパク質を回収し、回収したレポータータンパク質由来の発光、発色又は蛍光を測定することにより、プロテアーゼ活性を測定することができる。 In the method of the present invention, when the protease is brought into contact with the carrier to which the reporter protein is immobilized via the protease recognition sequence, the protease recognition sequence is cleaved by the action of the protease to release the reporter protein from the carrier. The protease activity can be measured by collecting the released reporter protein and measuring the luminescence, color development or fluorescence from the collected reporter protein.
担体がビーズである場合、溶液中で担体とプロテアーゼを接触させるとよい。プロテアーゼの作用により、プロテアーゼ認識配列が切断され、担体から遊離したレポータータンパク質は、遠心分離により担体を沈殿させ、その上清から回収することができる。担体が磁気ビーズであれば、遠心分離ではなく、磁気により担体を沈殿させることができ、その上清から遊離レポータータンパク質を回収することができる。 When the carrier is a bead, the protease may be contacted with the carrier in a solution. The protease recognition sequence is cleaved by the action of the protease, and the reporter protein released from the carrier can be collected from the supernatant by precipitating the carrier by centrifugation. If the carrier is magnetic beads, the carrier can be precipitated by magnetism rather than centrifugation, and the free reporter protein can be recovered from the supernatant.
担体がカラム充填剤である場合、カラムにプロテアーゼを含む溶液を流せば、プロテアーゼの作用により、プロテアーゼ認識配列が切断され、担体から遊離したレポータータンパク質が流出してくるので、流出液を採取すれば、遊離レポータータンパク質を回収することができる。 When the carrier is a column packing material, if a solution containing protease is run on the column, the protease recognition sequence is cleaved by the action of the protease, and the reporter protein released from the carrier flows out. , Free reporter protein can be recovered.
担体にプロテアーゼを接触させるときの条件は、20〜40℃の温度、好ましくは、25〜30℃の温度、pH2〜8で反応させるとよい。HIV-1プロテアーゼの最適pHは2〜5である。 The conditions for contacting the carrier with the protease may be reaction at a temperature of 20 to 40 ° C., preferably 25 to 30 ° C., and pH 2 to 8. The pH optimum of HIV-1 protease is 2-5.
回収したレポータータンパク質由来の発光、発色又は蛍光は、常法により測定することができる。例えば、レポータータンパク質がルシフェラーゼであれば、市販のルシフェリン／ルシフェラーゼ発光試薬（LL発光試薬）を用いて発光させ、その発光をルミノメーターで測定すればよい。 Luminescence, color development or fluorescence derived from the collected reporter protein can be measured by a conventional method. For example, if the reporter protein is a luciferase, light may be emitted using a commercially available luciferin / luciferase luminescent reagent (LL luminescent reagent), and the luminescence may be measured by a luminometer.
また、発光タンパク質がウミシイタケルシフェラーゼであれば、1mg/mlのセレンテラジンを含む溶液を回収した溶液に加えて発光させ、その発光をルミノメータで測定する。 If the photoprotein is sea pansy luciferase, a solution containing 1 mg / ml coelenterazine is added to the collected solution to cause light emission, and the light emission is measured with a luminometer.
レポータータンパク質としてペルオキシダーゼを用いる場合は発光・発色両方の測定方法が可能となる。すなわち、ペルオキシダーゼは過酸化水素の酸素原子を賦活して基質を酸化する酵素であるため、この酵素反応の原理を利用して，基質に酸化されると発光または発色する色素を用いてその酵素量の定量を行える。発光の場合はルミノメータで、発色の場合は特定の波長を吸収する色素の性質を利用して吸光度分析計で色素濃度の定量を行う。 When peroxidase is used as the reporter protein, both light emission and color development can be measured. That is, since peroxidase is an enzyme that activates the oxygen atom of hydrogen peroxide to oxidize a substrate, the principle of this enzyme reaction is used to measure the amount of the enzyme using a dye that emits or develops color when oxidized to the substrate Can be quantified. In the case of light emission, a luminometer is used, and in the case of color development, the dye concentration is quantified by an absorbance analyzer using the property of the dye that absorbs a specific wavelength.
蛍光タンパク質をレポータータンパク質とした場合、プロテアーゼ反応の切断反応により遊離したタンパク質の蛍光の測定は、励起光の照射と蛍光の測定を同時に行う機器を使用する。具体的には、蛍光分光光度計やマイクロプレートリーダーなどである。 When a fluorescent protein is used as a reporter protein, the measurement of the fluorescence of the protein liberated by the cleavage reaction of the protease reaction uses an instrument which simultaneously performs the irradiation of the excitation light and the measurement of the fluorescence. Specifically, it is a fluorescence spectrophotometer or a microplate reader.
検出された発光、発色又は蛍光がプロテアーゼの切断により生じたものであるかどうかを検証するために、プロテアーゼ反応中にプロテアーゼインヒビターを添加した試験区を設定するとよい。血液などの生体サンプルから発光、発色又は蛍光が検出されても、同じ生体サンプルにプロテアーゼインヒビターを添加した試験区で発光、発色又は蛍光が検出されなければ、検出された発光、発色又は蛍光がプロテアーゼの切断により生じたものであると言えるが、同じ生体サンプルにプロテアーゼインヒビターを添加した試験区でも発光、発色又は蛍光が検出されれば、検出された発光、発色又は蛍光がプロテアーゼの切断により生じたものであるとは言えない。 In order to verify whether the detected luminescence, color development or fluorescence is caused by the cleavage of the protease, it is preferable to set a test zone to which a protease inhibitor is added during the protease reaction. Even if luminescence, color development or fluorescence is detected from a biological sample such as blood, if luminescence, color development or fluorescence is not detected in a test section where a protease inhibitor is added to the same biological sample, the detected luminescence, color development or fluorescence is a protease However, if luminescence, color development or fluorescence is detected even in the test section where a protease inhibitor is added to the same biological sample, the detected luminescence, color development or fluorescence is produced by cleavage of the protease. It can not be said that it is a thing.
本発明において、担体に固定するレポータータンパク質及びプロテアーゼ認識配列はそれぞれ１種類に限定されることはなく、複数種類であってもよい。すなわち、種類の異なるレポータータンパク質のそれぞれが種類の異なるプロテアーゼ認識配列のそれぞれを介して固定された担体を用意して、種類の異なるプロテアーゼのそれぞれの活性を測定してもよい。例えば、図１０の（例１）に示すように、HIVプロテアーゼ認識配列を介してホタルルシフェラーゼを固定した担体と、C型肝炎ウイルス認識配列を介してレニーラルシフェラーゼを固定した担体を一つの測定系に用意して、複数ウイルスを同時測定する。あるいは、図１０の（例２）に示すように、HIVプロテアーゼ認識配列を介して緑光ルシフェラーゼを固定した担体と、C型肝炎ウイルス認識配列を介して赤光ルシフェラーゼを固定した担体を一つの測定系に用意して、複数ウイルスを同時測定する。 In the present invention, each of the reporter protein and the protease recognition sequence immobilized on the carrier is not limited to one type, and may be a plurality of types. That is, a carrier may be prepared in which each of the different types of reporter proteins is immobilized via each of the different types of protease recognition sequences, and the activity of each of the different types of protease may be measured. For example, as shown in FIG. 10 (Example 1), one measurement system is a carrier on which the firefly luciferase is immobilized via the HIV protease recognition sequence and a carrier on which the Renilla luciferase is immobilized via the hepatitis C virus recognition sequence. Prepare for and measure multiple viruses simultaneously. Alternatively, as shown in FIG. 10 (Example 2), one measurement system comprising a carrier on which the green light luciferase is immobilized via the HIV protease recognition sequence and a carrier on which the red light luciferase is immobilized via the hepatitis C virus recognition sequence Prepare for and measure multiple viruses simultaneously.
また、本発明は、プロテアーゼ認識配列を介してレポータータンパク質が固定された担体を含む、プロテアーゼ活性の測定キットを提供する。プロテアーゼ認識配列を介してレポータータンパク質が固定された担体については上述した。 In addition, the present invention provides a kit for measuring protease activity, which comprises a carrier on which a reporter protein is immobilized via a protease recognition sequence. The carrier on which the reporter protein is immobilized via the protease recognition sequence has been described above.
本発明の測定キットには、さらに、プロテアーゼ標準試薬、プロテアーゼインヒビター、レポータータンパク質を発光させるための試薬（例えば、ルシフェリン/ルシフェラーゼ発光試薬）、試薬溶解液（例えば、発光試薬溶解液、発光、発色又は蛍光量とプロテアーゼ量を対応づける検量線、取扱い説明書、数値結果より陰性・陽性を判断するソフトウエアなどを含めてもよい。 The assay kit of the present invention further comprises a protease standard reagent, a protease inhibitor, a reagent for causing the reporter protein to emit light (eg, luciferin / luciferase luminescent reagent), a reagent solution (eg, a luminescent reagent solution, luminescence, color development or A calibration curve that associates the amount of fluorescence with the amount of protease may be included, instruction manuals, software that determines negative / positive based on numerical results, and the like.
