JP2019068762A - 遺伝子改変不完全変態昆虫の作製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ノックアウト不完全変態昆虫を作製する方法であって、
不完全変態昆虫の卵に、Cas9mRNAおよびゲノム用gRNAを注入すること;および
前記卵から生じた昆虫から、所望の遺伝子改変を含む昆虫を選択すること
を含み、Cas9mRNAの濃度が約100pg/μl−約100ng/μl、および/またはゲノム用gRNAの濃度が約100pg/μl−約100ng/μlである、方法。
ノックイン不完全変態昆虫を作製する方法であって、
不完全変態昆虫の卵に、
約2ng/μl−約30ng/μlのゲノム用gRNA、
約2ng/μl−約30ng/μlのドナーベクター用gRNA、
約4ng/μl−約60ng/μlのドナーベクター、および
約4ng/μl−約60ng/μlのCas9mRNA
を注入すること;および
前記卵から生じた昆虫から、所望の遺伝子改変を含む昆虫を選択すること
を含む方法。
約2ng/μl−約30ng/μl、好ましくは約2.5ng/μl−約25ng/μlのゲノム用gRNA、
約2ng/μl−約30ng/μl、好ましくは約2.5ng/μl−約25ng/μlのドナーベクター用gRNA、
約4ng/μl−約60ng/μl、好ましくは約5ng/μl−約50ng/μlのドナーベクター、および
約4ng/μl−約60ng/μl、好ましくは約5ng/μl−約50ng/μlのCas9mRNA
を不完全変態昆虫の卵に注入する。
1.ノックアウト不完全変態昆虫を作製する方法であって、
不完全変態昆虫の卵に、Cas9mRNAおよびゲノム用gRNAを注入すること;および
前記卵から生じた昆虫から、所望の遺伝子改変を含む昆虫を選択すること
を含み、Cas9mRNAの濃度が約100pg/μl−約100ng/μl、および/またはゲノム用gRNAの濃度が約100pg/μl−約100ng/μlである、方法。
2.Cas9mRNAの濃度が約100pg/μl−約100ng/μlであり、ゲノム用gRNAの濃度が約100pg/μl−約100ng/μlである、請求項1に記載の方法。
3.Cas9mRNAの濃度が約500pg/μl−約50ng/μlであり、ゲノム用gRNAの濃度が約500pg/μl−約50ng/μlである、前記1に記載の方法。
4.ノックイン不完全変態昆虫を作製する方法であって、
不完全変態昆虫の卵に、
約2ng/μl−約30ng/μlのゲノム用gRNA、
約2ng/μl−約30ng/μlのドナーベクター用gRNA、
約4ng/μl−約60ng/μlのドナーベクター、および
約4ng/μl−約60ng/μlのCas9mRNA
を注入すること;および
前記卵から生じた昆虫から、所望の遺伝子改変を含む昆虫を選択すること
を含む方法。
5.約2.5ng/μl−約25ng/μlのゲノム用gRNA、
約2.5ng/μl−約25ng/μlのドナーベクター用gRNA、
約5ng/μl−約50ng/μlのドナーベクター、および
約5ng/μl−約50ng/μlのCas9mRNA
を注入する、前記4に記載の方法。
6.ドナーベクターがレポーター遺伝子を含む、前記5に記載の方法。
(1)gRNAおよびCas9mRNAの導入量と変異導入効率との関係
不完全変態昆虫においてCRISPR/Cas9システムによりゲノム編集を行うための実験条件を評価するため、G0における変異導入効率に対するgRNAおよびCas9mRNAの濃度の影響を検討した。
Cas9mRNAは、pMLM3613プラスミド(Addgene社)を制限酵素PmeIで直鎖化した産物を鋳型として、mMessage mMachine(Thermo Fisher社)を用いて合成した。Cas9mRNAの配列を配列番号2に示す。gRNAは、vermilion遺伝子を標的として作製した(標的配列:GGTGCCGGGCGCCCAGGACG(配列番号3))。gRNA転写用ベクターは、pDR274プラスミド(Addgene社)をBsaIで直鎖化し、Oligo1:TAGGTGCCGGGCGCCCAGGACG(配列番号4)とOligo2:AAACCGTCCTGGGCGCCCGGCA(配列番号5)のアニーリング産物を組み込み作製した。作製したベクターをDraIにより直鎖化した産物を鋳型として、mMessage mMachine(Thermo Fisher社)を用いて、gRNAを合成した。
