JP2019062890A - Measurement of glycated protein - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、糖化蛋白質の測定に関し、より具体的には、アマドリアーゼを用いる糖化蛋白質の測定の方法、装置、システムに関する。 The present disclosure relates to the measurement of glycated proteins, and more specifically to a method, apparatus, and system for measurement of glycated proteins using amadoriase.
蛋白質とグルコースなどの糖とが共存するとアマドリ化合物が形成されるため、アマドリ化合物量の測定により糖の量を知ることができる。糖の量は、人や動物の血液中や、食品などで測定されている。
特に糖化蛋白質量の測定は、糖尿病の診断や治療において重要である。糖化蛋白質量の測定方法としては、糖化蛋白質量のみを測定する方法や、糖化蛋白質量と蛋白質量を測定して比率を算出する方法などがあり、対象とする蛋白質も、特に限定しない場合や、特定の蛋白質に限定する場合や、特定の蛋白質の特定部位に限定する場合がある。
When a protein and a sugar such as glucose coexist, an Amadori compound is formed, so the amount of sugar can be known by measuring the amount of the Amadori compound. The amount of sugar is measured in blood of humans and animals and in food.
In particular, measurement of the amount of glycated protein is important in the diagnosis and treatment of diabetes. As a method of measuring the amount of glycated protein, there are a method of measuring only the amount of glycated protein, a method of calculating the ratio by measuring the amount of glycated protein and the amount of protein, and the like. It may be limited to a specific protein or may be limited to a specific site of a specific protein.
このような糖化蛋白質量の測定として、フルクトサミン、糖化アルブミン、糖化ヘモグロビン、及び、ヘモグロビンA1cなどがある。
例えば、フルクトサミンは血清や血漿中の蛋白質又はアルブミンの糖化量を測定し、糖化アルブミンは血清や血漿中のアルブミンの糖化量とアルブミン量の比率を測定する。糖化ヘモグロビンは血液中のヘモグロビンの糖化量を測定するか、ヘモグロビン量との比率を測定する。ヘモグロビンA1cは血液中のヘモグロビンのβ鎖N末端糖化量(HbA1c量)を測定するか、ヘモグロビン量との比率を測定する。
これらの糖化蛋白質の測定方法として、糖化アミノ酸や糖化ペプチドに反応するアマドリアーゼを用いた酵素法が一般的に使用される。
Examples of such measurement of the amount of glycated protein include fructosamine, glycated albumin, glycated hemoglobin, and hemoglobin A1c.
For example, fructosamine measures the glycation amount of protein or albumin in serum or plasma, and glycated albumin measures the ratio of the glycation amount of albumin to albumin amount in serum or plasma. Glycated hemoglobin measures the amount of glycated hemoglobin in the blood or measures the ratio to the amount of hemoglobin. Hemoglobin A1c measures the β-chain N-terminal glycation amount (HbA1c amount) of hemoglobin in blood or the ratio to the amount of hemoglobin.
As a method of measuring these glycated proteins, an enzyme method using amadoriase which reacts with glycated amino acids and glycated peptides is generally used.
フルクトサミンの測定法は特許3034698(特許文献1)、糖化アルブミンの測定法は特許4341809(特許文献2)及び特開2008−295305(特許文献3)、糖化ヘモグロビン量のみの測定法は特許5878096(特許文献4)などに示されている。 The measurement method of fructosamine is patent 3034698 (patent document 1), the measurement method of glycated albumin is patent 4341809 (patent document 2) and JP-A 2008-295305 (patent document 3), the measurement method of only the amount of glycated hemoglobin is patent 5878096 (patent) Reference 4) and the like.
その中でも、糖化ヘモグロビン比率の測定は、糖尿病の診断や治療において重要である。糖化ヘモグロビンの一つであるヘモグロビンA1c(HbA1c)の測定は特に広く測定されている。
糖化ヘモグロビン比率の測定のためには、糖化ヘモグロビン量とヘモグロビン量を測定する方法が広く使われている。
糖化ヘモグロビン量の測定方法として、糖化アミノ酸や糖化ペプチドに反応するアマドリアーゼを用いた酵素法が一般的に使用されている。アマドリアーゼとしては、過酸化水素などを生成するフルクトシルペプチドオキシダーゼ(特許4231668、特許文献5)や、デヒドロゲナーゼ活性が向上したフルクトシルペプチドデヒドロゲナーゼ(WO2016−63984、特許文献6)などがある。
Among them, the measurement of the glycated hemoglobin ratio is important in the diagnosis and treatment of diabetes. The measurement of hemoglobin A1c (HbA1c), which is one of glycated hemoglobins, is particularly widely measured.
Methods of measuring the amount of glycated hemoglobin and the amount of hemoglobin are widely used to measure the glycated hemoglobin ratio.
As a method of measuring the amount of glycated hemoglobin, an enzyme method using amadoriase that reacts with glycated amino acids and glycated peptides is generally used. Examples of the amadoriase include fructosyl peptide oxidase that generates hydrogen peroxide and the like (patent 4231668 and patent document 5), and fructosyl peptide dehydrogenase (WO 2016-63984 and patent document 6) with improved dehydrogenase activity.
従来の酵素法に用いられてきたアマドリアーゼは、糖化アミノ酸から糖化ペプチドに対して基質特異性を有している。このため、糖化ヘモグロビン量をアマドリアーゼにより測定する場合、アマドリアーゼが作用し易いように、糖化ヘモグロビンをプロテアーゼなどで予め処理して糖化アミノ酸や糖化ペプチドに分解しておく必要があった(WO2006−120976、特許文献7)。糖化ヘモグロビンをプロテアーゼで分解する場合、測定に用いるアマドリアーゼがプロテアーゼで分解されないために、別の試薬として調製される必要があった。
一方、試料とアマドリアーゼとプロテアーゼとを混合した後にヘモグロビン量を測定することは、Hbが試薬(特にプロテアーゼ)と反応してしまいHbの色調が変化すること、及び、アマドリアーゼの作用により糖化ヘモグロビン濃度に応じて生成する発色色素がHbの色調に重なって糖化ヘモグロビン値に影響が発生すること、などから困難であった。
Amadoriase, which has been used in conventional enzymatic methods, has substrate specificity from glycated amino acid to glycated peptide. For this reason, when the amount of glycated hemoglobin is to be measured by amadoriase, it is necessary to treat glycated hemoglobin in advance with a protease or the like to decompose it into glycated amino acid or glycated peptide so that the amadoriase is easily acted (WO2006-120976, Patent Document 7). When glycated hemoglobin is degraded by protease, the amadoriase used for measurement needs to be prepared as a separate reagent in order not to be degraded by protease.
On the other hand, to measure the amount of hemoglobin after mixing the sample, amadoriase and protease, Hb reacts with the reagent (especially protease) and the color tone of Hb changes, and the action of amadoriase causes the concentration of glycated hemoglobin to It was difficult because the color forming pigment generated accordingly overlapped with the color tone of Hb and the glycated hemoglobin value was affected.
酵素法による糖化ヘモグロビン量の測定の試薬は、現状では2試薬系又は3試薬系の試薬が用いられている。2試薬系の試薬の構成としては、以下の構成1〜4が挙げられる。 構成1
第1試薬:アマドリアーゼ、緩衝剤
第2試薬:プロテアーゼ、発色剤、緩衝剤
構成2
第1試薬:プロテアーゼ、緩衝剤
第2試薬:アマドリアーゼ、発色剤、緩衝剤
構成3
第1試薬:アマドリアーゼ、発色剤、緩衝剤
第2試薬:プロテアーゼ、緩衝剤
構成4
第1試薬:プロテアーゼ、発色剤、緩衝剤
第2試薬:アマドリアーゼ、緩衝剤
At present, a reagent of two-reagent system or three-reagent system is used as a reagent for measurement of the amount of glycated hemoglobin by the enzyme method. The following
First reagent: amadoriase, buffer Second reagent: protease, color former,
First reagent: Protease, buffer Second reagent: amadoriase, color former, buffer Composition 3
First reagent: amadoriase, color former, buffer Second reagent: protease, buffer Composition 4
First reagent: Protease, color former, buffer Second reagent: amadoriase, buffer
近年、アマドリアーゼが改良され、糖化蛋白質に対して基質特異性を有する(糖化蛋白質に直接作用する)アマドリアーゼが発見されるに至った(以下、「糖化蛋白直接型アマドリアーゼ」ともいう)(WO2015−005257(特許文献8)及びWO2015−060429(特許文献9))。糖化蛋白直接型アマドリアーゼを用いた糖化ヘモグロビン量の測定方法としては、例えば、下記(i)〜(ii)の工程を順次行うことを含む測定方法が開示されている。
(i)試料中の糖化ヘモグロビンに糖化蛋白直接型アマドリアーゼに作用させて糖化ヘモグロビンを酸化する工程。
(ii)上記工程(i)で生成された物質、又は、消費された物質を測定する工程。
In recent years, the amadoriase has been improved, and an amadoriase having substrate specificity for a glycated protein (that directly acts on the glycated protein) has been discovered (hereinafter, also referred to as "glycated protein direct type amadoriase") (WO2015-005257 (Patent Document 8) and WO2015-060429 (Patent Document 9)). As a method of measuring the amount of glycated hemoglobin using a glycated protein direct type amadoriase, for example, a measurement method including performing the following steps (i) to (ii) sequentially is disclosed.
(I) A step of causing glycated hemoglobin in a sample to act on glycated protein direct type amadoriase to oxidize glycated hemoglobin.
(Ii) measuring the substance produced in the step (i) or the substance consumed;
なお、ヘモグロビン量の測定は、ヘモグロビンのヘムの赤色を測定する方法が用いられる。ヘモグロビンは酸化型や還元型があり、型によってヘムの荷電状態が変化し、スペクトルが変化するため、ある一定の型にするための変性剤を用いる必要がある。 In addition, the measurement of the amount of hemoglobin uses the method of measuring the red of the heme of hemoglobin. Hemoglobin has an oxidized form and a reduced form, and the charge state of heme changes depending on the type, and the spectrum changes, so it is necessary to use a denaturing agent to make a certain form.
2試薬系の酵素法試薬で糖化蛋白質比率の測定を行う場合、2つの溶液を順次添加する工程が存在する。すなわち、試料と第1試薬とを混合する工程と、そこに第2試薬を混合する工程の2つの工程である。このため、2試薬系の試薬で糖化蛋白質比率の測定方法は、工程が煩雑であった。また、2工程あることで、分注や混合などの作業の時間がかかり時間短縮が難しい。 When the glycated protein ratio is measured with a two-reagent enzyme method reagent, there is a step of sequentially adding two solutions. That is, there are two steps, a step of mixing the sample and the first reagent, and a step of mixing the second reagent thereto. Therefore, the method of measuring the glycated protein ratio with the two-reagent system reagent is complicated in process. In addition, because there are two steps, it takes time for operations such as dispensing and mixing, so it is difficult to shorten the time.
本開示は、一態様において、酵素法により行う糖化蛋白質の測定方法であって、工程が簡便化された測定方法を提供する。 The present disclosure provides, in one aspect, a method for measuring a glycated protein performed by an enzymatic method, wherein the measuring method is simplified.
本開示は、一態様において、下記(1)から(3)を含む、試料中の糖化蛋白質の測定方法であって、下記(2)及び(3)を行うために試料と混合する試薬が1つである測定方法に関する。以下、この測定法方法を「本開示に係る測定方法」ともいい、下記(2)及び(3)を行うために試料と混合する試薬を「1試薬系試薬」ともいう。なお、本開示において、1試薬系試薬は、下記(1)から(3)を行うために試料と混合する試薬であってもよい。
(1)試料中の蛋白質を変性すること。
(2)試料中の糖化蛋白質とアマドリアーゼとの反応により発色剤を発色させること。 (3)(1)及び(2)の後の試料の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。
The present disclosure relates, in one aspect, to a method for measuring glycated protein in a sample, which comprises the following (1) to (3), wherein the reagent mixed with the sample to perform the following (2) and (3) is 1 One measurement method. Hereinafter, this measurement method is also referred to as “the measurement method according to the present disclosure”, and a reagent to be mixed with a sample to perform the following (2) and (3) is also referred to as “one reagent reagent”. In the present disclosure, one reagent-based reagent may be a reagent to be mixed with a sample in order to perform the following (1) to (3).
(1) Denature the protein in the sample.
(2) To develop a color former by the reaction of glycated protein in the sample with amadoriase. (3) To calculate the amount of glycated protein by measuring the chromogenic signal of the sample after (1) and (2).
本開示は、他の一態様において、本開示に係る測定方法を実行する、糖化蛋白質の測定装置又は測定システムに関する。 In another aspect, the present disclosure relates to a glycated protein measurement device or measurement system that implements the measurement method according to the present disclosure.
本開示によれば、例えば、酵素法により行う糖化蛋白質の測定方法の工程を簡便化できる。本開示によれば、例えば、溶血試料に2試薬又は3試薬を添加する工程を、1試薬を混合する工程とすることができる。これにより、例えば、ヘモグロビンA1c比率(HbA1c%)の測定にかかる時間を短縮できる。また、例えば、1試薬の混合であるから、糖化ヘモグロビン量の測定もヘモグロビン量の測定も同一の溶液内で行うことができるから、測定の正確性や精度を向上できる。 According to the present disclosure, for example, the steps of the method of measuring a glycated protein performed by an enzyme method can be simplified. According to the present disclosure, for example, the step of adding 2 reagents or 3 reagents to a hemolyzed sample can be a step of mixing 1 reagent. Thereby, for example, the time taken to measure the hemoglobin A1c ratio (HbA1c%) can be shortened. Further, for example, since it is a mixture of one reagent, the measurement of the amount of glycated hemoglobin and the measurement of the amount of hemoglobin can be performed in the same solution, so that the accuracy and precision of the measurement can be improved.
本開示において、糖化蛋白質の測定とは、一実施形態において、糖化蛋白質量を測定することを含み、その他の一実施形態において、糖化蛋白質量及び蛋白質量を測定することを含み、さらにその他の一実施形態において、糖化蛋白質量及び蛋白質量を測定してそれらの比を求めることを含みうる。
本開示において、「蛋白質」は、特に言及のない場合、「糖化蛋白質」を含みうる。
In the present disclosure, the measurement of glycated protein includes, in one embodiment, measuring the amount of glycated protein, and in another embodiment, includes measuring the amount of glycated protein and the amount of protein, and the other one. In embodiments, it may include measuring glycated protein mass and protein mass to determine their ratio.
In the present disclosure, "protein" may include "glycated protein" unless otherwise stated.
本開示において、1試薬系試薬の「試料との混合」は、試料へ1試薬系試薬を添加すること、及び、1試薬系試薬へ試料を添加することを含む。
本開示に係る測定方法は、一又は複数の実施形態において、蛋白質の変性、糖化蛋白質とアマドリアーゼとの反応、発色剤を発色、発色剤の吸光度の測定、及び、選択的に、変性した蛋白質の吸光度の測定が、試料と1試薬系試薬との一回の混合で、かつ、1容器(例えば、測光セル)内で行うことができる。
In the present disclosure, “mixing with a sample” of one reagent-based reagent includes adding one reagent-based reagent to a sample and adding a sample to one reagent-based reagent.
The measurement method according to the present disclosure includes, in one or more embodiments, denaturation of protein, reaction of glycated protein with amadoriase, coloration of color former, measurement of absorbance of color former, and selectively denaturation of protein The measurement of absorbance can be performed in one mixing of a sample and one reagent-based reagent and in one container (for example, a photometric cell).