本発明のプロテアーゼ活性の測定方法及び測定キットは、プロテアーゼを産生する微生物（ウイルスも含む）の検出、定量などに利用することができる。 The method and kit for measuring a protease activity of the present invention can be used for detection, quantification and the like of a microorganism (including a virus) that produces a protease.
さらに、本発明は、プロテアーゼ認識配列を介してレポータータンパク質が固定された担体を提供する。プロテアーゼ認識配列を介してレポータータンパク質が固定された担体については上述した。プロテアーゼ認識配列を介してレポータータンパク質が固定された担体は、プロテアーゼを産生する微生物（ウイルスも含む）の検出、定量などに利用することができる。 Furthermore, the present invention provides a carrier on which a reporter protein is immobilized via a protease recognition sequence. The carrier on which the reporter protein is immobilized via the protease recognition sequence has been described above. The carrier on which the reporter protein is immobilized via the protease recognition sequence can be used for detection, quantification and the like of protease-producing microorganisms (including viruses).
さらにまた、本発明は、プロテアーゼ認識配列が結合したリポータータンパク質からなるプロテアーゼ活性測定用レポータータンパク質を提供する。上述のように、プロテアーゼ認識配列にはビオチン結合配列又はHis tag配列を付加させるとよく、これらの配列を付加したプロテアーゼ認識配列を結合したレポータータンパク質（プロテアーゼ認識プローブタンパク質）を遺伝子工学的手法で作製し、このプロテアーゼ認識プローブタンパク質を担体に固定すれば（上述）、この担体を用いて、プロテアーゼを産生する微生物（ウイルスも含む）の検出、定量などを行うことができる。 Furthermore, the present invention provides a reporter protein for measuring protease activity, which comprises a reporter protein to which a protease recognition sequence is bound. As described above, it is preferable to add a biotin binding sequence or His tag sequence to the protease recognition sequence, and create a reporter protein (protease recognition probe protein) linked to the protease recognition sequence to which these sequences are added by genetic engineering techniques If this protease recognition probe protein is immobilized on a carrier (described above), this carrier can be used to detect, quantify, etc., a microorganism (including a virus) that produces a protease.
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕プロテアーゼ活性検出方法１
実験方法
ａ）プロテアーゼベクターの構築（ビオチン・アビジン結合系）（図４）
本発明による、アビジン・ビオチンの結合能力による担体への固定を利用した、プロテアーゼ活性測定用レポータータンパク質発現ベクターを構築した。プロテアーゼ認識配列は、Turbo 3C プロテアーゼ認識配列、またはHIV-1のMA-CA配列もしくはNc/p1配列を採用した。まず、Trbo3cプロテアーゼはLeu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro（配列番号３０）を認識配列として6番目と7番目の間を切断する酵素であり、His-tagやGST tagを利用したタンパク質精製システムに採用されている。また、MA-CA配列はSer-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln（配列番号１１）であり、Nc/p1配列はArg-Gln-Ala-Asn-Phe-Leu-Gly-Lys（配列番号１２）である。これらは、HIV-１が未成熟なウイルス粒子として出芽後に、自身が有する HIV-１プロテアーゼがウイルス粒子内の前駆体タンパク質 Pr５５ gag -pol をプロセシングすることにより感染性を有する成熟したウイルスとなるときの、HIV-1プロテアーゼに認識され切断される配列である[de Oliveira T et al. Variability at HIV-1 Subtype C Protease Cleavage Sites: An Indication of Viral Fitness? Journal of Virology (2003), 77(17): 9422-30]。なお、切断箇所はいずれの配列も4番目と5番目の間に存在する。
Hereinafter, the present invention will be described in detail based on examples, but the present invention is not limited to these examples.
Example 1 Protease Activity Detection Method 1
Experimental Method a) Construction of Protease Vector (Biotin / avidin binding system) (FIG. 4)
According to the present invention, a reporter protein expression vector for measuring protease activity was constructed using immobilization to a carrier by the binding ability of avidin-biotin. The protease recognition sequence was Turbo 3C protease recognition sequence, or the MA-1 CA sequence or Nc / p1 sequence of HIV-1. First, Trbo3c protease is an enzyme that cleaves between the sixth and seventh positions using Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro (SEQ ID NO: 30) as a recognition sequence, and His-tag or GST tag is It is adopted in the protein purification system used. In addition, the MA-CA sequence is Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln (SEQ ID NO: 11), and the Nc / p1 sequence is Arg-Gln-Ala-Asn-Phe-Leu-Gly-Lys (SEQ ID NO: 12). These are when the HIV-1 protease, which it possesses, becomes an infectious mature virus by processing the precursor protein Pr55 gag-pol in the virus particle after budding as an immature virus particle. It is a sequence that is recognized and cleaved by HIV-1 protease [de Oliveira T et al. Variability at HIV-1 Subtype C Protease Cleavage Sites: An Indication of Viral Fitness? Journal of Virology (2003), 77 (17) 9422-30]. The cleavage site exists between the fourth and the fifth in any arrangement.
まず、プロテアーゼ認識配列をルシフェラーゼに付加するため、ルシフェラーゼの5'末端側にプロテアーゼ認識配列を発現する配列を含んだプライマーとルシフェラーゼのC末端を含むプライマーを合成し、PCRを行った。これによりアミノ酸配列Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln（配列番号１１）とルシフェラーゼが融合したタンパク質を発現する遺伝子断片が得られる。次に、得られた断片をPinPoint Xa Vector（プロメガ）に挿入した。このベクターは挿入した配列にビオチン結合ペプチドを付加する目的で設計されたものである。ビオチン結合配列はLeu-Glu-Ala-Met-Lys-Met-Glu-Thr-Glu-Ile（配列番号２９）のうち、5番目のリジンの部位にビオチンがタンパク質を発現させる宿主により付加される。本原理は文献により公知である[Chapman-Smith, A., and Cronan, J.E. Jr. (1999) J. Nutr. 129: 477S-484S.]。次に、得られたベクターより、ビオチン結合ペプチド・プロテアーゼ認識配列・ルシフェラーゼを含む断片をタンパク質発現ベクターに挿入するための断片を得るためにプライマーを合成し、PCRを行った。得られたPCRにより増幅されたDNA断片を、pTriEx3 Neoベクター（メルク）に挿入した。pTriEx-3ベクターは大腸菌・酵母・昆虫細胞・哺乳動物細胞のいずれにおいても目的とするタンパク質の大量発現を可能としている。 First, in order to add a protease recognition sequence to luciferase, a primer containing a sequence expressing a protease recognition sequence at the 5 'end of the luciferase and a primer containing the C-terminus of luciferase were synthesized, and PCR was performed. Thus, a gene fragment expressing a protein in which the amino acid sequence Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln (SEQ ID NO: 11) is fused to luciferase is obtained. Next, the obtained fragment was inserted into PinPoint Xa Vector (Promega). This vector is designed for the purpose of adding a biotin-binding peptide to the inserted sequence. The biotin-binding sequence is added by the host which expresses a protein at the site of lysine at position 5 of Leu-Glu-Ala-Met-Lys-Met-Glu-Thr-Glu-Ile (SEQ ID NO: 29). The principle is known from the literature [Chapman-Smith, A., and Cronan, J. E. Jr. (1999) J. Nutr. 129: 477 S-484 S.]. Next, primers were synthesized from the obtained vector to obtain a fragment for inserting a biotin-binding peptide / protease recognition sequence / fragment containing luciferase into a protein expression vector, and PCR was performed. The resulting PCR amplified DNA fragment was inserted into pTriEx3 Neo vector (Merck). The pTriEx-3 vector enables large-scale expression of the target protein in any of E. coli, yeast, insect cells and mammalian cells.