濃度は、500ng/μlから希釈して、gRNAは50pg/μl、Cas9mRNAは5pg/μlを下限とした。gRNAの濃度検討の際に用いるCas9mRNA、およびCas9mRNAの濃度検討の際に用いるgRNAは、それぞれ500ng/μlとした。溶媒はTris-EDTAバッファーを用いた。
gRNAおよびCas9mRNAは、フタホシコオロギの卵(産卵後5時間以内)に、以下の方法によりインジェクションした。
(1)フィラメント入りガラスキャピラリーをMicropipette puller (P-1000IVF, Sutter Instruments)を用いてインジェクション針とした。
(2)できた針をMicropipette grinder (EG-44, Narishige)を用いて針先が20度となるように削った。
(3)0.7mm幅X0.5mm深さの突起が付いたプラスチック板を、9cmシャーレ中の20mLの熱した1%アガロース液に浮かべ、その後冷まして、コオロギ卵を並べる溝をもったアガロース板を作成した。
(4)コオロギ卵を1時間かけて採卵し、20mlの1XPBS(50U/mlペニシリン,50μg/mストレプトマイシン含有)で満たしたアガロース板の溝に並べた。
(5)条件をinjection pressure; 5-10 psi、injection time; 0.1 sec に設定し,コオロギ卵の後方にインジェクションした。
1週間後、インジェクションした卵1個ずつからゲノム抽出を行い,SURVEYOR nuclease assayにより変異導入された卵の割合を算出した。
G0におけるlaccase2遺伝子の表現型であるクチクラの白色化を指標として、体細胞ノックアウト効率および孵化率に対するgRNAの導入量の影響を調べた。
laccase2遺伝子を標的としてgRNAを作製した。Cas9mRNAは、上記1(1)と同じものを用いた。gRNAは、laccase2遺伝子を標的として作製した(標的配列:GGGGTCCTGGCCCGGGTTGA(配列番号6))。gRNA転写用ベクターは、pDR274プラスミド(Addgene社)をBsaIで直鎖化し、Oligo1:TAGGGGTCCTGGCCCGGGTTGA(配列番号7)とOligo2:AAACTCAACCCGGGCCAGGACC(配列番号8)のアニーリング産物を組み込み作製した。作製したベクターをDraIにより直鎖化した産物を鋳型として、mMessage mMachine(Thermo Fisher社)を用いて、gRNAを合成した。gRNAの導入量は、50pg/μl、500pg/μl、50ng/μlまたは500ng/μl、Cas9mRNAの導入量は500ng/μlとした。
上記1(2)の各gRNAの濃度での体細胞ノックアウトの生じた範囲を比較するために、画像解析ソフトウェアImageJにより、クチクラが白色化した領域の割合を算出した。
まず、個体の画像を白黒化し、胴体を枠線で囲み、白黒化画像の黒色の部分を赤色に表示して、枠線内の赤色の面積を測定した。その後、枠線内の全体の面積を測定し、計算により白色化領域の割合を算出した。
gRNAおよびCas9mRNAをコオロギ卵へ導入する時期の検討を行った。