本開示において、1試薬系試薬により試料中の蛋白質を変性することとは、1試薬系試薬が試料中の蛋白質を変性し得る変性剤(又は変性作用を有する物質)を含むことをいう。後述するように、混合前の試料は、溶血等のために界面活性剤(変性剤)を含んでいてもよい。 In the present disclosure, to denature a protein in a sample with 1 reagent-based reagent means that 1 reagent-based reagent contains a denaturing agent (or a substance having a denaturing action) capable of denaturing a protein in a sample. As described later, the sample before mixing may contain a surfactant (denaturant) for hemolysis and the like.
本開示に係る測定方法において測定する糖化蛋白質は、フルクトサミン、糖化アルブミン、糖化ヘモグロビンなどが挙げられ、一実施形態において、糖化アルブミン又は糖化ヘモグロビンである。糖化ヘモグロビンとしては、Hbβ鎖N末端が糖化されたヘモグロビンA1c(HbA1c)が挙げられる。 The glycated protein measured in the measurement method according to the present disclosure includes fructosamine, glycated albumin, glycated hemoglobin and the like, and in one embodiment is glycated albumin or glycated hemoglobin. Examples of glycated hemoglobin include hemoglobin A1c (HbA1c) in which the N-terminal end of the Hb β chain is glycated.
本開示に係る測定対象試料は、糖化蛋白質を含む試料が挙げられる。糖化蛋白質が糖化ヘモグロビンの場合、測定対象試料としては、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを含む試料が挙げられる。測定対象試料は、限定されない一又は複数の実施形態において、全血、血球等の赤血球を含む試料や、該試料を溶血させた試料が挙げられる。測定対象試料が赤血球を含む試料である場合、1試薬系試薬で溶血してもよく、1試薬系試薬とは別の手段で溶血させて溶血試料としてもよい。赤血球の溶血は既存の方法で実施できる。例えば、浸透圧を用いる方法(例、水)、界面活性剤を用いる方法、凍結する方法、超音波を用いる方法などがある。界面活性剤などの変性作用を有する物質を用いれば、溶血とともに蛋白質の変性も行える。 The measurement target sample according to the present disclosure includes a sample containing a glycated protein. When the glycated protein is glycated hemoglobin, the sample to be measured includes a sample containing hemoglobin and glycated hemoglobin. The sample to be measured includes, in one or more non-limiting embodiments, a sample containing red blood cells such as whole blood and blood cells, and a sample obtained by hemolyzing the sample. When the sample to be measured is a sample containing red blood cells, hemolysis may be performed with one reagent-based reagent, or hemolysis sample may be used as hemolysis by means other than the one reagent-based reagent. Hemolysis of red blood cells can be performed by existing methods. For example, there are a method using osmotic pressure (eg, water), a method using a surfactant, a method of freezing, a method using ultrasonic waves, and the like. If a substance having a denatured action such as a surfactant is used, the protein can be denatured as well as the hemolysis.
試料の発色シグナルからのHbA1c等の糖化蛋白質量やヘモグロビン等の蛋白質量の算出は、一又は複数の実施形態において、公知の方法により行うことができる。 The calculation of the amount of glycated protein such as HbA1c and the like and the amount of protein such as hemoglobin and the like from the chromogenic signal of the sample can be performed by a known method in one or more embodiments.
よって、本開示は、一態様において、下記(1)から(4)を含む、試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法であって、下記(1)から(4)を行うために試料と混合する試薬が1つである測定方法に関する。
(1)試料中のヘモグロビンを変性すること。
(2)試料中の糖化ヘモグロビンとアマドリアーゼとの反応により発色剤を発色させること。
(3)(1)及び(2)の後の試料の発色シグナルを測定して糖化ヘモグロビン量を算出すること。
(4)(1)及び(2)の後の試料の発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。
Therefore, the present disclosure is, in one aspect, a method for measuring glycated hemoglobin in a sample, comprising the following (1) to (4), which is a reagent mixed with the sample to perform the following (1) to (4): Relating to the measurement method in which
(1) Denature the hemoglobin in the sample.
(2) To develop a color former by the reaction of glycated hemoglobin in the sample with amadoriase.
(3) To calculate the amount of glycated hemoglobin by measuring the chromogenic signal of the sample after (1) and (2).
(4) To calculate the amount of hemoglobin by measuring the chromogenic signal of the sample after (1) and (2).
また、測定対象試料が赤血球を含む試料である場合には、1試薬系試薬とは別の手段で溶血及びヘモグロビンの変性を行ってもよい。すなわち、本開示は、一態様において、下記(0)から(4)を含む、試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法であって、下記(2)から(4)を行うために試料と混合する試薬が1つである測定方法に関する。
(0)試料中の赤血球を溶血しヘモグロビンを赤血球から放出すること。
(1)試料中のヘモグロビンを変性すること。
(2)試料中の糖化ヘモグロビンとアマドリアーゼとの反応により発色剤を発色させること。
(3)(1)及び(2)の後の試料の発色シグナルを測定して糖化ヘモグロビン量を算出すること。
(4)(1)及び(2)の後の試料の発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。
In addition, when the measurement target sample is a sample containing red blood cells, hemolysis and denaturation of hemoglobin may be performed by means other than the one reagent-based reagent. That is, the present disclosure is, in one aspect, a method for measuring glycated hemoglobin in a sample, which comprises the following (0) to (4), and a reagent mixed with the sample to perform the following (2) to (4) Relating to the measurement method in which
(0) Hemolysis of erythrocytes in a sample and releasing hemoglobin from the erythrocytes.
(1) Denature the hemoglobin in the sample.
(2) To develop a color former by the reaction of glycated hemoglobin in the sample with amadoriase.
(3) To calculate the amount of glycated hemoglobin by measuring the chromogenic signal of the sample after (1) and (2).
(4) To calculate the amount of hemoglobin by measuring the chromogenic signal of the sample after (1) and (2).
[糖化蛋白直接型アマドリアーゼを用いた実施形態]
本開示に係る測定方法は、一実施形態において、アマドリアーゼとして糖化蛋白質に対して基質特異性を有する(糖化蛋白質に直接作用する)アマドリアーゼ(糖化蛋白直接型アマドリアーゼ)を使用する。
本開示において、「糖化蛋白直接型アマドリアーゼ」は、糖化蛋白質をプロテアーゼ等によりペプチドに分解しなくても糖化蛋白質の糖化部分を基質として反応可能なアマドリアーゼをいう。
[Embodiment using glycated protein direct type amadoriase]
In one embodiment, the measurement method according to the present disclosure uses, as an amadoriase, an amadoriase (which directly acts on a glycated protein) having substrate specificity for a glycated protein (glycated protein direct type amadoriase).
In the present disclosure, "glycated protein direct type amadoriase" refers to an amadoriase that can be reacted using a glycated portion of a glycated protein as a substrate without degrading the glycated protein into a peptide by a protease or the like.
糖化蛋白直接型アマドリアーゼとしては、糖化蛋白直接型フルクトシルペプチドオキシダーゼ(直接型FPOX)、及び、糖化蛋白直接型フルクトシルペプチドデヒドロゲナーゼ(直接型FPDH)が挙げられる(特許文献8及び9)。 As glycated protein direct type amadoriases, glycated protein direct type fructosyl peptide oxidase (direct type FPOX) and glycated protein direct type fructosyl peptide dehydrogenase (direct type FPDH) can be mentioned (Patent Documents 8 and 9).
[直接型FPOXを用いる実施形態A]
本開示に係る測定方法は、限定されない実施形態Aにおいて、下記(1)から(4)を含み、下記(1)から(4)を行うために、あるいは、下記(2)から(4)を行うために、1つの試薬(1試薬系試薬)と試料とを混合することを含む、糖化蛋白質の測定方法である。
(1)試料中の蛋白質を変性すること。
(2)試料中の糖化蛋白質と直接型FPOXとの反応により過酸化水素を生成させること。
(3)生成した過酸化水素とペルオキシダーゼ(POD)との反応により酸化発色剤を発色させること。
(4)発色した酸化発色剤の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。
[Embodiment A using direct type FPOX]
The measurement method according to the present disclosure includes the following (1) to (4) in non-limiting embodiment A, and to perform the following (1) to (4), or the following (2) to (4) It is a measuring method of a glycated protein including mixing one reagent (one reagent system reagent) and a sample in order to carry out.
(1) Denature the protein in the sample.
(2) Generating hydrogen peroxide by the reaction of glycated protein in the sample with direct FPOX.
(3) Coloring the oxidized color former by the reaction between the generated hydrogen peroxide and peroxidase (POD).
(4) To calculate the amount of glycated protein by measuring the color development signal of the oxidized color developing agent that has developed color.
限定されない一又は複数の実施形態において、実施形態Aにおける1試薬系試薬として、下記構成A1〜A3が挙げられる。但し、本開示に係る試薬は、これらの実施形態には限定されない。1試薬系試薬は、さらにその他の成分を含んでもよい。
構成A1
1試薬系試薬:緩衝剤、変性剤、直接型FPOX、POD、酸化発色剤
構成A2
1試薬系試薬:緩衝剤、直接型FPOX、POD、酸化発色剤
構成A3
1試薬系試薬:緩衝剤、直接型FPOX、POD、ロイコ型色素、下記式(I)の化合物
Configuration A1
1 Reagent system reagent: Buffer, denaturant, direct type FPOX, POD, oxidation color former Composition A2
1 Reagent system reagent: Buffer, direct type FPOX, POD, oxidation color former Composition A3
1 Reagent system reagent: Buffer, direct type FPOX, POD, leuco type dye, compound of the following formula (I)
実施形態Aにおける緩衝剤としては、中性付近に調整でき、反応系を損なわないものが使用できる。緩衝剤の限定されない例として、N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid(BES)、3-Morpholinopropanesulfonic acid(MOPS)、N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid(TES)、2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid(HEPES)、N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycine(TRICINE)、Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)(PIPES)、Piperazine-1,4-bis(2-hydroxy-3-propanesulfonic acid)dehydrate(POPSO)、炭酸、リン酸、ホウ酸、グリシン、アラニン、ロイシン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、タウリン、アスパラギン酸、アスパラギン、ヒドロキシプロリン、プロリン、トレオニン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、バリン、システイン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、オルニチン、トリプトファン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ジメチルアミノエタノール、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、N−メチルアミノエタノール、クレアチニン、イミダゾール、バルビタール、アンモニア、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン等が挙げられる。 As the buffer in the embodiment A, one which can be adjusted to near neutrality and which does not impair the reaction system can be used. Nonlimiting examples of buffers include N, N-Bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES), 3-Morpholinopropanesulfonic acid (MOPS), N-Tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid (TES) , 2- [4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperidinyl] ethanesulfonic acid (HEPES), N- [Tris (hydroxymethyl) methyl] glycine (TRICINE), Piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid) ( PIPES), Piperazine-1,4-bis (2-hydroxy-3-propanesulfonic acid) dehydrate (POPSO), carbonic acid, phosphoric acid, boric acid, glycine, alanine, leucine, arginine, lysine, histidine, taurine, aspartic acid, Asparagine, hydroxyproline, proline, threonine, serine, glutamate, glutamine, valine, cysteine, methionine, isoleucine, leucine, tyrosine, phenylalanine, ornithine, tryptophan Trishydroxymethylaminomethane, dimethylaminoethanol, triethanolamine, diethanolamine, monoethanolamine, N- methylaminoethanol, creatinine, imidazole, barbital, ammonia, ethylamine, diethylamine, triethylamine, and the like.
実施形態Aにおけるペルオキシダーゼ(POD)は、過酸化水素と反応して発色基質であるロイコ型色素などの酸化発色剤を発光させるものを使用できる。PODが由来する生物種などは特に限定されない。限定されない例として、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼが挙げられる。 As the peroxidase (POD) in the embodiment A, one which can react with hydrogen peroxide to cause an oxidative color agent such as leuco type dye which is a color forming substrate to emit light can be used. The species of organism from which the POD is derived is not particularly limited. A non-limiting example includes horseradish peroxidase.
実施形態Aの構成A1における変性剤は、蛋白質を変性でき、酵素の活性を大きく損なわないものを使用できる。変性剤の限定されない例として、下記(1)から(8)が挙げられる。なお、(1)〜(7)は亜硝酸と併用してもよい。
(1)3−ラウリルジメチルアミノ酪酸
(2)3−ミリスチルジメチルアミノ酪酸
(3)ラウリルジメチルアミノプロパンスルホン酸
(4)ミリチルジメチルアミノプロパンスルホン酸
(5)ラウリルアミドプロピルジメチルアミノ酪酸
(6)ミリスタミドプロピルベタイン
(7)n−ドデシル−βD−マルトシド
(8)WST−3(2−(4−ヨードフェニル)−3−(2,4−ジニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム)
As the denaturing agent in the constitution A1 of Embodiment A, a denaturing agent which can denature proteins and which does not significantly impair the activity of the enzyme can be used. The following (1) to (8) may be mentioned as non-limiting examples of the modifier. In addition, (1) to (7) may be used in combination with nitrous acid.
(1) 3-lauryl dimethylaminobutyric acid (2) 3-myristyl dimethylaminobutyric acid (3) lauryl dimethylaminopropanesulfonic acid (4) myrityl dimethylaminopropanesulfonic acid (5) laurylamidopropyl dimethylaminobutyric acid (6) myristal Mydopropyl betaine (7) n-dodecyl-βD-maltoside (8) WST-3 (2- (4-iodophenyl) -3- (2,4-dinitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) ) -2H-tetrazolium)
実施形態Aの構成A1及びA2における酸化発色剤は、糖化ヘモグロビン量、ヘモグロビン量の測定を行う場合、ロイコ型色素が好ましい。
前記ロイコ型色素としては、例えば、入手が容易なN−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−4,4−ビス(ジメチルアミノ)ビフェニルアミン(DA−64)、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジン(DA−67)、2,2'−アミノビス(3−エチルベンゾチアゾリノン−6−スルホン酸(ABTS)、ビス−(4−ジエチルアミノフェニル)−2−スルフォフェニルメタン(BSPM)、ビス[3−ビス(4−クロロフェニル)メチル−4−ジメチルアミノフェニル]アミン(BCMA)、10−N−メチルカルバモイル−3,7−ジメチルアミノ−10H−フェノチアジン(MCDP)、o−トリジン、3,3'−ジアミノベンジジン・4HCl(DAB)、3−(4−ヒドロキシフェニル)プロピオン酸(HPPA)、3,3',5,5'−テトラメチルベンジジン(TMBZ)、N−(3−スルホプロピル)−3,3',5,5'−テトラメチルベンジジン・Na(TMBZ−PS)、N,N',N',N'',N''−ヘキサ(3−スルホプロピル)−4,4',4''−トリアミノトリフェニルメタン・6Na(TPM−PS)等が挙げられる。
The oxidized color former in the configurations A1 and A2 of the embodiment A is preferably a leuco-type dye when the amount of glycated hemoglobin and the amount of hemoglobin are measured.
As the leuco-type dye, for example, N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4-bis (dimethylamino) biphenylamine (DA-64), 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3, which is easily available 7-bis (dimethylamino) phenothiazine (DA-67), 2,2'-aminobis (3-ethylbenzothiazolinone-6-sulfonic acid (ABTS), bis- (4-diethylaminophenyl) -2-sulfo Phenylmethane (BSPM), bis [3-bis (4-chlorophenyl) methyl-4-dimethylaminophenyl] amine (BCMA), 10-N-methylcarbamoyl-3,7-dimethylamino-10H-phenothiazine (MCDP), o-tolidine, 3,3'-diaminobenzidine 4HCl (DAB), 3- (4- (4-) Droxyphenyl) propionic acid (HPPA), 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMBZ), N- (3-sulfopropyl) -3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine. Na (TMBZ-PS), N, N ', N', N '', N ''-hexa (3-sulfopropyl) -4,4 ', 4''-triaminotriphenylmethane · 6Na (TPM- PS etc.