ｂ）プロテアーゼ活性測定用レポータータンパク質の発現と精製（ビオチン・アビジン結合系）
まず、ａ）で得られた発現ベクターが、目的とするタンパク質を発現しているかを確認した。すなわち、発現ベクターを大腸菌BL21 DE3 (pLysS)に常法により形質転換した。発現ベクターを保持する大腸菌は薬剤耐性（アンピシリン）を有する。この大腸菌をアンプ１ｍｇ・ｍｌを含むLB培地2.5 mlに植菌し、一夜培養した。次に、培養液100ulを新たに2.5 mlの培養液に移し、5時間程培養した。氷上に30 分インキュベートし、IPTGを終濃度 0.1 mMになるように加えた。その後、16℃4時間で培養した。培養液から簡易的に可溶性タンパク質を抽出するため、-80℃に30分間で凍結および37℃で急速解凍の操作を３回繰り返し、大腸菌破砕液を得た。この液を15000rmpで15分間遠心分離してその上清を可溶性タンパク質溶液とした。一部を分取し、SDS-PAGEを行い目的の位置でのバンドを確認することによりレポータータンパク質が大腸菌で正常に生成されているとした。
b) Expression and purification of reporter protein for measuring protease activity (biotin / avidin binding system)
First, it was confirmed whether the expression vector obtained in a) expresses the target protein. That is, the expression vector was transformed into E. coli BL21 DE3 (pLysS) by a conventional method. E. coli carrying the expression vector has drug resistance (ampicillin). The E. coli was inoculated into 2.5 ml of LB medium containing 1 mg · ml of amplifier and cultured overnight. Next, 100 ul of culture solution was newly transferred to 2.5 ml of culture solution and cultured for about 5 hours. The mixture was incubated on ice for 30 minutes, and IPTG was added to a final concentration of 0.1 mM. Thereafter, the cells were cultured at 16 ° C. for 4 hours. In order to simply extract soluble proteins from the culture broth, operations of freezing at -80 ° C for 30 minutes and rapid thawing at 37 ° C were repeated three times to obtain E. coli disrupted solution. This solution was centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes to make the supernatant a soluble protein solution. A portion was separated and subjected to SDS-PAGE to confirm the band at the desired position, whereby the reporter protein was considered to be normally produced in E. coli.
次に、純度が高いレポータータンパク質を大量に得るため、スケールアップおよびNiカラムによるタンパク質の精製を行った。まず、大腸菌を200 mlのスケールで培養し、OD600が0.5になったら氷上で30分静置した。IPTGを終濃度0.1 mMになるように加え、16℃で4時間培養した。 Next, scale-up and purification of the protein by Ni column were performed in order to obtain a large amount of highly pure reporter protein. First, E. coli was cultured at a scale of 200 ml and left on ice for 30 minutes when the OD600 reached 0.5. IPTG was added to a final concentration of 0.1 mM and cultured at 16 ° C. for 4 hours.
大腸菌を遠心分離にて回収し、得られた大腸菌ペレットを10 mlの冷PBSで２回洗浄した。次に、9 mlのsonication buffer [20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 500 mM NaCl、1mM EDTA、1mM PMSF]を加え、氷上で超音波処理した。-80℃に10分間入れ処理液を急速凍結た後、室温下でシャーベット状になった固形物を30秒間、超音波処理を行った。上記の凍結融解処理を3回繰り返した。続いて10% Triton X-100を1mlを添加して4℃で１時間振とうした。夾雑物を除去するため、12,000回転で10分間遠心分離し、上清液を精製に用いた。 E. coli was recovered by centrifugation, and the resulting E. coli pellet was washed twice with 10 ml of cold PBS. Next, 9 ml sonication buffer [20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF] was added and sonicated on ice. After placing the solution at −80 ° C. for 10 minutes for quick freezing, the sherbet solid was sonicated for 30 seconds at room temperature. The above-mentioned freeze-thaw treatment was repeated three times. Subsequently, 1 ml of 10% Triton X-100 was added and shaken at 4 ° C. for 1 hour. The mixture was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes to remove contaminants, and the supernatant was used for purification.
次に、本操作で得られた可溶性全タンパク質から、His-tagで標識されたタンパク質を特異的に精製した。精製にはHiTrap Chelating HP（GEヘルスケア）を用いた。まず、カラムに10ml容のシリンジを接続して5mlの超純水を流速１滴／秒で送液してカラム保存液を超純水に置換した。続いて0.5mlの0.1M硫酸ニッケル溶液を流速1滴／2秒で送液してニッケルイオンをリガンドに結合させた。5mlの超純水を流速1滴／秒で送液してリガンドに未結合のニッケルイオンを洗い流した。カラムを平衡化するため、結合バッファー（20mMリン酸ナトリウム、0.5M 塩化ナトリウム、10mMイミダゾール、pH7.4）10mlを流速1滴／秒で送液した。次に上清液を流速1滴／2秒で送液し、His-tagを含むタンパク質をリガンドに結合させた。きょうざつ物および目的物以外のタンパク質を除去するため、10mlの結合バッファーを流速1滴／秒で送液してカラムの洗浄を行った。次に、5mlの溶出バッファー[20mM リン酸ナトリウム、500mM Nacl、500mMイミダゾール（pH 7.4）を流速1滴／秒で送液し、溶出液を回収した。溶出液の280nmの吸光度を測定して目的タンパク質の濃度を算出し、収量を計算した。続いて、溶出バッファーをプロテアーゼの反応に適したバッファーに置換するため、限外ろ過によるタンパク質の濃縮およびPBSバッファー（2.68mM KCl、136.89mM NaCl、1.47mM KH2PO4、8.10mM Na2HPO4）で目的タンパク質を再溶解した。限外ろ過にはAmicon Ultra 30Kデバイスを使用した（メルク社）を使用た。溶出したサンプル500mlをamicon lutarに入れ、14,000回転で30分間遠心分離を行い、フィルター上にあるタンパク質を20ｍｌのPBSバッファーで再溶解し、高濃度プローブタンパク質溶液とした。 Next, His-tag-labeled proteins were specifically purified from the soluble total proteins obtained by this operation. HiTrap Chelating HP (GE Healthcare) was used for purification. First, a 10 ml syringe was connected to the column and 5 ml of ultrapure water was sent at a flow rate of 1 drop / sec to replace the column storage solution with ultrapure water. Subsequently, 0.5 ml of 0.1 M nickel sulfate solution was delivered at a flow rate of 1 drop / 2 seconds to bind the nickel ion to the ligand. 5 ml of ultrapure water was sent at a flow rate of 1 drop / sec to wash away unbound nickel ions from the ligand. To equilibrate the column, 10 ml of binding buffer (20 mM sodium phosphate, 0.5 M sodium chloride, 10 mM imidazole, pH 7.4) was delivered at a flow rate of 1 drop / sec. The supernatant fluid was then delivered at a flow rate of 1 drop / 2 seconds to bind the protein containing His-tag to the ligand. In order to remove impurities and proteins other than the target, 10 ml of binding buffer was sent at a flow rate of 1 drop / sec to wash the column. Next, 5 ml of elution buffer [20 mM sodium phosphate, 500 mM Nacl, 500 mM imidazole (pH 7.4) was delivered at a flow rate of 1 drop / sec, and the eluate was recovered. The absorbance at 280 nm of the eluate was measured to calculate the concentration of the target protein, and the yield was calculated. Subsequently, in order to replace the elution buffer with a buffer suitable for the reaction of protease, the protein is concentrated by ultrafiltration and the target protein is re-treated with PBS buffer (2.68 mM KCl, 136.89 mM NaCl, 1.47 mM KH2PO4, 8.10 mM Na2HPO4). It dissolved. An Amicon Ultra 30K device was used for ultrafiltration (Merck). 500 ml of the eluted sample was placed in an amicon lutar, centrifuged at 14,000 rpm for 30 minutes, and the protein on the filter was redissolved in 20 ml of PBS buffer to make a high concentration probe protein solution.
ｃ）プローブタンパク質の固定化（ビオチン・アビジン結合系）
プローブタンパク質と固相担体を結合させるため、以下の操作を行った。すなわち、上記で得られたプローブタンパク質溶液とストレプトアビジンが微粒子金属表面にコーティングされているマイクロビーズであるDyaabeads Myone Streptavidin T1（Invitrogen社）（以下、ストレプトアビジンコートビーズ）。ストレプトアビジンコートビーズが結合できるビオチン化タンパク質の上限は、ビーズ溶液100ul当たり20ugである。まず、ストレプトアビジンコートビーズの保存液をPBSバッファーに置換する。100ulのストレプトアビジンコートビーズ懸濁液をチューブに分取する。チューブの底面を磁気に接近させ、ビーズを沈殿させる。吸引により上清液を除去し、PBSバッファーを200ul添加して転倒混和してビーズを洗浄する。再びチューブ底面を磁気に近づけビーズを沈殿させ、バッファーを吸引除去する。この操作を３回繰り返す。次に、高濃度プローブタンパク質溶液をタンパク質量が20ugを超過しないようにストレプトアビジンコートビーズに添加する。マイクロチューブローテーターを用い、30分間室温で混合することによりビオチン化タンパク質をビーズに結合させる。その後、チューブ底面を磁気に近づけてビーズを沈殿させ、上清液を除去後、プロテアーゼ反応バッファー（50 mM Na acetate [pH 5.5], 1 M NaCl, 1 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA）100ulで再懸濁する。この懸濁液をプロテアーゼ認識プローブ溶液とした。
c) Immobilization of probe protein (biotin / avidin binding system)
In order to bind the probe protein and the solid support, the following operation was performed. That is, the microbeads Dyaabeads Myone Streptavidin T1 (Invitrogen) (hereinafter, streptavidin coated beads), which are microbeads in which the probe protein solution obtained above and streptavidin are coated on a fine particle metal surface. The upper limit of the biotinylated protein to which streptavidin-coated beads can bind is 20 ug per 100 ul of bead solution. First, the stock solution of streptavidin-coated beads is replaced with PBS buffer. Aliquot 100 ul of streptavidin-coated bead suspension into a tube. The bottom of the tube is brought close to magnetism and the beads are allowed to settle. The supernatant fluid is removed by aspiration, 200 ul of PBS buffer is added and mixed by inversion, and the beads are washed. The bottom of the tube is again brought close to magnetism to precipitate the beads and the buffer is aspirated off. Repeat this operation three times. Next, a high concentration probe protein solution is added to streptavidin coated beads so that the amount of protein does not exceed 20 ug. The biotinylated proteins are attached to the beads by mixing for 30 minutes at room temperature using a microtube rotator. Then, the bottom of the tube is brought close to magnetism to precipitate the beads, and after removing the supernatant, resuspend with 100 ul of protease reaction buffer (50 mM Na acetate [pH 5.5], 1 M NaCl, 1 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA). It becomes cloudy. This suspension was used as a protease recognition probe solution.