gRNAは、Ubx遺伝子またはabd−A遺伝子を標的として作製した(Ubx標的配列:GGGTAGAAGGTGTGGTTGGC(配列番号9)、abd−A標的配列:GGGCAAGGCTCACCCGTGA(配列番号10))。Cas9mRNAは、上記1(1)と同じものを用いた。それぞれのgRNA転写用ベクターは、pDR274プラスミド(Addgene社)をBsaIで直鎖化し、UbxOligo1:TAGGGTAGAAGGTGTGGTTGGC(配列番号11)とUbxOligo2:AAACGCCAACCACACCTTCTAC(配列番号12)、abd−AOligo1:TAGGGCAAGGCTCACCCGTGA(配列番号13)とabd−AOligo2:AAACTCACGGGTGAGCCTTGC(配列番号14)のアニーリング産物を組み込み作製した。作製したベクターをDraIにより直鎖化した産物を鋳型として、mMessage mMachine(Thermo Fisher社)を用いて、gRNAを合成した。gRNAおよびCas9mRNAの濃度はそれぞれ、500ng/μlおよび1000ng/μlとした。
コオロギ卵を1時間かけて採集したのち、1時間後(1h)、3時間後(3h)、5時間後(5h)、9時間後(9h)に、gRNAおよびCas9mRNAをコオロギ卵へ注入した。その後、採卵から48時間後の時点でゲノムDNAを抽出し、それぞれの標的(オンターゲット)およびオフターゲット領域をPCR増幅し、次世代シークエンサー MiSeq(イルミナ社)を用いたアンプリコンシークエンス解析を行って、それぞれのPCR増幅断片中の変異導入されたDNAの割合をCRISPRessoにより解析した。
(1)NHEJによるノックイン
ドナーベクターとして、pUC57ベクター(2710bp)にeGFP遺伝子をコオロギアクチンプロモーターの下流に組み込んだもの(5625bp(配列番号15))を作製した。前記プロモーターの上流には、DsRed由来の短い配列をベイト(bait)として組み込んだ。また、Ubx遺伝子、abd−A遺伝子、および前記ベイトを標的とするgRNAをそれぞれ作製した。Cas9mRNAは、上記1(1)と同じものを用いた。ベイトのgRNAはDsRed遺伝子を標的とした(DsRed標的配列;GCCCTTCGCCTGGGACATCC(配列番号16))。ベイトgRNA転写用ベクターは、pDR274プラスミド(Addgene社)をBsaIで直鎖化し、DsRedOligo1;TAGGATGTCCCAGGCGAAGGGC(配列番号17)、DsRedOligo2;AAACGCCCTTCGCCTGGGACAT(配列番号18)のアニーリング産物を組み込み作製した。作製したベクターをDraIにより直鎖化した産物を鋳型として、mMessage mMachine(Thermo Fisher社)を用いて、gRNAを合成した。Ubx遺伝子およびabd−A遺伝子に対するそれぞれのgRNAは上記1(4)と同じものを用いた。
ゲノム用gRNA(50ng/μl)、ドナーベクター用gRNA(50ng/μl)、ドナーベクター(100ng/μl)、およびCas9mRNA(100ng/μl)を混合し、コオロギの卵(採卵後5時間以内)に注入した。
abd−A遺伝子のイントロンを標的とするgRNAを設計し、標的特異的エンハンサートラップ法を行った。
図8に、標的特異的エンハンサートラップ法の概要を示す。この方法では、上記と同様に、ドナーベクター、Cas9mRNA、ドナーベクター用gRNA、およびゲノム用gRNAを用いるが、ゲノム用gRNAを標的遺伝子の上流およびイントロンに対して作製する。これにより、ドナーベクターがノックインされても標的遺伝子には影響がなく、その機能を破壊することなく、エンハンサー活性をドナーベクターのGFP蛍光により可視化することができる。
ゲノム用gRNA(50ng/μl)、ドナーベクター用gRNA(50ng/μl)、ドナーベクター(100ng/μl)、およびCas9mRNA(100ng/μl)を混合し、コオロギの卵(採卵後5時間以内)に注入した。
abd−A遺伝子を標的として、ノックイン実験における注入溶液の濃度検討を行った。
ドナーベクター、ベイトgRNAおよびCas9mRNAは、上記2(1)と同じものを用いた。abd−A遺伝子に対するgRNAは、上記1(4)と同じものを用いた。