実施形態Aの構成A1及びA2における酸化発色剤は、フルクトサミンや糖化アルブミンの測定の場合は、4−アミノアンチピリン(4−AA)若しくは3−メチル−2−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン(MBTH)等のカップラーとフェノール等の色原体との酸化縮合により色素を生成するトリンダー試薬、又は、ロイコ型色素を用いることができる。
トリンダー試薬の水素供与体としては、フェノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン誘導体等が使用可能であり、具体例として、N−(3−スルホプロピル)アニリンナトリウム1水(HALPS)、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3−メチルアニリンナトリウム1水(TOPS)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリンナトリウム1水(MAOS)、N−(3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリンナトリウム1水(HDAPS)、N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリンナトリウム(HDAOS)、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリンナトリウム1水(DAPS)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリンナトリウム(DAOS)、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)アニリンナトリウム(ALPS)、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリンナトリウム1水(ADPS)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリンナトリウム2水(ADOS)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−m−トルイジン(TOOS)、N,N−ビス(4−スルホブチル)−3−メチルアニリン2ナトリウム(TODB)等が挙げられる。
In the case of measurement of fructosamine and glycated albumin, the oxidative color former in configurations A1 and A2 of Embodiment A is, for example, 4-aminoantipyrine (4-AA) or 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone (MBTH) in the case of measurement of glycated albumin. A Trinder reagent or a leuco-type dye can be used which produces a dye by oxidative condensation of a coupler and a chromogen such as phenol.
A phenol derivative, an aniline derivative, a toluidine derivative etc. can be used as a hydrogen donor of Trinder's reagent, A N- (3-sulfopropyl)
実施形態Aの構成A1及びA2は、さらに、色素安定剤、例えば、還元剤や界面活性剤などを含んでもよい。 Configurations A1 and A2 of Embodiment A may further include a dye stabilizer, such as a reducing agent or surfactant.
実施形態Aの構成A3においては、変性剤と色素安定剤の2つの機能を発揮しうる式(I)の化合物が含まれる。式(I)において、Rの炭素数は、酵素法測定を阻害しない観点及びロイコ型色素の安定性向上の観点から、8から17が好ましく、12から16がより好ましく、14がさらに好ましい。Rの炭化水素基は、同様の観点から、アルキル基が好ましく、直鎖アルキル基が好ましい。Rは、同様の観点から、ドデシル基及びテトラデシル基が好ましく、テトラデシル基がより好ましい。 Configuration A3 of Embodiment A includes compounds of Formula (I) that can perform the dual functions of modifier and dye stabilizer. In the formula (I), the number of carbon atoms of R is preferably 8 to 17, more preferably 12 to 16, and still more preferably 14 from the viewpoint of not inhibiting the measurement by the enzyme method and the stability improvement of the leuco dye. The hydrocarbon group of R is preferably an alkyl group from the same viewpoint, and a linear alkyl group is preferable. From the same viewpoint, R is preferably a dodecyl group and a tetradecyl group, and more preferably a tetradecyl group.
実施形態Aにおける測定対象試料は、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを含む試料が挙げられる。測定対象試料は、限定されない一又は複数の実施形態において、全血、血球等の赤血球を含む試料や、該試料を溶血させた試料が挙げられる。測定対象試料が赤血球を含む試料である場合、1試薬系試薬で溶血してもよく、1試薬系試薬とは別の手段で溶血させて溶血試料としてもよい。赤血球の溶血は既存の方法で実施できる。例えば、浸透圧を用いる方法(例、水)、界面活性剤を用いる方法、凍結する方法、超音波を用いる方法などがある。 The sample to be measured in Embodiment A includes a sample containing hemoglobin and glycated hemoglobin. The sample to be measured includes, in one or more non-limiting embodiments, a sample containing red blood cells such as whole blood and blood cells, and a sample obtained by hemolyzing the sample. When the sample to be measured is a sample containing red blood cells, hemolysis may be performed with one reagent-based reagent, or hemolysis sample may be used as hemolysis by means other than the one reagent-based reagent. Hemolysis of red blood cells can be performed by existing methods. For example, there are a method using osmotic pressure (eg, water), a method using a surfactant, a method of freezing, a method using ultrasonic waves, and the like.
本開示において発色シグナルとしては、一又は複数の実施形態において、吸光度、反射率及び透過率等が挙げられる。 In the present disclosure, the chromogenic signal includes, in one or more embodiments, absorbance, reflectance, transmittance, and the like.
糖化蛋白質量の算出は、一又は複数の実施形態において、測定により得られた発色シグナルを、所定の換算要素に基づき糖化蛋白質量に換算することを含む。所定の換算要素に基づく糖化蛋白質量の換算は、一又は複数の実施形態において、測定により得られた吸光度等の発色シグナルを、下記(i)〜(iv)のいずれかの換算ルールに基づいて糖化蛋白質量に換算することにより行うことができる。(iv)は、(i)〜(iii)と組み合わせて行ってもよい。
(i)試料中にある既知の検量物質に基づき検量線を求め、HbA1c由来の吸光度を検量線に基づきHbA1c量に換算すること
(ii)発色色素を検量物質(校正用物質)とし、発色色素の検量線を求め、発色色素の吸光度を該発色色素の検量線に基づき糖化蛋白質量に換算すること
(iii)異なる波長で求めた吸光度比をとって、吸光度比に対する検量線に基づき糖化蛋白質量に換算すること
(iv)試料と試薬との混合直後及び混合から所定の時間経過後に測定した吸光度の差を取って吸光度変化量を求め、吸光度変化量に対する検量線に基づき糖化蛋白質量に換算すること
(i)における既知の検量物質としては、一又は複数の実施形態において、既知量のHbA1cを含む校正用標準物質が挙げられる。既知量のHbA1cを含む校正用標準物質としては、一又は複数の実施形態において、全血又は血球の凍結品、それらを精製したHbA1cを含むHb溶液、又はそれらに緩衝液組成物及びHbの安定剤等を含む物質等が挙げられる。既知の検量物質としては、一又は複数の実施形態において、公的機関が提供している一次標準物質又は常用標準物質、キットに付属している校正物質等が挙げられる。
(iv)における混合直後としては、一又は複数の実施形態において、試料と試薬との混合から5秒〜30秒程度が挙げられる。所定の時間経過後としては、一又は複数の実施形態において、試料と試薬との混合から1分〜3分程度が挙げられる。
なお、上記形態では、発色シグナルが吸光度である場合の一例であって、吸光度以外の反射率及び透過率であっても同様に行うことができる。
The calculation of the amount of glycated protein includes, in one or more embodiments, converting the chromogenic signal obtained by the measurement into the amount of glycated protein based on a predetermined conversion factor. In one or more embodiments, conversion of the glycated protein mass based on a predetermined conversion factor is based on one of the following conversion rules (i) to (iv) of a chromogenic signal such as absorbance obtained by measurement: It can carry out by converting into the amount of glycated protein. (Iv) may be performed in combination with (i) to (iii).
(I) Obtain a calibration curve based on a known calibration substance in the sample, and convert the absorbance derived from HbA1c to the amount of HbA1c based on the calibration curve (ii) Using the chromogenic dye as a calibration substance (substance for calibration) And calculate the absorbance of the color forming dye based on the calibration curve of the color forming dye (iii) taking the absorbance ratios determined at different wavelengths, the weight of the glycated protein based on the calibration curve relative to the absorbance ratio Convert to (iv) Calculate the difference in absorbance after taking the difference between the absorbance measured immediately after mixing the sample and the reagent and after a predetermined time from mixing, and convert it to the amount of glycated protein based on the calibration curve for the amount of absorbance change. Known calibrators in (i) include, in one or more embodiments, calibration standards containing known amounts of HbA1c. The calibration standard containing known amounts of HbA1c includes, in one or more embodiments, frozen whole blood or blood cells, Hb solution containing HbA1c purified from them, or buffer composition and Hb stability thereof And the like. The known calibration substance includes, in one or more embodiments, a primary standard substance or routine standard substance provided by a public organization, a calibration substance attached to a kit, and the like.
Immediately after mixing in (iv), in one or more embodiments, about 5 seconds to 30 seconds may be mentioned from the mixing of the sample and the reagent. After a predetermined time has elapsed, in one or more embodiments, about 1 minute to 3 minutes may be mentioned from the mixing of the sample and the reagent.
In addition, in the said form, it is an example in case a color development signal is a light absorbency, Comprising: It can carry out similarly, even if it is reflectance and the transmittance | permeability other than a light absorbency.
実施形態Aにおける測定対象が糖化ヘモグロビンであり、糖化ヘモグロビン比率(ヘモグロビン量に対する糖化ヘモグロビン量の比率)を測定する実施形態Aaとして、下記(1)から(5)を含み、下記(1)から(5)を行うために1つの試薬(1試薬系試薬)と試料とを混合することを含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法が挙げられる。
実施形態Aa
(1)試料中のヘモグロビンを変性すること。
(2)試料中の糖化ヘモグロビンと直接型FPOXとの反応により過酸化水素を生成させること。
(3)生成した過酸化水素とペルオキシダーゼ(POD)との反応によりロイコ型色素を発色させること。
(4)発色したロイコ型色素の発色シグナルを測定して糖化ヘモグロビン量を算出すること。
(5)変性したヘモグロビンの発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。
An object to be measured in Embodiment A is glycated hemoglobin, and Embodiment Aa in which the ratio of glycated hemoglobin (ratio of the amount of glycated hemoglobin to the amount of hemoglobin) is measured includes the following (1) to (5). The method of measuring the glycated hemoglobin ratio includes mixing one sample (one reagent-based reagent) with the sample to perform 5).
Embodiment Aa
(1) Denature the hemoglobin in the sample.
(2) Generating hydrogen peroxide by the reaction of glycated hemoglobin in a sample with direct FPOX.
(3) Coloring a leuco-type dye by the reaction of generated hydrogen peroxide and peroxidase (POD).
(4) Calculate the amount of glycated hemoglobin by measuring the color development signal of the colored leuco dye.
(5) To calculate the amount of hemoglobin by measuring the color development signal of denatured hemoglobin.
実施形態Aにおける測定対象が糖化ヘモグロビンであり、糖化ヘモグロビン比率(ヘモグロビン量に対する糖化ヘモグロビン量の比率)を測定する実施形態Abとして、下記(0)から(5)を含み、下記(2)から(5)を行うために1つの試薬(1試薬系試薬)と試料とを混合することを含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法が挙げられる。
実施形態Ab
(0)試料中の赤血球を溶血しヘモグロビンを赤血球から放出すること。
(1)試料中のヘモグロビンを変性すること。
(2)試料中の糖化ヘモグロビンと直接型FPOXとの反応により過酸化水素を生成させること。
(3)生成した過酸化水素とペルオキシダーゼ(POD)との反応によりロイコ型色素を発色させること。
(4)発色したロイコ型色素の発色シグナルを測定して糖化ヘモグロビン量を算出すること。
(5)変性したヘモグロビンの発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。
An object to be measured in embodiment A is glycated hemoglobin, and an embodiment Ab for measuring a glycated hemoglobin ratio (ratio of the amount of glycated hemoglobin to the amount of hemoglobin) includes the following (0) to (5). The method of measuring the glycated hemoglobin ratio includes mixing one sample (one reagent-based reagent) with the sample to perform 5).
Embodiment Ab
(0) Hemolysis of erythrocytes in a sample and releasing hemoglobin from the erythrocytes.
(1) Denature the hemoglobin in the sample.
(2) Generating hydrogen peroxide by the reaction of glycated hemoglobin in a sample with direct FPOX.
(3) Coloring a leuco-type dye by the reaction of generated hydrogen peroxide and peroxidase (POD).
(4) Calculate the amount of glycated hemoglobin by measuring the color development signal of the colored leuco dye.
(5) To calculate the amount of hemoglobin by measuring the color development signal of denatured hemoglobin.
実施形態Aa及びAbは、さらに、糖化ヘモグロビン量とヘモグロビン量とから糖化ヘモグロビン比率を算出することを含みうる。
また、実施形態Aa及びAbにおいて、糖化ヘモグロビンは、一又は複数の実施形態において、ヘモグロビンA1cである。
Embodiments Aa and Ab may further include calculating a glycated hemoglobin ratio from the amount of glycated hemoglobin and the amount of hemoglobin.
In embodiments Aa and Ab, glycated hemoglobin is hemoglobin A1c in one or more embodiments.
実施形態Aにおける測定対象が糖化ヘモグロビン以外の糖化蛋白質(例えば、糖化アルブミンなど)であり、糖化蛋白質比率(蛋白質量に対する糖化蛋白質量の比率)を測定する場合、一又は複数の実施形態において、本開示に係る測定で得られる糖化蛋白質量と、別の方法で得られる蛋白質量から糖化蛋白質比率を求めることができる。糖化ヘモグロビン比率もこの方法で求めてもよい。
蛋白質量を求める方法は、例えば、ビウレット反応法、Folin phenol試薬を用いたLowry法、Coomassie G−250を用いたBradford(Coomassie)法などが挙げられ、アルブミンの場合には、BCG法やBCP法が挙げられる。
In one or more embodiments, when the measurement target in embodiment A is a glycated protein other than glycated hemoglobin (for example, glycated albumin etc.) and the glycated protein ratio (ratio of glycated protein mass to protein mass) is measured. The ratio of glycated protein can be determined from the amount of glycated protein obtained by the measurement according to the disclosure and the amount of protein obtained by another method. The glycated hemoglobin ratio may also be determined by this method.
Examples of methods for determining the amount of protein include the Biuret reaction method, Lowry method using Folin phenol reagent, Bradford (Coomassie) method using Coomassie G-250, etc. In the case of albumin, BCG method and BCP method Can be mentioned.
[実施形態Aの用事調製形態]
実施形態Aにおける1試薬系試薬は、流通段階では試薬の安定性の観点などから、1つの試薬でなくてもよい。本開示に係る測定方法を行う段階で用事調製してもよい。このような実施形態における1試薬系試薬を調製するための、限定されない2試薬の構成として下記構成A4からA9が挙げられる。但し、本開示に係る試薬は、これらの実施形態には限定されない。試薬は、さらにその他の成分を含んでもよい。
構成A4
試薬1:緩衝剤、変性剤、直接型FPOX、POD
試薬2:緩衝剤、酸化発色剤
構成A5
試薬1:緩衝剤、直接型FPOX、POD
試薬2:緩衝剤、変性剤、酸化発色剤
構成A6
試薬1:緩衝剤、POD
試薬2:緩衝剤、変性剤、直接型FPOX、酸化発色剤
構成A7
試薬1:緩衝剤、変性剤、POD
試薬2:緩衝剤、直接型FPOX、酸化発色剤
構成A8
試薬1:緩衝剤、直接型FPOX、POD
試薬2:緩衝剤、酸化発色剤
構成A9
試薬1:緩衝剤、POD
試薬2:緩衝剤、直接型FPOX、酸化発色剤
[Form of Administration Preparation of Embodiment A]
One reagent-based reagent in Embodiment A may not be a single reagent in terms of the stability of the reagent in the distribution stage, and the like. The preparation may be made at the stage of performing the measurement method according to the present disclosure. The following configurations A4 to A9 can be mentioned as configurations of two non-limiting reagents for preparing one reagent-based reagent in such an embodiment. However, the reagent according to the present disclosure is not limited to these embodiments. The reagent may further contain other components.