ｄ）プロテアーゼ活性の測定（ビオチン・アビジン結合系）
得られたプローブタンパク質が実際に特定のプロテアーゼの活性を測定可能であるかを検討した。Turbo 3C プロテアーゼ認識配列を有するプロテアーゼ認識プローブ溶液20ulへは1ユニットのTurbo 3Cプロテアーゼ、MA-CA配列またはNc/p1配列を有するプロテアーゼ認識プローブ溶液20ulへは１ユニットのHIV-1プロテアーゼ（ANASPEC社）を加え、15分間室温で反応させた。５分おきにタッピングしてプロテアーゼがよく混合するようにした。チューブ底面を磁気に近づけて磁気ビーズを沈殿させ、上清液を別チューブに回収した。回収した上清液にピッカジーンPGL-100を100ul添加し、ルミノメーターLV9800（ベルトールド社）で10秒間の発光量を測定した。また、検出された発光がプロテアーゼの切断により生じたものであるかどうかを検証するため、プロテアーゼ反応中にプロテアーゼインヒビターを同時に添加した試験区も設定した。
d) Measurement of protease activity (biotin / avidin binding system)
It was examined whether the obtained probe protein could actually measure the activity of a specific protease. One unit of Turbo 3C protease, One unit of HIV-1 protease to 20ul of protease recognition probe solution with MA-CA sequence or Nc / p1 sequence to 20ul of protease recognition probe solution having Turbo 3C protease recognition sequence (ANASPEC) Was added and allowed to react at room temperature for 15 minutes. The protease was mixed well by tapping every 5 minutes. The bottom of the tube was brought close to magnetism to precipitate magnetic beads, and the supernatant fluid was collected in another tube. 100 ul of PicaGene PGL-100 was added to the collected supernatant, and the luminescence amount was measured for 10 seconds with a luminometer LV 9800 (Berthold). Moreover, in order to verify whether the detected luminescence was generated by cleavage of the protease, a test zone was also set in which a protease inhibitor was simultaneously added during the protease reaction.
実験結果
結果を図５〜７に示す。
Experimental Results The results are shown in FIGS.
図５は、ルシフェラーゼの発光によるTurbo 3Cプロテアーゼの検出結果を示す。Protease(+)：Turbo 3C proteaseを1ユニット添加後、発光測定した結果。Protease(-)：Turbo 3C proteaseを添加せず。Protease(+)+Inhibitor：Turbo 3C protease 1ユニットおよびProtease Inhibitor Coktail（シグマ・アルドリッジ）を5ulを同時に添加後、発光測定した結果。 FIG. 5 shows the results of detection of Turbo 3C protease by luminescence of luciferase. Protease (+): Result of luminescence measurement after adding 1 unit of Turbo 3C protease. Protease (-): Without the addition of Turbo 3C protease. Protease (+) + Inhibitor: Result of luminescence measurement after simultaneously adding 5 ul of 1 unit of Turbo 3C protease and Protease Inhibitor Coktail (Sigma Aldridge).
Protease(+)試験区のみ発光が確認され、Protease(+)Inhibitor(+)試験区では発光がバックグラウンドレベルであった。Inhibitorはプロアーゼインヒビターで、Turbo3Cプロテアーゼの活性を特異的に阻害する。このため、検出された発光はプロテアーゼにより切断され遊離したルシフェラーゼ由来の発光である。 Luminescence was confirmed only in the Protease (+) test area, and the luminescence was at the background level in the Protease (+) Inhibitor (+) test area. Inhibitor is a proase inhibitor, which specifically inhibits the activity of Turbo3C protease. For this reason, the detected luminescence is luminescence from luciferase which has been cleaved and released by the protease.
図６は、ルシフェラーゼの発光によるHIV-1プロテアーゼの検出結果（MA/CA配列）の検出結果を示す。Protease(+)：HIV-1プロテアーゼを1ユニット添加後、発光測定した結果。Protease(-)：HIV-1プロテアーゼを添加せず。Protease+Inhibitor：HIV-1プロテアーゼ 1ユニットおよびProtease Inhibitor Coktail（シグマ・アルドリッジ）5ulを同時に添加後、発光測定した結果。 FIG. 6 shows the results of detection of HIV-1 protease (MA / CA sequence) by luminescence of luciferase. Protease (+): The result of luminescence measurement after adding 1 unit of HIV-1 protease. Protease (-): Without adding HIV-1 protease. Protease + Inhibitor: Result of luminescence measurement after simultaneously adding 1 unit of HIV-1 protease and 5 ul of Protease Inhibitor Coktail (Sigma Aldridge).
Protease(+)試験区のみ発光が確認され、Protease(+)Inhibitor(+)試験区では発光がバックグラウンドレベルであった。Inhibitorはプロアーゼインヒビターで、HIV-1プロテアーゼの活性を特異的に阻害する。このため、検出された発光はプロテアーゼにより切断され遊離したルシフェラーゼ由来の発光である。 Luminescence was confirmed only in the Protease (+) test area, and the luminescence was at the background level in the Protease (+) Inhibitor (+) test area. Inhibitor is a proase inhibitor that specifically inhibits the activity of HIV-1 protease. For this reason, the detected luminescence is luminescence from luciferase which has been cleaved and released by the protease.
図７は、ルシフェラーゼの発光によるHIV-1プロテアーゼの検出結果（NC/pl配列）の検出結果を示す。Protease(+)：HIV-1プロテアーゼを1ユニット添加後、発光測定。Protease(-)：HIV-1プロテアーゼを添加せず。Protease+Inhibitor：HIV-1プロテアーゼ 1ユニットおよびProtease Inhibitor Coktail（シグマ・アルドリッジ）5ulを同時に添加後、発光測定した結果。 FIG. 7 shows the results of detection of HIV-1 protease (NC / pl sequence) by luminescence of luciferase. Protease (+): luminescence measurement after adding 1 unit of HIV-1 protease. Protease (-): Without adding HIV-1 protease. Protease + Inhibitor: Result of luminescence measurement after simultaneously adding 1 unit of HIV-1 protease and 5 ul of Protease Inhibitor Coktail (Sigma Aldridge).
Protease(+)試験区のみ発光が確認され、Protease(+)Inhibitor(+)試験区では発光がバックグラウンドレベルであった。Inhibitorはプロアーゼインヒビターで、HIV-1プロテアーゼの活性を特異的に阻害する。このため、検出された発光はプロテアーゼにより切断され遊離したルシフェラーゼ由来の発光である。 Luminescence was confirmed only in the Protease (+) test area, and the luminescence was at the background level in the Protease (+) Inhibitor (+) test area. Inhibitor is a proase inhibitor that specifically inhibits the activity of HIV-1 protease. For this reason, the detected luminescence is luminescence from luciferase which has been cleaved and released by the protease.