ゲノム用gRNA:1μg/μl、ドナーベクター用gRNA:1μg/μl、ドナーベクター:2μg/μl、Cas9mRNA:2μg/μlのストック溶液1μlを4μlに希釈して、注入溶液(ゲノム用gRNA:250ng/μl、ドナーベクター用gRNA:250ng/μl、ドナーベクター:500ng/μl、Cas9mRNA:500ng/μl)を調製した。この注入溶液を、1倍、5倍、10倍、または100倍希釈して、実験に用いた。ノックインのネガティブコントロールとして、ドナーベクターのみ、注入のネガティブコントロールとして注入なし(No inj.)の実験も行った。
配列番号4:Oligo1
配列番号5:Oligo2
配列番号6:laccase2遺伝子中の標的配列
配列番号7:Oligo1
配列番号8:Oligo2
配列番号9:Ubx遺伝子中の標的配列
配列番号10:abd−A遺伝子中の標的配列
配列番号11:UbxOligo1
配列番号12:UbxOligo2
配列番号13:abd−AOligo1
配列番号14:abd−AOligo2
配列番号15:ドナーベクター
配列番号16:DsRed遺伝子中の標的配列
配列番号17:DsRedOligo1
配列番号18:DsRedOligo2
配列番号19:abd−A遺伝子中の標的配列
配列番号20:abd−A遺伝子中の標的配列
配列番号21:改変Oligo1
配列番号22:改変Oligo2
配列番号23:#1Oligo1
配列番号24:#1Oligo2
配列番号25:#2Oligo1
配列番号26:#2Oligo2
Claims (6)
- ノックアウト不完全変態昆虫を作製する方法であって、
不完全変態昆虫の卵に、Cas9mRNAおよびゲノム用gRNAを注入すること;および
前記卵から生じた昆虫から、所望の遺伝子改変を含む昆虫を選択すること
を含み、Cas9mRNAの濃度が約100pg/μl−約100ng/μl、および/またはゲノム用gRNAの濃度が約100pg/μl−約100ng/μlである、方法。 - Cas9mRNAの濃度が約100pg/μl−約100ng/μlであり、ゲノム用gRNAの濃度が約100pg/μl−約100ng/μlである、請求項1に記載の方法。
- Cas9mRNAの濃度が約500pg/μl−約50ng/μlであり、ゲノム用gRNAの濃度が約500pg/μl−約50ng/μlである、請求項1に記載の方法。
- ノックイン不完全変態昆虫を作製する方法であって、
不完全変態昆虫の卵に、
約2ng/μl−約30ng/μlのゲノム用gRNA、
約2ng/μl−約30ng/μlのドナーベクター用gRNA、
約4ng/μl−約60ng/μlのドナーベクター、および
約4ng/μl−約60ng/μlのCas9mRNA
を注入すること;および
前記卵から生じた昆虫から、所望の遺伝子改変を含む昆虫を選択すること
を含む方法。 - 約2.5ng/μl−約25ng/μlのゲノム用gRNA、
約2.5ng/μl−約25ng/μlのドナーベクター用gRNA、
約5ng/μl−約50ng/μlのドナーベクター、および
約5ng/μl−約50ng/μlのCas9mRNA
を注入する、請求項4に記載の方法。 - ドナーベクターがレポーター遺伝子を含む、請求項5に記載の方法。
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JOURNAL OF MORPHOLOGY, vol. 254, JPN6022015952, 2002, pages 266 - 271, ISSN: 0004759452 * |
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SCIENTIFIC REPORT, vol. 4, no. 6545, JPN6021040291, 2014, pages 1 - 7, ISSN: 0004759451 * |
SCIENTIFIC REPORT, vol. 5, no. 15885, JPN6021040294, 2015, pages 1 - 9, ISSN: 0004759448 * |
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