Configuration A4
Reagent 1: Buffer, denaturant, direct FPOX, POD
Reagent 2: Buffer, oxidative color former Composition A5
Reagent 1: Buffer, direct type FPOX, POD
Reagent 2: Buffer, denaturing agent, oxidation color former Composition A6
Reagent 1: Buffer, POD
Reagent 2: Buffering agent, denaturing agent, direct type FPOX, oxidation color former Composition A7
Reagent 1: Buffer, denaturant, POD
Reagent 2: Buffer, Direct FPOX, Oxidative Coloring Agent Composition A8
Reagent 1: Buffer, direct type FPOX, POD
Reagent 2: Buffer, Oxidative Colorant Composition A9
Reagent 1: Buffer, POD
Reagent 2: Buffer, direct type FPOX, oxidation color former
実施形態Aの構成A4からA9は、さらに、色素安定剤、例えば、還元剤や界面活性剤などを含んでもよい。また、構成A4からA9における緩衝剤、変性剤、酸化発色剤は、上述のものが使用できる。また、構成A4からA9において、変性剤及び/又は色素安定剤は、式(I)の化合物であってもよい。 Configurations A4 to A9 of Embodiment A may further comprise dye stabilizers, such as reducing agents, surfactants, and the like. Further, as the buffer, the modifier, and the oxidative color former in the configurations A4 to A9, those described above can be used. Also, in configurations A4 to A9, the modifier and / or the dye stabilizer may be a compound of formula (I).
本開示において「用事調製形態」とは、1又は複数の試料について本開示に係る測定方法をする場合に、1又は複数の試料用に、複数の試薬から1試薬系試薬を調製することを含む形態をいう。 In the present disclosure, the “form of business preparation” includes preparation of one reagent-based reagent from a plurality of reagents for one or a plurality of samples when the measurement method according to the present disclosure is performed on one or a plurality of samples. It says a form.
[直接型FPDHを用いる実施形態B]
本開示に係る測定方法は、限定されない実施形態Bにおいて、下記(1)から(3)を含み、下記(1)から(3)を行うために、あるいは、下記(2)から(3)を行うために、1つの試薬(1試薬系試薬)と試料とを混合することを含む、糖化蛋白質の測定方法である。
(1)試料中の蛋白質を変性すること。
(2)試料中の糖化蛋白質と直接型FPDHとの反応により還元発色剤を発色させること。
(3)発色した還元発色剤の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。
[Embodiment B using direct type FPDH]
The measurement method according to the present disclosure includes the following (1) to (3) in non-limiting embodiment B, and to perform the following (1) to (3), or the following (2) to (3) It is a measuring method of a glycated protein including mixing one reagent (one reagent system reagent) and a sample in order to carry out.
(1) Denature the protein in the sample.
(2) To develop a reduced color former by the reaction between the glycated protein in the sample and the direct type FPDH.
(3) To calculate the amount of glycated protein by measuring the color development signal of the reduced color former that has developed color.
限定されない一又は複数の実施形態において、実施形態Bにおける1試薬系試薬として、下記構成B1及びB2が挙げられる。但し、本開示に係る試薬は、これらの実施形態には限定されない。1試薬系試薬は、さらにその他の成分を含んでもよい。
構成B1
1試薬系試薬:緩衝剤、変性剤、直接型FPDH、還元発色剤
構成B2
1試薬系試薬:緩衝剤、直接型FPDH、還元発色剤
In one or more non-limiting embodiments, one reagent-based reagent in embodiment B includes the following configurations B1 and B2. However, the reagent according to the present disclosure is not limited to these embodiments. One reagent-based reagent may further contain other components.
Configuration B1
1 Reagent-based reagent: Buffer, denaturant, direct type FPDH, reduced color former Composition B2
1 Reagent-based reagent: Buffer, direct type FPDH, reduced color former
実施形態Bにおける緩衝剤、変性剤、及び測定対象試料は、実施形態Aと同様である。 The buffer, the denaturing agent, and the sample to be measured in Embodiment B are the same as in Embodiment A.
実施形態Bにおける還元発色剤としては、テトラゾリウム塩などが使用できる。
テトラゾリウム塩としては、2,5−ジフェニル−3−(1−ナフチル)−2H−テトラゾリウムクロリド<略称テトラゾリウムバイオレット>、3,3′−(3,3′−ジメトキシ−4,4′−ビフェニレン)−ビス[2−(p−ニトロフェニル)−5−フェニルテトラゾリウムクロリド]<略称ニトロブルーテトラゾリウム>、3,3′−(3,3′−ジメトキシ−4,4′−ビフェニレン)−ビス(2,5−ジフェニルテトラゾリウムクロリド)<略称ブルーテトラゾリウム>、3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド<略称MTT>、3−(p−ヨードフェニル)−2−(p−ニトロフェニル)−5−フェニル−テトラゾリウムクロリド、2,2′,5,5′−テトラ−(p−ニトロフェニル)−3,3′−(3−ジメトキシ−4−ジフェニレン)−ジテトラゾリウムクロリド<略称ニトロブルーテトラゾリウム>、2,3,5−トリフェニルテトラゾリウムクロリド、3,3′−(3,3′−ジメトキシ−4,4′−ビフェニレン)−ビス−[2,5−ビス(p−ニトロフェニル)テトラゾリウムクロリド]、3,3′−(4,4′−ビフェニレン)−ビス(2,5−ジフェニルテトラゾリウムクロリド)、2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−フェニル−2H−テトラゾリウム塩化物<略称INT>、3,3′−[3,3′−ジメトキシ−(1,1′−ビフェニル)−4,4′−ジイル]−ビス[2−(4−ニトロフェニル)−5−フェニル]−2Hテトラゾリウム塩化物<略称ニトロ−TB>、2−ベンゾチアゾイル−3−(4−カルボキシ−2−メトキシフェニル)−5−[4−(2−スルホエチルカルバモイル)フェニル]−2H−テトラゾリウム<略称WST−4>、2,2′−ジベンゾチアゾイル−5,5′−ビス[4−ジ(2−スルホエチル)カルバモイルフェニル]−3,3′−(3,3′−ジメトキシ−4,4′−ジフェニレン)ジテトラゾリウム2ナトリウム塩<略称WST−5>などが挙げられる。
これらの中でも、WST−4及びWST−5は、水溶性が高く試薬として調整しやすい上に、長波長域に吸収を有しておりヘモグロビンなどの蛋白質の吸収の影響を受け難い特徴がある。
As the reduced color former in Embodiment B, a tetrazolium salt can be used.
As a tetrazolium salt, 2,5-diphenyl-3- (1-naphthyl) -2H-tetrazolium chloride <abbreviated tetrazolium violet>, 3,3 '-(3,3'-dimethoxy-4,4'-biphenylene)- Bis [2- (p-nitrophenyl) -5-phenyltetrazolium chloride] <abbreviated as nitro blue tetrazolium>, 3,3 ′-(3,3′-dimethoxy-4,4′-biphenylene) -bis (2,5) -Diphenyltetrazolium chloride) <abbreviated blue tetrazolium>, 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide <abbreviated MTT>, 3- (p-iodophenyl) -2- (p -Nitrophenyl) -5-phenyl-tetrazolium chloride, 2,2 ', 5,5'-tetra- (p-nit) Phenyl) -3,3 '-(3-dimethoxy-4-diphenylene) -ditetrazolium chloride (abbreviated as nitro blue tetrazolium), 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride, 3,3'-(3,3 '-(3,3'-) Dimethoxy-4,4'-biphenylene) -bis- [2,5-bis (p-nitrophenyl) tetrazolium chloride], 3,3 '-(4,4'-biphenylene) -bis (2,5-diphenyltetrazolium) Chloride), 2- (4-iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5-phenyl-2H-tetrazolium chloride <abbreviation INT>, 3,3 '-[3,3'-dimethoxy- (1 1,1'-biphenyl) -4,4'-diyl] -bis [2- (4-nitrophenyl) -5-phenyl] -2H tetrazolium chloride <abbr. B>, 2-benzothiazoyl-3- (4-carboxy-2-methoxyphenyl) -5- [4- (2-sulfoethylcarbamoyl) phenyl] -2H-tetrazolium <abbreviation WST-4>, 2, 2 '-Dibenzothiazoyl-5,5'-bis [4-di (2-sulfoethyl) carbamoylphenyl] -3,3'-(3,3'-dimethoxy-4,4'-diphenylene) ditetrazolium disodium salt <Abbreviated WST-5> and the like can be mentioned.
Among these, WST-4 and WST-5 are high in water solubility, easy to be adjusted as a reagent, and have characteristics of having absorption in a long wavelength range and being less susceptible to absorption of proteins such as hemoglobin.
実施形態Bの構成B1及びB2は、さらに、色素安定剤が含まれてもよい。色素安定剤としては、アジ化ナトリウム(WO2003/029229)、pH調整剤(特開2009-072136)などが挙げられる。 Configurations B1 and B2 of Embodiment B may further include a dye stabilizer. Examples of dye stabilizers include sodium azide (WO 2003/029229), pH adjusters (JP 2009-072136) and the like.
実施形態Bの構成B1及びB2には、電子伝達剤が含まれてもよい。電子伝達剤としては、ジアホラーゼ、N−メチルフェナジン・メトサルフェート類(例えばN−メチルフェナジン・メトサルフェート、1−メトキシ−5−メチルフェナジン・メトサルフェート(1−メトキシPMS)等)、メルドラブルー、メチレンブルーなどが挙げられる。 The configurations B1 and B2 of Embodiment B may include an electron transfer agent. Examples of electron transfer agents include diaphorase, N-methylphenazine methosulfates (eg N-methylphenazine methosulfate, 1-methoxy-5-methylphenazine methosulfate (1-methoxy PMS), etc.), meldola blue, Methylene blue etc. are mentioned.
実施形態Bにおける発色シグナル及び糖化蛋白質量の測定は、実施形態Aと同様である。 The measurement of the chromogenic signal and the amount of glycated protein in Embodiment B are the same as in Embodiment A.
実施形態Bにおける測定対象が糖化ヘモグロビンであり、糖化ヘモグロビン比率(ヘモグロビン量に対する糖化ヘモグロビン量の比率)を測定する実施形態Baとして、下記(1)から(4)を含み、下記(1)から(4)を行うために1つの試薬(1試薬系試薬)と試料とを混合することを含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法が挙げられる。
実施形態Ba
(1)試料中のヘモグロビンを変性すること。
(2)試料中の糖化ヘモグロビンと直接型FPDHとの反応により還元発色剤を発色させること。
(3)発色した還元発色剤の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。
(4)変性したヘモグロビンの発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。
An object to be measured in Embodiment B is glycated hemoglobin, and an embodiment Ba for measuring a glycated hemoglobin ratio (ratio of the amount of glycated hemoglobin to the amount of hemoglobin) includes the following (1) to (4). The method of measuring the glycated hemoglobin ratio includes mixing one sample (one reagent-based reagent) and the sample to perform 4).
Embodiment Ba
(1) Denature the hemoglobin in the sample.
(2) To develop a reduced color former by the reaction of glycated hemoglobin in the sample with direct FPDH.
(3) To calculate the amount of glycated protein by measuring the color development signal of the reduced color former that has developed color.
(4) To calculate the amount of hemoglobin by measuring the chromogenic signal of denatured hemoglobin.
実施形態Bにおける測定対象が糖化ヘモグロビンであり、糖化ヘモグロビン比率(ヘモグロビン量に対する糖化ヘモグロビン量の比率)を測定する実施形態Bbとして、下記(0)から(4)を含み、下記(2)から(4)を行うために1つの試薬(1試薬系試薬)と試料とを混合することを含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法が挙げられる。
実施形態Bb
(0)試料中の赤血球を溶血しヘモグロビンを赤血球から放出すること。
(1)試料中のヘモグロビンを変性すること。
(2)試料中の糖化ヘモグロビンと直接型FPDHとの反応により還元発色剤を発色させること。
(3)発色した還元発色剤の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。
(4)変性したヘモグロビンの発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。
The measurement target in the embodiment B is glycated hemoglobin, and the embodiment Bb for measuring the glycated hemoglobin ratio (ratio of the amount of glycated hemoglobin to the amount of hemoglobin) includes the following (0) to (4), and The method of measuring the glycated hemoglobin ratio includes mixing one sample (one reagent-based reagent) and the sample to perform 4).
Embodiment Bb
(0) Hemolysis of erythrocytes in a sample and releasing hemoglobin from the erythrocytes.
(1) Denature the hemoglobin in the sample.
(2) To develop a reduced color former by the reaction of glycated hemoglobin in the sample with direct FPDH.
(3) To calculate the amount of glycated protein by measuring the color development signal of the reduced color former that has developed color.
(4) To calculate the amount of hemoglobin by measuring the chromogenic signal of denatured hemoglobin.
実施形態Ba及びBbは、さらに、糖化ヘモグロビン量とヘモグロビン量とから糖化ヘモグロビン比率を算出することを含みうる。
また、本実施形態Ba及びBbにおいて、糖化ヘモグロビンは、一又は複数の実施形態において、ヘモグロビンA1cである。
Embodiments Ba and Bb may further include calculating a glycated hemoglobin ratio from the amount of glycated hemoglobin and the amount of hemoglobin.
In the present embodiments Ba and Bb, glycated hemoglobin is hemoglobin A1c in one or more embodiments.
実施形態Bにおける測定対象が糖化ヘモグロビン以外の糖化蛋白質(例えば、糖化アルブミンなど)であり、糖化蛋白質比率(蛋白質量に対する糖化蛋白質量の比率)を測定する場合、一又は複数の実施形態において、本開示に係る測定で得られる糖化蛋白質量と、別の方法で得られる蛋白質量から糖化蛋白質比率を求めることができる。糖化ヘモグロビン比率もこの方法で求めてもよい。蛋白質量を求める方法は、例えば、上述したものがあげられる。 In one or more embodiments, when the measurement target in embodiment B is a glycated protein other than glycated hemoglobin (for example, glycated albumin etc.) and the glycated protein ratio (ratio of glycated protein mass to protein mass) is measured. The ratio of glycated protein can be determined from the amount of glycated protein obtained by the measurement according to the disclosure and the amount of protein obtained by another method. The glycated hemoglobin ratio may also be determined by this method. Examples of methods for determining the amount of protein include those described above.
[実施形態Bの用事調製形態]
実施形態Bにおける1試薬系試薬は、流通段階では試薬の安定性の観点などから、1つの試薬でなくてもよい。本開示に係る測定方法を行う段階で用事調製してもよい。このような実施形態における1試薬系試薬を調製するための、限定されない2試薬の構成として下記構成B3及びB4が挙げられる。
構成B3
試薬1:緩衝剤、変性剤、直接型FPDH
試薬2:緩衝剤、還元発色剤
構成B4
試薬1:緩衝剤、直接型FPDH
試薬2:緩衝剤、還元発色剤
[Form of Administration Preparation of Embodiment B]
One reagent-based reagent in the embodiment B may not be one reagent in terms of the stability of the reagent or the like at the distribution stage. The preparation may be made at the stage of performing the measurement method according to the present disclosure. The following configurations B3 and B4 can be mentioned as configurations of two non-limiting reagents for preparing one reagent-based reagent in such an embodiment.
Configuration B3
Reagent 1: Buffer, denaturant, direct type FPDH
Reagent 2: Buffer, reducing color former Composition B4
Reagent 1: Buffer, direct type FPDH
Reagent 2: Buffer, reducing color former
実施形態Bの構成B3及びB4は、さらに、上述の色素安定剤及び/又は電子伝達剤を含んでもよい。
また、構成B3及びB4における緩衝剤、変性剤、及び還元発色剤は、上述のものが使用できる。
Configurations B3 and B4 of Embodiment B may further include the above-mentioned dye stabilizer and / or electron transfer agent.
As the buffer, the modifier and the reducing color former in the configurations B3 and B4, those described above can be used.