〔実施例２〕プロテアーゼ活性検出方法２
実験方法
ｅ）プロテアーゼベクターの構築（His-tag Ni結合系）（図４）
アビジン−ビオチン結合系に依存しない、His-tagのみを結合部位とするプロテアーゼ検出系を検討した。まず、HIV-1プロテアーゼ認識配列であるMA/CA配列をルシフェラーゼに付加するため、ルシフェラーゼの5'末端側にプロテアーゼ認識配列を発現する配列を含んだプライマーとルシフェラーゼのC末端を含むプライマーを合成し、PCRを行った。これによりアミノ酸配列Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln（配列番号１１）とルシフェラーゼが融合したタンパク質を発現する遺伝子断片が得られる。得られたPCRにより増幅されたDNA断片を、pTriEx3 Neoベクター（メルク）に挿入した。pTriEx-3ベクターは大腸菌・酵母・昆虫細胞・哺乳動物細胞のいずれにおいても目的とするタンパク質の大量発現を可能としている。また、本ベクターは発現させるタンパク質のC末端にHis-tagを付加する。
Example 2 Protease Activity Detection Method 2
Experimental method e) Construction of protease vector (His-tag Ni binding system) (Fig. 4)
A protease detection system was investigated in which only the His-tag was the binding site, which did not depend on the avidin-biotin binding system. First, in order to add the MA / CA sequence, which is an HIV-1 protease recognition sequence, to luciferase, a primer containing a sequence expressing a protease recognition sequence at the 5 'end of the luciferase and a primer containing the C terminus of luciferase were synthesized. , PCR was performed. Thus, a gene fragment expressing a protein in which the amino acid sequence Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln (SEQ ID NO: 11) is fused to luciferase is obtained. The resulting PCR amplified DNA fragment was inserted into pTriEx3 Neo vector (Merck). The pTriEx-3 vector enables large-scale expression of the target protein in any of E. coli, yeast, insect cells and mammalian cells. In addition, this vector adds a His-tag to the C terminus of the protein to be expressed.
ｆ）プロテアーゼ活性測定用レポータータンパク質の発現と精製（His-tag Ni結合系）
まず、ｅ）で得られた発現ベクターが、目的とするタンパク質を発現しているかを確認した。すなわち、発現ベクターを大腸菌BL21 DE3 (pLysS)に常法により形質転換した。発現ベクターを保持する大腸菌は薬剤耐性（アンピシリン）を有する。この大腸菌をアンプ１ｍｇ・ｍｌを含むLB培地2.5 mlに植菌し、一夜培養した。次に、培養液100ulを新たに2.5 mlの培養液に移し、5時間程培養した。氷上に30 分インキュベートし、IPTGを終濃度 0.1 mMになるように加えた。その後、16℃4時間で培養した。培養液から簡易的に可溶性タンパク質を抽出するため、-80℃に30分間で凍結および37℃で急速解凍の操作を３回繰り返し、大腸菌破砕液を得た。この液を15000rmpで15分間遠心分離してその上清を可溶性タンパク質溶液とした。一部を分取し、SDS-PAGEを行い目的の位置でのバンドを確認することによりレポータータンパク質が大腸菌で正常に生成されているとした。
f) Expression and purification of reporter protein for measuring protease activity (His-tag Ni binding system)
First, it was confirmed whether the expression vector obtained in e) expresses the target protein. That is, the expression vector was transformed into E. coli BL21 DE3 (pLysS) by a conventional method. E. coli carrying the expression vector has drug resistance (ampicillin). The E. coli was inoculated into 2.5 ml of LB medium containing 1 mg · ml of amplifier and cultured overnight. Next, 100 ul of culture solution was newly transferred to 2.5 ml of culture solution and cultured for about 5 hours. The mixture was incubated on ice for 30 minutes, and IPTG was added to a final concentration of 0.1 mM. Thereafter, the cells were cultured at 16 ° C. for 4 hours. In order to simply extract soluble proteins from the culture broth, operations of freezing at -80 ° C for 30 minutes and rapid thawing at 37 ° C were repeated three times to obtain E. coli disrupted solution. This solution was centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes to make the supernatant a soluble protein solution. A portion was separated and subjected to SDS-PAGE to confirm the band at the desired position, whereby the reporter protein was considered to be normally produced in E. coli.
次に、純度が高いレポータータンパク質を大量に得るため、スケールアップおよびNiカラムによるタンパク質の精製を行った。まず、大腸菌を200 mlのスケールで培養し、OD600が0.5になったら氷上で30分静置した。IPTGを終濃度0.1 mMになるように加え、16℃で4時間培養した。 Next, scale-up and purification of the protein by Ni column were performed in order to obtain a large amount of highly pure reporter protein. First, E. coli was cultured at a scale of 200 ml and left on ice for 30 minutes when the OD600 reached 0.5. IPTG was added to a final concentration of 0.1 mM and cultured at 16 ° C. for 4 hours.
大腸菌を遠心分離にて回収し、得られた大腸菌ペレットを10 mlの冷PBSで２回洗浄した。次に、9 mlのsonication buffer [20 mM Tris-Cl (pH 8.0), 500 mM NaCl、1mM EDTA、1mM PMSF]を加え、氷上で超音波処理した。-80℃に10分間入れ処理液を急速凍結た後、室温下でシャーベット状になった固形物を30秒間、超音波処理を行った。上記の凍結融解処理を3回繰り返した。続いて10% Triton X-100を1mlを添加して4℃で１時間振とうした。夾雑物を除去するため、12,000回転で10分間遠心分離し、上清液を精製に用いた。 E. coli was recovered by centrifugation, and the resulting E. coli pellet was washed twice with 10 ml of cold PBS. Next, 9 ml sonication buffer [20 mM Tris-Cl (pH 8.0), 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF] was added and sonicated on ice. After placing the solution at −80 ° C. for 10 minutes for quick freezing, the sherbet solid was sonicated for 30 seconds at room temperature. The above-mentioned freeze-thaw treatment was repeated three times. Subsequently, 1 ml of 10% Triton X-100 was added and shaken at 4 ° C. for 1 hour. The mixture was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes to remove contaminants, and the supernatant was used for purification.
次に、本操作で得られた可溶性全タンパク質から、His-tagで標識されたタンパク質を特異的に精製した。精製にはHiTrap Chelating HP（GEヘルスケア）を用いた。まず、カラムに10ml容のシリンジを接続して5mlの超純水を流速１滴／秒で送液してカラム保存液を超純水に置換した。続いて0.5mlの0.1M硫酸ニッケル溶液を流速1滴／2秒で送液してニッケルイオンをリガンドに結合させた。5mlの超純水を流速1滴／秒で送液してリガンドに未結合のニッケルイオンを洗い流した。カラムを平衡化するため、結合バッファー（20mMリン酸ナトリウム、0.5M 塩化ナトリウム、10mMイミダゾール、pH7.4）10mlを流速1滴／秒で送液した。次に上清液を流速1滴／2秒で送液し、His-tagを含むタンパク質をリガンドに結合させた。きょうざつ物および目的物以外のタンパク質を除去するため、10mlの結合バッファーを流速1滴／秒で送液してカラムの洗浄を行った。次に、5mlの溶出バッファー[20mM リン酸ナトリウム、500mM NaCl、500mMイミダゾール（pH 7.4）を流速1滴／秒で送液し、溶出液を回収した。溶出液の280nmの吸光度を測定して目的タンパク質の濃度を算出し、収量を計算した。続いて、溶出バッファーをプロテアーゼの反応に適したバッファーに置換するため、限外ろ過によるタンパク質の濃縮およびPBSバッファー（2.68mM KCl、136.89mM NaCl、1.47mM KH2PO4、8.10mM Na2HPO4）で目的タンパク質を再溶解した。限外ろ過にはAmicon Ultra 30Kデバイスを使用した（メルク社）を使用した。溶出したサンプル500mlをamicon lutarに入れ、14,000回転で30分間遠心分離を行い、フィルター上にあるタンパク質を20ｍｌのPBSバッファーで再溶解し、高濃度プローブタンパク質溶液とした。 Next, His-tag-labeled proteins were specifically purified from the soluble total proteins obtained by this operation. HiTrap Chelating HP (GE Healthcare) was used for purification. First, a 10 ml syringe was connected to the column and 5 ml of ultrapure water was sent at a flow rate of 1 drop / sec to replace the column storage solution with ultrapure water. Subsequently, 0.5 ml of 0.1 M nickel sulfate solution was delivered at a flow rate of 1 drop / 2 seconds to bind the nickel ion to the ligand. 5 ml of ultrapure water was sent at a flow rate of 1 drop / sec to wash away unbound nickel ions from the ligand. To equilibrate the column, 10 ml of binding buffer (20 mM sodium phosphate, 0.5 M sodium chloride, 10 mM imidazole, pH 7.4) was delivered at a flow rate of 1 drop / sec. The supernatant fluid was then delivered at a flow rate of 1 drop / 2 seconds to bind the protein containing His-tag to the ligand. In order to remove impurities and proteins other than the target, 10 ml of binding buffer was sent at a flow rate of 1 drop / sec to wash the column. Next, 5 ml of elution buffer [20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, 500 mM imidazole (pH 7.4) was delivered at a flow rate of 1 drop / sec, and the eluate was recovered. The absorbance at 280 nm of the eluate was measured to calculate the concentration of the target protein, and the yield was calculated. Subsequently, in order to replace the elution buffer with a buffer suitable for the reaction of protease, the protein is concentrated by ultrafiltration and the target protein is re-treated with PBS buffer (2.68 mM KCl, 136.89 mM NaCl, 1.47 mM KH2PO4, 8.10 mM Na2HPO4). It dissolved. An Amicon Ultra 30K device was used for ultrafiltration (Merck). 500 ml of the eluted sample was placed in an amicon lutar, centrifuged at 14,000 rpm for 30 minutes, and the protein on the filter was redissolved in 20 ml of PBS buffer to make a high concentration probe protein solution.