[アマドリアーゼ及びプロテアーゼを用いる実施形態]
本開示に係る測定方法は、その他の一実施形態において、アマドリアーゼとしてN末端糖化ペプチド及び糖化アミノ酸(以下、単に「糖化ペプチド」ともいう)に対して基質特異性を有するアマドリアーゼを使用する。該アマドリアーゼとしては、フルクトシルペプチドオキシダーゼ(FPOX)、及び、フルクトシルペプチドデヒドロゲナーゼ(FPDH)が挙げられる。
フルクトサミンや糖化アルブミンの測定に用いられるアマドリアーゼとしては、リジンのεアミノ基が糖化されたアミノ酸及び/又はεアミノ基が糖化されたペプチドによく作用する糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素を用いることができる。例としては、ギベレラ(Gibberella)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、カンジダ(Candida)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フサリウム(Fusarium)属、アクレモニウム(Acremonium)属又はデバリオマイゼス(Debaryomyces)属由来のオキシダーゼ等が挙げられる。
[Embodiment Using Amadoriase and Protease]
In another embodiment, the measurement method according to the present disclosure uses, as an amadoriase, an N-terminal glycated peptide and an amadoriase having substrate specificity for a glycated amino acid (hereinafter, also simply referred to as "glycated peptide"). The amadoriase includes fructosyl peptide oxidase (FPOX) and fructosyl peptide dehydrogenase (FPDH).
As an amadoriase used for the measurement of fructosamine and glycated albumin, an amino acid in which the ε amino group of lysine is glycated and / or an enzyme which acts on a glycated amino acid and / or a glycated peptide which functions well on a peptide in which the ε amino group is glycosylated It can be used. For example, an oxidase derived from Gibberella, Aspergillus, Candida, Penicillium, Fusarium, Acremonium or Debaryomyces, etc. Can be mentioned.
[FPOXを用いる実施形態C]
本開示に係る測定方法は、限定されない実施形態Cにおいて、下記(1)から(5)を含み、下記(1)から(5)を行うために、あるいは、下記(2)から(5)を行うために、1つの試薬(1試薬系試薬)と試料とを混合することを含む、糖化蛋白質の測定方法である。
(1)試料中の蛋白質を変性すること。
(2)試料中の糖化蛋白質とプロテアーゼとの反応により糖化ペプチドを生成させること。
(3)糖化ペプチドとFPOXとの反応により過酸化水素を生成させること。
(4)生成した過酸化水素とペルオキシダーゼとの反応により酸化発色剤を発色させること。
(5)発色した酸化発色剤の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。
[Embodiment C using FPOX]
The measurement method according to the present disclosure includes the following (1) to (5) in non-limiting embodiment C, and to perform the following (1) to (5), or the following (2) to (5) It is a measuring method of a glycated protein including mixing one reagent (one reagent system reagent) and a sample in order to carry out.
(1) Denature the protein in the sample.
(2) To form a glycated peptide by the reaction of a glycated protein in a sample with a protease.
(3) Generating hydrogen peroxide by the reaction of a glycated peptide with FPOX.
(4) Coloring the oxidized color former by the reaction between the generated hydrogen peroxide and the peroxidase.
(5) To calculate the amount of glycated protein by measuring the color development signal of the oxidized color developing agent that has developed color.
限定されない一又は複数の実施形態において、実施形態Cにおける1試薬系試薬として、下記構成C1からC3が挙げられる。但し、本開示に係る試薬は、これらの実施形態には限定されない。1試薬系試薬は、さらにその他の成分を含んでもよい。
構成C1
1試薬系試薬:緩衝剤、変性剤、プロテアーゼ、FPOX、POD、酸化発色剤
構成C2
1試薬系試薬:緩衝剤、プロテアーゼ、FPOX、POD、酸化発色剤
構成C3
1試薬系試薬:緩衝剤、プロテアーゼ、FPOX、POD、ロイコ型色素、式(I)の化合物
In one or more non-limiting embodiments, one reagent-based reagent in embodiment C includes the following configurations C1 to C3. However, the reagent according to the present disclosure is not limited to these embodiments. One reagent-based reagent may further contain other components.
Configuration C1
1 Reagent-based reagent: Buffer, denaturant, protease, FPOX, POD, oxidative color former Composition C2
1 Reagent-based reagent: Buffer, Protease, FPOX, POD, Oxidative coloring agent Composition C3
1 Reagent system reagent: buffer, protease, FPOX, POD, leuco type dye, compound of formula (I)
実施形態Cの構成C1からC3は、さらに、上述の色素安定剤を含んでもよい。
構成C1からC3における緩衝剤、変性剤、POD、酸化発色剤、ロイコ型色素、式(I)の化合物、及び測定対象試料については、実施形態Aと同様である。
Configurations C1 to C3 of Embodiment C may further comprise the dye stabilizers described above.
The buffer, the modifier, the POD, the oxidative color developing agent, the leuco-type dye, the compound of the formula (I), and the sample to be measured in the configurations C1 to C3 are the same as in the embodiment A.
実施形態Cにおけるプロテアーゼとしては、中性付近で活性をもち、糖化ヘモグロビンと反応してN末端糖化ペプチド(本開示において、糖化アミノ酸を含む)を生成できるものを使用できる。産生生物種や酵素ファミリーは特に限定されない。プロテアーゼの限定されない例として、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、グルタミックプロテアーゼ、アスパラティックプロテアーゼ、メタロプロテアーゼなどが挙げられる。
実施形態Cにおけるプロテアーゼとしては、バチルス属、アスペルギルス属、ストレプトマイセス属などの微生物由来のプロテアーゼが挙げられる。その他、セリンプロテアーゼも好ましい。
また測定対象が糖化アルブミンである場合にはバチルス属及びストレプトマイセス属の微生物由来プロテアーゼがヒトアルブミンに対する作用が大きい為より好ましく、バチルス属由来プロテアーゼ、たとえばズブチリシン(Subtilisin)、ナガーゼ、プロテアーゼ−タイプ−VIII、−IX、−X、−XV、−XXIV、−XXVII、−XXXI(以上シグマ社製)、サーモリシン(Thermolysin)、ニュートラーゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、デュラザイム、バイオフィードプロ、アルカラーゼ、(以上ノボノルディスクバイオインダストリー社製)等が特に好ましく、ズブチリシン、ナガーゼ、プロテアーゼ−タイプ−XXVIIなどがより特に好ましい。
As the protease in embodiment C, one having an activity near neutral and capable of reacting with glycated hemoglobin to produce an N-terminal glycated peptide (including a glycated amino acid in the present disclosure) can be used. The production species and enzyme family are not particularly limited. Non-limiting examples of proteases include serine proteases, threonine proteases, glutamic proteases, asparatic proteases, metalloproteases and the like.
Examples of the protease in Embodiment C include proteases derived from microorganisms such as Bacillus, Aspergillus, Streptomyces and the like. In addition, serine proteases are also preferred.
When the measurement target is glycated albumin, a microorganism-derived protease of Bacillus and Streptomyces is more preferable because it has a greater effect on human albumin, and a Bacillus-derived protease such as subtilisin, Nagase, protease-type- VIII, -IX, -X, -XV, -XXIV, -XXVII, -XXXI (all manufactured by Sigma), thermolysin (Thermolysin), neutrase, esperase, savinase, durazyme, biofeed pro, alcalase, Disc bio-industry) and the like are particularly preferable, and subtilisin, nagase, protease-type-XXVII and the like are more preferable.
実施形態Cにおける発色シグナル及び糖化蛋白質量の測定は、実施形態Aと同様である。 The measurement of the chromogenic signal and the amount of glycated protein in Embodiment C are the same as in Embodiment A.
実施形態Cにおける測定対象が糖化ヘモグロビンであり、糖化ヘモグロビン比率(ヘモグロビン量に対する糖化ヘモグロビン量の比率)を測定する実施形態Caとして、下記(1)から(6)を含み、下記(1)から(6)を行うために1つの試薬(1試薬系試薬)と試料とを混合することを含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法が挙げられる。
実施形態Ca
(1)試料中のヘモグロビンを変性すること。
(2)試料中の糖化ヘモグロビンとプロテアーゼとの反応により糖化ペプチドを生成させること。
(3)糖化ペプチドとFPOXとの反応により過酸化水素を生成させること。
(4)生成した過酸化水素とペルオキシダーゼとの反応により酸化発色剤を発色させること。
(5)発色した酸化発色剤の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。
(6)変性したヘモグロビンの発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。
An object to be measured in Embodiment C is glycated hemoglobin, and as a embodiment Ca for measuring a glycated hemoglobin ratio (ratio of the amount of glycated hemoglobin to the amount of hemoglobin), the following (1) to (6) are included, The method of measuring the ratio of glycated hemoglobin may be mentioned, which comprises mixing one reagent (one reagent type reagent) and the sample to perform 6).
Embodiment Ca
(1) Denature the hemoglobin in the sample.
(2) Generating a glycated peptide by the reaction of glycated hemoglobin in a sample with a protease.
(3) Generating hydrogen peroxide by the reaction of a glycated peptide with FPOX.
(4) Coloring the oxidized color former by the reaction between the generated hydrogen peroxide and the peroxidase.
(5) To calculate the amount of glycated protein by measuring the color development signal of the oxidized color developing agent that has developed color.
(6) To calculate the amount of hemoglobin by measuring the color development signal of denatured hemoglobin.
実施形態Cにおける測定対象が糖化ヘモグロビンであり、糖化ヘモグロビン比率(ヘモグロビン量に対する糖化ヘモグロビン量の比率)を測定する実施形態Cbとして、下記(0)から(6)を含み、下記(2)から(6)を行うために1つの試薬(1試薬系試薬)と試料とを混合することを含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法が挙げられる。
実施形態Cb
(0)試料中の赤血球を溶血しヘモグロビンを赤血球から放出すること。
(1)試料中のヘモグロビンを変性すること。
(2)試料中の糖化ヘモグロビンとプロテアーゼとの反応により糖化ペプチドを生成させること。
(3)糖化ペプチドとFPOXとの反応により過酸化水素を生成させること。
(4)生成した過酸化水素とペルオキシダーゼとの反応により酸化発色剤を発色させること。
(5)発色した酸化発色剤の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。
(6)変性したヘモグロビンの発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。
An object to be measured in Embodiment C is glycated hemoglobin, and Embodiment Cb for measuring a glycated hemoglobin ratio (ratio of the amount of glycated hemoglobin to the amount of hemoglobin) includes the following (0) to (6), and The method of measuring the ratio of glycated hemoglobin may be mentioned, which comprises mixing one reagent (one reagent type reagent) and the sample to perform 6).
Embodiment Cb
(0) Hemolysis of erythrocytes in a sample and releasing hemoglobin from the erythrocytes.
(1) Denature the hemoglobin in the sample.
(2) Generating a glycated peptide by the reaction of glycated hemoglobin in a sample with a protease.
(3) Generating hydrogen peroxide by the reaction of a glycated peptide with FPOX.
(4) Coloring the oxidized color former by the reaction between the generated hydrogen peroxide and the peroxidase.
(5) To calculate the amount of glycated protein by measuring the color development signal of the oxidized color developing agent that has developed color.
(6) To calculate the amount of hemoglobin by measuring the color development signal of denatured hemoglobin.
実施形態Ca及びCbは、さらに、糖化ヘモグロビン量とヘモグロビン量とから糖化ヘモグロビン比率を算出することを含みうる。
また、実施形態Ca及びCbにおいて、糖化ヘモグロビンは、一又は複数の実施形態において、ヘモグロビンA1cである。
Embodiments Ca and Cb may further include calculating the glycated hemoglobin ratio from the amount of glycated hemoglobin and the amount of hemoglobin.
In embodiments Ca and Cb, glycated hemoglobin is hemoglobin A1c in one or more embodiments.
実施形態Cにおける測定対象が糖化ヘモグロビン以外の糖化蛋白質(例えば、糖化アルブミンなど)であり、糖化蛋白質比率(蛋白質量に対する糖化蛋白質量の比率)を測定する場合、一又は複数の実施形態において、本開示に係る測定で得られる糖化蛋白質量と、別の方法で得られる蛋白質量から糖化蛋白質比率を求めることができる。糖化ヘモグロビン比率もこの方法で求めてもよい。蛋白質量を求める方法は、例えば、上述のものが挙げられる。 In one or more embodiments, when the measurement target in embodiment C is a glycated protein other than glycated hemoglobin (for example, glycated albumin etc.) and the glycated protein ratio (ratio of glycated protein mass to protein mass) is measured, The ratio of glycated protein can be determined from the amount of glycated protein obtained by the measurement according to the disclosure and the amount of protein obtained by another method. The glycated hemoglobin ratio may also be determined by this method. Examples of methods for determining the amount of protein include those described above.
[実施形態Cの用事調製形態]
実施形態Cにおける1試薬系試薬は、流通段階では試薬の安定性の観点などから、1つの試薬でなくてもよい。本開示に係る測定方法を行う段階で用事調製してもよい。このような実施形態における1試薬系試薬を調製するための、限定されない2試薬の構成として下記構成C4からC11が挙げられる。
構成C4
第1試薬:緩衝剤、変性剤、FPOX、POD
第2試薬:緩衝剤、プロテアーゼ、酸化発色剤
構成C5
第1試薬:緩衝剤、変性剤、プロテアーゼ、POD
第2試薬:緩衝剤、FPOX、酸化発色剤
構成C6
第1試薬:緩衝剤、変性剤、FPOX、酸化発色剤
第2試薬:緩衝剤、プロテアーゼ、POD
構成C7
第1試薬:緩衝剤、変性剤、プロテアーゼ、酸化発色剤
第2試薬:緩衝剤、FPOX、POD
構成C8
第1試薬:緩衝剤、FPOX、POD
第2試薬:緩衝剤、プロテアーゼ、酸化発色剤
構成C9
第1試薬:緩衝剤、プロテアーゼ、POD
第2試薬:緩衝剤、FPOX、酸化発色剤
構成C10
第1試薬:緩衝剤、FPOX、酸化発色剤
第2試薬:緩衝剤、プロテアーゼ、POD
構成C11
第1試薬:緩衝剤、プロテアーゼ、酸化発色剤
第2試薬:緩衝剤、FPOX、POD
[Form of preparation of embodiment C]
One reagent-based reagent in the embodiment C may not be one reagent in terms of the stability of the reagent in the distribution stage, and the like. The preparation may be made at the stage of performing the measurement method according to the present disclosure. The following configurations C4 to C11 can be mentioned as configurations of two non-limiting reagents for preparing one reagent-based reagent in such an embodiment.
Configuration C4
First reagent: buffer, denaturant, FPOX, POD
Second Reagent: Buffer, Protease, Oxidative Coloring Agent Composition C5
First reagent: buffer, denaturant, protease, POD
Second reagent: Buffer, FPOX, oxidative color former Composition C6
First Reagent: Buffer, Denaturant, FPOX, Oxidized Coloring Agent Second Reagent: Buffer, Protease, POD
Configuration C7
First Reagent: Buffer, Denaturant, Protease, Oxidative Coloring Agent Second Reagent: Buffer, FPOX, POD
Configuration C8
First reagent: Buffer, FPOX, POD
Second Reagent: Buffer, Protease, Oxidative Coloring Agent Composition C9
First reagent: buffer, protease, POD
Second reagent: buffer, FPOX, oxidation color former composition C10
First Reagent: Buffer, FPOX, Oxidative Coloring Agent Second Reagent: Buffer, Protease, POD
Configuration C11
First Reagent: Buffer, Protease, Oxidative Coloring Agent Second Reagent: Buffer, FPOX, POD
実施形態Cの構成C4からC11は、さらに、色素安定剤、例えば、還元剤や界面活性剤などを含んでもよい。また、構成C4からC11における緩衝剤、変性剤、酸化発色剤、及び測定対象試料については、実施形態Aと同様である。また、構成C4からC11において、変性剤及び/又は色素安定剤は、式(I)の化合物であってもよい。 Configurations C4 to C11 of Embodiment C may further contain a dye stabilizer, such as a reducing agent or surfactant. Further, the buffer, the modifier, the oxidative color developing agent, and the sample to be measured in configurations C4 to C11 are the same as in the embodiment A. Also, in configurations C4 to C11, the modifier and / or the dye stabilizer may be a compound of formula (I).
[FPDHを用いる実施形態D]
本開示に係る測定方法は、限定されない実施形態Dにおいて、下記(1)から(4)を含み、下記(1)から(4)を行うために、あるいは、下記(2)から(4)を行うために、1つの試薬(1試薬系試薬)と試料とを混合することを含む、糖化蛋白質の測定方法である。
(1)試料中の蛋白質を変性すること。
(2)試料中の糖化蛋白質とプロテアーゼとの反応により糖化ペプチドを生成させること。
(3)糖化ペプチドとFPDHとの反応により還元発色剤を発色させること。
(4)発色した還元発色剤の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。
[Embodiment D using FPDH]
The measurement method according to the present disclosure includes the following (1) to (4) in non-limiting embodiment D, and to perform the following (1) to (4), or the following (2) to (4) It is a measuring method of a glycated protein including mixing one reagent (one reagent system reagent) and a sample in order to carry out.
(1) Denature the protein in the sample.
(2) To form a glycated peptide by the reaction of a glycated protein in a sample with a protease.
(3) To develop a reduced color former by the reaction of a glycated peptide with FPDH.
(4) To calculate the amount of glycated protein by measuring the color development signal of the reduced color former that has developed color.
限定されない一又は複数の実施形態において、実施形態Dにおける1試薬系試薬として、下記構成D1及びD2が挙げられる。但し、本開示に係る試薬は、これらの実施形態には限定されない。1試薬系試薬は、さらにその他の成分を含んでもよい。
構成D1
1試薬系試薬:緩衝剤、変性剤、プロテアーゼ、FPDH、還元発色剤
構成D2
1試薬系試薬:緩衝剤、FPDH、還元発色剤
In one or more non-limiting embodiments, one reagent-based reagent in embodiment D includes the following configurations D1 and D2. However, the reagent according to the present disclosure is not limited to these embodiments. One reagent-based reagent may further contain other components.
Configuration D1
1 Reagent-based reagent: Buffer, denaturant, protease, FPDH, reduced color former Composition D2
1 Reagent-based reagent: Buffer, FPDH, reduced color former
実施形態Dの構成D1及びD2は、さらに、上述の色素安定剤及び/又は電子伝達剤を含んでもよい。 Configuration D1 and D2 of Embodiment D may further include the above-described dye stabilizer and / or electron transfer agent.
構成D1及びD2における緩衝剤、変性剤、還元発色剤、及び測定対象試料は、実施形態Bと同様であり、プロテアーゼは、実施形態Cと同様である。 The buffer, the denaturant, the reduced color former, and the measurement target sample in configurations D1 and D2 are the same as in Embodiment B, and the protease is the same as in Embodiment C.
実施形態Dにおける発色シグナル及び糖化蛋白質量の測定は、実施形態Aと同様である。 The measurement of the chromogenic signal and the amount of glycated protein in Embodiment D is the same as in Embodiment A.
実施形態Dにおける測定対象が糖化ヘモグロビンであり、糖化ヘモグロビン比率(ヘモグロビン量に対する糖化ヘモグロビン量の比率)を測定する実施形態Daとして、下記(1)から(5)を含み、下記(1)から(5)を行うために1つの試薬(1試薬系試薬)と試料とを混合することを含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法が挙げられる。
実施形態Da
(1)試料中のヘモグロビンを変性すること。
(2)試料中の糖化ヘモグロビンとプロテアーゼとの反応により糖化ペプチドを生成させること。
(3)糖化ペプチドとFPDHとの反応により還元発色剤を発色させること。
(4)発色した還元発色剤の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。
(5)変性したヘモグロビンの発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。
An object to be measured in embodiment D is glycated hemoglobin, and an embodiment Da for measuring a glycated hemoglobin ratio (ratio of the amount of glycated hemoglobin to the amount of hemoglobin) includes the following (1) to (5). The method of measuring the glycated hemoglobin ratio includes mixing one sample (one reagent-based reagent) with the sample to perform 5).
Embodiment Da
(1) Denature the hemoglobin in the sample.
(2) Generating a glycated peptide by the reaction of glycated hemoglobin in a sample with a protease.
(3) To develop a reduced color former by the reaction of a glycated peptide with FPDH.
(4) To calculate the amount of glycated protein by measuring the color development signal of the reduced color former that has developed color.
(5) To calculate the amount of hemoglobin by measuring the color development signal of denatured hemoglobin.
実施形態Dにおける測定対象が糖化ヘモグロビンであり、糖化ヘモグロビン比率(ヘモグロビン量に対する糖化ヘモグロビン量の比率)を測定する実施形態Dbとして、下記(0)から(5)を含み、下記(2)から(5)を行うために1つの試薬(1試薬系試薬)と試料とを混合することを含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法が挙げられる。
実施形態Db
(0)試料中の赤血球を溶血しヘモグロビンを赤血球から放出すること。
(1)試料中のヘモグロビンを変性すること。
(2)試料中の糖化ヘモグロビンとプロテアーゼとの反応により糖化ペプチドを生成させること。
(3)糖化ペプチドとFPDHとの反応により還元発色剤を発色させること。
(4)発色した還元発色剤の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。
(5)変性したヘモグロビンの発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。
An object to be measured in embodiment D is glycated hemoglobin, and the embodiment Db for measuring the glycated hemoglobin ratio (ratio of the amount of glycated hemoglobin to the amount of hemoglobin) includes the following (0) to (5), and The method of measuring the glycated hemoglobin ratio includes mixing one sample (one reagent-based reagent) with the sample to perform 5).
Embodiment Db
(0) Hemolysis of erythrocytes in a sample and releasing hemoglobin from the erythrocytes.
(1) Denature the hemoglobin in the sample.
(2) Generating a glycated peptide by the reaction of glycated hemoglobin in a sample with a protease.
(3) To develop a reduced color former by the reaction of a glycated peptide with FPDH.
(4) To calculate the amount of glycated protein by measuring the color development signal of the reduced color former that has developed color.
(5) To calculate the amount of hemoglobin by measuring the color development signal of denatured hemoglobin.
実施形態Da及びDbは、さらに、糖化ヘモグロビン量とヘモグロビン量とから糖化ヘモグロビン比率を算出することを含みうる。
また、実施形態Da及びDbにおいて、糖化ヘモグロビンは、一又は複数の実施形態において、ヘモグロビンA1cである。
Embodiments Da and Db may further include calculating the glycated hemoglobin ratio from the amount of glycated hemoglobin and the amount of hemoglobin.
In embodiments Da and Db, glycated hemoglobin is hemoglobin A1c in one or more embodiments.
実施形態Dにおける測定対象が糖化ヘモグロビン以外の糖化蛋白質(例えば、糖化アルブミンなど)であり、糖化蛋白質比率(蛋白質量に対する糖化蛋白質量の比率)を測定する場合、一又は複数の実施形態において、本開示に係る測定で得られる糖化蛋白質量と、別の方法で得られる蛋白質量から糖化蛋白質比率を求めることができる。糖化ヘモグロビン比率もこの方法で求めてもよい。蛋白質量を求める方法は、例えば、上述したものがあげられる。 In one or more embodiments, when the measurement target in Embodiment D is a glycated protein other than glycated hemoglobin (for example, glycated albumin etc.) and the glycated protein ratio (ratio of glycated protein mass to protein mass) is measured, The ratio of glycated protein can be determined from the amount of glycated protein obtained by the measurement according to the disclosure and the amount of protein obtained by another method. The glycated hemoglobin ratio may also be determined by this method. Examples of methods for determining the amount of protein include those described above.
[実施形態Dの用事調製形態]
実施形態Dにおける1試薬系試薬は、流通段階では試薬の安定性の観点などから、1つの試薬でなくてもよい。本開示に係る測定方法を行う段階で用事調製してもよい。このような実施形態における1試薬系試薬を調製するための、限定されない2試薬の構成として下記構成D3からD10が挙げられる。
構成D3
第1試薬:緩衝剤、変性剤、FPDH
第2試薬:緩衝剤、プロテアーゼ、還元発色剤
構成D4
第1試薬:緩衝剤、変性剤、プロテアーゼ
第2試薬:緩衝剤、FPDH、還元発色剤
構成D5
第1試薬:緩衝剤、変性剤、FPDH、還元発色剤
第2試薬:緩衝剤、プロテアーゼ
構成D6
第1試薬:緩衝剤、変性剤、プロテアーゼ、還元発色剤
第2試薬:緩衝剤、FPDH
構成D7
第1試薬:緩衝剤、FPDH
第2試薬:緩衝剤、プロテアーゼ、還元発色剤
構成D8
第1試薬:緩衝剤、プロテアーゼ
第2試薬:緩衝剤、FPDH、還元発色剤
構成D9
第1試薬:緩衝剤、FPDH、還元発色剤
第2試薬:緩衝剤、プロテアーゼ
構成D10
第1試薬:緩衝剤、プロテアーゼ、還元発色剤
第2試薬:緩衝剤、FPDH
[Form of Administration Preparation of Embodiment D]
One reagent-based reagent in the embodiment D may not be one reagent in the distribution stage, from the viewpoint of the stability of the reagent. The preparation may be made at the stage of performing the measurement method according to the present disclosure. The following configurations D3 to D10 can be mentioned as configurations of two non-limiting reagents for preparing one reagent-based reagent in such an embodiment.
Configuration D3
First reagent: buffer, denaturant, FPDH
Second reagent: buffer, protease, reduced color former Composition D4
First reagent: buffer, denaturant, protease second reagent: buffer, FPDH, reduced color former Composition D5
First reagent: buffer, denaturant, FPDH, reduced color former Second reagent: buffer, protease Composition D6
First reagent: buffer, denaturing agent, protease, reduced color former Second reagent: buffer, FPDH
Configuration D7
First reagent: buffer, FPDH
Second reagent: buffer, protease, reduced color former Composition D8
First reagent: buffer, protease second reagent: buffer, FPDH, reduced color former Composition D9
First Reagent: Buffer, FPDH, Reduced Colorant Second Reagent: Buffer, Protease Constituent D10
First reagent: buffer, protease, reduced color former Second reagent: buffer, FPDH
実施形態Dの構成D3からD10は、さらに、上述の色素安定剤及び/又は電子伝達剤を含んでもよい。 Configuration D3 to D10 of Embodiment D may further comprise the above-mentioned dye stabilizer and / or electron transfer agent.
構成D3からD10における緩衝剤、変性剤、還元発色剤、及び測定対象試料は、実施形態Bと同様であり、プロテアーゼは、実施形態Cと同様である。 The buffer, the denaturing agent, the reduced color developing agent, and the measurement target sample in configurations D3 to D10 are the same as in embodiment B, and the protease is the same as in embodiment C.
[測定装置・測定システム]
本開示は、その他の態様において、本開示に係る測定方法を実行する、糖化蛋白質の測定装置又は測定システムに関する。
本開示に係る測定装置又はシステムは、一又は複数の実施形態において(図1)、反応容器(測光セル)に試料を供給するサンプリング部1、反応容器(測光セル)に1試薬系試薬を供給する試薬供給部2、測光セルの吸光度等の発色シグナルを測定する測光部3、サンプリング部1と試薬供給部2と測光部3を制御する制御部4、測光データ等を記録する記録部5、糖化蛋白質量等を算出する演算部6、及びデータ出力部7を備える。これらの各部は1つの装置に含まれてもよく、別個の装置に含まれシステムを構成してもよい。
[Measurement device / measurement system]
In another aspect, the present disclosure relates to a glycated protein measurement device or measurement system that implements the measurement method according to the present disclosure.
In one or more embodiments (FIG. 1), the measuring device or system according to the present disclosure supplies a
糖化蛋白質量を測定する方法として、本開示に係る測定方法のほかに、HPLC法がある。HPLC法は、近年高速化し、1検体(のみ)なら約1分で測定でき、複数検体については、10検体ごとに約5.5分の速度(1検体約30秒)での測定が可能になった。 一方、酵素法は、従来の2試薬系の場合、1検体につき測定時間が8−10分必要であった。但し、反応時間を並行に進ませ、サンプリング間隔での測光(測定)が可能であるから、検体数が多くなるほど1検体あたりの測定時間をサンプリング間隔の時間に近づけることができ、HPLCよりも高速処理が可能となる。
本開示に係る測定方法であれば、一又は複数の実施形態において、試料と1試薬系試薬との混合から10秒−180秒で測定でき、2試薬系よりもさらなる高速化が可能となる。
よって、一又は複数の実施形態において、本開示に係る装置は、一度に多数の検体を処理する大型の自動分析装置に好適である。
あるいは、本開示に係る測定方法は、一又は複数の実施形態において、1試薬系試薬を用いることにより従来の酵素法よりもかかる時間が短縮化できるから、測定対象試料が少ない小型の自動分析装置にも好適である。
As a method of measuring the amount of glycated protein, there is an HPLC method in addition to the measurement method according to the present disclosure. The HPLC method has become faster in recent years, and measurement with one sample (only) can be performed in about 1 minute, and multiple samples can be measured at a rate of about 5.5 minutes for every 10 samples (about 30 seconds with one sample) became. On the other hand, in the case of the conventional two-reagent system, the enzyme method required 8 to 10 minutes of measurement time for one sample. However, since the reaction time can be advanced in parallel and photometry (measurement) at sampling intervals is possible, the measurement time per sample can be made closer to the sampling interval time as the number of samples increases, and it is faster than HPLC. Processing becomes possible.
With the measurement method according to the present disclosure, in one or more embodiments, measurement can be performed in 10 seconds to 180 seconds from the mixing of the sample and the one reagent-based reagent, and the speed can be further increased than in the two reagent-based system.
Thus, in one or more embodiments, the devices of the present disclosure are suitable for large automated analyzers that process a large number of samples at one time.
Alternatively, in one or more embodiments, the measurement method according to the present disclosure can reduce the time required for the conventional enzyme method by using one reagent-based reagent, so a compact automatic analyzer with a small number of measurement target samples Is also suitable.
本開示に係る装置又はシステムの限定されない一又は複数の実施形態を説明する。
サンプリング部1には、採血に使用した採血管をそのままセットしたり、あるいは、血液等を試料カップに移し替えたり、採血管にサンプリング用具をセットしたりすることで、検体がサンプリング部1に供給される。採血管をそのままセットする場合には、キャップを貫通することのできるピアスノズルを用いることも可能である。
サンプリング部1において、供給された検体から試料が反応容器(測光セル)に移動される。サンプリング量は、例えば、0.1−10μLが挙げられる。測光セルに直接移動させる場合には、希釈率の観点から、0.1−2μLが好ましい。一方、検体から希釈槽を介して試料を測光セルに移動させてもよく、その場合のサンプリング量は、例えば、0.5−10μLである。
検体中の赤血球の溶血は、希釈槽を使用する場合には、希釈槽において、検体を精製水及び/又は界面活性剤を含む溶液など(以下、これらを「溶血溶液」ともいう)と混合することで溶血させることができる。溶血後、測定対象の試料として測光セルに移動する。したがって、本開示に係る装置又はシステムは、溶血溶液を供給する溶血溶液供給部を備えてもよい。
一方で、検体を直接測光セルに移動させてもよい。この場合、測光セルに溶血溶液を供給して溶血させてもよく、1試薬系試薬を供給することで溶血させてもよい。
いずれの場合も、溶血には、攪拌子による物理的な攪拌や、超音波による攪拌を利用できる。
One or more non-limiting embodiments of an apparatus or system according to the present disclosure will be described.