ｇ）プローブタンパク質の固定化（His-tag Ni結合系）
プローブタンパク質と固相担体を結合させるため、以下の操作を行った。すなわち、上記で得られたプローブタンパク質溶液とアガロース中において、イミノ二酢酸によりニッケルイオンがキレートされているマイクロビーズであるメタルキレートアガロース（和光純薬）（以下、Niビーズ）を混合することにより、プローブタンパク質中のHis-tagとNiビーズのニッケルイオンとを結合させる。His-tagが付加されたタンパク質はアガロースビーズ溶液1mll当たり20mgである。まず、Niビーズの保存液をPBSバッファーに置換するため、100ulのNiビーズ溶液をチューブに分取した。チューブを静置して、ビーズを沈殿させる。注意深く上清を除去し、PBSバッファーを200ul添加して転倒混和してビーズを洗浄する。再びチューブを静置してビーズを沈殿させ、PBSバッファーを吸引除去する。この操作を３回繰り返す。次に、高濃度プローブタンパク質溶液を、タンパク質量が2mgを超過しないようにNiビーズに添加する。マイクロチューブローテーターを用い、30分間室温で混合することによりHis-tagラベルされたプローブタンパク質をNiビーズに結合させる。その後、チューブを静置してビーズを沈殿させ、上清を除去するし、プロテアーゼ反応バッファー（50 mM Na acetate [pH 5.5], 1 M NaCl, 1 mMdithiothreitol, 1 mM EDTA）100ulで再懸濁する。この懸濁液をプロテアーゼ認識プローブ溶液とした。
g) Immobilization of probe protein (His-tag Ni binding system)
In order to bind the probe protein and the solid support, the following operation was performed. That is, by mixing metal chelate agarose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (hereinafter, Ni beads)), which is microbeads in which nickel ions are chelated with iminodiacetic acid, in the probe protein solution obtained above and agarose. The His-tag in the probe protein is bound to the nickel ion of Ni beads. The protein to which the His-tag has been added is 20 mg per ml of agarose bead solution. First, in order to replace the stock solution of Ni beads with PBS buffer, 100 ul of Ni beads solution was aliquoted into a tube. Allow the tube to settle and allow the beads to settle. Carefully remove the supernatant, add 200 ul PBS buffer and invert mix to wash the beads. Let the tube sit again to precipitate the beads and aspirate the PBS buffer. Repeat this operation three times. Next, a high concentration probe protein solution is added to the Ni beads so that the amount of protein does not exceed 2 mg. The His-tagged probe protein is bound to the Ni beads by mixing for 30 minutes at room temperature using a microtube rotator. Then, let the tube stand to precipitate beads, remove the supernatant, and resuspend in 100 ul of protease reaction buffer (50 mM Na acetate [pH 5.5], 1 M NaCl, 1 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA) . This suspension was used as a protease recognition probe solution.
ｈ）プロテアーゼ活性の測定（His-tag Ni結合系）
得られたプローブタンパク質が実際に特定のプロテアーゼの活性を測定可能であるかを検討した。MA-CA配列を有するプロテアーゼ認識プローブ溶液20ulに１ユニットのHIV-1プロテアーゼ（ANASPEC社）を加え、15分間室温で反応させた。５分おきにタッピングしてプロテアーゼがよく混合するようにした。その後、チューブを軽く遠心することによりビーズを沈殿させ、上清液を別チューブに回収した。回収した上清液にピッカジーンPGL-100を100ul添加し、ルミノメーターLV9800（ベルトールド社）で10秒間の発光量を測定した。また、検出された発光がプロテアーゼの切断により生じたものであるかどうかを検証するため、プロテアーゼ反応中にプロテアーゼインヒビターを同時に添加した試験区も設定した。
h) Measurement of protease activity (His-tag Ni binding system)
It was examined whether the obtained probe protein could actually measure the activity of a specific protease. One unit of HIV-1 protease (ANASPEC) was added to 20 ul of a protease recognition probe solution having MA-CA sequence, and allowed to react at room temperature for 15 minutes. The protease was mixed well by tapping every 5 minutes. Thereafter, the tube was gently centrifuged to precipitate the beads, and the supernatant was collected in another tube. 100 ul of PicaGene PGL-100 was added to the collected supernatant, and the luminescence amount was measured for 10 seconds with a luminometer LV 9800 (Berthold). Moreover, in order to verify whether the detected luminescence was generated by cleavage of the protease, a test zone was also set in which a protease inhibitor was simultaneously added during the protease reaction.
実験結果
結果を図８に示す。
図８は、ルシフェラーゼの発光によるHIV-1プロテアーゼの検出結果（MA/CA配列）の検出結果を示す。Protease(+)：HIV-1プロテアーゼを1ユニット添加後、発光測定した結果。Protease(-)：HIV-1プロテアーゼを添加せず。Protease+Inhibitor：HIV-1プロテアーゼ 1ユニットおよびProtease Inhibitor Coktail（シグマ・アルドリッジ）5ulを同時に添加後、発光測定した結果。
The experimental results are shown in FIG.
FIG. 8 shows the results of detection of HIV-1 protease (MA / CA sequence) by luminescence of luciferase. Protease (+): The result of luminescence measurement after adding 1 unit of HIV-1 protease. Protease (-): Without adding HIV-1 protease. Protease + Inhibitor: Result of luminescence measurement after simultaneously adding 1 unit of HIV-1 protease and 5 ul of Protease Inhibitor Coktail (Sigma Aldridge).
Protease(+)試験区のみ発光が確認され、Protease(+)Inhibitor(+)試験区では発光がバックグラウンドレベルであった。Inhibitorはプロアーゼインヒビターで、HIV-1プロテアーゼの活性を特異的に阻害する。このため、検出された発光はプロテアーゼにより切断され遊離したルシフェラーゼ由来の発光である。 Luminescence was confirmed only in the Protease (+) test area, and the luminescence was at the background level in the Protease (+) Inhibitor (+) test area. Inhibitor is a proase inhibitor that specifically inhibits the activity of HIV-1 protease. For this reason, the detected luminescence is luminescence from luciferase which has been cleaved and released by the protease.
〔実施例３〕プロテアーゼ活性検出方法３
レポータータンパク質として耐熱性ルシフェラーゼ（特表平09-510610、いわゆるE354K）を使用し、HIV-1プロテアーゼとMA-CA配列を有するプロテアーゼ認識プローブとの反応を30℃で行った以外は、実施例１と同様の操作で実験を行った。結果を図９に示す。
[Example 3] Protease activity detection method 3
Example 1 except that a thermostable luciferase (Japanese Patent Publication 09-510610, so-called E354K) was used as a reporter protein and the reaction between HIV-1 protease and a protease recognition probe having a MA-CA sequence was performed at 30 ° C. The experiment was performed in the same manner as in. The results are shown in FIG.
図９は、耐熱性ルシフェラーゼの発光によるHIV-1プロテアーゼの検出結果（MA/CA配列）の検出結果を示す。Protease(+)：HIV-1プロテアーゼを1ユニット添加後、発光測定した結果。Protease(-)：HIV-1プロテアーゼを添加せず。Protease+Inhibitor：HIV-1プロテアーゼ 1ユニットおよびProtease Inhibitor Coktail（シグマ・アルドリッジ）5ulを同時に添加後、発光測定した結果。 FIG. 9 shows the results of detection of HIV-1 protease (MA / CA sequence) by luminescence of thermostable luciferase. Protease (+): The result of luminescence measurement after adding 1 unit of HIV-1 protease. Protease (-): Without adding HIV-1 protease. Protease + Inhibitor: Result of luminescence measurement after simultaneously adding 1 unit of HIV-1 protease and 5 ul of Protease Inhibitor Coktail (Sigma Aldridge).