The sample is supplied to the
In the
When hemolyzing erythrocytes in a sample, when using a dilution tank, the sample is mixed with purified water and / or a solution containing a surfactant or the like (hereinafter, these are also referred to as “hemolytic solution”) in the dilution tank Hemolysis can be done by After hemolysis, it moves to a photometric cell as a sample to be measured. Thus, an apparatus or system according to the present disclosure may include a hemolytic solution supply that supplies a hemolytic solution.
On the other hand, the sample may be moved directly to the photometric cell. In this case, a hemolytic solution may be supplied to the photometric cell for hemolysis, or hemolysis may be performed by supplying one reagent system reagent.
In any case, for hemolysis, physical stirring with a stirrer or ultrasonic stirring can be used.
測光セルには、試薬供給部2から1試薬系試薬が供給される。試薬供給部2には、1液として供給される1試薬系試薬の溶液がセットされてもよく、2液として(用事調製形態として)供給された試薬を必要な検体分だけ混合して作製された1試薬系試薬がセットされてもよい。例えば、1日分や数日分を作製してもよく、例えば、数検体分から数千検体分を作製してもよい。
One reagent-based reagent is supplied from the
測光セルへの試料と1試薬系試薬の供給は、いずれが先であってもよく、同時でもよい。全血試料の場合、試料と試薬の混合比率は、例えば、1:30〜2000の比率であり、好ましくは1:100〜1000、より好ましくは1:150〜500である。血球試料の場合、試料と試薬の混合比率は、例えば、1:50〜4000の比率であり、好ましくは1:100〜2000、より好ましくは1:250〜1000である。 Either of the supply of the sample and the one reagent-based reagent to the photometric cell may be first or simultaneous. In the case of a whole blood sample, the mixing ratio of the sample and the reagent is, for example, a ratio of 1:30 to 2,000, preferably 1: 100 to 1000, and more preferably 1: 150 to 500. In the case of a blood cell sample, the mixing ratio of the sample and the reagent is, for example, a ratio of 1:50 to 4000, preferably 1: 100 to 2000, and more preferably 1: 250 to 1000.
本願明細書において、1試薬系試薬を用事調製してもよい。一又は複数の実施形態において、1試薬系試薬を試料との混合前5分以内に調製してもよい。この調製は、一又は複数の実施形態において、すべての試薬成分と接触させるために必要な最終的な工程をいう。特に限定されない一又は複数の実施形態において、酵素を含む第1試薬を、発色剤を含む第2試薬と組み合わせて1試薬系試薬を形成してもよい。試料と1試薬系試薬との混合後、測定までの時間は、例えば、10秒から180秒の間に設定できる。混合後測定までの時間は、例えば、30秒以上、45秒以上、又は、60秒以上である。また、混合後測定までの時間は、例えば、30秒以下、45秒以下、60秒以下、90秒以下、120秒以下、又は180秒以下である。 In the present specification, one reagent-based reagent may be prepared. In one or more embodiments, one reagent-based reagent may be prepared within 5 minutes prior to mixing with the sample. This preparation, in one or more embodiments, refers to the final steps required to make contact with all the reagent components. In one or more non-limiting embodiments, a first reagent comprising an enzyme may be combined with a second reagent comprising a color forming agent to form a one-reagent based reagent. After mixing the sample and the one reagent-based reagent, the time to measurement can be set, for example, between 10 seconds and 180 seconds. The time after mixing and before measurement is, for example, 30 seconds or more, 45 seconds or more, or 60 seconds or more. The time after mixing and before measurement is, for example, 30 seconds or less, 45 seconds or less, 60 seconds or less, 90 seconds or less, 120 seconds or less, or 180 seconds or less.
測定は、測光部3にて測光セルの吸光度等の発色シグナルを測定することで行われる。
糖化蛋白質の測定は、測定試薬添加後に速やかに1回目を測定し、測定終了時点で2回目を測定し、2回目と1回目の測光との差を測定値とする。
ヘモグロビンの測定は、Hbの吸収のある波長で測定するが、糖化ヘモグロビンの発色反応に影響されない波長が好ましく、例えば、発色剤がDA−67の場合、例えば、550nm以下、好ましくは500nm以下、より好ましくは450〜480nm付近で測定する。
測定セル、又は、溶血セルは、洗浄して何回も使用する形態でもよいが、一回で使い捨てる形態でもよい。
The measurement is performed by measuring a color forming signal such as the absorbance of the photometric cell by the photometry unit 3.
The measurement of the glycated protein is carried out immediately after the addition of the measurement reagent, and the second measurement is made at the end of the measurement, and the difference between the second measurement and the first photometry is taken as the measurement value.
Hemoglobin is measured at a wavelength at which Hb is absorbed, but a wavelength which is not affected by the color reaction of glycated hemoglobin is preferable. For example, when the color former is DA-67, for example, 550 nm or less, preferably 500 nm or less, more preferably Preferably, it measures at about 450-480 nm.
The measuring cell or the hemolyzing cell may be in the form of being washed and used many times but may be in the form of being disposable at one time.
制御部4は、例えば、サンプリング部1、試薬供給部2、測光部3、及び選択的に溶血溶液供給部が、上述のように作動するように制御する。
The control unit 4 controls, for example, the
測光部で測定されたデータは、記録部5で記録される。また、該データに基づき、演算部6で糖化蛋白質量、蛋白質量、及び/又は、糖化蛋白質比率が算出されて、記録部5に記録される。記録されたデータは、データ出力部から出力される。
演算部6は、測光部で得られた測定値(例えば、吸光度変化量)を、測定値に対する検量線に基づき糖化蛋白質量に換算して糖化蛋白質量を算出する。
The data measured by the photometry unit is recorded by the recording unit 5. Further, based on the data, the amount of glycated protein, the amount of protein, and / or the glycated protein ratio is calculated by the calculation unit 6 and recorded in the recording unit 5. The recorded data is output from the data output unit.
The calculation unit 6 calculates the amount of glycated protein by converting the measurement value (for example, the amount of change in absorbance) obtained by the photometry unit into the amount of glycated protein based on the calibration curve for the measurement value.
本開示は以下の限定されない一又は複数の実施形態に関しうる。
〔1〕 下記(1)から(3)を含む、試料中の糖化蛋白質の測定方法であって、
下記(2)から(3)を行うために試料と混合する試薬が1つである、測定方法。
(1)試料中の蛋白質を変性すること。
(2)試料中の糖化蛋白質とアマドリアーゼとの反応により発色剤を発色させること。 (3)(1)及び(2)の後の試料の吸光度を測定して糖化蛋白質量を算出すること。〔2〕 前記糖化蛋白質が、糖化ヘモグロビン又は糖化アルブミンであり、前記蛋白質が、ヘモグロビン又はアルブミンである、〔1〕に記載の測定方法。
〔3〕 下記(1)から(4)を含む、試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法であって、 下記(1)から(4)を行うために試料と混合する試薬が1つである、測定方法。
(1)試料中のヘモグロビンを変性すること。
(2)試料中の糖化ヘモグロビンとアマドリアーゼとの反応により発色剤を発色させること。
(3)(1)及び(2)の後の試料の吸光度を測定して糖化ヘモグロビン量を算出すること。
(4)(1)及び(2)の後の試料の吸光度を測定してヘモグロビン量を算出すること。
〔4〕 下記(0)から(4)を含む、試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法であって、 下記(2)から(4)を行うために試料と混合する試薬が1つである、測定方法。
(0)試料中の赤血球を溶血しヘモグロビンを赤血球から放出すること。
(1)試料中のヘモグロビンを変性すること。
(2)試料中の糖化ヘモグロビンとアマドリアーゼとの反応により発色剤を発色させること。
(3)(1)及び(2)の後の試料の吸光度を測定して糖化ヘモグロビン量を算出すること。
(4)(1)及び(2)の後の試料の吸光度を測定してヘモグロビン量を算出すること。
〔5〕 糖化ヘモグロビンが、ヘモグロビンA1cである、〔2〕から〔4〕のいずれかに記載の測定方法。
〔6〕 前記アマドリアーゼが、糖化蛋白直接型アマドリアーゼである、〔1〕から〔5〕のいずれかに記載の測定方法。
〔7〕 添加する試薬が、変性剤、糖化蛋白直接型フルクトシルペプチドオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、及び酸化発色剤を含有する、〔1〕から〔6〕のいずれかに記載の測定方法。
〔8〕 添加する試薬が、変性剤、糖化蛋白直接型フルクトシルペプチドデヒドロゲナーゼ、及び還元発色剤を含有する、〔1〕から〔6〕のいずれかに記載の測定方法。
〔9〕 前記(2)が、試料中の糖化ヘモグロビンとプロテアーゼと反応によりN末端糖化ペプチドを生成させること、及び、N末端糖化ペプチドとアマドリアーゼとの反応により発色剤を発色させること、である、〔2〕から〔8〕のいずれか記載の測定方法。
〔10〕 添加する試薬が、変性剤、プロテアーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、及び発色剤を含有する、〔1〕から〔5〕及び〔9〕のいずれかに記載の測定方法。
〔11〕 添加する試薬が、変性剤、プロテアーゼ、フルクトシルペプチドデヒドロゲナーゼ、及び発色剤を含有する、〔1〕から〔5〕及び〔9〕のいずれかに記載の測定方法。
〔12〕 〔1〕から〔11〕のいずれかに記載の測定方法を実行する、糖化ヘモグロビンの測定装置又は測定システム。
The present disclosure may relate to one or more of the following non-limiting embodiments.
[1] A method for measuring glycated protein in a sample, comprising the following (1) to (3),
A measurement method in which one reagent is mixed with the sample to perform the following (2) to (3).
(1) Denature the protein in the sample.
(2) To develop a color former by the reaction of glycated protein in the sample with amadoriase. (3) To calculate the amount of glycated protein by measuring the absorbance of the sample after (1) and (2). [2] The measurement method according to [1], wherein the glycated protein is glycated hemoglobin or glycated albumin, and the protein is hemoglobin or albumin.
[3] A method for measuring glycated hemoglobin in a sample, which comprises the following (1) to (4), wherein one reagent is mixed with the sample to perform the following (1) to (4): Method.
(1) Denature the hemoglobin in the sample.
(2) To develop a color former by the reaction of glycated hemoglobin in the sample with amadoriase.
(3) Calculate the amount of glycated hemoglobin by measuring the absorbance of the sample after (1) and (2).
(4) Calculate the amount of hemoglobin by measuring the absorbance of the sample after (1) and (2).
[4] A method for measuring glycated hemoglobin in a sample, comprising the following (0) to (4), wherein one reagent is mixed with the sample to perform the following (2) to (4): Method.
(0) Hemolysis of erythrocytes in a sample and releasing hemoglobin from the erythrocytes.
(1) Denature the hemoglobin in the sample.
(2) To develop a color former by the reaction of glycated hemoglobin in the sample with amadoriase.
(3) Calculate the amount of glycated hemoglobin by measuring the absorbance of the sample after (1) and (2).
(4) Calculate the amount of hemoglobin by measuring the absorbance of the sample after (1) and (2).
[5] The method according to any one of [2] to [4], wherein the glycated hemoglobin is hemoglobin A1c.
[6] The measurement method according to any one of [1] to [5], wherein the amadoriase is a direct glycated protein amadoriase.
[7] The measuring method according to any one of [1] to [6], wherein the reagent to be added contains a denaturing agent, glycated protein direct type fructosyl peptide oxidase, peroxidase, and an oxidative coloring agent.
[8] The measurement method according to any one of [1] to [6], wherein the reagent to be added contains a denaturing agent, glycated protein direct type fructosyl peptide dehydrogenase, and a reducing color former.
[9] The above (2) is the formation of an N-terminal glycated peptide by the reaction of glycated hemoglobin in the sample and the protease, and the coloration of the color former by the reaction of the N-terminal glycated peptide with the amadoriase. The measuring method in any one of [2] to [8].
[10] The measuring method according to any one of [1] to [5] and [9], wherein the reagent to be added contains a denaturing agent, a protease, fructosyl peptide oxidase, a peroxidase, and a color former.
[11] The measuring method according to any one of [1] to [5] and [9], wherein the reagent to be added contains a denaturing agent, a protease, fructosyl peptide dehydrogenase, and a color former.
[12] A measuring device or measuring system for glycated hemoglobin, which executes the measuring method according to any one of [1] to [11].
以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。 Hereinafter, the present disclosure will be described in more detail by way of examples, but these are illustrative and the present disclosure is not limited to these examples.
[実施例1]
1試薬系試薬
糖化蛋白直接型フルクトシルペプチドオキシダーゼ 3000U/L
ミリスチルジメチルアミノプロパンスルホン酸(東京化成工業) 3g/L
POD 10KU/L
DA−67(和光純薬工業) 0.1mmol/L
MOPS(同仁化学研究所) 50mmol/L
NaOH pH6.5
測定装置
BM−6010(日本電子製)
操作
人全血2μLと1試薬系試薬148μLとを混合し、37℃で2分間インキュベーションする。
吸光度測定
糖化ヘモグロビン測定:1試薬系試薬の混合から約20秒後と、約2分後との吸光度を、主波長654nm、副波長694nmで測定し、約2分後の吸光度から約20秒後の吸光度を差し引くことで、吸光度変化量を求める。
ヘモグロビン測定:1試薬系試薬の混合から約2分後の吸光度を、主波長478nm、副波長694nmで測定する。
糖化ヘモグロビン量の算出
吸光度変化量に対する検量線に基づき糖化ヘモグロビン量に換算して糖化ヘモグロビン量を算出する。
Example 1
1 Reagent system reagent glycated protein direct type fructosyl peptide oxidase 3000 U / L
Myristyl dimethylamino propane sulfonic acid (Tokyo Chemical Industry) 3 g / L
POD 10KU / L
DA-67 (Wako Pure Chemical Industries) 0.1 mmol / L
MOPS (Dojin Chemical Research Institute) 50 mmol / L
NaOH pH 6.5
Measuring device BM-6010 (manufactured by Nippon Denshi)
Absorbance measurement: Measured after about 20 seconds from mixing of reagent-based reagents and about 2 minutes after mixing of reagents based on absorbance at about 654 nm and 694 nm, and after about 20 seconds from about 2 minutes The amount of change in absorbance is determined by subtracting the absorbance of.
Hemoglobin measurement: The absorbance after about 2 minutes from the mixing of the reagent based reagents is measured at a main wavelength of 478 nm and a sub wavelength of 694 nm.
Calculation of the amount of glycated hemoglobin The amount of glycated hemoglobin is calculated by converting it into the amount of glycated hemoglobin based on the calibration curve for the amount of change in absorbance.