Protease(+)試験区のみ発光が確認され、Protease(+)Inhibitor(+)試験区では発光がバックグラウンドレベルであった。Inhibitorはプロアーゼインヒビターで、HIV-1プロテアーゼの活性を特異的に阻害する。このため、検出された発光はプロテアーゼにより切断され遊離したルシフェラーゼ由来の発光である。また、Protease(+)試験区での発光は実施例１で示した発光の約１００倍である。担体への結合操作やプロテアーゼ反応など、ルシフェラーゼの安定を妨害する操作に対し、耐熱性ルシフェラーゼを用いれば耐性が上昇するためであると考えられる。 Luminescence was confirmed only in the Protease (+) test area, and the luminescence was at the background level in the Protease (+) Inhibitor (+) test area. Inhibitor is a proase inhibitor that specifically inhibits the activity of HIV-1 protease. For this reason, the detected luminescence is luminescence from luciferase which has been cleaved and released by the protease. In addition, the light emission in the Protease (+) test area is about 100 times the light emission shown in Example 1. It is considered that the use of a thermostable luciferase increases the resistance to operations such as binding to a carrier and operations that interfere with the stability of luciferase, such as protease reaction.
本発明により、少ない工程、かつ短い作業時間でプロテアーゼを検出・測定することができる。 According to the present invention, protease can be detected and measured in a small number of steps and a short operation time.
本発明により、精密な分子設計を必要とせず、また、バックグラウンドの原因となる蛍光や発光が少なく、かつ、プロテアーゼによる切断とルシフェラーゼの再構成にタイムラグが生じないプロテアーゼの検出・測定が可能となる。 According to the present invention, it is possible to detect and measure a protease which does not require precise molecular design, has less fluorescence and luminescence causing background, and does not cause a time lag between cleavage by protease and reconstitution of luciferase. Become.
本発明は、プロテアーゼを産生する微生物の検出、定量などにも利用することができる。 The present invention can also be used to detect, quantify, etc., a microorganism that produces a protease.
＜配列番号１＞実施例１ａ）でpTriEx3 Neoベクターに挿入したDNA断片（Bio-Turbo3C-Luc-His）のDNA配列と、コードされるアミノ酸配列（三文字表記）を示す。
ヌクレオチド番号1-252:PinPoint Xa Vector（プロメガ）由来の配列
ヌクレオチド番号253-282:Bio（ビオチン結合配列）コード領域
ヌクレオチド番号283-384: PinPoint Xa Vector（プロメガ）由来の配列
ヌクレオチド番号385-408:3C（Turbo 3Cプロテアーゼ認識配列）コード領域
ヌクレオチド番号409-426:制限酵素サイトを含む配列
ヌクレオチド番号427-2064:Luc（ルシフェラーゼ）コード領域
ヌクレオチド番号2064-2142:pTriEx3 Neoベクター（メルク）由来の配列
ヌクレオチド番号2143-2166:His(His tag) コード領域
ヌクレオチド番号2167-2169:終始コドン
＜配列番号２＞実施例１ａ）でpTriEx3 Neoベクターに挿入したDNA断片（Bio-Turbo3C-Luc-His）がコードするアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３＞実施例１ａ）でpTriEx3 Neoベクターに挿入したDNA断片（Bio-MA/CA-Luc-His）のDNA配列と、コードされるアミノ酸配列（三文字表記）を示す。
ヌクレオチド番号1-252:PinPoint Xa Vector（プロメガ）由来の配列
ヌクレオチド番号253-282:Bio（ビオチン結合配列）コード領域
ヌクレオチド番号283-384: PinPoint Xa Vector（プロメガ）由来の配列
ヌクレオチド番号385-408:MA/CA（HIV-1のプロテアーゼ認識配列MA/CA）コード領域
ヌクレオチド番号409-426:制限酵素サイトを含む配列
ヌクレオチド番号427-2064:Luc（ルシフェラーゼ）コード領域
ヌクレオチド番号2064-2142:pTriEx3 Neoベクター（メルク）由来の配列
ヌクレオチド番号2143-2166:His(His tag) コード領域
ヌクレオチド番号2167-2169:終始コドン
＜配列番号４＞実施例１ａ）でpTriEx3 Neoベクターに挿入したDNA断片（Bio-MA/CA-Luc-His）がコードするアミノ酸配列を示す。
＜配列番号５＞実施例１ａ）でpTriEx3 Neoベクターに挿入したDNA断片（Bio-Nc/p1-Luc-His）のDNA配列と、コードされるアミノ酸配列（三文字表記）を示す。
ヌクレオチド番号1-252:PinPoint Xa Vector（プロメガ）由来の配列
ヌクレオチド番号253-282:Bio（ビオチン結合配列）コード領域
ヌクレオチド番号283-384: PinPoint Xa Vector（プロメガ）由来の配列
ヌクレオチド番号385-408: Nc/p1（HIV-1のプロテアーゼ認識配列Nc/p1）コード領域
ヌクレオチド番号409-426:制限酵素サイトを含む配列
ヌクレオチド番号427-2064:Luc（ルシフェラーゼ）コード領域
ヌクレオチド番号2064-2142:pTriEx3 Neoベクター（メルク）由来の配列
ヌクレオチド番号2143-2166:His(His tag) コード領域
ヌクレオチド番号2167-2169:終始コドン
＜配列番号６＞実施例１ａ）でpTriEx3 Neoベクターに挿入したDNA断片（Bio-Nc/p1-Luc-His）がコードするアミノ酸配列を示す。
＜配列番号７＞実施例２ｅ）でpTriEx3 Neoベクターに挿入したDNA断片（Luc-MA/CA- His）のDNA配列と、コードされるアミノ酸配列（三文字表記）を示す。
ヌクレオチド番号1-33:pTriEx3 Neoベクター（メルク）由来の配列
ヌクレオチド番号34-1671:Luc（ルシフェラーゼ）コード領域
ヌクレオチド番号1672-1689:制限酵素サイトを含む配列
ヌクレオチド番号1690-1713:MA/CA（HIV-1のプロテアーゼ認識配列MA/CA）コード領域
ヌクレオチド番号1714-1773:pTriEx3 Neoベクター（メルク）由来の配列
ヌクレオチド番号1774-1797:His(His tag) コード領域
ヌクレオチド番号1798-1800:終始コドン
＜配列番号８＞実施例２ｅ）でpTriEx3 Neoベクターに挿入したDNA断片（Luc-MA/CA- His）がコードするアミノ酸配列を示す。
＜配列番号９＞実施例３でpTriEx3 Neoベクターに挿入したDNA断片（Bio-MA/CA-TsLuc-His）のDNA配列と、コードされるアミノ酸配列（三文字表記）を示す。
ヌクレオチド番号1-252:PinPoint Xa Vector（プロメガ）由来の配列
ヌクレオチド番号253-282:Bio（ビオチン結合配列）コード領域
ヌクレオチド番号283-384: PinPoint Xa Vector（プロメガ）由来の配列
ヌクレオチド番号385-408:MA/CA（HIV-1のプロテアーゼ認識配列MA/CA）コード領域
ヌクレオチド番号409-426:制限酵素サイトを含む配列
ヌクレオチド番号427-2064:TsLuc（耐熱性ルシフェラーゼ）コード領域＊ヌクレオチド番号1495-1497がaaa(Lys)に置換。
ヌクレオチド番号2064-2142:pTriEx3 Neoベクター（メルク）由来の配列
ヌクレオチド番号2143-2166:His(His tag) コード領域
ヌクレオチド番号2167-2169:終始コドン
＜配列番号１０＞実施例３でpTriEx3 Neoベクターに挿入したDNA断片（Bio-MA/CA-TsLuc-His）がコードするアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１１＞MA/CA配列を示す。
＜配列番号１２＞NC/p1配列を示す。
＜配列番号１３＞p2/NC配列を示す。
＜配列番号１４＞p2/NC配列を示す。
＜配列番号１５＞p1/p6gag配列を示す。
＜配列番号１６＞NC/TFP配列を示す。
＜配列番号１７＞TFP/p6pol配列を示す。
＜配列番号１８＞TFP/p6pol配列を示す。
＜配列番号１９＞TFP/p6pol配列を示す。
＜配列番号２０＞p6pol/PR配列を示す。
＜配列番号２１＞p6pol/PR配列を示す。
＜配列番号２２＞p6pol/PR配列を示す。
＜配列番号２３＞PR/RTp51配列を示す。
＜配列番号２４＞RT/RTp66配列を示す。
＜配列番号２５＞RTp66/INT配列を示す。
＜配列番号２６＞Nef配列を示す。
＜配列番号２７＞Nef配列を示す。
＜配列番号２８＞CA/p2配列を示す。
＜配列番号２９＞ビオチン結合配列を示す。
＜配列番号３０＞Trbo3cプロテアーゼの認識配列（6番目と7番目の間を切断）を示す。
<SEQ ID NO: 1> The DNA sequence of the DNA fragment (Bio-Turbo3C-Luc-His) inserted into the pTriEx3 Neo vector in Example 1a) and the encoded amino acid sequence (three-letter code) are shown.
Nucleotide number 1-252: Sequence derived from PinPoint Xa Vector (Promega) Nucleotide number 253-282: Bio (biotin binding sequence) coding region Nucleotide number 283-384: Sequence derived from PinPoint Xa Vector (Promega) nucleotide number 385-408: 3C (Turbo 3C protease recognition sequence) coding region nucleotide numbers 409 to 426: containing restriction enzyme site nucleotide numbers 427 to 2064: Luc (luciferase) coding region nucleotide numbers 2064 to 1421: pTriEx 3 Sequence nucleotides derived from Neo vector (Merck) No. 2143-2166: His (His tag) Coding region Nucleotide No. 2167-2169: Ending codons <SEQ ID No. 2> A DNA fragment (Bio-Turbo3C-Luc-His) inserted into pTriEx3 Neo vector at the encoding of Example 1a) encodes The amino acid sequence is shown.
<SEQ ID NO: 3> The DNA sequence of the DNA fragment (Bio-MA / CA-Luc-His) inserted into the pTriEx3 Neo vector in Example 1a) and the encoded amino acid sequence (three letter code) are shown.
Nucleotide number 1-252: Sequence derived from PinPoint Xa Vector (Promega) Nucleotide number 253-282: Bio (biotin binding sequence) coding region Nucleotide number 283-384: Sequence derived from PinPoint Xa Vector (Promega) nucleotide number 385-408: MA / CA (Protease recognition sequence of HIV-1 MA / CA) coding region nucleotide number 409-426: Sequence containing restriction enzyme site nucleotide number 427-2064: Luc (luciferase) coding region nucleotide number 2064-2142: pTriEx3 Neo vector (Merck) -derived sequence nucleotide number 2143-2166: His (His tag) coding region nucleotide number 2167-2169: termination codon <SEQ ID 4> Example 1a) DNA fragment (Bio-MA /) inserted into pTriEx3 Neo vector The amino acid sequence encoded by CA-Luc-His) is shown.
<SEQ ID NO: 5> The DNA sequence of the DNA fragment (Bio-Nc / p1-Luc-His) inserted in the pTriEx3 Neo vector in Example 1a) and the encoded amino acid sequence (three-letter code) are shown.
Nucleotide number 1-252: Sequence derived from PinPoint Xa Vector (Promega) Nucleotide number 253-282: Bio (biotin binding sequence) coding region Nucleotide number 283-384: Sequence derived from PinPoint Xa Vector (Promega) nucleotide number 385-408: Nc / p1 (protease recognition sequence of HIV-1 Nc / p1) coding region nucleotide number 409 to 426: Sequence containing restriction enzyme site nucleotide number 427 to 2064: Luc (luciferase) coding region nucleotide number 2064 to 1422: pTriEx3 Neo vector (Merck) -derived sequence nucleotide number 2143-2166: His (His tag) coding region nucleotide number 2167-2169: termination codon <SEQ ID NO 6> Example 1a) DNA fragment inserted into pTriEx3 Neo vector (Bio-Nc / The amino acid sequence encoded by p1-Luc-His) is shown.
<SEQ ID NO: 7> The DNA sequence of the DNA fragment (Luc-MA / CA-His) inserted into the pTriEx3 Neo vector in Example 2e) and the encoded amino acid sequence (three-letter code) are shown.
Nucleotide number 1-33: Sequence derived from pTriEx3 Neo vector (Merck) Nucleotide number 34-1671: Luc (luciferase) coding region Nucleotide number 1672-1689: Sequence containing restriction enzyme site nucleotide number 1690 to 1713: MA / CA (HIV (HIV) -1 protease recognition sequence MA / CA) coding region nucleotide number 1714 to 1773: Sequence derived from pTriEx3 Neo vector (Merck) nucleotide number 1774 to 1797: His (His tag) coding region nucleotide number 1798-1800: start codon <sequence No. 8> The amino acid sequence encoded by the DNA fragment (Luc-MA / CA-His) inserted into the pTriEx3 Neo vector in Example 2e) is shown.
<SEQ ID NO: 9> The DNA sequence of the DNA fragment (Bio-MA / CA-TsLuc-His) inserted into the pTriEx3 Neo vector in Example 3 and the encoded amino acid sequence (three letter code) are shown.
Nucleotide number 1-252: Sequence derived from PinPoint Xa Vector (Promega) Nucleotide number 253-282: Bio (biotin binding sequence) coding region Nucleotide number 283-384: Sequence derived from PinPoint Xa Vector (Promega) nucleotide number 385-408: MA / CA (Protease recognition sequence of HIV-1 MA / CA) coding region nucleotide number 409 to 426: restriction enzyme site containing nucleotide number 427 to 2064: TsLuc (thermostable luciferase) coding region * nucleotide number 1495 to 1497 Replace with aaa (Lys).
Nucleotide number 2064-2142: Sequence derived from pTriEx3 Neo vector (Merck) Nucleotide number 2143-2166: His (His tag) Coding region Nucleotide number 2167-2169: termination codon <SEQ ID 10> Insertion in pTriEx3 Neo vector in Example 3 The amino acid sequence encoded by the fragmented DNA fragment (Bio-MA / CA-TsLuc-His) is shown.
<SEQ ID NO: 11> Shows the MA / CA sequence.
<SEQ ID NO: 12> shows an NC / p1 sequence.
<SEQ ID NO: 13> This shows the p2 / NC sequence.
<SEQ ID NO: 14> This shows the p2 / NC sequence.
<SEQ ID NO: 15> p1 / p6 shows a gag sequence.
<SEQ ID NO: 16> shows an NC / TFP sequence.
<SEQ ID NO: 17> shows a TFP / p6 pol sequence.
<SEQ ID NO: 18> shows a TFP / p6 pol sequence.
<SEQ ID NO: 19> shows a TFP / p6 pol sequence.
<SEQ ID NO: 20> p6 pol / PR sequence is shown.
<SEQ ID NO: 21> p6 pol / PR sequence is shown.
<SEQ ID NO: 22> Shows the p6 pol / PR sequence.
<SEQ ID NO: 23> shows PR / RTp51 sequence.
<SEQ ID NO: 24> This shows the RT / RTp66 sequence.
<SEQ ID NO: 25> This shows the RTp66 / INT sequence.
<SEQ ID NO: 26> This shows the Nef sequence.
<SEQ ID NO: 27> This shows the Nef sequence.
<SEQ ID NO: 28> shows a CA / p2 sequence.
<SEQ ID NO: 29> Shows a biotin binding sequence.
<SEQ ID NO: 30> Shows the recognition sequence of Trbo3c protease (cleavage between sixth and seventh).
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63251095A (en) * | 1987-03-10 | 1988-10-18 | エフ・ホフマン―ラ ロシュ アーゲー | Novel fused protein and purification thereof |
| JPH03172196A (en) * | 1989-11-03 | 1991-07-25 | Abbott Lab | Fluorescent substrate and detection of proteolytic enzyme using same |
| JPH11304786A (en) * | 1998-03-27 | 1999-11-05 | Synsorb Biotec Inc | Apparatus for screening compound library |
| JP2007330185A (en) * | 2006-06-16 | 2007-12-27 | Toyo B-Net Co Ltd | Method for detecting two or more luciferases in multispecimen sample |
| JP2008273926A (en) * | 2007-12-25 | 2008-11-13 | Nokodai Tlo Kk | Method for efficiently expressing protein in magnetic bacterium |
| WO2012047325A2 (en) * | 2010-06-11 | 2012-04-12 | Synaptic Research, Llc | N-end rule protease activity indication methods and uses thereof |
| WO2013094359A1 (en) * | 2011-12-19 | 2013-06-27 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | Cellulose-/chitin-type polymeric light-emitting material |
-
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Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63251095A (en) * | 1987-03-10 | 1988-10-18 | エフ・ホフマン―ラ ロシュ アーゲー | Novel fused protein and purification thereof |
| JPH03172196A (en) * | 1989-11-03 | 1991-07-25 | Abbott Lab | Fluorescent substrate and detection of proteolytic enzyme using same |
| JPH11304786A (en) * | 1998-03-27 | 1999-11-05 | Synsorb Biotec Inc | Apparatus for screening compound library |
| JP2007330185A (en) * | 2006-06-16 | 2007-12-27 | Toyo B-Net Co Ltd | Method for detecting two or more luciferases in multispecimen sample |
| JP2008273926A (en) * | 2007-12-25 | 2008-11-13 | Nokodai Tlo Kk | Method for efficiently expressing protein in magnetic bacterium |
| WO2012047325A2 (en) * | 2010-06-11 | 2012-04-12 | Synaptic Research, Llc | N-end rule protease activity indication methods and uses thereof |
| WO2013094359A1 (en) * | 2011-12-19 | 2013-06-27 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | Cellulose-/chitin-type polymeric light-emitting material |
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