[実施例2]
1試薬系試薬の用事調製用第1試薬(酵素試薬)
糖化蛋白直接型フルクトシルペプチドオキシダーゼ 400U/L
POD 20KU/L
MOPS(同仁化学研究所) 50mmol/L
NaOH pH6.5
1試薬系試薬の用事調製用第2試薬(発色剤試薬)
ミリスチルジメチルアミノプロパンスルホン酸(東京化成工業) 30g/L
DA-67(和光純薬工業) 1.0mmol/L
MOPS(同仁化学研究所) 50mmol/L
NaOH pH6.5
測定装置
BM−6010(日本電子製)
操作
第1試薬9mLと第2試薬1mLとを混合し、1試薬系試薬を作製する。
人全血2μLと1試薬系試薬148μLとを混合し、37℃で2分間インキュベーションする。
吸光度測定
糖化ヘモグロビン測定:1試薬系試薬の混合から約20秒後と、約2分後との吸光度を、主波長654nm、副波長694nmで測定し、約2分後の吸光度から約20秒後の吸光度を差し引くことで、吸光度変化量を求める。
ヘモグロビン測定:1試薬系試薬の混合から約2分後の吸光度を、主波長478nm、副波長694nmで測定する。
糖化ヘモグロビン量の算出
吸光度変化量に対する検量線に基づき糖化ヘモグロビン量に換算して糖化ヘモグロビン量を算出する。
Example 2
1 Reagents First reagent for preparation of reagents (enzyme reagent)
Glycated protein direct type fructosyl peptide oxidase 400 U / L
POD 20KU / L
MOPS (Dojin Chemical Research Institute) 50 mmol / L
NaOH pH 6.5
1 Reagents Second reagent for preparation of reagents (chromogen reagent)
Myristyl dimethylamino propane sulfonic acid (Tokyo Chemical Industry) 30 g / L
DA-67 (Wako Pure Chemical Industries) 1.0 mmol / L
MOPS (Dojin Chemical Research Institute) 50 mmol / L
NaOH pH 6.5
Measuring device BM-6010 (manufactured by Nippon Denshi)
Operation 9 mL of the first reagent and 1 mL of the second reagent are mixed to prepare 1 reagent system reagent.
2 μL of human whole blood and 148 μL of one reagent-based reagent are mixed, and incubated at 37 ° C. for 2 minutes.
Absorbance measurement: Measured after about 20 seconds from mixing of reagent-based reagents and about 2 minutes after mixing of reagents based on absorbance at about 654 nm and 694 nm, and after about 20 seconds from about 2 minutes The amount of change in absorbance is determined by subtracting the absorbance of.
Hemoglobin measurement: The absorbance after about 2 minutes from the mixing of the reagent based reagents is measured at a main wavelength of 478 nm and a sub wavelength of 694 nm.
Calculation of the amount of glycated hemoglobin The amount of glycated hemoglobin is calculated by converting it into the amount of glycated hemoglobin based on the calibration curve for the amount of change in absorbance.
[実施例3]
1試薬系試薬の用事調製用第1試薬(酵素試薬)
フルクトシルペプチドデヒドロゲナーゼ 500U/L
1−メトキシPMS(同仁化学研究所) 1mmol/L
MOPS(同仁化学研究所) 50mmol/L
NaOH pH6.5
1試薬系試薬の用事調製用第2試薬(発色剤試薬)
メタロプロテアーゼ 20000KU/L
ミリスチルジメチルアミノプロパンスルホン酸(東京化成工業) 30g/L
WST−4(同仁化学研究所) 1mmol/L
MOPS(同仁化学研究所) 50mmol/L
NaOH pH6.5
測定装置
BM−6010(日本電子製)
操作
第1試薬9mLと第2試薬1mLとを混合し、1試薬系試薬を作製する。
人全血2μLと1試薬系試薬148μLとを混合し、37℃で2分間インキュベーションする。
吸光度測定
糖化ヘモグロビン測定:1試薬系試薬の混合から約20秒後と、約2分後との吸光度を、主波長694nm、副波長805nmで測定し、約2分後の吸光度から約20秒後の吸光度を差し引くことで、吸光度変化量を求める。
ヘモグロビン測定:1試薬系試薬の混合から約2分後の吸光度を、主波長478nm、副波長694nmで測定する。
糖化ヘモグロビン量の算出
吸光度変化量に対する検量線に基づき糖化ヘモグロビン量に換算して糖化ヘモグロビン量を算出する。
[Example 3]
1 Reagents First reagent for preparation of reagents (enzyme reagent)
Fructosyl peptide dehydrogenase 500 U / L
1-methoxy PMS (Dojin Chemical Research Institute) 1 mmol / L
MOPS (Dojin Chemical Research Institute) 50 mmol / L
NaOH pH 6.5
1 Reagents Second reagent for preparation of reagents (chromogen reagent)
Metalloprotease 20000 KU / L
Myristyl dimethylamino propane sulfonic acid (Tokyo Chemical Industry) 30 g / L
WST-4 (Dojin Chemical Research Institute) 1 mmol / L
MOPS (Dojin Chemical Research Institute) 50 mmol / L
NaOH pH 6.5
Measuring device BM-6010 (manufactured by Nippon Denshi)
Operation 9 mL of the first reagent and 1 mL of the second reagent are mixed to prepare 1 reagent system reagent.
2 μL of human whole blood and 148 μL of one reagent-based reagent are mixed, and incubated at 37 ° C. for 2 minutes.
Absorbance measurement: Measurement of glycated hemoglobin: The absorbance at about 20 seconds after mixing of the reagent based reagents and at about 2 minutes is measured at a main wavelength of 694 nm and a sub wavelength of 805 nm, and after about 20 seconds from the absorbance after about 2 minutes The amount of change in absorbance is determined by subtracting the absorbance of.
Hemoglobin measurement: The absorbance after about 2 minutes from the mixing of the reagent based reagents is measured at a main wavelength of 478 nm and a sub wavelength of 694 nm.
Calculation of the amount of glycated hemoglobin The amount of glycated hemoglobin is calculated by converting it into the amount of glycated hemoglobin based on the calibration curve for the amount of change in absorbance.
[実施例4]
1試薬系試薬の用事調製用第1試薬(酵素試薬)
フルクトシルペプチドオキシダーゼ 500U/L
POD 20KU/L
MOPS(同仁化学研究所) 50mmol/L
NaOH pH6.5
1試薬系試薬の用事調製用第2試薬(発色剤試薬)
メタロプロテアーゼ 30000KU/L
ミリスチルジメチルアミノプロパンスルホン酸(東京化成工業) 30g/L
DA-67(和光純薬工業) 1.0mmol/L
MOPS(同仁化学研究所) 50mmol/L
NaOH pH6.5
測定装置
BM−6010(日本電子製)
操作
第1試薬9mLと第2試薬1mLとを混合し、1試薬系試薬を作製した。
人全血2μLと1試薬系試薬148μLとを混合し、37℃でインキュベーションした。
吸光度測定
糖化ヘモグロビン測定:1試薬系試薬の混合から約20秒後、約1分後、約2分後、約5分後の吸光度を、主波長658nm、副波長694nmで測定し、約1分後、約2分後、約5分後の各吸光度から約20秒後の吸光度を差し引くことで、それぞれの吸光度変化量を求めた。
ヘモグロビン測定:1試薬系試薬の混合から約2分後の吸光度を、主波長478nm、副波長694nmで測定した。
糖化ヘモグロビン量の算出
吸光度変化量に対する検量線に基づき糖化ヘモグロビン量に換算して糖化ヘモグロビン量を算出した。
結果
約1分後、約2分後及び約5分後のいずれにおいても、同じ測定結果がえられた。
Example 4
1 Reagents First reagent for preparation of reagents (enzyme reagent)
Fructosyl peptide oxidase 500 U / L
POD 20KU / L
MOPS (Dojin Chemical Research Institute) 50 mmol / L
NaOH pH 6.5
1 Reagents Second reagent for preparation of reagents (chromogen reagent)
Metalloprotease 30000KU / L
Myristyl dimethylamino propane sulfonic acid (Tokyo Chemical Industry) 30 g / L
DA-67 (Wako Pure Chemical Industries) 1.0 mmol / L
MOPS (Dojin Chemical Research Institute) 50 mmol / L
NaOH pH 6.5
Measuring device BM-6010 (manufactured by Nippon Denshi)
Operation 9 mL of the first reagent and 1 mL of the second reagent were mixed to prepare one reagent system reagent.
2 μL of human whole blood and 148 μL of one reagent-based reagent were mixed and incubated at 37 ° C.
Absorbance measurement: Measurement of glycated hemoglobin: About 1 minute after about 20 seconds, about 1 minute, about 2 minutes and about 5 minutes of the mixing of the reagent based reagents, the absorbance is measured at the main wavelength of 658 nm and the sub wavelength of 694 nm. After that, each absorbance change was determined by subtracting the absorbance after about 20 seconds from each absorbance after about 2 minutes and about 5 minutes.
Hemoglobin measurement: The absorbance after about 2 minutes from the mixing of 1 reagent-based reagent was measured at a main wavelength of 478 nm and a sub wavelength of 694 nm.
Calculation of the amount of glycated hemoglobin The amount of glycated hemoglobin was calculated by converting it into the amount of glycated hemoglobin based on the calibration curve for the amount of change in absorbance.
Results The same measurement results were obtained after about 1 minute, about 2 minutes and about 5 minutes.
Claims (14)
下記(2)及び(3)を行うために試料と混合する試薬が1つである、測定方法。
(1)試料中の蛋白質を変性すること。
(2)試料中の糖化蛋白質とアマドリアーゼとの反応により発色剤を発色させること。 (3)(1)及び(2)の後の試料の発色シグナルを測定して糖化蛋白質量を算出すること。 A method for measuring glycated protein in a sample, comprising the following (1) to (3),
A measuring method in which one reagent is mixed with the sample to perform the following (2) and (3).
(1) Denature the protein in the sample.
(2) To develop a color former by the reaction of glycated protein in the sample with amadoriase. (3) To calculate the amount of glycated protein by measuring the chromogenic signal of the sample after (1) and (2).
下記(1)から(4)を行うために試料と混合する試薬が1つである、測定方法。
(1)試料中のヘモグロビンを変性すること。
(2)試料中の糖化ヘモグロビンとアマドリアーゼとの反応により発色剤を発色させること。
(3)(1)及び(2)の後の試料の発色シグナルを測定して糖化ヘモグロビン量を算出すること。
(4)(1)及び(2)の後の試料の発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。 A method for measuring glycated hemoglobin in a sample, comprising the following (1) to (4),
A measuring method in which one reagent is mixed with the sample to perform the following (1) to (4).
(1) Denature the hemoglobin in the sample.
(2) To develop a color former by the reaction of glycated hemoglobin in the sample with amadoriase.
(3) To calculate the amount of glycated hemoglobin by measuring the chromogenic signal of the sample after (1) and (2).
(4) To calculate the amount of hemoglobin by measuring the chromogenic signal of the sample after (1) and (2).
下記(2)から(4)を行うために試料と混合する試薬が1つである、測定方法。
(0)試料中の赤血球を溶血しヘモグロビンを赤血球から放出すること。
(1)試料中のヘモグロビンを変性すること。
(2)試料中の糖化ヘモグロビンとアマドリアーゼとの反応により発色剤を発色させること。
(3)(1)及び(2)の後の試料の発色シグナルを測定して糖化ヘモグロビン量を算出すること。
(4)(1)及び(2)の後の試料の発色シグナルを測定してヘモグロビン量を算出すること。 A method of measuring glycated hemoglobin in a sample, comprising the following (0) to (4),
A measuring method in which one reagent is mixed with the sample to perform the following (2) to (4).
(0) Hemolysis of erythrocytes in a sample and releasing hemoglobin from the erythrocytes.
(1) Denature the hemoglobin in the sample.
(2) To develop a color former by the reaction of glycated hemoglobin in the sample with amadoriase.
(3) To calculate the amount of glycated hemoglobin by measuring the chromogenic signal of the sample after (1) and (2).
(4) To calculate the amount of hemoglobin by measuring the chromogenic signal of the sample after (1) and (2).
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2023536735A (en) * | 2020-08-03 | 2023-08-29 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド | Melting device and method with piezoelectric element |
US12031890B2 (en) | 2021-07-23 | 2024-07-09 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Lysis devices having a piezo element and methods |
Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007029094A (en) * | 2005-07-27 | 2007-02-08 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | Method for stabilization of leuco dye |
JP2007139452A (en) * | 2005-11-15 | 2007-06-07 | Oji Paper Co Ltd | Method and apparatus for analyzing glycated protein |
JP2007155684A (en) * | 2005-12-08 | 2007-06-21 | Oji Paper Co Ltd | Analysis apparatus |
WO2008093723A1 (en) * | 2007-01-30 | 2008-08-07 | Arkray, Inc. | Measurement method for hba1c |
US20080223733A1 (en) * | 2005-05-02 | 2008-09-18 | Oji Paper Co., Ltd | Analysis Apparatus and Analysis Method for Glycosylated Hemoglobin |
JP2012137500A (en) * | 2010-09-27 | 2012-07-19 | Toyobo Co Ltd | Measuring apparatus and measuring method |
WO2014192200A1 (en) * | 2013-05-31 | 2014-12-04 | パナソニックヘルスケア株式会社 | Method for quantifying glycated hemoglobin |
WO2015005257A1 (en) * | 2013-07-09 | 2015-01-15 | 協和メデックス株式会社 | Method for measuring glycated hemoglobin |
JP2015509361A (en) * | 2012-02-10 | 2015-03-30 | アイ−センス インコーポレイテッドI−Sens,Inc. | Hemolytic reagent composition for quantitative analysis of hemoglobin A1c using enzymatic method |
WO2016076408A1 (en) * | 2014-11-14 | 2016-05-19 | パナソニックヘルスケアホールディングス株式会社 | Reaction accelerator, composition for hemoglobin degradation, method for measuring hemoglobin a1c and kit for measuring hemoglobin a1c |
WO2017183717A1 (en) * | 2016-04-22 | 2017-10-26 | キッコーマン株式会社 | HbA1c DEHYDROGENASE |
-
2018
- 2018-09-28 JP JP2018185124A patent/JP7226955B2/en active Active
Patent Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080223733A1 (en) * | 2005-05-02 | 2008-09-18 | Oji Paper Co., Ltd | Analysis Apparatus and Analysis Method for Glycosylated Hemoglobin |
JP2007029094A (en) * | 2005-07-27 | 2007-02-08 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | Method for stabilization of leuco dye |
JP2007139452A (en) * | 2005-11-15 | 2007-06-07 | Oji Paper Co Ltd | Method and apparatus for analyzing glycated protein |
JP2007155684A (en) * | 2005-12-08 | 2007-06-21 | Oji Paper Co Ltd | Analysis apparatus |
WO2008093723A1 (en) * | 2007-01-30 | 2008-08-07 | Arkray, Inc. | Measurement method for hba1c |
JP2012137500A (en) * | 2010-09-27 | 2012-07-19 | Toyobo Co Ltd | Measuring apparatus and measuring method |
JP2015509361A (en) * | 2012-02-10 | 2015-03-30 | アイ−センス インコーポレイテッドI−Sens,Inc. | Hemolytic reagent composition for quantitative analysis of hemoglobin A1c using enzymatic method |
WO2014192200A1 (en) * | 2013-05-31 | 2014-12-04 | パナソニックヘルスケア株式会社 | Method for quantifying glycated hemoglobin |
WO2015005257A1 (en) * | 2013-07-09 | 2015-01-15 | 協和メデックス株式会社 | Method for measuring glycated hemoglobin |
WO2016076408A1 (en) * | 2014-11-14 | 2016-05-19 | パナソニックヘルスケアホールディングス株式会社 | Reaction accelerator, composition for hemoglobin degradation, method for measuring hemoglobin a1c and kit for measuring hemoglobin a1c |
WO2017183717A1 (en) * | 2016-04-22 | 2017-10-26 | キッコーマン株式会社 | HbA1c DEHYDROGENASE |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2023536735A (en) * | 2020-08-03 | 2023-08-29 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド | Melting device and method with piezoelectric element |
JP7442014B2 (en) | 2020-08-03 | 2024-03-01 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド | Melting device and method with piezoelectric element |
US12031890B2 (en) | 2021-07-23 | 2024-07-09 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Lysis devices having a piezo element and methods |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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